SE453514B - Sett att bestemma deoxitymidinkinas-dtk-isoenzymnivaer i kroppsvetska eller cellprov och anvendningen av forfarandet for isoenzymtypning - Google Patents

Description

453 514 2 d'l'k-isoenzym- medierad dT-omvandling till dTmp (deoxitymidinmonofosfat), som utövas av dT-analogen Zßdeoxi-.S-joduridin (lUdR), har varit känd sedan lång tid. användning av radioaktivt märkt lUdR direkt som substrat för att ge hög känslighet i bestämningar av virala dTk-enzymer har visats av oss (Gronowitz d: 5 Källander, Infec. immun. 29:425, 1980).

Som nämnts är förekomst *av dTk-F i celler kopplad till cellproliferation och saknas mer eller mindre i den differentierade cellen (Mundi-Petersen å; Tyrsted, Biochim. Biophys. 4789614, 1977). Studier av dTk-aktiviteten i transplan- terbara mustumörer har avslöjat höga d'l'k-aktiviteter med korrelation till 10 tillväxthastigheten (Bresnick et al, Cancer Res. 29:l932, 1969, och Cancer Res. 31943, 197 ). Rapporter på senare tid har visat förhöjt dTk-F i perifera blodlym ocyter hos vissa patienter, som lider av maligna non-Hodgkins lymfom och lymfatisk leukemi (Ellims et al, Cancer Res. 4l:69l och Brit. J. Haematol. 49:479, 1981). Dessa forskare har också visat förhöjda serum dTk-nivåer hos vissa is patienter u: non-Hødgkans-gfuppen (Emm a: al, ßiaoa same, mi). susanna på den använda konventionella dTk-bestämningsmetoden, som utnyttjar 3l-l-d1' i hög koncentration (5xi0'6M), kunde dTk-aktivitet återfinnas endast hos några få patienter med långt framskriden sjukdom. Vidare kunde dTk-aktiviteten endast utvärderas som en prognostisk markör om differentialanalys avseende dTk-VF och 20 dTk-A utfördes.

Föreliggande uppfinning tillhandahåller ett förfarande, som gör det möjligt att påvisa mycket låga dTk-isoenzymnivåer i kroppsvätskor eller cellprov från människa eller djur. Enligt uppfinningen uppnås detta genom att förfarandet givits de i patentkraven angivna kännetecknen. Förfarandet kan användas som ett 25 instrument för diagnos av vissa virusinfektioner och maligna tumörer, inklusive övervakning av sjukdomarna i olika syften. Uppfinningen erbjuder sålunda ett känsligt bestämningssystem, som är kapabelt att detektera mydret små mängder av i serum, spinalvätska och vesikelvätska och även är utxformat för att minimera bidraget av cellulärt dTk-A. 30 Förfarandet kan bl.a. användas a i samband med tumörsjukdomar för påvisande och prognos b i samband med tumörsjukdomar för kontinuerlig övervakning av ändringar i sjukdomen, terapieffekter och påvisande av återfall c i samband med lungcancer av havrecelltyp vid utvärdering av metastaser 35 d i samband med leukemi för att utgående från närvarande dT k i spinalvätska bestämma om det finns metastaser i det cerebrospinala systemet . e i samband med virala sjukdomar som en gruppspecifik markör för vissa in- fektioner. ' _ '#0 Modifierat genom utbyte av ATP mot CT P och utnyttjande av förinkuba- tion av prov med herpesvirusspecifika dT k-blockerande antisera, kan förfarandet 10 15 20 25 30 35 äflväfldflS för att uppnå specifikt påvisande av herpesvirusspecifika dTk-enzymer som finns i serum eller vesikelvätska.

