JPS59220647A - ポリヌクレオチド連鎖を利用する検定方法 - Google Patents
ポリヌクレオチド連鎖を利用する検定方法Info
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- JPS59220647A JPS59220647A JP59090041A JP9004184A JPS59220647A JP S59220647 A JPS59220647 A JP S59220647A JP 59090041 A JP59090041 A JP 59090041A JP 9004184 A JP9004184 A JP 9004184A JP S59220647 A JPS59220647 A JP S59220647A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明はポリヌクレオチド相互作用にもとづく一般的な
検出システムを利用する分析物の免疫検定および核酸検
定の両者を含む検定に関するものである。 生物学的および非生物学的試料における物質の微爪の分
析および検出は全世界の臨床および分析研究所における
日常の業務になっている。大ざっぱに言えば、分析手法
は配位子一受容体相互作用にもとづくもの（即ち免疫検
定にもとづいた手法）、および核酸ハイブリッド化にも
とづくもの（ポリヌクレオチド連鎖にもとづく手法）と
に分けられることが出来る。 例えば、免疫検定手法は手順中のあるステージまたはス
テップにおいて、抗体結合位置とこれに対する補体とな
る抗原との間の非共有結合を含むものである（例えば、
Ｔ．Ｃｈａｒｄ著ＩＩＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔ
ｏＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙａｎｄＲｅｌａｔ
ｅｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ
ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅｒｄ
ａｍ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７８参照。 ）ポリヌクレオチド連鎖にもとづく手法において、方法
は、あるステップまたは他のステップにおいて、ハイブ
リノド化条件下に補体となる連鎖に対するポリヌクレオ
チド連鎖の非共有結合を含むものである（例えば、Ｆａ
ｌｋＯｗ他、米国特許第４，３５８，５３５号、Ｗａｈ
ｌ他、米国特許第４，３０２，２０４号、およびＨｅｉ
ｍｅｒ，米国特許第３，７５５，０８６号参照。） 一般に広められている動向においては、上記の手法は両
方共正確な分子配列や相互作用によって成し遂げられ、
そして非共有結合自由エネルギー（例えば水素結合、分
散結合、イオン結合、双極子結合等）の放出Ｋよってエ
ネルギー的に与えられる第１認識事象を含んでいる。該
第１認識事象に加えて、上記の手法は両方共、一つのス
テップまたは他のステップにおいて、信号を発する事象
を含むものである。このステップまたは事象は、人手ま
たは装置検出システムに対するいくらかの証明出来る方
法において、第１認識事象を検出する必要性に関するも
のである。 信号発信は主として二つの広い分野、放射能および非放
射能手法に集中する。 放射能信号はシステムにおいて例えばＰ，１３１１，１
４Ｃ，８Ｈ等の原子による一つまたはそれ以上の放射性
ラベル付けに依存する０検出は通常放射性検出体による
。非放射性手法はこれらが放射能を含まず、かくしてこ
のような手法をよシ安全に、よシきれいに、そして貯蔵
に対してより安定にせしめるのでこの数年の間にますま
す使われるようになった。これらは放射性ラベル手法と
同程度な高い感度を持つように発展されて来た。 現在用いられている最も一般的な非放射性信号発信手法
には酵素結合された免疫検定（例えばＳｃｈｕｕｒｓ，
Ａ．Ｉ｛−他、ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ
，ｓｉ：１〜４０（１９７７））ｔ螢光（Ｂａｕｍａｎ
等、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，８４：１〜１８（１９８１
）），間接免疫螢光（Ｒｕｄｋｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，
２６５：４７２〜４７３（１９７７）），７ヒジンービ
オチン相互作用（Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｊ．等、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，１６：１３６５〜１３７０（１９７７
））ｙ例えばフェリチンのような高電子密度核の電子顕
微鏡検査（Ｂｒｏｋｅｒ，Ｔ．Ｒ．等、Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，５：３６３〜３８４（１
９７８）），ラテックス接触（Ｓｏｄｊａ，Ａ．，前掲
、３５：３８５〜４０１（１９７８）），上記手法の組
合せ、そしてその他のものがある。 第１認識事象と信号発信事象は直接または間接Ｋ、比例
的Ｋまたは逆比例的に相互に関係付けられることを必要
とする。かくして放射性ラベルされたブローブとの核酸
のハイブリノド化のようなシステムにおいて、放射能の
量は通常存在する分析物の量に直接比例する。検出され
るラベルを付された第２抗体の量が正常には試料中に存
在する抗原の量に直接比例するサンドイッチ免疫検定の
ようなシステムでは同様なことが云える。逆比例手法は
例えば検出される信号の量が試料中に存在する分析物の
量が増えると減少する競合免疫検定を含む。 従来技術はまた信号発信事象が１：１よシも大きな比率
で第１認識事象と関連する増巾手法を利用して来た。か
くして、検定の信号発信成分は各認識成分に対してｌＯ
：１の比率で存在するであろう。 ポリヌクレオチド連鎖にもとづく認識システムの広汎な
多用性はなされるべき実験と研究を広範囲に拡大する。 この多用性は補体ヌクレオチド塩基相互の正確な配列、
チミジン（１）に対して配列するアデニン（４）および
シチジン（ｃ）に配列するグアニン、によってもたらさ
れるものである。との相補性が与えられれば無限に多方
面にわたるシステムを提供するためにいかなる所望の連
鎖を利用することも可能になる。 ポリヌクレオチド相互作用にもとづくシステムのよ９広
汎な用途に対する障害の一つは、しかしながら、信号発
信または報告グループ（例えば放射性燐、または酵素、
またはビオチン等）をボリマー鎖中の個々のヌクレオチ
ド残基に結合する必要性があったことである。この要求
から少くとも二つの問題が生ずる。 第１はポリヌクレオチドポリマーの変性に含まれる化学
反応条件が一般的にとシわけいかなる１つの核酸を充分
に選択するためには激し過ぎることである。例えば、ケ
トキザールまたはグリオキザールのようなジカルボニル
試薬はグアニンと無差別に反応するであろう。（例えば
、Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｒ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，５：２７９９−２８０７（１９６６ＬＬｘｔｔ，Ｍ．
ｔ前掲、８：３２４９−３２５３（１９６９），または
ＰｏｌｉｔｚｙＳ．’Ｍ．等、前掲、２０：３７２−３
７８（１９８１））参照。）かくしてもしジカルボニル
基盤の架橋剤が酵素１たは低分子信号発信成分を直接ポ
リヌクレオチド鎖に結合するために用いられるならば鎖
中のすべてのグアニン残基の可成シの量が変性する危険
性があるであろう（実際このようなことはある）。 このことは認識ステップにおいてこのような変性された
鎖の使用を甚大に妨ける。この問題は従来技術において
、個々の変性されたヌクレオチド（予じめ非水素結合分
裂方法で変性された）を発生期のポリヌクレオチド鎖の
中への酵素的な（ＤＮＡポリメラーゼを基盤とする）取
シ入れの使用によって解決されていた。しかしながら、
最終ポリヌクレオチドそれ自体についての化学的変性手
