CN101760520A - 一种检测肺炎支原体的靶序列及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的遗传标记和方法，具体地，本发明提供了肺炎支原体一组高度保守的重复核苷酸序列，以及以该序列为基础设计的寡核苷酸引物和探针。本发明还提供了用这些引物和探针特异性和高灵敏度检测肺炎支原体的方法以及由此获得的肺炎支原体检测试剂盒。

Description

一种检测肺炎支原体的靶序列及试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，特别是涉及一种聚合酶链式反应扩增P1细胞粘附蛋白基因(P1 Cytadhesin Gene)的重复序列，从而高灵敏度特异检测临床样本肺炎支原体的方法，以及利用该方法获得的实时荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

支原体肺炎是一种非常严重的传染性疾病，在肺炎中，支原体肺炎约占15％～20％，并且导致多种并发症，支原体肺炎是由肺炎支原体引起的急性肺部感染。肺炎支原体广泛存在，无地区性差别，平时散发，支原体肺炎每4～5年有1次流行。发病季节不明显，寒冷季节发病率较高，占住院肺炎的10％～20％，流行期间可占30％。肺炎支原体的感染可发生在不同年龄的小儿，在年长儿多见，在新生儿中报道不多。蒋巍等报道了新生儿感染14例，认为孕妇生殖道支原体感染，经宫内或产道可感染胎儿和新生儿，是引起早产、新生儿低体重、新生儿肺炎和中枢感染的主要原因。肺炎支原体的感染率有逐年增多的趋势。支原体感染的临床主要表现为咳嗽、咳痰、哮喘、气促、胸闷、胸痛及不同程度的发热和惊厥等。

肺炎支原体感染也可导致一系列呼吸系统外疾病，可引起支原体血症，直接侵犯各系统、组织引起病变。国外报道，从肺炎支原体呼吸道感染的病例血液中直接分离出肺炎支原体，提示肺炎支原体可进入血液，存在呼吸系统以外的部位增殖的可能性。支原体感染引起的肺外并发症常累及心血管系统、血液系统、中枢神经系统、皮肤及肝肾器官。国外报道，皮疹发生率为25％，皮疹形态可为红色斑丘疹、麻疹样或猩红热样皮疹，也可有水疱、大疱性疹，7％为中枢神经系统损害，以支原体脑炎多见，可并发心肌炎、心包炎甚至心力衰竭，发生率4％-5％，泌尿系统可出现蛋白尿、血尿和肾功能衰竭。发病机制除直接侵袭、毒紊作用外，目前倾向于免疫损伤。

石蕙文等报道支原体肺炎并发一过性单纯红细胞再生障碍性贫血1例，其原因可能与感染直接抑制红细胞DNA合成或免疫紊乱有关。支原体肺炎造成溶血多为自身免疫性溶血，随着支原体肺炎的好转，患儿红细胞系造血恢复，预后良好。

可见，要消灭肺炎支原体需要多方努力，如发展快速诊断方法、研制新药、进行分子机制研究和疫苗研究等，其中发展快速诊断方法最为紧迫。目前常用的检查方法包括：冷凝聚试验、间接血凝抑制试验、补体结合试验、肺炎支原体的培养、聚合酶链反应(PCR)。支原体肺炎的诊断有病原体培养、多种特异性血清学检查，近年又有基因探针及DNA、PCR方法。而冷凝聚试验、间接血凝抑制试验、补体结合试验及肺炎支原体的培养由于特异性差、敏感性低等问题在临床应用价值受限。冷凝聚试验、支原体抗体测定时两者的高峰出现晚，多在2～4周，并与患者年龄、免疫功能、感染轻重、病程的长短有密切关系。肺炎支原体感染后血清冷凝聚抗体阳性者，仅仅占45％～75％。婴幼儿由于免疫系统发育未完善，部分免疫功能低下，在肺炎支原体感染时抗体产生不足，从而影响检出率，咽拭培养分离肺炎支原体，对于一些血清学不能诊断肺炎支原体的患儿，可提高检出阳性率。LISA方法测定特异性MP-IgA，其阳性率达56.01％；用颗粒凝聚法测定的MP-IgM，其阳性率达60.81％。目前国内外一致认为MP-IgM、MP-IgG等特异性抗体测定是临床诊断肺炎支原体感染较为可靠的指标之一。Granstorm认为，测定MP-IgA抗体比MP-IgM更有价值。其原因是MP-IgM抗体的产生可因浆细胞受非相关抗原(如呼吸道病毒等)刺激后出现非特异反应，而MP-IgA的产生不受这些因素的影响。在MP-IgA阳性的基础上，MP-IgM的进一步的上升或下降可以提示有无支原体感染的可能。

