JPS59500796A - ｄＴｋアイソザイム活性の測定法とその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｄＴｋアインザイム活性の測定法とその利用本発明はヒト又は動物の体液中又は 細胞試料中のアイソザイムｄＴｋ　（デオキシチミジンキナーゼ）レベルの測定 法に関するものでおる。本発明は更に、癌、腫瘍および成る種のウイールス性感 染症のような、ΔＴＰ（アデノシン三燐酸塩）媒介ｄＴｋ活性により支配される 病気、並びにＨ４Ｆ（単純庖疹ウイールス）Ｉ型および■型およびＶＺＶ（水痘 ・帯状庖疹ウイールス）感染症のよりなｃｒｐ（シチジン三燐酸塩）媒介ｄＴｋ 活性によって特徴づけられる病気の診断および予後判定のために上記方法を利用 することに関するものである。本発明は又、ｄＴｋアイソザイムの型決定のため に上記方法を利用することにも関する。

発明の背景 真核細胞は、酵素デオキシテばジンキナーゼ（ｄＴＡ）のおかげで、チミジレー ト合成における中間生成物ではないデオキシチミジン（ｇＴ）をオリ用すること ができる。

このため、ｄＴｋはｃｔＴをＤＮＡ代謝に導入するサルヴエージ酵素と考えられ る。哨乳動物細胞の主なｄＴｋ型は、細胞分裂期にあられれるだけであるから、 ｄＴｋはスキャヴエンジャー酵素と呼称された。

ヒト細胞中には３種類の細胞アイソザイムがあると報告されている。ｄＴｋ−Ｆ と呼ばれる細胞質ゾルｄＴｋは。

分裂細胞Ｃ，Ｇ　１期〜Ｓ期）の中に適量あられれ（Ｂｅｌｌｙ。

Ｅｘｐｔｌ、Ｃｅ１１．Ｒａｇ、８９：２６３．Ｉ９’１４：Ｌｉｔｔｌｅｆｉ ｅｌｃＬ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、１１５：３９８．　１９６６） 。

静止細胞にはほとんど存在しない。ヒトではこの酵素は。

染色体（クロモンーム）１７にガラクトキナーゼ座の近くにコードされる。第二 の細胞アイソザイムは、ｃＬＴｋ−Ａと呼ばれるもトコンドリアーアイソザイム で、ミトコンドリア基質中に存在する。このｄＴｋの活性は種々の細胞期中比較 的一定であり（Ａｄｅｌｓｔｅｉｎら、　Ｄｉυｏｌｏｐ。

Ｂｉｏｌ、２６：５３７．　１９７１）、ｄＴん−Ａは染色体Ｉ６によってコー ドされる。活性の小さい、ｄＴｋ−Ｂと呼ばれる第三のｄ　Ｔｋは、連続継代性 細胞系ＨｅＬａおよびｋＢに見出されることが報告されたのみであり、ミトコン ドリア膜の内側に限り存在すると言われている（Ｋｉｔによる考察、ｐｈａｒｍ ａｃｏ１．Ｔｈｅｒ、４　：　５０１＋＋９７９）。

この３釉類の細胞ｄＴｋは、生化学的性質がそれぞれ異る。ｄＴｋ−ＦとｄＴｋ −Ｂは、非常に似ているが。

位置の他に１等電点電気泳動によって（異なる等電点ＰＩをもつため）、又電気 泳動移動度によって区別される。

ｄＴｋ　−ＦおよびｃＬ　Ｔ　、ｋ　−Ｂとは違って、ｃＬＴｋ−Ａはシチジン −三燐酸塩（ＣＴＰ）を燐酸供与体として受け容れ、ｄＴＴＰ＜チオキシチミジ ン三燐酸塩）−フィードバンク阻害に対して他の三者はど敏感でない。ｄＴｋ　 −Ａは又、チオキシシチジン（ｄＣ）を燐酸化し、ｄ、ＣＴｐによって阻害され る（Ｋｉｔによる考察、ｐｈαγｍａｃｏ　ｌ　。

Ｔｈｅγ、４：５０１．　１９７９）。

ウイールスに関して言えは、ウィールスゲツムによって規定される特異的アイソ ザイムが、ヘルペス群およびボックス群のウイールスによる感染後に、細胞中に 見出される。酵素的には、ヒトウイールスに特異的ないくつかの種類のｃｔＴｋ は、ワクシニアｄＴｈを除けばｄ、Ｔｋ−，４に似ている；ワクシニアｄＴｋは ＣＴＰを燐酸供与体として利用することができす、デオキシシチジンを燐酸化す ることもできない。このｄＴｋは、電気泳動によって容易にヒト細胞ｄＴｋ、？ と区別される（Ｈｉｔ　ら、　ｐｒｏｇγ。

