CN1710101B - 一种检测猪伪狂犬病毒荧光定量pcr试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测猪伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒包括：a)DNA裂解液，b)Taq DNA聚合酶，c)标准阳性模板含有pG-HB的核苷酸序列，d)荧光定量反应液含有正相、反相引物和荧光探针序列，该试剂盒方法简便，定量准确，检测速度快，可同时进行多通量的样品检测。

Description

一种检测猪伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及一种定量检测猪伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒，适用于猪伪狂犬病毒定性定量检测，同时还涉及具有定性定量检测猪伪狂犬病毒的用途。

背景技术

伪狂犬病是猪的一种高度接触性传染病，常给养猪业造成严重的经济损失。目前，疫病的早期特异性诊断、染疫动物的扑杀和疫苗接种是有效预防控制猪瘟的重要手段。

传统的伪狂犬病检测方法主要包括：酶连免疫吸附(ELISA)试验、琼脂免疫扩散试验、病毒血凝(HA)与血凝抑制实验(HI)、胶体金等方法，这些方法在病毒病诊断和进出口检验检疫中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，诸如周期长，操作繁琐，特异性和敏感性差，不规范，不适用于大批量检测，给伪狂犬病的检测带来巨大困难。

近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determinedby LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，163：29-38)、病原体的定性(McGoldrick A，Lowings JP，Ibata G，et al.A Novel Approach to the Detection ofClassical Swine Fever Virus by RT-PCR with a Fluorogenic Probe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods，1998，72：125-135.；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCRassay(TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，83：1-10.)和定量检测(Desire N，Dehee A，Schneider V，et al.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1Proviral Load by a TaqManReal-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，39：1303-1310.；Martell M，Gomez J，Esteban JI，et al.High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCRQuantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37：327-332.；Kearns AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detection and Quantificationof CMV DNA in Urine using Lightcycler-based Real-time PCR[J].J.Clin.Virol，2002，24：131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitation of HCVRNAusing real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95：111-119.)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量主要方法，国内目前也已有关于丙肝、乙肝、支原体、爱滋病、结核定量检测的试剂盒上市。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量检测猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量仪器，而且能快速地对伪狂犬病毒进行定量检测。

本发明的另一个目的猪伪狂犬病毒的荧光定量PGR试剂盒在伪狂犬病毒快速定量检测中的应用。

本发明采用以下技术措施：一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括该试剂盒包括a)DNA裂解液，b)Taq DNA聚合酶，c)标准阳性模板，d)荧光定量反应液，其特征是：荧光定量反应液含有引物和荧光探针，引物为正向引物(SEQ ID NO：1)和反向引物(SEQ ID NO：2)，正向引物为5′-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT-3′，反向引物为5′-TGGTAGATGCAGGGCTCGTA-3′，荧光探针序列为5′-CGGGGACACGTTCGACCTGATGCC-3′(SEQ ID NO：3)，荧光探针5′端标记FAM(荧光报告基团)，3′端标记ROX(荧光淬灭基团)，标准阳性模板pG-HB(SEQID NO：4)是含有伪狂犬病毒HB毒株(请见：伪狂犬病毒胸苷激酶基因变异引起的病毒致弱作用，潘兹书等，科学通报，2001年16期)gE基因167个核苷酸片段构成的pGEM-T载体，且该载体(购于Takara公司)可在大肠杆菌DH5α(购于Takara公司)中增殖。

在本发明的一个优选方案中，荧光定量反应液是由正向引物和反向引物，荧光探针，PCR 10×buffer溶液，MgCl₂溶液，dNTPs溶液，Taq DNA聚合酶和无菌双蒸水组成；在本发明的一个具体方案中，荧光定量反应液由PCR 10×buffer 2μl，10μmol/L正向引物和反向的引物各1.5μl，1μmol/L荧光探针2μl，25mmol/LMgCl₂3μl，10mmol/L dNTPs 0.5μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌双蒸水9μl组成。其中荧光探针为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，荧光探针5′端标记FAM，3′端标记ROX。

在本发明的一个优选方案中，标准阳性模板是含有伪狂犬病毒(请见：伪狂犬病毒胸苷激酶基因变异引起的病毒致弱作用，潘兹书等，科学通报，2001年16期)gE基因167个核苷酸片段连接入pGEM-T载体(请见编号为：PromegaCorporation，Technical Manual，NO：042：1-30，1999年修订版)构成的。且该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。贮存浓度为5×10¹⁰拷贝/μl，使用前系列稀释。实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒pGS，该质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀(所测样品在吸收波长为260nm紫外线照射下的光密度)的定量并稀释至5×10¹⁰拷贝/μl，-20℃保存。