法を利用することが望ましい。 第２の問題は信号発信グループをポリヌクレオチドに結
合することに関連し、第１の問題にいくぶんかは関係し
ている。該問題は、ポリマー中へのこれら酵素的取シ入
れに先立って時には非常に複雑なそして手のこんだ合成
技術による合成の必要性にもとづくものである。かくし
て放射性ラベルされたヌクレオテドまたはビオチンラベ
ルされたヌクレオチドは独立して合成さｎることになる
。 更に最終核酸ボリマ〜中への化学的に変性されたヌクレ
オチドの結合量は才だ分析物上の与えられた連鎖を認識
するためのグローブの能力に影響する。これはもし信号
発信グループが認識グループＫ犬巾に数でまさっている
増巾手法が利用されるならば特に重要である。それ故に
容易に調整され、化学的変性に対して酵素にもとづく反
応よりもむしろ制御しやすい成分を利用し、ポリヌクレ
オチドにもとづく連鎖の広汎な多用性を利用し、そして
信号増巾方法の可能性を含む検定システムを開発するこ
とは非常に有用である。 本発明はポリヌクレオチド連鎖認識を利用する一般的な
検定システムを提供するものであシ、該検定システムは
化学的変性反応の使用を可能とし、またいかなるタイプ
の非結合相互作用にもとず〈認識事象を利用することが
出来、そして有効な信号発信方法の無数のうちのいかな
るものも用いることが出来るものである。 不発明の手順は （１）分析物（４）上の分子的認識可能部分を認識する
ことが出来る部分、および （ト）ポリヌクレオチド連鎖からなる部分、を有する分
子架橋体（６） および （１）該架橋体の該ポリヌクレオチド部分にアニーリン
グすることが出来、それによって安定なポリヌクレオチ
ドハイブリッドを形成するポリヌクレオチド部分、およ
び （り信号発信部分 を有する信号発信体（０ を提供すること、 および （１）該分子的認識可能部分を介して複合化されている
該分析物囚 （２）該架橋体（Ｂ）の認識部分、（該架橋体の）は該
ポリヌクレオチド部分を介して複合化されている）。 （３）該信号発信体Ｃ）のポリヌクレオチド部分から々
る複合体を形成すること、 および 該複合体中に存在する該信号発信部分によシ信号を検出
すること、 からなる分子的認識可能部分を有する分析物（８）を試
料中で検出する方法よりなるものである。 上記手順に加えて本発明は例えば種々な分子架橋体や種
々な信号発信体のようなそれに用いられるぺ＠種々の要
素や成分を該架橋体や発信体からなるキットや該手順に
用いられる他の成分と同様に提供するものである。 本質において、本発明は多重成分検定システムの認識部
分および信号発信部分がシステムの異なった成分上に存
在し、それによってそれらを分離しそして認識部分上の
信号発信部分の妨害を防止するべきであると云う理解に
もとすいている。この多重成分体への分離はまた認識成
分に影響することなくして成分の一つに化学的変性手法
によって結合せしめることを可能にする。 該手順、システム、および成分の用途は限定されるもの
ではなく、そして一般的にいかなる試料中の認識するこ
とが出来るいかなる分析物の検出のみならず従来の検定
手法が適用されてきた用途のすべてを含むものである。 本発明の明細書および特許請求の範囲において用いられ
る蟻分析物“なる言葉は検出されるべき、そして所望な
れば定量されるべき単一物もしくは混合物におけるいか
なる物質または複数の物質を含むものである。該分析物
は小さなまたは高分子量の分子、分子複合体、または例
えばウィルス、細胞、または細胞群のような生物系であ
ろう。一般的な分析物としては蛋白質、ポリサンカライ
ド、リボボリサッカライド、蛋白質複合体、核酸または
そのセグメント、単一らせん形状または二重らせん形状
のいづれか、例えばコアーまたはカプシド、種々の異な
ったタイプのバクテリア、組織細胞等のようなすべての
ウィルスまたはウィルス成分がある。最も一般的な蛋白
質には構造蛋白質、酵素、免疫グロブリン、またはその
断片がある。 最も一般的な核酸は例えばｔＲＮＡ，ｍＲＮＡ，ｒＲＮ
Ａ等の種々の異なったタイプのＤＮＡおよびＲＮＡがあ
る。バクテリアは全体、または細胞壁または他の認識可
能部分のようなその断片としてグラム陽性およびグラム
陰性バクテリアを含む。 菌、藻類および他の亜顕微鏡的微生物はまた動物（例え
ば啼乳類）細胞と同様に含まれる。 該分析物は分子的に認識可能な部分をその上に有するべ
きである。この相はシステム中の架橋体上の補体分子部
分によって認識されることの出来る分析物のいかなる分
子部分をも示すものである。 分子認識は当業者には理解されているように、２つの分
子の補体部分の間の３″：）の次元中の非共有結合を含
む。ある分析物上の分子的認識可能部分には、例えばＲ
ＮＡまたはＤＮＡのようなその補体連鎖によって認識さ
れるべきポリヌクレオチド連鎖；その対応するモノクロ
ーンまたはポリクローン抗体Ｋよって認識されるべき抗
原部分；その対応する抗原によって認識されるべき抗体
部分；その糖によって認識されるべきレクチン部分、そ
のレクチンＫよって認識されるべき糖部分、その受容体
によって認識されるべきホルモン部分：そのホルモンに
よって認識されるべき受容体部分；その酵素によって認
識されるべき阻害物質部分；その阻害物質部分によって
認識されるべき酵素部分；補因子酵素結合位置によって
認識されるべき補因子部分；その補因子によって認識さ
れるべき位置部分を結合しだ補因子酵素；その基質によ
って認識される結合配位子およびその逆（例えばピオチ
ンーアビジン）：またはいかなるそれらの順列および組
合せがある。 最も一般的な分子的認識可能部分には、多くの異なった
種類の抗原においての三次元的蛋白質配列、種々の細胞
中に存在する細胞壁構造、または生物のＤＮＡまたはＲ
ＮＡ中に存在する核酸連鎖がある。 該システムの第２の成分は亀架橋体″である。 この架橋体は分析物上の分子的認識可能部分を認識する
ことの出来る第１部分と、そしてポリヌクレオチド連鎖
からなる第２部分のみを含むことを必要とする。該架橋
体のこれら２つの部分は同じタイプ（即ち異なったもの
とは云えどもその両方共がポリヌクレオチド連鎖）また
は異なったタイプ（例えば一つが抗体部分であり、他が
ポリヌクレオチド部分である）のものであろう。 分析物上の分子的認識可能部分を認識するととが出来る
架橋体の部分は分析物上の認識可能部分の補体である分
子または分子断片を含まねばならない。それ故にもし分
析物がポリヌクレオチド連鎖を含んでいるならば、該架
橋体の認識部分は補体ボリヌクレオチド連鎖または気グ
ローブ〃であるべきである。もし分析物上の分子的認識
可能部分が広く一般に使用されている抗原であれば、該
架橋体上の認識部分はそれに対する抗体である。 糖／レクチン，受容体／ホルモン，阻害物質／酵素等の
前記された補体対に関しても同様々ことが云える。 該分子架橋体の第２部分は一つのポリヌクレオチド連鎖
からなる。該ポリヌクレオチド連鎖は、与えられた厳重
な条件下で補体連鎖との安定なアニーリングを与えるに
充分でおること、それが信号発信体上のポリヌクレオチ
ド連鎖の補体となること、そしてもし該架橋体上の認識
部分がそれ自体ポリヌクレオチド鎖であるならば、分析
物連鎖と架橋体上の第２ポリヌクレオチド部分との間の
ハイブリッド形成を避けるためにそれが該認識連鎖部分
から充分に相違することが備えられたいがなる選択され
た連鎖ともするこ七が出来る。該三つの条件の後者は悪
い結果を生ずる付随物によって分子混同を防ぐことが必
要である。 架橋体上の第２部分ポリヌクレオチド連鎖（即ち信号発
信体上の連鎖に対する一つの補体）は一つもしくは複数
の特殊遺伝子生成物に対するコードを有するか、または
遺伝子生成物に対するコードを全く有しなめであろう。 かくしていかなる構造遺伝子またはその部分も架．僑体
上のポリヌクレオチド連鎖部分として用いられることが
出来るであろう。望丑しい連鎖は、しかしながら、この
ようなコードを有することは分析物中に存在する補体遺
伝子連鎖に干渉するものであるから、与えられた遺伝子
に対するコードは有しないであろう。 かくして例えばポリデオキシＧ，ボリデオキシＡ，ポリ
デオキシＧＴ，ポリデオキ：／ＧＡ，ポリデオキシＧＡ
Ｔ，ポリデオキシＧＴＡ，ｔたは他のいかなる複合（繰
返し）連鎖からなる連鎖のような分析物上の連鎖Ｋ対す
るコードを有ざずそして補体であシそうもない架橋体上
のポリヌクレオチド連鎖を選択することが望ましい。−