Ｍｅｄ、、　Ｖｉｒｏｌ、　２Ｎ１３．　Ｋａｒｇｅｒ　Ｂａ５ｅｌ　１９７５ ）。

Ｅ　Ｓ　Ｖ　ｒｔＴｋｚモＶ　Ｚ　Ｖ　ｄ、Ｔｋ　モ、　広イ燐酸供与体スヘク トラムを有し、種々のピリばジンおよびピリミジン同族体を基質として受け容れ る（　Ｃｈｅｎｇ　ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｚ、Δｃｔα、４５２：３７０．　ｌ’？７６、およびＪ、Ｖｉｒ ｏｔ。

３１：１７２．１９７９）　ｏ　ｄＴｋ　アイソザイムが介在するｃｔＴのｄＴ ｍｐ（デオキシチミジン−燐酸）への変換が、ｃｔＴＮ族体である／−デオキシ −５−ヨードウリジン（ＩＵｄＲ）によって競合的ブロックを受けることは以前 から知られていた。ウイールスｄＴｋｚ試験において高い感度を得るために、放 射性標識化ＩＵｄＲを直接、基質として用い得ることを我々は示した（　Ｇｒｏ ｎｏｗｉｔｚ　＆　ＫａｌｌαＢｄｔｒ。

Ｉｎｆｅｃ、Ｉｍｍｕｎ、２９　：　４２５，１９８０）。

前述のように、細胞中にｄＴｋ−Ｆが出現するのは細胞増殖の時であり１分化し た細胞には多かれ少かれ存在しない（Ｍｕｎｃｈ−ｐｅｔｔｒｓｏｎ　＆　Ｔｙ ｒｓｔｅｄ、Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙθ、４７８　：　３６４．＋９７７）。移植可能のマウス腫瘍にお けるｔｒｈ活性の研究によれは、増殖速度に応じてｄＴｋ活性が高くなることが 明らかにされた（Ｂｒｅｓｎｉｃｋａｔ　ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｔｓ、２９　 ：　１９６９．　およびｃａｎｃｅｒＲｅｓ、３　ｌ　：　７４３，１９７１） ｏ　ｍ近の報告によると、悪性非ホジキン性リンパ腫およびリンパ性白血病に罹 っている若干の想者の末梢血液リンパ球に、ｄＴん−Ｆが増加している（　Ｅｌ ｌｉｍｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４（：６ｑｌおよびＢｒ１ｔ、 ／、　Ｈａｅｍａｔｏｌ　）　０高譲度ノ３Ｂ−ｄ、Ｔｃ５ｘ１０−６Ｍ）を用 いる従来のｄＴｋ試験法によると、ｄＴｋ活性は、病気の進んだ少数の想者に見 出されるに過きなかった。その他には、ｄ、Ｔｋ−ＦとｄＴｋ−Ａの鑑別分析を 行った場合に限り％ｄＴｋ活性を予後マーカー（指示物）として測定することが できた。

このように、従来Ｖｉ、ＡＴＰを燐酸供与体として用いる。３Ｂ−又は１４Ｃ− 標識ｄＴのｄＴｒｎｐへの変換を追跡することにより、ｄ　Ｔｋ活性を測定して きた。最近、我々は。

ウイールスｄＴｋアインサイムのための進歩したｄＴｋアッセイ（検定）システ ムを考案した。そこでは、基質として１２５１−ヨードデオキシウリジンＣＩＵ ｄＲ）が用いられる。この方法では、感度が高まるため２５ＢＳＶ−感染細胞の ような小さい細胞からｄＴｋを検出することができるようになった。それと比較 して、３Ｅ−ｄＴを通常ＩＦ５＃＠［で用いる従来のアッセイでは、少くとも４ ５０倍多くの酵素が必要とされる。しがし、ウィールスｄＴｋｓの研究に有用で あるとはいえ、この進歩したアッセイシステムも、この酵素が不安定なためもあ って、長期に互る細胞ｄＴｋ−Ｆアッセイには不適当であった。

この方法では血清中の微量のｄＴｋの存在を検出することができないというとと も、ウィールスｄＴｋ阻止抗体せる。これらの研究では、２７５以上のヒト血清 についてｄＴｋ−ａ　ｈアッセイが行われたが、血清ｄＴｋ活性の阻止は２例に 見出されただけであった（　Ｇｒｏｎｏｗｉｔｚ　＆に’ｔ；ｌｌａｎｄｇｒ、 Ｉｎｆｇｃ、Ｉｍｍｕｎ、２９　：　４２５．１９８０　；ＧｒｏＢｏｗｉｔｚ ＆Ｋａｌｌａｎｄｔｒ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、Ｖｉｒｏｌ、８：１７７、　１９８ １；に’ａｌｌａｎｄｅｒ　ｉｔ　ａｌ、Ｉｎｆｅｃ、Ｉｍｍｕｎ。

３６：３０．＋９８２）。

発明の概袈 本発明の目的は１種々の目的における悪性腫瘍の監視を含む、成る種のウイール ス性感染症および悪性腫瘍の診断のための手段を提供することにある。

本発明の他の目的は、ヒトおよび動物の体液および細胞試料−例えは血清、庖疹 分泌液、ＶＢ液、小水庖液およびこの種の臨床標本−中にある微量のｄＴｋを検 出できる高感度のアッセイシステムで、しかも細胞ｄＴｋ−１の寄与が最小にな るように考案されたアッセイシステムを提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、腫瘍疾患の発見および予後のために使用し、病気の 変化を監視し、再発を発見するためのｄ、Ｔｋ−Ｆアッセイ法を提供することに おる。

