JP3068848B2

JP3068848B2 - 増幅ｄｎａ検定

Info

Publication number: JP3068848B2
Application number: JP2500923A
Authority: JP
Inventors: ケンプ、デイビッド・ジェームス; フート、シモン・ジェイムス; ペーターソン、マイケル・グレゴリー; サマラス、ニコラス; スミス、ドナルド
Original assignee: アムラド・コーポレイション・リミテッド
Priority date: 1988-12-09
Filing date: 1989-12-08
Publication date: 2000-07-24
Anticipated expiration: 2015-07-24
Also published as: DK108091A; ES2121750T3; DE68928769T2; NO912169D0; CA2004990A1; NO912169L; JPH04502251A; DE68928769D1; WO1990006374A1; HK1009705A1; AU4663789A; EP0447464B1; EP0447464A4; DK108091D0; AU633036B2; EP0447464A1; ATE169341T1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、概括的に述べると試料中において増幅させ
た標的DNAの捕獲および検出に関するものである。さら
に特定すれば、本発明は、単一または多段階増幅DNA検
定（ADA）並びに試料中の標的DNAの迅速な捕獲および検
出、例えば病原体の検出におけるその使用に関するもの
である。

DNAの特定セグメントを増幅するポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）システム（1,2）は、既に実験生物学において
非常に価値が高いことが判っている（１−８、また、シ
ータス・コーポレーション名義のオーストラリア国特許
出願第55322/86、55323/86、69962/87および77298/87号
参照）。PCR法では、興味の対象であるDNAを含む試料を
３温度に対して反復循環させる。この結果、DNAの変
性、興味の対象である配列の境界における合成オリゴヌ
クレオチドのアニーリングおよびテルムス・アクアティ
クスからのDNAポリメラーゼ（Taq）によるオリゴヌクレ
オチドの伸長が連続的に行なわれる（２）。次いで、指
数関数的に増幅したDNAセグメントは、単純な方法、例
えばアガロース・ゲル電気泳動後の臭化エチジウム染
色、またはハイブリダイゼーションもしくは配列決定に
よりそれを予想された配列と確認することにより検出さ
れ得る（１−６）。

PCRシステムがマススクリーニングの多くの領域にお
いて急速に慣用的方法に取って代わるのは当然である
（７）。これらのうちの一つは、技術の一般性およびそ
の鋭敏な感度故に病原体の検出である。ヒト免疫不全ウ
イルス（HIV）配列に関する血液試料の試験は、予備試
験が既に報告されている上記一領域である（８）。他の
領域には、疫学およびヒト遺伝子適用、例えばHLA型判
別および遺伝病スクリーニングがある。しかしながら、
PCR反応産物の現行検出方法は、それらが一般にゲル電
気泳動を必要とするため、マススクリーニングにはあま
り適していない。さらに、プライマーの２量重合または
不適切な配列へのプライマーの誤った取り込みといった
事象から生じるアーチファクトDNA分子が容易に生成し
得るため、ハイブリダイゼーションまたは配列情報が確
実な分子同定には必要である。それ故、高特異的かつ迅
速であり、マススクリーニングへ容易に適用可能であ
り、あらゆる既知配列に適し、多くの実験室で既に利用
可能な装置を使用するPCR方法により増幅したDNAを検出
するための検定システムは有益である。

本発明は、試料中の標的DNAの捕獲検出を可能にする
増幅DNA検定に関するものである。この検定は、１つま
たはそれ以上の段階で遂行され得る。

従って、本発明は、固体基質上における増幅した標的
DNAの捕獲方法であって、１セットのプライマー（ただ
し、プライマーの一つはリガンドを有する）を用いてポ
リメラーゼ連鎖反応により第１リガンドを上記DNAへ取
り込み、そうして処理されたDNAを、そこに固定化され
たリガンドに対する結合性試薬を有する固体基質に接触
させることを含む方法を意図したものである。

さらに、本発明は、上記固定化増幅DNAを、１セット
のプライマー（ただし、プライマーの一つは検出試薬に
結合し得るリガンドを有する）を用いてポリメラーゼ連
鎖反応により上記増幅DNAへ予め取り込まれた第２リガ
ンドに結合し得る検出試薬に接触させることによる、捕
獲されたDNAの検出を意図したものである。

従って、本発明は、試料中から標的DNAを検出する方
法であって、所望によりポリメラーゼ連鎖反応により上
記DNAを増幅し得、上記DNAを固体基質上に固定した後、
DNAに取り込まれたリガンドまたは標識を検出すること
を含む方法に関するものである。

一実施態様において、本発明方法では、まず、所望に
より上記標的DNAの鎖に相補的となるように選択された
オリゴヌクレオチド・プライマーの第１セットを用いて
ポリメラーゼ連鎖反応方法により標的DNAを増幅するこ
とができる。最初のPCRは、専門家が最初の増幅を行わ
ずに次の段階へ進み得るのに充分な量の標的DNAを存在
し得る場合は随意である。増幅または非増幅標的DNA
を、オリゴヌクレオチド・プライマーの第２セットを用
いてポリメラーゼ連鎖反応方法により増幅する。上記第
２セットのプライマーは、上記標的DNAの鎖に相補的と
なるように選択され、第１セットのプライマー間にはめ
込まれており、第２セットのライマーの一方は第１リガ
ンドを有し、第２セットのプライマーの他方は第２リガ
ンドまたは標識を有している。増幅DNAを、そこに固定
された第１リガンドに対する結合性試薬を有する固体基
質に接触させる。

本発明の別の態様は、標的DNAの検出方法であって、
上記DNAは、所望により標的DNA鎖に相補的となるように
選択されたオリゴヌクレオチド・プライマーの第１セッ
トを用いて第１ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されて
いてもよく、増幅DNAを、標的DNAの鎖に相補的となるよ
うに選択され、第１セットのプライマー間にはめ込ま
れ、第２セットのプライマーの一方が第１リガンドを有
し、第２セットのプライマーの他方が第２リガンドまた
は標識を有しているオリゴヌクレオチド・プライマーの
第２セットを用いて、第２ポリメラーゼ連鎖反応に付
し、増幅DNAをそこに固定された第１リガンドに対する
結合性試薬を有する固体基質に接触させ、次いで固体基
質に結合した増幅DNAの存在を示す第２リガンドまたは
標識を検出することを含む方法に関するものである。

本発明のさらに別の態様は、増幅DNA検定による試料
中の標的DNA検出用試験キットであって、区画形態で、
所望によるポリメラーゼ連鎖反応用試験を含むように適
合され、第１および／または所望による第２セットのオ
リゴヌクレオチド・プライマーを含む標的DNAを受け入
れ得る第１容器、第２セットのオリゴヌクレオチド・プ
ライマーおよび第２ポリメラーゼ連鎖反応用試薬（上記
第１容器に含まれていない場合）を含むように適合させ
た第２容器、結合性試薬により被覆された固体基質、お
よび固体基質に結合した増幅DNAの検出用手段を含むキ
ットに関するものである。

本発明のさらに別の態様は、試料中の標的DNA検出用
増幅DNA検定であって、 a.標的DNAが試料中に存在する場合、所望により、標的D
NA鎖に相補的となるように選択されたオルゴヌクレオチ
ド・プライマーの第１セットを用いてポリメラーゼ連鎖
反応方法により標的DNAを増幅し得、 b.第２セットのオリゴヌクレオチド・プライマーを用い
たポリメラーゼ連鎖反応方法により段階a.の生成物を増
幅またはさらに増幅し、ただし、上記第２セットのプラ
イマーは、標的DNA鎖に相補的となるように選択され、
第１セットのプライマー間にはめ込まれ、第２セットの
プライマーの一方が第１リガンドを有し、第２セットの
プライマーの他方が第２リガンドまたは標識を有してい
るものであり、 c.段階b.の増幅生成物を、そこに固定された第１リガン
ドに対する結合性試薬を有する固体基質に接触させ、お
よび d.固体基質に結合した増幅DNAの存在をを示す第２リガ
ンドまたは標識を検出するという段階を含む検定に関するものである。

さらに本発明によると、上記段階（ａ）および（ｂ）
は、単一反応混合物または２連続反応混合物中で行なわ
れ得る。

本発明の別の態様では、標的DNAは、標識第２セット
のプライマーを用いた１またはそれ以上のサイクルのPC
Rに直接付され、次いで基質への結合に付され得る。標
的DNAが多数存在する場合および／または検出手段が非
常に鋭敏である場合、これは特に有用である。

この明細書では、下記略語を使用する。

PCR ポリメラーゼ連鎖反応 DNA デオキシリボ核酸 A アデニン T チミン G グアニン C シトシン GST グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ ADA 増幅DNA検定 HIV ヒト免疫不全ウイルス TMB テトラメチルベンジジン ABTS 2,2′−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチア
ゾリン−６−スルホン酸） MTPBS マウス張性（tonicity）燐酸緩衝食塩水 RT 室温 PBS 燐酸緩衝食塩水添付図面の説明図１は、ADAの一実施態様の３つの基本段階を示す。
段階１では、DNAセグメントを、オリゴヌクレオチドａ
およびｂにより生物学的試料から増幅させる。段階２で
は、内部に収められたオリゴヌクレオチドによりさらに
少なくとも３回の増幅サイクルを通じて増幅DNAセグメ
ントに特異的リガンドを取り込む。オリゴヌクレオチド
c.はその５′末端にビオチン分子を含み、オリゴヌクレ
オチドd.は、サッカロマイセス・セレビシアエのDNA結
合性蛋白質GCN4により特異的に認識される５′ヌクレオ
チド配列を含む。段階３では、リガンド担持DNAセグメ
ントは、細菌において製造された精製GCN4（GST−GCN
4）により被覆した固体支持体に結合し、オリゴヌクレ
オチドc.のビオチンへのアビジン−ペルオキシダーゼの
結合により検出され、続いてペルオキシダーゼ活性の比
色定量的検出が行なわれる。