ポリヌクレオチトリの意味には、ポリリボヌクレオチド
、ポリデオキシリボヌクレオチドまたはいかなるポリー
プリン、ビリミジン、またはそれらの類似物およびそれ
らの結合が含まれる。 本発明において用いられる架橋体の特殊な例はポリヌク
レオチドとモノク四−ンまたはポリクローン抗体、蛋白
質抗原とポリヌクレオチド，サツカライドとポリヌクレ
オチド，小分子量有機化合物とポリヌクレオチド，レク
チンとポリヌクレオチド，受容体とポリヌクレオチド，
ポルモンとポリヌクレオチド，酵素阻害物質とポリヌク
レオチド，酵素補因子とポリヌクレオチド，およびこれ
らの組合せもしくは順列との共有結合されたものである
。 架橋体上の認識部分のポリヌクレオチド連鎖部分に対す
る分子比率は１：１であることを必要としない０認識部
分よシ以上のポリヌクレオチド連鎖部分が存在するかあ
るいはその逆もあるであろう。ポリヌクレオチド連鎖部
分の架橋体上の認識部分に対する比率は１よリも大きく
、例えば５，１０またはそれ以上である場合には、シス
テムは比率に等しい因子によって第１認識を増巾する。 本発明の好ましい架橋体には単一または二重らせん形状
をなすＤＮＡの環状ボリマーがある。単一らせん形状の
ものは例えばｆｄ，ｆｌおよびＭ１３のようないわゆる
線状ファージを含んでいる（ＶａｎＷｅｚｅｎｂｅｅｋ
，Ｐ−，Ｇｅｎｅ，１１：１２９（１９８０）参照）。 これら線状ファージはこれらの宿主を分離さぞない。む
しろこれらは細胞が生長と分化を続けるので感染した細
胞から解放される。 Ｍ１３は市場で人手可能であり（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅ
ｓｅａｒｃｈＬａｂｓ，Ｉｎｃ−），そしてクアーン化
および連鎖化システムとして広く用いられて来ている。 それはその中へいかなる所望のポリヌクレオチドグロー
ブ連鎖を取り入れるために、架橋体の認識部分としての
役目を果すために制限エンドヌクレアーゼ位置で切断さ
れることが出来る０同じ位置または異なった位置のいづ
れかで、該環状ＤＮＡは架橋体のポリヌクレオチド部分
と結合を開始して信号発信部分上の補体部分にアニーリ
ングすることが出来るようになる。この様式においては
ハイブリッド化による分析体上の遺伝子連鎖を認識する
ことが可能であ９、そしてまた他の連鎖を介して信号発
信体にアニーリングすることが可能である架橋体が得ら
れる（この種類の一般化システムは第２図に示される）
。 一つの特に好ましい実施例においては、該架橋体は与え
られた遺伝子（例えばＨｅｐａｔｉｔｉｓＢウィルス、
ＥＢｖ等のウィルスブローブ）に対する連鎖、およびポ
リマーの他の部分にはポリＧ，またはボＩＪＧＴ，また
はポＩＪｄＧ，またはポＩＪｄＣ，またはボリｄＣＡ，
’ｌ：たはポリｄＧｄＴボリヌクレオチド部分を担持す
るＤＮＡ’ボリマーからなる。 理想的には単一らせん形状をなすＤＮＡポリマーは信号
発信体へのア二一リング可能なポリヌクレオチド部分（
例えばポ！ＪｄＧＴ）を担持すること、そして１た使用
物がその中へいかなる所望のＤＮＡプローブも取υ入れ
ることが出来るような制限エンドヌクレアーゼ位置を担
持することをもたらすことが出来る。この様式において
は、いくらかの単一酵素的操作によって、該ＤＮＡポリ
マー架橋体は広い範囲の架橋体の中へ迅速に変転される
ことが出来る。本発明の信号発信体は架橋体上の補体部
分に対してアニーリングすることの出来るポリヌクレオ
チド部分および信号発信部分の両方を担持する必要があ
る。 信号発信体上のポリヌクレオチド部分は分子架橋体上の
補体部分と同じパラメーターによって定義される。架橋
体上の相当するポリヌクレオチドによる安定なポリヌク
レオチドノ＼イプリツドを形成することが出来る長さの
ものであるべきである。 本発明のこの部分において用いられるようなアニ−ＩＪ
ングは厳密な条件のいかなる与えられる一組の下におい
て、二つの補体ボリヌクレオチドらせんの間の要求され
る塩基対の結び付きを云う○この分野において一般に一
つの列において約１２から１３のヌクレオチドが安定な
アニーリングに対して必要とされる。かくして最小、連
鎖中のヌクレオチドの数は架橋体のポリヌクレオチド部
分に安定にアニーリングするために必要なだけにすべき
である。ハイグリソドの形成はハイブリッド化の後に続
くいかなる洗滌、流し出し、捷たは信号検出過程に対し
ても充分安定であるべきである。 該信号発信体の！信号発信“部分は事実上従来用いられ
ている信号発信システムおよび将来において開発される
べきいかなるシステムも含むことが出来る。それはそれ
自体信号を発信ずる部分（例えば放射性ラベル）、捷た
は更に反応または操作することによって信号を生ずる部
分（例えば酵素一結合システム）からなる。両方のクイ
ズ共、こＸではＮ信号発信”部分と呼ばれる。 かくして該信号発信部分は放射性ラベル（例えば１４Ｃ
，８２Ｐ，８Ｈ等）、酵素（例えばバーオキシダーゼ、
アルカリまたは酸ホスファターゼ等）、バクテリアラベ
ル、螢光ラベル、抗体（二重抗体システムにおいて用い
られるであろう）、抗体（ラベルされている抗体と共に
用いられるべきである）、ビオチンのような低分子（ア
ビジン、ストレブトアピジン、またはアンチピオチンシ
スラムと共に用いられるべきである，、ラテックス粒子
（浮揚力１たはラテソクス膠着システムにおいて用いら
れるべきである）、フエリチンのような高電子密度化合
物（電子顕微鏡検査において用いられるべきである）、
捷たぱそれらの組み合せーまたは順列からなるであろう
。 例えば、も（〜信号発信休の信号発信部分が抗原である
場合、信号は該抗原と一つの抗休／酵素結合体との複合
、その後の酵素基質の添加によって発信させることが出
来る。もし信号発信体の信号発信部分が抗体であったな
らば、信号は抗一抗体゛または蛋白質Ａのような蛋白質
を結合しているＦＣの複合化によって発信させられるこ
とが出来、第２抗体寸たぱ蛋白質Ａは酵素に対になって
結合せられている。 望′１１−い信号発信部分にはビオチン／アビジンシス
テムにもとづくものがある。このシステムは種々の手段
によって信号の中へ取り入れられることが出来る。例え
ば、該信号発信体のポリヌクレオチド部分はチトクロー
ムＣ架橋を介してビオチンに共有結合することが出来る
（Ｍａｎｎｉｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６
：１３６４〜１３７０（１９７７），Ｍａｎｎｉｎｇ等
、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，５３：ＬＯ７＝−１１７（１
９７５）ｙＳｏｄｊａ，Ａ−）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓＲｅｓｅａｒｃｈ，５：３８５〜４０１（１９７８）
Ｌまたは該ビオチンは固有ヌクレオチド残基の中へ共有
結合物に取り入れられることが出来る（Ｌａｎｇｅｒ，
Ｐ−Ｒ−，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉ
ｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ
，７８：６６３３＝６６３７（１９８１），また該ビオ
チンはジアミン（例えばベンタンジアミン）によってポ
リヌクレオチドに結合されることが出来る（Ｂｒｏｋｅ
ｒ，Ｔ−Ｒ−等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａ
ｒｃｈ，５：３６３〜３８４（１９７８））。 信号発信部分におけるビオチン分子とアビジン、ストレ
プトアビジン丑たは抗ビオテン抗体との相互作用はその
後行なわれ、アビジン，ストレプトアビジンまたは抗体
がラテックス粒子（Ｓｏｄｊａ，Ａ．等、上記、または
Ｍａｎｎｉｎｇ等、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，上記）、７
エリチン（Ｂｒｏｋｅｒ，上記）、フルオレセインのよ
うな螢光物質、酵素等のような信号発信成分と対になっ
て結合される。 ビオチン／アビジン基盤および非ビオチン／アピジン基
盤の両方の種々力非放射性信号発信システムの完全な記
述は二つの現在継続中の特許出願において見出すことが
出来る。（Ｗａｒｄ等による１９８１年４月１７Ｆ３米
