CN108614116B - 一种预测替莫唑胺耐药性的生物标志物的应用 - Google Patents

Abstract

一种预测替莫唑胺耐药性的生物标志物的应用，其属于生物标志物技术领域。本发明以ELISA技术检测胶质瘤治疗药物替莫唑胺耐药性的生物标志物，在高级别胶质瘤中血浆GPBB可预测替莫唑胺的耐药性，尤其在IDH1突变患者中具有更好的预测价值。可用于胶质瘤治疗药物替莫唑胺耐药的预测，寻找到的生物标志物GPBB有助于胶质瘤精准给药方案的制定。另外，本发明高灵敏度、高特异性，AUC达83.5%。以血浆样本作为生物标志物检测样本具有方法可行，科学合理，取材方便，操作步骤简单和可连续动态检测等优点。

Description

一种预测替莫唑胺耐药性的生物标志物的应用

技术领域

本发明属于生物标志物领域，具体涉及一种胶质瘤血浆中GPBB(糖原磷酸化酶BB)作为预测替莫唑胺耐药性的生物标志物的应用。

背景技术

神经胶质瘤(Gliomas)是颅内常见肿瘤之一，占中枢神经系统肿瘤32%以上，其中一半以上为恶性胶质瘤，年发病率约3.5-4.5/10万人口。自NCCN指南提出以手术结合辅助放化疗的综合治疗作为恶性胶质瘤的标准治疗策略以来，其治疗效果已经取得了一定的改善，但总体生存获益仍不乐观。研究报道术后辅助化疗联合全脑放疗的恶性神经胶质瘤的中位生存期仅12-15月，五年生存率不及10%。化疗作为胶质瘤的主要治疗手段之一，其在胶质瘤治疗中的地位是其他治疗手段无法替代的，替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）作为第二代烷化剂的口服化疗药物，属于咪唑四嗪类衍生物，具有高脂溶性，易于通过血脑屏障，原药不经过肝脏代谢，毒副作用小。在体外药物敏感性试验中，我们前期工作发现替莫唑胺抑制胶质瘤细胞有效率达60-70%，较其他化疗方案疗效高。然而替莫唑胺的临床有效率不足45%，甚至有些患者替莫唑胺治疗后近期疗效佳，但很快出现肿瘤复发。因此，体外药敏试验结果和临床获益率之间的差距证实了体内肿瘤微环境的改变与肿瘤细胞的固有耐药和获得性耐药有一定相关性，后者也在一定程度上限制了替莫唑胺的临床治疗效果。目前临床上检测胶质瘤组织的基因变异知道临床实践包括MGMT启动子甲基化、IDH1突变和1p/19q共缺失等。IDH1突变和1p/19q共缺失主要与胶质瘤预后相关，仅MGMT启动子甲基化与替莫唑胺疗效相关，但与临床实际疗效符合度尚欠佳，尤其是无手术适应症的胶质瘤，在无法获取组织的情况下无法评估替莫唑胺疗效。因此，上述方法并不能做到有效、便捷的预测胶质瘤替莫唑胺疗效的价值。

因此，寻找敏感、特异的具有预测胶质瘤的治疗药物替莫唑胺疗效的生物标志物是目前亟需解决的问题。

发明内容

本发明目的是在于克服现有胶质瘤治疗的上述不足，提供血浆GPBB作为预测胶质瘤的治疗药物替莫唑胺耐药生物标志物应用，旨在解决替莫唑胺原发耐药导致疗效不佳的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种预测替莫唑胺耐药性的生物标志物的应用，所述生物标志物为血浆GPBB，应用于预测胶质瘤治疗药物替莫唑胺的耐药性。

所述血浆GPBB的基因核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，或如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的核苷酸序列。

SEQ ID No.1如下所示：

atggcgaagc cgctgacgga cagcgagaag cggaagcaga tcagcgtgcg cggcctggcggggctaggcg acgtggccga ggtgcggaag agcttcaacc ggcacttgca cttcacgctg gtcaaggaccgcaatgtggc cacgccccgc gactacttct tcgcgctggc gcacacggtg cgcgaccacc tcgtgggccgctggatccgc acgcagcagc actactacga gcgcgacccc aag。

