CN1261403A

CN1261403A - 新的肺炎衣原体表面蛋白

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Publication number: CN1261403A
Application number: CN98806428A
Authority: CN
Inventors: 斯万德·伯克伦德; 根纳·克里斯蒂安森; K·克努森; A－S·赫布斯加德·彼泽森; P·迈金迪
Original assignee: LOCK DIAGNOSIS APS
Current assignee: LOCK DIAGNOSIS APS
Priority date: 1997-06-23
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2000-07-26
Anticipated expiration: 2018-06-19
Also published as: ES2264810T3; US20080226679A1; AU8011998A; WO1998058953A2; EP1007685B1; DE69834194T2; CN1249233C; PT1007685E; AU749382B2; EP1007685A2; CA2294651A1; DK1007685T3; ATE323164T1; DE69834194D1; BR9810288A; JP2002510970A; WO1998058953A3; JP4160640B2; US7264941B1

Abstract

本发明涉及对来自人呼吸道病原体肺炎衣原体的、编码大小约为89—101kDa和56—57kDa(较佳的约为89.6—100.3kDa和约为56.1kDa)的表面膜蛋白的基因家族成员的鉴定。本发明涉及新的DNA序列,对应蛋白质的推定的氨基酸序列,以及该DNA序列和蛋白在病理学和流行病学上诊断由肺炎衣原体引起的感染的用途,以及作为疫苗组分的用途。

Description

新的肺炎衣原体表面蛋白

本发明涉及人呼吸道病原体肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的、编码大小约为89-101kDa和56-57kDa(较佳的约为89.6-100.3kDa和约为56.1kDa)的表面(surfaceexposed)膜蛋白的基因家族成员的鉴定。本发明涉及新的DNA序列，其对应蛋白质的推定的氨基酸序列，以及该DNA序列和蛋白在病理学和流行病学上诊断由肺炎衣原体引起的感染和作为疫苗组分的用途。

总体背景

肺炎衣原体是专性胞内细菌(Christiansen和Birkelund(1992)；Grayston等人，(1986))。它具有和革兰阴性菌一样的细胞壁结构，具有外膜、周质间隙和胞质膜。用洗涤剂十二烷基肌氨酸钠可以纯化革兰阴性菌的外膜。该组分被命名为“外膜复合物(OMC)”(Caldwell等人，(1981))。肺炎衣原体的COMC(衣原体外膜复合物)含有四组蛋白质：经SDS-PAGE测得的98kDa高分子量蛋白、62/60kDa的富含半胱氨酸的外膜蛋白2(Omp2)的两条条带、38kDa的主要外膜蛋白(MOMP)、以及12kDa的低分子量脂蛋白Omp3。Omp2/Omp3和MOMP蛋白存在于所有衣原体种类的COMC中，已经从沙眼衣原体(C.trachomtis)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和肺炎衣原体中克隆出这些基因。然而编码肺炎衣原体COMC中98kDa蛋白的基因还未被鉴别或克隆。

肺炎衣原体血清学和鉴定的现有状况

肺炎衣原体是一种专性胞内细菌，属于衣原体属，该衣原体属可以分为四种：沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和C.pecorum。四个种类的共同之处是它们在细胞内的专性生长，且它们具有胞外感染性颗粒(原体，EB)和胞内复制形式(网状体，RB)的双相生命周期。另外，衣原体种类的特征是在人类感染中高度免疫原性的共同脂多糖(LPS)表位。沙眼衣原体引起人眼感染(沙眼)和生殖感染。鹦鹉热衣原体是一类可变的动物病原体，其中的禽株偶尔会感染人并引起严重的肺炎鸟疫。第一个肺炎衣原体分离物从眼感染获得，但是它被归类为非典型(non-typable)的衣原体。在芬兰肺炎流行性爆发时，发现患者在衣原体属特异性测试(淋巴肉芽肿皮肤试验抗原测试)中有阳性反应，且患者表现非典型的衣原体分离物的滴度升高。在西雅图上呼吸道感染爆发时获得了类似的分离物，该衣原体分离物归类为一种新的种类肺炎衣原体(Grayston等人，1989)。另外，有人指出肺炎衣原体涉及到粥样动脉硬化病变发展和刺激性支气管哮喘(Kuo等人，1995)。这两种病症被认为是由于慢性感染或过敏反应或两者共同引起的。

肺炎衣原体感染的诊断

诊断肺炎衣原体引起的急性呼吸道感染是困难的。对患者样品的肺炎衣原体培养是不敏感的，甚至是选择合适的组织培养细胞未分离时也如此。因此Campbell等人(1992)开发出一种肺炎衣原体特异性的聚合酶链反应(PCR)。

尽管在一些研究中已经用该PCR方法检测了肺炎衣原体，但是该方法是否适用于所有的临床场合仍有争论。其原因是，急性呼吸道感染中携带肺炎衣原体的细胞还未确定，且预计会有慢性携带状态，只是不知道它们存在于哪些器官和细胞中。另外，PCR测试很难进行，因为这些细菌的产量很低，且患者样品中存在抑制性的物质。因此，开发出敏感的、特异性的血清型诊断方法来检测急性和慢性感染是将会有很大价值。衣原体感染的血清学诊断方法目前是基于属特异性的测试(如淋巴肉芽肿皮肤试验抗原测试和ELISA(测定LPS的抗体))，或是更特异性的种属测试(用微量免疫荧光法(Micro-IF)测定针对纯化的EB的抗体)(Wang等人，1970)。然而，微量免疫荧光法要用显微镜来读数，且为了确保有正确的读数，必须将结果与用作抗原(由于与共有的LPS表位的交叉反应抗体)的沙眼衣原体的结果比较。因此，正如Kuo等人(1995)年所表述的，“本领域中主要需要一种用于临床实验室的测试感染的迅速、可靠实验室方法”，本领域迫切需要开发出用于针对肺炎衣原体的种特异性诊断方法。另外，肺炎衣原体可能涉及粥样动脉硬化和支气管哮喘显然也使得开发有效的疫苗有正当的理由。

发明详细公开

本发明的目的是提供有效诊断肺炎衣原体感染的方法以及开发出有效抵抗该微生物感染的疫苗。因此，本发明涉及种特异性的哺乳动物(如人)体内肺炎衣原体感染的诊断测试方法，所述测试是根据对抗体进行检测，该抗体针对大小约为89-101kDa和56-57kDa(较佳的约为89.6-100.3kDa和56.1kDa)(推导的氨基酸序列的大小范围为100.3至89.6，除大小为56.1的Omp13外)的表面膜蛋白，或是基于对编码该蛋白或其变体或亚序列的核酸片段进行检测。本发明还涉及本发明蛋白的氨基酸序列，其变体和亚序列，以及编码这些蛋白或其变体或亚序列的核酸片段。本发明还涉及针对本发明蛋白的抗体。本发明还涉及本发明的核酸片段和蛋白在诊断肺炎衣原体以及抗肺炎衣原体疫苗中的用途。

在本发明公开前，只有很少的肺炎衣原体基因被测序。它们主要是编码已知的沙眼衣原体同系物(MOMP、Omp2、Omp3、Kdo转移酶)的基因、热休克蛋白基因GroEl/Es和Dnak(一种核酸酶P同系物)和编码功能未知的76kDa蛋白的基因。为何至今只有如此少的基因被克隆的原因是因为从宿主细胞纯化后能获得的肺炎衣原体的产量非常低。在这种纯化后，DNA必须从EB中纯化出，而在此步骤肺炎衣原体DNA容易被宿主细胞DNA污染。除了这些固有的困难外，培育肺炎衣原体并用DNA技术产生很少数量(几个μ)DNA的表达文库非常困难。自1993年起已经知道(Melgosa等人，1993)，98kDa的蛋白存在于肺炎衣原体的OMC中。尽管Melgosa提到98kDa的蛋白条带是肺炎衣原体OMC的一部分，但是其基因序列以及推导的氨基酸序列一直未被确定。该文中只描述了用SDS-PAGE大致分离出的肺炎衣原体蛋白的条带。然而，在本发明前，编码该蛋白的基因一直未被确定。发现98kDa蛋白与人血清只有很弱的反应或没有反应(Campbell等人，1990)，在本发明者的工作之前，还没有认识到89-101kDa蛋白是表面外露的或它们实际上有免疫原性。在该报道中描述了许多人血清样品能与SDS-PAGE中迁移至98kDa的肺炎衣原体蛋白反应。该蛋白没有进一步作特性分析，因此它与本申请没有冲突。

Halme等人1997年描述了92-98kDa肺炎衣原体蛋白中存在人T细胞表位。从总衣原体蛋白的SDS-PAGE中洗脱出该蛋白，但是该蛋白的身份没有被确定。

用抗体来筛选表达文库是克隆编码蛋白的抗原性部分基因片段众所周知的方法。然而，由于患者的血清没有表现出与98kDa蛋白有明显的反应，因此不可能用患者血清来克隆该蛋白。

已知由发明者获得的单克隆抗体能与肺炎衣原体表面上的构象表位反应，它们还与肺炎衣原体OMC反应(经免疫电子显微镜测得)(Christiansen等人，1994)。另外，98kDa蛋白是肺炎衣原体OMC中唯一未知的蛋白(Melgosa等人，1993)。本发明者选择采用非常规的步骤来克隆编码至今未知的98kDa蛋白的基因：纯化肺炎衣原体OMC，在免疫接种前用SDS处理抗原破坏免疫原性构象表位。从而获得对免疫原性较低的线性表位的抗体(PAB150)。这提供了获得能检测该蛋白的抗血清的可能性，并表明编码本发明的89-101kDa和56kDa蛋白的基因家族能在重组体大肠杆菌的菌落印迹中检测到。

肺炎衣原体感染的小鼠产生了针对发明者鉴定并命名为Omp4-15的抗体，但是不识别通常用于SDS-PAGE和免疫印迹的经SDS处理热变性的抗原。但是，如果抗原没有热变性，则可见到强反应。因此，如果在人感染中见到类似的反应，则本发明的抗原很有可能在血清诊断测试中具有不可估量的用途，并且很可能用作预防感染的疫苗。

通过产生针对肺炎衣原体COMC的抗体，获得与所有蛋白反应的多克隆抗体(PAB150)。用该抗体鉴别肺炎衣原体DNA表达文库中编码89.6-101.3kDa和56.1kDa的基因。与本发明有关的一个问题是在肺炎衣原体中发现了包含许多类似基因的一个家族。因此，需要大量不同的克隆来鉴别诸片段簇。本发明者成功克隆并测序以上四个基因只是因为用SDS-变性抗原产生的家兔抗体含有针对位于该蛋白家族不同成员中的许多不同表位的抗体。通过该方法，一个基因已被完全测序，第二个基因除远部外已测序，并获得了两个附加基因的更短的片段。为了获得附加基因的DNA序列并搜寻该基因家族的更多成员，用测序基因衍生的引物和数据库中已经公开基因的引物进行长范围(long range)PCR。该方法检测到属于该家族的另外8个基因。这些基因位于两个基因簇中：Omp12，11，10，5，4，13和14在一个簇中，Omp6，7，8，9和15在第二个簇中。从Omp4，5，6，7，8，9，10，11和13获得全序列，并获得Omp12，14部分序列。Omp13是1545核苷酸的截短的基因，全长基因的其余部分为2526(Omp7)至2838(Omp15)的核苷酸。推导的氨基酸序列揭示，推定的多肽为89.6至100.3kDa，除Omp13为56.1kDa外。与所有序列相比，推导的氨基酸序列的排列表现出最大相同性为49％(Omp5/Omp9)。除了Omp13外，最低的同源性是Omp7与其它任何氨基酸序列的相同性不到34％。Omp13与所有其它序列的同源性评分为29-32％。

在本文中，SEQ ID NO：1和2对应于Omp4，SEQ ID NO：3和4对应于Omp5，SEQ ID NO：5和6对应于Omp6，SEQ ID NO：7和8对应于Omp7，SEQ ID NO：9和10对应于Omp8，SEQ ID NO：11和12对应于Omp9，SEQ ID NO：13和14对应于Omp10，SEQ ID NO：15和16对应于Omp11，SEQ ID NO：17和18对应于Omp12，SEQ ID NO：19和20对应于Omp13，SEQ ID NO：21和22对应于Omp14，SEQ ID NO：23和24对应于Omp15。

下面列出了本发明的Omp蛋白估计的大小。Omp4的大小为98.9kDa，Omp5的估计大小为97.2kDa，Omp6的估计大小为100.3kDa，Omp7的估计大小为89.7kDa，Omp8的估计大小为90.0kDa，Omp9的估计大小为96.7kDa，Omp10的估计大小为98.4kDa，Omp11的估计大小为97.6kDa，Omp13的估计大小为56.1kDa，Omp12和Omp14为一部分。

另外，SEQ ID NO：25是SEQ ID NO：3的亚序列，SEQ ID NO：26是SEQ ID NO：4的亚序列，SEQ ID NO：27是SEQ ID NO：5的亚序列，SEQ ID NO：28是SEQ ID NO：6的亚序列，SEQ ID NO：29是SEQ ID NO：7的亚序列，SEQ ID NO：30是SEQ ID NO：8的亚序列。

部分omp蛋白以融合蛋白形式表达并产生了针对这些蛋白的小鼠多克隆单特异性抗体。这些抗体在免疫荧光和免疫电镜法中与肺炎衣原体的表面反应。这第一次表明肺炎衣原体中89-101kDa和56-57kDa蛋白家族包含表面的外膜蛋白。这一重要发现导致这样一个认识，即89-101kDa和56-57kDa肺炎衣原体蛋白家族成员是开发血清学诊断测试肺炎衣原体、以及开发抵抗肺炎衣原体感染的疫苗(根据采用这些蛋白)的优秀的候选物。另外，这些蛋白可用作流行病学标记，针对这些蛋白的多克隆单特异性血清可用来检测人组织中的肺炎衣原体或用来检测组织培养物中的肺炎衣原体分离物。另外，编码89-101kDa和56-57kDa(如89.6-100.3kDa和56.1蛋白家族)的基因可用来开发基于核酸检测/扩增的种特异性诊断测试。