国特許庁出願の米国特許出願第２５５，２２３号ｌＶＭ
ｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＭｅｔｈ
ｏｄｓｏｆＰｒｅｐａｒｉｎｇａｎｄＵｓｉｎｇＳａｍ
ｅ”，およびＥｎｇｅｌｈａｒｄｔ等による１９８２年
６月２３日米国特許庁出願の米国特許出願第３９１，４
４０号’ＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｏｆＰｒｅｐａｒｉｎｇａｎｄＵｔｉｌｉ
ｊｉｎｇ，ａｎｄＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓＣｏｎｔａ
ｉｎｉｎｇｔｈｅＳａｍｅ“）そしてこの特許出願の両
方ともこ＼に参照によって完全に取り入れられている。 力ρうるに、該信号発信体の信号発信部分はいがなる方
法によっても化学的に変性または、人工的に改変されて
いるボリヌクレオチドであることを必要としない。ある
生物学的システムはこのシステムによって利用され得る
生体内変性を行なうものである。このようなシステムの
ーっ（ｄＥ．ｃｏＬｉにおいて成長せしめられたファー
ジＴ４である。 Ｔ４ＤＮΔはグリコシル化されてぃるＣ残基の非常に高
い含有量を有する。低度複雑性繰返しポリヌクレオチド
連鎖（クローン）をファージＴ４の中へ挿入することは
可能である。その後、このファージ（は宿主において自
然に繁殖せられそしてグリコシル化せられるつウィルス
ＤＮＡｕＥ．ｃｏｌｉから単離せられそして架橋部分上
の補体連鎖に結合ぜしめられる。検出はその後、レクチ
ン／酵素シスデ．ｚｙ，ｉたはレクチン／螢光染料，甘
たはレクチン／高電子密度物質，１たはレクチン／放射
性ラベルを介してＴ４ＤＮＡ上の自然クルコース残基を
投錨点として用いて達成せられることが出来る。例えば
Ｔ２ｒ’１６ｒ′？ｆ．たはＴ８のような他のＴ（均等
）ファージがまた用いられる。 信号発信部分の数は該信号発信体上のポリヌクレオチド
部分の数と化学量論的に１：ｌである必要はない。該信
号発信体の信号発信部分におけるポリヌクレオチド部分
に対する信号発信部分の比が１よシも大きな時（例えば
５または１０より大きい時）、該システムは増巾システ
ムとして作用している。かくして例えばもし信号発信体
においてポリヌクレオチド部分に対して１０の信号発信
部分が存在するならば、架橋体をおおって１０：１信号
増中が得られる。もし、加うるに、架橋体がそれ自体信
号増巾システムを有するならば、即ち架橋体上の認識部
分に対するポリヌクレオチドの比率が１よシも大きいな
らば、すべての信号増巾システムは両方の比率の積であ
る。このことは分析物の水準で発生するすべての第１認
識事象に対して増巾が迅速に増大して非常に鋭敏なシス
テムを導びくことを意味している。この因子はシステム
構成要素の設計によって容易に制御され得る０調製の手
順 前述したように該架橋体は認識部分とポリヌクレオチド
部分とからなることが必要である。該信号発信体はポリ
ヌクレオチド部分および信号発信部分を必要とする。か
くして一般には、該システムにおいて個々の成分の調製
方法はポリヌクレオチドまたは個々の成分の１）蛋白質
部分、２）サツカライド部分、３）他のポリヌクレオチ
ド部分、４ノ低分子量化合物（例えば分子量約１０００
以下のり、５）放射性ラベル、または６）例えばバクテ
リア粒子またはラテックス粒子のような不溶性相に対す
る共有結合
検出システムを利用する分析物の免疫検定および核酸検
定の両者を含む検定に関するものである。 生物学的および非生物学的試料における物質の微爪の分
析および検出は全世界の臨床および分析研究所における
日常の業務になっている。大ざっぱに言えば、分析手法
は配位子一受容体相互作用にもとづくもの（即ち免疫検
定にもとづいた手法）、および核酸ハイブリッド化にも
とづくもの（ポリヌクレオチド連鎖にもとづく手法）と
に分けられることが出来る。 例えば、免疫検定手法は手順中のあるステージまたはス
テップにおいて、抗体結合位置とこれに対する補体とな
る抗原との間の非共有結合を含むものである（例えば、
Ｔ．Ｃｈａｒｄ著ＩＩＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔ
ｏＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙａｎｄＲｅｌａｔ
ｅｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ
ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅｒｄ
ａｍ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７８参照。 ）ポリヌクレオチド連鎖にもとづく手法において、方法
は、あるステップまたは他のステップにおいて、ハイブ
リノド化条件下に補体となる連鎖に対するポリヌクレオ
チド連鎖の非共有結合を含むものである（例えば、Ｆａ
ｌｋＯｗ他、米国特許第４，３５８，５３５号、Ｗａｈ
ｌ他、米国特許第４，３０２，２０４号、およびＨｅｉ
ｍｅｒ，米国特許第３，７５５，０８６号参照。） 一般に広められている動向においては、上記の手法は両
方共正確な分子配列や相互作用によって成し遂げられ、
そして非共有結合自由エネルギー（例えば水素結合、分
散結合、イオン結合、双極子結合等）の放出Ｋよってエ
ネルギー的に与えられる第１認識事象を含んでいる。該
第１認識事象に加えて、上記の手法は両方共、一つのス
テップまたは他のステップにおいて、信号を発する事象
を含むものである。このステップまたは事象は、人手ま
たは装置検出システムに対するいくらかの証明出来る方
法において、第１認識事象を検出する必要性に関するも
のである。 信号発信は主として二つの広い分野、放射能および非放
射能手法に集中する。 放射能信号はシステムにおいて例えばＰ，１３１１，１
４Ｃ，８Ｈ等の原子による一つまたはそれ以上の放射性
ラベル付けに依存する０検出は通常放射性検出体による
。非放射性手法はこれらが放射能を含まず、かくしてこ
のような手法をよシ安全に、よシきれいに、そして貯蔵
に対してより安定にせしめるのでこの数年の間にますま
す使われるようになった。これらは放射性ラベル手法と
同程度な高い感度を持つように発展されて来た。 現在用いられている最も一般的な非放射性信号発信手法
には酵素結合された免疫検定（例えばＳｃｈｕｕｒｓ，
Ａ．Ｉ｛−他、ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ
，ｓｉ：１〜４０（１９７７））ｔ螢光（Ｂａｕｍａｎ
等、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，８４：１〜１８（１９８１
）），間接免疫螢光（Ｒｕｄｋｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，
２６５：４７２〜４７３（１９７７）），７ヒジンービ
オチン相互作用（Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｊ．等、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，１６：１３６５〜１３７０（１９７７
））ｙ例えばフェリチンのような高電子密度核の電子顕
微鏡検査（Ｂｒｏｋｅｒ，Ｔ．Ｒ．等、Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，５：３６３〜３８４（１
９７８）），ラテックス接触（Ｓｏｄｊａ，Ａ．，前掲
、３５：３８５〜４０１（１９７８）），上記手法の組
合せ、そしてその他のものがある。 第１認識事象と信号発信事象は直接または間接Ｋ、比例
的Ｋまたは逆比例的に相互に関係付けられることを必要
とする。かくして放射性ラベルされたブローブとの核酸
のハイブリノド化のようなシステムにおいて、放射能の
量は通常存在する分析物の量に直接比例する。検出され
るラベルを付された第２抗体の量が正常には試料中に存
在する抗原の量に直接比例するサンドイッチ免疫検定の
ようなシステムでは同様なことが云える。逆比例手法は
例えば検出される信号の量が試料中に存在する分析物の