図２は、酵母GCN4およびGST−GCN4の構造を示す。上
部には、四角で囲まれた暗号化領域（281アミノ酸）を
有するサッカロマイセス・セレビシアエGCN4遺伝子
（９）の構造が示され、バッチングにより示されたGCN4
蛋白質の転写活性化およびDNA結合領域が呈示されてい
る（10）。また、PCRによる酵母DNAからのGCN4遺伝子の
増幅に使用されるオリゴヌクレオチド１−３の位置も示
されている。また、図２は、プラスミド発現ベクターpG
EX−2TへGCN4遺伝子のフラグメントを導入することによ
りエシェリヒア・コリにおいて産生されるGST−GCN4融
合蛋白質をコードする遺伝子の構造を示す（11）。オリ
ゴヌクレオチド２および３または１および３を用いて酵
母DNAからGCN4遺伝子を増幅し、シストソーマ・ジャポ
ニクムのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GS
T）に融合したGCN4ポリペプチドの部分的（GST−GCN4
3.12）または完全長（GST−GCN4 6.8）バージョンをコ
ードするプラスミドを生成させた。

図3aは、プラスミドpGST−GCN4 3.12（レーン１−
３）またはpGST−GCN4 6.8（レーン４−６）によりト
ランスフェクションし、37℃で１時間0.1ミリモルIPTG
の存在下で生長させたエシェリヒア・コリ株7118からの
総蛋白質のポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による分
画化を示す（レーン１および４）。また、１段階アフィ
ニティー・クロマトグラフィーにより溶解した細菌から
精製された物質（レーン３および６）およびグルタチオ
ン−アガロース・ビーズとのインキュベーション後に残
存する可溶性蛋白質（レーン２および５）が示されてい
る。図3bは、GCN4結合部位を含む³²P標識DNAフラグメン
トの移動度が、それを精製GST−GCN4 3.12（レーン２
および４）またはGST−GCN4 6.8（レーン６）と混合し
た場合に、蛋白質の非存在下でのその移動度と比べて
（レーン１）減少していることを立証するゲル遅延検定
を示す。

図４は、HIVプラスミドpHXBc2からのDNAに関するADA
の特異性に対する加えられた担体DNAの作用を示す。Ａ
列にはマイクロタイター皿において加えられた担体DNA
は存在しなかったが、Ｂ、ＣおよびＤ列は、各々１μg/
ml、0.1μg/mlおよび0.01μg/mlの音波処理したヒトDNA
を含んでいた。ADAの段階１は、オリゴヌクレオチドa.
およびb.並びにpHXBc2（12）からのSacl−Sal1フラグメ
ントを用い、下記実施例１記載の30サイクルにおよぶも
のであった。次いで、段階１からの試料（5ml）を、オ
リゴヌクレオチドc.プラスb.（カラム１−３）、c.プラ
スd.（カラム４−６）またはc.プラスd2（カラム７−
９）を用いてさらに10サイクル増幅した。次いで、試料
（１、４および７では５μｌ、２、５および８では0.5
μｌ、３、６および９では0.05μｌ）を、精製GST−GCN
4 3.12（ａ）またはGST−GCN4 6.8（ｂ）で被覆した
プレートのウェルに加えた。ADAの残りの段階は実施例
１に記載した通りであった。

図５は、HIV感染細胞からのDNAにおけるADAを示す。
試料１−３、バーキットリンパ腫からのヒトDNA（〜100
ng）、試料４−６、HIV感染細胞からのヒトDNA（〜100n
g）、試料７−９、DNA無し、試料10−12、プラスミドpH
XBc2からのDNA（〜1ng）。ADAの段階１は、オリゴヌク
レオチドa.およびb.を用いた実施例１記載の35サイクル
であった。次いで、段階１からの10μｌの試料を、オリ
ゴヌクレオチドc.およびd.を用いてさらに６サイクル増
幅した。試料（１、４、７および10については15μｌ、
２、５、８および11について３μｌ、並びに３、６、９
および12については0.6μｌ）を、音波処理したヒトDNA
（１μg/ml）の存在下、精製GST−GCN4 3.12により被
覆したプレートのウェルに加えた。ADAの残りの段階は
実施例１と同様であった。

図6Aは、一段階ADA反応の特異性を示す。一段階結合
反応における非反応ビオチニル化オリゴヌクレオチドと
ADA基質のきっ抗。24回サイクルで、100μｌ反応混合物
中1ngのプラスミドpHXBc2を伴うオリゴヌクレオチドc1
およびd1（0.2μｇ）を用いてPCRを行った。対照はプラ
スミドDNAを全く含まなかった。列１および３では、示
されたPCR反応容量を、示された5mg/mlアビジン−ペル
オキシダーゼ溶液希釈物を含む50μｌの結合性混合物
（粉乳不含有）に加えた。列２および４では、示された
PCR反応容量を加え、さらに８μｌの対照PCRを各ウェル
に加えた。結合反応および色素展開は実施例３に記載さ
れている。

図6Bは、一段階結合反応の特異性を示す。方法は図6A
の場合と同じであるが、ただしウェルは示された％（w/
v）の脱脂粉乳を含んでいた。最上および最下列は、５
μl/ウェルの上記PCR混合物を含んでいた。列２の場
合、オリゴヌクレオチドｄを省いた。列３の場合、PCR
にDNAは全く存在しなかった。列４は列３の場合と同様
であったが、ただし、非関連オリゴヌクレオチド（１μ
g/ml）を加えた。列５の場合、ウェルをGCN4で被覆しな
かった。

図７は、取り込みに対するアニーリング温度の影響を
示す。示されている通り1ngのプラスミドpHXBc2および
オリゴヌクレオチドa1およびb1（１μl/ml）、c2および
d2（２μg/ml）によりPCRを行い、示された条件下で循
環させ、10μｌ試料を、１μg/ml臭化エチジウムの存在
下1.6％（w/v）アガロース・ゲルにおいて分画化した。
Ａの場合、a1およびb1の濃度は0.3μg/mlであった。Ｂ
の場合、PCRにおけるオリゴヌクレオチドa1およびc1の
濃度は、連続トラックで次の通りであった:a1＝６、
６、２、0.6、２μg/ml、b1＝３μg/ml、c1＝20、30、1
0、10、20μg/ml、d1＝５μg/ml。

図8Aは、異なるオリゴヌクレオチド濃度による感度を
示す。20μｌ反応物において指示量（右方、μｇ）のプ
ラスミドを含むオリゴヌクレオチドa2およびb2（指示濃
度）並びにc2およびd2（５μg/ml）により二段階PCRを
行い、30回（95゜/30秒、65゜/60秒）、次いで12回（95
゜/30秒、40゜/60秒、65゜/30秒）循環させた。次い
で、５μｌの生成物を一段階結合反応によるADAで分析
した。

図8Bは、ADA反応の感度を示す。c2およびd2とは異な
るスペーシングをもつａおよびｂオリゴヌクレオチドを
用いたADA反応の感度の比較。ａおよびｂオリゴヌクレ
オチドは0.3μg/mlであった。

図９は、温度シフトに対するADA依存関係を示す。図3
Bの場合と同様にオリゴヌクレオチドa2、b2、c2およびd
2により二段階PCRを行った。DNAは５×10³HIV−感染CEM
細胞由来のものであった。矢印で示された数のサイクル
においては95゜/30秒、65゜/60秒、次いでさらに０、５
および10サイクルにおいては95゜/30秒、40゜/60秒、65
゜/30秒でPCRを循環させた。下部に示されたサイクル数
は、各試料における総数である。

図10は、培養細胞におけるHIVの検出を示す。非感染
またはHIV感染CEM細胞由来のDNAを、30回（95゜/30秒、
65゜/60秒）、次いでさらに10（右パネルにおける上部
３列）または15（右パネルにおける下部３列、および左
パネル）サイクル（95゜/30秒、40゜/60秒、65゜/30
秒）循環させたオリゴヌクレオチドa2およびb2（0.3μg
/ml）およびc2（2.5μg/ml）およびd2（５μg/ml）を含
むPCR反応用インプットDNAとして使用した。プラスミド
DNAを陽性対照として使用した。一段階結合反応によるA
DA反応を５μｌ試料において行い、10ml試料においてア
ガロース・ゲル電気泳動を行った。ADAまたはゲル電気
泳動により分析されたDNA試料は、示された細胞数また
は示されたプラスミド分子数から得られた物質を表し
た。

図11は、図10に示されたADA反応の定量結果を示す。

図12は、GCN4被覆ピンが介在するADAにおけるTMBおよ
びABTSの比較を示す。

図13は、ADA反応におけるGCN4およびTyrRの比較を示
す。

図14は、ADAにおけるGCN4のトロンビン開裂の影響を
示す。

図15は、エイズ（AIDS）にり患しているものとして陽
性診断された患者または陰性対照から採取された末梢血
リンパ球（PBL）について行なわれた臨床試験の結果を
示す。この方法は、２回のPCR、35および12サイクルを
各々使用した点以外は図10における記載と同様である。
略語は実施例９で定義されている。

概括的に述べると、本発明の一態様では、まず標的DN
Aを、既知PCR方法による適当なオリゴヌクレオチド・プ
ライマーの第１セットを用いたPCRにより増幅し、次い
で最初の２つの間にはめ込まれた第２セットのオリゴヌ
クレオチド・プライマーを少数の追加的サイクルにより
取り込む。第２セットのプライマーにおけるヌクレオチ
ドはリガンドを有し、例えば一方はビオチニル化され
得、他方は２本鎖DNA結合性蛋白質に対する部位を含
む。固定された親和試薬、例えば結合性蛋白質に結合
し、第２親和試薬、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ
に結合したアビジンにより標識した後、色素原基質との
反応により増幅DNAが検出され得る。さらに、例えばジ
ゴキシゲニンなどの系が使用され得る。最初の増幅無し
で充分な標的DNAが存在する場合または例えば検定の都
合もしくは速度といった他の理由により、標的DNAは直
接標識プライマーによる取り込みに付され得る。