Föreliggande uppfinning är sålunda baserad på användning av ett nytt bestäm- ningssystem för påvisande av mycket små mängder av dTk-F i kliniska prov, t.ex. serum eller blåssekret. Konventionellt har dTk-aktivitet mätts genom att följa omvandlingen av antingen 3 H- eller wC-märkt d'l' till dTmp med ATP som fosfatgivare. Vi har nyligen utvecklat och optimerat ett dTk-bestämnlngssystem för virala dTk-isoenzymer, vilket utnyttjar 125 i-joddeoxiuridin (iUdR) som substrat (Gronowitz och Källander, infec. immun. 29:425, 1980). Den erhållna höga känsligheten medgav påvisande av dTk från så litet som 25 HSV-infekterade celler. i motsats härtill kräver för enzymbestämning ett test baserat på användning av BH-dT, vid en “normalt använd koncentration av 10", M, minst 050 gånger mera enzym (Gronowitz och Källander, lnfec. immun. 29:425, 1980). Även om det är användbart vid studier av virala dTk-enzymer (Gronowitz och Källander, J. Med. Virol. 8:177, 1981; Gronowitz et al, J. Clin. Microbiol. 13366, 1982; Källander et al, lnfec. immun. 36:30, 1982), var detta bestämningssystem inte lämpligt för långtidsförsök av cellulärt dTk-F, delvis beroende på detta enzyms instabilitet. Metodens oförmåga att påvisa närvaro av mycket små dTk- mängder i serum kan lätt utläsas av studierna av förekomsten av virus-dTk- blockerande antikroppar (dTk) (Gronowitz å: Källander, J. Med. Virol. 8:177, 1981; Källander et al, lnfec. immun. 36:30, 1982). Vid dessa studier undersöktes mer än 275 humansera med avseende på dTk ab, och närvaro av störande serum dTk-aktiviteter återfanns endast i två fall (GK 1981).

De två fallen föranledde uppfinning av ett nytt bestämnlngssystem, som är lämpligt för mätning av serum dTk-nivåer, vilket här beskrivs och patentsöks.

Studierna demonstrerade känsligt påvisande av serum- dTk-nivåer om ett l-lepes- buffertsystem, som saknar reaktiva primära amingrupper och har låg ionstyrka, används. Vidare befanns låg ATP-koncentration och en sammansättning av de övriga komponenterna såsom beskrivs i Tabell i vara optimala. Produktanaiyser vid dTk-test utfördes såsom tidigare beskrivits (Gronowitz å: Källander, lnfec. immun. 29:li25, 1980).

Detta nya bestämningssystem befanns inte endast vara känsligt och reproducerbart för dTk-F-bestäniningar, med linjära resultat under mer än två timmar, utan befanns' också ge 2-6 gånger högre omsättning med de virala dTk- engymerna. En annan viktig fördel, som inte kan uppnås i konventionella bestämningssystem, är den relativt låga omsättningen av dTk-A, beroende på användning av iUdR i låga_ koncentrationer som substrat, vilket ger minimalt bidrag från detta isoenzym vid mätning av dTk-F eller vlralt dTk 1 orenade prov. _ En variant av detta bestämnlngssystem, som använder CTP 1 stället för ATP som fosfatgivare, är användbar för specifik bestämning av herpesviruslndu- 453 ' ~ l0 l5 20 25 30 35 453 514 14 cerat dTk när prov som skall analyseras förinkuberas med antiherpesvirus-dTk- blockerande sera.

Vid förfarandet enligt uppfinningen bör koncentrationen av buffert- substansen vara mindre än 250 mM, företrädesvis mindre än 150 mM, speciellt ca 100 mM, varvid buffertsubstansen är väsentligen fri från reaktiva amino- grupper, särskilt är en HEPES-buffert. pH-värdet bör ligga i området 5-9, företrädesvis mellan 6,5 och 8, särskilt omkring 7,4. Substratet bör vara en radioaktivt märkt tymidinanaiog, företrädesvis en T-deoxi-S-halogenuridin, särskilt T-deoxi-S-joduridin, där märkningen företrädesvis skall vara en radioak- tiv haiogenisotop, särskilt 1251. Den totala substratkoncentrationen skall vara i omradet fran mo” :in sxifßm, företrädesvis meuan mo* een sxia'7M, 7M. Fosfatgivaren skall vara närvarande i en koncentration, som 2+ särskilt ca 10' inte överstiger 20 mM, företrädesvis mindre än 10 mM, särskilt 0,54: mM. Mg skall vara närvarande i åtminstone ekvimolär koncentration relativt fosfat- givaren, företrädesvis 2-8 gånger högre koncentration än fosfatgivaren. Ett reducerande medel såsom ditiotreitol bör också vara närvarande.

