CN113785198A - 呼吸道感染检测和分类 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于所确定的身体样品中TK1蛋白水平对呼吸道感染进行诊断和分类。具体地，基于所确定的TK1蛋白水平，呼吸道感染可被诊断并分类为由肺炎支原体引起的肺炎支原体。

Description

呼吸道感染检测和分类
技术领域
本实施方式通常涉及呼吸道感染，并且特别涉及此类呼吸道感染的检测和分类。
背景技术
医学上最重要的支原体感染是由肺炎支原体引起的下呼吸道感染，所述肺炎支原体是一种非常小的无壁细菌。本病表现为非典型细菌性肺炎，简称支原体肺炎，其潜伏期较长、临床症状谱广，但通常表现为低强度持续性干咳。据估计，美国每年发生约200万例肺炎支原体感染，每50例社区获得性肺炎病例中就有1-10例为肺炎支原体感染。因此，它通常被认为是世界范围内的主要健康问题。
目前可用于肺炎支原体感染的诊断测试包括培养和血清学方法以及基于聚合酶链反应(PCR)的方法，目前使用的分子方法数量有限。因此，非常需要更好的诊断程序。
发明内容
提供改进的呼吸道感染检测和分类是一个总的目标。
该目标和其他目标通过如本文公开的实施方式来满足。
本发明在独立权利要求中定义。本发明的进一步实施方式在从属权利要求中定义。
本实施方式涉及使用身体样品中确定的胸苷激酶1(TK1)物质水平来预测和诊断患者中由肺炎支原体引起的支原体肺炎的存在。确定的TK1物质水平还可用于将患者的呼吸道感染分类为由肺炎支原体引起的支原体肺炎，或由病毒引起的病毒性肺炎或由除肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎中的一种。
本实施方式由此提供了一种检测和分类原本难以诊断的肺炎支原体感染的技术。
附图说明
通过结合附图参考以下描述，可以最好地理解实施例及其进一步的目的和优点，其中：
图1说明了健康受试者(n＝144)和患有急性细菌(n＝98)、病毒(n＝64)或肺炎支原体(n＝25)感染的人的血清胸苷激酶1(STK1)蛋白浓度。Y轴显示STK1浓度的10-log值，显著性P值用于健康和不同患者组之间的成对比较。
图2说明了健康受试者(n＝144)和患有急性细菌(n＝60)或肺炎支原体(n＝25)下呼吸道感染的人的STK1蛋白浓度。Y轴显示STK1浓度的10-log值，显着性P值用于健康和不同患者组之间的成对比较。
图3显示了健康受试者与肺炎支原体急性感染者之间的区别。显示了来自具有临床诊断和可能的肺炎支原体感染病因的患者的结果。图中给出的P值是STK1浓度的受试者工作特征(ROC)曲线之间的统计差异。
图4说明了下呼吸道感染的细菌和肺炎支原体病因之间区别的ROC分析结果。
图5说明了下呼吸道感染的病毒性和肺炎支原体病因之间区别的ROC分析结果。
图6说明了下呼吸道感染的细菌和肺炎支原体病因之间区别的ROC分析结果。
图7说明了与CRP(C反应蛋白)、PCT(降钙素原)和血液中性粒细胞计数相比，下呼吸道感染的细菌和肺炎支原体病因之间区别的ROC分析结果。
图8说明了针对血清TK1(S-TK1)、血浆HNL(P-HNL二聚体)、血浆C反应蛋白(P-CRP)、血清降钙素原(S-PCT)和血清TK1与血浆HNL之间的比率(TK1/HNL二聚体)。
图9A和9B说明了健康受试者(n＝144)和患有细菌性肺炎(n＝86)或支原体肺炎(n＝28)的人的血清TK1(S-TK1)(9A)和血浆HNL(P-HNL二聚体)蛋白浓度。Y轴显示浓度的10-log值。
具体实施方式
本实施方式通常涉及呼吸道感染，并且特别涉及此类呼吸道感染的检测和分类。
本发明基于实验结果，其表明由肺炎支原体、特别是支原体肺炎引起的呼吸道感染导致人患者中的胸苷激酶1(TK1)蛋白、特别是血清TK1(STK1或S-TK1)蛋白水平显著升高。然而，这种STK1蛋白水平的增加在健康人或患有由其他病原体引起的呼吸道感染的患者中都看不到，例如由病毒引起的病毒性肺炎和由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
因此，TK1蛋白水平、例如STK1蛋白水平可用于鉴别或诊断患有由肺炎支原体引起的支原体肺炎的呼吸道感染患者。从而可以将这些肺炎支原体患者与其他患有由肺炎支原体以外的病原体引起的呼吸道感染的患者区分开来。
这意味着TK1蛋白测定可用作其他难以诊断的肺炎支原体感染的有价值的生物标志物，任选地与其他生物标志物一起使用，例如C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、钙卫蛋白和/或人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)，例如血液(B-HNL)和/或血浆(P-HNL)中的HNL。
在一个实施方式中，TK1与选自CRP、PCT、钙卫蛋白和HNL中的至少一种生物标志物一起用作生物标志物。在一个优选实施方式中，TK1与选自CRP、PCT和HNL，更优选CRP、PCT和P-HNL中的至少一种生物标志物一起用作生物标志物。
因此，在一个实施方式中，TK1与CRP一起使用。在另一个实施方式中，TK1与PCT一起使用，并且在另一个实施方式中TK1与HNL，例如B-HNL和/或P-HNL，优选P-HNL一起使用。在又一个实施方式中，TK1与钙卫蛋白一起使用。TK1也可以与至少两种其他生物标志物一起使用，例如TK1和CRP、TK1和PCT、TK1和钙卫蛋白，或TK1和HNL，例如B-HNL和/或P-HNL，优选P-HNL。在进一步的实施方式中，TK1与至少三种其他生物标志物一起使用，例如TK1、CRP和PCT；TK1、CRP和钙卫蛋白；TK1、CRP和HNL，例如B-HNL和/或P-HNL，优选P-HNL；TK1、PCT和钙卫蛋白；TK1、PCT和HNL，例如B-HNL和/或P-HNL，优选P-HNL；或TK1、钙卫蛋白和HNL，例如B-HNL和/或P-HNL，优选P-HNL。在其他实施方式中，TK1与至少四种其他生物标志物一起使用，例如TK1、CRP、PCT和钙卫蛋白、TK1、CRP、PCT和HNL，例如B-HNL和/或P-HNL，优选P-HNL；TK1、CRP、钙卫蛋白和HNL，例如B-HNL和/或P-HNL，优选P-HNL；TK1、PCT、钙卫蛋白和HNL，例如B-HNL和/或P-HNL，优选P-HNL。在另一个实施方式中，TK1与CRP、PCT、钙卫蛋白和HNL，例如B-HNL和/或P-HNL，优选P-HNL一起使用。
例如，当TK1与至少一种其他生物标志物一起使用时，将TK1的水平和至少一种其他生物标志物的水平与相应的阈值进行比较，然后估计、诊断或分类基于每个生物标志物(TK1和至少一种其他生物标志物)与其各自阈值的比较。
在替代实施方式中，基于TK1的水平和至少一种其他生物标志物的水平计算值，并将该值与阈值进行比较。例如，该值可以基于函数f()、f(TK1、(CRP、PCT、钙卫蛋白和/或HNL))计算，其中TK1、CRP、PCT、钙卫蛋白和HNL表示对于特定的生物标志物确定的各自水平或量。可以使用的函数f()的一个典型示例是两个生物标志物水平之间的比率或商，例如TK1/HNL，例如TK1/P-HNL，或HNL/TK1，例如P-HNL/TK1。函数f()的另一个示例是两个或多个生物标志物水平的乘积。
TK1多年来一直被用作血液系统恶性肿瘤预后和监测的血清生物标志物。TK1是使用三磷酸腺苷(ATP)作为磷酸盐供体将胸苷(dThd)磷酸化为脱氧胸苷单磷酸(dTMP)的酶。dTMP进一步磷酸化并形成脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，在细胞周期的S期将其整合到脱氧核糖核酸(DNA)中。
STK1已经通过酶活性测定或最近的免疫测定来确定。
使用放射性TK1酶活性测定(TK-REA)的临床研究表明，血清TK1测量值在几种恶性肿瘤(例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病和各种形式的白血病)中具有预后价值。
在TK-REA的一项早期研究中，研究了几种不同类型的恶性肿瘤以及其他临床状况，包括病毒感染、单核细胞增多症和肺炎支原体[1]。发现在单核细胞增多症患者中，所有具有急性疾病症状的患者的TK1水平都急剧增加。就病毒诊断患者血清中的TK1水平而言，83％的水平低于健康人的临界水平，而17％的血清显示TK1活性水平升高。TK1活性升高的存在与风疹、麻疹、巨细胞病毒以及在某些情况下的单纯疱疹病毒(HSV)或水痘带状疱疹病毒(VZV)感染有关。然而，据报道，肺炎支原体感染受试者的TK1活性水平没有增加[1]。病毒性肝炎患者血清TK1活性升高，尤其是甲型肝炎感染，与天冬氨酸转氨酶(ASAT)、丙氨酸转氨酶(ALAT)和乳酸脱氢酶(LDH)显著相关，但与其他肝脏血液生物标志物无关。
急性细菌感染患者血清中的TK1活性研究不多，关于该主题的出版物也很少。在[2,3]中测定了100名健康受试者血清中TK1的活性，平均值为4U/L，而在100名不明细菌感染患者中，中值为10U/L，与40明患有良性乳腺癌的女性中发现的相似。相应地，100名不明病毒感染患者的平均值为54U/L[2,3]。
实施方式的一个方面涉及预测患有呼吸道感染的患者或受试者中肺炎支原体的存在的方法。该方法包括用抗TK1抗体或其片段测定从患者或受试者获得的身体样品中TK1物质的水平。该方法还包括基于身体样品中TK1物质的水平估计呼吸道感染是由肺炎支原体引起的支原体肺炎的可能性。
在一个实施方式中，该方法还包括确定从受试者获得的身体样品或另一身体样品中至少一种其他生物标志物的水平。在该实施方式中，至少一种其他生物标志物选自CRP、PCT、钙卫蛋白和HNL。在该实施方式中，估计可能性包括基于确定的身体样品中TK1物质的水平和基于确定的身体样品或另一个身体样品中至少一种其他生物标志物的水平估计呼吸道感染是由肺炎支原体引起的支原体肺炎的可能性。
实施方式的另一方面涉及在患者或受试者中诊断支原体肺炎的方法。该方法包括用抗TK1抗体或其片段测定从患者或受试者获得的身体样品中TK1物质的水平。该方法还包括基于身体样品中TK1物质的水平诊断患有支原体肺炎的患者或受试者。