本発明の検定方法は、特にヒト免疫不全ウイルス（HI
V）配列の検出検定法に関して本明細書で詳細に記載さ
れている。しかしながら、この特定検定は本発明の適例
を用いて記載されており、本発明は下記で検討されてい
る通りさらに広い適用性を有するものとする。従って、
「標的DNA」とは、真核生物、原核生物またはウイルス
性核酸配列を意味し、病原体の同定または例えば癌細胞
におけるヒトまたは他のほ乳類の遺伝的疾患のスクリー
ニングが含まれる。さらに、標的DNAは、逆転写酵素の
作用により、対応するDNAが最初に合成させるRNA、すな
わちRNAからの逆転写酵素によりコピーされたcDNAを包
含する。従って、標的DNAはまた、RNAウイルスまで拡大
される。また、標的DNAは、植物遺伝子配列およびそれ
らの病原体をも包含する。

さらに、標的DNAの供給源は、特定の環境および相対
的便宜性により変化し得る。例えば、主たる発明の一態
様は、血液からのHIV配列の検出に関して記載されてい
る。しかしながら、これは、これらおよび他の標的配列
も他の体内流体、例えば唾液（これに限定されるわけで
はない）から単離され得ると理解した上で為されてい
る。従って、本発明は、適当な生物学的流体、例えば血
液、唾液、リンパ液、細胞および組織抽出物、培養上
清、樹液および／または他の流体または組織抽出物、エ
アゾール類、様々な環境立地（例、土壌、水等）などに
おける標的DNAの検出にまで拡大される。

この発明のADA方法は、少なくとも一つのPCRにより増
幅された特異的DNAセグメントの非常に高感度で特異的
で単純かつ便利な検出方法を提供する。この方法の感度
は、PCR方法自体（それは、少なくとも10⁶ヒト・ゲノム
の基底値に対して単一DNA分子を検出し得る（２））お
よび増幅DNAに関する鋭敏な新規検出方法の固有の感度
の組み合わせから生じる。下記データは、リガンド含有
増幅DNA分子が容易に検出され得、典型的PCR反応による
生成物の小フラクションのみが検出には必要であること
を示している。

この方法の特異性は、一具体例において、ADAが、は
め込まれたオリゴヌクレオチド・プライマーとの２連続
のPCR反応を使用するという事実を反映している。リガ
ンドは第２段階中に導入されるのみであるため、第２段
階で生成されたDNA分子のみが最終段階で検出される。
別法として、標的DNAに対し、最初のPCRを必要とせずに
結合段階を直接行ない得る。この明細書の実施例２で示
されている通り、GST−GCN4のみが２本鎖DNAに結合する
−それは１本鎖オリゴヌクレオチドを認識しないという
事実により、この特異性はさらに高められ得る。第２段
階は少数のサイクル（例えば３−12サイクル）しか使用
しないため、第２セットのオリゴヌクレオチドから誘導
されたプライマー−２量体または他の２本鎖DNAアーチ
ファクトの顕著な量の蓄積には時間的に不充分である。
さらに、例えばゲノムの他の場所での擬似プライミング
（priming）により第1PCR段階で生成された上記アーチ
ファクトは第２段階では一切増幅されない。その理由
は、それらが第２セットのプライマーのはめ込まれた配
列を含まないためである。第１段階で形成されたプライ
マー−２量体は、リガンドを含まないため検出されな
い。

本発明の別の態様では、PCRは一反応混合物中で有効
に行なわれ、その結果「単一段階ADA」とし得る。先に
概略を示した多段階方法に対するこの修正法は、その長
さに対するオリゴヌクレオチド２本鎖の熱安定性の強い
依存性に一部基づくため、オリゴヌクレオチド・プライ
マーは、PCRにおけるそれらの取り込みがアニーリング
温度に厳密に依存するように選択され得る。従って、１
セットのプライマーが第２のセットよりもかなり長い場
合、連続PCR反応は、まず高温、次いで低温の熱サイク
ル体制を通して混合物をインキュベーションすることに
より、一反応混合物中で行なわれ得る。（実施例５参
照）。

従って、本発明は多段階および単一段階ADAに拡大さ
れる。

また、一段階ADAは、固体物質に固定された結合性試
薬への増幅生成物の結合が、検出複合体の結合またはそ
れへの結合と同時に行なわれる結合段階において利点を
有する。一態様において、増幅DNAは、アビジン−ペル
オキシダーゼ・コンジュゲートへの結合と同時に、マイ
クロタイター皿のウェルに固定されたGST−GCN4に結合
する。

一段階ADAのさらに別の態様は、結合性試薬により被
覆された単一または多数のビーズまたはピンを用いるこ
とにより、反応容器からの増幅生成物を、洗浄し、固定
化増幅生成物を検出複合体に接触させた後に検出基質へ
移動させる方法に関するものである。例えば、増幅DNA
を、GST−GCN4被覆ビーズまたはピンのアレイによりマ
イクロタイター・ウェルから移し、洗浄およびアビジン
−ペルオキシダーゼと接触後、ビーズをABTS基質含有マ
イクロタイター皿に浸す。

連続PCR反応は、単に混合物をまず高温、次いで低温
の熱サイクル体制を通してインキュベーションすること
により、一反応混合物中で行なわれ得る。これ用の４つ
のオリゴヌクレオチドおよび酵素（マイナス試料DNA）
全てを含む完全なPCR混合物は冷凍保存され得るため、
プロトコルは非常に単純化されており、すなわち（１）
DNA試料をPCR混合物に加え、１滴のパラフィン油を加
え、管を熱循環器上に置き、２連続温度体制に付し、
（２）次いで、試料をGST−GCN4被覆マイクロタイター
・ウェルに入れることにより、固定化および結合を同時
に行い、（３）次いで、皿を洗浄し、基質を加える。こ
のプロトコルは、中程度の数の試料の操作に充分適して
いる。例えば、50試料に関する結果は、PCR完了の約１
時間後に得られる。

一段階検定において、増幅DNAは、マイクロタイター
皿のウェルに固定されたGST−GCN4に結合し、同時にア
ビジン−ペルオキシダーゼ・コンジュゲートに結合す
る。この方法により、必要とされる操作数および試料操
作にかかる時間は両方とも減少するが、感度および特異
性は減少しない。しかしながら、非取り込みビオチニル
化オリゴヌクレオチドは、アビジンへの結合について増
幅DNAときっ抗するので、確実にビオチンの量がアビジ
ンの結合能力を越えないようにすることが必要である。

さらに、一段階検定はまた、２連続温度体制によるPC
R自体が修飾マイクロタイター皿で行なわれるプロトコ
ルを提供する。次いで、増幅されたDNA分子を、マイク
ロタイター皿の蓋に結合させたポリスチレン・ビーズに
固定されたGCN4に結合させる。この方法は同時の固定化
およびアビジン−ペルオキシダーゼ結合という利点を有
し得ないが、個々のDNA試料を第１マイクロタイター・
ウェルへピペットにより移し入れた後、96の試料が、汎
用されている「高速ELISA」システムと同様の形で同時
に操作され得るという非常に重要な利点を有する。

これらのシステムの全てにおいて、検出システムの能
率化は、現在、個々のDNA試料の製造および操作に費や
される時間が律速的事象である点にまで到達した。標的
配列があまり豊富ではない場合、必要とされる精製度は
高い。標的配列が１μｌ未満の全血において検出可能な
場合、試料を沸騰させれば充分であり得る。しかしなが
ら、要求された感度が、大量の血液からの総DNAを単一P
CRに加えることを必要とする場合、精製が要求される。
これが、固有の検定感度（すなわち、理想的状況におい
て検出され得る関連した分子の数）およびシステム阻害
が行なわれる前の試料の最大量の両方に左右されること
は自明である。血液は、蛋白質含有率が高いため、特に
不適当なDNA供給源であると思われる。明らかに、特定
システムに必要な最小精製プロトコルはこれらのパラメ
ーターにより異なる。さらに、ここに記載されている多
段階プロトコルに対するこれらの修正は、ヒトDNAの基
底値からのHIV配列の検出を可能にする。

ADAの簡単さおよび便利さは、PCR段階後、試料が、同
じ装置を用いた常用の固相酵素免疫検定法（ELISA）と
正確に同じ方法で処理され得るという事実によるもので
ある。固相（例えば、GST−GCN4またはアビジン）への
親和結合による固定化は（実施例では、アビジン−ペル
オキシダーゼによる）、DNA分子の他端における標識と
同じ段階で行なわれ得るため、ピペット操作および洗浄
の数は最小となる。さらに、親和試薬で被覆された固相
がマイクロタイター皿のルーフにおけるピンで構成され
る場合、洗浄は簡易化され得る。また、この後者の方法
は、容易に検出段階の自動化に役立ち得る。この明細書
の例における反応は、基質に対するアビジンおよびGCN4
の親和力が高く、西洋わさびペルオキシダーゼのVmaxが
高いため、非常に迅速である。

この明細書で詳述されているADAシステムは、多くの
選択肢を有する唯一可能な方式である。明らかに、この
方法は、多くの他のウイルス、細菌、原生動物、真菌お
よびマイコプラズマ病原体の検出に使用され得る。肝
炎、結核、マラリアおよびカンジダ感染症のスクリーニ
ングは、これらの本質的に異なる生物が関与する明白な
適応例に含まれる。同時に、このシステムは、細胞性疾
患、例えば癌などの検出に使用され得る。ADA方法の著
しく有用な特徴は、単純な色試験によりあらゆる生物由
来の遺伝子を検出するためにオリゴヌクレオチドの配列
を変えるだけでよいことである。各場合における試験DN
Aセグメントの長さが同一である場合、同じ親和試薬が
全ての場合において同じリガンドと相互作用しているた
め、検出段階の速度論は同一であるべきである。これ
は、親和力および速度論が、各状況について異なるモノ
クローナル抗体により測定されるELISAシステムとは対
照的である。別の潜在的適用性は、ある種の病原体の遺
伝子型の測定に存する。例えば、プラスモディウム・フ
ァルシパルムでは、比較的保存された領域により囲まれ
た相違なる抗原決定基を特定する可変領域を含む遺伝子
もある（13）。プライマーの第１セットのプローブが上
記近接保存領域に対応する場合、第1PCR段階の生成物
は、異なる血清型を特定する内部可変領域に対応する幾
つかの対のオリゴヌクレオチドにより試験され得る。ま
た、この明細書に記載されているADAは、遺伝疾患、特
に例えば嚢性線維症および癌に関するスクリーニングに
適用可能である。