Tillämpningen av dessa bestämnihgssystem för att påvisa dTk-aktiviteter i kliniska prov, t. ex. serum eller blåssekret, gav oss ett nytt verktyg för diagnos av vissa virusinfektioner och maligna sjukdomar. Vidare befanns onormala serum- dTk-nivåer (> 10 enheter), erhållna med en enda dTk-bestämning med den beskrivna metoden, vara en utmärkt markör för prognostisk användning, och dTk- värden i serie befanns också vara värdefulla för övervakning av progressionen eller regressionen hos maligna sjukdomar. Vidare befanns hos dessa patienter dTk-nivåerna vara användbara som en markör av återfall och för utvärdering av terapieffekter, allt såsom exemplifieras nedan.

Detta bestämningssystem utnyttjar l25I-iUdR som föredraget substrat, som har visat sig vara en relevant substratanalog för d'i'k-bestämningar (Gronowitz år Källander, Infec. Immun. 29:23, 1980). I motsats till den tidigare beskrivna metoden ger det nya systemet en linjär omsättning av substratet för cellulärt dTk-F under mer än två timmar, och dessutom ökades detekterings- känsligheten dramatiskt, såsom framgår av Fig. i. Detta uppnåddes genom ett nytt och kritiskt buffertsystem, men även andra förändringar gjordes. Siutkon- centrationen av komponenterna i det nya bestämningssystemet ges i Tabell l, som även anger proportionerna av de olika använda lösningarna. I allmänhet består ett dubbelprov av 51,5 ul reaktionslösning som blandas med 6 ul substratlösning omedelbart före användningen. Reaktlonen startas sedan genom tillsats av 2,5 ul enzym. Fran denna standardvolym av totalt 60 ul tas två prov om vardera 25 ul.

Sammansättningen av försöksblandningarna för experiment bestående av flera dubbeiprov tagna efter olika inkubationstider bestäms genom att man multiplice- 10 15 20 25 30 35 \ rar volymerna av komponenterna i standardlösningen med det önskade antalet dubbelprover. Bestämningen utförs vid 3700, och alla komponenter förvärms i 2 minuter innan reaktionen startas. Enzymreaktionen avslutas genom pipettering av provet på ett lcmz stycke Whatman DEAE-8l-papper, som hålls vid 90-l00°C. För att uppnå separation av produkten från substratet tvättas papperet fyra gånger i 6 mM ammoniumformiatlösning, en gång i destillerat vatten och slutligen i metanol. Tvättningarna utförs i 1-liters glaskärl med magnetomrörning. 10-15 pappersskivor, som hålls i durkslag, behandlas sam- tidigt. Durkslaget förs till ett nytt tvättbad var femte minut. Slutligen räknas pappersskivorna i en automatisk gammaräknare.

För att eliminera dag-till-dagvariation i dTk-bestämningen omräknades erhållna reaktionshastigheter till enheter. Orsaken till att man använder enheter för att definiera enzymmängder är variationen i initial radiokemisk renhet, kombinerat med det funna biologiska sönderfallet av kommersiellt tillgängligt lzsl-lUdR, som gör total radioaktivitet tillsatt per prov irrelevant för enzym- aktivitetsberäkningar (Fig. 2). I stället inkluderades en intern biologisk kontroll, som mäter tillgänglig radioaktivitet, i varje bestämning. Denna kontroll var - hundra gånger överskott av en HSV-typ 2 dTk-beredning, vilket ger omfattande substratutarmning. Mängden radioaktivitet införlivad i en l-timmas bestämning genom denna kontroll befanns vara ca 8596 av värdena av intakt lzjl-lUdR beräknat från tunnskiktskromatografi. Med beaktande av den funna nivån (8596) för den biologiska kontrollen kommer en enzymenhet att vara den enzymmängd, som omvandlar 2,7xl0'15 betingelserna). Denna relation mellan enhet och approximativ molär omsättning l enhet praktiskt uttrycks som ca 1000 cpm, med den normalt moler substrat per timma (under de beskrivna valdes eftersom använda mängden isotop (Tabell I). En annan fördel isotopkontroll, när den bearbetas likadant som testproven, är att man eliminerar möjliga variationer i enheter beroende på variationer i produktåtervinning.