近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，特异性好，速度快等优点在基因表达水平分析、病原体的定性检测和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法。

对于聚合酶链式反应(PCR)来说，选择待扩增的靶DNA的碱基序列最为重要。针对肺炎支原体，这个碱基序列必须为肺炎支原体特异拥有并且不能存在于为人类的DNA基因组及可能发生合并感染的其它物种中。许多研究者已经报告了类似的碱基序列，最具代表性的是原核生物中高度保守基因序列16S rRNA，16S rRNA基因的大小为1500bp左右，具有：(1)高保守性，在生物进化中比其它基因演变得慢，有“分子化石”之称；(2)保守性是相对的，不同科、属、种间都有不同程度的差异；(3)不能侧向转移；(4)大小适度，能满足进行比较、扩增的要求。所以，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增检测肺炎支原体，16S rRNA基因具有一定优势。因此，16S rRNA基因一直被广泛应用于聚合酶链式反应(PCR)的靶序列。然而，据最近的报告，肺炎支原体和生殖支原体的16S rRNA基因序列极为相近，在此基础上设计的引物，肺炎支原体和生殖支原体均会高效扩增。临床检测中，肺炎支原体感染患者的样本中经常发现混合有生殖支体，所以为了能准确区分二者，有必要寻找另外的肺炎支原体特异的碱基序列。

在肺炎支原体(MP)感染中，黏附宿主呼吸道上皮细胞和成功定植是感染的关键一步，黏附通过MP表面的P1蛋白介导与宿主细胞的分子受体结合。P1基因有2个重复区域和4个单拷贝区，在两型MP的P1基因上，重复区域的核苷酸序列和氨基酸序列有所差异，而3′端的单拷贝区核苷酸是高度保守的。因此，可选择P1基因3′端的单拷贝区作为聚合酶链式反应(PCR)的特异性靶序列，然而，临床中肺炎支原体感染初期病原体非常少，即使是荧光定量PCR检测也有漏检的可能。因此，本领域迫切需要开发新的高特异性、高灵敏度地检测肺炎支原体的方法和试剂盒。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明提供了一种高灵敏度检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的遗传标记和方法，具体地，本发明提供了肺炎支原体一组高度保守的重复核苷酸序列，以及以该序列为基础设计的寡核苷酸引物和探针。本发明还提供了用这些引物和探针特异性和高灵敏度检测肺炎支原体的方法以及由此获得的肺炎支原体检测试剂盒。

技术方案

本发明的第一方面是提供一种检测肺炎支原体的遗传标记物，它具有SEQID NO：1中连续的240bp高度保守重复核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的遗传标记物，它具有SEQ ID NO：2中连续的105个核苷酸序列。

本发明的第二方面是提供了一种肺炎支原体检测试剂盒，它含有特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对，所述的引物序列一条与SEQ ID NO：1所示的序列相同，且另一个引物序列与SEQ ID NO：1所示的序列互补，其引物对为：

上游引物SEQ ID NO：3为：5’-GAT TCT GTA CGA TGC GCC TTA-3’

下游引物SEQ ID NO：4为5’-GTT CTT CAA CTG GGC GGA TA-3’

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有探针，所述探针的核苷酸与SEQID NO：1所示的序列相同或互补，其检测探针为：

检测探针SEQ ID NO：5为：5’-FAM-CGC GTT GAT CAC TTG GAT CCCAA-TAMRA-3’；

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

在另一优选中，所述的试剂盒还包括DNA提取液、荧光PCR反应液、定量参考品、阳性对照品和阴性对照品。

在另一优选中，所述试剂盒的参考品为如下DNA序列SEQ ID NO：6为：

5’-GATTCTGTAC GATGCGCCTT ATGCGCGCAA CCGTACCGCCATTGACCGCG TTGATCACTT  GGATCCCAAG  GCCATGACCGCGAACTATCC  GCCCAGTTGA  AGAAC-3’。