在一个实施方式中，该方法还包括确定从受试者获得的身体样品或另一身体样品中至少一种其他生物标志物的水平。在该实施方式中，至少一种其他生物标志物选自由CRP、PCT、钙卫蛋白和HNL组成的组。在该实施方式中，诊断受试者包括基于确定的身体样品中TK1物质的水平和基于确定的身体样品或另一身体样品中至少一种其他生物标志物的水平来诊断受试者患有支原体肺炎。
在一个实施方式中，上述实施方式中的估计和诊断步骤是基于确定的TK1物质水平与阈值之间的比较来执行的。在一个特定的实施方式中，如果确定的TK1物质水平高于阈值，则估计步骤包括估计呼吸道感染是由肺炎支原体引起的支原体肺炎的高可能性，否则估计呼吸道感染是由肺炎支原体引起的支原体肺炎的低可能性。因此，在一个实施方式中，如果确定的TK1物质水平不超过阈值，则该方法包括估计呼吸道感染由肺炎支原体以外的病原体引起的高可能性，例如病毒引起的病毒性肺炎或由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
实施方式的另一方面涉及对受试者的呼吸道感染进行分类的方法。该方法包括用抗TK1抗体或其片段确定从受试者获得的身体样品中TK1物质的水平。该方法还包括基于确定的身体样品中TK1物质的水平将呼吸道感染分类为由肺炎支原体引起的支原体肺炎，或将呼吸道感染分类为由病毒引起的病毒性肺炎或由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
在一个实施方式中，该方法还包括确定从受试者获得的身体样品或另一身体样品中至少一种其他生物标志物的水平。在该实施方式中，至少一种其他生物标志物选自由CRP、PCT、钙卫蛋白和HNL组成的组。在本实施方式中，对呼吸道感染进行分类包括基于确定的身体样品中TK1物质的水平和基于确定的身体样品或另一身体样品中至少一种其他生物标志物的水平将呼吸道感染分类为由肺炎支原体引起的支原体肺炎，或将呼吸道感染分类为由病毒引起的病毒性肺炎或由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
在具体实施方式中，该方法包括确定从受试者获得的身体样品或另一身体样品中的HNL水平。该方法还包括计算身体样品中所确定的TK1物质水平与身体样品或另一身体样品中所确定的HNL水平之间的比率或商。在该具体实施方式中，对呼吸道感染进行分类包括如果商或比率超过阈值则将呼吸道感染分类为由肺炎支原体引起的支原体肺炎，否则将呼吸道感染分类为由除肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
实施方式的另一方面涉及对患者或受试者的呼吸道感染进行分类的方法。该方法包括用抗TK1抗体或其片段测定从患者或受试者获得的身体样品中TK1物质的水平。该方法还包括如果身体样品中TK1物质的水平超过阈值，则将呼吸道感染分类为由肺炎支原体引起的支原体肺炎，否则将呼吸道感染分类为由病毒引起的病毒性肺炎或由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
病毒性肺炎是由病毒引起的肺炎。病毒是儿童肺炎的最常见原因，而在成人中，细菌是更常见的原因。病毒性肺炎的常见原因包括流感病毒A和B、呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人博卡病毒和副流感病毒。通常导致肺炎的稀有病毒包括腺病毒、偏肺病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒和中东呼吸综合征(MERS)病毒。主要引起其他疾病但有时引起肺炎的病毒包括单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、麻疹病毒、风疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、天花病毒和登革热病毒。
细菌性肺炎是一种由细菌感染引起的肺炎。细菌性肺炎可由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起。除新生儿外，肺炎链球菌是所有年龄组肺炎最常见的细菌性病因。肺炎链球菌是一种革兰氏阳性细菌，通常存在于没有肺炎的人的喉咙中。肺炎的其他重要革兰氏阳性病因是金黄色葡萄球菌和炭疽芽孢杆菌。革兰氏阴性菌很少被视为肺炎的病因。流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、百日咳博德特菌和卡他莫拉菌是最常见的革兰氏阴性肺炎病因。细菌性肺炎也可能由非典型细菌引起，例如伯内氏柯克西氏菌、肺炎衣原体和嗜肺军团菌。
本文所用的细菌性肺炎是指由肺炎支原体以外的细菌引起的肺炎。
支原体肺炎是由肺炎支原体引起的一种肺炎。肺炎支原体通过呼吸道飞沫传递来传播。一旦附着在宿主生物的粘膜上，肺炎支原体就会通过二元裂变提取营养、生长和繁殖。附着部位包括上呼吸道和下呼吸道，引起咽炎、支气管炎和肺炎。由这种细菌引起的感染有时被称为非典型肺炎，因为其病程长、不产生痰和大量肺外症状。支原体肺炎可并发史蒂文斯-约翰逊综合征、自身免疫性溶血性贫血、心血管疾病、脑炎或格林-巴利综合征。
在一个实施方式中，对呼吸道感染进行分类包括如果所确定的身体样品中TK1物质的水平超过阈值，则将呼吸道感染分类为由肺炎支原体引起的支原体肺炎，否则将呼吸道感染分类为由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
该方法中使用的阈值通常取决于用于测量身体样品中TK1的方法，例如基于特定的抗TK1抗体或测量中使用的抗体。阈值可以如实施例部分中公开的那样通过确定从诊断为支原体肺炎的患者收集的身体样品中以及任选从健康受试者和/或诊断为除支原体肺炎以外的病毒性肺炎或细菌性肺炎的患者收集的身体样品中的TK1水平来确定。然后可以从这样的测量中确定阈值。例如，图1和2说明了使用TK1酶联免疫吸附测定(ELISA)(AroCellTK 210ELISA)在健康志愿者和不同患者组中确定的血清TK1(STK1)物质水平。在这种情况下，可以在0.5至1.0μg/L的范围内选择合适的阈值，例如0.6至1.0μg/L，优选0.7至0.9μg/L，例如0.7μg/L或0.8μg/L。
在一个实施方式中，该方法还包括从患者获得身体样品。
身体样品优选地是包含TK1物质的体液样品。此类体液样品的非限制性但优选的实例包括血清样品、血浆样品、血液样品、滑液样品、淋巴液样品、尿液样品和唾液样品，优选血清样品、血浆样品或血液样品，更优选血清样品或血浆样品，例如肝素锂血浆样品。
在一个实施方式中，确定TK1物质的水平包括确定从具有抗TK1抗体或其片段的患者获得的血清或血浆样品中STK1物质的水平。
人体中的TK1以各种形式存在，这取决于某些分子的存在，例如三磷酸腺苷(ATP)的存在或不存在；取决于蛋白质的浓度，即高浓度或低浓度；取决于蛋白质的类型，即天然或重组TK1；取决于蛋白质的位置，即在血清或细胞质中。
通常，胞质和重组人TK1在ATP存在或高浓度时以四聚体形式存在，在ATP不存在或低浓度时以二聚体形式存在。胞质和重组人TK1的四聚体形式具有高TK1活性，而二聚体形式具有较低的TK1活性。胞质TK1也称为细胞TK1，是存在于细胞内并可从此类细胞中分离的TK1。
与此形成鲜明对比的是，人STK1可以是高分子量复合物的形式，例如低聚物或包含此类低聚物，具有TK1活性以及二聚体和四聚体形式，具有非常低或甚至缺乏TK1活性。低聚似乎与血液中发生的二硫化物交联的形成有关。
如本文所用，TK1物质是指各种形式的TK1，例如二聚体、四聚体、低聚物和包含TK1的复合物。TK1物质优选为血清TK1物质，即存在于患者血液、血浆或血清中的STK1物质。STK1物质然后可以包含上述形式的STK1，例如二聚体、四聚体、低聚物和包含STK1的复合物。TK1物质还包括具有至少一个TK1蛋白质单位和其他分子和/或大分子的复合物。
如果确定了至少一种其他生物标志物，那么除了TK1物质之外，还可以确定身体样品或与TK1物质相同类型的身体样品中的至少一种其他生物标志物的水平。在另一个实施方式中，在来自受试者的另一身体样品中确定至少一种其他生物标志物。例如，可以在来自受试者的血清样品中确定血清TK1物质，而且可以在来自受试者的血浆样品中确定至少一种其他生物标志物，例如HNL。
至少一种其他生物标志物的水平可以根据本领域众所周知的技术来确定，包括使用与相应生物标志物特异性结合的抗体的免疫测定。此类免疫测定的说明性但非限制性实例包括ELISA或粒子增强比浊免疫测定(PETIA)。
在一个实施方式中，确定TK1物质的水平包括将身体样品与抗TK1抗体或其片段接触。该实施方式还包括检测或确定与TK1物质结合的抗TK1抗体或片段的量。
身体样品与抗体或其片段的接触可以通过将抗体或其片段加入身体样品并将身体样品与抗体或其片段一起温育来实现。抗体或其片段由此与TK1物质结合，在抗体或其片段与TK1物质之间形成复合物。在这样的实施方式中，测量与TK1物质结合的抗体或片段的量可以包括测量或量化抗体或其片段与TK1物质之间的复合物，从而测量或量化与TK1物质结合的抗体或片段的量。
在一个实施方式中，确定TK1物质的水平包括基于所确定的结合的抗TK1抗体或片段的量以及结合的抗TK1抗体或片段的量与TK1物质水平之间的标准相关性，确定身体样品中TK1物质的水平。因此，在该实施方式中，在结合的抗TK1抗体或片段的量与TK1物质的预定浓度或水平，例如重组TK1的预定浓度或水平之间建立了标准相关性。然后可通过确定不同预定浓度的重组TK1的结合抗TK1抗体或片段的各自量以获得它们之间的相关性来建立这种标准相关性。
在一个实施方式中，该方法包括将与TK1物质结合的抗体或片段的测量量与TK1物质的水平相关联。这可以通过使用与参考TK1物质结合的抗体或片段的测量量与参考TK1物质的浓度之间的预定或标准相关性来进行。生成此类预定或标准相关性时可使用的典型参考TK1物质是重组人TK1。
因此，可以通过将抗体或其片段添加到包含不同浓度的参考TK1物质，优选重组人TK1的不同样品中来产生预定或标准相关性。然后在不同样品中测量结合参考TK1物质、优选重组人TK1的抗体或片段的量，从而获得参考TK1物质、优选重组人TK1的浓度与所测量的结合参考TK1物质、优选重组人TK1的抗体或片段的量之间的标准曲线、函数或关系。