所述血浆GPBB的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。

SEQ ID NO.2如下所示：

Met Ala Lys Pro Leu Thr Asp Ser Glu Lys Arg Lys Gln Ile Ser Val ArgGly Leu Ala Gly Leu Gly Asp Val Ala Glu Val Arg Lys Ser Phe Asn Arg His LeuHis Phe Thr Leu Val Lys Asp Arg Asn Val Ala Thr Pro Arg Asp Tyr Phe Phe AlaLeu Ala His Thr Val Arg Asp His Leu Val Gly Arg Trp Ile Arg Thr Gln Gln HisTyr Tyr Glu Arg Asp Pro Lys。

所述血浆GPBB的浓度为9.17-42.96 ng/ml。

所述预测替莫唑胺耐药性为检测胶质瘤患者的血浆GPBB的含量的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1，将未经化疗的胶质瘤患者的外周血待测样本，进行离心处理收集血浆；

步骤2，检测所述血浆的待测样本中的GPBB的浓度，检测方法为酶联免疫吸附试验。

所述血浆GPBB在制备预测替莫唑胺耐药性试剂盒的中的应用。

本发明发现，在未经化疗的胶质瘤患者血浆中GPBB具有预测替莫唑胺耐药性的价值，该血浆GPBB浓度与体外胶滴药敏检测的替莫唑胺抑制肿瘤活性存在一定范围的负相关联系。另外，还发现该血浆GPBB尤其在IDH1突变亚组中预测替莫唑胺耐药性更显著，而无论MGMT启动子甲基化或1p/19q共缺失的状态，该血浆GPBB均具有预测胶质瘤替莫唑胺疗效的价值，即该血浆GPBB在胶质瘤个体化治疗具有潜在的应用前景。

上述的应用，生物标志物通过以下步骤筛选得到：

血浆采集是术前采用EDTA抗凝采血管收集，共计3~5毫升。

取样后1小时内完成低温4°C离心，1000rpm，15分钟，分离后采集上层血浆层至2毫升冻存管（购自上海万格， Avantech，2毫升），并保存于-80°C冰箱待统一进行后续的试验。

血浆GPBB浓度测定采用血浆GPBB ELISA试剂盒 (CSB-E08475h, CUSABIO, 中国武汉)，根据说明书先做标准品浓度曲线，浓度梯度分别为80 ng/ml、40 ng/ml、20 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、2.5 ng/ml、1.25 ng/ml和0 ng/ml。将血样取出并放置室温。

量取100微升血样或标准品至反应孔中37°C静置2小时，弃上清，加入100微升blotin抗体37°C静置1小时后，弃上清并清洗3次。

加入100微升HRP-avidin37°C静置1小时后，加入90微升底物37°C静置30分钟，加入50微升反应终止液。

立即采用酶标仪进行检测，测定波长570 nm，检测波长为450 nm。

根据标准曲线换算为样本的血浆GPBB浓度。

本发明相对比现有技术，具有如下的优点及有益效果：

本发明以ELISA技术检测胶质瘤替莫唑胺耐药性的生物标志物，在高级别胶质瘤中血浆GPBB可预测替莫唑胺的耐药性，尤其在IDH1突变患者中具有更好的预测价值。可用于胶质瘤的治疗药物替莫唑胺耐药的预测，寻找到的生物标志物GPBB有助于胶质瘤精准给药方案的制定。

与普通的组织基因变异检测相比，具有高灵敏度和高特异性的优点，AUC达83.5%，具有重要的应用价值。

血浆GPBB检测是以血浆样本作为生物标志物检测样本，具有取材方便，方法可行，科学合理，操作步骤简单和可连续动态检测等优点。

本发明的生物标志物是糖原代谢的重要代谢酶，其预测胶质瘤替莫唑胺耐药性具有重要价值，有助于临床上制定个体化患者的给药方案。另外，对于研发克服替莫唑胺改善胶质瘤预后的药物提供潜在靶点，以便筛选出对不同个体具有良好疗效的药物成分。

附图说明

图1为本发明实施例中基于血浆GPBB浓度鉴别替莫唑胺耐药组和替莫唑胺敏感组，a为替莫唑胺耐药组的血浆GPBB显著高于替莫唑胺敏感组，b展示出了血浆GPBB鉴别替莫唑胺耐药和替莫唑胺敏感的接收者操作曲线（ROC曲线），曲线下面积（AUC）为0.835，95%置信区间为0.737-0.933，对角线代表AUC为0.5的曲线；根据最大拟合参数确定血浆GPBB的界值为30.71。