在本发明提供伪狂犬病毒快速定量检测伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒中，有一条两端标记有荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5′-3′外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的FRET(荧光共振能量转移)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对伪狂犬病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环圈数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

在本发明提供检测猪伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒中，针对伪狂犬病毒检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、Mg2+浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测系统相结合，将其用于伪狂犬病毒定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了检测猪伪狂犬病毒荧光定量PCR方法，并研制出检测猪伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10Copies，完全可以满足快速鉴别诊断伪狂犬病毒的要求。

该方法包括下列步骤：

A)用标准阳性模板制备阳性标准品，并用紫外分光光度计定量；

B)用DNA裂解液从待测标本中提取DNA；

C)分别取B)步中的DNA和同样量的系列稀释的A)步中的阳性标准品加入到含Taq DNA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测；

D)通过比较待测样品和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。

在本发明中提供的伪狂犬病毒快速定量检测伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒可对伪狂犬病毒进行定量检测，并可替代一直沿用的传统的胶体金检测方法和伪狂犬病毒ELISA鉴别诊断方法。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、定量准确；

2、检测速度快，仅1小时，加上DNA提取的制备，共仅需2-3小时；

3、步骤简单；

4、可同时进行高通量的样品检测。

附图说明

图1为荧光定量PCR检测湖北仙桃样品的动力曲线图，结果：全为阳性；

图2为荧光定量PCR检测湖北天门、河南信阳样品的动力曲线图，结果：全为阳性；

图3为荧光定量PCR检测湖北京山、湖北仙桃、湖北武汉样品的动力曲线图，结果：除了武汉的3份样品，甘肃样品为阴性外，其余都是阳性；

图4为荧光定量PCR检测湖北武汉样品的动力曲线图，结果：全为阴性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

实施例1  用伪狂犬病毒快速定量检测的荧光定量PCR试剂盒检测伪狂犬病毒

1猪伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒组成与配制，

试剂组成：

a).DNA提取试剂为自己配制，裂解液：4mol/L异硫氰酸胍、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.1mmol/Lβ巯基乙醇、25mmol/L柠檬酸钠，异丙醇，双蒸水，用灭菌双蒸水配制的75％乙醇。

b).标准阳性模板。

c).荧光定量反应液：PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各1.5μl(10μmol/L)，荧光探针2μl(1μmol/L)，MgCl₂2.5μl(25mmol/L)，dNTPs 0.5μl(10mmol/L)，Taq DNA聚合酶0.5μl(3U/μl)，无菌双蒸水9μl。荧光探针FP序列为SEQ ID NO：3，其5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光受体基团为ROX。使用浓度为1μmol/L。

2用伪狂犬病毒快速定量检测的荧光定量PCR试剂盒检测伪狂犬病毒

A)取伪狂犬病毒野毒HB株接种PK-15单层细胞(由本实验室保藏)出现CPE以后反复冻溶三次，6000r/min离心10min，取100μl上清加入200μl裂解液(试剂a)置室温10分钟，再加300μl-20℃预冷的异丙醇沉淀RNA和DNA。5分钟后12000r/min室温离心10min，-20℃预冷的75％乙醇漂洗1次，干燥后溶于10μl水中备用。

B)将阳性标准模板(试剂b)系列稀释为5×10⁷拷贝数/μl、5×10⁶拷贝数/μl5×10⁵拷贝数/μl、5×10⁴拷贝数/μl、5×10³拷贝数/μl。

C)分别取荧光定量PCR反应液(试剂c)各18μl，取第B)步所得DNA和第C)步稀释的阳性标准模板各2μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变52min；94℃15s，59℃40s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为530nm。

循环结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为：

标准阳性模板2×10⁵拷贝数/μl、5×10⁴拷贝数/μl、5×10³拷贝数/μl的Ct值分别为30.15、33.78和36.04，阴性对照为0；

换算后每ml疫苗样品拷贝数为6×10⁶拷贝数/ml。

反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析P＞0.05，数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。