将全长Omp14克隆到允许Omp4多肽表达的表达载体系统中。用该多肽作为抗原来免疫家兔。由于该蛋白在变性条件下纯化，因此其抗体不与肺炎衣原体天然表面反应，但是在采用纯化的肺炎衣原体EB作为抗原的免疫印迹中，它和98kDa蛋白反应。另外，抗体在试验性感染小鼠的石蜡包埋肺组织切片中反应。

本发明较宽的方面涉及种特异性地诊断测试肺炎衣原体感染哺乳动物(如人)的方法，所述测试方法包括检测患者体内或较佳的是患者样品中是否存在针对分子量为89-101kDa或56-57kDa的肺炎衣原体外膜蛋白的抗体，或检测是否存在编码所述外膜蛋白或其片段的核酸片段。

在本申请的内容中，术语“患者样品”应指患者(如人患者)的一定量的血清、血浆、粘液、组织、咳出物、强迫咳出的痰液或支气管吸出物、尿液、脑脊髓液、粥样动脉硬化病灶、粘膜拭子(mucosal swap)、来自所述患者的组织培养的细胞、或以任何方式源自所述患者的物质。本发明的人体内测试包括本领域中已知的皮肤测试，如真皮内测试，例如类似于Mantaux测试。在对于测试非常敏感的某些患者(通常情况是儿童)体内，测试可以是非侵入型的，例如用膏药在皮肤表面测试。

在本文中，术语89-101kDa蛋白指通常在肺炎衣原体外膜中的蛋白，其在SDS-PAGE中所见的一条或多条条带，表观分子量基本上在89-101kDa范围内。根据推导的氨基酸序列，分子大小在89.6-100.3kDa之间不等。

基于利用属于本申请书公开的基因家族的基因的种特异性血清诊断测试在本发明的范围内。

本发明的较佳实例涉及本发明的种特异性诊断测试，其中外膜蛋白具有选自SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24的序列。

当采用本发明的蛋白时，术语“变体”应理解成表现出与本发明的某一种蛋白的相似性低于100％的氨基酸序列。变体序列的大小可以和与之比较的序列相同或不同。变体通常宜表现出序列相似性至少为50％，较佳的至少60％，更佳的至少70％，例如至少80％、90％、95％或98％。

关于本发明蛋白序列的术语“序列相似性”指本发明蛋白和长度相同或不同的对比蛋白中相同的和保守性变化的氨基酸残基(在位置和类型上)的百分数。关于本发明蛋白序列的术语“序列相同性”指本发明蛋白和长度相同或不同的对比蛋白中在位置和类型上相同的氨基酸的百分数。

在本发明的范围内，本发明的一种蛋白的亚序列是指取自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24的氨基酸残基的连续序列。一个亚序列通常包含至少100个氨基酸，较佳的至少80个氨基酸，更佳的至少70个氨基酸，如50个氨基酸。它甚至可以短达10-50个氨基酸，例如20-40个氨基酸，例如约30个氨基酸。亚序列通常表现出的序列同源性至少为50％，较佳的至少为60％，更佳的至少70％，例如至少80％，如至少90％，95％或98％。

本发明的诊断测试所包括的免疫试验选自直接或间接的EIA(如ELISA)、免疫印迹技术(如Western印迹)、放射免疫试验和其它任何非酶联抗体结合试验或诸如荧光、凝集或沉淀反应的程序，以及比浊法。

本发明的一个较佳实例涉及本发明的种特异性诊断测试，所述测试包括ELISA，其中检测样品中针对本发明蛋白或其片段的抗体。

本发明的一个较佳的实例是以检测样品中针对本发明蛋白的抗体为基础的ELISA。该ELISA可采用本发明的蛋白或其变体(即抗原)作为包被试剂。ELISA通常根据本领域熟知的标准方法(例如David Lane Harlow编辑的“抗体实验手册”(ColdSpring Habor laboratories，1988)中所述的方法，该文纳入本文作参考)来进行。

重组蛋白可用按照下文实施例中所述的方法获得的DNA序列来生产。这些DNA序列(包括本发明基因家族中每个基因的整个编码区)将被克隆到表达载体中，从该表达载体中可以纯化获得推导的蛋白序列。在ELISA中用单克隆和多克隆抗体以及实验性感染的小鼠的血清和人患者的血清分析纯化获得的蛋白的反应性。

从实验性感染的小鼠血清的反应性知道，它主要识别的是非线性表位。因此，可以考虑用本领域中已知的不同形式的纯化方案来分析不连续表位的存在，和分析人免疫应答是否也针对这类表位。

本发明的较佳实例涉及本发明的种特异性诊断测试，其中核酸片段具有选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23的序列。

关于本发明的核酸片段，术语“变体”应理解成表现出的序列同源性低于100％的核酸序列。变体序列的大小可以和与之比较的序列相同或不同。变体通常宜表现出序列同源性至少为50％，较佳的至少60％，更佳的至少70％，例如至少80％、90％、95％或98％。

关于本发明的核酸片段，术语“序列同源性”指本发明的核酸片段中的核酸在位置和类型上与长度相同或不同的序列对比时相匹配核酸百分数。

为了获得关于本发明每个基因总体分布的信息，对于所有可获得的肺炎衣原体分离物上的每个基因进行PCR。这将提供关于本发明的基因或核酸片段的总体变化性的信息。对可变区测序。可用PCR从患者样品扩增出流行病学基因的可变部分。不变的部分可用来PCR扩增和分析用于诊断测试的可能性。预计，如果发现可变性，则可变区的PCR可用于流行病学。不变区的PCR可用作种特异性诊断测试。用编码所有已知分离物中不变蛋白的基因作为PCR的靶来制备编码功能未知蛋白的基因。

本发明的特别佳的实例涉及本发明的诊断测试，其中利用核酸扩增、较佳的是聚合酶链反应(PCR)来检测核酸片段。

以PCR为基础的测试在本发明的范围内，该测试的目的是检测本发明的核酸片段或其变体。PCR测试通常根据本领域熟知的方法来进行，其通常包括能检测和区别本发明的核酸片段的PCR测试。较佳的是定量的竞争性PCR测试或嵌套式PCR测试。本发明的PCR测试通常根据EPB540588、EPA586112、EPA643140或EPA669401中详细描述的方法来设计，这些专利均纳入本文作参考。

在本发明的范围内，本发明的一种核酸片段的变体和亚序列指取自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23的连续延伸核酸。变体或亚序列宜包含至少100个核酸，较佳的至少80个核酸，更佳的至少70个核酸，例如至少50个核酸。它甚至可以短达10-50个核酸，例如20-40个核酸，例如约30个核酸。亚序列通常表现出至少30％的序列同源性，较佳的为至少60％，更佳的为至少70％，例如至少80％，如至少90％、95％或98％。亚序列越短，所需的同源性越高。因此，100个核酸或更少的亚序列必须表现出至少80％的同源性。

本发明的一个非常重要的方面涉及本发明衍生自肺炎衣原体的蛋白，该蛋白具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24，具有的序列相似性至少为50％，较佳的至少60％，更佳的至少70％，例如至少80％，如至少90％、95％或98％，并具有类似的生物功能。

术语“类似的生物功能”指该蛋白表现出类似于可从肺炎衣原体膜蛋白衍生获得的蛋白的性质特征。这些蛋白包括GGAI的重复基序(至少2个，较佳的至少3个重复序列)和/或保守的色氨酸(w)位置。

比较编码Omp4-15的基因的DNA序列，结果表明，单个基因之间的总体相似性范围在43-55％之间。比较Omp4-15的氨基酸序列结果表明相同性为34-49％，相似性为53-64％。同源性一般沿推导的氨基酸整个长度分散散布。然而，从图8A-J看出，存在一些区域其同源性更明确。这见于重复序列中，其中序列GGAI在基因中重复4-7次。令人感兴趣的是，对于编码四个氨基酸GGAI的序列，DNA同源性并不保守。这可能表明了蛋白该部分的功能性作用，并表明该重复结构并不是由基因复制而产生的。除了四个氨基酸的重复序列GGAI外，氨基酸400-490的区域所具有的同源性要高于该蛋白的其它部分，在所有序列中均有保守序列FYDPI。功能上相似性进一步表明，氨基酸色氨酸(W)在该蛋白C端部分4-6个局部区域完全保守。

由于本发明的基因和推导的氨基酸序列没有一个相同，因此下列内容在本发明的范围内：单特异性抗体的生产，用所述抗体来鉴别哪个肺炎衣原体蛋白被表达，用所述抗体鉴别所述肺炎衣原体蛋白在发育生命周期的何时被表达，用所述抗体鉴定所述肺炎衣原体蛋白的精确的细胞定位。用针对本发明蛋白的单特异性抗体来测定所述蛋白的哪个部分是外露的，肺炎衣原体COMC中的蛋白是怎样相互作用的，这些也在本发明的范围内。

本发明较佳的实例涉及包含本发明蛋白质亚序列的多肽，所述亚序列包含序列GGAI。本发明其它较佳的实例涉及包含本发明蛋白亚序列的多肽，所述亚序列包含序列FSGE。

本发明的多肽的长度通常为至少6个氨基酸，较佳的至少15个氨基酸，较佳的至少20个氨基酸，较佳的至少25个氨基酸，较佳的至少30个氨基酸，较佳的至少35个氨基酸，较佳的至少40个氨基酸，较佳的至少45个氨基酸，较佳的至少50个氨基酸，较佳的至少55个氨基酸，较佳的至少100个氨基酸。

本发明非常重要的一方面涉及本发明衍生自肺炎衣原体的核酸片段，其变体和亚序列。

本发明另一个重要的方面涉及针对本发明蛋白的抗体，这些抗体包括针对具有选自序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24的蛋白的多克隆单特异性抗体和单克隆抗体。

本发明的一个非常重要的方面涉及用来诊断哺乳动物(如人)感染肺炎衣原体的诊断试剂盒，所述试剂盒包含的一种或多种蛋白具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

本发明另一非常重要的方面涉及用来诊断哺乳动物(如人)感染肺炎衣原体的诊断试剂盒，所述试剂盒包含针对具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24的氨基酸序列的蛋白的抗体。本发明的诊断试剂盒中包括的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体或其混合物。

本发明还有一个重要的方面涉及用来诊断哺乳动物(如人)感染肺炎衣原体的诊断试剂盒，所述试剂盒包含具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23的序列的一种或多种核酸片段。

本发明一方面涉及一种用于免疫接种哺乳动物(如人)抵抗肺炎衣原体的组合物，所述组合物包含具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24的氨基酸序列的一种或多种蛋白质。

预计本发明的蛋白在预防哺乳动物(如人)感染肺炎衣原体上有重要作用。因此，通常用重组技术产生本发明的蛋白(包括其变体和亚序列)，然后用作免疫接种哺乳动物(如家兔)的抗原。随后，用组织培养试验分析免疫获得的超级免疫血清抵抗肺炎衣原体的保护作用。另外，可以考虑生产单克隆抗体(通常用标准的杂交瘤技术)，并分析其抵抗肺炎衣原体感染的保护作用。

预计在本发明的蛋白(包括所述蛋白的亚序列)中可以找到特别感兴趣的和免疫原性表位。较佳的是用包含本发明蛋白的这些亚序列的多肽来免疫哺乳动物(如人)以抵抗肺炎衣原体。

本发明的一个重要的方面涉及下述蛋白在诊断哺乳动物(如人)受肺炎衣原体感染中的应用，该蛋白具有的序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24。

本发明的一个较佳的实例涉及非变性形式的本发明蛋白在诊断哺乳动物(如人)受肺炎衣原体感染中的应用。

本发明的一个非常重要的方面涉及下述蛋白在免疫哺乳动物(如人)抵抗肺炎衣原体中的应用，该蛋白具有的序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24。

本发明的一个较佳的实例涉及非变性形式的本发明蛋白在免疫哺乳动物(如人)抵抗肺炎衣原体中的应用。

本发明的一个非常重要的方面涉及下述核酸片段在免疫哺乳动物(如人)抵抗肺炎衣原体中的应用，该核酸片段具有的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23。

预计可以开发出一类用基因枪接种小鼠抗肺炎衣原体的疫苗。通常，含有本发明的核酸片段、核酸片段组合的不同基因构建物可用于基因枪方法。随后分析小鼠产生的体液和细胞免疫应答以及在攻击后其抵抗肺炎衣原体感染的保护作用。

鉴于此，本发明还涉及本发明蛋白作为药物(疫苗)的用途以及用来制备抵抗肺炎衣原体感染的疫苗的用途。

含有蛋白序列作为活性组分的疫苗的制备方法是本领域中所熟知的，例子有美国专利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792和4,578,770，所有这些文献均纳入本文作参考。通常，这些疫苗被制成液体溶液或悬浮液形式的可注射剂；还可制成适合在注射液体前溶于溶液或悬浮液的固体形式。制剂还可乳化。活性免疫组分通常和药学上可接受的并与活性组分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂例如是水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。另外，如果需要，疫苗还可含有少量辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、或增强疫苗效果的佐剂。

疫苗通常是经肠胃外注射给予，例如皮下注射或肌内注射。适用于其它给药方式的其它制剂包括栓剂以及在一些场合下的口服制剂。这些组合物的形式是溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉末，含有10-95％(较佳的为25-70％)的活性组分，并任选地含有合适的载体。

蛋白序列可以本领域已知的中性或盐形式配制入疫苗内。疫苗以相容于剂型的方式给予，其量在治疗上是有效的并且有免疫原性。给药量取决于待治疗的对象。合适的剂量范围为每次接种约几百微克活性组分，较佳的范围约为0.1-1000微克。如果疫苗还包含本领域已知的佐剂物质，则可增强免疫应答。其它可能性包括采用免疫调节物质如淋巴因子(如IFN-γ、IL-2和IL-12)或合成的IFN-γ诱导剂如与上述佐剂组合的聚I∶C。