这种预定或标准相关性，例如标准曲线、函数或关系然后可用于将测量的身体样品中与TK1物质结合的抗体或片段的量映射或转换为身体样品中TK1物质的浓度。
在一个实施方式中，在身体样品与抗体或其片段温育之前或期间处理身体样品。这种样品处理可用于稳定身体样品中选定的TK1形式和/或将较大的TK1复合物或低聚物分解成较小的复合物或低聚物。
因此，在一个实施方式中，在将抗体或其片段添加至身体样品之前(或与其相关)，优选在将抗体或其片段添加至身体样品之前，将样品稀释液或预处理缓冲液添加至身体样品。
在一个实施方式中，样品稀释缓冲液包含ATP，优选地以在1.5mM至50mM的区间内选择的浓度。如前所述，ATP稳定了TK1的四聚体形式，其具有高酶促TK1活性。
在另一个实施方式中，样品稀释缓冲液包含还原剂。然后，还原剂可以破坏较大的TK1复合物和低聚物中的二硫化物交联以获得较小的TK1形式，例如四聚体。根据实施方式可以使用能够破坏二硫键的各种还原剂，包括但不限于二硫赤藓糖醇(DTE)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫代丁胺(DTBA)、三(2-羧乙基)膦)(TCEP)和其组合。还原剂的量通常在0.1mM至10mM的区间内选择。
在一个实施方式中，样品稀释缓冲液可以包含ATP和还原剂。
在一个实施方式中，抗TK1抗体是单克隆抗TK1抗体。在另一个实施方式中，抗TK1抗体是多克隆抗TK1抗体。
在一个实施方式中，抗TK1抗体对由来自TK1、优选人TK1的C末端区域的氨基酸序列组成的表位或肽具有特异性。
肽优选地选自TK1的一部分，范围从氨基酸位置200到TK1的末端，即人中的氨基酸位置234(SEQ ID NO：28)。在一个具体实施方式中，肽选自从氨基酸位置205、优选210至氨基酸位置230、优选225的一部分TKl蛋白。
肽优选是N聚体，其中N是8至20范围内的整数，优选10至15范围内的整数。
肽优选由TK1蛋白的C-末端区域中的N个连续氨基酸组成。
在一个实施方式中，肽由以下氨基酸序列GEAVAARKLF(SEQ ID NO：1)组成。在另一个实施方式中，肽由以下氨基酸序列NCPVPGKPGE(SEQ ID NO：2)组成。在另一个实施方式中，肽由以下氨基酸序列PVPGKPGEAV(SEQ ID NO：3)组成。在又一个实施方式中，肽由以下氨基酸序列NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO：4)组成。
对由GEAVAARKLF(SEQ ID NO：1)组成的表位具有特异性的单克隆抗TK1抗体包含具有氨基酸序列DYEMH(SEQ ID NO：5)的可变重(VH)结构域互补决定区1(CDR1)，具有氨基酸序列AIHPGYGGTAYNQKFKG(SEQ ID NO：6)的VH结构域CDR2，具有氨基酸序列FITKFDY(SEQID NO：7)的VH结构域CDR3，具有氨基酸序列KSSQSLLDSDGKTFLN(SEQ ID NO：8)的可变轻(VL)结构域CDR1、具有氨基酸序列LVSKLDS(SEQ ID NO：9)的VL结构域CDR2，以及具有氨基酸序列WQGTHFPWT(SEQ ID NO：10)的VL结构域CDR3。
对表位NCPVPGKPGE(SEQ ID NO：2)、PVPGKPGEAV(SEQ ID NO：3)和NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO：4)具有特异性的单克隆抗TKl抗体包含具有氨基酸序列DYEMH(SEQ ID NO：5)的VH结构域CDR1、具有氨基酸序列AILPGSGGTAYNQKFKG(SEQ ID NO：17)的VH结构域CDR2、具有氨基酸序列LITTFDY(SEQ ID NO：18)的VH结构域CDR3、具有氨基酸序列KSSQSLLDSDGKTYLN(SEQ ID NO：19)的VL结构域CDR1、具有氨基酸序列LVSKLDS(SEQ ID NO：9)的VL结构域CDR2，以及具有氨基酸序列WQGTHFPWT(SEQ ID NO：10)的VL结构域CDR3。
在另一个实施方式中，抗TK1抗体对人TK1的构象依赖性表位具有特异性。对这种构象依赖性表位具有特异性的单克隆抗TK1抗体包含具有氨基酸序列SGYSWH(SEQ ID NO：11)的VH结构域CDR1、具有氨基酸序列YIHYSGSTTYNPSLKG(SEQ ID NO：12)的VH结构域CDR2、具有氨基酸序列WGTGHWYFDV(SEQ ID NO：13)的VH结构域CDR3、具有氨基酸序列RSSTGAVTTTNYAN(SEQ ID NO：14)的VL结构域CDR1、具有氨基酸序列GTNNRVP(SEQ ID NO：15)的VL结构域CDR2，以及具有氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：16)的VL结构域CDR3。
WO 2015/094106中进一步公开了可根据实施方式使用的单克隆抗TK1抗体的上述三个实例。
因此，在一个实施方式中，单克隆抗体或其片段选自对人TK1的GEAVAARKLF(SEQID NO：1)具有特异性的单克隆抗体或其片段，对人TK1的NCPVPGKPGE(SEQ ID NO：2)、PVPGKPGEAV(SEQ ID NO：3)和NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO：4)中的至少一种的具有特异性的单克隆抗体或其片段，以及对人TK1的构象依赖性表位具有特异性的单克隆抗体或其片段。
在另一个实施方式中，抗TK1抗体对由KPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID NO：20)组成的表位或肽具有特异性。
WO 95/29192中进一步公开了对该表位具有特异性的抗TK1抗体。
至少一种另外的氨基酸、例如半胱氨酸残基可以添加到肽的N-末端或C-末端、优选N-末端，以用作与其他分子、例如载体蛋白的偶联。
在另一个实施方式中，抗TK1抗体对由来自TK1活性位点的氨基酸序列组成的表位或肽具有特异性。肽优选地选自人TK1中氨基酸位置150至氨基酸位置190的一部分TK1。在一个具体实施方式中，肽选自从氨基酸位置155、优选160、更优选161至氨基酸位置185、优选183的一部分TKl。
肽优选为M聚体，其中M是10至40范围内，优选20至30范围内的整数，更优选23或24。
该肽优选由TK1蛋白活性位点中的M个连续氨基酸组成。
至少一种另外的氨基酸、例如半胱氨酸残基可以添加到肽的N-末端或C-末端、优选N-末端，以用作与其他分子、例如载体蛋白的偶联。
在一个实施方式中，由来自TK1活性位点的氨基酸序列组成的肽具有与人TK1中161至183位氨基酸相对应的氨基酸序列，即具有AYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHS的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。
WO 2008/142664中进一步公开了对该表位具有特异性的抗TK1抗体。
在进一步的实施方式中，抗体或其片段是如WO 2019/201901中公开的单克隆抗体或其片段。
例如，单克隆抗体可以是mAb 6C6、mAb 4H4或mAb 23C11。
mAb 6C6 VH结构域(SEQ ID NO：22)：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLEESGGDLVKPEGSLTLTCTASRFSFSSSYWICWVRQAPGKGLEWIACIYAGDSGSSYYASWAKGRFTVSKTSSTTVTLQTTSLTAADTATYFCARASVGAAYDYFALWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCWNSYGEP
mAb 6C6 VL结构域(SEQ ID NO：23)：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCALVMTQTPASVEAAMGGTVTIKCQASEDVSSHLAWYQQRPGQPPKLLIYGASDLASGVPSRFTGSGSGTQFTLAISDLECADAATYYCQGYYYISDSPYVFGGGTEVVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVGTTVTVCVANKYFPDVQTVTADCVTSQNSQNRGTSTDCVTSQNSFQ
mAb 4H4 VH结构域(SEQ ID NO：24)：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSFSSGYDMCWVRQTPGKGLEWIACISVDSDGVTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGYESSSGVYIPYFTLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCVNSY
mAb 4H4 VL结构域(SEQ ID NO：25)：
MDMRAPTQLLGLLLLWLPGARCADIVLTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASQSIYSYLAWYQHKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISDLECADAATYYCQHYYYSSTSGGGVFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYLSDGNSQVTSGTQNTRGIVGTQFQNTQFGTVGTSQFGTQFGTVGTSQFQNGFWGTVTSGVPSRFKGSGTEY