本发明的第三方面是提供了一种肺炎支原体检测方法，它包括操作步骤：

①样品DNA提取；

②将提取的DNA作为模板，用特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)进行PCR扩增。

③检测扩增产物是否存在，存在扩增产物表示样品吕存在肺炎原体。

在另一优选择中，所述的检测方法是通过检测荧光信号的强弱来检测样品中肺炎支原体。

附图说明

图1为样本标准检测图。

图2为样品标准曲线图。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，从肺炎支原体基因组发现一组同源性相对保守的核苷酸序列，长约1300bp碱基对，此外，该序列即包含P1细胞粘附蛋白基因(P1 Cytadhesin Gene)，而基因为肺炎支原体本身特有的功能性基因序列，所编码的结构蛋白称为粘附蛋白。P1细胞粘附蛋白集聚于菌体顶端的突出部分，与肺炎支原体粘附宿主细胞有关，甚至可能与致病性有关，另外，P1细胞粘附蛋白的抗原性可能引起被感染宿主的抗体反应。因此，选择这一组含有特定结构性、功能性蛋白的核苷酸序列设计引物探针，具有选好的特征性。

根据这一组含有P1细胞粘附蛋白的核苷酸序列设计的引物探针，经NCBI比对，特异性非常好，而且在肺炎支原体的国际标准株(FH)、分离株(M129)以及临床标本中扩增出相应的DNA片段，说明以该组核苷酸序列为基础设计的PCP检测结果具有较好的特异性。

就灵敏度而言，该组特异性高核苷酸序列重复序列组成，以此序列为基础设计的引物探针并对肺炎支原体患者的临床标本进行荧光PCR检测时，结果显示为单基因检测灵敏度提高至少5～6倍。

因此，基于SEQ ID NO：1和1，本发明提供了一种利用PCR技术扩增一组同源性、特异性比较好、含有P1细胞粘附蛋白基因且的核苷酸序列检测肺炎支原体的方法，同时，检测灵敏度较检测单拷贝基因高5～6倍；还提供一种快速定量检测肺炎支原体的荧光定量PCR检测试剂盒。基中的关键是使用了特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对(SEQ ID NO：3和4)，且扩增产物长度为105bp。

本发明所述肺炎支原体专一性核酸分子引物具有极好的特异性。用本发明引物对进行常规PCR反应，结果能从含有肺炎支原体的材料中的DNA提取物中扩增出大小为105bp特异性PCR产物。因此，以本发明引物进行常规PCR反应，可以准确、快速检测肺炎支原体，而且所需的样品量很少。

为了减少假阳性，还可对扩增产物用肺炎支原体特异性探针进行杂交，一种优选的探针是TaqMan探针，它可在PCR反应中直接实时地通过荧光信号反映扩增产物的存在与否以及数量的高低。

本发明的探针5’端的报告荧光基团为FAM，3’端的淬灭荧光基团为TAMRA，可用于对肺炎支原体进行定性和定量分析的PCR反应。

将本发明的引物和TaqMan探针技术相结合，便得到了本发明克服了常规PCR中的误差，而且分析所需的样品量少，检出极限低，灵敏度高。

在一优选中：一种高灵敏度检测肺炎支原体试剂盒，该试剂盒包括DNA提取液、荧光PCR反应液、定量参考品、阳性对照品和阴性对照品。其中荧光PCR反应液含有PCR缓冲液、dNTPs溶液、MgCl₂溶液、特异性扩增引物对(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)和探针(SEQ ID NO：5)，荧光探针5’端的报告荧光基团为FMA，3’端的淬灭荧光基团为TAMRA；定量参考品是含有SEQ ID NO：6共105个核苷酸片段构成的T载体，且载体可在大肠杆菌DH5a中增殖。阳性对照品是肺炎支原体分离株(M129)的培养物。