本発明のさらに他の目的は、燕麦細胞型肺癌と関連した転移を調べる場合に、上 記アッセイ法を利用することにある。

本発明の別の目的は、脳−を飾糸に転移がある場合。

髄液中のｄＴｋの測定によって、白血病を調べるために上記アッセイ法を利用す ることにある。

本発明のさらに別の目的は、ウイールス性疾患と関連した成る種の感染症のため の１群特異的マーカーとしての上記アッセイ法の利用にある。

本発明のさらに他の目的は、血清又は小水痕液等に存′在する。ヘルペスウイー ルスに％異的なｄＴｈｓを％異的に検出するために上記アッセイ法の変法を利用 することにある。

本発明の上記およびその他の目的は１本発明によるアッセイ法およびその適用に 関する下記の記述により、詳細に説明される。

本発明は、このように、血清等に存在するｄＴｋレベル、特にｄＴｋ−Ｆレベル 測定のための進歩したアッセイ法を提供する。このアッセイシステムは、従来技 術のシステムよりかなり感度が高い。そして感度が非常に高いために、非常に簡 単に実施できるこのアッセイシステムを、病的ｄＴｋレベルのみならす健常者の 正常レベルでさえ測定するのに用いることができることが判明した（第１図と第 ６図を比較参照）。このアッセイシステムは、非常に実際的で、２時間以上も直 線性ターンオーバーを与えて、査現性のあるｄＴｋ−Ｆ測定値を示すことがわか っただけでなく、ウィールスｄＴｋｚに関する従来技術のシステムより２〜６倍 高いターンオーバーを与えることもわかった。従来のアッセイシステムと比較し て１髪なもう一つの利点は、ｄＴｋ−，４のターンオーバーが比較的小さいこと であり、未精製試料中でｄＴｋ−Ｆ又はウイールスｄＴｋを測定する場合、この アイソザイムは極くわすか寄与するのみでるる。

燐酸供与体として、４Ｔｐの代シにＣＴＰを用いるこのアッセイシステムの変法 は１分析すべき試料を、抗ヘルペスウイールスｄＴｋ阻止血清と共にあらかじめ インキュベートしたときに、ヘルペスウィールス誘導ｄＴｋを特異的に恨出する のに有用であることがわかった。

本文中に記載された好都合のまた期待以上の技術的効果は、本発明によれは、低 ＃度および低イオン強度の緩衝系、特異的種類の放射性標識化基質（その濃度は 低い）および低濃度の燐酸供与体とを組合わせて用いることによシ得られる。

広い見地からみて１本発明は、ヒト又は動物の体液又［Ｂ］胞試料中のｄＴｈア イソザイムレベルを測定する方法であって、上記試料を燐酸供与体および緩衝系 の存在下で上記アイソザイムのための基質と反応させ、生成した燐酸化物の虻を 測定し、この童は上記アインザイムレベルと比例するという方法に関するもので ある。本発明による上記方法は。

ａ）ｐＨ範囲５〜’？、濃度２５０　ｍＭ以下の緩衝系と。

ｈ）一部は放射性標識化−５−ハロケンを有する２′−デオキシ−５−ハロウリ ジンから成り、その濃度が２　Ｘ　Ｉ　Ｏ−９〜５ＸＩＯ−６＃である基質と。

ｃ）２０ｍＭ以下の濃度で存在する燐酸供与体とを組み合わせて用いるという特 徴を有する。

基質として＋２５１−　ＩＵｄＲを用いる以前に報告されたアッセイシステムと 違って１本発明によるアッセイシステムでは細胞ｔｒｈ−ｐのための基質が２時 間以上も＠純性ターンオーバーを与え、第１図に見られるように検出感度が劇的 に増加した。この図は本発明によるアッセイ系（−〇−〇−○　）と上記先行技 術のアッセイ系（−△−△−△−）との比較である（　Ｇｒｏｎｏｗｉｔｚ　＆ 、に’ａｌｌａｎｄｅｒ、Ｉｎｆｔｃ。

Ｉｍｍｕｎ、　２９　：　４２５　、　ｌ　９８０°）。ｌ−白崩病岩者に由米 するヒトｄＴｋ−Ｆを含む２血消。Ｂ−細胞培養起源のＩｆ　Ｓ　Ｖ型２ｄＴｋ ｏ利用可能の総＋２５Ｉ−１１ＪｄＲは５５０　Ｘ　Ｉ　０３第１１およびＢ図 は１時間に対してプロットした酵素活性を示し、最も近い先行技術に比較して、 本発明方法の感度が劇的に進歩していることを示すグラフである。