mAb 23C11 VH结构域(SEQ ID NO：26)：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYMSWVRQAPGKGLEWIGIIYGDDNTYCANWTKGRFTISKTSTTVDLTITSPTTEDTATYFCARGPDYIAAKMDIWGPGTLVTVSLGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSG
mAv 23C11 VL结构域(SEQ ID NO：27)：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASQSISGYLSWYQQKPGQRPKLLIYRASTLESGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQCTYGSSTFSSYGNAFGGGTEVVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYADCTQNSGVTQNTRQFPSQNSGTVQNKYADCTQNSGVTSGQNTRGQFQNTQFQNSGTVK
在一个实施方式中，身体样品中TK1物质的水平是使用试剂盒确定的。该试剂盒优选包含固定到支持物或旨在固定到支持物的第一或所谓的捕获抗TK1抗体和第二或所谓的检测抗TK1抗体。第一和第二抗TK1抗体可选自上述单克隆和多克隆抗TK1抗体的说明性实例。
在一个具体实施方式中，该试剂盒包含对选自以下的表位具有特异性的第一单克隆抗体或其第一片段：i)人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID NO：1)，ii)NCPVPGKPGE(人TK1的SEQID NO：2)、PVPGKPGEAV(SEQ ID NO：3)和NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO：4)，和iii)人TK1的构象依赖性表位。该试剂盒还包含对选自以下的表位具有特异性的第二单克隆抗体或其第二片段：i)人TK1的GEAVAARKLF(SEQ ID NO：1)，ii)人TK1的NCPVPGKPGE(SEQ ID NO：2)、PVPGKPGEAV(SEQ ID NO：3)和NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO：4)中的至少一个，和iii)人TK1的构象依赖性表位。
在一个实施方式中，第一抗体或其第一片段是固定到支持物或旨在固定到支持物的所谓的捕获抗体，而第二抗体或其第二片段是所谓的检测抗体。在另一个实施方式中，第二抗体或其第二片段是固定至支持物或旨在固定至支持物的捕获抗体，而第一抗体或其第一片段用作检测抗体。
在一个实施方式中，第一和第二抗TK1抗体对人TK1中的不同表位具有特异性。
在另一个实施方式中，第一和第二抗TK1抗体对人TK1中的相同表位具有特异性。这是可能的，因为在多个TK1蛋白质单位的高分子量复合物中可能存在多个拷贝的相同表位。因此，TK1物质可以是多个，即至少两个TK1蛋白质单位的多价复合物。
因此，本文所用的TK1物质包括TK1蛋白、具有多个TK1蛋白单元的复合物，例如二聚体、三聚体、四聚体等。TK1物质还包括具有至少一个TK1蛋白单元和其他分子和/或大分子的复合物。
在一个实施方式中，第一和第二抗TK1抗体中的一个对由来自TK1活性位点的氨基酸序列组成的肽具有特异性，而第一和第二抗TK1抗体中的另一个对由TK1 C-末端区域的氨基酸序列组成的肽具有特异性。
在另一个实施方式中，第一和第二抗TK1抗体中的一个对由TK1的C末端区域的第一氨基酸序列组成的肽具有特异性，并且第一和第二抗TK1抗体中的另一个对由TK1 C-末端区域的第一氨基酸序列或TK1 C-末端区域的第二不同氨基酸序列组成的肽具有特异性。
在另一个实施方式中，第一和第二抗TK1抗体中的一个对由TK1的C末端区域的氨基酸序列组成的肽具有特异性，并且第一和第二抗TK1抗体中的另一个对人TK1的构象依赖性表位具有特异性。
如本文所用的抗体片段可选自单链抗体、Fv片段、scFv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fd片段、单域抗体(sdAb)、scFv-Fc片段、di-scFv片段和CDR区。
抗体或其片段与TK1物质特异性结合，特别是与TK1蛋白特异性结合。
抗体的特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。由抗原与抗体解离的平衡常数(KD)表示的亲和力是抗原决定簇与抗体上抗原结合位点之间结合强度的量度。KD值越小，抗原决定簇与抗体之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和力常数(KA)，即1/KD。本领域技术人员将清楚，亲和力可以以本身已知的方式确定，这取决于感兴趣的特定抗原。
亲合力是抗体与相关抗原之间结合强度的量度。亲合力与抗原决定簇与其在抗体上的抗原结合位点之间的亲和力以及抗体上存在的相关结合位点的数量有关。
通常，抗体将以10-5至10-12摩尔/升(M)或更低，优选10-7至10-12M或更低，更优选10-8至10-12M的解离常数(KD)与其抗原结合，即结合常数(KA)为105至1012M-1或更大，优选107至1012M-1或更大，更优选108至1012M-1。
通常，任何大于10-4M的KD值(或任何小于104M-1的KA值)都被认为表示非特异性结合。
优选地，实施方式的抗TK1抗体或片段将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM、例如小于5nM的亲和力结合人TK1的血清形式。
抗体或其片段与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何合适的方式测定，包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，以及本领域本身已知的其不同变体。
在一个实施方式中，该试剂盒是夹心测定试剂盒。在一个特定的实施方式中，该试剂盒是ELISA试剂盒，优选夹心ELISA。
在下面的讨论中，假设第一抗TK1抗体或第一片段是捕获抗体，而第二抗TK1抗体或第二片段充当检测抗体。然而，实施例不限于此，而是可以切换捕获抗体和检测抗体。
夹心ELISA可用于通过制备支持物(例如固体支持物)的表面来检测生物样品中的TK1蛋白，第一抗TK1抗体作为所谓的捕获抗体与该表面结合。在一个优选的实施方式中，已知量的第一抗TK1抗体结合到支持物的表面。表面上的任何非特异性结合位点任选地但优选地被封闭。然后将生物样品施加到表面，以便其中存在的任何TK1蛋白将被固定的第一抗TK1抗体捕获。未结合的物质优选地通过一个或多个洗涤步骤去除。然后加入通常表示为检测抗体的第二抗TK1抗体，并使其与由第一抗TK1抗体捕获的任何TK1蛋白结合。
然后通过直接或间接检测方法确定结合的第二抗TK1抗体的量。例如，标记或酶可以直接连接到第二抗TK1抗体上，或者通过连接、例如生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素连接来间接连接。或者，可以使用标记或连接到酶并与第二抗TK1抗体特异性结合的第二抗体。
因此，在一个实施方式中，第二抗TK1抗体具有共价连接的生物素。或者，第二抗TK1抗体具有共价连接的链霉亲和素或亲和素。
该试剂盒优选还包括辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素或HRP标记的亲和素。或者，该试剂盒还包含HRP标记的生物素。该试剂盒还包含HRP底物，例如3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)底物或2,2'-叠氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)底物。在这种情况下，样品中TK1蛋白的水平可以通过分光光度法确定，该方法检测HRP将显色底物转化为可检测的有色产物。
在一个实施方式中，该试剂盒还包括作为支持物的微量滴定板(MCP)，其上固定或旨在固定第一抗TK1抗体。
可以根据实施方式使用的合适的ELISA试剂盒是由瑞典乌普萨拉的AroCell AB生产的AroCell TK 210ELISA。
该试剂盒不一定必须是ELISA试剂盒。在另一个实施方式中，该试剂盒使用亲和层析，其中第一抗TK1抗体与固定相、例如与柱中的凝胶基质或珠子结合。例如，凝胶基质或珠子可以由琼脂糖制成，例如
Figure BDA0003329334140000172
在这种情况下，生物样品中存在的TK1蛋白将通过与固定的第一抗TK1抗体结合而被截留在柱中。洗涤后，可以使用第二抗TK1抗体洗脱并检测结合的TK1蛋白。例如，洗脱的TK1蛋白的量可以使用蛋白质印迹法和第二抗TK1抗体来确定，用于使用直接或间接检测方法进行TK1检测。
支持物也可以是磁珠，例如
Figure BDA0003329334140000171
磁珠。
该试剂盒不一定必须包含两种抗TK1抗体，而是可以仅包含一种类型的抗TK1抗体。
此外，该试剂盒不一定必须包含所谓的捕获抗TK1抗体。形成鲜明对比的是，可以使用多种、即至少两种不同的抗TK1抗体来确定TK1物质的水平，而无需固定至少一种抗TK1抗体。
在一个实施方式中，患者是人患者，优选成人患者。
在一个实施方式中，该方法还包括基于估计的可能性、诊断或基于确定的来自患者的身体样品中TK1物质的水平获得的分类为患者选择治疗。
因此，为患者选择最佳或至少合适的治疗是基于所确定的身体样品中TK1物质的水平，并由此基于患者的呼吸道感染是否被预测为由肺炎支原体引起、即患者是否可能患支原体肺炎，或由病毒或其他细菌引起、即患者是否可能患病毒性肺炎或由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。这意味着具有高确定水平的TK1物质并因此预测患有支原体肺炎的患者可以选择适合对抗肺炎支原体感染的治疗，而具有相对较低水平的TK1物质的患者可以选择治疗适用于对抗病毒或其他细菌感染的治疗。适用于支原体肺炎的治疗方法包括针对核糖体复合物中细菌rRNA的抗生素，包括大环内酯类、四环素类、酮内酯类和氟喹诺酮类。根除肺炎支原体感染的困难是由于该细菌能够在个体内持续存在，以及肺炎支原体缺乏细胞壁，这使得针对细菌细胞壁的多种抗生素无法有效治疗感染。因此，肺炎支原体对抗微生物剂表现出抗性，例如β-内酰胺类、糖肽类、磺胺类、甲氧苄啶、多粘菌素、萘啶酸和利福平。