图2为本发明实施例中根据IDH1变异分组可见血浆GPBB在替莫唑胺耐药组和替莫唑胺敏感组的分布。在IDH1突变的亚组中，替莫唑胺耐药组的血浆GPBB显著高于替莫唑胺敏感组（14.62 ng/ml vs 36.65 ng/ml），两者具有统计学差异；而在IDH1野生型的亚组中，替莫唑胺耐药组的血浆GPBB略高于替莫唑胺敏感组(mean 23.19 ng/ml vs 30.23 ng/ml)，但两者并无统计学差异。

图3为本发明实施例中根据1p/19q共缺失分组可见血浆GPBB在替莫唑胺耐药组和替莫唑胺敏感组的分布。在1p/19q共缺失的亚组中，替莫唑胺耐药组的血浆GPBB显著高于替莫唑胺敏感组（21.46 ng/ml vs. mean 31.08 ng/m），两者具有统计学差异；在1p/19q野生型的亚组中可见替莫唑胺耐药组的血浆GPBB也显著高于替莫唑胺敏感组（21.39 ng/mlvs. mean 32.00 ng/ml），两者具有统计学差异。

图4为本发明实施例中根据MGMT启动子甲基化与否分组可见血浆GPBB在替莫唑胺耐药组和替莫唑胺敏感组的分布。在MGMT启动子甲基化的亚组中，替莫唑胺耐药组的血浆GPBB显著高于替莫唑胺敏感组（21.46 ng/ml vs. mean 31.08 ng/ml），两者具有统计学差异；在MGMT启动子非甲基化的亚组中可见替莫唑胺耐药组的血浆GPBB也显著高于替莫唑胺敏感组（ 21.39 ng/ml vs. mean 32.00 ng/ml），两者具有统计学差异。需要说明的是，在MGMT启动子非甲基化亚组中血浆GPBB浓度相对于MGMT启动子甲基化亚组更高。

图5为本发明实施例中总生存曲线，血浆GPBB浓度根据30.71作为界值分为GPBB高水平和GPBB低水平两组（7 月 vs 14 月, P=0.032），两组的中位总生存存在显著差异，可见GPBB高水平的预后更差。

具体实施方式

本发明的生物标志物，是根据患者体外胶滴药敏的替莫唑胺的敏感性作为评价指标，采集胶质瘤的血浆测定GPBB浓度与替莫唑胺耐药性的关系而得出的。具体的，这种对应关系或者生物标志物的获得，是以血浆GPBB浓度为一个对象，胶质瘤替莫唑胺的肿瘤细胞抑制率为第二个对象，通过接收者操作曲线和最大拟合参数而计算得到分界值为30.71，最终根据预测替莫唑胺耐药性和胶质瘤患者的总生存预后得到血浆GPBB作为本发明的生物标志物。

本发明所用术语是本领域普通技术人员通常理解的含义。为了更好地理解本发明，对一些定义和相关缩写术语的解释如下：

本发明的“胶质瘤”，是源自神经上皮的肿瘤统称为脑胶质瘤，占颅脑肿瘤的40%～50%，是最常见的颅内恶性肿瘤。

本发明的生物标志物，也称为“生物学标志物”，是指个体的生物状态的可测量指标。这样的生物标记物可以是个体中的任何物质，只要他们与被检测个体的特定生物状态，如耐药，存在关系即可。这样的生物标记物可以是并不局限于核酸标记物、蛋白质标记物、细胞因子标记物、抗原标记物、抗体标记物和功能标记物等。本发明的生物标记物具体的为蛋白质类生物标志物。

本发明的“GPBB”是指脑型糖原磷酸化酶。糖原磷酸化酶（Glycogenphosphorylase, GP）是糖原分解的限速酶（EC 4.4.1.1），根据结构功能和组织分布特性分为三种亚型，肝型（GP-LL）、肌型（GP-MM）和脑型（GP-BB）。其中，GP-BB基因位于人类第20号染色体上，其主要分布在脑、心脏和肿瘤组织中。

本发明的“MGMT”是指O6-mG DNA甲基转移酶（O6-mG DNA methyltransferase,MGMT），MGMT是修复细胞毒性甲基加合物的关键酶，能转移受损DNA上的鸟嘌呤第6位氧原子位点的甲基至自身第145位半胱氨酸残基上，修复鸟嘌呤，抵抗替莫唑胺造成的甲基化损害，从而使肿瘤细胞逃避凋亡，导致替莫唑胺的耐药。

本发明的“IDH1”是指异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase, IDH1)。IDH1突变可见于50~80%的WHO II和III级星形细胞和少枝胶质细胞肿瘤和继发的胶质母细胞瘤中，以及5%的原发性胶质母细胞瘤中。和IDH1野生型胶质瘤相比，存在IDH1突变的胶质瘤和明显延长的无进展期和总的生存期相关。