第２／４およびＢ図は、−薄層クロマトグラフによって一本発明による好ましい 基質１２５　Ｉ−１ｊ／　ｄ　Ｒの放射化学的純度の貯蔵中における減少を示す グラフである。

第３図は、内部基質コントロール（対照）を用いる時酵素活性を巣位で計算する ことを説明するグラフである。

第４図は、ｄＴｋ測定において血清中の高濃度の阻止的影響を示すグラフである 。

第５図は、異なる臨床標本におけるウイールスｄ、　Ｔ　ｋの型決定（タイピン グ）を、グラフによって示す。

第６図は、供血者および妊婦におけるｄＴｋ活性の正常分布を示す図である。

第７図は、伝染性単核症患者の血清中で本発明に依って測定したｄＴｋ活性を、 病気発生後の経過時間と関連づけて示した図である。

第８図は、種々のウイールス性感染症、マイコプラズマ肺灸およびオウム病にか かった。φ者の血清中に見出されるｄＴｋ活性を明らかにする図である。

第９αおよび９ｈ図は１本発明に従って測定した血清ｄＴｋ活性と、ＮＩＩＬ患 者の病期との間の相関関係を示す図である。

第１０αおよびＩＯｈ図は、Ｎｌ１Ｌ、９．者の生存の確率と１本発明に従って 測定した血清ｄＴｈレベルとの関係を示す。

第１１および１２図は、種々の臨床的経過を辿ったＮＥＬ想者の血清ｄＴｌｃレ ベルの経過研究を説明する図本発明の好ましい態様においては、上記緩衝系は約 １５０ｍｂ１以下、特に好ましくは約１００　ｍＭの濃度である。緩衝液の好捷 しいｐＨは６５〜８の範囲で、特に約７４が好せしい。マレイン酸塩を含有しな い緩衝液、反応性に富むアミノ基又は第一アミノ基を欠く緩衝液、特にトリス− マレエートを実質的に含有しない緩衝液で最も良い結果が得られ、　ＨＥＰＥＳ 　緩衝液が特に好ましい。

基質は放射性標識化チミジン同族体１％に２′−チオキシ−５−ハロケン−ウリ ジンであるべきで、その場合その標識は反応性ハロケン同位元素であることが好 ましい。

好ましい基質は１２５７−２ｔ−チオキシ−５−ヨードウリジンである。好まし い基質濃度はｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ−８〜５　Ｘ　Ｉ　Ｏ−７の範囲内、特に約１０− ７Ｍである。

ｄＴｋ−Ｆ測定のために好捷しい燐酸供与体はＡＴｐで。

ウイールスｄＴｋ測定のために好ましい燐酸供与体はＣＴＰである。燐酸供与体 の好ましい濃度は約Ｉ　Ｑ　ｍｕ以下、特に約０．５〜５ｍＭである。本来、４ ＴＰおよびＣＴＰと同様のアイソザイム特異性をもつことが知られている燐酸供 与体を用いてもよい。

Ｈｇ２＋は燐酸供与体と少くとも等モル濃度で存在するのが好ましい。ジチオス レイトールのような還元剤が存在するのが好ましい。

燐酸化生成物は本来知られている方法によって測定できる（例えはＧｒｏｎｏｗ ｉｔｚとに’Ａ１１ａｎｄｔｒ、Ｉｎｆｅｃ。

Ｉｍｍｔｔｎ、　２９　：　４２５．１９８０参照）０例えば血清又は庖疹分泌 物のような臨床標本におけるｄＴｋ活性を検出するために本発明によるアッセイ システムを適用することは、成る種のウイールス感染症および悪性腫瘍の診断の ための新しい手段をもたらす。前述した方法による単一のｄＴｋアンセイで得ら れた異常な血清ｄＴｋレベル（例えは、〉１０単位）は、予後診断的に使用する 場合、すぐれたマーカーになることが判明し、また同様に連続ｄＴｋ値も悪性疾 岩の進行又は退行を監視する場合のすぐれたマーカーになることが判明した。史 に、これらの患者では血清ｄＴｋレベルが再発のマーカーとして、又治療効果を 評価する上で役に立つ。

これらすべてを以下に例証する。

以下に報告するテストを行う場合に実際に採用された好ましい態様においては、 １２５７−　ＩＵｄＲが基質として用いられる。好ましいアッセイシステムの組 成、比率および最終濃度を第１表に記す。

’ＥＥＰＥＳ　Ｏ，ｌ　Ｍ　８６ｍＭ ＭｇＣ１２１７ｍＭ　’　１５ｍＭ ＫＣｌ　２０ｍＭ　ｌ’７ｍＭ ＮａＦ　１．２ｍＭ　１．０ｍＭ 、４　Ｔ　ｐ　４．６　ｒｎ　Ｍ　３．９　ｍ　ＭシｆオスＬ／イ）−ル２．７ 　ｍＭ　２．３　ｍＡｉウシ・アルブミン０．３３　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　、Ｉ Ｑ、　２８　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌグリセロール　６．６％　′５７％ ＩＵｄＲ１，１ｘｌｏ　Ａ１ ｐＨ７，４７，４ α、一つの２倍試料の比率は：アツセイ混合物５１．５μ４基質溶液６μｔｃ　 １２５１−　ＩＵｄＲの最終濃度Ｉ　Ｘ　１０−７Ｍ　。