本発明のADAシステムは、論理上は広範な種類のリガ
ンドおよび／または親和試薬を使用し得る。一態様にお
いて、２本鎖DNA−特異的DNA結合性蛋白質は、ロイシン
・ジッパー型、すなわちGCN4に属する。この型に属する
ある範囲の他のDNA結合性蛋白質、例えばトロンビン開
裂GCN4も使用され得る（図２、14）。従って、本発明
は、ロイシン・ジッパー型DNA結合性蛋白質、例えばGCN
4および／またはその誘導体を包含し、ただし上記誘導
体がDNA結合活性を保持するものとして、例えばGST−GC
N4、トロンビン開裂GCN4およびそれらの他の修飾体、例
えばGCN4アミノ酸および／または炭水化物部分に対する
付加、欠失および／または置換が含まれる。

ADAで使用され得る別のDNA結合性蛋白質は、Ｃ−末端
DNA結合性ドメインを有する「ヘリックス・ターン・ヘ
リックス」型のTyrR蛋白質である（V.アーギーロポラス
博士、セシス・サブミッティッド・フォー・ディグリー
・オブ・ドクター・オブ・フィロゾフィー、ザ・ユニバ
ーシティー・オブ・メルボルン、パークビル、ビクトリ
ア、オーストラリア国）。ADAで使用され得る他のDNA結
合性蛋白質はよく知られており、例えば「亜鉛フィンガ
ー」型がある。これらの結合性蛋白質は、シュトルール
により概説されている（19）。さらに、ビオチンに対す
る代用物質は、単純な発色団または蛍光染料である。こ
の変形では、上記DNA結合性蛋白質が２本鎖（すなわち
取り込み）および１本鎖（すなわち非取り込み）オリゴ
ヌクレオチドを識別する能力から生じる特異性の向上は
失われる。反応において既にかなりの特異性が存在する
ため、これは多くの状況で許容され得る。

上記システムの開発に使用される病原体、例えばHIV
への適用および上述の病原体の遺伝子型分類への適用と
同様に、ADAシステムは、PCR自体に敏感に反応する事実
上あらゆる応用に関して適当な修飾を加えることにより
使用され得る（例えば、参考文献（１）〜（８）および
上記オーストラリア国特許出願参照）。主な例として
は、ヒト遺伝子学的応用、例えばHLA型分類および遺伝
疾患の胎児診断がある。この方法は簡便、特異的かつ普
遍的であるため、多くの他の応用が考えられる。

主発明の別の態様では、単一PCRを用いて、標識およ
び／またはリガンド結合プライマーを直接標的DNAへ取
り込む。この場合、最初に標的DNAを増幅し、次いで検
出前または検出と同時に標識した標的DNAを固体支持体
に暴露する段階は含まない。この結果、より一層合理化
された標的DNAの検出方法が提供され、第1PCRは環境に
応じて所望により行なわれ得る段階となる。

また、本発明は、本質的に支持体、前記支持体に固定
されたDNA結合性蛋白質、好ましくは２本鎖DNA特異的DN
A結合性蛋白質、さらに好ましくはGST−GCN4またはTyr
R、および第１端部が前記結合性蛋白質、例えばGST−GC
N4へ結合した増幅２本鎖DNAから成るコンジュゲートを
包含する。このコンジュゲートは、さらに上記２本鎖DN
Aの第２端部に標識を含み、好ましくは上記標識は酵素
である。一態様において、標識は、アビジン−ビオチン
架橋により増幅DNAにコンジュゲートされる。

以下、非限定的実施例により本発明についてさらに記
載する。

実施例１多段階ADA 原材料および方法サッカロマイシス・セレビシアエからのGCN4遺伝子の単
離および発現サッカロマイシス・セレビシアエ由来のGCN4遺伝子の
完全な暗号化領域（９）は、GCN4のオリゴ１（GGAATTCT
AATGTCCGAATATCAGCCA）およびオリゴ３（GGAATTCAGCGTT
CGCCAACTAATTTC）を用いた粗DNA標本におけるPCRおよび
それらの５′末端におけるEcoR1部位の取り込みにより
合成された（図2a）。EcoR1により開裂後、DNAを発現ベ
クターpGEX−2T（11）のEcoR1切断DNAへライゲーション
した。また、GCN4のさらに小さい部分は、上記オリゴ３
および５′末端にBamH1部位を含むオリゴ２（CGGATCCAT
GTTTGAGTATGAAAACC）（図2a）を用いたPCRおよびBamH1
およびEcoR1切断pGEX−2T DNAへのBamH1およびEcoR1に
よる開裂後のPCR生成物の挿入により単離された。

ゲル遅延検定 7.5％（w/v）ポリアクリルアミド・ゲルにおいて（1
5）の記載に従いゲル遅延を行ったが、ただし遮断性DNA
は存在しなかった。結合用基質は、各々40ngの２つのオ
リゴヌクレオチド（CCACCTAGCGGATGACTCATTTTTTTTCTTAG
CGおよびCGCTAAGAAAAAAAATGAGTC）をアニーリングし、d
ATPを20mCiの³²P−dATP（アマーシャム）と置き換えた
点以外はPCRに使用されたのと同じ反応混合物中でそれ
らをTaq DNAポリメラーゼ（シータス）とインキュベー
ションすることにより作成された。70℃で５分後、dATP
を加えて0.25ミリモルとし、インキュベーションを５分
間続けた。セファデックスＧ−10スピン・カラムに通す
ことにより、³²P−dATPを除去した。

HIV配列の増幅−段階１。

HIV感染細胞から単離されたDNA由来のp24配列の増幅
に関するPCR反応には、50ミリモルのKCl、10ミリモルの
トリスpH8.4、2.5ミリモルのCl₂、各々0.25ミリモルのd
ATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、0.01％のゼラチン、1.5単
位のTaq DNAポリメラーゼ（シータス）、4ngのオリゴヌ
クレオチド・プライマーa.およびb.並びに100ngの精製D
NAが含まれた。反応混合物（100ml）を40℃、70℃およ
び95℃間で各々1.5分、2.0分および1.5分約30回循環さ
せた。

リガンドの取り込み−段階２。

段階1PCR反応生成物の10分の１を、同一条件下で少な
くとも３回のPCR追加循環に付したが、ただし使用した
プライマーはオリゴヌクレオチドb.およびc.、c.および
d.またはc.およびd1であった。

オリゴヌクレオチドの配列使用されたHIVのp24遺伝子に対応するオリゴヌクレオ
チドの配列（12）は、次の通りであった。

a.AGAGAACCAAGGGGAAGTGA（1481−1500位） b.TCTCTAAAGGGTTCCTTTGG（1661−1680位） c.CATAGCAGGAACTACTAGTA（1501−1520位）。

オリゴヌクレオチドc.は５′末端がビオチニル化され
た。

d.AAGTGACTCAAGTGACTCAA/TCCTTGTCTTATGTCCAGAA （スラッシュまでのヌクレオチド５′は人工的GCN4結合
部位（14）に対応し、スラッシュまでのヌクレオチド
３′は1641−1660位に対応する）。

d1.AGCGGATGACTCATTTTTTTT/TCCTTGTCTTATGTCCAGAA （スラッシュまでのヌクレオチド５′は人工的GCN4結合
部位（14）に対応し、スラッシュまでのヌクレオチド
３′は1641−1660位に対応する）。

HIV感染細胞からのDNAの製造。

急性リンパ芽球白血病患者から得られたヒト末梢血細
胞を培養することによりCEM細胞を誘導し、次いでHTLV
III bにより感染させた。グアニジンHClおよびCsCl遠心
分離を用いて、DNAを精製した。

増幅DNAの検出−段階３。

マイクロタイター・トレイ（ダイナテック・ラボラト
リーズ・インコーポレイテッド）を、37℃で３時間マウ
ス張性（tonicity）燐酸緩衝食塩水（MTPBS）中約１μg
/mlでの精製GST−GCN4融合ポリペプチドにより被覆し
（１ウェル当たり50μｌ）、次いでMTPBS中37℃で１時
間１％（w/v）牛血清アルブミン（フラクションＶ）
（フロー・ラボラトリーズ）により遮断した。次に、ト
レイを0.05％（v/v）トウィーン−20含有MTPBS（MTPBS
−Tw−20）、次いでMTPBS単独（２回）により洗浄した
後、20℃で30分間MTPBS−Tw−20で希釈した50μｌのリ
ガンド担持DNAとインキュベーションした。トレイを先
と同様に洗浄し、20℃で30分間MTPBS−Tw−20中2.5μg/
mlの濃度での西洋わさびペルオキシダーゼ−アビジンＤ
コンジュゲート（ベクター・ラボラトリーズ、インコー
ポレイテッド）50μｌと再びインキュベーションした。
MTPBS−Tw−20中で１回およびMTPBS中で４回洗浄後、１
ミリモルの2,2′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチ
アゾリン−６−スルホン酸）および0.1％過酸化水素を
含む新鮮な0.1モルくえん酸溶液（pH4.2）100μｌを各
ウェルに加え、414nmおよび492nmのフィルターを用いた
タイターテック・マルチスキャンMCC/340スキャナーで
吸光度を読み取った。