通过下述方式还可产生活疫苗：将编码本发明的蛋白片段或蛋白的至少一个核酸片段导入非病原性微生物中，使蛋白片段或蛋白在微生物表面表达(例如包括膜锚着部分的融合蛋白形式或携带允许锚着到膜上的脂质化(lipidation)信号的略经修饰的蛋白或蛋白片段形式)。技术人员知道怎样使相关表达系统适合此目的。

本发明另一部分依据的事实是，最近的研究揭示，克隆到在载体中的在真核细胞内的非复制性的DNA片段可通过(例如)肌内注射或经皮肤给药(所谓的“基因枪”方法)导入动物(包括人)体内。DNA被肌细胞摄取，感兴趣的基因被在真核细胞内起作用的启动子(例如病毒启动子)表达，随后基因产物刺激免疫系统。Ulmer等人在1993年回顾了这些新发现的方法，该文纳入本文作参考。

因此，编码本发明蛋白的核酸片段可用来实现体内表达抗原，即核酸片段可用作所谓的DNA疫苗。因此，本发明还涉及一种疫苗，它包含编码本发明的蛋白片段或蛋白的核酸片段，该疫苗使已给予疫苗的哺乳动物(如人)在体内表达抗原，表达的抗原量能有效地使哺乳动物(如人)对体内肺炎衣原体感染的抵抗力大大增加。

通过将编码表达产物的基因和编码能调节免疫应答的蛋白的DNA片段一起给予，可以增强这种“DNA疫苗”的效率。例如，通过给予两种分开的DNA片段或给予包含在同一载体中的两种DNA片段，编码淋巴因子前体或淋巴因子(例如IFN-γ、IL-2或IL-12)的基因可以和编码免疫原性蛋白片段或蛋白的基因一同给予。还有一个可能性是给予包含多个核苷酸序列的DNA片段，其中每个核苷酸序列编码本文公开的蛋白片段和蛋白的相对表位，用这些表位的宽谱来实现连续致敏免疫应答。

下列实验为非限制性实施例，目的是为了描述本发明的某些特征和实例。

附图图例

图1显示了负染色的纯化肺炎衣原体EB(A)和纯化的OMC(B)的电镜结果。

图2显示了纯化的EB和OMC银染的15％SDS-PAGE结果。泳道1，纯化的肺炎衣原体EB；泳道2，肺炎衣原体OMC；泳道3，纯化的沙眼衣原体EB；和泳道4，沙眼衣原体OMC。

图3显示了经10％SDS-PAGE分离、转移到硝酸纤维素膜并和家兔抗肺炎衣原体OME血清反应的免疫印迹。

图4显示了经家兔抗肺炎衣原体血清检测的重组pEX的考马斯蓝染色7.5％SDS-PAGE结果。箭头表示117kDaβ半乳糖苷酶蛋白的定位。

图5显示了经菌落印迹检测、7.5％SDS-PAGE分离、转移到硝酸纤维素膜上并和家兔抗肺炎衣原体OMC反应的重组体pEX克隆的免疫印迹。泳道1，海蓝色(seablue)分子量标准。泳道2-6，于42℃培育以诱导产生β半乳糖苷酶融合蛋白的pEX克隆。

图6显示了Omp4和Omp5的序列策略。箭头表示用来测序的引物。

图7。肺炎衣原体omp基因。基因排列在两个簇中。在第1簇中发现Omp12、11、10、5、4、13和14。在第2簇中发现Omp6、7、8、9和15。

图8A-J显示了肺炎衣原体4-15的序列对比，采用GCG软件包中的pile up程序。

图9显示了肺炎衣原体感染的HeLa细胞感染后72小时与针对pEX3-36融合蛋白的小鼠单特异性抗血清反应的免疫荧光。pEX3-36是Omp5基因的一部分。

图10显示了肺炎衣原体EB的免疫印迹。泳道1-3，在SDS-样品缓冲液中加热至100℃，泳道4-6未加热。泳道1和家兔抗肺炎衣原体OMC反应；泳道2和4是前血清(pre-serum)；泳道3和5是多克隆家兔抗pEX1-1融合蛋白；泳道6是单克隆抗体26.1。

图11显示了肺炎衣原体的免疫印迹。泳道1-4，在SDS-缓冲液中加热至100℃，泳道5-6未加热。与10⁷CFU的肺炎衣原体感染后14天的C57-黑色小鼠的血清反应。泳道1和5，小鼠1；泳道2和6小鼠2；泳道3和5，小鼠3；泳道4和8，小鼠4。

图12显示了小鼠肺组织的免疫组织学分析，肺炎包涵体存在于支气管上皮组织和肺胞壁中(箭头所指处)。

实施例1

编码98/95 kDa肺炎衣原体COMC蛋白的基因的克隆

肺炎衣原体EB和COMC的纯化

在HeLa细胞中培育肺炎衣原体。培育按照Miyashita和Matsumoto(1992)的说明书进行，只是略作修改，以100,000Xg离心上清液和后一次沉淀以及混浊的底层。通过1000xg离心30分钟，使微生物附着于HeLa细胞，然后在5％CO₂气氛下在含有5％胎牛血清(FCS，Gibco BRL，Germany目录号10106.169)庆大霉素的RPMI1640培养基(Gibco BRL，Germany目录号51 800-27)中37℃培育2小时。将培养基换成另外还含有1毫克/毫升放线菌酮的培养基。培育48小时后，从培养中取出盖玻片，用对肺炎衣原体有特异性的抗体(单克隆抗体26.1)(Christiansen等人，1994)和对种沙眼衣原体有特异性的单克隆抗体(单克隆抗体32.3，Loke diagnostics，ArhusDenmark)测试包涵体，以确保没有发生沙眼衣原体污染。通过Hoechst染色并在BEa和BEg培养基(Freund等人，1979)中培养来测试HeLa细胞中有无支原体污染。另外，通过在BEa和BEg培养基中培育来测试肺炎衣原体原种中有无支原体污染。在培养物或细胞中没有检测到沙眼衣原体、支原体或细菌污染。感染后72小时，以PBS洗涤单层，在PBS中用橡胶刮棒打松细胞，用超声法从宿主细胞中释放出衣原体。在不连续密度梯度上纯化肺炎衣原体EB和RB(Miyashita等人，1992)。用负染色和电子显微镜确认衣原体EB的纯度(图1)，只检测到符合肺炎衣原体EB结构的大小为0.3-0.5mm的颗粒。如Caldwell等人(1981)中所述的那样，对纯化的衣原体EB进行十二烷基肌氨酸钠提取，改动之处在于用简单的超声破碎来悬浮COMC。用电子镜和负染色测试纯化的COMC(图1)，从中看到折叠的外膜复合物。

SDS-PAGE分析纯化的EB和COMC

在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离纯化的EB和肺炎衣原体OMC中的蛋白，对凝胶银染(图2)，在泳道1中看到纯化的EB含有100/95 kDa的主要蛋白和38kDa的蛋白，在纯化的COMC(泳道2)中这两种蛋白组也是主要的。另外，分子量为62/60kDa、55kDa和12kDa的蛋白已经在COMC制备物中增浓。在比较纯化的肺炎衣原体EB和纯化的沙眼衣原体EB(泳道3)时，看到沙眼衣原体EB中主要的蛋白是主要外膜蛋白(MOMP)，它也是沙眼衣原体COMC制备物(泳道4)中的主要条带，在该制备物中看到60/62kDa的Omp2和12kDa的Omp3。然而没有检测到如同肺炎衣原体COMC制备物的大小为100/95kDa的主要条带。

抗肺炎衣原体COMC的家兔多克隆抗体的产生

为了确保产生在免疫印迹和菌落印迹中识别所有肺炎衣原体蛋白的家兔抗体，将10微克COMC抗原溶解在20微升SDS样品缓冲液中，然后分装在5个小管中。用1毫升PBS和1毫升Freund不完全佐剂(Difco laboratories，USA目录号0639-606)进一步稀释溶解的抗原，并注射新西兰白兔四头肌内。以间隔一周时间肌内注射三次，再过三周，静脉内注射稀释在1毫升PBS中的溶解的COMC蛋白，两周后重复该步骤。在开始免疫后的11周后，从家兔获得血清。用SDS-PAGE分离纯化的肺炎衣原体EB，将蛋白电转移到硝酸纤维素膜上。用多克隆COMC抗体封闭膜并免疫染色(图3)。该血清识别EB制备物中大小为100/95，60和38kDa的蛋白。这与外膜蛋白的大小相符。

COMC蛋白的克隆

由于在HeLa细胞中培育肺炎衣原体，因此EB制备物中可能存在污染性的宿主细胞DNA。因此，用DNA酶处理纯化的EB制备物以除去污染性DNA。然后用CsCl梯度离心纯化肺炎衣原体DNA。用Sau3A部分消化肺炎衣原体DNA，将含有大小约为0.5-0.4kb的DNA片段的级分克隆到表达载体系统pEX(Boehringer，Germany目录号1034766，1034774，1034782)中。pEX载体系统具有β半乳糖苷酶基因，β-半乳糖苷酶基因的3′端有多个克隆位点。基因的表达由PR启动子调节，因此可以通过将温度从32℃升高到42℃来诱导蛋白的表达。将重组细菌菌落转移到硝酸纤维素膜上，将温度升高至42℃2小时。将硝酸纤维素膜置于滤膜上浸泡在5％SDS中，使细菌裂解。用针对肺炎衣原体COMC的多克隆抗体检测表达外膜蛋白的菌落。将阳性克隆培育在悬浮液中并于42℃诱导2小时。用SDS-PAGE分析克隆的蛋白全貌，观察到诱导的β半乳糖苷酶的大小增加(图4)。另外，将蛋白电泳转移到硝酸纤维素膜上，确认与针对COMC的多克隆血清的反应(图5)。

阳性COMC克隆的测序

为了对pEX克隆进行特性分析，对插入的肺炎衣原体DNA测序。在GenEmbl数据库中针对原核序列搜索所得DNA序列。搜索结果鉴定了6个克隆是Omp2基因的部分，2个克隆是Omp3基因的部分，2个克隆是MOMP基因的部分，提示COMC蛋白已经被成功克隆。另外，获得32个克隆，其中含有在GenEmbl数据库中未发现的DNA序列。然而，这些序列可能以两个4-6个克隆的毗连群(contic)簇集，三个克隆是相同的。发现另外19个克隆与该毗连群不重叠(图7)。为了获得关于基因的更多的序列信息，用BamHI限制性酶整个消化肺炎衣原体DNA，将片段克隆到载体pBluescript中。将连接的DNA电转化到大肠杆菌XL1-Blue中，并在含有氨苄青霉素的平板上选择。将重组细菌菌落转移到硝酸纤维素膜上，用pEX1-1克隆的插入物作为探针进行菌落杂交。发现了含有4.5kb的单个BamHI片段的一个克隆，用Southern印迹确认此克隆和探针杂交。用各约为300bp的合成引物对此克隆的插入物进行双向测序。BamHI片段的序列使得其能连接pEX克隆的两个毗连群。和pEX克隆一起总共能装配出编码两个新COMC蛋白的6.5kb DNA序列(图6)。

采用来自已知Omp基因和来自其它已知基因的引物在纯化的肺炎衣原体DNA上进行PCR，获得另外的序列。对获得的PCR产物进行测序。序列结构显示在图7中。检测到另外8个Omp基因。推导的氨基酸序列的序列对比显示在图8A和B中。

DNA序列的分析

DNA序列编码大小为89.6-100.3kDa的Omp4-15蛋白(Omp13为56.1kDa)。Omp4和Omp5以相反方向转录。可能的终止结构位于Omp4下游。Omp5基因的3′端没有被克隆，因为该基因内存在BamHI限制性酶切位点。用GCG软件包(Wisconsin软件包，8.1-UNIX版，1995年8月，序列分析软件包)的gap程序比较Omp4和Omp5的翻译的DNA序列。两个基因的氨基酸相同性为41％(相似性为61％)，在Omp4中，信号肽酶1的可能的断裂位点在氨基酸17位，而在Omp5中在氨基酸25位。当将其它两个pEX克隆编码的氨基酸序列与Omp4和Omp5相比时，它们与这些基因也具有氨基酸同源性。发现两个克隆与Omp4和Omp5蛋白中的同一区域有同源性。因此，pEX克隆必定源自另两个基因。因此将这些基因命名为Omp6和Omp7。对其它基因进行类似的分析。与Omp4和Omp5中所见相反，其它推定的Omp蛋白均没有信号肽断裂位点。

实施例2

针对pEX融合蛋白以及加上Omp4的全长重组的多克隆单特异性抗体

为了调查Omp4-7蛋白的拓扑结构，从每个基因中选出代表性的pEX克隆。诱导出β-半乳糖苷酶/Omp的融合蛋白，如同包涵体那样部分纯化。用该抗原以一周的间隔对Balb/c小时肌内免疫三次，6周后获得小鼠血清。用肺炎衣原体感染HeLa细胞。感染72小时后用3.7％甲醛固定单层。由于外膜蛋白被甲醛广泛交联，因此该处理使得抗体不能透过衣原体外膜。用0.2％ Triton X100渗透HeLa细胞，用PBS洗涤单层，然后用20％(v/v)FCS培育，以灭活甲醛游离基团。用含20％(v/v)FCS的PBS稀释小鼠血清1∶100，并和单层一起培育半小时。用PBS洗涤单层，加入偶联FITCH的第二家兔抗小鼠血清反应半小时，洗涤单层并固定。一些抗体与包涵体中的EB强烈反应(图9)。尽管作了甲醛固定，但是也不能排除EB表面因处理而改变，这样抗体能到达Omp4-7。因此，用针对克隆pEX3-36的抗体进行免疫电子显微镜法确认反应。将纯化的肺炎衣原体EB吸收到碳涂覆的镍栅格上。吸收后，用PBS洗涤栅格，用溶解在PBS中的0.5％卵白蛋白封闭。用相同缓冲液1∶100稀释抗体，并培育30分钟。用PBS洗涤栅格。在栅格中加入用含1％明胶的PBS稀释的偶联10nm胶体金的家兔抗小鼠Ig，放置半小时。栅格用含1％明胶的PBS洗3次，再用PBS洗3次，栅格用0.7％磷钨酸反染色(contrastain)。在40kV的Jeol 1010电镜中分析栅格。看到金颗粒覆盖了纯化的EB的表面。由于肺炎衣原体EB在纯化或和抗体反应条件下没有接触洗涤剂或固定，因此这些结果表明克隆的蛋白具有外露的表位。