１３０〜１６０°’／ｍＭ　）、酵素浴液（例えは血液）２５μｔ（反応開始時 に加わえる）、最終容量は６０μｔとなる。

ｂ、ＨＥｐＥｓ　＝ｊｖ　−２−ヒドロキシエテルピペラジンＮ−２−エタンス ルホン酸 一般に、５１．５μを反応溶液を使用直前に６μｌ基質溶液と混合して、一つの ２倍試料を調製する。２５μを酵素溶液（例えは血清試料）の添加によって反応 が始まる。全量６０μｌというこの標準容量から２５μｔ−６つ２回試料をとる 。異なるインキュベーション時間をおいて採取される数組の２倍試料から成る実 験のためのアッセイ混液の期成は、標準溶液中の成分の量に、２倍試料の所望数 を乗することによって計算される。アッセイは３７℃で行われ１反応開始の前に ２分間全敗分をりらかしめあたためる。試料をピペットで、９０〜１００℃に保 たれたｊＣｒ／ｌのＷｈａｔｍａｎ　ＤＥＡＥ−ｇ　１紙片上に置くことによっ て、酵素反応は終る。生成物を基質から分離するために、その紙をｆ、ｍＭ蟻酸 アンモニウム溶液で４回、蒸泗水で１回。

最後にメタノールで洗う。洗浄は、磁気攪拌器にとりつけられた１ｔのガラス容 器中で行われる。１０〜１５枚の円形の紙片を沖過器に入れて、同時に処理する 。その沖過器を５分おきに新しい洗浄槽に移すのでりる。敢後にその円形紙を自 動ノｊンマ計数管でカウントする。

ｃｔｒｈアッセイにおける駐日変動を排除するために、得られた反応速度を単位 に計算し直した。酵素量を定めるのに単位を使う理由は、市販の１２５７−　Ｉ ＵｄＲの生物学的崩壊が見出されたことと関連して最初の放射化学−的純度に変 動があるためでｈる。生物学的崩壊は、試料毎に加えた総数′射能を、酵素活性 の計算に無関係なものにしてし１つ。第２図は、予備コーティングしたシリカケ ルプレート（Ｍａｒｃｈ　６０Ｆ２５４　）を用いて行った薄層クロマトグラフ ィーにおける市販の１２５７−ｌＵｄＲバンチの分離を示す。溶出液として１５ チメタノール、８５％クロロホルムを用いた。ｌ＝入手日における性状、放射化 学的純度６２％を示す。Ｂ＝１５０日冷蔵庫に貯蔵後の同一バッチ。製造業者の 主張では、最初の放射化学的純度は〉９０チである。その代り、易感受性放射能 を測定する生物学的内部コントロール（対照）を各アッセイに含めた。この対照 はＨ５Ｖ２型ｄＴｋを１００倍も多く含むものであって、大規模な基質疲態を招 いた。１時間アッセイにおいて、との対照により挿入される放射能の量は完全な １２５Ｉ−１ｇｄＨの約８５％であることがわかった（薄層クロマトグラフィー から計算して）０生物学的対照で見出されたそのレベル（８５％）を考慮して、 酵素１単位は、（記載せる条件下で）１時間につき基質４．３　Ｘ　１０”５モ ルを変換する酵素量となる。単位と、概算モル・ターンオーバーとの間のこの関 係は、通常用いられる同位元素量の場合％　１単位が実際上約ｌ　０００　ｃｐ ｍとしてあられされるように選択された（第１表参照）。この生物学的同位元素 対照を、試験試料と同様な方法で処理して用いる場合のもう一つの利点は、生産 物回収率の＝ｍによりおこり得る単位の変動が回避されることである。単位計算 の手順は第３図に例示する。試料（−０−０−）および対照（−△−△−）両方 の値を示す。ｌは内部対照の値をｃｐｍであられしである：これは利用可能の総 放射性標識化基質に比例する。Ｂは被験試料により生成した産物の数値を’Ｐ” ／ｈｏｕｒ　であられしたものである。

単位（Ｕ）−ｍゝ１−一丁　ここで（Ｓは基質濃度（ハ）。

、（ｘ５．３ｘｌ。

Ｖは試料の景（４である。

血清ｄ、Ｔｋ活性の測定　血清ｄＴｌ＃ｐ定量をミクロタイター・プレートで行 なった。２０血清試料毎に、パンクグラウンド対照と内部基質対照（上記参照） が含まれ。

その−組をユニットとして処理した。用いた血清試料の量は最終容量１２０μｔ あた９５μｔ（又はそれ以下）であった：それ以上の血清は阻止的に働くかも知 れない。第４図参照。１２０分後にサンプリングを行ってｄＴｋ活性を測定した 。酵素活性を、試料６０μｌあたりの血清濃度に対してプロットした。（○−○ ）　−ＮＥＬに罹った個体からの血清、（△−△）＝活性ＣＬＬにかかった個体 からの血清。

