CN1377369A - 莫拉氏菌属的疫苗抗原 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及莫拉氏菌属、特别是牛莫拉氏菌的抗原、编码这些抗原的核酸序列和用于提高抗莫拉氏菌属的免疫应答的制剂。

Description

莫拉氏菌属的疫苗抗原
发明领域
本发明涉及莫拉氏菌属、特别是牛莫拉氏菌(Moraxella bovis)的抗原、编码这些抗原的核酸序列和用于提高抗莫拉氏菌属的免疫应答的制剂。
发明背景
传染性牛角膜结膜炎(IBK)是一种经济上重要的牛疾病，是由革兰氏阴性球杆菌牛莫拉氏菌所导致的。IBK更普遍地称为红眼病，是一种接触传染性高的眼部感染，可以从轻微结膜炎发展为严重溃疡、角膜穿孔和失明。在控制IBK中治疗性与预防性措施仅取得有限成功，需要预防该疾病的疫苗。引起生物毒力的因素有很多，迄今得到认定的两种最重要的属性是菌毛的表达和产生溶血素的能力。根据菌毛的类型，在澳大利亚、英国和美国分离的七种不同的牛莫拉氏菌菌株血清群已经得到鉴别(1)。有效的菌毛类疫苗必须含有来自所有七种血清型的足量菌毛，以成为完全保护性的，因为两种血清型之间缺乏交叉保护(2，3)。尚未实现所有七种菌毛血清型的表达水平之高足以可用于商品疫苗制备。
理想的疫苗候选者刺激对抗牛莫拉氏菌的保护作用，它将是这样一种分子，在该菌种所有菌株中是非常保守的。可能的候选者是由牛莫拉氏菌产生的溶血素、蛋白酶、脂肪酶和/或磷脂酶(4)。例如，来自牛莫拉氏菌的一种溶血性菌株的部分纯化的无细胞上清液已经显示带来对抗异种的野生型攻击的显著保护作用(5)。溶血素在牛莫拉氏菌的所有七种血清型中保守的可能性使它成为对抗IBK的潜在疫苗候选者。不过，研究人员迄今既不能克隆编码溶血素的基因，也不能纯化该蛋白质达到同源性。虽然如此，任意或所有这些分子单独或组合都能够证实可用于产生对抗IBK有效的疫苗。
发明概述
在第一方面，本发明在于多肽，该多肽具有如SEQ.ID.NO.1氨基酸37至1114所述氨基酸序列、或与之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
在优选的实施方式中，该多肽具有与SEQ.ID.NO.1所示序列的同一性为至少70％的序列，更优选为至少80％，最优选为至少90％。
在本发明第一方面进一步优选的实施方式中，该多肽具有蛋白酶活性。
在第二方面，本发明在于核酸分子，该核酸分子编码本发明第一方面的多肽。
在第三方面，本发明在于核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.2所述序列、或与之具有至少60％同一性的序列、或在严格条件下与之杂交的序列。
在优选的实施方式中，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性为至少70％的序列，更优选为至少80％，最优选为至少90％。
在第四方面，本发明在于用于提高动物免疫应答的组合物，该组合物包含本发明第一方面的多肽或本发明第二方面的核酸序列和可选的载体和/或佐剂。
在第五方面，本发明在于多肽，该多肽具有如SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所述氨基酸序列、或与之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
在优选的实施方式中，该多肽具有与SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所示序列的同一性为至少70％的序列，更优选为至少80％，最优选为至少90％。
在第五方面进一步优选的实施方式中，该多肽具有脂肪酶活性。
在第六方面，本发明在于核酸分子，该核酸分子编码本发明第五方面的多肽。
在第七方面，本发明在于核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.4所述序列、或与之具有至少60％同一性的序列、或在严格条件下与之杂交的序列。
在优选的实施方式中，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性为至少70％的序列，更优选为至少80％，最优选为至少90％。
在第八方面，本发明在于用于提高动物免疫应答的组合物，该组合物包含本发明第五方面的多肽或本发明第六方面的核酸序列和可选的载体和/或佐剂。
在第九方面，本发明在于多肽，该多肽具有如SEQ.ID.NO.5所述氨基酸序列、或与之具有至少60％同一性的序列、或其功能片段。
在优选的实施方式中，该多肽具有与SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性为至少70％的序列，更优选为至少80％，最优选为至少90％。
在第九方面进一步优选的实施方式中，该多肽具有溶血素活性。
在第十方面，本发明在于核酸分子，该核酸分子编码本发明第九方面的多肽。
在第十一方面，本发明在于核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.6所述序列、或与之具有至少60％同一性的序列、或在严格条件下与之杂交的序列。
在优选的实施方式中，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性为至少70％的序列，更优选为至少80％，最优选为至少90％。
在第十二方面，本发明在于用于提高动物免疫应答的组合物，该组合物包含本发明第九方面的多肽或本发明第十方面的核酸序列和可选的载体和/或佐剂。
本文所用的术语“功能片段”打算覆盖保留完全多肽至少10％生物活性的多肽片段。该术语特别用于涵盖显示与完整多肽的免疫交叉反应性的片段，例如与片段反应也与完全多肽反应的配体。
在第十三方面，本发明在于用于提高动物针对莫拉氏菌属的免疫应答的组合物，该组合物包含至少一种多肽，选自由本发明第一、第五和第九方面的多肽组成的组，可选地还包括佐剂或载体。
在优选的实施方式中，该组合物包括本发明第九方面的多肽和本发明第一与第五方面的多肽之一，或优选地二者皆是。
在优选的实施方式中，该莫拉氏菌是牛莫拉氏菌或黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)，最优选为牛莫拉氏菌。
在第十四方面，本发明在于针对多肽而产生的抗体，该多肽选自由第一、第五和第九方面的多肽组成的组。
正如将为本领域技术人员所易于领会的，本发明的多肽与抗体和从核苷酸序列衍生的探针作为诊断试剂，能够用于测定莫拉氏菌属、特别是牛莫拉氏菌感染。例如，多肽和抗体能够用在ELISA类测定法中，而探针能够用在PCR类测定法中。探针的长度将提供所需的特异性水平，通常将是至少18个核苷酸。
遍及本说明书的词语“包含”或类似表达将被理解为意味着包括所述要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤组在内，但不排除任意其他要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤组。
附图的简要说明
图1：来自牛莫拉氏菌Dalton 2d的蛋白酶的核苷酸与氨基酸序列。推定的启动子序列仅有下划线。推定的核糖体结合部位以粗体和下划线表示。推定的起始密码子以粗体表示。推定的转录终止子序列用倒置的箭头指出。核苷酸与氨基酸序列的编号都表示在左手侧。
图2：来自牛莫拉氏菌Dalton 2d的脂肪酶的核苷酸与氨基酸序列。推定的启动子序列仅有下划线。推定的核糖体结合部位以粗体和下划线表示。推定的起始密码子以粗体表示。推定的转录终止子序列用倒置的箭头指出。核苷酸与氨基酸序列的编号都表示在左手侧。
图3：来自牛莫拉氏菌的脂肪酶在其重组形式(pMB1/MC1061)中被表达时的热稳定性(在90℃下进行加热)。
图4：(i)天然形式与(ii)重组形式牛莫拉氏菌的生长速率和脂肪酶的表达水平比较。生长速率以实心条表示，脂肪酶表达水平以空心菱形表示。
图5：来自牛莫拉氏菌Dalton 2d的RTX毒素A亚单位的核苷酸与氨基酸序列。推定的核糖体结合部位以粗体和下划线表示。推定的起始密码子以粗体表示。A亚单位可译框架的上游是C亚单位编码区的一部分(核苷酸1至195)(对应的氨基酸序列以SEQ ID NO：8表示)，A亚单位的下游是B亚单位编码区的一小部分(核苷酸3080至3250)(对应的氨基酸序列以SEQ ID NO：9表示)。核苷酸与氨基酸序列的编号都表示在左手侧。
发明的详细说明
为了更清楚地理解本发明的本性，现在根据下列非限制性实施例描述其优选方式。
通用分子生物学
除非另有指示，用在本发明中的重组DNA技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这类技术在文献来源中有所描述和解释，例如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆实践指南)，JohnWiley和Sons(1984)；J.Sambrook等，Molecualr Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)；T.A.Brown(编者)，Essential MolecularBiology：A Practical Approach(基本分子生物学：实践方法)，第1卷和第2卷，IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编者)，DNA Cloning：A Practical Approach(DNA克隆：实践方法)，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)；F.M.Ausubel等(编者)，CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学方法)，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括迄今所有更新)，引用在此作为参考文献。
蛋白质变体
向DNA引入适当的核苷酸变化，或者体外合成所需的多肽，可以制备氨基酸序列变体。这类变体例如包括氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。可以进行缺失、插入和取代的组合，以得到最终的构建体，只要最终的蛋白质产物具有所需特征即可。氨基酸变化还可以改变翻译后过程，例如改变膜锚着特征，通过插入、缺失或影响天生蛋白质的跨膜序列改变细胞内定位，或者修饰它对蛋白水解裂解作用的易感性。
在设计氨基酸序列变体时，突变部位的定位和突变的本性将取决于所要修饰的特征。可以单独或连续修饰突变部位，例如通过(1)首先用保守性氨基酸选择取代，然后用更自由的选择取代，这取决于所达到的结果，(2)缺失靶残基，或者(3)在与所定位的部位相邻处插入其他配体的残基。
可用于鉴别进行诱变的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells所述(Science(科学)(1989)244：1081-1085)。这里，鉴别一个残基或靶残基组(例如带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电氨基酸(最优选为丙氨酸或多丙氨酸)代替，以影响氨基酸与细胞内或外周围水性环境的相互作用。然后通过引入进一步的或其他变体精制证明对取代的功能敏感性的那些结构域。因而，尽管用于引入氨基酸序列变异的部位是预定的，不过突变本身的本性不必是预定的。例如，为了优化给定部位上的突变性能，可以在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，筛选被表达变体关于所需活性的最佳组合。