量が増えると減少する競合免疫検定を含む。 従来技術はまた信号発信事象が１：１よシも大きな比率
で第１認識事象と関連する増巾手法を利用して来た。か
くして、検定の信号発信成分は各認識成分に対してｌＯ
：１の比率で存在するであろう。 ポリヌクレオチド連鎖にもとづく認識システムの広汎な
多用性はなされるべき実験と研究を広範囲に拡大する。 この多用性は補体ヌクレオチド塩基相互の正確な配列、
チミジン（１）に対して配列するアデニン（４）および
シチジン（ｃ）に配列するグアニン、によってもたらさ
れるものである。との相補性が与えられれば無限に多方
面にわたるシステムを提供するためにいかなる所望の連
鎖を利用することも可能になる。 ポリヌクレオチド相互作用にもとづくシステムのよ９広
汎な用途に対する障害の一つは、しかしながら、信号発
信または報告グループ（例えば放射性燐、または酵素、
またはビオチン等）をボリマー鎖中の個々のヌクレオチ
ド残基に結合する必要性があったことである。この要求
から少くとも二つの問題が生ずる。 第１はポリヌクレオチドポリマーの変性に含まれる化学
反応条件が一般的にとシわけいかなる１つの核酸を充分
に選択するためには激し過ぎることである。例えば、ケ
トキザールまたはグリオキザールのようなジカルボニル
試薬はグアニンと無差別に反応するであろう。（例えば
、Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｒ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，５：２７９９−２８０７（１９６６ＬＬｘｔｔ，Ｍ．
ｔ前掲、８：３２４９−３２５３（１９６９），または
ＰｏｌｉｔｚｙＳ．’Ｍ．等、前掲、２０：３７２−３
７８（１９８１））参照。）かくしてもしジカルボニル
基盤の架橋剤が酵素１たは低分子信号発信成分を直接ポ
リヌクレオチド鎖に結合するために用いられるならば鎖
中のすべてのグアニン残基の可成シの量が変性する危険
性があるであろう（実際このようなことはある）。 このことは認識ステップにおいてこのような変性された
鎖の使用を甚大に妨ける。この問題は従来技術において
、個々の変性されたヌクレオチド（予じめ非水素結合分
裂方法で変性された）を発生期のポリヌクレオチド鎖の
中への酵素的な（ＤＮＡポリメラーゼを基盤とする）取
シ入れの使用によって解決されていた。しかしながら、
最終ポリヌクレオチドそれ自体についての化学的変性手
法を利用することが望ましい。 第２の問題は信号発信グループをポリヌクレオチドに結
合することに関連し、第１の問題にいくぶんかは関係し
ている。該問題は、ポリマー中へのこれら酵素的取シ入
れに先立って時には非常に複雑なそして手のこんだ合成
技術による合成の必要性にもとづくものである。かくし
て放射性ラベルされたヌクレオテドまたはビオチンラベ
ルされたヌクレオチドは独立して合成さｎることになる
。 更に最終核酸ボリマ〜中への化学的に変性されたヌクレ
オチドの結合量は才だ分析物上の与えられた連鎖を認識
するためのグローブの能力に影響する。これはもし信号
発信グループが認識グループＫ犬巾に数でまさっている
増巾手法が利用されるならば特に重要である。それ故に
容易に調整され、化学的変性に対して酵素にもとづく反
応よりもむしろ制御しやすい成分を利用し、ポリヌクレ
オチドにもとづく連鎖の広汎な多用性を利用し、そして
信号増巾方法の可能性を含む検定システムを開発するこ
とは非常に有用である。 本発明はポリヌクレオチド連鎖認識を利用する一般的な
検定システムを提供するものであシ、該検定システムは
化学的変性反応の使用を可能とし、またいかなるタイプ
の非結合相互作用にもとず〈認識事象を利用することが
出来、そして有効な信号発信方法の無数のうちのいかな
るものも用いることが出来るものである。 不発明の手順は （１）分析物（４）上の分子的認識可能部分を認識する
ことが出来る部分、および （ト）ポリヌクレオチド連鎖からなる部分、を有する分
子架橋体（６） および （１）該架橋体の該ポリヌクレオチド部分にアニーリン
グすることが出来、それによって安定なポリヌクレオチ
ドハイブリッドを形成するポリヌクレオチド部分、およ
び （り信号発信部分 を有する信号発信体（０ を提供すること、 および （１）該分子的認識可能部分を介して複合化されている
該分析物囚 （２）該架橋体（Ｂ）の認識部分、（該架橋体の）は該
ポリヌクレオチド部分を介して複合化されている）。 （３）該信号発信体Ｃ）のポリヌクレオチド部分から々
る複合体を形成すること、 および 該複合体中に存在する該信号発信部分によシ信号を検出
すること、 からなる分子的認識可能部分を有する分析物（８）を試
料中で検出する方法よりなるものである。 上記手順に加えて本発明は例えば種々な分子架橋体や種
々な信号発信体のようなそれに用いられるぺ＠種々の要
素や成分を該架橋体や発信体からなるキットや該手順に
用いられる他の成分と同様に提供するものである。 本質において、本発明は多重成分検定システムの認識部
分および信号発信部分がシステムの異なった成分上に存
在し、それによってそれらを分離しそして認識部分上の
信号発信部分の妨害を防止するべきであると云う理解に
もとすいている。この多重成分体への分離はまた認識成
分に影響することなくして成分の一つに化学的変性手法
によって結合せしめることを可能にする。 該手順、システム、および成分の用途は限定されるもの
ではなく、そして一般的にいかなる試料中の認識するこ
とが出来るいかなる分析物の検出のみならず従来の検定
手法が適用されてきた用途のすべてを含むものである。 本発明の明細書および特許請求の範囲において用いられ
る蟻分析物“なる言葉は検出されるべき、そして所望な
れば定量されるべき単一物もしくは混合物におけるいか
なる物質または複数の物質を含むものである。該分析物
は小さなまたは高分子量の分子、分子複合体、または例
えばウィルス、細胞、または細胞群のような生物系であ
ろう。一般的な分析物としては蛋白質、ポリサンカライ
ド、リボボリサッカライド、蛋白質複合体、核酸または
そのセグメント、単一らせん形状または二重らせん形状
のいづれか、例えばコアーまたはカプシド、種々の異な
ったタイプのバクテリア、組織細胞等のようなすべての
ウィルスまたはウィルス成分がある。最も一般的な蛋白
質には構造蛋白質、酵素、免疫グロブリン、またはその
断片がある。 最も一般的な核酸は例えばｔＲＮＡ，ｍＲＮＡ，ｒＲＮ
Ａ等の種々の異なったタイプのＤＮＡおよびＲＮＡがあ
る。バクテリアは全体、または細胞壁または他の認識可
能部分のようなその断片としてグラム陽性およびグラム
陰性バクテリアを含む。 菌、藻類および他の亜顕微鏡的微生物はまた動物（例え
ば啼乳類）細胞と同様に含まれる。 該分析物は分子的に認識可能な部分をその上に有するべ
きである。この相はシステム中の架橋体上の補体分子部
分によって認識されることの出来る分析物のいかなる分
子部分をも示すものである。 分子認識は当業者には理解されているように、２つの分
子の補体部分の間の３″：）の次元中の非共有結合を含
む。ある分析物上の分子的認識可能部分には、例えばＲ
ＮＡまたはＤＮＡのようなその補体連鎖によって認識さ
れるべきポリヌクレオチド連鎖；その対応するモノクロ
ーンまたはポリクローン抗体Ｋよって認識されるべき抗
原部分；その対応する抗原によって認識されるべき抗体
部分；その糖によって認識されるべきレクチン部分、そ
のレクチンＫよって認識されるべき糖部分、その受容体
によって認識されるべきホルモン部分：そのホルモンに
よって認識されるべき受容体部分；その酵素によって認
識されるべき阻害物質部分；その阻害物質部分によって
認識されるべき酵素部分；補因子酵素結合位置によって
認識されるべき補因子部分；その補因子によって認識さ
れるべき位置部分を結合しだ補因子酵素；その基質によ
って認識される結合配位子およびその逆（例えばピオチ
ンーアビジン）：またはいかなるそれらの順列および組
合せがある。 最も一般的な分子的認識可能部分には、多くの異なった
種類の抗原においての三次元的蛋白質配列、種々の細胞
中に存在する細胞壁構造、または生物のＤＮＡまたはＲ
ＮＡ中に存在する核酸連鎖がある。 該システムの第２の成分は亀架橋体″である。 この架橋体は分析物上の分子的認識可能部分を認識する
ことの出来る第１部分と、そしてポリヌクレオチド連鎖