上記の阻止的影響は、多分１例えはチミジン、チミジン三燐酸塩のような、ヌク レオチド又はヌクレオシドの存在、又は成る血清中には存在する分解用酵素によ るものであろう。６０分後と１２０分後に二重に試料を採取した。

バンクグラウンドを補正した後、１時間および２５μｌ試料についての培地ター ンオーバーを、各二倍試料から別別に計算した。それから６０分および１２０分 サンプリングの平均速度値を測定し、変動かく２０％であった場合はその平均速 度値をその後の計算に用いた。

髄液中のｄＴｈ活性の測定　本質的には血清の揚台と同じ方法を用いた。１２５ Ｉ−ＩＵｄＲの比放射能を約３２０Ｃｉ／ｍＨに増加させた。酵素測定の前に髄 液を濃縮しても例えば小水庖液、血清のような臨床標本を、アイソザイムに特異 的なｄＴｋ阻止抗体と共にあらがじ検インキュベートし、残シの酵素活性を上述 の方法によって御」定した。アッセイ混液中の／ＩＴｐをＣＴＰに代えた。その 結果ｄＴｋ−Ｆ活性は除かりる。試験すべき標本を反応溶液で段階的二倍稀釈を 行い（普通は１：６で開始する）。

そして稀釈液から１５μｌづつ、ばクロタイタープレートの４つの凹みに移す。

こうして同一稀釈の４検体が１組となる。

あらかじめ稀釈したＶＺＶ　ｃｔＴｋ−阻止血清（２５ｒｎｔ）を１つの凹みに 加え、Ｈ５ＶＩ型ｔｔｒｈ阻止血清を２番目の凹みに、ＥＳＶ２型ｄＴｋ阻止血 清を３番目の凹みに、マイナス血清を４査目の凹みに加えた。その混合物を３７ ℃で９０分間インキュベートし、酵素−抗体反応を行わせた。その後残留酵素活 性を測定した。基質浴液６μｔおよび反応浴液１４μｔがら成る混合液２０μｔ を加えることにより反応は開始した。各稀釈毎に異なる抗体の存在下で得られた 数値を、マイナス血清で得られた数値のパーセンテージとして計算し面した。そ のような残留酵素活性を、標本の１ｏ１２Ｗｕ釈に対してプロットした例を第５ 図に示す；ここでは抗−ＶＺＶ　ｄＴｋ血清（△−△）　、抗−ＥＳＶ　ｌ型ｄ Ｔｋ崩清（ｅ−ｅ　＞および抗−１１ＳＶ２型血清（Ｏ−○）と共にインキュベ ーションした後の残留活性と、マイナス血清と共にインキュベーションした対照 との比を１次の試料の種々の稀釈に対してプロットした二Ａ＝Ｈ５Ｖ２型感染症 にかかった固体からの小水拒液；　Ｂ＝ＶＺＶ感染症にかかった個体からの／」 ・水＠液；Ｃ＝ＥＳＶＩ型感染症にかかった個体からの小水液液；Ｄ＝ＶＺＶ感 染症にかかった個体からの血清〇叱正パターンから、ｄＴｋの型が容易に定めら れる（以下の第２衣も参照）。

こうして１本発明の重要な特徴の−っは、劇的に増加した検出感度である。この おかけで第６図から判るように（第６図は９９人の供血者の血清中に見出された ｄＴｋ活性の分布（内柱）と、３ケ月以内の妊婦２２人の血清中のそれの分布（ 斜線柱）とを示す）、健常者の血清中の正常なｄＴｋ−Ｆレベルの測定さえ可能 となる。平均値は２４単位／μｔ、標準偏差は１．２５である。

感染性疾患にかかった個体から得た血清試料を研究することによって、成る種の ウィールス性疾患　例えは伝染性単核症、風珍−１麻疹−ウィールス感染症　の 急性期における患者の血清中ｄＴｋレベルは１０〜４０倍上昇していることが発 見された。第７図は、伝染性単核症患者の血清中に生成するｄＴｋ活性／μｔを 、その病気の発生後の時間経過と関連づけて示したものである。同一文字を付し たＯ印は同一患者からの血清を示し１点線は健常者の正常値を示す。第８図は釉 λのウイールス感染症。

マイコプラズマ肺炎、およびオウム病にかかつ＊　、＠−４−の急性期（＃＃） および回復期（０）の血清中に見出される□ｄＴｋ活性／μｌを示す。点線は、 健常者の正常値の４倍の数値を示す。

この結果によると、ヘルペスウイールスに関しては原感染症のために血清ｄＴｋ 活性が上昇するとＬが示される。他の感染症に関しては、その結果としておこる ｄＴｋ活性の上昇（〉１０年位）は見出されな゛かった（宛８図）。