如前所述，根据实施方式的TK1蛋白测定可以与肺炎支原体的至少一种其他生物标志物组合，包括但不限于CRP、PCT、钙卫蛋白及B-HNL和/或P-HNL。该方法然后可以包括至少一个另外的步骤，即确定从受试者获得的身体样品中CRP、PCT、钙卫蛋白和/或B-HNL和/或P-HNL的水平。在这样的实施方式中，估计可能性包括基于确定的TKl物质水平和确定的CRP、PCT、钙卫蛋白和/或B-HNL和/或P-HNL水平来估计呼吸道感染是由肺炎支原体引起的支原体肺炎的可能性。相应地，在这样的实施方式中，诊断受试者包括基于确定的TK1物质水平和确定的CRP、PCT、钙卫蛋白和/或B-HNL和/或P-HNL水平来诊断受试者患有支原体肺炎。
实施例
实施例1
由瑞典乌普萨拉的AroCell AB生产的夹心AroCell TK 210ELISA被用作TK1活性测定的替代方法。这种ELISA是一种定量酶免疫分析，它基于向涂有另一种单克隆抗TK1抗体的微量滴定孔中依次添加样品、生物素标记的抗TK1单克隆抗体、链霉亲和素标记的酶偶联物和底物[4]。
本研究的目的是调查与其他病毒和细菌感染引起的血清TK1蛋白浓度相比，肺炎支原体的急性感染、更特别是下呼吸道感染是否会改变血清TK1蛋白浓度。研究中患者的纳入标准是发热>38℃以及急性感染的体征和症状。一个对照组是144名明显未感染的健康受试者，第二个对照组是98名临床诊断为细菌感染的患者。下呼吸道感染通过肺部X光检查以及CRP、白细胞计数和在某些情况下的微生物检测结果进行验证。在肺炎组中，诊断通过胸部X光检查阳性来证实，并得到了下呼吸道样品中肺炎支原体阳性聚合酶链反应(PCT)检测的支持[5]。
结果清楚地显示，与健康受试者以及患有病毒性急性感染以及由细菌引起的下呼吸道感染的受试者相比，急性肺炎支原体感染患者的血清TK1蛋白水平显著增加。因此，这些结果表明TK1蛋白测定作为补充或替代其他生物标志物、如CRP和B-HNL的有价值的生物标志物，用于难以诊断的肺炎支原体感染。
材料和方法
不同形式感染的患者和诊断
162名出现急性感染症状的患者在临床上判断为细菌(n＝98)或病毒(n＝64)感染原因，并对他们进行了临床诊断。98名临床诊断为细菌感染的患者包括55名女性(中位年龄37岁；范围18至84岁)和43名男性(中位年龄48岁；范围20至90岁)。
入选标准是至少38℃的发烧和急性呼吸道感染的体征和症状。除了临床发现之外，判断者还知道CRP、白细胞计数、X射线检查结果，且在某些情况下，还有微生物测试结果。根据这些信息，判断患者的传染源是细菌还是病毒，即临床诊断为感染。通过肺部X光检查证实下呼吸道感染。排除标准为已知慢性病毒感染，如人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
AroCell TK 210ELISA程序
根据制造商的说明，使用AroCell TK 210ELISA测定血清样品中的TK1蛋白水平[4,6]。简而言之，血清样品、校准品和对照品与样品稀释缓冲液(SDB)在室温下预温育1小时。在加入温育的血清样品、校准品和对照之前，用洗涤缓冲液洗涤抗体预包被的板。在振动平台上温育2小时后，用洗涤缓冲液洗涤板4次。然后将板与生物素化的抗TK1抗体在振动平台上温育1小时。在另一个洗涤循环后，将板与酶标记的链霉亲和素一起温育30分钟。最后一次洗涤后，加入底物溶液并通过分光光度计在450nM下测量颜色强度。使用校准品作为标准和SDB作为空白与4-PL曲线拟合程序计算血清样品中的血清TK1蛋白水平。每个样品一式两份进行分析，平均值表示为μg/L。
统计方法
数据表示为中位数和四分位距。通过独立组的非参数Mann-Whitney检验进行组比较。为了评估生物标志物测定的临床性能，进行了受试者工作特征(ROC)分析，并通过c统计分析了曲线下面积(AUC)的比较。
对于统计的计算，使用了MedCalc统计软件版本16.4.3(MedCalc Software bvba，Ostend，比利时[https://www.medcalc.org]；2016)。
结果
图1显示了健康受试者和细菌、病毒或肺炎支原体感染患者的TK1蛋白浓度。在健康组和患者组之间的成对比较中，观察到P值<0.0001的显著差异。当患者组仅限于由细菌或肺炎支原体引起的上呼吸道感染患者时，两组之间的差异对于健康和细菌引起的肺炎仍然非常显著，见图2。
进行ROC曲线分析以评估TK1生物标志物在区分肺炎支原体患者组与健康对照组方面的潜在临床表现，见图3。曲线下面积(AUC)值为0.98，敏感性和特异性分别为95％和94％。
当将肺炎支原体组与急性细菌感染患者进行比较时，AUC值为0.84，敏感性和特异性分别为64％和90％，见图4。
图5显示了肺炎支原体组与病毒剂引起的急性感染患者相比的ROC曲线分析。在该实验中，AUC值为0.77，灵敏度为68％，特异性为81％。相反，当将肺炎支原体组与细菌性下呼吸道感染患者进行比较时，AUC值为0.81，敏感性和特异性分别为91％和68％，见图6。
CRP和降钙素原(PCT)以及嗜中性粒细胞计数已被用作细菌感染患者的生物标志物。在图7中，呈现了ROC曲线分析，其中将这些生物标志物与TK1进行了比较。从这些结果可以清楚地看出，在区分细菌和肺炎支原体感染方面，TK1优于任何其他生物标志物，差异显著，P值从<0.02至<0.0002。
导致肺炎支原体感染中血清TK1上调的机制尚不清楚。肺炎支原体是一种无壁细菌，因此缺乏脂多糖抗原。因此，该机制与大多数其他细菌不同。已经证明肺炎支原体诱导ATP从宿主细胞流出，这可以通过P2X7受体激活炎症小体，随后分泌IL-1β。其他研究还表明，肺炎支原体对宿主细胞的细胞粘附与炎症反应的诱导密切相关。因此，有证据表明肺炎支原体诱导宿主反应机制与其他细菌不同。
结果显示在图1至7中，其强烈表明血清TK1蛋白测定可作为敏感的血液生物标志物，用于区分肺炎支原体感染与其他感染原因，例如病毒或细菌病原体。TK1作为生物标志物明显优于CRP、PCT和中性粒细胞计数。因此，将TK1浓度作为生物标志物，特别是在下呼吸道疾病的情况下，可以显著改善大量寻求初级医疗保健的患者的体外诊断。
实施例2
正确诊断细菌、支原体或病毒的急性感染是一项临床挑战，对治疗决策有很大影响。目前对呼吸道肺炎支原体感染的诊断测试、如PCR和血清学要么有些不可靠，要么缓慢，不能完全满足准确快速诊断的临床需求。本实施例的目的是检查一组候选生物标志物及其区分肺炎支原体呼吸道感染与由细菌或病毒引起的呼吸道感染的能力。
材料和方法
研究组包括144名健康对照者，平均年龄为43.6±12.8岁，其中男性57名(年龄41.3±12.7岁)和女性87名(年龄45.0±12.8岁)；以及156名确诊为急性呼吸道感染病因的患者。纳入标准为发热>38℃和急性呼吸道感染的体征和症状。感染原因的临床诊断辅以客观的微生物/血清学检测。在抗生素治疗开始前抽血。该研究得到了乌普萨拉伦理委员会的批准。
在这156名患者中，86人有细菌感染，男性n＝41(54岁，IQ范围41-71)，女性n＝45(43岁，IQ范围29-66)；42人有病毒感染，男性n＝23(49岁，IQ范围39-73)，女性n＝19(40岁，IQ范围25-57)；并且28人有肺炎支原体感染，男性n＝14(年龄42.5岁，IQ范围34-61)和女性n＝14(年龄36.5岁，IQ范围22-44)。支原体感染的估计持续时间为168小时、130-196小时(中位数和IQ范围)。
生物标志物检测
HNL在EDTA血浆(Diagnostics Development，Uppsala，Sweden)中通过HNL测定法测量，该测定法配置为特异性捕获分子的二聚体，随后称为P-HNL二聚体。在EDTA血浆中测量钙卫蛋白(Gentian AS，Norway)。测定血清中的PCT(Thermo Fisher ScientificFrederick,MD,USA)和TK1(AroCell AB，Uppsala，瑞典)。所有生物标志物均根据制造商的使用说明运行。对于所有测定，重复样品的不精确度在4-10％CV之间。
统计数据
数据表示为中位数和四分位距或如所示的全范围。组的比较通过独立组的非参数Mann-Whitney检验或Kruskal-Wallis方差分析进行。生物标志物检测的临床性能通过受试者工作特征(ROC)分析进行评估。生物标志物组合的诊断性能表示为ROC曲线下面积(AuROC)，并通过逻辑回归分析计算。对于统计数据的计算，使用了MedCalc统计软件19.1.5版(MedCalc软件bvba，比利时奥斯坦德；http://www.medcalc.org；2020)。
结果
图9A和9B显示了由肺炎支原体或细菌引起的急性呼吸道感染患者中TK1和HNL二聚体在血浆/血清中的分布。与健康受试者的发现相比，肺炎支原体感染患者的S-TK1显著升高。与细菌感染相比，肺炎支原体感染中S-TK1的浓度(p<0.001)升高，而P-HNL二聚体的浓度(p<0.001)显著降低。
通过ROC曲线分析估计肺炎支原体呼吸道感染与细菌引起的呼吸道感染之间的区别。如图8所示，所有生物标志物都显示出显著的区别。P-HNL二聚体和S-TK1的AUC分别为0.82和0.79。
基于上述结果，在选定的生物标志物之间构建比率。为了区分肺炎支原体和细菌性呼吸道感染，血清和血浆中TK1和HNL二聚体的结果之间的比率分别使这些生物标志物的AUC增加到0.95。
来自由细菌引起的肺炎的支原体肺炎的临床诊断是一项挑战，目前依赖于临床体征和症状、基于PCR的诊断和血清学。轻度支原体肺炎可能会发展为严重疾病，因此早期发现和治疗很重要。在本实施例中，选择的不同血液生物标志物的结果与其区分支原体肺炎与细菌引起的下呼吸道感染的能力一起呈现。在与细菌感染的区别中，TK1和HNL的二聚体形式似乎特别令人感兴趣。肺炎支原体感染中TK1的浓度增加，这增加了它们的诊断性能。与细菌感染相比，肺炎支原体中的HNL二聚体较低。然而，在逻辑回归分析中，两种生物标志物都显著增加了诊断性能，导致非常高的AUC(0.95)和88％的正确分类患者百分比。TK1和P-HNL二聚体之间的比率似乎是区分肺炎支原体和细菌感染的优越诊断比率，并且与逻辑回归的结果一致。