Proceduren för beräkningen av enheter exemplifieras i Fig. 3.' I Kvantifiering av serum-dTk med denna biologiska Bestämning av serum dTk-aktiviteter. utfördes i mikrotiterplattor. För var 20de serumprov inkluderades bakgrundskon- troller och intern substratkontroll (se ovan), och satsen behandlades sedan som en enhet. Använda serummängder var 5 ul (eller mindre) per 120 ul slutvolym, eftersom mera serum kan vara hämmande (Fig. b). Denna effekt beror troligen på närvaro av nukleotider eller nukleosider, som t. ex. tymidin, tymidintrifosfat, eller kataboliska enzymer, som förekommer i vissa sera. Dubbelprov togs efter 60 och 120 minuter. Medelomsättning, per timma och 25 ul prov, efter korrigering för bakgrund, beräknades från varje dubbelprov separat. Medel- hastighetsvärdet för provtagningen vid 60 och 120 minuter bestämdes sedan och 10 15 20 25 30 35 455 514 användes för ytterligare beräkningar (se ovan), om variationer ¿ 2096 påträffa- des.

Bestämning av dTk-aktiviteter i spinalvätska. Väsentligen samma proce- dur användes som för serum. Den specifika aktiviteten för 125 l-IUdR ökades till ca 320 Ci/mM. Spinalvätskor kan koncentreras före enzymbestämningar.

Kvalitativa bestämningar av dTk-isoenzymer. I princip kliniska prov, t.ex. vesikelvätskor eller serum, innehållande dTk-aktivitet förinkuberades med isoenzymspecifik dTk-blockerande antikropp och kvarstående enzymaktivitet bestämdes enligt det ovan beskrivna tillvägagångssättet.

Praktisk procedur. ATP i försöksblandningen ersattes med CTP, vilket resulterar i uteslutande av dTk-F aktivitet. De prov som skulle undersökas seriespäddes två gånger (vanligen med start vid 1:6) i reaktionslösning och 15 ul överfördes från varje spädning till fyra brunnar i en mikrotiterplatta för att uppnå fyra identiska spädningssatser. Förutspätt VZV- dTk-blockerande serum (25 ul) sattes till en sats, ett HSV typ l dTk-blockerande serum till en andra sats, ett HSV typ 2 dTk-blockerande serum till en tredje brunn och till den sista satsen ett negativt serum. Blandningarna inkuberades vid 37°C i 90 minuter, vilket tillät enzym-antikroppsreaktionerna att ske. Därefter bestämdes de kvarstående enzymaktiviteterna. Reaktionen startades genom tillsats av 20 ul, sammansatt av 6 ul substratlösning blandad med ll: ul reaktionslösning. varje spädning beräknades de erhållna värdena i närvaro av de olika antisera som procent av de värden, som erhölls med det negativa serumet. Exempel på sådana kvarstående enzymaktiviteter, plottade mot zlog-spädningen av proven, visas i Fig. 5. Från hämningsmönstren kan dTk-typen lätt etableras (se även Tabell 2).

De följande exemplen är avsedda att ytterligareillustrera uppfinningen, utan ag på något sätt begränsa densamma.