からなる第２部分のみを含むことを必要とする。該架橋
体のこれら２つの部分は同じタイプ（即ち異なったもの
とは云えどもその両方共がポリヌクレオチド連鎖）また
は異なったタイプ（例えば一つが抗体部分であり、他が
ポリヌクレオチド部分である）のものであろう。 分析物上の分子的認識可能部分を認識するととが出来る
架橋体の部分は分析物上の認識可能部分の補体である分
子または分子断片を含まねばならない。それ故にもし分
析物がポリヌクレオチド連鎖を含んでいるならば、該架
橋体の認識部分は補体ボリヌクレオチド連鎖または気グ
ローブ〃であるべきである。もし分析物上の分子的認識
可能部分が広く一般に使用されている抗原であれば、該
架橋体上の認識部分はそれに対する抗体である。 糖／レクチン，受容体／ホルモン，阻害物質／酵素等の
前記された補体対に関しても同様々ことが云える。 該分子架橋体の第２部分は一つのポリヌクレオチド連鎖
からなる。該ポリヌクレオチド連鎖は、与えられた厳重
な条件下で補体連鎖との安定なアニーリングを与えるに
充分でおること、それが信号発信体上のポリヌクレオチ
ド連鎖の補体となること、そしてもし該架橋体上の認識
部分がそれ自体ポリヌクレオチド鎖であるならば、分析
物連鎖と架橋体上の第２ポリヌクレオチド部分との間の
ハイブリッド形成を避けるためにそれが該認識連鎖部分
から充分に相違することが備えられたいがなる選択され
た連鎖ともするこ七が出来る。該三つの条件の後者は悪
い結果を生ずる付随物によって分子混同を防ぐことが必
要である。 架橋体上の第２部分ポリヌクレオチド連鎖（即ち信号発
信体上の連鎖に対する一つの補体）は一つもしくは複数
の特殊遺伝子生成物に対するコードを有するか、または
遺伝子生成物に対するコードを全く有しなめであろう。 かくしていかなる構造遺伝子またはその部分も架．僑体
上のポリヌクレオチド連鎖部分として用いられることが
出来るであろう。望丑しい連鎖は、しかしながら、この
ようなコードを有することは分析物中に存在する補体遺
伝子連鎖に干渉するものであるから、与えられた遺伝子
に対するコードは有しないであろう。 かくして例えばポリデオキシＧ，ボリデオキシＡ，ポリ
デオキシＧＴ，ポリデオキ：／ＧＡ，ポリデオキシＧＡ
Ｔ，ポリデオキシＧＴＡ，ｔたは他のいかなる複合（繰
返し）連鎖からなる連鎖のような分析物上の連鎖Ｋ対す
るコードを有ざずそして補体であシそうもない架橋体上
のポリヌクレオチド連鎖を選択することが望ましい。−
ポリヌクレオチトリの意味には、ポリリボヌクレオチド
、ポリデオキシリボヌクレオチドまたはいかなるポリー
プリン、ビリミジン、またはそれらの類似物およびそれ
らの結合が含まれる。 本発明において用いられる架橋体の特殊な例はポリヌク
レオチドとモノク四−ンまたはポリクローン抗体、蛋白
質抗原とポリヌクレオチド，サツカライドとポリヌクレ
オチド，小分子量有機化合物とポリヌクレオチド，レク
チンとポリヌクレオチド，受容体とポリヌクレオチド，
ポルモンとポリヌクレオチド，酵素阻害物質とポリヌク
レオチド，酵素補因子とポリヌクレオチド，およびこれ
らの組合せもしくは順列との共有結合されたものである
。 架橋体上の認識部分のポリヌクレオチド連鎖部分に対す
る分子比率は１：１であることを必要としない０認識部
分よシ以上のポリヌクレオチド連鎖部分が存在するかあ
るいはその逆もあるであろう。ポリヌクレオチド連鎖部
分の架橋体上の認識部分に対する比率は１よリも大きく
、例えば５，１０またはそれ以上である場合には、シス
テムは比率に等しい因子によって第１認識を増巾する。 本発明の好ましい架橋体には単一または二重らせん形状
をなすＤＮＡの環状ボリマーがある。単一らせん形状の
ものは例えばｆｄ，ｆｌおよびＭ１３のようないわゆる
線状ファージを含んでいる（ＶａｎＷｅｚｅｎｂｅｅｋ
，Ｐ−，Ｇｅｎｅ，１１：１２９（１９８０）参照）。 これら線状ファージはこれらの宿主を分離さぞない。む
しろこれらは細胞が生長と分化を続けるので感染した細
胞から解放される。 Ｍ１３は市場で人手可能であり（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅ
ｓｅａｒｃｈＬａｂｓ，Ｉｎｃ−），そしてクアーン化
および連鎖化システムとして広く用いられて来ている。 それはその中へいかなる所望のポリヌクレオチドグロー
ブ連鎖を取り入れるために、架橋体の認識部分としての
役目を果すために制限エンドヌクレアーゼ位置で切断さ
れることが出来る０同じ位置または異なった位置のいづ
れかで、該環状ＤＮＡは架橋体のポリヌクレオチド部分
と結合を開始して信号発信部分上の補体部分にアニーリ
ングすることが出来るようになる。この様式においては
ハイブリッド化による分析体上の遺伝子連鎖を認識する
ことが可能であ９、そしてまた他の連鎖を介して信号発
信体にアニーリングすることが可能である架橋体が得ら
れる（この種類の一般化システムは第２図に示される）
。 一つの特に好ましい実施例においては、該架橋体は与え
られた遺伝子（例えばＨｅｐａｔｉｔｉｓＢウィルス、
ＥＢｖ等のウィルスブローブ）に対する連鎖、およびポ
リマーの他の部分にはポリＧ，またはボＩＪＧＴ，また
はポＩＪｄＧ，またはポＩＪｄＣ，またはボリｄＣＡ，
’ｌ：たはポリｄＧｄＴボリヌクレオチド部分を担持す
るＤＮＡ’ボリマーからなる。 理想的には単一らせん形状をなすＤＮＡポリマーは信号
発信体へのア二一リング可能なポリヌクレオチド部分（
例えばポ！ＪｄＧＴ）を担持すること、そして１た使用
物がその中へいかなる所望のＤＮＡプローブも取υ入れ
ることが出来るような制限エンドヌクレアーゼ位置を担
持することをもたらすことが出来る。この様式において
は、いくらかの単一酵素的操作によって、該ＤＮＡポリ
マー架橋体は広い範囲の架橋体の中へ迅速に変転される
ことが出来る。本発明の信号発信体は架橋体上の補体部
分に対してアニーリングすることの出来るポリヌクレオ
チド部分および信号発信部分の両方を担持する必要があ
る。 信号発信体上のポリヌクレオチド部分は分子架橋体上の
補体部分と同じパラメーターによって定義される。架橋
体上の相当するポリヌクレオチドによる安定なポリヌク
レオチドノ＼イプリツドを形成することが出来る長さの
ものであるべきである。 本発明のこの部分において用いられるようなアニ−ＩＪ
ングは厳密な条件のいかなる与えられる一組の下におい
て、二つの補体ボリヌクレオチドらせんの間の要求され
る塩基対の結び付きを云う○この分野において一般に一
つの列において約１２から１３のヌクレオチドが安定な
アニーリングに対して必要とされる。かくして最小、連
鎖中のヌクレオチドの数は架橋体のポリヌクレオチド部
分に安定にアニーリングするために必要なだけにすべき
である。ハイグリソドの形成はハイブリッド化の後に続
くいかなる洗滌、流し出し、捷たは信号検出過程に対し
ても充分安定であるべきである。 該信号発信体の！信号発信“部分は事実上従来用いられ
ている信号発信システムおよび将来において開発される
べきいかなるシステムも含むことが出来る。それはそれ
自体信号を発信ずる部分（例えば放射性ラベル）、捷た
は更に反応または操作することによって信号を生ずる部
分（例えば酵素一結合システム）からなる。両方のクイ
ズ共、こＸではＮ信号発信”部分と呼ばれる。 かくして該信号発信部分は放射性ラベル（例えば１４Ｃ
，８２Ｐ，８Ｈ等）、酵素（例えばバーオキシダーゼ、
アルカリまたは酸ホスファターゼ等）、バクテリアラベ
ル、螢光ラベル、抗体（二重抗体システムにおいて用い
られるであろう）、抗体（ラベルされている抗体と共に
用いられるべきである）、ビオチンのような低分子（ア
ビジン、ストレブトアピジン、またはアンチピオチンシ
スラムと共に用いられるべきである，、ラテックス粒子
（浮揚力１たはラテソクス膠着システムにおいて用いら
れるべきである）、フエリチンのような高電子密度化合
物（電子顕微鏡検査において用いられるべきである）、
捷たぱそれらの組み合せーまたは順列からなるであろう
。 例えば、も（〜信号発信休の信号発信部分が抗原である
場合、信号は該抗原と一つの抗休／酵素結合体との複合
、その後の酵素基質の添加によって発信させることが出
来る。もし信号発信体の信号発信部分が抗体であったな
らば、信号は抗一抗体゛または蛋白質Ａのような蛋白質