针对Omp4的多克隆单特异性抗体

用含有LIC位点的引物作PCR扩增Omp4基因，将PCR产物克隆到pET-30 LIC载体(Novagen)中。通过IPTG诱导合成来表达组氨酸标记的融合蛋白，并在镍柱上纯化。用纯化的Omp4蛋白免疫家兔(6次，每次8微克)。

用针对重组体Omp4的家兔多克隆抗体检测石蜡包埋切片中的肺炎衣原体

在经鼻感染后3天，获得肺炎衣原体感染的小鼠的肺。将组织样品固定在4％甲醛中，用石蜡包埋，切片并在染色前去除石蜡。使切片和以TBS 1∶200稀释的家兔血清室温培育30分钟。在TBS中洗涤两次后，用1∶300稀释于TBS中的第二抗体(生物素化山羊抗家兔抗体)培育切片，然后用TBS洗涤两次。用链霉亲和素-生物素复合物(streptABCompelx/AP，Dako)对切片染色30分钟，洗涤，并在镜检下用chromagen+new fuchsin(Vector Laboratories)显影。用苏木素对切片反染色，用显微镜分析。

用超免疫单特异性家兔抗血清进行免疫印迹分析

用含有LTC位点的引物PCR扩增pEX1-1克隆的插入物。因此，PCR产物能插入pET-32 LIC载体(Novagen，UK目录号69076-1)中。因此，pEX1-1克隆的插入物序列在新载体中以融合蛋白形式表达，由pET-32 LIC载体编码的融合蛋白部分具有一排6个组氨酸残基。在该载体中诱导融合蛋白的表达，由于组氨酸残基对二价阳离子有高亲合力，因此该融合蛋白可在变性条件下在Ni2+柱上纯化。用纯化的蛋白免疫新西兰白色家兔。肌内免疫6次、静脉内免疫2次后，获得家兔血清。将纯化的肺炎衣原体EB溶解在SDS样品缓冲液中。一半样品在样品缓冲液中加热至100℃，而另一半样品则不加热。用SDS-PAGE分离样品，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，使血清和条带反应。对于加热至100℃的样品，血清识别约98kDa的高分子量条带。这与Omp5的预计大小相符，pEX1-1克隆是其一部分，然而，当抗体与未加热EB条带反应时，图形是不同的。现在发现了大小为75kDa的条带，另外在条带上方还观察到较弱的条带(图1a)。这些数据证明，Omp5需要在SDS-样品缓冲液中煮沸来完全变性，并迁移至从基因产物预计的大小处。当样品未煮沸时，蛋白没有完全变性，更少的SDS与蛋白结合，它具有更具球形的结构，其在丙烯酰胺凝胶中会迁移至更远处。条带图形看上去与用单克隆抗体(MAb26.1)的结果相同(泳道6)(我们以前已经描述过(Christiansen等人，1994))，即与肺炎衣原体EB表面反应，但是抗体不与免疫印迹中SDS完全变性的肺炎衣原体EB反应。

C57黑色小鼠的实验性感染

由于了解到没有煮沸的Omp4-7蛋白的迁移发生改变，我们选择在小鼠受实验性感染后分析针对肺炎衣原体EB的抗体。为了从肺炎衣原体引起的感染获得抗体，在微量乙醚麻醉下用10⁷ CFI肺炎衣原体鼻内接种C57黑色小鼠。感染14天后获得血清样品，分析肺的病理学变化。在两个小鼠的肺切片中观察到严重的肺炎，而在第3只小鼠中只发现有少量改变。1∶100稀释小鼠血清，并和溶解在煮沸和没有煮沸的样品缓冲液中的纯化的EB反应。在已加热至100℃的制备物中，来自两只小鼠的血清与60/62kDa条带以及55kDa的较弱条带反应强烈，但是对于大小为Omp4-7的蛋白没有观察到反应(图11)。然而，当血清和未加热过的制备物反应时，它们和大小约为75kDa的宽条带均有强反应。这与未加热制备物中Omp4-7蛋白的大小相符。因此，可以归结为，肺炎衣原体感染后抗体识别的Omp4-7蛋白的表位是不连续的表位，因为抗原完全变性完全破坏了表位。在未加热样品中观察到的75kD蛋白不是Omp2(如Omp2特异性抗体免疫印迹所表明)。

实施例3

肺炎衣原体Omp4-7和鹦鹉热衣原体推定的外膜蛋白(POMP)的比较

Longbottom等人1996年已经公开了鹦鹉热衣原体的98-90kDa的部分序列。他们已经将该家族中5个基因的全序列输入了EMBL数据库。他们已将基因命名为“推定的外膜蛋白”(POMP)，因为还未确定它们的精确位置。该家族由两个完全相同的基因组成，这两个基因与这些基因高度同源。他们计算出分子大小为90和91kDa。第5个基因编码98kDa的蛋白。用GCG软件包的pileup程序比较肺炎衣原体Omp4-7蛋白的序列和鹦鹉热衣原体POMP蛋白的序列。氨基酸同源性在51-63％范围内。发现肺炎衣原体Omp4-5蛋白与鹦鹉热衣原体的98kDaPOMP蛋白最相关。令人感兴趣的是，与其它鹦鹉热衣原体基因相比，98kDa的鹦鹉热衣原体POMP蛋白和肺炎衣原体基因更相关。GGAI的重复序列在98kDa POMP蛋白中是保守的，但是在90和91kDa鹦鹉热衣原体POMP蛋白中只有3个GGAI重复序列。对于鹦鹉热衣原体，已经显示，针对这些蛋白的抗体似乎对感染有保护作用。

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序列表

(1)一般信息

(i)申请人

(A)姓名：Svend Birkelund

(B)街道：Dept.of Medical Microbiology and Immunology，

University of Arhus

(C)城市：Arhus C

(D)省份：

(E)国家：Denmark

(F)邮政编码(邮编)：8000

(ii)发明名称：肺炎衣原体抗原

(iii)序列数目：30

(iv)计算机可读形式：

(A)记录介质类型：软盘

(B)计算机：IBM兼容型

(C)操作系统：DOS

(D)软件：FastSEQ for Windows Version 2.0

(v)本申请资料：

(A)申请号：

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3200碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ix)特征：

(A)名称/关键字：编码序列

(B)位置：205...2987

(D)其它信息：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CAATGTCGAA GAGAGCACTA ACCAGGAAAA TTGCGATTTC ATAAACCCAC TTTATTATTA 60AATTCTTACT TGCGTCATAT AAAATAGAAA ACTCAGAGAG TCAAGATAAA AATTCTTGAC 120AGCTGTTTTG TCATCTTTAA CTTGATTTAC TTATTTTGTT TCTATATTGA TGCGAATAGT 180TCTCTAAAAAA ACAAAAAGCAT TACC ATG AAG ACT TCG ATT CCT TGG GTT TTA 231

Met Lys Thr Ser Ile Pro Trp Val Leu

1 5GTT TCC TCC GTG TTA GCT TTC TCA TGT CAC CTA CAG TCA CTA GCT AAC 279Val Ser Ser Val Leu Ala Phe Ser Cys His Leu Gln Ser Leu Ala Asn10 15 20 25GAG GAA CTT TTA TCA CCT GAT GAT AGC TTT AAT GGA AAT ATC GAT TCA 327Glu Glu Leu Leu Ser Pro Asp Asp Ser Phe Asn Gly Asn Ile Asp Ser

30 35 40GGA ACG TTT ACT CCA AAA ACT TCA GCC ACA ACA TAT TCT CTA ACA GGA 375Gly Thr Phe Thr Pro Lys Thr Ser Ala Thr Thr Tyr Ser Leu Thr Gly

45 50 55GAT GTC TTC TTT TAC GAG CCT GGA AAA GGC ACT CCC TTA TCT GAC AGT 423Asp Val Phe Phe Tyr Glu Pro Gly Lys Gly Thr Pro Leu Ser Asp Ser

60 65 70TGT TTT AAG CAA ACC ACG GAC AAT CTT ACC TTC TTG GGG AAC GGT CAT 471Cys Phe Lys Gln Thr Thr Asp Asn Leu Thr Phe Leu Gly Asn Gly His

75 80 85AGC TTA ACG TTT GGC TTT ATA GAT GCT GGC ACT CAT GCA GGT GCT GCT 519Ser Leu Thr Phe Gly Phe Ile Asp Ala Gly Thr His Ala Gly Ala Ala90 95 100 105GCA TCT ACA ACA GCA AAT AAG AAT CTT ACC TTC TCA GGG TTT TCC TTA 567Ala Ser Thr Thr Ala Asn Lys Asn Leu Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu

110 115 120CTG AGT TTT GAT TCC TCT CCT AGC ACA ACG GTT ACT ACA GGT CAG GGA 615Leu Ser Phe Asp Ser Ser Pro Ser Thr Thr Val Thr Thr Gly Gln Gly

125 130 135ACG CTT TCC TCA GCA GGA GGC GTA AAT TTA GAA AAT ATT CGT AAA CTT 663Thr Leu Ser Ser Ala Gly Gly Val Asn Leu Glu Asn Ile Arg Lys Leu

140 145 150GTA GTT GCT GGG AAT TTT TCT ACT GCA GAT GGT GGA GCT ATC AAA GGA 711Val Val Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ala Asp Gly Gly Ala Ile Lys Gly

155 160 165GCG TCT TTC CTT TTA ACT GGC ACT TCT GGA GAT GCT CTT TTT AGT AAC 759Ala Ser Phe Leu Leu Thr Gly Thr Ser Gly Asp Ala Leu Phe Ser Asn170 175 180 185AAC TCT TCA TCA ACA AAG GGA GGA GCA ATT GCT ACT ACA GCA GGC GCT 807Asn Ser Ser Ser Thr Lys Gly Gly Ala Ile Ala Thr Thr Ala Gly Ala

190 195 200CGC ATA GCA AAT AAC ACA GGT TAT GTT AGA TTC CTA TCT AAC ATA GCG 855Arg Ile Ala Asn Asn Thr Gly Tyr Val Arg Phe Leu Ser Asn Ile Ala

205 210 215TCT ACG TCA GGA GGC GCT ATC GAT GAT GAA GGC ACG TCG ATA CTA TCG 903Ser Thr Ser Gly Gly Ala Ile Asp Asp Glu Gly Thr Ser Ile Leu Ser

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285 290 295ACA GAG TTT CTA CGA AAT AAT GTC TCA TCA GCA ACT CCT AAG GGG GGT 1143Thr Glu Phe Leu Arg Asn Asn Val Ser Ser Ala Thr Pro Lys Gly Gly

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525 530 535GAT GCT GAT GTT GAT ACT AAC GTT GAC ATC AGC AGC CTT ATC CCT GTT 1863Asp Ala Asp Val Asp Thr Asn Val Asp Ile Ser Ser Leu Ile Pro Val

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700 705 710CAA AAC TAT TTG AGA TTA GGA AGA GCA AAG TTT TCT GAA TCA GCT ATA 2391Gln Asn Tyr Leu Arg Leu Gly Arg Ala Lys Phe Ser Glu Ser Ala Ile

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(2)SEQ ID NO：2的信息：

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(v)片段类型：内部

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(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：928氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

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325 330 335Gh Ala Gly Asp Ile Thr Phe Asn Gly Asn Ala Ile Val Ala Thr Thr

340 345 350Pro Gln Thr Thr Lys Arg Asn Ser Ile Asp Ile Gly Ser Thr Ala Lys

355 360 365Ile Thr Asn Leu Arg Ala Ile Ser Gly His Ser Ile Phe Phe Tyr Asp

370 375 380Pro Ile Thr Ala Asn Thr Ala Ala Asp Ser Thr Asp Thr Leu Asn Leu385 390 395 400Asn Lys Ala Asp Ala Gly Asn Ser Thr Asp Tyr Ser Gly Ser Ile Val

405 410 415Phe Ser Gly Glu Lys Leu Ser Glu Asp Glu Ala Lys Val Ala Asp Asn

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565 570 575Thr Trp Val Asp Asp Thr Ala Ser Thr Pro Lys Thr Lys Thr Ala Thr

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610 615 620Ile Gln Gly Val Ile Glu Arg Ser Ala Leu Thr Leu Cys Ser Asp Arg625 630 635 640Gly Phe Trp Ala Ala Gly Val Ala Asn Phe Leu Asp Lys Asp Lys Lys

645 650 655Gly Glu Lys Arg Lys Tyr Arg His Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Ile Gly

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740 745 750Asp Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ala Tyr Pro Glu Val Lys Gly Ser Trp

755 760 765Gly Asn Asn Ala Phe Asn Met Met Leu Gly Ala Ser Ser His Ser Tyr

770 775 780Pro Glu Tyr Leu His Cys Phe Asp Thr Tyr Ala Pro Tyr Ile Lys Leu785 790 795 800Asn Leu Thr Tyr Ile Arg Gln Asp Ser Phe Ser Glu Lys Gly Thr Glu

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915 920 925

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3052碱基对

(B)类型：核酸

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(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