在本发明的优选方案中，荧光PCR反应液包含10mM Tris-HCl(ph8.3)、50mM KCl、2.5mM MgCl₂、引物对各2.5pmol，荧光探针2.5pmol，0.2mMdNTPs、0.8单位Taq酶(TAKARA)和无菌双蒸水。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，Taq DNA聚合酶、购自美国Promega公司，引物和探针均由上海英骏公司合成，荧光PCR仪为ABI公司的7500。

实施例1：肺炎支原体临床样品处理及DNA提取

首先，用灭菌生理盐水漂洗临床样本(咽拭子)，将漂洗液15,000rpm离心10分钟，用移液器吸弃上清，保留5μl左右的沉淀。在离心沉淀中加入50μl DNA提取液，振荡混匀，100℃沸水浴10分钟，裂解肺炎支原体，释放DNA；最后15,000rpm离心5分钟，DNA溶解至上清液中，取上清液用于PCR检测肺炎支原体DNA。

实施例2：检测试剂盒的制备

该试剂盒包括DNA提取液、荧光PCR反应液、定量参考品、阳性对照品和阴性对照品，其中：其中荧光PCR反应液含有PCR缓冲液、dNTPs溶液、MgCl₂溶液、特异性扩增引物对(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)和探针(SEQID NO：5)，荧光探针5’端的报告荧光基团为FAM，3’端的淬灭荧光基团为TAMRA。

具体地，荧光PCR反应液包含10mM Tris-HCl(ph8.3)、50mM KCl、2.5mMMgCl₂、引物对各2.5pmol，荧光探针3pmol，0.2mM dNTPs、1单位Taq酶(TAKARA)和无菌双蒸水。

定量参考品是含有SEQ ID NO：6共105个核苷酸片段构成的T载体，且载体可在大肠杆菌DH5a中增殖。阳性对照品是肺炎支原体国际标准株FH培养物。

具体地，定量参考品的贮存浓度为7.5×10⁸拷贝/μl，使用前10倍梯度稀释。含有目的片段的质粒转化大肠杆菌DH5a中增殖后，用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释到7.5×10⁸拷贝/μl，-20℃保存。

DNA提取液包含0.05M NaCl、1％Triton X-100、1％NP-40、0.05mMEDTA、10mM Tris-HCl(ph8.0)等。

实施例3：运用聚合酶链式反应进行肺炎支原体检测

分别取实施例2中荧光PCR反应液各26μl加入到不同的PCR反应管，将实施例1中所得到的DNA和定量参考品向荧光PCR反应液中加入4μl，总体积为30μl，在荧光定量PCR仪(ABI 7500)上，以50℃反应2min，94℃反应5min，94℃变性10s和60℃退火40s扩增程序进行扩增和荧光检测。

循环结束后，运用PCR配套软件，读取待测样本拷贝数。结果为：定量参考品1.5×10⁶拷贝数/μl、1.5×10⁵拷贝数/μl、1.5×10⁴拷贝数/μl、1.5×10³拷贝数/μl的Ct值分别为25.11、28.40、31.94、35.46；待测样本的Ct值范围为23～38，经标准曲线换算定量范围为4.75×10⁶拷贝数/μl～1.88×10²拷贝数/μl。具体结果如下表：

待测样本	Ct值	病毒量(拷贝数/μl)
			1	24.62	1.26×106
2	37.92	1.88×102

待测样本	Ct值	病毒量(拷贝数/μl)
			3	31.90	1.04×104
4	23.77	4.75×106
			5	27.64	3.60×105
6	33.51	7.14×103

这表明，本发明试剂盒可在4.75×10⁶拷贝数/μl～1.88×10²拷贝数/μl的广大范围内具有极高灵敏度检测出肺炎支原体。

实施例4：用于各种病原体进行荧光PCR检测

采用实施例1～3相同的方法荧光PCR检测，本实施例不同在于反应模板选用其它相近种类病原体DNA，如肺炎衣原体、肺炎链球菌、生殖支原体、沙眼衣原体、解脲支原体、人形支原体。检测结果如下：