在氨基酸序列变体的构建中存在两个主要变量：突变部位的定位和突变的本性。它们可以代表天然存在的等位基因或预定的突变体形式，后者是通过使DNA突变为等位基因或自然界不存在的变体而制成的。一般来说，突变的定位和本性的选择将取决于所要修饰的特征。
氨基酸序列的缺失一般从约1至30个残基，更优选为约1至10个残基，通常为约1至5个毗邻残基。
氨基酸序列的插入包括氨基和/或羧基末端融合，长度从一个残基至含有一百个或以上残基的多肽，以及单或多氨基酸残基的序列内插入。其他插入变体包括蛋白质的N-或C-末端与免疫原性多肽的融合，后者例如细菌多肽，如β内酰胺酶或被大肠杆菌trp部位所编码的酶，或酵母蛋白、牛血清白蛋白和趋化性多肽。包括C-末端与半衰期长的蛋白质的融合，后者例如免疫球蛋白恒定区(或其他免疫球蛋白区域)、白蛋白或铁蛋白。
另一组变体是氨基酸取代变体。这些变体除去蛋白质分子中的至少一个氨基酸残基，并在其位置插入不同的残基。最相关的取代诱变部位包括被鉴别为活性部位的部位。其他有关部位是其中得自各种物种的特定残基是同一的那些。这些位置对生物活性来说可能是重要的。这些部位、尤其是属于至少其他三个同样保守的部位序列的那些以相对保守性方式被取代。这类保守性取代如表1“优选的取代”下所示。如果这类取代导致生物活性的变化，那么引入更实质性的变化，在表1中命名为示范的取代，或者进一步描述在关于氨基酸类的下文中；并且筛选产物。
表1
原始的残基 示范的取代 优选的取代
 Ala(A) val；leu；ile  val
 Arg(R) lys；gln；asn  lys
 Asn(N) gln；his；lys；arg  gln
 Asp(D) glu  glu
 Cys(C) ser  ser
 Gln(Q) asn  asn
 Glu(E) asp  asp
 Gly(G) pro  pro
 His(H) asn；gln；lys；arg  arg
 Ile(I) leu；val；met；ala；phe正亮氨酸  leu
 Leu(L) 正亮氨酸，ile；val；met；ala；phe  ile
 Lys(K) arg；gln；asn  arg
 Met(M) leu；phe；ile；  leu
 Phe(F) leu；val；ile；ala  leu
 Pro(P) gly  gly
 Ser(S) thr  thr
 Thr(T ser  ser
 Trp(W) tyr  tyr
 Tyr(Y) trp；phe；thr；ser  phe
 Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸  leu
突变体、变体和同源性——蛋白质
突变体多肽将具有一种或多种突变，它们是氨基酸残基的缺失、插入或取代。突变体既可以是天然存在的(也就是说，是从天然来源纯化或分离的)，也可以是合成的(例如，对编码性DNA进行部位定向的诱变)。因而显然，本发明的多肽既可以是天然存在的，也可以是重组的(也就是说，是利用重组DNA技术制备的)。
等位基因变体将是在单独生物体内天然存在的变体。
如果蛋白质序列与来自共同祖先的趋异有关，那么它们是同源的。所以，蛋白质的一种物种同系物将是天然存在于另一物种中的等价蛋白质。在任意一种物种内，同系物可以以大量等位基因变体的形式存在，它们将被视为蛋白质的同系物。通过本领域技术人员已知的下列标准技术可以得到等位基因变体和物种同系物。优选的物种同系物包括得自同门代表性物种的那些，更优选为同纲，进而更优选为同目。
正如本领域技术人员熟知的方法(例如Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)Ad.Appl.Math.(应用数学进展)，2：482-489或Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，48：443-453所述方法)所测定的，本发明包括与本发明的同一性至少50％的蛋白质，与本发明蛋白质的同一性优选为至少70％或80％，更优选为至少90％。这一般将是至少20个、优选为至少30个毗邻氨基酸的区域。
突变体、变体和同源性——核酸
突变体多核苷酸将具有一种或多种突变，它们是核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变体既可以是天然存在的(也就是说，是从天然来源分离的)，也可以是合成的(例如，对DNA进行部位定向的诱变)。因而显然，本发明的多核苷酸既可以是天然存在的，也可以是重组的(也就是说，是利用重组DNA技术制备的)。
等位基因变体将是在单独生物体内天然存在的变体。
如果核苷酸序列与来自共同祖先的趋异有关，那么它们是同源的。所以，多核苷酸的一种物种同系物将是天然存在于另一物种中的等价多核苷酸。在任意一种物种内，同系物可以以大量等位基因变体的形式存在，它们将被视为多核苷酸的同系物。通过本领域技术人员已知的下列标准技术可以得到等位基因变体和物种同系物。优选的物种同系物包括得自同门代表性物种的那些，更优选为同纲，进而更优选为同目。
正如本领域技术人员熟知的方法(例如Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)Ad.Appl.Math.(应用数学进展)，2：482-489或Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，48：443-453所述方法)所测定的，本发明包括与本发明的同一性至少70％的多核苷酸，与本发明多核苷酸的同一性优选为至少80％或90％，更优选为至少95％。这一般将是至少60个、优选为至少90个毗邻核苷酸残基的区域。
抗体的产生
术语“抗体”应当被解释为覆盖任意特异性结合物质，具有结合结构域和所需特异性。因而，该术语覆盖抗体片段、抗体的衍生物、功能等价物和同系物，包括任何包括免疫球蛋白结合结构域的多肽，天然或合成的均可。因此包括与另一种多肽融合的嵌合分子或等价物，其中包括免疫球蛋白结合结构域。
本领域技术人员利用标准技术可以生产对本发明的蛋白质来说是特异性的多克隆或单克隆抗体，例如但不限于Harlow等，Antibodies：ALaboratory Manual(抗体：实验室手册)，Cold Springs HarborLaboratory Press(1988)和D.Catty(编者)，Antibodies：A PracticalApproach(抗体：实用方法)，IRL Press(1988)所述的那些。
各种本领域已知程序可以用于生产抗蛋白质表位的多克隆抗体。关于多克隆抗体的生产，大量宿主动物都是抗体产生可接受的，利用多肽制备物的一次或多次注射致免疫，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。各种佐剂可以用于增加宿主动物的免疫应答，取决于宿主的种类，包括但不限于弗罗因德氏佐剂(完全的与不完全的)，矿物凝胶、例如氢氧化铝，表面活性物质、例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、油乳剂、钥孔戚血蓝蛋白、二硝基苯酚，和潜在有用的人佐剂、例如BCG(卡介苗)和小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
抗蛋白质表位的单克隆抗体可以利用任何为抗体分子的产生而在培养物中提供连续细胞系的技术加以制备。这些技术包括但不限于杂交瘤技术，最初由Kohler和Milstein(1975，Nature(自然)256，493-497)所描述，和最近的人B-细胞杂交瘤技术(Kesber等，1983，ImmunologyToday(今日免疫学)4：72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体与癌症疗法)，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)。另外，可以使用为生产“嵌合抗体”而开发的技术，剪接具有适当抗原特异性的抗体分子基因以及具有适当生物活性的人抗体分子基因(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院院报)，81：6851-6855；Neuberger等，1984，Nature(自然)312：604-608；Takeda等，1985，Nature(自然)31：452-454)。或者，所述用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)经过修改，能够生产4-特异性单链抗体。
重组人或人源化版本的单克隆抗体是人治疗应用的优选实施方式。人源化抗体可以按照文献程序加以制备(例如Jones等，1986，Nature(自然)321：522-25；Reichman等，1988，Nature(自然)332：323-27；Verhoeyen等，1988，Science(科学)239：1534-36)。最近所述用于生产人源化单克隆抗体的“基因转化诱变”策略也可以用于生产人源化抗体(Carter等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院院报)，89：4285-89)。或者，用于产生重区与轻区随机组合的重组噬菌体文库的技术可以用于制备重组抗体(例如Huse等，1989 Science(科学)246：1275-81)。
通过已知技术可以产生含有分子独特型、例如Fu F(ab1)和F(ab2)的抗体片段。例如，这类片段包括但不限于：F(ab)E2片段，它可以通过完整抗体分子的胃蛋白酶消化而生产；Fab1片段，它可以通过还原F(ab1)2片段的二硫桥而产生；和两种Fab片段，它们可以通过将抗体分子用木瓜蛋白酶和还原剂处理而产生。或者，可以构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science(科学)246：1275-1281)，以便迅速和容易克隆具有所需特异性的单克隆Fab片段，得到蛋白质。
佐剂和载体
药学上可接受的载体或稀释剂包括用在组合物中的那些，该组合物适合于口服、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、阴道、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)给药。它们在所用剂量和浓度下对受者是无毒的。药学上可接受的载体或稀释剂的代表性实例包括但不限于水；等渗溶液，它们优选地被缓冲为生理pH(例如磷酸盐缓冲盐水或Tris缓冲盐水)，还可以含有一种或多种甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖、甘油、乙醇或多肽(例如人血清白蛋白)。组合物适宜为单位剂型，可以通过药学领域熟知的任意方法加以制备。
如上所述，组合物可以包括佐剂。正如将被理解的，“佐剂”表示由一种或多种物质组成的组合物，它增强疫苗组合物的致免疫性和功效。适合的佐剂的非限制性实例包括角鲨烷和角鲨烯(或其他动物来源的油)；嵌段共聚物；洗涤剂，例如Tween-80、QuilA；矿物油，例如Drakeol或Marcol；植物油，例如花生油；从棒状杆菌属(Corynebacterium)衍生的佐剂，例如小棒状杆菌；从丙酸杆菌属(Propionibacterium)衍生的佐剂，例如痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acne)；牛结核分支杆菌(Mycobacterium bovis)(卡介苗或BCG)；白介素，例如白介素2和白介素12；单核因子，例如白介素1；肿瘤坏死因子；干扰素，例如γ干扰素；组合，例如皂甙-氢氧化铝或Quil A-氢氧化铝；脂质体；ISCOM佐剂；分支杆菌细胞壁提取物；合成的糖肽，例如胞壁酰二肽或其他衍生物；阿夫立定；脂质A衍生物；葡聚糖硫酸酯；DEAE-葡聚糖或含有磷酸铝；羧聚乙烯，例如Carbopol’EMA；丙烯酸共聚物乳剂，例如NeocrylA640(例如美国专利No.5,047,238)；牛痘或动物痘病毒蛋白；亚病毒粒子佐剂，例如霍乱毒素，或它们的混合物。