Ett viktigt särdrag för uppfinningen är den dramatiskt ökade bestäm- ningskänsligheten, som tillåter mätning av normala serumnivåer av dTk-F hos friska individer. (Fig. 6). Undersökningar av serumprov från personer, som lider av infektionssjukdomar, leder till upptäckt av 10-40 gånger förhöjda dTk-nivåer i serum från patienter i akuta stadier av vissa virusinfektioner, t. ex. mononucleo- sis infectiosa (Fig. 7), rubella- och morbillivirusinfektioner (Fig. 8). Beträffande herpesvirus indikerar resultaten förhöjda serum-dTk-aktiviteter i samband med primära infektioner. Inga åtföljande ökningar i dTk-aktiviteter (> 10 enheter) återfanns i samband med andra infektioner (Fig. 8). Karaktäriseringen av de funna serumaktiviteterna har hittills demonstrerat närvaro av Varicella Zoster Virus (VZV) specifikt dTk (Tabell 2). Även användningen av virusspecifikt dTk närvarande i vesikelvätskor för snabb diagnos av infektioner demonstreras (Tabell 2). Alla serum-d'l'k-aktiviteter funna i samband med virala infektioner försvann 10 15 20 25 30 35 453 514 7 gradvis och nådde normala nivåer inom 2-6 veckor.

Beträffande patienter, som lider av maligna sjukdomar, visade en begränsad studie förhöjda serum-dTk-nivåer inte endast hos patienter, som led av maligna sjukdomar härrörande från det lymfoproliferativa systemet, men ocksåi sådana, som hade maligna sjukdomar i andra celler med metastaser i det lymfoproliferativa systemet (Tabell 3). Utvidgade studier har utförts med väldefinierade stora serummaterial från patienter lidande av lymfo-proliferativa sjukdomar såsom non-Hodgkins lymfom (NHL), Hodgkins sjukdom (HD) kronisk och aktiverad lymfatisk leukemi (CLL) och myelom. Detaljerade resultat i NHL- gruppen var följande: normalt serum-dTk och förhöjda dTk-nivåer av olika storlek återfanns; dessa dTk-nivåer korrelerade till stadiet av sjukdomen (Fig. 9a), dvs. ju längre framskriden sjukdom desto högre dTk-värde; om dTk-nivåerna relatera- des till maligniciteten hos tumörcellerna (klassificering enligt Kiel-systemet, Fig. 9b) återfanns god korrelation mellan höga dTk-nivåer och grad av malignitet.

Beträffande prognostisk användning av dessa förbehandlings-dTk-nivåer återfanns mycket signifikanta skillnader i överlevnadstid mellan patientgrupper konstruerade genom uppdelning enligt dTk-värden < l0 enheter eller > l0 enheter, både vid användning av endast patienter i stadierna lll-IV (P4 0,001, Fig. l0a,) och vid användning av endast patienter med "hög malignicitet" (p< 0,02, Elg. l0b.) Vidare avslöjade longitudinella studier av serum-dTk-nivåer i NHL- patienter förändringar korrelerade till förändringar i sjukdomen, dvs. lägre värde vid regression av sjukdomen, högre vid progression och oförändrad vid konstant sjukdom (Fig. ll, l2). Detta visar klart möjligheten att övervaka eller följa terapieffekten, och vidare detekteras återfall snabbt, såväl under som efter behandling, som ökande dTk-värden (Fig. ll, l2).

Beträffande de andra ovannämnda lymfo-proliferativa sjukdomarna åter- fanns varierande serum-dTk-nivåer (Tabell 3), t. ex. återfanns normala värden vid kronisk CLL, medan halvaktiverad CLL gav låga men patologiska värden (>l0 enheter) och aktiv CLL höga värden (Tabell 3). Möjliga användningar av dTk- nivåer, såsom exemplifierat för NHL, är också relevanta för CLL, men måste utvärderas ytterligare för de övriga grupperna. Vidare visar studier av spinal- vätska, härledd från patienter med leukemi, närvaro av dTk när leukemiceller finns i det cerebro-spinala systemet (Tabell 3).

Beträffande cancer indikerar resultaten från patienter med lungcancer av havrecelltyp möjlighet att utnyttja serum-dTk-nivåer som en markör av metastaser (Tabell 3), liksom för andra cancertyper.

Givetvis måste man vara medveten om möjlig tillfälligt förhöjd serum- dTk-nivå hos patienter med maligna sjukdomar, beroende på ovannämnda virusinfektioner. Emellertid går dessa virussjukdomar normalt tillbaka i barn- 453 514 domen, medan maligna tumörer vanligtvis förekommer hos vuxna. En ytterligare faktor, som är relevant för användningen av serumdTk-nivâer för de beskrivna syftena, är den sällsynta förekomsten av förhöjda dTk-aktiviteter, som visas i en studie av oselekterat serummaterial, härledd från patienter med odefinierad sjukdom. Studier av medicinska journaler för dessa och andra patienter har visat, att varken patologiska värden i leverfunktionstester eller leukocytos normalt åtföljs av förhöjda serum-dTk-nivåer.