実施例２多段階ADAの結果 a.ADAの３つの基本段階。

特異的に増幅されたDNAの検出方法は、図１で概略的
に示されている。ADAは３つの基本段階から成り、その
最初の２つは連続的に行なわれる相異なるPCR反応であ
る。次いで、増幅DNAの試料を検出用マイクロタイター
皿のウェルに入れる。上述した通り、異なる特異性およ
び単純性をもつADAの多くの異なる可能な順列が存在す
る。明白にするため、論理的に最も特異的な方式の唯一
の例がこの項で記載されている。

段階1:増幅。

この段階は、単に、多数のサイクルにおいて、興味の
対象である配列に関連した適当なDNA含有抽出物につい
て行なわれる標準的PCR反応である。段階１用のオリゴ
ヌクレオチド（図１においてａおよびｂと命名）はこの
反応に関して制限的である。段階１では、単にDNAの所
望のセグメントを増幅するだけである。

段階2:配列特異的リガンドの取り込み。

この段階では、特異性が達成されると同時に、リガン
ドを、親和試薬と反応し得ることにより段階３で検出さ
れ得るPCR生成物へ取り込む。段階２では、２つの新し
いオリゴヌクレオチド（図１においてｃおよびｄと命
名）を第2PCR反応用に使用する。オリゴヌクレオチドｃ
およびｄがオリゴヌクレオチドａおよびｂ間にはめ込ま
れているため、これて特異性が獲得される。少数のサイ
クルしか存在しないため、検出可能な程度まで形成する
分子は、段階１における正確な配列の増幅により生成さ
れる分子のみである。また、段階２でもリガンドを取り
込む。これは、ビオチニル化されているオリゴヌクレオ
チドｃについて示した通り、または２本鎖DNA結合性蛋
白質、例えば酵母調節蛋白質GCN4に対する認識部位をコ
ードする余分の配列を含むオリゴヌクレオチドｄについ
て示した通りに行なわれ得る（14）。両端にこれらのリ
ガンドをもつブランド端分子を生成させるためには、段
階２の少なくとも３つのサイクルが必要である（図
１）。

段階3:親和結合による増幅DNAのアンカリングおよび酵
素結合標識。

この段階では、増幅DNAを一端における親和結合によ
り固相に結合させ、洗浄後、後続の発色用に他端におい
て親和結合により酵素を結合させる。段階３では、段階
２からの試料をマイクロタイター皿のウェルに加える。
このウェルは、親和試薬の一つ、例えばDNA結合性蛋白
質GCN4を担持するクローン化融合ポリペプチドにより予
め被覆されている（下記参照）。このポリペプチドは、
オリゴヌクレオチドd.により取り込まれた、正確な配列
を含む２本鎖DNAに対して親和性を有するため、増幅分
子を特異的に固定する。洗浄後、酵素にコンジュゲート
した他の親和試薬、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ
に結合したアビジンの溶液を加える。これは、オリゴヌ
クレオチドc.に結合したビオチンに結合する。当然、こ
れら２つの親和試薬の位置は容易に交換され得る（下記
参照）。

洗浄後、色素原基質をマイクロタイター皿に加え、展
開させ、マイクロタイター−プレート・リーダーで吸光
度を読み取る。

b.容易に精製され得るDNA結合性蛋白質の生成。

ADAにおける常用用途に適した高親和性DNA結合性蛋白
質を大量に生成させるため、サッカロマイセス・セレビ
シアエ調節蛋白質GCN4を、図２で示されている通りグル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）融合蛋白質
として発現させた。プラスミドpGST−GCN4−3.12は、プ
ラスミドpGEX−2T（11）へ挿入されたＣ−末端DNA結合
領域を含むサッカロマイセス・セレビシアエからのGCN4
の配列の大部分を含むが、プラスミドpGST−GCN4−6.8
はGCN4の全暗号化配列を含む。Ｎ−末端において、GST
−GCN4融合ポリプチドは、シストソーマ・ジャポニクム
からのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）
の全配列を含むため、分子は、グルタチオン−アガロー
ス・ビーズへの結合により一つの単純な親和段階で精製
され得る（11）。図３は、GST−GCN4ポリペプチドが、
これらのプラスミドにより形質転換されエシェリヒア・
コリのクローンに豊富に存在することを示す。一段階親
和精製後、GST−GCN4ポリペプチドの各々は、ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動後に２つのクーマシー・ブル
ー染色帯として検出された（図3a）。これらの精製蛋白
質は、ゲル遅延検定により示された通り、共通GCN4結合
性配列への結合能力を保持している（第3b）。

この故、必要な親和試薬（GST−GCN4およびアビジ
ン）は、両方とも現在容易に入手され得る。さらに、そ
れらは、各々ADA試験において固相へPCR増幅DNAをアン
カリングするか、または水相でDNAを標識するのに使用
され得る。

c.ヒト免疫不全ウイルス（HIV）配列をコードするDNAセ
グメントへのADAの適用。

重要で臨床的に密接な関係であるため、HIVゲノムの
一領域が試験配列として選ばれた。位置が図１における
ａ、ｂ、ｃおよびｄと標示されたものに対応するオリゴ
ヌクレオチドをHIVのp24遺伝子用に合成した。これらは
「原材料および方法」で定義されている。ADAを展開さ
せるため、この遺伝子を担持するプラスミドpHXBc2を最
初に試験供給源として使用した。親和反応が可能であっ
たことを確立するための最初の試験において、一端にビ
オチン・リガンドおよび他端にGCN4結合性部位をもつDN
A分子を、オリゴヌクレオチドa.およびb.、次いでオリ
ゴヌクレオチドc.およびd.を伴うプラスミドのPCR増幅
により生成させた。これらの生成物をGST−GCN4で予め
被覆したマイクロタイター・ウェルへ結合させ、次いで
洗浄し、ペルオキシダーゼに結合したアビジンを結合さ
せ、次いで洗浄し、色素原基質と反応させた後、強い反
応が観察された（図４）。PCRがプラスミドDNAの非存在
下で行なわれたとき、これは観察されなかった（図５、
試料７−９）。

増幅DNAを担体DNAの非存在下でマイクロタイター皿に
加えたとき、GST−GCN4は、GCN4結合性配列とは無関係
で２本鎖DNAに結合するときが見出された。これは、オ
リゴヌクレオチドb.およびc.（両方ともGCN4結合性部位
を欠く）が第２段階で使用された場合の図４における列
Ａで認められ得る。しかしながら、オリゴヌクレオチド
b.およびc.により形成されたこの生成物は担体DNAの存
在下では結合しなかったが（図４の列Ｂ、カラム１−
３）、オリゴヌクレオチドc.およびd.（図４の列Ｂ、カ
ラム４−６）またはｃおよびd2（図４における列Ｂ、カ
ラム７−９）により形成された対応する生成物は、強い
反応が示す通りまだ結合していた。ただし、この場合の
シグナルは列Ａの場合よりも低い。担体DNAの中間レベ
ルは部分的にきっ抗していた（列ＣおよびＤ）。GST−G
CN4 3.12および6.8は似た活性および特異性を有すると
思われる。

d.HIV感染したヒト細胞に対するADAの適用。

ADAが感染ヒト細胞からのDNAにおいて特異的にHIV配
列を検出し得るか否かを調べるため、永続的感染細胞か
らの精製DNAを使用した。非感染細胞からのDNAの場合、
検出可能なシグナルは存在しなかったが（図５、試料１
−３）、HIV含有DNAの場合強いシグナルが得られた（図
５、試料４−６）。

実施例３単一段階ADA 原材料および方法 GST−GCN4 クローンGST−GCN4 3.12からの融合ポリペプチド（1
6）を、（11）の記載に従いグルタチオン−アガロース
への結合により精製した。

TyrR TyrR、Ｃ−末端DNA結合性ドメインを有する「ヘリッ
クス・ターン・ヘリックス」型のDNA結合性蛋白質が、
Ｖ・アルギロポラス博士により試験用に提供された（1
8）。

PCR反応 HIVのp24配列の増幅におけるPCR反応には、50ミリモ
ルのKCl、10ミリモルのトリスpH8.4、2.5ミリモルのMgC
l₂、0.25ミリモルの各dNTP、Taqポリメラーゼ（0.5単
位）および様々な濃度のオリゴヌクレオチド・プライマ
ーが含まれた。下記条件を用いて反応混合物（20μｌ）
をパラフィン油下でインキュベーションした。常用用途
の場合、DNA以外の全成分を含むPCR混合物を、凍結アリ
コートとして貯蔵した。