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(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：ATGAAGACTT CAGTTTCTAT GTTGTTGGCC CTGCTTTGCT CGGGGGCTAG CTCTATTGTA 60CTCCATGCCG CAACCACTCC ACTAAATCCT GAAGATGGGT TTATTGGGGA GGGCAATACA 120AATACTTTTT CTCCGAAATC TACAACGGAT GCTGCAGGAA CTACCTACTC TCTCACAGGA 180GAGGTTCTGT TTATAGATCC GGGGAAAGGT GGTTCAATTA CAGGAACTTG CTTTGTAGAA 240ACTGCTGGCG ATCTTACATT TTTAGGTAAT GGAAATACCC TAAAGTTCCT GTCGGTAGAT 300GCAGGTGCTA ATATCGCGGT TGCTCATGTA CAAGGAAGTA AGAATTTAAG CTTCACAGAT 360TTCCTTTCTC TGGTGATCAC AGAATCTCCA AAATCCGCTG TTAGTACAGG AAAAGGTAGC 420CTAGTCAGTT CAGGTGCAGT CCAACTGCAA GATATAAACA CTCTAGTTCT TACAAGCAAT 480GCCTCTGTCG AAGATGGTGG CGTGATTAAA GGAAACTCCT GCTTGATTCA GGGAATCAAA 540AATAGTGCGA TTTTTGGACA AAATACATCT TCGAAAAAAG GAGGGGCGAT CTCCACGACT 600CAAGGACTCA CCATAGAGAA TAACTTAGGG ACGCTAAAGT TCAATGAAAA CAAAGCAGTG 660ACCTCAGGAG GCGCCTTAGA TTTAGGAGCC GCGTCTACAT TCACTGCGAA CCATGAGTTG 720ATATTTTCAC AAAATAAGAC TTCTGGGAAT GCTGCAAATG GCGGAGCCAT AAATTGCTCA 780GGCGACCTAA CATTTACTGA TAACACTTCT TTGTTACTTC AAGAAAATAG CACAATGCAG 840GATGGTGGAG CTTTGTGTAG CACAGGAACC ATAAGCATTA CCGGTAGTGA TTCTATCAAT 900GTGATAGGAA ATACTTCAGG ACAAAAAGGA GGAGCGATTT CTGCAGCTTC TCTCAAGATT 960TTGGGAGGGC AGGGAGGCGC TCTCTTTTCT AATAACGTAG TGACTCATGC CACCCCTCTA 1020GGAGGTGCCA TTTTTATCAA CACAGGAGGA TCCTTGCAGC TCTTCACTCA AGGAGGGGAT 1080ATCGTATTCG AGGGGAATCA GGTCACTACA ACAGCTCCAA ATGCTACCAC TAAGAGAAAT 1140GTAATTCACC TCGAGAGCAC CGCGAAGTGG ACGGGACTTG CTGCAAGTCA AGGTAACGCT 1200ATCTATTTCT ATGATCCCAT TACCACCAAC GATACGGGAG CAAGCGATAA CTTACGTATC 1260AATGAGGTCA GTGCAAATCA AAAGCTCTCG GGATCTATAG TATTTTCTGG AGAGAGATTG 1320TCGACAGCAG AAGCTATAGC TGAAAATCTT ACTTCGAGGA TCAACCAGCC TGTCACTTTA 1380GTAGAGGGGA GCTTAGAACT TAAACAGGGA GTGACCTTGA TCACACAAGG ATTCTCGCAG 1440GAGCCAGAAT CCACGCTTCT TTTGGATTTG GGGACCTCAT TACAAGCTTC TACAGAAGAT 1500ATCGTCATCA CAAATTCATC TATAAATGCC GATACCATTT ACGGAAAGAA TCCAATCAAT 1560ATTGTAGCTT CAGCAGCGAA TAAGAACATT ACCCTAACAG GAACCTTAGC ACTTGTAAAT 1620GCAGATGGAG CTTTGTATGA GAACCATACC TTGCAAGACT CTCAAGATTA TAGCTTTGTA 1680AAGTTATCTC CAGGAGCGGG AGGGACTATA ATTACTCAAG ATGCTTCTCA GAAGCTTCTT 1740GAAGTAGCTC CTTCTAGACC ACATTATGGC TATCAAGGAC ATTGGAATGT GCAAGTCATC 1800CCAGGAACGG GAACTCAACC GAGCCAGGCA AATTTAGAAT GGGTGCGGAC AGGATACCTT 1860CCGAATCCCG AACGGCAAGG ATTTTTAGTT CCCAATAGCC TGTGGGGTTC TTTTGTTGAT 1920CAGCGTGCTA TCCAAGAAAT CATGGTAAAT AGTAGCCAAA TCTTATGTCA GGAACGGGGA 1980GTCTGGGGAG CTGGAATTGC TAATTTCCTA CATAGAGATA AAATTAATGA GCACGGCTAT 2040CGCCATAGCG GTGTCGGTTA TCTTGTGGGA GTTGGCACTC ATGCTTTTTC TGATGCTACG 2100ATAAATGCGG CTTTTTGCCA GCTCTTCAGT AGAGATAAAG ACTACGTAGT ATCCAAAAAT 2160CATGGAACTA GCTACTCAGG GGTCGTATTT CTTGAGGATA CCCTAGAGTT TAGAAGTCCA 2220CAGGGATTCT ATACTGATAG CTCCTCAGAA GCTTGCTGTA ACCAAGTCGT CACTATAGAT 2280ATGCAGTTGT CTTACAGCCA TAGAAATAAT GATATGAAAA CCAAATACAC GACATATCCA 2340GAAGCTCAGG GATCTTGGGC AAATGATGTT TTTGGTCTTG AGTTTGGAGC GACTACATAC 2400TACTACCCTA ACAGTACTTT TTTATTTGAT TACTACTCTC CGTTTCTCAG GCTGCAGTGC 2460ACCTATGCTC ACCAGGAAGA CTTCAAAGAG ACAGGAGGTG AGGTTCGTCA CTTTACTAGC 2520GGAGATCTTT TCAATTTAGC AGTTCCTATT GGCGTGAAGT TTGAGAGATT TTCAGACTGT 2580AAAAGGGGAT CTrATGAACT TACCCTTGCT TATGTTCCTG ATGTGATTCG CAAAGATCCC 2640AAGAGCACGG CAACATTGGC TAGTGGAGCT ACGTGGAGCA CCCACGGAAA CAATCTCTCC 2700AGACAAGGAT TACAACTGCG TTTAGGGAAC CACTGTCTCA TAAATCCTGG AATTGAGGTG 2760TTCAGTCACG GAGCTATTGA ATTGCGGGGA TCCTCTCGTA ATTATAACAT CAATCTCGGG 2820GGTAAATACC GATTTTAA 2838

(2)SEQ ID NO：24的信息：

(i)序列特征：

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(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

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85 90 95Leu Ser Val Asp Ala Gly Ala Asn Ile Ala Val Ala His Val Gln Gly

100 105 110Ser Lys Asn Leu Ser Phe Thr Asp Phe Leu Ser Leu Val Ile Thr Glu

115 120 125Ser Pro Lys Ser Ala Val Ser Thr Gly Lys Gly Ser Leu Val Ser Ser

130 135 140Gly Ala Val Gln Leu Gln Asp Ile Asn Thr Leu Val Leu Thr Ser Asn145 150 155 160Ala Ser Val Glu Asp Gly Gly Val Ile Lys Gly Asn Ser Cys Leu Ile

165 170 175Gln Gly Ile Lys Asn Ser Ala Ile Phe Gly Gln Asn Thr Ser Ser Lys

180 185 190Lys Gly Gly Ala Ile Ser Thr Thr Gln Gly Leu Thr Ile Glu Asn Asn

195 200 205Leu Gly Thr Leu Lys Phe Asn Glu Asn Lys Ala Val Thr Ser Gly Gly

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275 280 285Gly Thr Ile Ser Ile Thr Gly Ser Asp Ser Ile Asn Val Ile Gly Asn

290 295 300Thr Ser Gly Gln Lys Gly Gly Ala Ile Ser Ala Ala Ser Leu Lys Ile305 310 315 320Leu Gly Gly Gln Gly Gly Ala Leu Phe Ser Asn Asn Val Val Thr His

325 330 335Ala Thr Pro Leu Gly Gly Ala Ile Phe Ile Asn Thr Gly Gly Ser Leu

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355 360 365Thr Thr Thr Ala Pro Asn Ala Thr Thr Lys Arg Asn Val Ile His Leu

370 375 380Glu Ser Thr Ala Lys Trp Thr Gly Leu Ala Ala Ser Gln Gly Asn Ala385 390 395 400Ile Tyr Phe Tyr Asp Pro Ile Thr Thr Asn Asp Thr Gly Ala Ser Asp

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435 440 445Asn Leu Thr Ser Arg Ile Asn Gln Pro Val Thr Leu Val Glu Gly Ser

450 455 460Leu Glu Leu Lys Gln Gly Val Thr Leu Ile Thr Gln Gly Phe Ser Gln465 470 475 480Glu Pro Glu Ser Thr Leu Leu Leu Asp Leu Gly Thr Ser Leu Gln Ala

485 490 495Ser Thr Glu Asp Ile Val Ile Thr Asn Ser Ser Ile Asn Ala Asp Thr

500 505 510Ile Tyr Gly Lys Asn Pro Ile Asn Ile Val Ala Ser Ala Ala Asn Lys

515 520 525Asn Ile Thr Leu Thr Gly Thr Leu Ala Leu Val Asn Ala Asp Gly Ala

530 535 540Leu Tyr Glu Asn His Thr Leu Gln Asp Ser Gln Asp Tyr Ser Phe Val545 550 555 560Lys Leu Ser Pro Gly Ala Gly Gly Thr Ile Ile Thr Gln Asp Ala Ser

565 570 575Gln Lys Leu Leu Glu Val Ala Pro Ser Arg Pro His Tyr Gly Tyr Gln

580 585 590Gly His Trp Asn Val Gln Val Ile Pro Gly Thr Gly Thr Gln Pro Ser

595 600 605Gln Ala Asn Leu Glu Trp Val Arg Thr Gly Tyr Leu Pro Asn Pro Glu

610 615 620Arg Gln Gly Phe Leu Val Pro Asn Ser Leu Trp Gly Ser Phe Val Asp625 630 635 640Gln Arg Ala Ile Gln Glu Ile Met Val Asn Ser Ser Gln Ile Leu Cys

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675 680 685Val Gly Val Gly Thr His Ala Phe Ser Asp Ala Thr Ile Asn Ala Ala

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725 730 735Phe Arg Ser Pro Gln Gly Phe Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Glu Ala Cys

740 745 750Cys Asn Gln Val Val Thr Ile Asp Met Gln Leu Ser Tyr Ser His Arg

755 760 765Asn Asn Asp Met Lys Thr Lys Tyr Thr Thr Tyr Pro Glu Ala Gln Gly

770 775 780Ser Trp Ala Asn Asp Val Phe Gly Leu Glu Phe Gly Ala Thr Thr Tyr785 790 795 800Tyr Tyr Pro Asn Ser Thr Phe Leu Phe Asp Tyr Tyr Ser Pro Phe Leu

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820 825 830Gly Glu Val Arg His Phe Thr Ser Gly Asp Leu Phe Asn Leu Ala Val

835 840 845Pro IIe Gly Val Lys Phe Glu Arg Phe Ser Asp Cys Lys Arg Gly Ser

850 855 860Tyr Glu Leu Thr Leu Ala Tyr Val Pro Asp Val Ile Arg Lys Asp Pro865 870 875 880Lys Ser Thr Ala Thr Leu Ala Ser Gly Ala Thr Trp Ser Thr His Gly

885 890 895Asn Asn Leu Ser Arg Gln Gly Leu Gln Leu Arg Leu Gly Asn His Cys

900 905 910Leu Ile Asn Pro Gly Ile Glu Val Phe Ser His Gly Ala Ile Glu Leu

915 920 925Arg Gly Ser Ser Arg Asn Tyr Asn Ile Asn Leu Gly Gly Lys Tyr Arg

930 935 940Phe945

(2)SEQ ID NO：25的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3000碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ix)特征：

(A)名称/关键字：编码序列

(B)位置：259...3000

(D)其它信息：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：ATCAGGTGAT AAAAGTTCCT CGTTAGCTAG TGACTGTAGG TGACATGAGA AAGCTAACAC 60GGAGGAAACT AAAACCCAAG GAATCGAAGT CTTCATGGTA ATGCTTTTGT TTTTTAGAGA 120ACTATTCGCA TCAATATAGA AACAAAATAA GTAAATCAAG TTAAAGATGA CAAAACAGCT 180GTCAAGAATT TTTATCTTGA CTCTCTGAGT TTTCTATTTT ATATGACGCA AGTAAGAATT 240TAATAATAAA GTGGGTTT ATG AAA TCG CAA TTT TCC TGG TTA GTG CTC TCT 291

Met Lys Ser Gln Phe Ser Trp Leu Val Leu Ser

1 5 10TCG ACA TTG GCA TGT TTT ACT AGT TGT TCC ACT GTT TTT GCT GCA ACT 339Ser Thr Leu Ala Cys Phe Thr Ser Cys Ser Thr Val Phe Ala Ala Thr

15 20 25GCT GAA AAT ATA GGC CCC TCT GAT AGC TTT GAC GGA AGT ACT AAC ACA 387Ala Glu Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Phe Asp Gly Ser Thr Asn Thr

30 35 40GGC ACC TAT ACT CCT AAA AAT ACG ACT ACT GGA ATA GAC TAT ACT CTG 435Gly Thr Tyr Thr Pro Lys Asn Thr Thr Thr Gly Ile Asp Tyr Thr Leu

45 50 55ACA GGA GAT ATA ACT CTG CAA AAC CTT GGG GAT TCG GCA GCT TTA ACG 483Thr Gly Asp Ile Thr Leu Gln Asn Leu Gly Asp Ser Ala Ala Leu Thr60 65 70 75AAG GGT TGT TTT TCT GAC ACT ACG GAA TCT TTA AGC TTT GCC GGT AAG 531Lys Gly Cys Phe Ser Asp Thr Thr Glu Ser Leu Ser Phe Ala Gly Lys