基因/DNA分离
编码蛋白质的DNA可以得自任意cDNA文库，该文库是从据信以可检出水平表达基因mRNA的组织制备的。DNA也可以得自基因组文库。
用设计用来鉴别有关基因或被其编码的蛋白质的探针或分析工具筛选文库。关于cDNA表达文库，适合的探针包括识别并特异性结合蛋白质的单克隆或多克隆抗体；长约20-80个碱基的寡核苷酸，编码相同或不同物种cDNA的已知或可疑部分；和/或互补性或同源性cDNA或其片段，编码相同或杂交基因。适合于筛选基因组DNA文库的探针包括但不限于寡核苷酸；cDNA或其片段，编码包括被表达序列标记等的相同或杂交DNA；和/或同源性基因组DNA或其片段。用所选择的探针筛选cDNA或基因组文库可以利用标准程序进行，如Sambrook等第10-12章所述。
分离编码有关蛋白质的基因的替代手段是利用聚合酶链反应(PCR)方法学，如Sambrook等第14节所述。该方法要求使用与基因杂交的寡核苷酸探针。
选择作为探针的寡核苷酸序列应当是足够长的和足够明确的，假阳性是最小化的。实际的核苷酸序列通常基于基因的保守性或高同源性核苷酸序列或区域。寡核苷酸可以在一个或多个位置是简并性的。若筛选其中优先密码子在该物种中的用途已知的物种文库，简并性寡核苷酸的使用可能是特别重要的。寡核苷酸必须被标记，以便它在与所筛选的文库中的DNA杂交后能够被检出。优选的标记方法是使用(α-32P)-dATP与多核苷酸激酶，这是本领域熟知的，以放射性标记寡核苷酸。不过，其他方法也可以用于标记寡核苷酸，包括但不限于生物素基化作用或酶标记。
涵盖所有蛋白质编码序列的DNA是这样获得的，筛选所选择的cDNA或基因组文库，如果必要的话，利用如Sambrook等第7.79节所述常规的引物延长程序，以检测可能没有被逆转录到cDNA中的mRNA的前体和加工中间体。
用于获得有关基因的另一种替代方法是利用Fingels等所述方法之一化学合成之(Agnew Chem.Int.Ed.Engl.(应用化学国际英文版)28：716-734，1989)。这些方法包括三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺与H-膦酸酯法、PCR与其他自动引物(autoprimer)法、和固体载体上的寡核苷酸合成。如果基因的全部核酸序列是已知的，或者与编码链互补的核酸序列是可利用的，那么可以使用这些方法，或者如果靶氨基酸序列是已知的，那么人们可以利用关于每种氨基酸残基已知的和优选的编码残基推断可能的核酸序列。
基本上纯化的
“基本上纯化的”表示已经从脂质、核酸、其他多肽和其他污染分子中分离的多肽。
杂交
本发明的多核苷酸序列可以在高严格条件下与SEQ ID NOS 2、4或6所述各序列杂交。本文所用的严格条件是(i)采用低离子强度和高温进行杂交后的洗涤，例如0.1×SSC与0.1％(w/v)SDS、50℃；(ii)在杂交期间采用这样的条件，杂交温度比杂交中的多核苷酸的双螺旋熔化温度低25℃，例如1.5×SSPE、10％(w/v)聚乙二醇6000、7％(w/v)SDS、0.25mg/ml片段化鲱鱼精子DNA、65℃；或(iii)例如0.5M磷酸钠，pH 7.2、5mM EDTA、7％(w/v)SDS和0.5％(w/v)BLOTTO、70℃；或(iv)在杂交期间采用变性剂，例如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺，与5×SSC、50mM磷酸钠(pH 6.5)和5×Denhardt溶液(32)、42℃；或(v)例如采用50％(v/v)甲酰胺、5×SSC、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％(w/v)焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、超声处理过的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)和10％葡聚糖硫酸酯、42℃。
实施例1
本实施例描述来自牛莫拉氏菌的蛋白酶的克隆和鉴定。
细菌和基因组文库的构建
牛莫拉氏菌Dalton 2d菌株是从牛眼收集的场分离物，通过CSIROAnimal Health，Parkville，Australia鉴定(6)。大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α以前已有描述(7，8)。
所有酶均购自Promega(Madison，WI，USA)，另有注解除外。
一般的克隆和DNA技术如文献所述(9)，另有注解除外。
基因组文库是这样构建的，利用下述CTAB法在从牛莫拉氏菌Dalton2d菌株提取的基因组DNA上进行部分Sau3A消化。将这种DNA用NaCl梯度进行尺寸分级(10)，与预先已用BamHI消化的粘粒克隆载体pHC79形成配合物(11)。利用Packagene Lambda DNA包装系统(Promega，Madison，WI，USA)将这种DNA包装在λ噬菌体头内，用于转导大肠杆菌菌株DH5α。将文库贮存在96孔托盘(50％甘油/luria肉汤/氨苄西林(50μg/ml))和-70℃下。
牛莫拉氏菌的CTAB基因组DNA提取
在5ml脑心浸剂(BHI)(Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，U.K.)肉汤中接种取自马血琼脂上的新鲜过夜培养基的Dalton 2d菌落，在37℃下摇动培养6小时。该培养物用于接种50ml BHI肉汤，在37℃下摇动生长过夜。将40ml培养物转移至SS34试管，在3000xg下离心10分钟使细胞形成粒状沉淀。将粒状沉淀再次悬浮在9.5ml含25％蔗糖的TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA(pH8))中后，加入500μl 10％SDS、50μl20mg/ml蛋白酶K和20μl 10mg/ml RNA酶A，将该混合物在37℃轨道摇瓶内培养1小时。向该混合物中加入1.8ml 5M NaCl和1.5ml CTAB(N-鲸蜡基-N，N，N-三甲基-溴化铵)/NaCl溶液，继续在65℃下培养20分钟。使用苯酚/氯仿提取DNA，用0.6体积异丙醇沉淀。将所得DNA用70％乙醇洗涤，干燥，再次悬浮在2ml TE缓冲液中。
筛选基因组文库的酶活性
为筛选显示蛋白酶活性的克隆体的存在，在37℃下在脱脂乳琼脂(双强度哥伦比亚琼脂培养基(Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，U.K.)/10％脱脂乳)上培养基因组文库达24小时，然后在4℃下冷藏一至两天。
检测到来自基因组文库的单一克隆体具有抗脱脂乳琼脂活性。DNA分析确认该克隆体含有牛莫拉氏菌Dalton 2d基因组DNA，大小为大约4万个碱基。该构建体被称为pJF1。
牛莫拉氏菌蛋白酶克隆体pJF1的核苷酸序列
分别利用Wizard Plus SV Minipreps DNA纯化系统(Promega，Madison，WI，USA)和Qiagen Plasmid Midi试剂盒(Qiagen Pty.Ltd.，Clifton Hill，Vic，Australia)提取质粒和粘粒DNA，用于自动测序。
利用“引物步行”过程测定插入片段DNA的核苷酸序列(12)。这是利用合成寡核苷酸(Bresatec/Geneworks，Thebarton，SA，Australia)和染剂终止子循环测序备用反应(Perkin Elmer Corporation，Norwalk，CT，USA)来实现的。在Applied Biosystems 373A DNA序列分析仪上分析所得序列。
自动测序揭示3345bp可译框架能够编码1115个氨基酸的蛋白质。按5’至3’方向书写序列，如图1所示，其中还有预期编码分子量为120kDa的蛋白质的相应氨基酸序列。氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，DNA序列如SEQ ID NO 2所示。
通过可能的上游核糖体结合部位的存在鉴别关于成熟蛋白酶蛋白的公认起始密码子。通过与大肠杆菌RBS共有序列的相似性鉴别这种RBS，以前用于鉴别牛莫拉氏菌菌毛蛋白基因(AGGAG)(27)。
由于蛋白酶的秘密本性，假定它在其N-末端序列中含有用于蛋白质分泌的信号肽。利用可从Expasy网站(http：//www.expasy.ch/tools/)得到的预测程序(SignalP)进行这种分析，可鉴别原核生物的信号肽，预测可能的裂解部位。这种分析仅利用伴随蛋白质/DNA序列所示起始密码子鉴别信号肽。
序列对比
利用可在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov得到的BlastX与BlastP程序进行所推导的氨基酸序列与数据库中的序列的对比。
在氨基酸水平上，从Dalton 2d克隆的蛋白酶显示下列与所列蛋白质的相似性和同一性。生物体                   蛋白质                 相似性     同一性粘质沙雷氏菌             ssp-h2-丝氨酸蛋白酶    39％       23％(Serratia marcescens)    自动转运蛋白粘质沙雷氏菌             ssp-h1-丝氨酸蛋白酶    37％       22％
                     自动转运蛋白荧光假单胞菌             丝氨酸蛋白酶同系物     34％       20％(Pseudomonas fluorescens)托拉假单胞菌             丝氨酸蛋白酶           35％       21％(Pseudomonas tolaasii)
更一般地，牛莫拉氏菌蛋白酶的5’结构域显示与枯草杆菌蛋白酶(丝氨酸蛋白酶)家族的同源性，而3’区域类似于大量外膜蛋白。
发现牛莫拉氏菌序列含有富集大量脯氨酸的区域，这区别于所有其他与之密切相关的蛋白质。
被pJF1编码的蛋白酶类型
为了鉴别被pJF1编码的蛋白酶活性类型，检查了一定范围特异性蛋白酶抑制剂对牛莫拉氏菌蛋白酶表达的作用。
利用Bourgeau等(1992)(14)的方法测定抑制剂活性，并作下列修改。将来自新鲜过夜肉汤培养物的100μl无细胞上清液与650μl 100mMTris(pH 7.2)和适合体积的抑制剂(PMSF(苯甲磺酰氟)5mM；EDTA 5mM；亮肽素100μg/ml；胃酶抑素50μg/ml)混合。用蒸馏水加至体积达1ml。将混合物在37℃下培养30分钟，然后加入10mg azocoll(Calbiochem，Alexandria，NSW，Australia)。将悬液在37℃下培养16小时，读取520nm下的光密度。
按照这种方法确认了可归因于被pJF1编码的蛋白酶的活性是丝氨酸蛋白酶的活性，因为PMSF(丝氨酸蛋白酶抑制剂)减少Dalton 2d和pJF1的蛋白酶活性至零。
牛莫拉氏菌中的蛋白酶保守
利用蛋白酶编码区的内部片段作为探针进行DNA杂交，以调查蛋白酶是否存在于代表已知牛莫拉氏菌菌毛血清型的菌株中。