増幅DNA検定ｉ）一段階結合検定：マイクロタイター・トレイ（ダイナテック・ラボラト
リーズ、インコーポレイテッド）を、37℃で１時間燐酸
緩衝食塩水（PBS）中約５μg/mlの活性生成物（複数も
可）割合で精製GST−GCN4融合ポリペプチドにより被覆
し、１回洗浄し、次いでPBS中10％（w/v）脱脂粉乳によ
り遮断した。次いで、プレートを廃液はするが洗浄はせ
ず、50μl/ウェルの割合でPBS中10％（w/v）脱脂粉乳、
４μg/mlの音波処理したサケDNA、0.05％（v/v）トウィ
ーン−20およびPBS中50μg/mlの西洋わさびペルオキシ
ダーゼ−アビジンＤコンジュゲート（ベクター・ラボラ
トリーズ、インコーポレイテッド）を含む混合物を加え
た。次いで、PCR反応の試料（１−10μｌ）を加え、RT
で少なくとも20分間反応させた。トレイをMTPBS−トウ
ィーン−20で４回、MTPBSで４回、H₂Oで１回洗浄し、廃
液し、次いで１ミリモルの2,2′−アジノ−ビス（３−
エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ABTS）お
よび0.1％（v/v）過酸化水素を含む新鮮な0.1モルくえ
ん酸ナトリウム、pH4.2、100mlを各ウェルに加え、414n
mおよび492nmのフィルターを用いたモード２でのタイタ
ーテック・マルチスキャンMCC/340スキャナーで吸光度
を読み取った。

ii）ビーズに固定したGST−GCN4によるADA。

角を切断した「高速ELISA」皿（ファルコン・プラス
ティックス）の蓋上のビーズを、37℃で１時間上記と同
様にマイクロタイター・トレイ（ダイナテック・ラボラ
トリーズ・インコーポレイテッド）中GST−GCN4−PBSの
50μｌアリコートにそれらを入れることによりGST−GCN
4で被覆し、次いでMTPBSに10％（w/v）脱脂粉乳、４μg
/mlサケDNAおよび0.05％（v/v）トウィーン−20を溶か
した溶液中でブロックした。次いで、蓋をめくって過剰
の溶液を排出させ、PCR試料を含むマイクロタイター皿
にビーズを入れた。RTで20分後、ビーズをPBS−0.05％
（v/v）トウィーン20で洗浄した。次いで、それらを、2
0分間MTPBS中10％（w/v）粉乳、0.05％（v/v）トウィー
ン−20中ペルオキシダーゼ−アビジン・コンジュゲート
と反応させた。次いで、それらをPBSで充分に洗浄し、
上記と同様にABTSと反応させた。別法として、それら
を、0.1モルNaAc、pH5.5中0.4ミリモルのテトラメチル
ベンジジン（TMB）および1.41ミリモルの過酸化水素と
反応させ、フィルター番号７を用いたモード１でのタイ
ターテック・マルチスキャンMCC/340スキャナーで読み
取った。

オリゴヌクレオチド HIVデータベースから入手可能な配列を整列させた
後、HIVのgag遺伝子からの配列に対応する共通オリゴヌ
クレオチドを選択した。合成されたオリゴヌクレオチド
は次の通りであった。

a1 ATGAGAGAACCAAGGGGAAG （1470→1489） a2 GGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATG （1362→1388） b1 TTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC （1656←1630） b2 ACTCCCTGACATGCTGTCATCATTTCTTC （1846←1818） c1 ５′ビオチン−CATAGCAGGAACTACTAGTA （1493→1512） c2 ５′ビオチン−CAGGAACTACTAGTA （1498→1512） d1 AAGTGACTCAAGTGACTCAATCCTTGTCTTATGTCCAGAA （1652←1633） d2 GGATGACTCATAGGGCTATACATTC （1625←1611） HIV感染細胞からのDNA 急性リンパ芽球白血病患者から得られたヒト末梢血細
胞を培養することによりCEM細胞を誘導し、次いでHIV分
離株HTLV III bにより感染させた。グアニジンHClおよ
びCsCl遠心分離を用いてDNAを精製した。

臨床血液試料からのDNA グアニジンHClおよびフェノール／クロロホルム／エ
タノール遠心分離を用いて、末梢血白血球からDNAを精
製した。

プラスミドDNA HIVのGAG遺伝子をコードするプラスミドpHXBc2（12）
を、反応展開用DNA供給源として使用した。総じて、PCR
1000ml当たり１μg/ml溶液１μｌを使用した。

実施例４ ADAにおける一段階結合反応実施例１における２記載のADAにおいて、増幅DNAをま
ずマイクロタイター・ウェルに固定したGST−GCN4上で
捕獲し、非取り込み基質を洗浄し、次いでアビジン−ペ
ルオキシダーゼを増幅DNA分子に結合させた。手順を簡
易化するため、増幅DNAを、蛋白質およびDNA担体の存在
下アビジン−ペルオキシダーゼ・コンジュゲートと混合
し、これらを単一反応混合物中固定化GST−GCN4に結合
させた。増加量のPCR試料およびDNA鋳型不含有PCR混合
物による実験は、コンジュゲートを洗浄し、基質を加え
た後の後続の色素展開により測定された通り（図6A）、
非取り込みビオチニル化オリゴヌクレオチドが急速に結
合を競うことを示した。アビジンの濃度を高め、ビオチ
ンの量を減らすことにより、この作用は容易に克服され
得る。しかしながら、増加したペルオキシダーゼのレベ
ルが基底値を上昇させた。これは、ウェルをGST−GCN4
で被覆後、高レベルの蛋白質担体、例えば10％（w/v）
粉乳で蛋白質結合部位を遮断することにより阻止され得
る（図6B）。対照実験は、プレート上にGST−GCN4およ
び増幅DNAにおいて適当な標的配列を有することが不可
欠であることを示した（図6B）。

実施例５２つのPCR段階の熱分離オリゴヌクレオチド２本鎖の熱安定性はその長さに非
常に強く依存するため、PCRにおけるオリゴヌクレオチ
ドａ、ｂ、ｃおよびｄ（26頁参照）の取り込みがアニー
リング温度に厳密に依存するように、それらの長さを選
択することが可能であると予想された。オリゴヌクレオ
チドａおよびｂがｃおよびｄよりもかなり長いことによ
り、それらがｃおよびｄよりもかなり安定した２本鎖を
形成する場合、充分高温でのアニーリングによりｃおよ
びｄの取り込みが阻止され、４つのオリゴヌクレオチド
を全て含む混合物中で反応物が分離され得るのは当然で
ある。予備試験は、意外なことに、様々なオリゴヌクレ
オチド18−20は塩基長を使用したとき、70℃程度の高い
アニーリング温度では、取り込みは阻止されないが、効
率は低下することを示した。しかしながら、ｃおよびHI
V配列に相補的なｄの部分が15塩基長である場合、明白
な熱分離は65℃で達成され得る。

この故に、95℃で１分間、次いで65℃で２分間とい
う、１サイクル当たり僅か２つの段階から成る熱循環体
制により（「アニーリング無し」と呼ぶ）、オリゴヌク
レオチドa1およびb1（各々20および28塩基長）は、鋳型
として1ngのプラスミドDNAを用いて24サイクルで取り込
まれたが、c2およびd2（図7A、左パネル）はこの高い鋳
型投入量を用いても取り込まれなかった。１分間40℃の
アニーリング段階を他の２段階と同じく導入した場合
（「アニーリング有り」と呼ぶ）、c2およびd2は追加の
24サイクルで有効に取り込まれ得る（図7A、左パネ
ル）。同様に、合計24サイクルで全てアニーリング有り
の場合、ｃおよびｄは有効に取り込まれた（図7A、右パ
ネル）。アニーリング有りの場合、a1およびb1の取り込
みの効率は劣っていた（図7A、右パネル）。

４つのオリゴヌクレオチド全部が含まれる場合（図7A
およびＢ）、予想通りアニーリング無しで循環させたと
きa1およびb1のみが取り込まれた。しかしながら、驚く
べきことに、アニーリング有りの場合、予想されたc2−
d2生成物は得られなかった。その代わりに、a1−d2およ
び／またはc2−b1に対応するさらに長い生成物が得られ
た。それ故、a1および／またはb1は、c2またはd2または
その両方について徹底的に競うと思われる。c2の非存在
下において、この生成物は得られたが、d2の非存在下で
は、それがa1−d2生成物であることは示されていなかっ
た（図7A、右パネル）。従って、c2およびd2に対するa1
およびb1の相対量を低下させた場合の影響を調査した。
図7Bは、a1およびb1の相対量を充分に減らしたとき、ア
ニーリング有りで循環させると、予想されたc2−d2生成
物が実際に得られたことを示す。予想通り、a1−b1生成
物のみがアニーリング無しで形成され、この量は、a1お
よびb1の濃度を低くしてもあまり大きな影響は受けなか
った（図7B、左パネル）。

これらの反応の生成物におけるADAも行なわれた（デ
ータは示されず）。上記検定で増幅DNAを機能させるた
めには、それは一端にビオチン部分および他端にGCN4結
合部位を含んでいなければならない。短いｃ−ｄ生成物
を含む上記反応混合物のみが、ADAにおいて顕著な発色
反応を生じたため、これらの分子の構造が確認された。

適当な長さのオリゴヌクレオチドを選ぶことにより、
PCR段階１および２を熱的に分離することが可能である
という結論に達した。第２反応の生成物は、予想通りAD
Aにおける基質として作用する。しかしながら、オリゴ
ヌクレオチドａおよびｂの濃度を慎重に制御しないと、
反応を容易に消去し得るきっ抗作用が存在する。

異なる２つの温度体制下で様々な回数循環させた、HI
Vプラスミドの系列希釈試験により、上記反応の若干の
さらに別の特徴が明らかにされた。まず、アニーリング
有りおよび無しの両場合とも、色の強さがサイクル数に
依存することは明らかであった。しかしながら、これら
の条件下では感度は制限され、少なくとも10⁴分子が要
求される（下記実施例６）。それにも拘わらず、永続的
感染細胞から得られたヒトDNAからHIV配列を検出するの
には充分な感度であるが、非感染対照は陰性であった。

実施例６さらに広い間隔をあけたオリゴヌクレオチドを用いる、
２つのPCRの熱分離。

ａおよびｂオリゴヌクレオチドとｃおよびｄオリゴヌ
クレオチドとの見かけ上のきっ抗（実施例５）は、部分
的には立体障害およびオリゴヌクレオチドのアニーリン
グ速度に関連した反応速度作用により生じ得る。a/cお
よびb/dの間隔を近付けることにより、これが激化され
得ることは先に示されている（16）。別法として、アニ
ーリングし、ａ−ｂ鋳型上に伸ばされるｃおよびｄオリ
ゴヌクレオチドは、同じ伸長サイクルにおいて同一鋳型
分子上のａまたはｂオリゴヌクレオチドによる第２開始
事象後にニック翻訳により続いて除去され得る。Taqポ
リメラーゼが５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有す
ることにより、ニックを翻訳し得ることは今や明白であ
る。オリゴヌクレオチドa/cおよびb/dの間隔を増やした
場合、当然これらの作用は全て低減化される。従って、
オリゴヌクレオチドa2およびb2は、a1およびb1の場合よ
りもc2およびd2からかなり遠くに離れて保存された位置
に対応する形で合成された。