80 85 90GGG TAC TCA CTT TCT TTT TTA AAT ATT AAG TCT AGT GCT GAA GGC GCA 579Gly Tyr Ser Leu Ser Phe Leu Asn Ile Lys Ser Ser Ala Glu Gly Ala

95 100 105GCA CTT TCT GTT ACA ACT GAT AAA AAT CTG TCG CTA ACA GGA TTT TCG 627Ala Leu Ser Val Thr Thr Asp Lys Asn Leu Ser Leu Thr Gly Phe Ser

110 115 120AGT CTT ACT TTC TTA GCG GCC CCA TCA TCG GTA ATC ACA ACC CCC TCA 675Ser Leu Thr Phe Leu Ala Ala Pro Ser Ser Val Ile Thr Thr Pro Ser

125 130 135GGA AAA GGT GCA GTT AAA TGT GGA GGG GAT CTT ACA TTT GAT AAC AAT 723Gly Lys Gly Ala Val Lys Cys Gly Gly Asp Leu Thr Phe Asp Asn Asn140 145 150 155GGA ACT ATT TTA TTT AAA CAA GAT TAC TGT GAG GAA AAT GGC GGA GCC 771Gly Thr Ile Leu Phe Lys Gln Asp Tyr Cys Glu Glu Asn Gly Gly Ala

160 165 170ATT TCT ACC AAG AAT CTT TCT TTG AAA AAC AGC ACG GGA TCG ATT TCT 819Ile Ser Thr Lys Asn Leu Ser Leu Lys Asn Ser Thr Gly Ser Ile Ser

175 180 185TTT GAA GGG AAT AAA TCG AGC GCA ACA GGG AAA AAA GGT GGG GCT ATT 867Phe Glu Gly Asn Lys Ser Ser Ala Thr Gly Lys Lys Gly Gly Ala Ile

190 195 200TGT GCT ACT GGT ACT GTA GAT ATT ACA AAT AAT ACG GCT CCT ACC CTC 915Cys Ala Thr Gly Thr Val Asp Ile Thr Asn Asn Thr Ala Pro Thr Leu

205 210 215TTC TCG AAC AAT ATT GCT GAA GCT GCA GGT GGA GCT ATA AAT AGC ACA 963Phe Ser Asn Asn Ile Ala Glu Ala Ala Gly Gly Ala Ile Asn Ser Thr220 225 230 235GGA AAC TGT ACA ATT ACA GGG AAT ACG TCT CTT GTA TTT TCT GAA AAT 1011Gly Asn Cys Thr Ile Thr Gly Asn Thr Ser Leu Val Phe Ser Glu Asn

240 245 250AGT GTG ACA GCG ACC GCA GGA AAT GGA GGA GCT CTT TCT GGA GAT GCC 1059Ser Val Thr Ala Thr Ala Gly Asn Gly Gly Ala Leu Ser Gly Asp Ala

255 260 265GAT GTT ACC ATA TCT GGG AAT CAG AGT GTA ACT TTC TCA GGA AAC CAA 1107Asp Val Thr Ile Ser Gly Asn Gln Ser Val Thr Phe Ser Gly Asn Gln

270 275 280GCT GTA GCT AAT GGC GGA GCC ATT TAT GCT AAG AAG CTT ACA CTG GCT 1155Ala Val Ala Asn Gly Gly Ala Ile Tyr Ala Lys Lys Leu Thr Leu Ala

285 290 295TCC GGG GGG GGG GGG GGT ATC TCC TTT TCT AAC AAT ATA GTC CAA GGT 1203Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Ser Phe Ser Asn Asn Ile Val Gln Gly300 305 310 315ACC ACT GCA GGT AAT GGT GGA GCC ATT TCT ATA CTG GCA GCT GGA GAG 1251Thr Thr Ala Gly Asn Gly Gly Ala Ile Ser Ile Leu Ala Ala Gly Glu

320 325 330TGT AGT CTT TCA GCA GAA GCA GGG GAC ATT ACC TTC AAT GGG AAT GCC 1299Cys Ser Leu Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ile Thr Phe Asn Gly Asn Ala

335 340 345ATT GTT GCA ACT ACA CCA CAA ACT ACA AAA AGA AAT TCT ATT GAC ATA 1347Ile Val Ala Thr Thr Pro Gln Thr Thr Lys Arg Asn Ser Ile Asp Ile

350 355 360GGA TCT ACT GCA AAG ATC ACG AAT TTA CGT GCA ATA TCT GGG CAT AGC 1395Gly Ser Thr Ala Lys Ile Thr Asn Leu Arg Ala Ile Ser Gly His Ser

365 370 375ATC TTT TTC TAC GAT CCG ATT ACT GCT AAT ACG GCT GCG GAT TCT ACA 1443Ile Phe Phe Tyr Asp Pro Ile Thr Ala Asn Thr Ala Ala Asp Ser Thr380 385 390 395GAT ACT TTA AAT CTC AAT AAG GCT GAT GCA GGT AAT AGT ACA GAT TAT 1491Asp Thr Leu Asn Leu Asn Lys Ala Asp Ala Gly Asn Ser Thr Asp Tyr

400 405 410AGT GGG TCG ATT GTT TTT TCT GGT GAA AAG CTC TCT GAA GAT GAA GCA 1539Ser Gly Ser Ile Val Phe Ser Gly Glu Lys Leu Ser Glu Asp Glu Ala

415 420 425AAA GTT GCA GAC AAC CTC ACT TCT ACG CTG AAG CAG CCT GTA ACT CTA 1587Lys Val Ala Asp Asn Leu Thr Ser Thr Leu Lys Gln Pro Val Thr Leu

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445 450 455GGC TTT ACT CAG ACC GCG GGT TCC TCT GTT ATT ATG GAT GCG GGC ACA 1683Gly Phe Thr Gln Thr Ala Gly Ser Ser Val Ile Met Asp Ala Gly Thr460 465 470 475ACG TTA AAA GCA AGT ACA GAG GAG GTC ACT TTA ACA GGT CTT TCC ATT 1731Thr Leu Lys Ala Ser Thr Glu Glu Val Thr Leu Thr Gly Leu Ser Ile

480 485 490CCT GTA GAC TCT TTA GGC GAG GGT AAG AAA GTT GTA ATT GCT GCT TCT 1779Pro Val Asp Ser Leu Gly Glu Gly Lys Lys Val Val Ile Ala Ala Ser

495 500 505GCA GCA AGT AAA AAT GTA GCC CTT AGT GGT CCG ATT CTT CTT TTG GAT 1827Ala Ala Ser Lys Asn Val Ala Leu Ser Gly Pro Ile Leu Leu Leu Asp

510 515 520AAC CAA GGG AAT GCT TAT GAA AAT CAC GAC TTA GGA AAA ACT CAA GAC 1875Asn Gln Gly Asn Ala Tyr Glu Asn His Asp Leu Gly Lys Thr Gln Asp

525 530 535TTT TCA TTT GTG CAG CTC TCT GCT CTG GGT ACT GCA ACA ACT ACA GAT 1923Phe Ser Phe Val Gln Leu Ser Ala Leu Gly Thr Ala Thr Thr Thr Asp540 545 550 555GTT CCA GCG GTT CCT ACA GTA GCA ACT CCT ACG CAC TAT GGG TAT CAA 1971Val Pro Ala Val Pro Thr Val Ala Thr Pro Thr His Tyr Gly Tyr Gln

560 565 570GGT ACT TGG GGA ATG ACT TGG GTT GAT GAT ACC GCA AGC ACT CCA AAG 2019Gly Thr Trp Gly Met Thr Trp Val Asp Asp Thr Ala Ser Thr Pro Lys

575 580 585ACT AAG ACA GCG ACA TTA GCT TGG ACC AAT ACA GGC TAC CTT CCG AAT 2067Thr Lys Thr Ala Thr Leu Ala Trp Thr Asn Thr Gly Tyr Leu Pro Asn

590 595 600CCT GAG CGT CAA GGA CCT TTA GTT CCT AAT AGC CTT TGG GGA TCT TTT 2115Pro Glu Arg Gln Gly Pro Leu Val Pro Asn Ser Leu Trp Gly Ser Phe

605 610 615TCA GAC ATC CAA GCG ATT CAA GGT GTC ATA GAG AGA AGT GCT TTG ACT 2163Ser Asp Ile Gln Ala Ile Gln Gly Val Ile Glu Arg Ser Ala Leu Thr620 625 630 635CTT TGT TCA GAT CGA GGC TTC TGG GCT GCG GGA GTC GCC AAT TTC TTA 2211Leu Cys Ser Asp Arg Gly Phe Trp Ala Ala Gly Val Ala Asn Phe Leu

640 645 650GAT AAA GAT AAG AAA GGG GAA AAA CGC AAA TAC CGT CAT AAA TCT GGT 2259Asp Lys Asp Lys Lys Gly Glu Lys Arg Lys Tyr Arg His Lys Ser Gly

655 660 665GGA TAT GCT ATC GGA GGT GCA GCG CAA ACT TGT TCT GAA AAC TTA ATT 2307Gly Tyr Ala Ile Gly Gly Ala Ala Gln Thr Cys Ser Glu Asn Leu Ile

670 675 680AGC TTT GCC TTT TGC CAA CTC TTT GGT AGC GAT AAA GAT TTC TTA GTC 2355Ser Phe Ala Phe Cys Gln Leu Phe Gly Ser Asp Lys Asp Phe Leu Val

685 690 695GCT AAA AAT CAT ACT GAT ACC TAT GCA GGA GCC TTC TAT ATC CAA CAC 2403Ala Lys Asn His Thr Asp Thr Tyr Ala Gly Ala Phe Tyr Ile Gln His700 705 710 715ATT ACA GAA TGT AGT GGG TTC ATA GGT TGT CTC TTA GAT AAA CTT CCT 2451Ile Thr Glu Cys Ser Gly Phe Ile Gly Cys Leu Leu Asp Lys Leu Pro

720 725 730GGC TCT TGG AGT CAT AAA CCC CTC GTT TTA GAA GGG CAG CTC GCT TAT 2499Gly Ser Trp Ser His Lys Pro Leu Val Leu Glu Gly Gln Leu Ala Tyr

735 740 745AGC CAC GTC AGT AAT GAT CTG AAG ACA AAG TAT ACT GCG TAT CCT GAG 2547Ser His Val Ser Asn Asp Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ala Tyr Pro Glu

750 755 760GTG AAA GGT TCT TGG GGG AAT AAT GCT TTT AAC ATG ATG TTG GGA GCT 2595Val Lys Gly Ser Trp Gly Asn Asn Ala Phe Asn Met Met Leu Gly Ala

765 770 775TCT TCT CAT TCT TAT CCT GAA TAC CTG CAT TGT TTT GAT ACC TAT GCT 2643Ser Ser His Ser Tyr Pro Glu Tyr Leu His Cys Phe Asp Thr Tyr Ala780 785 790 795CCA TAC ATC AAA CTG AAT CTG ACC TAT ATA CGT CAG GAC AGC TTC TCG 2691Pro Tyr Ile Lys Leu Asn Leu Thr Tyr Ile Arg Gln Asp Ser Phe Ser

800 805 810GAG AAA GGT ACA GAA GGA AGA TCT TTT GAT GAC AGC AAC CTC TTC AAT 2739Glu Lys Gly Thr Glu Gly Arg Ser Phe Asp Asp Ser Asn Leu Phe Asn

815 820 825TTA TCT TTG CCT ATA GGG GTG AAG TTT GAG AAG TTC TCT GAT TGT AAT 2787Leu Ser Leu Pro Ile Gly Val Lys Phe Glu Lys Phe Ser Asp Cys Asn

830 835 840GAC TTT TCT TAT GAT CTG ACT TTA TCC TAT GTT CCT GAT CTT ATC CGC 2835Asp Phe Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Tyr Val Pro Asp Leu Ile Arg

845 850 855AAT GAT CCC AAA TGC ACT ACA GCA CTT GTA ATC AGC GGA GCC TCT TGG 2883Asn Asp Pro Lys Cys Thr Thr Ala Leu Val Ile Ser Gly Ala Ser Trp860 865 870 875GAA ACT TAT GCC AAT AAC TTA GCA CGA CAG GCC TTG CAA GTG CGT GCA 2931Glu Thr Tyr Ala Asn Asn Leu Ala Arg Gln Ala Leu Gln Val Arg Ala

880 885 890GGC AGT CAC TAC GCC TTC TCT CCT ATG TTT GAA GTG CTC GGC CAG TTT 2979Gly Ser His Tyr Ala Phe Ser Pro Met Phe Glu Val Leu Gly Gln Phe

895 900 905GTC TTT GAA GTT CGT GGA TCC 3000Val Phe Glu Val Arg Gly Ser

910

(2)SEQ ID NO：26的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：914氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(v)片段类型：内部

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Met Lys Ser Gln Phe Ser Trp Leu Val Leu Ser Ser Thr Leu Ala Cys1 5 10 15Phe Thr Ser Cys Ser Thr Val Phe Ala Ala Thr Ala Glu Asn Ile Gly

20 25 30Pro Ser Asp Ser Phe Asp Gly Ser Thr Asn Thr Gly Thr Tyr Thr Pro

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260 265 270Gly Asn Gln Ser Val Thr Phe Ser Gly Asn Gln Ala Val Ala Asn Gly

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325 330 335Glu Ala Gly Asp Ile Thr Phe Asn Gly Asn Ala Ile Val Ala Thr Thr

340 345 350Pro Gln Thr Thr Lys Arg Asn Ser Ile Asp Ile Gly Ser Thr Ala Lys

355 360 365Ile Thr Asn Leu Arg Ala Ile Ser Gly His Ser Ile Phe Phe Tyr Asp

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420 425 430Leu Thr Ser Thr Leu Lys Gln Pro ValThr Leu Thr Ala Gly Asn Leu