本发明的“1p\19q”是指1号染色体和19号染色体同时发生杂合性缺失，也是少枝胶质细胞来源肿瘤的标记物。在星形细胞肿瘤、少枝星形细胞肿瘤和少枝胶质细胞肿瘤中1p/19q联合缺失的发生率分别为19.3%、50.0%和80.8%。染色体1p/19q杂合性缺失是胶质瘤预后较好的生物标志物。

下面通过具体实施例和附图对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。

实施例1

1.材料与方法

1.1样本收集

本例的样本采集由辽宁省肿瘤医院神经外科医生协助进行。在术前进行样本采集，并接受胶质瘤切除手术，组织病理根据WHO分级为III或IV诊断为高级别胶质瘤。另外，组织接受体外胶滴药敏（Collagen gel droplet embedded culture drug sensitivitytest ，CD-DST）检测替莫唑胺的敏感性。患者接受替莫唑胺治疗。根据以上标准，本例筛选出63例高级别胶质瘤患者，作为研究对象，并对以上63例入组的患者进行详细的表型信息登记，以及了解其病史、家族史、IDH1变异、1p/19q共缺失和MGMT启动子甲基化状态等，并且均签署了知情同意书。本发明经辽宁省肿瘤医院伦理委员会批准（批准号：No. 20150309-2）。

血浆采集是术前采用EDTA抗凝采血管收集，共计3~5毫升。具体的，样本的编号分别为：G002、G005、G007、G008、G011、G012、G013、G015、G017、G019、G025、G026、G028、G030、G031、G032、G033、G037、G039、G040、G041、G042、G045、G047、G052、G053、G056、G058、G061、G063、G064、G069、G071、G072、G075、G077、G078、G081、G087、G092、G095、G097、G099、G101、G102、G104、G105、G106、G112、G116、G117。上述63例患者的临床资料特征详见表1。

EDTA抗凝采血管购自沈阳市三力医用科技发展有限公司，型号为EDTAK2 5ml一次性使用人体静脉血样采集容器。取样后1小时内完成低温4°C离心，1000rpm，15分钟，分离后采集上层血浆层至2毫升冻存管（购自上海万格， Avantech，2毫升），并保存于-80°C冰箱待统一进行后续的试验。

2.血浆GPBB浓度测定。

血浆GPBB浓度测定采用血浆GPBB ELISA试剂盒 (CSB-E08475h, CUSABIO, 中国武汉)，根据说明书先做标准品浓度曲线，浓度梯度分别为80 ng/ml、40 ng/ml、20 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、2.5 ng/ml、1.25 ng/ml和0 ng/ml。将血样取出并放置室温。量取100微升血样或标准品至反应孔中37°C静置2小时，弃上清，加入100微升blotin抗体37°C静置1小时后，弃上清并清洗3次。加入100微升HRP-avidin37°C静置1小时后，加入90微升底物37°C静置30分钟，加入50微升反应终止液。立即采用酶标仪进行检测，测定波长570 nm，检测波长为450 nm。根据标准曲线换算为样本的血浆GPBB浓度。

结果显示：基于血浆GPBB浓度鉴别替莫唑胺耐药组和替莫唑胺敏感组，如图1a所示，替莫唑胺耐药组的血浆GPBB显著高于替莫唑胺敏感组，血浆GPBB鉴别替莫唑胺耐药和替莫唑胺敏感的接收者操作曲线（ROC曲线），曲线下面积（AUC）为0.835，95%置信区间为0.737-0.933，对角线代表AUC为0.5的曲线；根据最大拟合参数确定血浆GPBB的界值为30.71。

图2为本发明实施例中根据IDH1变异分组可见血浆GPBB在替莫唑胺耐药组和替莫唑胺敏感组的分布。在IDH1突变的亚组中，替莫唑胺耐药组的血浆GPBB显著高于替莫唑胺敏感组（14.62 ng/ml vs 36.65 ng/ml），两者具有统计学差异；而在IDH1野生型的亚组中，替莫唑胺耐药组的血浆GPBB略高于替莫唑胺敏感组(23.19 ng/ml vs 30.23 ng/ml)，但两者并无统计学差异。