将从牛莫拉氏菌的代表性菌株提取的基因组DNA(15)用XbaI和EcoRI消化，利用琼脂糖凝胶电泳分离。利用文献所述方法将DNA转移至Hybond N+滤器(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)(9)。用于DNA杂交的探针是经过PCR扩增的片段，它位于蛋白酶编码区的内部。利用Megaprime标记系统(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)，按照厂商指导将该片段用α32P-dATP标记。使用高严格条件(杂交温度68℃；在室温下用2×SSC/0.1％ SDS洗涤2次；在68℃下用0.1×SSC/0.1％ SDS洗涤1次)，使所得滤器暴露于放射自显影膜(Kodak，Rochester，New York，USA)达5至24小时，然后显影。
结果显示在pJF1中克隆的蛋白酶基因存在于所有所检查的牛莫拉氏菌菌株中。
实施例2
本例描述来自牛莫拉氏菌的脂肪酶的克隆和鉴定。
细菌和质粒文库的构建
牛莫拉氏菌Dalton 2d菌株是从牛眼收集的场分离物(fieldisolate)，通过CSIRO Animal Health，Parkville，Australia鉴定(6)。大肠杆菌菌株MC1061以前已有描述(16)。
所有酶均购自Promega(Madison，WI，USA)，另有注解除外。一般的克隆和DNA技术如文献所述(9)，另有注解除外。
质粒文库是在克隆载体pBR322中构建的(17)。它是这样进行的，在1至2kb范围内最大化DNA的量的条件下，用Sau3A部分消化(利用实施例1所述CTAR法)从Dalton 2d提取的基因组DNA。使该DNA与预先已用BamHI消化的pBR322连接。将连接后的DNA电穿孔(2.5kV、200Ω和200μF，理论时间常数为4.7)到电反应潜能大肠杆菌MC1061细胞内。
筛选质粒文库的脂肪酶表达
连接后的DNA向MC1061细胞的电穿孔之后，在含有Tween 80的培养基[10ml Tween 80(Sigma，St Louis，MO，USA)，5g NaCl，3g琼脂No.1(Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，U.K.)，10g胨，0.1gCaCl2.H2O/升]上，在37℃下培养文库达24小时，检测显示脂肪酶活性的重组克隆体。
在所筛选的24,000个克隆体中，发现有二十八个显示脂肪酶活性。DNA分析确认所有这些克隆体都含有一个5.4kb片段的共有DNA。选择一个克隆体继续实验，将其命名为pMB1。
在有些实验中(见下)，利用对-硝基苯基棕榈酸酯作为底物进行细胞外脂肪酶活性的光度测定(18，19)。使大肠杆菌和/或牛莫拉氏菌在37℃下生长所需时间。将不含细胞的培养物上清液(100μl)与2.4ml酶缓冲液混合(19)，以测定所分泌的脂肪酶活性。在37℃下培养30分钟后，测定410nm下的光密度。一个酶单位被定义为每分钟从每ml对-硝基苯基棕榈酸酯释放1nmol对-硝基苯基的酶量。在Stuer等所述条件下(18)，0.041的410nm下光密度等于1个酶单位。
牛莫拉氏菌脂肪酶克隆体pMB1的核苷酸序列
利用实施例1所述方法，对质粒pMB1进行自动DNA测序。
该分析揭示1851bp的可译框架能够编码617个氨基酸。按5’至3’方向书写序列，如图2所示，其中还有预期编码分子量为65.8kDa的蛋白质的相应氨基酸序列。氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示，DNA序列如SEQ ID NO 4所示。
利用上述关于蛋白酶的技术鉴别脂肪酶蛋白的潜在起始密码子。
序列对比
利用实施例1所述方法进行序列对比。
在氨基酸水平上，从牛莫拉氏菌Dalton 2d克隆的脂肪酶显示下列与所列蛋白质的相似性和同一性。生物体                        蛋白质            相似性         同一性发光致病杆菌                  三酰甘油脂肪酶    36％           24％(Xenorhabdus luminescens)恶臭假单胞菌                  假定的蛋白质      36％           24％(Pseudomonas putida)鼠伤寒沙门氏菌                外膜酯酶          35％           23％(Salmonella typhimurium)铜绿假单胞菌                  脂肪酶/酯酶       36％           23％(Pseudomonas aeruginosa)
牛莫拉氏菌被鉴别为可能是GDSL家族(20)脂解酶的新成员。
对脂肪酶成熟蛋白进行N-末端测序
在500ml luria肉汤中，在37℃下摇动培养所需大肠杆菌菌株过夜。在5,000rpm下离心15分钟，使细胞形成粒状沉淀，通过0.45μm滤器过滤上清液。向上清液中加入固体硫酸铵至60％饱和度(180g/500ml)，在4℃下搅拌30分钟使溶解。将该混合物置于4℃下过夜，在7,000rpm下离心30分钟使所沉淀的蛋白质形成粒状沉淀。将蛋白质再次悬浮在3ml重蒸馏水中，使溶解的蛋白质对重蒸馏水透析过夜，以除去所有的盐。通过0.45μm滤器过滤所得混合物，贮存在-20℃下。
用SDS-PAGE分离蛋白质后，将蛋白质转移至PVDF膜上，切除。对蛋白质进行自动(埃德曼降解)序列分析(28)，在自动序列分析仪(470A型，Applied Biosystems)(Applied Biosystems Division，Foster City，CA，USA)中发生临界试剂的蒸汽相传递(29)，该仪器连接有PTH氨基酸分离系统(120A型PTH分析器，Applied Biosystems)。
利用这种技术，鉴别了具有两个裂隙的17个氨基酸KEFSQVIIFGDSLXDXG(SEQ ID NO：7)，它精确对应于随附序列所示第26至42个氨基酸。这种结果还表明该蛋白质最有可能包括参与蛋白质分泌的氨基末端信号肽。该氨基末端对应于随附序列的第1至25个氨基酸。
升高兔脂肪酶抗体
通过注射被硫酸铵沉淀过的大肠杆菌MC1061/pMB4上清液，升高兔重组脂肪酶抗体。在疫苗接种之前，将脂肪酶制备物加热至90℃达90分钟进行灭活。注射30μg该蛋白质，以2周为间隔，注射4周。将原代接种物用弗罗因德完全佐剂乳化，随后用弗罗因德不完全佐剂进行疫苗接种。
牛莫拉氏菌脂肪酶的热稳定性
发现从牛莫拉氏菌Dalton 2d克隆的重组脂肪酶是非常热稳定的，因为使活性减少97％需要在90℃下加热105分钟。图3阐述了这种现象，酶活性以根据细胞外脂肪酶测定法测定的“脂肪酶单位”表示。
天然对重组脂肪酶的相对表达水平
进行实验以描绘脂肪酶产生的生长速率，比较MC1061pMB1产生重组脂肪酶与牛莫拉氏菌Dalton 2d产生天然形式的脂肪酶。图4阐述了两种菌株的生长速率大约相等，但是它们没有达到相等的细胞密度，9小时后Dalton 2d基本上低于MC1061pMB1。与牛莫拉氏菌Dalton 2d的天然脂肪酶表达相比，大肠杆菌pMB1构建体的脂肪酶表达水平最高。
将来自大肠杆菌克隆体或牛莫拉氏菌Dalton 2d的无细胞上清液的蛋白质用硫酸铵沉淀，用SDS-PAGE分析，利用重组热灭活脂肪酶抗血清进行蛋白质印迹分析，进一步证实了该结果。
分别在500ml Luria肉汤或脑心浸剂肉汤中，在37℃下摇动培养大肠杆菌或牛莫拉氏菌过夜，制备硫酸铵沉淀过的上清液。在5000xg下离心15分钟，使细胞形成粒状沉淀，通过0.45μm滤器过滤上清液。向上清液中加入固体硫酸铵至60％饱和度(180g/500ml)，在4℃下搅拌30分钟使溶解。将该混合物置于4℃下过夜，在7000xg下离心30分钟使所沉淀的蛋白质形成粒状沉淀。将蛋白质再次悬浮在3ml重蒸馏水中，使溶解的蛋白质对重蒸馏水透析过夜，以除去所有的盐。通过0.45μm滤器过滤所得混合物，贮存在-20℃下。
将蛋白质再次悬浮在100μl 2x样本缓冲液(5ml 0.5M Tris(pH6.8)，8ml 10％ SDS，4ml甘油，0.8ml β-巯基乙醇，1ml重蒸馏H2O，溴酚蓝)中，加热至100℃达5分钟，制备SDS-PAGE用蛋白质样本(100μl)。利用Laemlli的缓冲系统(21)，在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质。
按照Towbin等的方法(22)进行蛋白质印迹，用SDS-PAGE分离蛋白质后，利用Bio-Rad微型电池(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)转移系统转移至硝基纤维素。用已被MC1061细胞吸附的重组脂肪酶抗血清(浓度为1/100)对滤器进行免疫印迹分析。抗已被灭活(90℃下1小时45分钟)的硫酸铵沉淀过的重组脂肪酶的抗血清被升高了，用于以4周间隔接种兔子(三次各50μg)。在致免疫之前和每次疫苗接种之时从耳缘静脉采集血样。
结果显示重组脂肪酶阳性构建体MC1061/pMB1存在显著的谱带，在牛莫拉氏菌Dalton 2d制备物中可检测到相对微小的量。用抗血清检出的蛋白质的大小大约等于牛莫拉氏菌脂肪酶的预测分子量大小(65.8kDa)。
被pMB1编码的脂肪酶类型
利用薄层色谱法(TLC)测定牛莫拉氏菌Dalton 2d的脂肪酶是否显示磷脂酶活性。磷脂酶类型的特征鉴别本质上遵循前人所述方法(23)，但是在100℃下用10％磷钼酸的乙醇溶液展开后，用肉眼观察硅胶60板上的分离结果。所用试剂全部购自Sigma(Sigma，St Louis，MO，USA)。
TLC测定了当使用溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱作为底物时，牛莫拉氏菌脂肪酶显示与商业上可得到的磷脂酶B相同的酶特异性(数据未显示)。
牛莫拉氏菌中脂肪酶的保守
利用Dalton 2d脂肪酶编码区的内部片段进行DNA印迹分析，以调查脂肪酶基因是否存在于代表已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株中。
将从代表每种已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株提取的基因组DNA(15)用HindIII消化，利用琼脂糖凝胶电泳分离。利用前人所述方法(9)将DNA转移至Hybond N+滤器(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)。用于DNA杂交的探针是含有脂肪酶编码区内部序列的HindIII片段。利用Megaprime标记系统(Amersham，LittleChalfont，Buckinghamshire，U.K.)，按照厂商指导将该片段用α32P-dATP标记。使用高严格条件(杂交温度68℃；在室温下用2×SSC/0.1％ SDS洗涤2次；在68℃下用0.1×SSC/0.1％SDS洗涤1次)，使所得滤器暴露于放射自显影膜(Kodak，Rochester，New Yor k，USA)达5至24小时，然后显影。
结果显示脂肪酶存在于所有所检查的牛莫拉氏菌菌株中。
为了确认脂肪酶基因是否在每种血清型代表性菌株内被表达，所升高的抗重组体热灭活脂肪酶抗血清用于全细胞制备物的蛋白质印迹分析。结果显示脂肪酶的确被所有这些牛莫拉氏菌菌株所表达。
实施例3
细菌和溶血素克隆体的构建
牛莫拉氏菌Dalton 2d菌株是从牛眼收集的场分离物，通过CSIROAnimal Health，Parkville，Australia鉴定(6)。
所有代表已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株表达溶血活性，在马血琼脂上检测。
大肠杆菌degP4∷Tn5菌株具有渗漏外膜，有蛋白水解缺陷，前人已有描述(24)。所有酶均购自Promega(Madison，WI，USA)，另有注解除外。
一般的克隆和DNA技术如文献所述(9)，另有注解除外。