435 440 445Val Leu Lys Arg Gly Val Thr Leu Asp Thr Lys Gly Phe Thr Gln Thr

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645 650 655Gly Glu Lys Arg Lys Tyr Arg His Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Ile Gly

660 665 670Gly Ala Ala Gln Thr Cys Ser Glu Asn Leu Ile Ser Phe Ala Phe Cys

675 680 685Gln Leu Phe Gly Ser Asp Lys Asp Phe Leu Val Ala Lys Asn His Thr

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740 745 750Asp Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ala Tyr Pro Glu Val Lys Gly Ser Trp

755 760 765Gly Asn Asn Ala Phe Asn Met Met Leu Gly Ala Ser Ser His Ser Tyr

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820 825 830Gly Val Lys Phe Glu Lys Phe Ser Asp Cys Asn Asp Phe Ser Tyr Asp

835 840 845Leu Thr Leu Ser Tyr Val Pro Asp Leu Ile Arg Asn Asp Pro Lys Cys

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900 905 910Gly Ser

(2)SEQ ID N0：27的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1200碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ix)特征：

(A)名称/关键字：编码序列

(B)位置：1...1200

(D)其它信息：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：GAT CCT AAA AAT AAA GAG TAC ACA GGG ACC ATA CTC TTT TCT GGA GAA 48Asp Pro Lys Asn Lys Glu Tyr Thr Gly Thr Ile Leu Phe Ser Gly Glu1 5 10 15AAG AGT CTA GCA AAC GAT CCT AGG GAT TTT AAA TCT ACA ATC CCT CAG 96Lys Ser Leu Ala Asn Asp Pro Arg Asp Phe Lys Ser Thr Ile Pro Gln

20 25 30AAC GTC AAC CTG TCT GCA GGA TAC TTA GTT ATT AAA GAG GGG GCC GAA 144Asn Val Asn Leu Ser Ala Gly Tyr Leu Val Ile Lys Glu Gly Ala Glu

35 40 45GTC ACA GTT TCA AAA TTC ACG CAG TCT CCA GGA TCG CAT TTA GTT TTA 192Val Thr Val Ser Lys Phe Thr Gln Ser Pro Gly Ser His Leu Val Leu

50 55 60GAT TTA GGA ACC AAA CTG ATA GCC TCT AAG GAA GAC ATT GCC ATC ACA 240Asp Leu Gly Thr Lys Leu Ile Ala Ser Lys Glu Asp Ile Ala Ile Thr65 70 75 80GGC CTC GCG ATA GAT ATA GAT AGC TTA AGC TCA TCC TCA ACA GCA GCT 288Gly Leu Ala Ile Asp Ile Asp Ser Leu Ser Ser Ser Ser Thr Ala Ala

85 90 95GTT ATT AAA GCA AAC ACC GCA AAT AAA CAG ATA TCC GTG ACG GAC TCT 336Val Ile Lys Ala Asn Thr Ala Asn Lys Gln Ile Ser Val Thr Asp Ser

100 105 110ATA GAA CTT ATC TCG CCT ACT GGC AAT GCC TAT GAA GAT CTC AGA ATG 384Ile Glu Leu Ile Ser Pro Thr Gly Asn Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Met

115 120 125AGA AAT TCA CAG ACG TTC CCT CTG CTC TCT TTA GAG CCT GGA GCC GGG 432Arg Asn Ser Gln Thr Phe Pro Leu Leu Ser Leu Glu Pro Gly Ala Gly

130 135 140GGT AGT GTG ACT GTA ACT GCT GGA GAT TTC CTA CCG GTA AGT CCC CAT 480Gly Ser Val Thr Val Thr Ala Gly Asp Phe Leu Pro Val Ser Pro His145 150 155 160TAT GGT TTT CAA GGC AAT TGG AAA TTA GCT TGG ACA GGA ACT GGA AAC 528Tyr Gly Phe Gln Gly Asn Trp Lys Leu Ala Trp Thr Gly Thr Gly Asn

165 170 175AAA GTT GGA GAA TTC TTC TGG GAT AAA ATA AAT TAT AAG CCT AGA CCT 576Lys Val Gly Glu Phe Phe Trp Asp Lys Ile Asn Tyr Lys Pro Arg Pro

180 185 190GAA AAA GAA GGA AAT TTA GTT CCT AAT ATC TTG TGG GGG AAT GCT GTA 624Glu Lys Glu Gly Asn Leu Val Pro Asn Ile Leu Trp Gly Asn Ala Val

195 200 205AAT GTC AGA TCC TTA ATG CAG GTT CAA GAG ACC CAT GCA TCG AGC TTA 672Asn Val Arg Ser Leu Met Gln Val Gln Glu Thr His Ala Ser Ser Leu

210 215 220CAG ACA GAT CGA GGG CTG TGG ATC GAT GGA ATT GGG AAT TTC TTC CAT 720Gln Thr Asp Arg Gly Leu Trp Ile Asp Gly Ile Gly Asn Phe Phe His225 230 235 240GTA TCT GCC TCC GAA GAC AAT ATA AGG TAC CGT CAT AAC AGC GGT GGA 768Val Ser Ala Ser Glu Asp Asn Ile Arg Tyr Arg His Asn Ser Gly Gly

245 250 255TAT GTT CTA TCT GTA AAT AAT GAG ATC ACA CCT AAG CAC TAT ACT TCG 816Tyr Val Leu Ser Val Asn Asn Glu Ile Thr Pro Lys His Tyr Thr Ser

260 265 270ATG GCA TTT TCC CAA CTC TTT AGT AGA GAC AAA GAC TAT GCG GTT TCC 864Met Ala Phe Ser Gln Leu Phe Ser Arg Asp Lys Asp Tyr Ala Val Ser

275 280 285AAC AAC GAA TAC AGA ATG TAT TTA GGA TCG TAT CTC TAT CAA TAT ACA 912Asn Asn Glu Tyr Arg Met Tyr Leu Gly Ser Tyr Leu Tyr Gln Tyr Thr

290 295 300ACC TCC CTA GGG AAT ATT TTC CGT TAT GCT TCG CGT AAC CCT AAT GTA 960Thr Ser Leu Gly Asn Ile Phe Arg Tyr Ala Ser Arg Asn Pro Asn Val305 310 315 320AAC GTC GGG ATT CTC TCA AGA AGG TTT CTT CAA AAT CCT CTT ATG ATT 1008Asn Val Gly Ile Leu Ser Arg Arg Phe Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile

325 330 335TTT CAT TTT TTG TGT GCT TAT GGT CAT GCC ACC AAT GAT ATG AAA ACA 1056Phe His Phe Leu Cys Ala Tyr Gly His Ala Thr Asn Asp Met Lys Thr

340 345 350GAC TAC GCA AAT TTC CCT ATG GTG AAA AAC AGC TGG AGA AAC AAT TGT 1104Asp Tyr Ala Asn Phe Pro Met Val Lys Asn Ser Trp Arg Asn Asn Cys

355 360 365TGG GCT ATA AAA TGC GGA GGG AGC ATG CCT CTA TTG GTA TTT GAA AAC 1152Trp Ala Ile Lys Cys Gly Gly Ser Met Pro Leu Leu Val Phe Glu Asn

370 375 380GGA AAA CTT TTC CAA GGT GCC ATC CCA TTT ATG AAA CTA CAA TTA GTT 1200Gly Lys Leu Phe Gln Gly Ala Ile Pro Phe Met Lys Leu Gln Leu Val385 390 395 400

(2)SEQ ID NO：28的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：400氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(v)片段类型：内部

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：Asp Pro Lys Asn Lys Glu Tyr Thr Gly Thr Ile Leu Phe Ser Gly Glu1 5 10 15Lys Ser Leu Ala Asn Asp Pro Arg Asp Phe Lys Ser Thr Ile Pro Gln

20 25 30Asn Val Asn Leu Ser Ala Gly Tyr Leu Val Ile Lys Glu Gly Ala Glu

35 40 45Val Thr Val Ser Lys Phe Thr Gln Ser Pro Gly Ser His Leu Val Leu

50 55 60Asp Leu Gly Thr Lys Leu Ile Ala Ser Lys Glu Asp Ile Ala Ile Thr65 70 75 80Gly Leu Ala Ile Asp Ile Asp Ser Leu Ser Ser Ser Ser Thr Ala Ala

85 90 95Val Ile Lys Ala Asn Thr Ala Asn Lys Gln Ile Ser Val Thr Asp Ser

100 105 110Ile Glu Leu Ile Ser Pro Thr Gly Asn Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Met

115 120 125Arg Asn Ser Gln Thr Phe Pro Leu Leu Ser Leu Glu Pro Gly Ala Gly

130 135 140Gly Ser Val Thr Val Thr Ala Gly Asp Phe Leu Pro Val Ser Pro His145 150 155 160Tyr Gly Phe Gln Gly Asn Trp Lys Leu Ala Trp Thr Gly Thr Gly Asn

165 170 175Lys Val Gly Glu Phe Phe Trp Asp Lys Ile Asn Tyr Lys Pro Arg Pro

180 185 190Glu Lys Glu Gly Asn Leu Val Pro Asn Ile Leu Trp Gly Asn Ala Val

195 200 205Asn Val Arg Ser Leu Met Gln Val Gln Glu Thr His Ala Ser Ser Leu

210 215 220Gln Thr Asp Arg Gly Leu Trp Ile Asp Gly Ile Gly Asn Phe Phe His225 230 235 240Val Ser Ala Ser Glu Asp Asn Ile Arg Tyr Arg His Asn Ser Gly Gly

245 250 255Tyr Val Leu Ser Val Asn Asn Glu Ile Thr Pro Lys His Tyr Thr Ser

260 265 270Met Ala Phe Ser Gln Leu Phe Ser Arg Asp Lys Asp Tyr Ala Val Ser

275 280 285Asn Asn Glu Tyr Arg Met Tyr Leu Gly Ser Tyr Leu Tyr Gln Tyr Thr

290 295 300Thr Ser Leu Gly Asn Ile Phe Arg Tyr Ala Ser Arg Asn Pro Asn Val305 310 315 320Asn Val Gly Ile Leu Ser Arg Arg Phe Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile

325 330 335Phe His Phe Leu Cys Ala Tyr Gly His Ala Thr Asn Asp Met Lys Thr

340 345 350Asp Tyr Ala Asn Phe Pro Met Val Lys Asn Ser Trp Arg Asn Asn Cys

355 360 365Trp Ala Ile Lys Cys Gly Gly Ser Met Pro Leu Leu Val Phe Glu Asn

370 375 380Gly Lys Leu Phe Gln Gly Ala Ile Pro Phe Met Lys Leu Gln Leu Val385 390 395 400

(2)SEQ ID NO：29的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1830碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/关键字：编码序列

(B)位置：1...1830

(D)其它信息：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：GAT CTC ACA TTA GGG AGT CGT GAC AGT TAT AAT GGT GAT ACA AGC ACC 48Asp Leu Thr Leu Gly Ser Arg Asp Ser Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Thr1 5 10 15ACA GAA TTT ACT CCT AAA GCG GCA ACT TCT GAT GCT AGT GGC ACG ACC 96Thr Glu Phe Thr Pro Lys Ala Ala Thr Ser Asp Ala Ser Gly Thr Thr

20 25 30TAT ATT CTC GAT GGG GAT GTC TCG ATA AGC CAA GCA GGG AAA CAA ACG 144Tyr Ile Leu Asp Gly Asp Val Ser Ile Ser Gln Ala Gly Lys Gln Thr

35 40 45AGC TTA ACC ACA AGT TGT TTT TCT AAC ACT GCA GGA AAT CTT ACC TTC 192Ser Leu Thr Thr Ser Cys Phe Ser Asn Thr Ala Gly Asn Leu Thr Phe

50 55 60TTA GGG AAC GGA TTT TCT CTT CAT TTT GAC AAT ATT ATT TCG TCT ACT 240Leu Gly Asn Gly Phe Ser Leu His Phe Asp Asn Ile Ile Ser Ser Thr65 70 75 80GTT GCA GGT GTT GTT GTT AGC AAT ACA GCA GCT TCT GGG ATT ACG AAA 288Val Ala Gly Val Val Val Ser Asn Thr Ala Ala Ser Gly Ile Thr Lys

85 90 95TTC TCA GGA TTT TCA ACT CTT CGG ATG CTT GCA GCT CCT AGG ACC ACA 336Phe Ser Gly Phe Ser Thr Leu Arg Met Leu Ala Ala Pro Arg Thr Thr

100 105 110GGT AAA GGA GCC ATT AAA ATT ACC GAT GGT CTG GTG TTT GAG AGT ATA 384Gly Lys Gly Ala Ile Lys Ile Thr Asp Gly Leu Val Phe Glu Ser Ile

115 120 125GGG AAT CTT GAT CCG ATT ACT GTA ACA GGA TCG ACA TCT GTT GCT GAT 432Gly Asn Leu Asp Pro Ile Thr Val Thr Gly Ser Thr Ser Val Ala Asp

130 135 140GCT CTC AAT ATT AAT AGC CCT GAT ACT GGA GAT AAC AAA GAG TAT ACG 480Ala Leu Asn Ile Asn Ser Pro Asp Thr Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Thr145 150 155 160GGA ACC ATA GTC TTT TCT GGA GAG AAG CTC ACG GAG GCA GAA GCT AAA 528Gly Thr Ile Val Phe Ser Gly Glu Lys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Lys

165 170 175GAT GAG AAG AAC CGC ACT TCT AAA TTA CTT CAA AAT GTT GCT TTT AAA 576Asp Glu Lys Asn Arg Thr Ser Lys Leu Leu Gln Asn Val Ala Phe Lys

180 185 190AAT GGG ACT GTA GTT TTA AAA GGT GAT GTC GTT TTA AGT GCG AAC GGT 624Asn Gly Thr Val Val Leu Lys Gly Asp Val Val Leu Ser Ala Asn Gly