模板来源	Ct值
		肺炎衣原体	-
肺炎链球菌	-
		生殖支原体	-
沙眼衣原体	-
		解脲支原体	-
人形支原体	-

本实施例对其它相近的病原体基因组无交叉反应，可特异地扩增出肺炎支原体，特别是具有极高灵敏度检出肺炎支原体。

因此，本发明第一次提示了一组相对保守的重复序列在特异性和高灵敏度方面的优势，同时提供了一种在此基础上快速、特异、高灵敏度检测肺炎支原体的荧光PCR检测试剂盒。

核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110>上海复星医药(集团)股份有限公司

     上海复星医学科技发展有限公司

<120>一种检测肺炎支原体的靶序列及试剂盒

<130>3

<140>CN

<141>2008-10-10

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>240

<212>DNA

<213>Mycoplasma pneumoniae

<220>

<221>SEQ ID NO：1

<222>(1)..(240)

<400>1

ctgaaggccg tggcttgcga ctgagcaaat tcacaaggac ctccccaaat gatccgcctc  60

gatcctgatt ctgtacgatg cgccttatgc gcgcaaccgt accgccattg accgcgttga 120

tcacttggat cccaaggcca tgaccgcgaa ctatccgccc agttgaagaa cgcccaagtg 180

aaaccaccac ggtttgtggg actgaaaggc gcgcgatgtt ttgctccaaa ccaccgggtt 240

<210>2

<211>105

<212>DNA

<213>Mycoplasma pneumoniae

<220>

<221>SEQ ID NO：2

<222>(1)..(105)

<400>2

gattctgtac gatgcgcctt atgcgcgcaa ccgtaccgcc attgaccgcg ttgatcactt  60

ggatcccaag gccatgaccg cgaactatcc gcccagttga agaac                 105

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Mycoplasma pneumoniae

<220>

<221>SEQ ID NO：1

<222>(1)..(21)

<400>3

gattctgtac gatgcgcctt a                                           21

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Mycoplasma pneumoniae

<220>

<221>SEQ ID NO：4

<222>(1)..(20)

<400>4

gttcttcaac tgggcggata                                             20

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>Mycoplasma pneumoniae

<220>

<221>SEQ ID NO：5

<222>(1)..(23)

<223>“n＝FAM”，“y＝TAMRA”

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<400>5

ncgcgttgat cacttggatc ccaay                                       25

<210>6

<211>105

<212>DNA

<213>Mycoplasma pneumoniae

<400>6

gattctgtac gatgcgcctt atgcgcgcaa ccgtaccgcc attgaccgcg ttgatcactt 60

ggatcccaag gccatgaccg cgaactatcc gcccagttga agaac                105

Claims (8)

1.一种检测肺炎支原体的遗传标记物，其特征在于，它具有SEQ ID NO：1中连续的240bp高度保守重复核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的遗传标记物，其特征在于，它具有SEQ ID NO：2中连续的105个核苷酸序列。

3.一种检测肺炎支原体的试剂盒，其特征在于，它含有特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对，所述的引物序列一条与SEQ ID NO：1所示的序列相同，且另一个引物序列与SEQ ID NO：1所示的序列互补，其引物对为：上游引物SEQ ID NO：3为：5’-GAT TCT GTA CGA TGC GCC TTA-3’下游引物SEQ ID NO：4为5’-GTT CTT CAA CTG GGC GGA TA-3’

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还含有探针，所述探针的核苷酸与SEQ ID NO：1所示的序列相同或互补，其检测探针为：

检测探针SEQ ID NO：5为：5’-FAM-CGC GTT GAT CAC TTG GAT CCCAA-TAMRA-3’；

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括DNA提取液、荧光PCR反应液、定量参考品、阳性对照品和阴性对照品。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所说的参考品为如下DNA序列SEQ ID NO：6为：

5’-GATTCTGTAC GATGCGCCTT ATGCGCGCAA CCGTACCGCCATTGACCGCG TTGATCACTT GGATCCCAAG GCCATGACCGCGAACTATCC GCCCAGTTGA AGAAC-3’。

7.一种检测样品中肺炎支原体的方法，其特征在于，它包括操作步骤：

①样品DNA提取；

②将提取的DNA作为模板，用特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)进行PCR扩增。

③检测扩增产物是否存在，存在扩增产物表示样品吕存在肺炎原体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的检测方法是通过检测荧光信号的强弱来检测样品中肺炎支原体。

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