图3为本发明实施例中根据1p/19q共缺失分组可见血浆GPBB在替莫唑胺耐药组和替莫唑胺敏感组的分布。在1p/19q共缺失的亚组中，替莫唑胺耐药组的血浆GPBB显著高于替莫唑胺敏感组（21.46 ng/ml vs. mean 31.08 ng/m），两者具有统计学差异；在1p/19q野生型的亚组中可见替莫唑胺耐药组的血浆GPBB也显著高于替莫唑胺敏感组（21.39 ng/mlvs. mean 32.00 ng/ml），两者具有统计学差异。

图4为本发明实施例中根据MGMT启动子甲基化与否分组可见血浆GPBB在替莫唑胺耐药组和替莫唑胺敏感组的分布。在MGMT启动子甲基化的亚组中，替莫唑胺耐药组的血浆GPBB显著高于替莫唑胺敏感组（21.46 ng/ml vs. mean 31.08 ng/ml），两者具有统计学差异；在MGMT启动子非甲基化的亚组中可见替莫唑胺耐药组的血浆GPBB也显著高于替莫唑胺敏感组（ 21.39 ng/ml vs. mean 32.00 ng/ml），两者具有统计学差异。需要说明的是，在MGMT启动子非甲基化亚组中血浆GPBB浓度相对于MGMT启动子甲基化亚组更高。

图5为本发明实施例中总生存曲线，血浆GPBB浓度根据30.71作为界值分为GPBB高水平和GPBB低水平两组（7月 vs 14月, P=0.032），两组的中位总生存存在显著差异，可见GPBB高水平的预后更差。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的替换，都应当视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 辽宁省肿瘤医院

<120> 一种预测替莫唑胺耐药性的生物标志物的应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 243

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

atggcgaagc cgctgacgga cagcgagaag cggaagcaga tcagcgtgcg cggcctggcg 60

gggctaggcg acgtggccga ggtgcggaag agcttcaacc ggcacttgca cttcacgctg 120

gtcaaggacc gcaatgtggc cacgccccgc gactacttct tcgcgctggc gcacacggtg 180

cgcgaccacc tcgtgggccg ctggatccgc acgcagcagc actactacga gcgcgacccc 240

aag 243

<210> 2

<211> 81

<212> PRT

<213> 未知

<400> 2

Met Ala Lys Pro Leu Thr Asp Ser Glu Lys Arg Lys Gln Ile Ser Val

1 5 10 15

Arg Gly Leu Ala Gly Leu Gly Asp Val Ala Glu Val Arg Lys Ser Phe

20 25 30

Asn Arg His Leu His Phe Thr Leu Val Lys Asp Arg Asn Val Ala Thr

35 40 45

Pro Arg Asp Tyr Phe Phe Ala Leu Ala His Thr Val Arg Asp His Leu

50 55 60

Val Gly Arg Trp Ile Arg Thr Gln Gln His Tyr Tyr Glu Arg Asp Pro

65 70 75 80

Lys

Claims (5)

1.血浆GPBB作为生物标志物在制备应用于预测高级别胶质瘤对治疗药物替莫唑胺的耐药性的试剂盒的应用。

2.根据权利要求1所述的的应用，其特征在于，所述血浆GPBB的基因核苷酸序列为SEQID No.1所示：

atggcgaagc cgctgacgga cagcgagaag cggaagcaga tcagcgtgcg cggcctggcggggctaggcg acgtggccga ggtgcggaag agcttcaacc ggcacttgca cttcacgctg gtcaaggaccgcaatgtggc cacgccccgc gactacttct tcgcgctggc gcacacggtg cgcgaccacc tcgtgggccgctggatccgc acgcagcagc actactacga gcgcgacccc aag。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血浆GPBB的氨基酸序列如SEQ IDNO.2：Met Ala Lys Pro Leu Thr Asp Ser Glu Lys Arg Lys Gln Ile Ser Val Arg GlyLeu Ala Gly Leu Gly Asp Val Ala Glu Val Arg Lys Ser Phe Asn Arg His Leu HisPhe Thr Leu Val Lys Asp Arg Asn Val Ala Thr Pro Arg Asp Tyr Phe Phe Ala LeuAla His Thr Val Arg Asp His Leu Val Gly Arg Trp Ile Arg Thr Gln Gln His TyrTyr Glu Arg Asp Pro Lys。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血浆GPBB的浓度为9.17-42.96 ng/ml。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预测替莫唑胺耐药性为检测患者的血浆GPBB的含量的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1，将未经化疗的胶质瘤患者的外周血待测样本，进行离心处理收集血浆；

步骤2，检测所述血浆的待测样本中的GPBB的浓度，检测方法为酶联免疫吸附试验。

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