Tabell l. Buffertsammansättning för dTk-bestämning.

Komponent Provblandning Slutkoncentrationa ”Haves o,iM ssmM MgClz l7mM l5mM KC! 20mM l7mM NaF l,2mM l ,OmM ATP lß,6mM 3,9mM Ditiotreitol 2,7mM 2,3mM Bovint albumin 0,33mg/ ml 0,28mg/ ml Glycerol 6,696 5, 796 iudn - 1,1x1o'7M pH 7,4 7,4 __, ___ __-~___--.-.__«__-------_-- aProportionerna i ett dubbelprov är: 51,5 ul provblandning, 6 ul substratlösning (slutkoncentration av 125 I-lUdR lxl0'7M, 130-160 Ci/mM) och 2,5 ul enzymlös- ning, t. ex. serum (tillsätts vid start av reaktionen), vilket ger en slutvolym av 60 ul. bN-Z-hydroxietylpiperazin-N'-2-etansulfonsyra. 453 514 .oëcåu oNn >N .vzwfixm xšuvaw ...o E.. m3: nuo >oä .an >u wšcucuïcm E> .E23 tšwuo: noE 2223.... >o..& :obcox No.. Nuzàtïø u N NN N.. .E x N.N N >m..._ . NN .. NN NE x N.. . >mz 5.3.3.

N.. NE, N .E x N... >N> 5.2....

NN ... NN. NE x N.. <5... ...Paâx NN=NUIN> >N> .. .E x ...N ..NNN.N NN=NutN> >N> E .E x N... ENN NN=NUIN> >N> NN _... N. .E x ...N å.

NN=NUIN> >N> NN NN N NE x N.. NN NN=NutN> >N> N. NE x N.. NN-..

NN__N2._N> >N> . E .E x ...N NN... 2:..

:Eäuøw 9 ...SNS NNBN... UNENEENU >N> NN NN E NE x N.. ...NNNN NN=NutN> >N> E. NE N NE x N... NNNEN ...N=NU.._N> >N> .N NN N NE x ...N NSEN >N> E. NN E .E x N.. NNNEN NzzNeoä ...Nazi . >wx NN ._ NE NE x N.N NNE ...N33 Nää... >N> ..E NN. .. NE x N.. N.ENN NNEN... .BENQ N >NI N NN .E .E x ...N NE.

NN=NutN> >N> NE NN. N NE x Nx.. .NNNNN NNEN.. .BENQ N >NI N NN NN .E x ...N EE Emgo _~.:> :oc NBBNN; .. .. | .. | N22..

~N=N¥ä> >N> NE N.. N NE x ...N N32...

.NES Nää... ..>N> ...N E. N NE x ..._ 2.5.... .zzNQNJNQLNI >N> NN. NN N. NE x N.N NNNNNN 22.... -.9_.$> VE. ä N... N ä: _ ä... >N> .N-Exs..u.

, Nocwm... xflczx xflwxxocaêë. 9.3 nu... ccwmnaxc. NuNWw.. mNuNÉÉm uoxštm .šïoi ucšncm ...Nïflxmcšncv vucøflrë>z .8 ...SN ...VEÉN . .8.>.c_~..._,... .ES ä 9.2.5 ...ö Nëëüfæ.. .N ._33 Tabell 3. dTk-nivåer i sera från patienter med olika tumörsjukdomar.