上述实施例应理解为本发明的几个说明性示例。本领域技术人员可以理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对实施例进行各种修改、组合和变化。特别地，在技术上可能的情况下，不同实施例中的不同部分方案可以在其他配置中组合。
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序列表
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asn Cys Pro Val Pro Gly Lys Pro Gly Glu
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Pro Val Pro Gly Lys Pro Gly Glu Ala Val
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Asn Cys Pro Val Pro Gly Lys Pro Gly Glu Ala Val
1 5 10
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗TK1抗体的VH CDR区域
<400> 5
Asp Tyr Glu Met His
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<212> PRT
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<220>
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<400> 6
Ala Ile His Pro Gly Tyr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗TK1抗体的VH CDR区域
<400> 7
Phe Ile Thr Lys Phe Asp Tyr
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<220>
<223> 单克隆抗TK1抗体的VL CDR区域
<400> 8
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 单克隆抗TK1抗体的VL CDR区域
<400> 9
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
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<220>
<223> 单克隆抗TK1抗体的VL CDR区域
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Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr
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<220>
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Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Gly
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Trp Gly Thr Gly His Trp Tyr Phe Asp Val
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<220>
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<400> 14
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Thr Asn Tyr Ala Asn
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Gly Thr Asn Asn Arg Val Pro
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<220>
<223> 单克隆抗TK1抗体的VL CDR区域
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Ala Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
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Gly
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Leu Ile Thr Thr Phe Asp Tyr
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<220>
<223> 单克隆抗TK1抗体的VL CDR区域
<400> 19
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Lys Pro Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro Gln
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Thr Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly
1 5 10 15
Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser
20
<210> 22
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TK1抗体的VH结构域
<400> 22
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Glu Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Arg Phe Ser Phe
35 40 45
Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Asp Ser Gly Ser Ser Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser
85 90 95
Thr Thr Val Thr Leu Gln Thr Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Ala Tyr Asp Tyr Phe
115 120 125
Ala Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro
130 135 140
Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro
145 150 155 160
Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly
180 185
<210> 23
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TK1抗体的VL结构域
<400> 23
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser
20 25 30
Val Glu Ala Ala Met Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Glu Asp Val Ser Ser His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
50 55 60
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Ala
85 90 95
Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Ile Ser Asp Ser Pro Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu
115 120 125
Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val
145 150 155 160
Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly
165 170 175
Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser
180 185 190
Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr
195 200 205
Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr
210 215 220
Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 24
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TK1抗体的VH结构域
<400> 24