实施例2  用伪狂犬病毒快速定量检测的荧光定量PCR试剂盒检测伪狂犬病毒

临床标本：对2005年2月份至2005年5月份湖北京山、仙桃，河南明港等地的猪采集鼻拭子和组织样品，标本采集时间为6-10日龄仔猪、断奶前仔猪(35日龄)。

1猪伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒组成与配制，

试剂组成：

a).DNA提取试剂为自己配制，裂解液：4mol/L异硫氰酸胍、0.5％十二烷基肌氨酸钠、0.1mmol/L β巯基乙醇、25mmol/L柠檬酸钠，异丙醇，双蒸水，用灭菌双蒸水配制的75％乙醇。

b).标准阳性模板。

c).荧光定量反应液：PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各1.5μl(10μmol/L)，荧光探针2μl(1μmol/L)，MgCl₂2.5μl(25mmol/L)，dNTPs 0.5μl(10mmol/L)，Taq DNA聚合酶0.5μl(3U/μl)，无菌双蒸水9μl。荧光探针FP序列为SEQ ID NO：3，其5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光受体基团为ROX。使用浓度为1μmol/L。

2用伪狂犬病毒快速定量检测的荧光定量PCR试剂盒检测伪狂犬病毒样品

A)取鼻咽洗液作为分离病毒的样品：用高压灭菌的棉拭子，伸入鼻咽部上1-2厘米，旋转一周，停留约10秒钟后取出，将棉拭子头放入盛有1毫升无菌生理盐水的冷冻保存管中，从颈部剪断拭子，将拭子头在生理浸入盐水中反复漂洗(漂洗液可在-20℃保存一个月，或在-70℃长期保存)。取咽拭子抽提液，接种PK-15单层细胞(由本实验室保藏)出现CPE以后反复冻溶三次，6000r/min离心10min，取100μl上清加入200μl裂解液(试剂a)置室温20-25℃10分钟，再加300μl-20℃预冷的异丙醇沉淀DNA。5分钟后12000r/min室温离心10min，-20℃预冷的75％乙醇漂洗1次，干燥后溶于10μl水中备用。

B)将阳性标准模板(试剂b)系列稀释为5×10⁷拷贝数/μl、5×10⁶拷贝数/μl5×10⁵拷贝数/μl、5×10⁴拷贝数/μl、5×10³拷贝数/μl。

C)分别取荧光定量PCR反应液(试剂c)各18μl，取第B)步所得DNA和第C)步稀释的阳性标准模板各2μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变52min；94℃15s，59℃40s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为530nm。循环结束后，运用仪器自带软件，对以上60份样本进行DNA的提取、荧光定量PCR检测，以水做阴性对照，结果如下：

一共66份样品，其中阳性42份，阴性24份，阳性率为63.6％。

从上述实验可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需4个小时就能完成，而传统的细胞培养法约需1周左右才能完成，因此，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。

该试剂盒的操作只需1人即可完成整个定量操作过程，一次可检测32-384个(由定量检测仪的型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。

                   SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>一种检测猪伪狂犬病病毒荧光定量PCR试剂盒及应用

<130>一种检测猪伪狂犬病病毒荧光定量PCR试剂盒及应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

cttccactcg cagctcttct                20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

tggtagatgc agggctcgta                20

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

cggggacacg ttcgacctga tgcc           24

<210>4

<211>168

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

cttccactcg cagctcttctcgcccggggacacgttcgac ctgatgccgcgcgtggtctc    60

gaacatgggtgactcgcgtgagaactttaccgccacgctgactggtactacgcgcgcgc      120

gcccccgcgg tgcctgctgt actacgtgtacgagccctgcatctacca               167

Claims (4)

1. 一种检测猪伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括a)DNA裂解液，b)Taq DNA聚合酶，c)标准阳性模板，d)荧光定量反应液，其特征是：荧光定量反应液含有引物和荧光探针，引物为正向引物和反向引物，正向引物为SEQ ID NO：1，反向引物为SEQ ID NO：2，荧光探针序列为SEQ ID NO：3，荧光探针5′端标记FAM，3′端标记ROX基团，标准阳性模板pG-HB是含有猪伪狂犬病毒毒株gE基因167个核苷酸片段构成的pGEM-T载体，且该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。

2. 根据权利要求1所述的一种检测猪伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征是：荧光定量反应液是由PCR10×buffer，10μmol/L的正向引物和反向引物，1μmol/L荧光探针，25mmol/L MgCl₂，10mmol/L dNTPs和无菌双蒸水组成。

3. 根据权利要求1所述的一种检测猪伪狂犬病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征是：标准阳性模板pG-HB的核苷酸序列为：SEQ ID NO：4。

4. 权利要求1所述的一种检测猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒在猪伪狂犬病毒定量检测中的应用。

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