Typ av sjukdom Status dTk-aktivitet (enheter/ul) Lungcancerd inga metastaser 5 Lungcancer inga metastaser 2 Lungcancer metastaser 163 Lungcancer metastaser 19 HD metastaser 108 HD metastaser 28 HD inga metastaser 4 HD inga metastaser 3 NHL -\_ framskridet stadium 333 NHL framskridet stadium 11+ NHL tidigt stadium 3 NHL tidigt stadium 5 Adenocarcinom aktivt 72 Leukemi akut 40 Leukemi akut 185 B-cell-leukemi aktivt 52 ) cm. aktiv: asoo a CML aktivt 45 CLL aktivt 62 CLL aktivt 18 _ CLL halvaktivt l l CLL halvaktivt 12 b) CLL inaktivt 2,8 c) Friska individer 2,1: e) Akut leukemi inga metastaser 0,07 e) Akut leukemi inga metastaser 0,20e) Akut leukemi metastaser 1,3 e) Akut leukemi metastaser 1,6 a) Terapi två dagar tidigare. b) Medelvärde från 6 patienter; värden varierar mellan 0,5 och 5,l+. c) Se tidigare avsnitt. d) Alla lungcancrar i denna studie var av havrecelltyp. e) Bestämning av dTk-aktivitet i spinalvätska, 5ul ospädd spinalvätska användes per 120111 slutvolym i provet. ' Använda förkortningar: HD; Hodgkins sjukdom NHL; non-Hodgkins lymfom CML; kronisk myeloisk leukemi CLL; kronisk lymfatisk leukemi 10 15 20 25 30 35 453 514 ll Figurbeskrivnirß Jämförelse mellan metoden enligt uppfinningen och metoden enligt Gronowitz 6: Källander, InfecJmmun. 29:l+25 1980 för dTk-bestämningar. A: två sera innehållande humant dTk-F från patienter med leukemi. B: HSV typ 2 dTk av cellkulturursprung. -o-o-o= nytt buffertsystem, -A -A -= känt buffertsystem. rutan riugängiig mx-iudn var ssox1o"3 cpm.

Separation av batcher av kommersiellt erhållen 125 I-lUdR pä tunnskikts- kromatografi med användning av förbelagda silikagelplattor (Merck 60 F34), 1596 metanol, 8596 kloroform som elueringsmedel.

A: profiler på leveransdagen, indikerande 6296 radiokemisk renhet.

B: samma batch efter 150 dagar i kylskåp. initialt angavs > 9096 radiokemisk renhet av tillverkarna.

Ett exempel som illustrerar hur beräkningar av enzymaktiviteter i enheter utfördes med användning av en intern substratkontroll. Värden visas både för prov (-o-o-) och kontroll (-A-A-). A är värdet för den interna kontrollen i cpm, vilket är proportionellt mot det totalt tillgängliga radiomärkta substratet. B är värdet för produkt bildad genom det undersökta provet uttryckt som cpm per fimme- Enheter (U) = B x (S) x v _15 , där (S) är substratkoncentrationen A x 3,1 x 10 (M) och v provvolymen (liter).

Exempel på inhiberingseffekter av höga serumkoncentrationer i dTk- försök. dTk-aktiviteter bestämdes genom provtagning vid 120 minuter. Enzyrn- aktivitet plottades mot serumkoncentration per 60 ul prov. (-o-o) serum från en patient som lider av NHL, (-A -A-) serum från en patient som lider av aktiv CLL.

Typning av viralt dTk i kliniska prov. Den kvarstående aktiviteten efter inkubation med anti-VZV dTk-serum (A-A), anti-HSV typ l dTk-serum (o-o-) och anti-HSV typ 2 serum (-o-o-) i relation till kontrollinkubering med negativt serum. Resultaten är plottade mot olika spädningar av följande prov: A = vesi- kelvätska från en patient ndivid som lider av infektion av HSV typ 2; B = vesikel- vätska från en patient som lider av en VZV-infektion; C = vesikelvätska från en patient som lider av HSV typ 1 infektion; D = serum från en patient med VZV- infektion.

Fördelning av dTk-aktivitet funnen i sera från 99 blodgivare (ofyllda kolumner) och 25 gravida kvinnor i den första trimestern (skuggade kolumnen).