を結合しているＦＣの複合化によって発信させられるこ
とが出来、第２抗体寸たぱ蛋白質Ａは酵素に対になって
結合せられている。 望′１１−い信号発信部分にはビオチン／アビジンシス
テムにもとづくものがある。このシステムは種々の手段
によって信号の中へ取り入れられることが出来る。例え
ば、該信号発信体のポリヌクレオチド部分はチトクロー
ムＣ架橋を介してビオチンに共有結合することが出来る
（Ｍａｎｎｉｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６
：１３６４〜１３７０（１９７７），Ｍａｎｎｉｎｇ等
、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，５３：ＬＯ７＝−１１７（１
９７５）ｙＳｏｄｊａ，Ａ−）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓＲｅｓｅａｒｃｈ，５：３８５〜４０１（１９７８）
Ｌまたは該ビオチンは固有ヌクレオチド残基の中へ共有
結合物に取り入れられることが出来る（Ｌａｎｇｅｒ，
Ｐ−Ｒ−，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉ
ｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ
，７８：６６３３＝６６３７（１９８１），また該ビオ
チンはジアミン（例えばベンタンジアミン）によってポ
リヌクレオチドに結合されることが出来る（Ｂｒｏｋｅ
ｒ，Ｔ−Ｒ−等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａ
ｒｃｈ，５：３６３〜３８４（１９７８））。 信号発信部分におけるビオチン分子とアビジン、ストレ
プトアビジン丑たは抗ビオテン抗体との相互作用はその
後行なわれ、アビジン，ストレプトアビジンまたは抗体
がラテックス粒子（Ｓｏｄｊａ，Ａ．等、上記、または
Ｍａｎｎｉｎｇ等、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，上記）、７
エリチン（Ｂｒｏｋｅｒ，上記）、フルオレセインのよ
うな螢光物質、酵素等のような信号発信成分と対になっ
て結合される。 ビオチン／アビジン基盤および非ビオチン／アピジン基
盤の両方の種々力非放射性信号発信システムの完全な記
述は二つの現在継続中の特許出願において見出すことが
出来る。（Ｗａｒｄ等による１９８１年４月１７Ｆ３米
国特許庁出願の米国特許出願第２５５，２２３号ｌＶＭ
ｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＭｅｔｈ
ｏｄｓｏｆＰｒｅｐａｒｉｎｇａｎｄＵｓｉｎｇＳａｍ
ｅ”，およびＥｎｇｅｌｈａｒｄｔ等による１９８２年
６月２３日米国特許庁出願の米国特許出願第３９１，４
４０号’ＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｏｆＰｒｅｐａｒｉｎｇａｎｄＵｔｉｌｉ
ｊｉｎｇ，ａｎｄＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓＣｏｎｔａ
ｉｎｉｎｇｔｈｅＳａｍｅ“）そしてこの特許出願の両
方ともこ＼に参照によって完全に取り入れられている。 力ρうるに、該信号発信体の信号発信部分はいがなる方
法によっても化学的に変性または、人工的に改変されて
いるボリヌクレオチドであることを必要としない。ある
生物学的システムはこのシステムによって利用され得る
生体内変性を行なうものである。このようなシステムの
ーっ（ｄＥ．ｃｏＬｉにおいて成長せしめられたファー
ジＴ４である。 Ｔ４ＤＮΔはグリコシル化されてぃるＣ残基の非常に高
い含有量を有する。低度複雑性繰返しポリヌクレオチド
連鎖（クローン）をファージＴ４の中へ挿入することは
可能である。その後、このファージ（は宿主において自
然に繁殖せられそしてグリコシル化せられるつウィルス
ＤＮＡｕＥ．ｃｏｌｉから単離せられそして架橋部分上
の補体連鎖に結合ぜしめられる。検出はその後、レクチ
ン／酵素シスデ．ｚｙ，ｉたはレクチン／螢光染料，甘
たはレクチン／高電子密度物質，１たはレクチン／放射
性ラベルを介してＴ４ＤＮＡ上の自然クルコース残基を
投錨点として用いて達成せられることが出来る。例えば
Ｔ２ｒ’１６ｒ′？ｆ．たはＴ８のような他のＴ（均等
）ファージがまた用いられる。 信号発信部分の数は該信号発信体上のポリヌクレオチド
部分の数と化学量論的に１：ｌである必要はない。該信
号発信体の信号発信部分におけるポリヌクレオチド部分
に対する信号発信部分の比が１よシも大きな時（例えば
５または１０より大きい時）、該システムは増巾システ
ムとして作用している。かくして例えばもし信号発信体
においてポリヌクレオチド部分に対して１０の信号発信
部分が存在するならば、架橋体をおおって１０：１信号
増中が得られる。もし、加うるに、架橋体がそれ自体信
号増巾システムを有するならば、即ち架橋体上の認識部
分に対するポリヌクレオチドの比率が１よシも大きいな
らば、すべての信号増巾システムは両方の比率の積であ
る。このことは分析物の水準で発生するすべての第１認
識事象に対して増巾が迅速に増大して非常に鋭敏なシス
テムを導びくことを意味している。この因子はシステム
構成要素の設計によって容易に制御され得る０調製の手
順 前述したように該架橋体は認識部分とポリヌクレオチド
部分とからなることが必要である。該信号発信体はポリ
ヌクレオチド部分および信号発信部分を必要とする。か
くして一般には、該システムにおいて個々の成分の調製
方法はポリヌクレオチドまたは個々の成分の１）蛋白質
部分、２）サツカライド部分、３）他のポリヌクレオチ
ド部分、４ノ低分子量化合物（例えば分子量約１０００
以下のり、５）放射性ラベル、または６）例えばバクテ
リア粒子またはラテックス粒子のような不溶性相に対す
る共有結合
【関係するだろう。それ故、核酸のそれらの
相邑する一つまたは複数の相手との共有結合まだは対を
なす結合の中に含まれる化学はよく知られた技術の範囲
の中にある。 ポリヌクレオチド連鎖の蛋白質に対する共有結合はまた
文献中に充分記載されている。通常、該反応はカルポジ
イミド架橋（Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｍ．Ｋ−，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｉ，３７３（１９６６））によって、またはホル
ムアルデヒド（例えばＢｒｕｔｌａｇ，Ｄ．等、Ｅｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋８：３２１４〜３２１８（１９６
９），Ｍａｎｎｉｎｇ＋Ｊ−Ｅ．等、Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍａ，５３：１０７〜１１７（１９７５）をみよ）、（
４−アジド７エニール）グリオキザ−７レ（Ｐｏｌｉｔ
ｚ，Ｓ−Ｍ−，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０：３７
２〜３７８（１９８１）のような試薬の存在下の核酸に
対する蛋白質の架橋によってポリヌクレオチドの≠＄２
’，３’−ハイドロキシ末端の酸化、次いで１）蛋白質
のアミ７基とのシッフ塩基形成、そして１１）ボロハイ
ドライド反応（Ｓｏｄｊａ，Ａ．等、ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，５：３８５〜４０１（１９
７８））によって直接に行われる。他の方法はＤＮ八の
直接ブロム化（Ｊｏｎｅｓ，Ａ−Ｓ−，Ｎａｔｕｒｅ１
８３：１６０３（１９５９））それＫつづ〈ジアミノヘ
キサンとの反応（Ｌｏｗｅ，Ｃ．Ｒ．，Ｅｕｒ−Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ，７３：２６５〜２７４（１９７７））そ
して蛋白質カルボキシル官能基を介しての対になる結合
、またはシトシン部分の水銀化（．Ｄａｌｅ，Ｒ−Ｍ．
Ｋ．等、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７０：２２６３〜２２４２
，（１９７３）），それに続くハロゲン化（Ｄａｌｅ，