見出された血清活性を特徴づけると、これまでに水痘−帯状庖疹ウイールス（Ｆ ＺＶ）−特異的−ｄＴｋ（第２表）および細胞ｄＴｋ−Ｆの存在が証明された。

本発明方法は、感染症を速かに診断するために／Ｊ’ｌ水庖液中に存在するウイ ールス特異的−ｄＴｋを決定するために用いることができることも証明された（ 第２表）。ウイールス感染症と関連して見出されるすべての血清ｄＴｋ活性は。

徐々に消失し、２〜６週間以内に正常レベルに達する。

悪性疾、壱恵者に関しては１本発明に依るアッセイ法を用いた限られた研究の結 果、リンパ球−増殖系に起因する悪性肺瘍にかかつている患者のみならす、その 他の細胞の悪性Ｉ！！Ｉ瘍にかかシ、リンパ球増殖系に転移した患者においても 血清ｄテにレベルの上昇が証明された（第３表参照）。

非ホジキン性リンパ１ｍ（ＩＶＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）。

慢性活性化リンパ性白血病（ＣＬＬ　）および骨蝕肺のような、リンパ球増殖症 にかかつている患者から、十分に確認された大量の血清試料を得て、これを用い て大規模な研究を行った。ＮＨＬ群の詳細な結果は次のようであった：正常な血 清ｄＴｋレベルと１種々の程度に上昇したｄＴｋレベルが発見された。これらの ｄＴｋレベルは病期と関連していた（第９図参照、この図は、未処激のＩＶＢＬ 患者１５５人の血清中ｄＴｋを病期と関連つけて示す）１部ち病気が進行すれは する程ｄＴｋ値は高くなる。

２１ 肺　癌′）　転移なし　５ 転　移　１６３ 転　移　１９ Ｈｌ）　転　移　１０６ ＥＤ　転　移　２８ ＨＤ　転移なし　４ ＨＤ　転移なし　３ ＮＨＬ　元通期　３３３ ＮＨＬ　元通期　１４ ＮＥＬ　初　期　３ ＮＩＩＬ　初　期　５ 腺　倍　活　性　７２ 白血病　急　性　４０ 白血病　急　性　１８５ Ｂ−ｃｅｌｌ−白血病　活　性　５２ ＣＭＬ　活　性　３５００α） ＣＭＬ　活　性　４５ ＣＬＬ　活　性　６２ ＣＬＬ　活　性　１８ ＣＬＬ　生活性　１１ ＣＬＬ　生活性　１２ ＣＬＬ　不活性　２．８ｂ） 急性白血病　転移なし　０．２０’） 急性白血病　転　移　１．３１） α）治療が２日程早い。

Ａ）６．１！者からの平均値：数値は０．５から５４までの範囲内にある。

Ｃ）前節参照。

ｄ）本研究における肺癌は、全部燕麦細胞型であった。

ｅ）髄液中のｄＴｋ活性の測定、アッセイの最終容量１２０μノにつき未稀釈の 髄液５μｔを用いた０略記号；ＨＤ；ホジキン病 ＮＨＬ　；非ホジキン性すンパ肺 ＣＭＬ　；慢性骨髄性白梅病 ＣＬＬ　；慢性リンパ性白血病 ｄ　７”　ｋレベルを腫瘍細胞の悪性化と関連づけて見る時（キール・システム による分類）、高いｄＴｋレベルと悪性化の間には十分な相関関係が認められた 。（第９図参照、３期に分けられた悪性腫瘍の第■〜■期の、ＮＢＬ患者１０１ 人に２ける匍悄ｄＴｋを示す）。

本発明によるアッセイ法を予後を知る目的のために使用し得ることが証明された 。それは、測定したｄＴｋ値が＜１０単位であるか、〉１０単位であるかによっ て分類した慶者群の間で、生存期間に高度に有意な差があられれたからである。

第１０α図は、あらかじめ測定した血清ｄＴんが＜１０単位（−〇−Ｑ−、７１ ，＝　５０　）又は＞　１０単位（−〇−・−、’ｎ＝５１）を示した■〜■期 のＮＢＬ、＠３省の生存確率を示す。カッコ内の数字は、３２ケ月後の観察時に 生き残っている人数を示す０第１０Ａａは。

”高度に″悪性化した腫瘍をもったｌ〜■期のＭＥＬ、告者についての生存確率 を示す。あらかじめ測定したｄＴｋレベル：〈１０単位（−０−０−、ｎ　＝　 ｌ　Ｉ　）および〉１０単位（−・−・−、ｆｉ＝２７）。カッコ内の数字は３ ２ケ月後の観、整時に残っている人数である。