195 200 205TTC TCT CAG GAT GCA AAC TCT AAG TTG ATT ATG GAT TTA GGG ACG TCG 672Phe Ser Gln Asp Ala Asn Ser Lys Leu Ile Met Asp Leu Gly Thr Ser

210 215 220TTG GTT GCA AAC ACC GAA AGT ATC GAG TTA ACG AAT TTG GAA ATT AAT 720Leu Val Ala Asn Thr Glu Ser Ile Glu Leu Thr Asn Leu Glu Ile Asn225 230 235 240ATA GAC TCT CTC AGG AAC GGG AAA AAG ATA AAA CTC AGT GCT GCC ACA 768Ile Asp Ser Leu Arg Asn Gly Lys Lys Ile Lys Leu Ser Ala Ala Thr

245 250 255GCT CAG AAA GAT ATT CGT ATA GAT CGT CCT GTT GTA CTG GCA ATT AGC 816Ala Gln Lys Asp Ile Arg Ile Asp Arg Pro Val Val Leu Ala Ile Ser

260 265 270GAT GAG AGT TTT TAT CAA AAT GGC TTT TTG AAT GAG GAC CAT TCC TAT 864Asp Glu Ser Phe Tyr Gln Asn Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Ser Tyr

275 280 285GAT GGG ATT CTT GAG TTA GAT GCT GGG AAA GAC ATC GTG ATT TCT GCA 912Asp Gly Ile Leu Glu Leu Asp Ala Gly Lys Asp Ile Val Ile Ser Ala

290 295 300GAT TCT CGC AGT ATA GAT GCT GTA CAA TCT CCG TAT GGC TAT CAG GGA 960Asp Ser Arg Ser Ile Asp Ala Val Gln Ser Pro Tyr Gly Tyr Gln Gly305 310 315 320AAG TGG ACG ATC AAT TGG TCT ACT GAT GAT AAG AAA GCT ACG GTT TCT 1008Lys Trp Thr Ile Asn Trp Ser Thr Asp Asp Lys Lys Ala Thr Val Ser

325 330 335TGG GCG AAG CAG AGT TTT AAT CCC ACT GCT GAG CAG GAG GCT CCG TTA 1056Trp Ala Lys Gln Ser Phe Asn Pro Thr Ala Glu Gln Glu Ala Pro Leu

340 345 350GTT CCT AAT CTT CTT TGG GGT TCT TTT ATA GAT GTT CGT TCC TTC CAG 1104Val Pro Asn Leu Leu Trp Gly Ser Phe Ile Asp Val Arg Ser Phe Gln

355 360 365AAT TTT ATA GAG CTA GGT ACT GAA GGT GCT CCT TAC GAA AAG AGA TTT 1152Asn Phe Ile Glu Leu Gly Thr Glu Gly Ala Pro Tyr Glu Lys Arg Phe

370 375 380TGG GTT GCA GGC ATT TCC AAT GTT TTG CAT AGG AGC GGT CGT GAA AAT 1200Trp Val Ala Gly Ile Ser Asn Val Leu His Arg Ser Gly Arg Glu Asn385 390 395 400CAA AGG AAA TTC CGT CAT GTG AGT GGA GGT GCT GTA GTA GGT GCT AGC 1248Gln Arg Lys Phe Arg His Val Ser Gly Gly Ala Val Val Gly Ala Ser

405 410 415ACG AGG ATG CCG GGT GGT GAT ACC TTG TCT CTG GGT TTT GCT CAG CTC 1296Thr Arg Met Pro Gly Gly Asp Thr Leu Ser Leu Gly Phe Ala Gln Leu

420 425 430TTT GCG CGT GAC AAA GAC TAC TTT ATG AAT ACC AAT TTC GCA AAG ACC 1344Phe Ala Arg Asp Lys Asp Tyr Phe Met Asn Thr Asn Phe Ala Lys Thr

435 440 445TAC GCA GGA TCT TTA CGT TTG CAG CAC GAT GCT TCC CTA TAC TCT GTG 1392Tyr Ala Gly Ser Leu Arg Leu Gln His Asp Ala Ser Leu Tyr Ser Val

450 455 460GTG AGT ATC CTT TTA GGA GAG GGA GGA CTC CGC GAG ATC CTG TTG CCT 1440Val Ser Ile Leu Leu Gly Glu Gly Gly Leu Arg Glu Ile Leu Leu Pro465 470 475 480TAT GTT TCC AAT ACT CTG CCG TGC TCT TTC TAT GGG CAG CTT AGC TAC 1488Tyr Val Ser Asn Thr Leu Pro Cys Ser Phe Tyr Gly Gln Leu Ser Tyr

485 490 495GGC CAT ACG GAT CAT CGC ATG AAG ACC GAG TCT CTA CCC CCC CCC CCC 1536Gly His Thr Asp His Arg Met Lys Thr Glu Ser Leu Pro Pro Pro Pro

500 505 510CCG ACG CTC TCG ACG GAT CAT ACT TCT TGG GGA GGA TAT GTC TGG GCT 1584Pro Thr Leu Ser Thr Asp His Thr Ser Trp Gly Gly Tyr Val Trp Ala

515 520 525GGA GAG CTG GGA ACT CGA GTT GCT GTT GAA AAT ACC AGC GGC AGA GGA 1632Gly Glu Leu Gly Thr Arg Val Ala Val Glu Asn Thr Ser Gly Arg Gly

530 535 540TTT TTC CGA GAG TAC ACT CCA TTT GTA AAA GTC CAA GCT GTT TAC TCG 1680Phe Phe Arg Glu Tyr Thr Pro Phe Val Lys Val Gln Ala Val Tyr Ser545 550 555 560CGC CAA GAT AGC TTT GTT GAA CTA GGA GCT ATC AGT CGT GAT TTT AGT 1728Arg Gln Asp Ser Phe Val Glu Leu Gly Ala Ile Ser Arg Asp Phe Ser

565 570 575GAT TCG CAT CTT TAT AAC CTT GCG ATT CCT CTT GGA ATC AAG TTA GAG 1776Asp Ser His Leu Tyr Asn Leu Ala Ile Pro Leu Gly Ile Lys Leu Glu

580 585 590AAA CGG TTT GCA GAG CAA TAT TAT CAT GTT GTT GCG ATG TAT TCT CCA 1824Lys Arg Phe Ala Glu Gln Tyr Tyr His Val Val Ala Met Tyr Ser Pro

595 600 605GAT GTT 1830Asp Val

610

(2)SEQ ID NO：30的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：610氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(v)片段类型：内部

(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：Asp Leu Thr Leu Gly Ser Arg Asp Ser Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Thr1 5 10 15Thr Glu Phe Thr Pro Lys Ala Ala Thr Ser Asp Ala Ser Gly Thr Thr

20 25 30Tyr Ile Leu Asp Gly Asp Val Ser Ile Ser Gln Ala Gly Lys Gln Thr

35 40 45Ser Leu Thr Thr Ser Cys Phe Ser Asn Thr Ala Gly Asn Leu Thr Phe

50 55 60Leu Gly Asn Gly Phe Ser Leu His Phe Asp Asn Ile Ile Ser Ser Thr65 70 75 80Val Ala Gly Val Val Val Ser Asn Thr Ala Ala Ser Gly Ile Thr Lys

85 90 95Phe Ser Gly Phe Ser Thr Leu Arg Met Leu Ala Ala Pro Arg Thr Thr

100 105 110Gly Lys Gly Ala Ile Lys Ile Thr Asp Gly Leu Val Phe Glu Ser Ile

115 120 125Gly Asn Leu Asp Pro Ile Thr Val Thr Gly Ser Thr Ser Val Ala Asp

130 135 140Ala Leu Asn Ile Asn Ser Pro Asp Thr Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Thr145 150 155 160Gly Thr Ile Val Phe Ser Gly Glu Lys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Lys

165 170 175Asp Glu Lys Asn Arg Thr Ser Lys Leu Leu Gln Asn Val Ala Phe Lys

180 185 190Asn Gly Thr Val Val Leu Lys Gly Asp Val Val Leu Ser Ala Asn Gly

195 200 205Phe Ser Gln Asp Ala Asn Ser Lys Leu Ile Met Asp Leu Gly Thr Ser

210 215 220Leu Val Ala Asn Thr Glu Ser Ile Glu Leu Thr Asn Leu Glu Ile Asn225 230 235 240Ile Asp Ser Leu Arg Asn Gly Lys Lys Ile Lys Leu Ser Ala Ala Thr

245 250 255Ala Gln Lys Asp Ile Arg Ile Asp Arg Pro Val Val Leu Ala Ile Ser

260 265 270Asp Glu Ser Phe Tyr Gln Asn Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Ser Tyr

275 280 285Asp Gly Ile Leu Glu Leu Asp Ala Gly Lys Asp Ile Val Ile Ser Ala

290 295 300Asp Ser Arg Ser Ile Asp Ala Val Gln Ser Pro Tyr Gly Tyr Gln Gly305 310 315 320Lys Trp Thr Ile Asn Trp Ser Thr Asp Asp Lys Lys Ala Thr Val Ser

325 330 335Trp Ala Lys Gln Ser Phe Asn Pro Thr Ala Glu Gln Glu Ala Pro Leu

340 345 350Val Pro Asn Leu Leu Trp Gly Ser Phe Ile Asp Val Arg Ser Phe Gln

355 360 365Asn Phe Ile Glu Leu Gly Thr Glu Gly Ala Pro Tyr Glu Lys Arg Phe

370 375 380Trp Val Ala Gly Ile Ser Asn Val Leu His Arg Ser Gly Arg Glu Asn385 390 395 400Gln Arg Lys Phe Arg His Val Ser Gly Gly Ala Val Val Gly Ala Ser

405 410 415Thr Arg Met Pro Gly Gly Asp Thr Leu Ser Leu Gly Phe Ala Gln Leu

420 425 430Phe Ala Arg Asp Lys Asp Tyr Phe Met Asn Thr Asn Phe Ala Lys Thr

435 440 445Tyr Ala Gly Ser Leu Arg Leu Gln His Asp Ala Ser Leu Tyr Ser Val

450 455 460Val Ser Ile Leu Leu Gly Glu Gly Gly Leu Arg Glu Ile Leu Leu Pro465 470 475 480Tyr Val Ser Asn Thr Leu Pro Cys Ser Phe Tyr Gly Gln Leu Ser Tyr

485 490 495Gly His Thr Asp His Arg Met Lys Thr Glu Ser Leu Pro Pro Pro Pro

500 505 510Pro Thr Leu Ser Thr Asp His Thr Ser Trp Gly Gly Tyr Val Trp Ala

515 520 525Gly Glu Leu Gly Thr Arg Val Ala Val Glu Asn Thr Ser Gly Arg Gly

530 535 540Phe Phe Arg Glu Tyr Thr Pro Phe Val Lys Val Gln Ala Val Tyr Ser545 550 555 560Arg Gln Asp Ser Phe Val Glu Leu Gly Ala Ile Ser Arg Asp Phe Ser

565 570 575Asp Ser His Leu Tyr Asn Leu Ala Ile Pro Leu Gly Ile Lys Leu Glu

580 585 590Lys Arg Phe Ala Glu Gln Tyr Tyr His Val Val Ala Met Tyr Ser Pro

595 600 605Asp Val

610

Claims

1.一种鉴定哺乳动物如人感染肺炎衣原体的种特异性诊断测试方法，所述测试方法包括检测患者体内或患者样品内是否有针对肺炎衣原体外膜的一种或多种蛋白的抗体存在，所述蛋白的分子量为100.3-89.6kDa或56.1kDa，或检测编码所述外膜蛋白的核酸片段是否存在。

2.根据权利要求1所述的诊断测试方法，其中外膜蛋白具有SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示的序列，或其变体或亚序列。

3.根据权利要求1所述的诊断测试方法，其中核酸片段具有SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23所示的序列或其变体或亚序列。

4.根据权利要求3所述的诊断测试方法，其中用核酸扩增检测核酸片段。

5.根据权利要求4所述的诊断测试方法，其中用聚合酶链反应检测核酸片段。

6.一种衍生自肺炎衣原体的核酸片段，它包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列，或与任一所述序列的序列同源性至少为50％的所述核苷酸序列的变体或亚序列。

7.一种衍生自肺炎衣原体的蛋白质，它具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，或序列同源性至少为50％且具有类似生物功能的它的变体或亚序列。

8.一种多克隆单特异性抗体，它针对具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示序列的蛋白或其变体或亚序列。

9.一种用来诊断哺乳动物如人感染肺炎衣原体的诊断试剂盒，所述试剂盒包含具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的蛋白质或其变体或亚序列。

10.一种用来诊断哺乳动物如人感染肺炎衣原体的诊断试剂盒，所述试剂盒包含抗体，该抗体针对具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的蛋白或其变体或亚序列。

11.一种用来诊断哺乳动物如人感染肺炎衣原体的诊断试剂盒，所述试剂盒包含具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23所示序列的核酸片段或其变体或亚序列。

12.一种用来免疫接种哺乳动物如人来抵抗肺炎衣原体的组合物，所述组合物包含具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的蛋白质或其变体或亚序列。

13.具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示序列的蛋白质或其变体或亚序列在诊断哺乳动物如人感染肺炎衣原体中的应用。

14.非变性形式的具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示序列的蛋白质或其变体或亚序列在诊断哺乳动物如人感染肺炎衣原体中的应用。

15.具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示序列的蛋白质或其变体或亚序列在免疫接种哺乳动物如人以抵抗肺炎衣原体中的应用。

16.非变性形式的具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示序列的蛋白质或其变体或亚序列在免疫接种哺乳动物如人以抵抗肺炎衣原体中的应用。

17.核酸片段或其变体或亚序列在免疫接种哺乳动物如人以抵抗肺炎衣原体中的应用，其中核酸片段具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23所示序列，所述变体或亚序列与所述任一序列的序列同源性至少为50％。