采用能够鉴别输出蛋白质的phoA融合技术(25)，并作一定修改。将来自牛莫拉氏菌Dalton 2d的基因组DNA(利用实施例1所述CTAB法制备)用Sau3A部分消化。使限制性DNA与一系列载体连接，以便与三种不同阅读框架内的碱性磷酸酶基因融合。使连接后的DNA电穿孔至大肠杆菌degP4∷Tn5内，在含有氨苄西林(50μg/ml)和X-P(200μg/ml)(5-溴-3-氯-吲哚基磷酸酯)的luria琼脂上筛选所得克隆体。克隆体的选择依赖于观察结果，也就是如果片段被克隆并且含有输出序列，那么所得菌落将呈蓝色。渗漏大肠杆菌菌株允许与外膜结合的蛋白质和所分泌的蛋白质(都与phoA融合)有别于非分泌性融合蛋白。
牛莫拉氏菌溶血素决定子的测序
选择存在所分泌的或外膜蛋白基因序列的克隆体，利用实施例1所述方法进行自动DNA测序。发现这些克隆体之一pMbh1含有200bp的DNA，对其他RTX毒素的A亚单位显示较高同源性。利用反向PCR和变性寡核苷酸得到完整A亚单位的序列。2784bp的可译框架能够编码928个氨基酸。按5’至3’方向书写序列，如图5所示，其中还有预期编码分子量为98.8kDa的蛋白质的相应氨基酸序列。氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示，DNA序列如SEQ ID NO 6所示。
利用上述RBS技术鉴别推定的起始密码子。没有进行信号肽分析，因为A亚单位不被主动分泌。不过由于这些蛋白质(RTX)的蛋白序列是非常保守的，该起始密码子是对单独的氨基酸同源性的选择之一。
序列同源性
在氨基酸水平上，牛莫拉氏菌Dalton 2d溶血素基因产物显示与若干RTX的A亚单位和其他溶血素具有惊人的相似性，如下表所示。生物体                       蛋白质          相似性        同一性溶血性巴斯德氏菌             LktA蛋白        68％          50％(Pasteurella haemolytica)    (白细胞毒素)大叶性肺炎放线杆菌           RTX毒素决定子   68％          48％(Actinobacillus pleuropneumoniae)大肠杆菌                     溶血素-质粒     58％          43％大肠杆菌                     溶血素-染色体   58％          43％
牛莫拉氏菌溶血素的功能互补
得到表达大肠杆菌携带染色体的溶血素的构建体(pLG900；通过联合两个质粒pLG575(26)和pLG816而生成(克隆到pBluescriptSK内的hlyC和hlyA))。pLG900包含克隆到pBluescriptSK内的四种RTX操纵子基因hlyC、hlyA、hlyB、hlyD，能够赋予以前是非溶血性的大肠杆菌细胞以溶血性表型。使这种构建体的A亚单位(hlyA)变异，以便它不再能够被表达，但是参与操纵子的其他基因(hlyB、hlyC和hlyD)保持完整。含有该构建体的大肠杆菌菌株(pLG900/hlyA阴性)不再是溶血性的。不过，通过在转运中提供从牛莫拉氏菌Dalton 2d克隆的溶血素亚单位基因可以恢复溶血性表型。因而确认了所克隆的牛莫拉氏菌溶血素基因编码最有可能是RTX家族溶血酶成员的结构亚单位。
进一步的序列分析已经确立，象其他家族成员一样，牛莫拉氏菌RTXA亚单位基因旁侧是能够编码RTX B、C和D蛋白的DNA序列。
RTX A亚单位在牛莫拉氏菌中的保守性
为了确定RTX A亚单位基因是否存在于代表已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株中，使用RTX A亚单位的编码区作为探针进行DNA杂交分析。
将从牛莫拉氏菌的七种血清型菌株提取的基因组DNA(15)用EcoRV消化，利用琼脂糖凝胶电泳分离。利用前人所述方法(9)将DNA转移至Hybond N+滤器(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)。所用探针是含有来自牛莫拉氏菌RTX溶血素A亚单位的所有编码区的PCR扩增产物。利用Megaprime标记系统(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)，按照厂商指导将该片段用α32P-dATP标记。使用高严格条件(杂交温度68℃；在室温下用2×SSC/0.1％ SDS洗涤2次；在68℃下用0.1×SSC/0.1％ SDS洗涤1次)，使所得滤器暴露于放射自显影膜(Kodak，Rochester，New York，USA)达5至24小时，然后显影。
结果显示编码RTX A溶血素亚单位的基因在所检查的全部七种代表性牛莫拉氏菌菌株中是保守的。有趣的是，已知这些菌株每种都在马血琼脂上显示溶血性表型。相反，非溶血性牛莫拉氏菌菌株Gordon 26L3没有与RTX A基因探针杂交，可能提示牛莫拉氏菌仅含有负责在马血琼脂上检出的溶血性表型的单一结构基因。
本领域技术人员将领会到，可以对如具体实施方式所示发明进行大量改变和/或修改，而不背离如广泛描述的发明精神或范围。因此，这些实施方式被视为说明性的而非限制性的。
参考文献1.Moore L.J.，和A.W.D.Lepper.(1991).Vet Microbiol.(兽医微生物学)29：75-83.2.Lehr，C.H.，G.Jayappa，和R.A.Goodnow.(1985).Cornell Vet.(Cornell兽医学)75：484-492.3.Pugh，G.W.，D.E.Hughes，和G.D.Booth.(1977).Am J Vet Res.(美国兽医研究杂志)38：1519-1522.4.Frank，S.K.，和J.D.Gerber.(1981).J Clin Microbiol.(临床微生物学杂志)13(2)：269-271.5.Billson，F.M.，J.L.Hodgson，A.W.Lepper，W.P.Michalski，C.L.Schartzkoff，P.R.Lehrbach，和J.M.Tennent.(1994).FEMSMicrobiol Lett.(欧洲微生物学会联合会微生物学快报)124(1)：69-73.6.Elleman，T.C.，P.A.Hoyne，和A.W.D.Lepper.(1990).InfectImmun.(传染与免疫性)58(6)：1678-1684.7.Woodcock，D.M.，P.J.Crowther，J.Doherty，S.Jefferson，E.DeCruz，M.Noyer-Weidner，S.S.Smith，M.Z.Michael，和M.W.Graham.(1989).Nucleic Acids Res.(核酸研究)17(9)：3469-3478.8.Raleigh，E.A.，K.Lech，和R.Brent.(1989).In CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学方案)eds.Ausubel，F.M.et al.，Publishing Associates和WileyInterscience；New York.Unit 1.4.9.Sambrook，J.，E.F.Fritsch，和T.Maniatis.(1989).MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd edition.(分子克隆实验室手册第2版)Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold SpringHarbour，New York.10.Dillela，A.G.，和S.L.C.Woo.(1985).Focus.(焦点)7(2)：1-5.11.Hohn，B.，and J.Collins.(1980).Gene.(基因)11(3-4)：291-298.12.Narberhaus.F.，K.Giebeler，和H.Bahl.(1992).J Bacteriol.(细菌学杂志)174(10)：3290-3299.13.Altschul，S.F.，T.L.Madden，A.A.Schaffer，Z.Jinghui，Z.Zhang，W.Miller，和D.J.Lipman.(1997).Nucleic Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402.14.Bourgeau，G.，H.Lapointe，P.Peloquin，和D.Mayrand.(1992).Infection and Immunity.(传染与免疫性)60(8)：3186-3192.15.Ausubel，F.M.，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，和K.Struhl.(1994).Current Protocols inMolecular Biology.(最新分子生物学方案)Green PublishingAssociates，Inc.and John Wiley and Sons Inc.New York.16.Wertman，K.F.，A.R.Wyman，和D.Botstein.(1986).Gene.(基因)49(2)：253-262.17.Bolivar F.，R.L.Rodrigucz，P.J.Greene，M.C.Betlach，H.L.Heynecker，和H.W.Boyer.(1977).Gene.(基因)2(2)：95-113.18.Stuer，W.，K.E.Jaeger，和U.K.Winkler.(1986).J Bacteriol.(细菌学杂志)168：1070-1074.19.Winkler，U.K.，和M.Stuckman.(1979).J Bacteriol.(细菌学杂志)138：663-670.20.Upton，C.，和J.T.Buckley.(1995).Trends Biochem Sci.(生化科学趋势)20(5)：178-9.21.Laemmli，U.K.(1970).Nature.(自然)227(259)：680-685.22.Towbin，H.，T.Staehlin，和J.Gordon.(1979).Proc Natl Acad SciUSA.(美国国家科学院院报)76(9)：4350-4354.23.Fifis，T.，C.Costopoulos，和J.A.Vaughn.(1996).VetMicrobiol.(兽医微生物学)49：219-233.24.Strauch，K.L.，和J.Beckwith.(1988).Proc Natl Acad Sci USA.   (美国国家科学院院报)85(5)：1576-1580.25.Gilaldi，M.，C.I.Champion，D.A.Haake，D.R.Blanco，J.F.Miller，J.N.Miller，和M.A.Lovett.(1993).J Bacteriol.(细菌学杂志)175：4129-4136.26.Mackman，N.，J-M.Nicaud，L.Gray，和I.B.Holland.(1985).MolGenet.(分子遗传学)201：282-288.27.Atwell，J.L.，J.M.Tennent，A.W.Lepper和T.C.Elleman.(1994).J Bacteriol.(细菌学杂志)176(16)：4875-82.28.Edman，P.，和C.Begg.(1967).Eur J Biochem.(欧洲生物化学杂志)1：80-91.29.Hewick，R.M.，M.W.Hunkapillar，L.E.Hood，和W.J.Dreyer.1981.J Biol Chem.(生物化学杂志)256：7990-7997.