まずアニーリング無し、次いでアニーリング有りで循
環させた後、オリゴヌクレオチドc2およびd2の取り込み
は、オリゴヌクレオチドa2およびb2の濃度により異なっ
た（図8a）。a2およびb2の最適濃度において、c2−d2生
成物は、オリゴヌクレオチドa1およびb1による場合より
も約100倍低い投入量のプラスミドDNAからADA反応また
はEtBr染色により検出され得た（図8b）。c2−d2生成物
の生成およびADAにおける色の強さは、アニーリング無
しおよび有りの両場合ともサイクル数により異なり、40
サイクル後でさえ、アニーリング無しでは顕著なc2−d2
生成物は存在しなかった（図９）。

これらの条件下において、HIV配列は、HIV感染CEM培
養からの約250の細胞から得られたDNAにおいて検出され
得たが、非感染細胞からの100倍多いDNAを用いた場合で
さえ顕著な基底値は存在しなかった（図10および11）。
はめ込まれたオリゴヌクレオチドによる２つの連続反応
が特異性にとっては実際極めて重大であること−非感染
DNAから生じた多くの帯は存在するが、これらはADAにお
いて陽性としては作用しないことが、図10に示されたゲ
ルから明らかである。

それ故、ｃおよびｄからかなり離れた場所に位置する
ａおよびｂオリゴヌクレオチドを用いると、特異性を失
わずに感度を高めることができる。

実施例７マイクロタイター皿で行なわれるPCR反応検定用システ
ムの開発。

ADAシステムをさらに簡易化するための一方法は、マ
イクロタイター皿でPCRを行い、次いで、一アレイのGST
−GCN4被覆ビーズまたはピンを用いて96ウェルの各々か
ら増幅DNAを捕獲し、第２の皿へ移す方法である。これ
が可能であったか否かを試験するため、オリゴヌクレオ
チドc2およびd2により行なわれたPCR反応の１−10μｌ
試料をマイクロタイター皿中で20μｌに調製し、１滴の
パラフィン油で被覆した。高速ELISAスクリーニング・
プレートのビーズをGST−GCN4で被覆し、粉乳−DNAで遮
断し、次いで20分間PCR試料に浸した。続いて、ビーズ
を洗浄し、アビジン−ペルオキシダーゼに暴露し、洗浄
し、ABTS基質を含むマイクロタイター皿に入れた。得ら
れた応答は増幅DNAの量に比例しており（図12）、基質D
NA無しでインキュベーションした等量のPCR混合物から
の基質値は無視してよい程度であった。色の強さは、同
じ原材料によりGST−GCN4被覆ウェルを用いて行なわれ
た反応よりも２−３の係数により低く（データは示さ
ず）、ビーズの低い表面積を反映していた。しかしなが
ら、基質としてTMBを用いると、感度は約10倍高められ
得、基底値はあまり増加しなかった（図12）。それ故、
増幅DNA分子はGCN4被覆ビーズを用いて効果的に捕獲お
よび移動され得る。被覆ビーズがまずパラフィン油の層
から浸漬されたと仮定すると、これは驚くべきことであ
り、PCRに関する必要条件とよく似ている。

PCR反応が上記要領でマイクロタイター皿で行なわ
れ、次いで移動され得ることを確立するため、オリゴヌ
クレオチドa1およびb1、c2およびd2または４つの全オリ
ゴヌクレオチドとの反応を図２に従い開始させ、適当な
温度の水が中を通って循環する中空アルミニウム・ブロ
ックに載せた可撓性マイクロタイター皿のウェル中でイ
ンキュベーションした。ブロックの上部をミリングして
皿の底部に合わせ、酸化亜鉛ヒートシンク・クリームを
用いて、熱接触を確実にした。１滴のパラフィン油によ
り蒸発を阻止した。40℃アニーリング段階による24サイ
クル後、オリゴヌクレオチドa1−b1およびc2−d2を予想
サイズの生成物へ取り込ませた。さらに、c2−d2生成物
により、予想通りのADA反応が得られた（データは示さ
ず）。

実施例８ ADAにおける別のDNA結合蛋白質、TyrRおよびトロンビン
開裂GCN4の使用。

ADA反応で作用し得る、異なるDNA認識配列を伴う他の
結合性蛋白質を有することが目的によっては有用な場合
もある。例えば、GST−GCN4部位を伴うHIV−オリゴヌク
レオチドの１セットは、第2DNA結合性蛋白質部位により
マークされたＢ型肝炎ウイルスのオリゴヌクレオチドの
１セットと同じ混合物中に含まれ得、その場合、各々特
異的に一PCRから読み取られ得る。TyrRは、Ｃ−末端DNA
結合性ドメインを有する「ヘリックス・ターン・ヘリッ
クス」型のDNA結合性蛋白質であり、V.アルギロポラス
博士により試験用に提供された（18）。

TyrR認識部位およびHIV配列を含む、すなわち、TyrR
認識部位がGCN4結合部位と置き換えられた点以外は実施
例３記載のオリゴ「ｄ」に対応するオリゴヌクレオチド
・プローブを製造した。

上記プローブは、下記配列を有した。

このプローブをオリゴ「ｃ」によるADA試験へ組み込
み、GST−GCN4またはTyrRにより被覆したプレート上で
反応生成物を試験した。

図13に示されたGST−GCN4結合部位を含む原オリゴ
「ｄ」を用いた同じ実験のものと結果を比較した。

実施例９臨床試験下記実施例は、エイズにり患していると陽性診断され
た患者または陰性対照から採取された末梢血リンパ球
（PBL）において行なわれた臨床試験の結果を示す。試
験は盲検で行なわれた。

グアニジン・チオシアネート緩衝液（４モル）および
遠心分離により血液試料からPBLを製造した。

DNAを抽出し、グアニジン・チオシアネート遠心分離
の同技術を用いてPBLから精製した。

実施例３記載のオリゴa2、b2、c2およびd2を用いて一
段階ADA反応が行なわれた。

図15に示された結果に関する凡例は次の通りである。

− DNA無し DO ヒトDNA（陰性対照） CC HIVによりトランスフェクションされたCEM細胞を用
いた陽性対照 CP プラスミドDNAを用いた陽性対照＋プラスミドDNAがそこに取り込まれているCEM細胞を
用いた陽性対照。

20−55 臨床標本試料20および46は、健康人から得られた。

結果は、明らかにADAの感度および特異性によりHIVが
検出されることを示している。

実施例10 ADAを用いたマイコプラズマ・ニューモニエの検出。

この実施例は、重い呼吸器系感染症を誘発し得る病原
体であるマイコプラズマ・ニューモニエからのDNAの検
出にADAが使用され得ることを示している。第１実験で
は、ヒュー等、「ジーン」、64、217に記載されたマイ
コプラズマ・ニューモニエのP1遺伝子を含むプラスミド
DNAおよび１対のADAプライマーを使用した。第２実験で
は、全マイコプラズマ・ニューモニエ細胞が加えられた
臨床標本（鼻咽腔吸引物）およびはめ込まれた２対のプ
ライマーを使用した。

（ｉ）この実験では、下記に示された１対のみのプライ
マーを使用した。それらの一方はビオチニル化されてお
り、他方はGCN4認識配列を含む。

ADAプライマー1:5′ビオチニル−TCAAAACAACGACAC−
３′ （P1遺伝子のヌクレオチド3863−3877に対応） ADAプライマー2:5′−GGATGACTCATTTCAGAAAGTCGAC−
３′ （P1遺伝子のヌクレオチド4144−4100に対応、最初の10
ヌクレオチドがGCN4部位を構成する） ADAは、精製P1プラスミドDNAを採取し、0.6マイクロ
モル/120ngの割合で各ADAプライマー１および２を加え
ることにより構成された。増幅の最初の５サイクルは次
の要領で行なわれた:94℃−１分（融解）、37℃−２分
（アニーリング）、60℃−３分（伸長）。次の25サイク
ルは、90℃−１分、37℃−２分、60℃−３分であり、最
終伸長は72℃で10分間であった。

次いで、生成物の約1/5を、マイクロタイター・プレ
ートを４℃で一夜GST−GCN4（PBS中250ng/ウェル）によ
り被覆する一段階結合反応で分析した。増幅DNAの検出
は前述の要領で行なわれた。この実験の第２部では、出
発物質としてより少量（すなわち1/10）のDNAを使用し
た。

PCRの遂行に使用される混合物は、50μｌの容量中、２単位のTaqポリメラーゼ（シータス）、 10ミリモルのトリスHCl、pH8.3、 50ミリモルのKCl、 1.5ミリモルのMgCl₂、 0.2％マイクロモルdNTP、および上記ADAプライマーを含んでいた。

（ii）この実験では、２対のプライマー−上記ADAプラ
イマー、および下記のADAプライマーの外側にある別の
対のPCRプライマーを使用した。

PCRプライマー1:5′−CAAGCCAAACACGAGCTCCGGCC−
３′ （P1遺伝子のヌクレオチド3666−3688に対応） PCRプライマー2:5′−CCAGTGTCAGCTGTTTGTCCTTCCCC−
３′ （P1遺伝子のヌクレオチド4208−4183に対応）様々な量の全マイコプラズマ・ニューモニエ細胞を鼻
咽腔吸引物に加え、加えられた細胞の量を適当な数のゲ
ノムとして測定した。材料を遠心分離し、沈澱物を集め
た。これを37℃/1時間でプロテイナーゼＫ（30μｌ、10
ミリモルのトリスCL（pH8.3）中200μg/ml）により処理
してDNAを遊離させ、次いで95℃/15分間でプロテイナー
ゼＫを不活化した。次いで、ADAを下記の要領で行っ
た。