更に、ＮＨＬ患者の血清ｄＴｋレベルの紅時研究は。

病気の変化に相関した変化をあられした。即ち病気の回復でそのレベルは低くな り、病気の亢進で高くなり、定常状態では変化しない。第１１商のＡは、元通期 の病気の３．轡者の血清ｄＴｋレベル測定値の変化、Ｂは治療して幾分緩解した ２、轡者、Ｃは治療して完全に緩解した４慶者におけるそれを示している。第１ ２図では、病気の元通（ａ）も回復（ｈ）も両方共おこった患者において血清ｄ Ｔｋを縦に追跡したＯＡ）は元通性疾磨の２患者を示し、彼等は治療法を変えた 後、幾分緩解し、その後再び病気は元通した。Ｂ）は治療して緩解した３、＠者 のものである（／４゜ＩＬ、　Ｅ、　Ｌ、は幾分緩解、Ｇ、Ｅ、は完全にＭ解） 。彼等全員はその後再発した。／ｆ、　Ｈ，はもう一度その治療に短期間反応し た。以上の結果は、治療効果を監視できること。

そして治療中にも治療後にも、ｄＴｋ値の増加によって。

杓発の早期発見ができることを明らかに示している。

本発明によるアッセイ法をその他の上記リンパ球増殖性疾恵と関係つけて用いた 嶺合、血清ｄＴｋレベルの変動が見出された１例えは慢性ＣＬＬでは正常値が見 出されたが、生活性化ＣＬＬでは低い、病的数値（〉１０単位）となり、活性Ｃ ＬＬは高い数値を与えた。ＮＨＬで示したようなｄＴｋレベルの利用の仕方はＣ ＬＬにもちては廿る。その上、白梅病想者から採取した髄液の研究により、白血 病細胞が脳−を髄液中にある時にはｄＴｋが存在することが判った。

轟然、悪性疾患、の者においても上記のウイールス性感染症による一過性の血清 ｄＴｋレベルの上昇か２ζり骨ることに、気がつかなければならない。しかしな がらこれらのウイールス性疾、密に関しては、子供の頃に免役を＠得しているの が普通である。一方、悪性に瘍疾恵は、普通、成人におこる。上述の目的のため に血清ｄＴｋレベルを利用することが理に叶う　もう一つの理由は、未確定の病 気をもった患者から採取した　診断的目的のために連続的に得た非選択的血清試 料の研究で、ｄＴｋ活およびその他の患者に関する医学的記録を調べると、肝機 能検査の病的数値も白血球増多症も普通は血清ｄＴｋレベルの上昇を伴わないこ とが判明した。

／ （ｐｒｒｌｘｌＱ ｇ ３ ｐｍｍｌＱ ＩＧ３ 呵 ） 暫 ｇνｆ虻；二ｆ、メこン≧ｑ−グＮ ＦＩＣ，，’７゜ Ｈが 国際調査報告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　ヒト−又は動物体液、又は細胞試料のｄＴｋアインザイムレベルを測定す る方法であって、燐酸供与体をよび緩衝系の存在において上記試料を上記アイソ ザイムのための基質と反応させる段階と、生成した燐酸化物の量を測定するトｉ 階とからＥｌ　Ｄ、上記の量は上記アイソザイムレベルに比例し。 α）ＰＲ範囲５〜９で、２５０ｍＡ（以下の一度で存在する緩衝系と。 ｂ）一部は放射性標識化ハロゲンをもつ２′−チオキシ−５−ハｏつ＋）ジンカ ラ成す、２ｘ　ｌ　Ｏ−９〜５ｘ　ｌ　０−６Ｍの範囲の濃度で存在する基質と 。 Ｃ）２０ｍＭを超えない濃度で存在する燐酸供与体とを組み合わせて用いること を特徴とするヒトもしくは動物体液または細胞試料のｄＴｋアインザイムレベル を測定する方法。 ２　上記ｐ１１が約６５〜δ、上記基質＠度が１０−８〜５Ｘ１０−’　Ｍ、上 記燐酸供与体濃度が約０５〜５ｍＭである請求の範囲第１項記載の方法。 ３　上記緩衝物質が本質的にトリス−マレエートを含まない請求の範囲第１又は 第２項記載の方法。 ４　上記燐酸供与体がＡＴＰとＣＴｐとがら成る群がら選はれる請求の範囲第１ ．２又は３項記載の方法。 ５、　利用可能の放射性標識化基質を％基質波・（９）をおこす程十分過剰のｄ Ｔｋアインザイムから成る対照ヲ台もととによって測定する段階から成り、上記 対照は上記唐忽化物の放射能測定前に、上記試料と同様に処理される請求の範囲 第１．２．３又は４項記載の方法。 ６　癌、腫瘍および成る種のウイールス感染症のよりナ。 ＡＴｐ媒介ｃＬＴｋ活性の変化を含む病気の診断のために、請求の範囲第１項乃 至第５項中のいづれか一つに記載の方法の使用。 ７、ＥＳＶＩ型、２型およびＶＺＶ感染症のようなｃｒｐ媒介ｄＴｋ活性の変化 を含む病気の診断のために、請求の範囲第１項乃至第５項の中のいづれか一つに 記載の方法の使用。 ８　上記試料を、ｄＴｋアインサイム型に特異的な阻止物質１例えば抗体、と共 にあらかじめインキュベーションする段階を含む、ｄＴｋアインサイム型決定の ために請求の範囲第１項乃至第５項のいづれか一つに記載の方法の使用。