                   序列表<110>The University of Melbourne
 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation<120>莫拉氏菌属的疫苗抗原<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1114<212>PRT<213>牛莫拉氏菌<400>1Met Ser Leu Gln Thr Gln Pro Ala Lys Arg Gly Phe Tyr Val Lys Pro1               5                  10                  15Leu Ser Met Ala Cys Met Leu Val Ile Ser Ala Ser Ser Thr Val Ser
         20                  25                  30Tyr Ala Asn Ser Ala Pro Met Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asn Ser Ser
     35                  40                  45Lys Tyr Ser Phe Tyr Asp Tyr Tyr Leu Asp Phe Leu Lys Arg Phe Arg
 50                  55                  60Pro Thr Pro Thr Pro Val Pro Ser Pro Val Arg Pro Ala Pro Glu Leu65                  70                  75                  80Val Arg Pro Thr Pro Ala Pro Ile Pro Ala Pro Thr Pro Val Pro Thr
             85                  90                  95Pro Ala Pro Ile Ser Gly Gly Ile Ser Gly Ser Tyr Ile Ala Pro Val
        100                 105                 110Ser Pro Ser Glu Val Arg Gln Pro Asp Tyr Thr Arg Arg Val Gln Ala
    115                 120                 125Asn Leu Lys Arg Asn Gln Pro Ala Pro Ser Ala Gly Thr Arg Thr Gly
130                 135                 140Tyr Ser Val Met Asp Thr Ser Asn Asn Ser Asn Leu Thr Ser Lys Phe145                 150                 155                 160Tyr Gly Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ala Glu Arg Leu Asp Asn Leu Lys
            165                 170                 175Asn Thr Ile Asp Thr Arg Gln Ala Lys Val Gly Val Ile Asp Thr Gly
        180                 185                 190Ile Asn Arg Phe Asn Arg Asp Leu Val Gly Ala Asn Val His Asp Thr
    195                 200                 205Gln Ile Glu Cys Val Ser Ala Gly Arg Ser Thr Cys Tyr Thr Pro Glu
210                 215                 220Asn Asp Ser Gly Ile Val Glu Ile Pro Thr Thr Ser Ala Ser Gly Ser225                 230                 235                 240His Gly Asn Gln Met Ala Ala Val Ile Ala Gly Asn Asn Gly Met Thr
            245                 250                 255Asn Ala Lys Ile Tyr Gly Ser Asp Ser Ile Asp Arg Arg Ser Asn Gly
        260                 265                 270Gly Asn His Phe Leu Met Met Arg Lys Leu Asn Gln Asp His Gly Val
    275                 280                 285Lys Ile Phe Asn Asn Ser Trp Gly Ser Asn Asn Thr Asp Gln Trp Tyr
290                 295                 300Tyr Asp Ala Gln Arg Leu Asn Tyr Asn Pro Thr Thr Gly Gln Ile Asn305                 310                 315                 320Pro Asn Pro Tyr Arg Thr Ser Ile Thr Asn Ala Glu Val Thr Leu Pro
            325                 330                 335Val Ile His Asp Leu Ile Met Asn Arg Asp Ser Leu Ile Ile Lys Ala
        340                 345                 350Thr Gly Asn Glu Gly Leu Asn Asp Ala His Asp Glu Asn Leu Ala Pro
    355                 360                 365Leu Met Asn Ser Asn Phe Lys Lys Gly Phe Ile Thr Val Ser Ser Pro
370                 375                 380Arg Glu Asp Phe Gly Lys Ala Asn His Cys Gly Arg Thr Ala Glu Trp385                 390                 395                 400Cys Val Sar Ala Thr Ser Ser Thr Gln Asn Tyr Ala Asn Asp Gly Arg
            405                 410                 415Leu Ser Ser Tyr Lys Gly Thr Ser Pro Ala Thr Ala Arg Val Ser Gly
        420                 425                 430Thr Ala Val Leu Val Gln Ser Ala Tyr Pro Trp Met Lys Asn Glu Asn
    435                 440                 445Ile Ser Gln Thr Ile Leu Gly Thr Ala Lys Asp Phe Ser Glu Ile Thr
450                 455                 460Ala Asn Ser Pro Asn Gly Tyr Gln Gly Leu Arg Lys Val Ser Arg Leu465                 470                 475                 480Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Thr Asp Asn Gln Gly Asn Phe
            485                 490                 495Tyr Val Pro Gly Asn Val Asn Trp Glu Asn Arg Arg Ile Val Ala Asn
        500                 505                 510His Asn Gly Lys Asn Ile Thr Trp Glu Asp Gly Trp Gly Leu Leu Asp
    515                 520                 525Pro Glu Ala Ala Ala Lys Gly Tyr Gly Gly Phe Tyr Trp Asp Asn Val
530                 535                 540Glu Leu Asp Thr Lys Gly Thr Pro Leu Ser Val Phe Tyr Asn Asp Leu545                 550                 555                 560Lys Gly Asp Lys Gly Phe Thr Lys Lys Gly Glu Gly Lys Leu Val Phe
            565                 570                 575Thr Gly Asn Asn Ser Tyr Lys Gly Asp Ser Val Ile Glu Gly Gly Ser
        580                 585                 590Leu Glu Val Asn Gly Asn Asn Gly Gly Ser Thr Met Val Val Lys Gly
    595                 600                 605Gly Glu Leu Thr Gly Tyr Gly Asn Val Ala Asn Val Arg Gln Thr Gly
610                 615                 620Gly Trp Val Asn Asn Glu Gly Asn Leu Asn Ile Arg Gly Asp Tyr Asn625                 630                 635                 640Ile Asn Thr Gln Arg Gly Val Asp Ala Gly Leu Lys Ala Gln Phe Gly
            645                 650                 655Asn Met Leu Thr Val Asp Gly Lys Ala Lys Leu Gly Gly Thr Leu Asn
        660                 665                 670Leu Thr Gly Glu Thr Lys Asp Gly Ile Ile Ser Lys Ser Gly Ser Arg
    675                 680                 685Ser Thr Val Leu Arg Ala Lys Arg Gly Leu Glu Gly Gln Phe Asp Asn
690                 695                 700Tyr Arg Ser Ser Asn Pro Leu Phe Glu Val Thr Asn Val Glu Tyr Thr705                 710                 715                 720Pro Glu Val Asp Arg Asn Gly Arg Val Val Gly Gly Ser Arg Thr Asn
            725                 730                 735Asn Asp Val Gln Val Thr Ala Lys Arg Leu Ser Ala Gly Asn Val Val
        740                 745                 750Tyr Gly Ile Ser Met Asn Asp Ser Gly Ser Arg Val Ala Gln Asn Leu
    755                 760                 765Asp Lys Val Leu Asn Asp Leu Asp Lys Lys Gln Glu Thr Gln Gly Ser
770                 775                 780Leu Thr Ser Asp Glu Lys Gln Phe Ala Asn Arg Val Phe Thr Gly Phe785                 790                 795                 800Glu Asn Met Asn Ser Gly Ala Glu Ser Lys Leu Ser Thr Val Ser Thr
            805                 810                 815Asn Arg Glu Leu Tyr Lys Leu Asp Pro Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Ala
        820                 825                 830Leu Asn Ala Val Glu Asp Ser Ala Asn His Ala Thr Glu Phe Gly Lys
    835                 840                 845Arg Val Ser Ala Pro Arg Gly Val Trp Gly Asn Ile Ser His His Asp
850                 855                 860Tyr Asp Val Glu Leu Glu His Ala Thr Ser Ala Arg Lys Gly Asn Asn865                 870                 875                 880Ile Ser Val Gly Ala Ser Thr Gln Thr Ala Ala Asp Ile Ser Val Gly
            885                 890                 895Ala Gln Leu Asp Val Ser Lys Leu Asp Leu Glu Glu Ser Val Tyr Gly
        900                 905                 910Ile Gly Asn Lys Thr Lys Thr Asp Ser Ile Gly Leu Thr Val Gly Ala
    915                 920                 925Ser Lys Lys Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Ser Gly Trp Val Lys Gly Ala
930                 935                 940Lys Val Asp Thr Glu Ala Asn Arg Gly Glu Asn Ser Asn Lys Val Glu945                 950                 955                 960Tyr Asn Gly Lys Leu Tyr Gly Ala Gly Ile Gln Ala Gly Thr Asn Ile
            965                 970                 975Asp Thr Ala Ser Gly Val Ser Val Gln Pro Tyr Ala Phe Val Asn His
        980                 985                 990Gln Gln Tyr Lys Asn Asp Gly Ser Phe Asn Asp Gly Leu Asn Val Val
    995                1000                1005Asp Asp Ile Glu Ala Lys Gln Thr Gln Val Gly Val Gly Ala Asp Met1010                1015                1020Val Phe Gln Ala Thr Pro Ala Leu Gln Leu Thr Gly Gly Val Gln Val1025               1030                1035                1040Ala His Ala Val Ser Arg Asp Thr Asn Leu Asp Thr Arg Tyr Val Gly
           1045                1050                1055Thr Ala Thr Asp Val Gln Tyr Gly Thr Trp Asp Thr Asp Lys Thr Lys
       1060                1065                1070Trp Ser Ala Lys Val Gly Ala Asn Tyr Asn Val Thr Pro Asn Ser Gln