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Glu Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
35 40 45
Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Ala Cys Ile Ser Val Asp Ser Asp Gly Val Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr
85 90 95
Thr Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Glu Ser Ser Ser Gly Val Tyr Ile Pro
115 120 125
Tyr Phe Thr Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp
145 150 155 160
Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly
180 185
<210> 25
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TK1抗体的VL结构域
<400> 25
Met Asp Met Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala
20 25 30
Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
His Tyr Tyr Tyr Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val
145 150 155 160
Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val
165 170 175
Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln
180 185 190
Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
195 200 205
Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln
210 215 220
Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 26
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TK1抗体的VH结构域
<400> 26
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45
Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Gly Asp Asp Asn Thr Tyr Cys Ala Asn Trp
65 70 75 80
Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Thr Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Arg Gly Pro Asp Tyr Ile Ala Ala Lys Met Asp Ile Trp Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Leu Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
165 170 175
Asn Ser Gly
<210> 27
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TK1抗体的VL结构域
<400> 27
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser
20 25 30
Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys
100 105 110
Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile
145 150 155 160
Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu
165 170 175
Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro
180 185 190
Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr
210 215 220
Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 28
<211> 234
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Met Ser Cys Ile Asn Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Lys
1 5 10 15
Thr Arg Gly Gln Ile Gln Val Ile Leu Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys
20 25 30
Ser Thr Glu Leu Met Arg Arg Val Arg Arg Phe Gln Ile Ala Gln Tyr
35 40 45
Lys Cys Leu Val Ile Lys Tyr Ala Lys Asp Thr Arg Tyr Ser Ser Ser
50 55 60
Phe Cys Thr His Asp Arg Asn Thr Met Glu Ala Leu Pro Ala Cys Leu
65 70 75 80
Leu Arg Asp Val Ala Gln Glu Ala Leu Gly Val Ala Val Ile Gly Ile
85 90 95
Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Val Glu Phe Cys Glu Ala Met
100 105 110
Ala Asn Ala Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr Phe
115 120 125
Gln Arg Lys Pro Phe Gly Ala Ile Leu Asn Leu Val Pro Leu Ala Glu
130 135 140
Ser Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Glu Cys Phe Arg Glu Ala
145 150 155 160
Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Thr Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly
165 170 175
Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser Val Cys Arg Leu Cys Tyr Phe Lys Lys
180 185 190
Ala Ser Gly Gln Pro Ala Gly Pro Asp Asn Lys Glu Asn Cys Pro Val
195 200 205
Pro Gly Lys Pro Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro
210 215 220
Gln Gln Ile Leu Gln Cys Ser Pro Ala Asn
225 230

Claims (28)

1.一种预测患有呼吸道感染的受试者存在支原体肺炎的方法，所述方法包括：
用抗TK1抗体或其片段确定从所述受试者获得的身体样品中胸苷激酶1(TK1)物质的水平；以及
基于所确定的所述身体样品中TK1物质的水平来估计所述呼吸道感染是由肺炎支原体引起的支原体肺炎的可能性。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所确定的所述身体样品中TK1物质的水平与阈值进行比较，其中估计所述可能性包括基于所述比较来估计所述呼吸道感染是由肺炎支原体引起的支原体肺炎的可能性。
3.根据权利要求2所述的方法，其中估计所述可能性包括：如果所确定的所述身体样品中TK1物质的水平超过所述阈值，则估计所述呼吸道感染是由肺炎支原体引起的支原体肺炎的高可能性，否则估计所述呼吸道感染是由肺炎支原体引起的支原体肺炎的低可能性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其还包括：
确定从所述受试者获得的所述身体样品或另一身体样品中至少一种其他生物标志物的水平，其中所述至少一种其他生物标志物选自由C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、钙卫蛋白和人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)组成的组，优选由CRP、PCT和HNL组成的组，且更优选HNL，其中，
估计所述可能性包括：基于所确定的所述身体样品中TK1物质的水平和基于所确定的所述身体样品或所述另一身体样品中所述至少一种其他生物标志物的水平，所述呼吸道感染是由肺炎支原体引起的支原体肺炎的可能性。
5.一种诊断受试者的支原体肺炎的方法，所述方法包括：
用抗TK1抗体或其片段确定从所述受试者获得的身体样品中胸苷激酶1(TK1)物质的水平；以及