使用されたPCR混合物は、それが250ngの各ADAプライ
マーおよび5ngの各PCRプライマーを含む点以外は実験
（ｉ）の場合と同様であった。

循環の第１ラウンド（すなわち、PCRプライマーに有
利なラウンド）は、94℃−１分間、65℃−２分間、72℃
−３分間の30サイクルにより構成された。ADAプライマ
ーを指向した第２ラウンドは、90℃−１分間、40℃−１
分間、60℃−３分間の15サイクルにより構成され、最後
に最終伸長段階は10分間72℃であった。

増幅DNAの分析および検出は、実験（ｉ）の場合と同
様に行なわれた。

（iii）実験（ｉ）および（ii）で得られた結果を下表
に示す（結果は、プラス（＋）尺度を用いて得点評価さ
れ、最大着色は＋＋＋＋であり、無着色は−である）：実験（ｉ）プラスミドDNAの量結果 56ng（７×10⁸分子）P1プラスミド：＋＋ 5.6ng（６×10⁷分子）P1プラスミド：＋プラスミド不含有対照 − 実験（ii）マイコプラズマ・ニューモニエのゲノムの概数結果５×10⁸ ＋＋＋ 2.5×10⁸ ＋ 10⁸ ＋＋ 10⁷ ＋／− ５×10⁵ − 2.5×10⁵ − 10⁵ − 10⁴ − 0 − 参考文献 1.サイキ、R.K.、シャルフ、S.、ファルーナ、F.、ムリ
ス、K.B.、ホーン、G.T.、エルリッチ、H.A.およびアル
ンハイム、N.（1985）「サイエンス」230、1350−135
4。

2.サイキ、R.K.、ゲルファンド、D.H.、ストフェル、
S.、シャルフ、S.J.、樋口、R.、ホーン、G.T.、ムリ
ス、K.B.およびエルリッチ、H.A.（1987）、「サイエン
ス」239、487−491。

3.リー、C.C.、ウー、X.、ギブス、R.A.、クック、R.
G.、ムズニー、D.M.およびキャスキー、C.T.（1988）
「サイエンス」239、1288−1291。

4.ギレンステン、U.B.およびエルリッチ、H.A.（1988）
「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユー・エス・
エー」85、7652−7656。

5.トリグリア、T.、ピーターソン、M.G.およびケンプ、
D.J.（1988）「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」1
6、8186。

6.キム、Ｈ−S.およびスミシーズ、O.（1988）「ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ」16、8887−8904。

7.ランデグレン、U.、カイザー、R.、キャスキー、C.T.
およびフード、L.（1988）「サイエンス」、242、229−
237。

8.ロール、F.、ルジョー、C.、ベーベル、F.、ジャコ
ム、C.、クルニョー、G.、ブランシュ、S.、ブルガー
ル、M.、グリセリ、C.およびブルショー、C.（1988）
「ザ・ランセット」、538−541。

9.ヒネブーシュ、A.G.（1984）「プロシーディングス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ーズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー」81、6442−6446。

10.ホープ、I.A.およびシュトルール、K.（1986）「セ
ル」46、885−894。

11.スミス、D.B.およびジョンソン、K.S.（1988）「ジ
ーン」67、31−40。

12.ソドロスキー、J.、パタルカ、R.、ローゼン、C.、
ウェング−スター、F.およびハーゼルチネ、W.（1985）
「サイエンス」229、74−77、サンチェス−ペスカド
ン、R.、パワー、M.D.、バール、P.J.、ステインマー、
K.S.、ステンピエン、M.M.、ブラウン−シャイマー、S.
L.、ジー、W.W.、レナード、A.、ランドルフ、A.、リー
バイ、I.A.、ダイナ、D.およびルチゥ、P.A.（1985）
「サイエンス」227、484−492。

13.ケンプ、D.J.、コッペル、R.L.およびアンダース、
R.F.（1987）「マニュアル・レビュー・オブ・マイクロ
バイオロジー」41、181−208。

14.ヒル、D.E.、ホープ、I.A.、マック、J.P.およびシ
ュトルール、K.（1986）「サイエンス」234、451−45
7。

15.ホープ、I.A.およびシュトルール、K.（1985）「セ
ル」43、177−188。

16.ケンプ、D.J.、スミス、D.B.、フーテ、S.J.、サマ
ラス、N.およびピーターソン、M.G.（1989）「プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー」86、
2423−2427。

17.ヒネブーシュ、A.G.（1984）「プロシーディングス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シーズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー」81、6442−644
6。

18.アルギロポラス、V.（1989）シーサス・フォー・ド
クター・オブ・フィロゾフィー、ザ・ユニバーシティー
・オブ・メルボルン、パークビル、ビクトリア、オース
トラリア。

19.シュトルール、K.（1989）「トレンズ・イン・バイ
オロジカル・サイエンシーズ」、14、137。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ペーターソン、マイケル・グレゴリーオーストラリア連邦3107 ビクトリア州、ローワー・テンプルストウ、ロワン・アベニュー９番 (72)発明者サマラス、ニコラスオーストラリア連邦3162 ビクトリア州、コールフィールド、ティーク・ストリート１番 (72)発明者スミス、ドナルドイギリス国ティーディー13・５エックスイースコットランド、バーウィックシャー、コックスバーンパス、ダングラス・ミル（番地の表示なし) (56)参考文献Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 86 ｐ．2423−2427 （1989) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 ZNA C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】標的DNAを、当該標的DNAの鎖に相補的であ
るように選択されたオリゴヌクレトチドプライマーのセ
ットであって、当該セットのプライマーの一方が２本鎖
DNA特異的結合性蛋白質に対する部位を含む第１のリガ
ンドを担持しており、他方のプライマーが第２のリンガ
ドまたは標識を担持しているものを使用するポリメラー
ゼ連鎖反応に付し、増幅された２本鎖DNAを、固定化された上記第１のリガ
ンドに対する２本鎖DNA特異的DNA結合性蛋白質を有する
固体基質と接触させ、第２のリガンドまたは標識を検出すると共に、増幅され
た２本鎖DNAを上記固体基質に結合させて、増幅された
２本鎖DNAの存在を示すことを特徴とする、標的DNAを捕捉、検出する方法。
【請求項２】標的DNAを、試料中に存在する場合には、
当該標的DNAの鎖に相補的であるように選択されたオリ
ゴヌクレオチドプライマーの第１のセットを使用する、
ポリメラーゼ連鎖反応法により増幅させ、増幅された標的DNAを、プライマーのセットがオリゴヌ
クレオチドプライマーの上記第１のセットの間で入れ子
状（nested）になっているものを使用する請求項１に記
載の方法によって検出する、試料中の標的DNAを捕捉、
検出する方法。
【請求項３】第１と第２のポリメラーゼ連鎖反応が単一
反応混合物中で生ずる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】増幅されたDNAの固体基質に対する結合
が、検出複合体に対する結合と同時に生ずる、請求項１
〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】２本鎖DNA特異的DNA結合性蛋白質がロイシ
ンジッパー型のものである、請求項１〜４のいずれかに
記載の方法。
【請求項６】DNA結合性蛋白質がGCN4および／またはそ
の誘導体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】DNA結合性蛋白質がGST−GCN4である、請求
項６に記載の方法．
【請求項８】２本鎖DNA特異的DNA結合性蛋白質がらせん
回転らせん型のものである、請求項１〜４のいずれかに
記載の方法。
【請求項９】DNA結合性蛋白質がTyrRである、請求項８
に記載の方法。
【請求項１０】結合DNAがアビジン−パーオキシダーゼ
を含む検出試薬を用いて検出される、請求項１〜９のい
ずれかに記載の方法。
【請求項１１】検出試薬に対する結合部がビオチンであ
る、請求項１〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】標的DNAがHIV DNAである、請求項１〜1
1のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】２本鎖DNA特異的DNA結合性蛋白質で被覆
された固体基質がミクロタイター皿のウエルである、請
求項１〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】２本鎖DNA特異的DNA結合性蛋白質で被覆
された固体基質が検出複合体を持った増幅生産物を検出
基質に移動させることが出来る単一または複数のビーズ
またはピン装置である、請求項１〜13のいずれかに記載
の方法。
【請求項１５】標的DNAがRNAから逆転写酵素により複製
されたcDNAである、請求項１〜14のいずれかに記載の方
法。
【請求項１６】区画状態で、標的DNAの鎖に対して相補
的であるように選択されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーのセットであって、当該セットのプライマーの一方は
２本鎖DNA特異的結合性蛋白質に対する部位を含む第１
のリガンドを担持しており、他方のプライマーは第２の
リガンドまたは標識を担持するものであるものを含む第
１の容器；および当該第１の容器または第２の容器に、
ポリメラーゼ連鎖反応用試薬、２本鎖DNA特異的結合性
蛋白質で被覆された固体基質および当該固体基質に結合
した増幅された２本鎖DNAを検出するための手段を含む
キットからなる、請求項１〜15のいずれかに記載の方法
により試料中の標的DNAを捕捉、検出するための試験キ
ット。
【請求項１７】更に、標的DNAを増幅することが出来る
プライマーの第１のセットを含み、ポリメラーゼ連鎖反
応の間に、請求項16に定義したプライマーのセットが上
記第１のプライマーのセットの間に入れ子状（nested）
になる、請求項16に記載のキット。
【請求項１８】支持体、当該支持体上に固定化されたGS
T−GCN4および第１の端部で当該GST−GCN4に結合してい
る増幅された２本鎖DNAにより本質的に構成された、請
求項１〜７のいずれかに記載の方法で使用するコンジュ
ゲート。
【請求項１９】第２の端部でDNAが標識にコンジュゲー
トしている、請求項18記載のコンジュゲート。
【請求項２０】標識が酵素である、請求項19記載のコン
ジュゲート。
【請求項２１】標識がアビジン−ビオチン架橋によって
増幅されたDNAにコンジュゲートしている、請求項20記
載のコンジュゲート。