Medelvärdet är 2,4 enheter/ ul med en standardavvikelse av 1,25. dTk-aktivitet/ul i sera från patienter med infektiös mononukleos relaterad till tid efter insättande av sjukdomen. Symboler märkta med samma bokstav anger sera från samma patient, och den streckade linjen anger normalvärdet. 10 15 20 25 453 514 12 dTk-aktivitet/ul i akut (o) och konvalescens (o) sera från patienter, som lider av olika virusinfektioner, mycoplasma pneumoniae, och psittacosis. Den streckade linjen anger ett värde, som är 14 gånger normalvärdet.

Pig. 9a. s-dTk hos 155 obehandlade patienter med NHL korrelerat till sjukdomsstadiet.

Fig. 9b. s-dTk hos l0l NHL-patienter i stadierna lll-IV uppdelade i tre malignitetsstadier.

Fig. l0a. Överlevnadssannoiikhet för NHL-patienter i stadierna IlI-lV med s-dTk före behandling 10 enheter -o-o-, n=5l. (Antal inom parentes anger återstående individer vid observation efter 32 månader).

Fig. l0b. Överlevnadssannolikhet för NHL-patienter i stadierna Ill-IV med "high grade" tumörmalignitet. dTk före behandling 10 enheter -o-o-, n=27. (Tal inom parentes anger kvarstående individer vid observation efter 32 månader).

Fig. ll. s-dTk hos NHL-patienter med olika kliniskt förlopp, A) patienter med progressiv sjukdom, B) två patienter behandlade till partiell remission, C) fyra patienter behandlade till fullständig remission.

Fig. 12. s-dTk följt longitudineilt hos patienter, där både progressiv sjukdom (a) och remission (b) uppträder, A) två patienter med progressiv sjukdom, som efter ändring av terapi behandlades till partiell remission innan sjukdomen åter progresserade, B) tre patienter behandlade till remission (AJ-l. och E.L till partiell och G.E. till fullständig remission). Alla fick återfall senare. A.H. svarade under kort tid ännu en gång på terapLW

Claims (5)

10 15 20 25 453 514 PAfÉNTKRAV

1. Sätt att bestämma dTk-isoenzymnivåer i en kroppsvätska eller cellprov hos människa eller djur, företrädesvis vid diagnos av sjukdomar dominerade av ATP-medierad dTk-aktivitet, såsom cancrar, tumörer och vissa virus, diagnos av sjukdomar karaktäriserade av CTP-medierad dTk-aktivitet såsom HSV typ l, typ 2 och VZV-infektioner, vilket omfattar stegen att låta provet reagera med ett substrat för nämnda isoenzym i närvaro av en fosfatgivare och ett buffertsystem och mäta mängden fosforylerad produkt som bildats, vilken mängd eller vid är proportionell mot nämnda isoenzymnivå, varvid man använder ett buffert- system vid ett pH från 5 till 9, ett substrat bestående av Zßdeoxi-S-halouridin, av vilket en del har en radiomärkt 5-halogen och vilket är närvarande i en koncentration från 2 x 10-9 - 5 x l0_6M och fosfatgivaren är närvarande i en koncentration, som inte överstiger 20 mM, k ä n n e t e c k n a t av att buffertsystemet är närvarande i en koncentration av högst 250 mM och är väsentligen fri från reaktiva primära aminogrupper.

2. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda pH är från ca 6,5 - 8, nämnda substrat- koncentration är från 5 x 10-7 - IO-BM, och nämnda fosfatgivarkoncentration är från ca 0,5 - 14 mM.

3. Förfarande enligt patentkravet l. eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda fosfatgivare är ATP eller CTP.

4. Förfarande enligt patentkravet l, 2 eller 3, av att det omfattar steget att bestämma tillgängligt som innefattar dTk- kännetecknat radiomärkt substrat genom att införliva en kontroll, isoenzym i ett överskott tillräckligt för att orsaka substratutarmning, varvid nämnda kontroll behandlas på samma sätt som nämnda prov före mätning av radioaktiviteten hos nämnda fosforylerade produkt.

5. Användning av förfarandet enligt något av patentkraven 1-4 för dTk- isoenzymtypning, k ä n n e t e c k n a d av att det omfattar steget att förinkubera nämnda prov med dTk-isoenzym-typspecifika blockerande antikroppar.