基于所确定的所述身体样品中TK1物质的水平来诊断所述受试者患有支原体肺炎。
6.根据权利要求5所述的方法，其还包括将所确定的所述身体样品中TK1物质的水平与阈值进行比较，其中诊断所述受试者包括基于所述比较来诊断所述受试者患有支原体肺炎。
7.根据权利要求6所述的方法，其中诊断所述受试者包括：如果所确定的所述身体样品中TK1物质的水平超过所述阈值，则诊断所述受试者患有支原体肺炎。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其还包括：
确定从所述受试者获得的所述身体样品或另一身体样品中至少一种其他生物标志物的水平，其中所述至少一种其他生物标志物选自由C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、钙卫蛋白和人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)组成的组，优选由CRP、PCT和HNL组成的组，且更优选HNL，其中，
诊断所述受试者包括：基于确定的所述身体样品中TK1物质的水平和基于所确定的所述身体样品或所述另一身体样品中所述至少一种其他生物标志物的水平，诊断所述受试者患有支原体肺炎。
9.一种对受试者的呼吸道感染进行分类的方法，所述方法包括：
用抗TK1抗体或其片段确定从所述受试者获得的身体样品中胸苷激酶1(TK1)物质的水平；
基于所确定的所述身体样品中TK1物质的水平，将所述呼吸道感染分类为由肺炎支原体引起的支原体肺炎，或将所述呼吸道感染分类为由病毒引起的病毒性肺炎、或由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
10.根据权利要求9所述的方法，其还包括：
确定从所述受试者获得的所述身体样品或另一身体样品中至少一种其他生物标志物的水平，其中所述至少一种其他生物标志物选自由C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、钙卫蛋白和人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)组成的组，优选由CRP、PCT和HNL组成的组，且更优选HNL，其中，
对所述呼吸道感染进行分类包括：基于所确定的所述身体样品中TK1物质的水平和基于所确定的所述身体样品或所述另一身体样品中所述至少一种其他生物标志物的水平，将所述呼吸道感染分类为由肺炎支原体引起的支原体肺炎，或将所述呼吸道感染分类为由病毒引起的病毒性肺炎、或由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其还包括：
确定从受试者获得的所述身体样品或另一身体样品中人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)的水平；以及
计算所确定的所述身体样品中TK1物质的水平与所确定的所述身体样品或所述另一身体样品中HNL水平之间的商，其中，
对所述呼吸道感染进行分类包括：如果所述商超过阈值，则将所述呼吸道感染分类为由肺炎支原体引起的支原体肺炎，否则将所述呼吸道感染分类为由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
12.一种对受试者的呼吸道感染进行分类的方法，所述方法包括：
用抗TK1抗体或其片段确定从所述受试者获得的身体样品中胸苷激酶1(TK1)物质的水平；
如果所确定的所述身体样品中TK1物质的水平超过阈值，则将所述呼吸道感染分类为由肺炎支原体引起的支原体肺炎，否则将所述呼吸道感染分类为由病毒引起的病毒性肺炎、或由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
13.根据权利要求12所述的方法，其中对所述呼吸道感染进行分类包括：如果所确定的所述身体样品中TK1物质的水平超过所述阈值，则将所述呼吸道感染分类为由肺炎支原体引起的支原体肺炎，否则将所述呼吸道感染分类为由肺炎支原体以外的细菌引起的细菌性肺炎。
14.根据权利要求13所述的方法，其还包括从所述受试者获得所述身体样品。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述身体样品为包含TK1物质的体液样品，所述体液样品优选地选自血清样品、血浆样品和血液样品。
16.根据权利要求15所述的方法，其中确定所述TK1物质的水平包括：用所述抗TK1抗体或其片段确定从所述受试者获得的血清或血浆样品中血清TK1(STK1)物质的水平。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中确定所述TK1物质的水平包括：
使所述身体样品与所述抗TK1抗体或其片段接触；以及
确定与所述TK1物质结合的抗TK1抗体或片段的量。
18.根据权利要求17所述的方法，其中确定所述TK1物质的水平包括：基于所确定的结合的抗TK1抗体或片段的量、以及结合的抗TK1抗体或片段的量与TK1物质的水平之间的标准相关性，确定所述身体样品中TK1物质的水平。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述抗TK1抗体是单克隆抗TK1抗体。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述抗TK1抗体对由TK1的C端区域的氨基酸序列组成的表位具有特异性，所述氨基酸序列优选地选自TK1中氨基酸位置200至氨基酸位置234的范围内，更优选TK1中氨基酸位置205至氨基酸位置230的范围内，并且甚至更优选TK1中氨基酸位置210至氨基酸位置225的范围内的一部分TK1。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述表位是N聚体，其中N是8至20范围内、优选10至15范围内的整数。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述表位选自由GEAVAARKLF SEQ ID NO：1、NCPVPGKPGE SEQ ID NO：2、PVPGKPGEAV SEQ ID NO：3和NCPVPGKPGEAV SEQ ID NO：4组成的组。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述抗TK1抗体是对由GEAVAARKLFSEQ ID NO：1组成的表位具有特异性并具有以下的单克隆抗TK1抗体：
具有氨基酸序列DYEMH SEQ ID NO：5的可变重(VH)结构域互补决定区1(CDR1)；
具有氨基酸序列AIHPGYGGTAYNQKFKG SEQ ID NO：6的VH结构域CDR2；
具有氨基酸序列FITKFDY SEQ ID NO：7的VH结构域CDR3；
具有氨基酸序列KSSQSLLDSDGKTFLN SEQ ID NO：8的可变轻(VL)结构域CDR1；
具有氨基酸序列LVSKLDS SEQ ID NO：9的VL结构域CDR2；以及
具有氨基酸序列WQGTHFPWT SEQ ID NO：10的VL结构域CDR3。
24.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述抗TK1抗体是对表位NCPVPGKPGE SEQ ID NO：2、PVPGKPGEAV SEQ ID NO：3和NCPVPGKPGEAV SEQ ID NO：4具有特异性并具有以下的单克隆抗TK1抗体：
具有氨基酸序列DYEMH SEQ ID NO：5的可变重(VH)结构域互补决定区1(CDR1)；
具有氨基酸序列AILPGSGGTAYNQKFKG SEQ ID NO：17的VH结构域CDR2；
具有氨基酸序列LITTFDY SEQ ID NO：18的VH结构域CDR3；
具有氨基酸序列KSSQSLLDSDGKTYLN SEQ ID NO：19的可变轻(VL)结构域CDR1；
具有氨基酸序列LVSKLDS SEQ ID NO：9的VL结构域CDR2；以及
具有氨基酸序列WQGTHFPWT SEQ ID NO：10的VL结构域CDR3。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述抗TK1抗体是对TK1的构象依赖性表位具有特异性并具有以下的单克隆抗TK1抗体：
具有氨基酸序列SGYSWH SEQ ID NO：11的可变重(VH)结构域互补决定区1(CDR1)；
具有氨基酸序列YIHYSGSTTYNPSLKG SEQ ID NO：12的VH结构域CDR2；
具有氨基酸序列WGTGHWYFDV SEQ ID NO：13的VH结构域CDR3；
具有氨基酸序列RSSTGAVTTTNYAN SEQ ID NO：14的可变轻(VL)结构域CDR1；
具有氨基酸序列GTNNRVP SEQ ID NO：15的VL结构域CDR2；以及
具有氨基酸序列ALWYSNHWV SEQ ID NO：16的VL结构域CDR3。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中确定所述TK1物质的水平包括用包含以下的试剂盒确定从所述受试者获得的所述身体样品中TK1物质的水平：
固定到支持物或旨在固定到支持物的第一抗TK1抗体；以及
第二抗TK1抗体，其中所述第一抗TK1抗体和所述第二抗TK1抗体优选地选自如权利要求17至19中任一项所定义的单克隆抗TK1抗体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，
所述第一抗TK1抗体是如权利要求23或24所定义的单克隆抗TK1抗体；并且
所述第二抗TK1抗体是如权利要求23或24所定义的单克隆抗TK1抗体。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述试剂盒是酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，优选夹心ELISA试剂盒。
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