   1075                1080                1085Val Gly Leu Asn Tyr Ser Tyr Thr Gly Ser Gly Asp Ser Asp Ala Ser1090                1095                1100Gln Val Gly Val Ser Phe Thr Ser Lys Phe1105               1110<210>2<211>4384<212>DNA<213>牛莫拉氏菌<400>2ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 240tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 300ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 360cacacccgtc ctgtggatca ataattaatg aacatatata ctctatttaa tatttcttat 420ttattcgtaa tattgccata aaaataatac attatttcta tattaactaa actgttaata 480tttgtaaata ataaacattt gtttatctaa aaaaataaat aatataaatc aagcaattac 540aatcttattt ttgaaaatac aataatactg caattgctta atctagacat taagtttatt 600tttgattaaa attgccaaaa cttgtgtaaa taagtttcac cgaattgata ctttaagggt 660atcaatattg caacatggta aatgattgct atgttgttgg gcattgcata aattgtctat 720aataacttgt tatggatgat tgatggcaat gataaactta gtgacaatga taaacgcaaa 780gaggtgtaat atgtcattac aaactcaacc tgccaagaga gggttctatg ttaagccttt 840aagtatggct tgcatgctgg taattagtgc tagtagtacg gtaagttatg ccaactcagc 900tccaatgatt gttgattcac agtacaatag ttctaaatac tctttctacg attactattt 960agatttcctt aaacgtttta gaccaactcc aactccagtg ccaagccctg tgagaccggc 1020tcctgaactc gttcgtccga ccccagcccc gattccggct ccaacgcctg tgccaacacc 1080ggcaccaatt agtggcggta tatcaggtag ctatattgct ccagtatcgc catcagaggt 1140gagacagcct gattacacaa gacgcgttca agccaatcta aaacgcaacc aacctgcacc 1200aagtgctggc acacgtacag gttatagtgt catggatacg tcaaataatt ctaatttgac 1260atctaaattt tatggcacaa ccgaagatgg ttatgccgag cgtcttgaca acctaaagaa 1320caccattgat acacgtcaag ccaaagtagg tgtgattgat acaggcatta accgcttcaa 1380ccgagacttg gttggtgcaa atgtgcatga tacacagatt gagtgtgttt ctgctggacg 1440ttccacctgc tatacgccag aaaatgattc aggcattgtt gaaatcccaa caacctctgc 1500tagtggtagt catggcaacc aaatggcggc tgtcatcgct ggtaacaacg gcatgaccaa 1560cgccaaaatt tacggcagtg acagtattga tcgacgttca aatggtggca accatttctt 1620gatgatgcgt aagctgaacc aagaccatgg tgtcaagatt tttaacaact cttggggttc 1680taacaacact gaccaatggt actacgatgc tcagcgccta aattacaatc ctactacagg 1740acagattaat ccaaatcctt acagaaccag tattaccaat gctgaagtga ctttgcctgt 1800cattcatgat cttattatga atcgtgactc gcttatcatt aaagcaacag gtaacgaagg 1860cttgaacgat gctcatgatg aaaacctagc accgctcatg aacagcaact tcaaaaaagg 1920tttcattact gtctcctcgc ctagagaaga ttttggtaaa gcgaatcatt gtggtcgaac 1980tgccgaatgg tgtgtatccg caacatcatc tacccaaaat tacgccaacg atggcagact 2040gagtagctat aagggtacat cacctgcaac cgctcgtgtg tccggcacgg cagtgctcgt 2100gcaatctgct tatccttgga tgaaaaatga aaatatctct caaaccattt tgggtactgc 2160caaggatttc tcagagatta ctgccaattc acctaatggc taccaaggac taagaaaggt 2220tagtagattg ccatctggtt attacggctc ttattacact gacaatcagg gtaatttcta 2280tgttcctggc aatgtcaatt gggaaaaccg tcgaattgtc gctaatcata acggcaagaa 2340cattacatgg gaagatggtt ggggtttgtt agatccagaa gcggccgcta aaggttatgg 2400tggtttctat tgggataatg tggaattaga cactaaaggc acgcctttat ctgtattcta 2460caatgaccta aaaggtgata aaggctttac caaaaaaggt gaaggtaaac ttgtctttac 2520tggtaataat agctataaag gcgactctgt catcgagggt ggttcactag aagtaaatgg 2580taacaacggt ggttcaacca tggttgttaa aggtggtgaa ctaacaggtt atggtaatgt 2640agctaatgtt cgtcaaacag gtggttgggt taacaacgaa ggtaacctaa acatcagagg 2700tgactacaac atcaacactc aacgtggcgt ggatgctggt ctaaaagctc aatttggcaa 2760catgcttacc gtggacggta aggccaaact aggtggtaca ctaaatctaa ctggtgagac 2820caaagatggt atcatcagca aatcaggtag ccgtagcact gtacttcgtg ctaagcgtgg 2880tcttgaaggt caatttgaca attatcgttc aagcaaccca ttatttgaag taacaaatgt 2940tgaatatacg ccagaagtag acagaaatgg cagagtggta ggtggttcac gcacgaacaa 3000tgacgtgcaa gtaactgcca aacgtctaag tgcaggcaat gttgtttatg gcatcagcat 3060gaatgacagt ggtagccgtg ttgcacaaaa cctagacaaa gtacttaatg atttagataa 3120aaaacaagaa acacaaggtt cactgaccag tgatgagaag caatttgcta accgtgtatt 3180cactggtttt gaaaacatga attctggtgc agaatctaaa ctttctacag taagcaccaa 3240ccgtgagcta tacaagcttg acccaacttt ctatgctgac agtgcattaa acgcagtaga 3300agacagtgct aaccatgcaa ccgaatttgg taagcgtgtt agcgccccaa gaggtgtttg 3360gggtaatatc agtcaccatg attatgatgt agaactagag catgctacaa gtgcacgtaa 3420aggcaacaac attagtgttg gtgcaagcac tcaaactgca gccgacatta gtgttggtgc 3480acaacttgat gtaagtaaac ttgacttgga agaatctgtt tatggtattg gcaacaaaac 3540caaaactgac agcattggct tgactgttgg tgcttctaag aagttgggtg atgcctatct 3600atcaggttgg gtaaaaggtg ccaaagttga tacagaagcg aaccgtggtg aaaactctaa 3660caaagttgag tacaatggta agctatatgg tgctggtatc caagcgggta caaacattga 3720tactgcatcg ggcgtgagtg tacaacctta tgcctttgtt aaccatcagc agtacaaaaa 3780cgatggtagc ttcaatgacg gtcttaacgt tgttgacgac atcgaagcaa aacaaactca 3840ggtaggtgtg ggtgctgata tggtgttcca agcaacacct gctctacagc ttactggtgg 3900tgtgcaagtt gctcacgctg ttagccgtga caccaaccta gacactcgct atgttggtac 3960agcgacagat gtacagtatg gcacttggga tactgacaaa accaaatggt cagccaaggt 4020tggtgctaac tataatgtga caccaaacag ccaagtgggt ctaaactaca gctacacagg 4080ta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    435                 440                 445Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Asn Asn Ile Gly Glu Leu Ala Gly Ile
450                 455                 460Thr Lys Leu Gly Glu Arg Ile Lys Ser Gly Lys Ala Tyr Ala Asp Ala465                 470                 475                 480Phe Glu Asp Gly Lys Lys Val Glu Ala Gly Ser Asn Ile Thr Leu Asp
            485                 490                 495Ala Lys Thr Gly Ile Ile Asp Ile Ser Asn Ser Asn Gly Lys Lys Thr
        500                 505                 510Gln Ala Leu His Phe Thr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Gly Thr Glu Ser
    515                 520                 525Arg Glu Arg Leu Thr Asn Gly Lys Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Leu Lys
530                 535                 540Phe Gly Arg Val Lys Asn Trp Gln Val Thr Asp Gly Glu Ala Ser Ser545                 550                 555                 560Lys Leu Asp Phe Ser Lys Val Ile Gln Arg Val Ala Glu Thr Glu Gly
            565                 570                 575Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Val Asn Ala Lys Ala Gly Asn Asp Asp
        580                 585                 590Ile Phe Val Gly Gln Gly Lys Met Asn Ile Asp Gly Gly Asp Gly His
    595                 600                 605Asp Arg Val Phe Tyr Ser Lys Asp Gly Gly Phe Gly Asn Ile Thr Val
610                 615                 620Asp Gly Thr Ser Ala Thr Glu A la Gly Ser Tyr Thr Val Asn Arg Lys625                 630                  635                 640Val Ala Arg Gly Asp Ile Tyr His Glu Val Val Lys Arg Gln Glu Thr
            645                 650                 655Lys Val Gly Lys Arg Thr Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Asp Tyr Glu Leu
        660                 665                 670Arg Lys Val Gly Tyr Gly Tyr Gln Ser Thr Asp Asn Leu Lys Ser Val
    675                 680                 685Glu Glu Val Ile Gly Ser Gln Phe Asn Asp Val Phe Lys Gly Ser Lys
690                 695                 700Phe Asn Asp Ile Phe His Ser Gly Glu Gly Asp Asp Leu Leu Asp Gly705                 710                 715                 720Gly Ala Gly Asp Asp Arg Leu Phe Gly Gly Lys Gly Asn Asp Arg Leu
            725                 730                 735Ser Gly Asp Glu Gly Asp Asp Leu Leu Asp Gly Gly Ser Gly Asp Asp
        740                 745                 750Val Leu Asn Gly Gly Ala Gly Asn Asp Val Tyr Ile Phe Arg Lys Gly
    755                 760                 765Asp Gly Asn Asp Thr Leu Tyr Asp Gly Thr Gly Asn Asp Lys Leu Ala
770                 775                 780Phe Ala Asp Ala Asn Ile Ser Asp Ile Met Ile Glu Arg Thr Lys Glu785                 790                 795                 800Gly Ile Ile Val Lys Arg Asn Asp His Ser Gly Ser Ile Asn Ile Pro
            805                 810                 815Arg Trp Tyr Ile Thr Ser Asn Leu Gln Asn Tyr Gln Ser Asn Lys Thr
        820                 825                 830Asp His Lys Ile Glu Gln Leu Ile Gly Lys Asp Gly Ser Tyr Ile Thr
    835                 840                 845Ser Asp Gln Ile Asp Lys Ile Leu Gln Asp Lys Lys Asp Gly Thr Val
850                 855                 860Ile Thr Ser Gln Glu Leu Lys Lys Leu Ala Asp Glu Asn Lys Ser Gln865                 870                 875                 880Lys Leu Ser Ala Ser Asp Ile Ala Ser Ser Leu Asn Lys Leu Val Gly
            885                 890                 895Ser Met Ala Leu Phe Gly Thr Ala Asn Ser Val Ser Ser Asn Ala Leu
        900                 905                 910Gln Pro Ile Thr Gln Pro Thr Gln Gly Ile Leu Ala Pro Ser Val
    915                 920                 925<210>6<211>3231<212>DNA<213>牛莫拉氏菌<400>6atgagaacgt tattttcaga tgaattgttt agagcgattc gtgtagatgg aaattcatcg 60catggtaaga tatctgaatt ttatggaaag tctgttgatt caaaattagc ctcaagaata 120tttgcacaat atcacgaaga tttgacgagc aaattgtcaa ctcagaataa ttttattata 180tctaaagata attaatacaa ccttttctaa cacaacgagg agagacatat tatgtccaat 240ataaatgtaa ttaaatctaa tattcaagca ggcttgaatt caacaaagtc tggattaaaa 300aatctttact tggctattcc caaagattat gatccgcaaa aaggtgggac tttaaatgat 360tttattaaag ctgctgatga attaggtatt gctcgtttag cagaagagcc taatcacact 420gaaacagcaa aaaaatctgt tgacacagta aatcagtttc tctctctcac acaaactggt 490attgctattt ctgcaacaaa attagaaaag ttcttacaaa aacattctac caataagtta 540gccaaagggt tagacagtgt agaaaatatt gatcgtaaat taggtaaagc aagtaatgta 600ttatcaacat taagctcttt tttgggcact gcattagcgg gtatagaact tgattcttta 660atcaaaaaag gtgatgctgc acctgatgct ttggctaaag ctagtattga cttgattaat 720gagataattg gtaatctatc tcagagtact caaacgattg aagcattttc ttcacagtta 780gcaaagttag gttctactat atcgcaggct aaaggcttct ctaatatagg aaacaagttg 840caaaacttaa atttttctaa aacaaatctt ggtttggaaa taattactgg tttgctatca 900ggcatttctg caggctttgc tttagcggat aaaaatgcat cgactggcaa aaaagttgct 960gcaggttttg aattaagcaa tcaagttatt ggtaatgtaa caaaagcaat ttcttcatat 1020gttttagcac aacgtgttgc tgctggtcta tcaactactg gtgctgttgc tgctttaatt 1080acttcatcga ttatgttggc aattagtcct ttggcattta tgaatgcagc agataaattc 1140aatcatgcta atgctcttga tgagtttgca aaacaattcc gaaaatttgg ctatgatggg 1200gatcatttat tggctgaata tcagcgtggt gtgggtacta ttgaagcttc attaactaca 1260attagtacgg cattaggtgc agtttctgct ggtgtttccg ctgctgctgt aggatctgct 1320gttggtacac cgattgcact attagttgca ggtgttacag gattgatctc tggaatttta 1380gaagcgtcta aacaggcaat gtttgaaagt gttgctaacc gtttacaagg taaaatttta 1440gagtgggaaa agcaaaatgg cggtcagaac tattttgata aaggctatga ttctcgttat 1500gctgcttatt tagctaataa cttaaaattt ttgtctgagc taaataaaga gttggaagct 1560gaacgtgtta ttgcaatcac ccaacaacgt tgggataata atattggtga gttagcaggt 1620attaccaaat tgggtgaacg cattaagagc ggaaaagctt atgcagatgc ttttgaagat 1680ggcaagaaag ttgaagctgg ttccaatatt actttggatg ctaaaactgg tatcatagac 1740attagtaatt caaatgggaa aaaaacgcaa gcgttgcatt tcacttcgcc tttgttaaca 1800gcaggaactg aatcacgtga acgtttaact aatggtaaat actcttatat taataagtta 1860aaattcggac gtgtaaaaaa ctggcaagtt acagatggag aggctagttc taaattagat 1920ttctctaaag ttattcagcg tgtagccgag acagaaggca cagacgagat tggtctaata 1980gtaaatgcaa aagctggcaa tgacgatatc tttgttggtc aaggtaaaat gaatattgat 2040ggtggagatg gacacgatcg tgtcttctat agtaaagacg gaggatttgg taatattact 2100gtagatggta cgagtgcaac agaagcaggc agttatacag ttaatcgtaa ggttgctcga 2160ggtgatatct accatgaagt tgtgaagcgt caagaaacca aggtgggtaa acgtactgaa 2220actatccagt atcgtgatta tgaattaaga aaagttgggt atggttatca gtctaccgat 2280aatttgaaat cagtagaaga agtaattggt tctcaattta atgatgtatt caaaggttct 2340aaattcaacg acatattcca tagtggtgaa ggtgatgatt tactcgatgg tggtgctggt 2400gacgaccgct tgtttggtgg taaaggcaac gatcgacttt ctggagatga aggcgatgat 2460ttactcgatg gcggttctgg tgatgatgta ttaaatggtg gtgctggtaa tgatgtctat 2520atctttcgga aaggtgatgg taatgatact ttgtacgatg gcacgggcaa tgataaatta 2580gcatttgcag atgcaaatat atctgatatt atgattgaac gtaccaaaga gggtattata 2640gttaaacgaa atgatcattc aggtagtatt aacataccaa gatggtacat aacatcaaat 2700ttacaaaatt atcaaagtaa taaaacagat cataaaattg agcaactaat tggtaaagat 2760ggtagttata tcacttccga tcaaattgat aaaattttgc aagataagaa agatggtaca 2820gtaattacat ctcaagaatt gaaaaagctt gctgatgaga ataagagcca aaaattatct 2880gcttcggaca ttgcaagtag cttaaataag ctagttgggt caatggcact atttggtaca 2940gcaaatagtg tgagttctaa cgccttacag ccaattacac aaccaactca aggaattttg 3000gctccaagtg tttagtgatt taatttacta gacaatatca ccacccatat cattggttat 3060agattatgaa actagtgata tgggtggtga tacttcttta attagactta atttacaaac 3120ccttaatagt aatttagtta tgatagatta tgctcaacaa cctgctctat ctgctctggt 3180tatccttgcc aaatactatg gtatttctgc aagtccagca gacattatgc a          3231<210>7<211>17<212>PRT<213>牛莫拉氏菌<220><221>misc_特征<222>(14) (16)<223>Xaa＝未知<400>7Lys Glu Phe Ser Gln Val Ile Ile Phe Gly Asp Ser Leu Xaa Asp Xaa1               5                  10                  15Gly<210>8<211>64<212>PRT<213>牛莫拉氏菌<400>8Met Arg Thr Leu Phe Ser Asp Glu Leu Phe Arg Ala Ile Arg Val Asp1               5                  10                  15Gly Asn Ser Ser His Gly Lys Ile Ser Glu Phe Tyr Gly Lys Ser Val
         20                  25                  30Asp Ser Lys Leu Ala Ser Arg Ile Phe Ala Gln Tyr His Glu Asp Leu
     35                  40                  45Thr Ser Lys Leu Ser Thr Gln Asn Asn Phe Ile Ile Ser Lys Asp Asn
 50                  55                  60<210>9<211>57<212>PRT<213>牛莫拉氏菌<400>9Met Gly Gly Asp Thr Ser Leu Ile Arg Leu Asn Leu Gln Thr Leu Asn1               5                  10                  15Ser Asn Leu Val Met Ile Asp Tyr Ala Gln Gln Pro Ala Leu Ser Ala
         20                  25                  30Leu Val Ile Leu Ala Lys Tyr Tyr Gly Ile Ser Ala Ser Pro Ala Asp
     35                  40                  45Ile Met His Arg Leu Ala Lys Lys Leu
 50                  55

Claims (38)

1、多肽，该多肽具有如SEQ.ID.NO.1氨基酸37至1114所述氨基酸序列、或与之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
2、如权利要求1所要求保护的多肽，该多肽具有与SEQ.ID.NO.1氨基酸37至1114所示序列的同一性为至少70％的序列。
3、如权利要求1所要求保护的多肽，该多肽具有与SEQ.ID.NO.1氨基酸37至1114所示序列的同一性为至少80％的序列。
4、如权利要求1所要求保护的多肽，该多肽具有与SEQ.ID.NO.1氨基酸37至1114所示序列的同一性为至少90％的序列。
5、如权利要求1至4任意一项所要求保护的多肽，该多肽具有蛋白酶活性。
6、核酸分子，该核酸分子包含编码如权利要求1至5任意一项所要求保护的多肽的序列。
7、核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.2所述序列、或与之具有至少60％同一性的序列、或在严格条件下与之杂交的序列。
8、如权利要求7所要求保护的核酸分子，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性为至少70％的序列。
9、如权利要求7所要求保护的核酸分子，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性为至少80％的序列。
10、如权利要求7所要求保护的核酸分子，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性为至少90％的序列。
11、用于提高动物免疫应答的组合物，该组合物包含如权利要求1至5任意一项所要求保护的多肽或如权利要求6所要求保护的的核酸序列和可选的载体和/或佐剂。
12、多肽，该多肽具有如SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所述氨基酸序列、或与之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
13、如权利要求12所要求保护的多肽，该多肽具有与SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所示序列的同一性为至少70％的序列。
14、如权利要求12所要求保护的多肽，该多肽具有与SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所示序列的同一性为至少80％的序列。
15、如权利要求12所要求保护的多肽，该多肽具有与SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所示序列的同一性为至少90％的序列。
16、如权利要求12至15任意一项所要求保护的多肽，该多肽具有脂肪酶活性。
17、核酸分子，该核酸分子包含编码权利要求12至16任意一项的多肽的序列。
18、核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.4所述序列、或与之具有至少60％同一性的序列、或在严格条件下与之杂交的序列。
19、如权利要求18所要求保护的核酸分子，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性为至少70％的序列。
20、如权利要求18所要求保护的核酸分子，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性为至少80％的序列。
21、如权利要求18所要求保护的核酸分子，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性为至少90％的序列。
22、用于提高动物免疫应答的组合物，该组合物包含如权利要求12至16任意一项所要求保护的多肽或如权利要求17所要求保护的核酸序列和可选的载体和/或佐剂。
23、多肽，该多肽具有如SEQ.ID.NO.5所述氨基酸序列、或与之具有至少60％同一性的序列、或其功能片段。
24、如权利要求23所要求保护的多肽，该多肽具有与SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性为至少70％的序列。
25、如权利要求23所要求保护的多肽，该多肽具有与SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性为至少80％的序列。
26、如权利要求23所要求保护的多肽，该多肽具有与SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性为至少90％的序列。
27、如权利要求23至26任意一项所要求保护的多肽，该多肽具有溶血素活性。
28、核酸分子，该核酸分子包含编码权利要求23至27任意一项的多肽的序列。
29、核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.6所述序列、或与之具有至少60％同一性的序列、或在严格条件下与之杂交的序列。
30、如权利要求29所要求保护的核酸分子，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性为至少70％的序列。
31、如权利要求29所要求保护的核酸分子，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性为至少80％的序列。
32、如权利要求29所要求保护的核酸分子，该核酸分子具有与SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性为至少90％的序列。
33、用于提高动物免疫应答的组合物，该组合物包含权利要求23至27任意一项的多肽或权利要求28的核酸序列和可选的载体和/或佐剂。
34、用于提高动物针对莫拉氏菌属的免疫应答的组合物，该组合物包含至少一种多肽，选自由如权利要求1至5任意一项所要求保护的多肽、如权利要求12至16任意一项所要求保护的多肽和如权利要求23至27任意一项所要求保护的多肽组成的组，可选地还包括佐剂或载体。
35、如权利要求34所要求保护的组合物，该组合物包含如 23至27任意一项所要求保护的多肽，以及如权利要求1至5任意一项所要求保护的多肽与如权利要求12至16任意一项所要求保护的多肽二者之一，或优选地二者皆是。
36、如权利要求34或权利要求35所要求保护的组合物，其中该莫拉氏菌是牛莫拉氏菌或黏膜炎莫拉氏菌。
37、如权利要求34或权利要求35所要求保护的组合物，其中该莫拉氏菌是牛莫拉氏菌。
38、针对多肽而产生的抗体，该多肽选自由如权利要求1至5任意一项所要求保护的多肽、如权利要求12至16任意一项所要求保护的多肽和如权利要求23至27任意一项所要求保护的多肽组成的组。
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