Ｒ−Ｍ．Ｋ．等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ−ｔ
２：９１’５〜９３０（１９７５’）Ｌジアミノヘキザ
ンとの反応そして蛋白質カルボキシル基との対になる結
合を含むものである。 特に興味があるのは、該信号発信体の調製において、グ
アニン塩基の化学変性のだめのジカルボニル試薬の使用
である。これは現在の多重成分検定システムの特に有用
な利点の一つを示す。もし信号発信体上のポリヌクレオ
チド部分が非常に低いＧ含量を有するならば、当のポリ
ヌクレオチド部分のア二一リング特性の非可逆変性のお
それなくして、該ポリヌクレオチド部分を例えばジヵル
ボニル化合物のような架橋剤を介していかなる物質とも
化学的Ｋ反応させることが可能である。このことはいか
なる小分子量分子のポリヌクレオチド部分とのジカルボ
ニル化合物または他の非識別架橋の使用による結合に対
して等しく好都合に適用されるものである。この手法は
個々のヌクレオチド残基を予かしめ変性しそしてその後
に酵素重合によってポリヌクレオチドらせんの中へこれ
らを取り入れると云うような労力と時間とを節約するも
のである。 ポリヌクレオチド連鎖のサツカライドに対する結合はＣ
ｒａｍｅｒ等、Ｃｈｅｍ，Ｂｅｒ９２：３８４〜３９１
（１９５９）によって行われることが出来る。２０以内
のサツカライド単位を有するサツカライドが望−ｈしい
。 ポリヌクレオチド連鎖の他のポリヌクレオチド連鎖に対
する結合は例えば短太な終端の結紮またはエンドヌクレ
アーゼ分解酵素によって生ずる結合力を有す末端の存在
にもとづく結紮を用いて、化学的または酵素的手法のい
づれかによって行なわれ得るｏＤＮＡ連鎖の相互分割お
よび結紮はＨｅｌｌｉｎｇおよびＬｏｍａｘ，’Ｔｈｅ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇｏｆＧｅｎｅｓ一Ｇ
ｅｎｅｒａｌＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ″，Ｃｈａｋｒａｂ
ａｒｔ）’による’ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ”の第１章、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９７８，Ｐａｇ
ｅｓ：Ｌ〜３０に詳細に述べられている。 ポリヌクレオチドのポリヌクレオチドに対する結合のた
めの他の方法はＳＳＤｎａ＋ＲｉｂｏｄＵＴＰ十末端ト
ランス７アラーゼ （Ｒｏｙｃｈｏｕｄｅｒｙ，Ｒ．＋Ｗｕ，Ｒ．，ｉｎＭ
ｅｔｈ．ｉｎＥｎｚ．，ＬＸＶ，４３，（１９８０））
；過ヨウ素酸塩酸化、■，６ジアミノヘキサン（１），
３−アミノグロビオン酸（２），またはビス（２−アミ
ノエタンチオール）（３）を含むアミン誘導体との還元
アミノ化（Ｐｅｒｉｋｅｈ，ＩＭａｃｈ，Ｓ，および（
？ｕａｔｒｅｃａｓａｓ，ｉｎＭｅｔｈ．ｉｎＥｎｚ．
ＸＸＸＩＶ，８２（１９７４）；マタハｃ（７）制限ク
ｏム化（水銀化を介して）（ＤａｌｅおよびＷａｒｄ上
記参照）そしてそれに続＜ＤＮＡの同様の試薬（（１）
，（２）＋（３））との反応を用いることを含む。 上記化合物（１）または（２）のＤＮＡ誘導体はこれに
続いて水溶性カルボジイミド誘導体を介して蛋白質と対
に結合される（Ｉｎｍａｎ，Ｊ．Ｋ−ｉｎＭｅｔｈｉｎ
Ｅｎｚ．，ＸＸＸＩＶ，５２〜５３，（１９７４））。 （３）の場合には、該蛋白質はブロモ酢酸のＮ−ハイド
ロキシサクシンイミドエステルによグて活性化され得る
。得られた活性化蛋白質は室温でチオール化核酸と共有
的に結合させることが出来る。 例えば８２Ｐのような放射性ラベルのＤＮＡ連鎖の中へ
の共有結合による取ｐ入れは例えば酵素重合による放射
性ラベルされているヌクレオチドの直接結合、遷移罎訳
等のような種々の方法のいつれによってもなされること
が出来る（Ｒｉｇｂｙ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１
３：２３７〜２５１（１９７７Ｌ）０ 例えば蛋白質／ラテックス結合体、蛋白質／フェリチン
結合体、抗体／酵素結合体、螢光物質／抗体結合体、ア
ビジン／酵素結合体等のような信号発信７ステムの個々
の要素の調製はこの技術分野ではよく知られておシそし
て以下の詳細な説明には記述されないであろう。 個々のポリヌクレオチド連鎖の特別な調製はまた当業者
にはよく知られている。例えば、もし一つのポリヌクレ
オチド連鎖が１つまたは複数の遺伝子からなっているな
らば、合成方法または逆トランスクリブターゼを用いて
ｍＲＮＡを逆転写して補体ＤＮＡを生ずることによって
それが調整され得る。もし該ポリヌクレオチド連鎖がい
かなるヌクレオチドのらせん（例えばボリｄＧまたはポ
リｄＣ）またはいかなるジヌクレオチド対（例えばポＩ
ＪｄＧＴ等）からなるものであれば、それは例えばＤＮ
Ａポリメラーゼを用いることによシ、また合成方法論に
よって容易に調整され得る。 使用方法 検出されるべき分析物は例えば血液、尿糞便、だ液、う
み、精液、血清、その他の組織、発酵肉汁、培地等の臨
床試料のようないかなる生物学的または非生物学的試料
中に存在し得る。もし必要でろれば、該分析物はその混
合成分から分析物の特別なタイプのものを濃縮するため
に知られた方法によって予；１抽出または精製される。 例えば、もし分析物が蛋白質または蛋白質含有フラクシ
ョンであれば、例えば塩沈澱、アルコール沈澱またはク
ロマトグラフのような蛋白質抽出方法が利用され得る。 もし分析物が同定されるべき核酸セグメントからなって
いれば、例えばフェノール抽出のような核酸抽出方法が
利用され得る。該分析物は、もしこのような場合もある
ならば精製されていない材料と共に、精製されながら該
混合物中で試験されることが出来、捷た特にそれが核酸
セグメントである場合には固定されることが出来る（例
えば、Ｗａｈ１等、米国特許出願４，３０２，２０４を
みよ）。 該分析物を含むと思われる細成物はある時間、分析物の
認識可能部分と架橋体上の認識部分との間の複合化を行
わしめるに充分な条件下で評置される。これらの条件は
分析物と架橋体の性質および量によって種々に変化する
。通常は複合化が起った後に、該試料は中性溶液で洗滌
して過剰の架橋体を除去する。これに代えて、このステ
ージでは洗滌を行わずに信号発信体は混合物に添加して
そして架橋体上のポリヌクレオチドらせんと信号発信体
上のそれとの間にア二一リングが起った後に洗滌が行わ
れる。該架橋体らせんの該信号発信らせんとのハイブリ
ノド化はハイブリッド化条件下でそして厳密な条件のい
かなる組み合せの下で行われる。最後の洗滌は信号の発
信に先立って必要であろう。 信号発信は信号発信システムの性質によっていづれかの
与えられた手法によって行なう。かくしてもし酵素結合
検定が利用されるならば、分析物架橋体そして信号発信
体間の三成分からなる複合体は酵素担持試薬（例えば酵
素／抗体結合体）と共に卿置せしめられ、そして基質は
発色のためにそこへ添加される。それに代えて、酵素は
信号発信体上のポリヌクレオチドらせんに直接に結合さ
れ、この場合には基質は直接に添加されてその後発色が
得られる６もし該信号発信体の信号発信部分がビオチン
部分であれば、アビジン，ストレブトアビジン：または
抗−ビオチン抗体のようなビオチン反応分子がそれに添
加される。該ピオチン反応分子は酵素，螢光化合物，高
電子密度化合物、捷たけ不溶性固体相と対になって結合
してそして検出が適当な方法で行われる。 本発明のシステムの応用は制限されない。試料中の検出
されそして分析されることが望まれるいかなる分析物に
も本発明の方法を行なうことが出来る。例えば該システ
ムは分析物中の認識可能部分および認識部分、および架
橋体の夫々いかなる種類のものを用いることによっても
微生物検出および同定のために用いられ有る。 特に興味あることは、ウィルスおよびバクテリアＤＮＡ
連鎖の検出および同定である。 該方法は遺伝的不調が併なわれるＤＮＡ遺伝子連鎖に対
するポリヌクレオチド補体を調整し、そしていづれかの
第１認識事象の存在を測定することによって遺伝的不調
の診断に利用することが出来る。これら遺伝的疾病とし
ては、例えば、サラセミアをあげることが出来る。ザラ
セミアの判定はオリゴヌクレオチドのゲノームＤＮＡに
対するハイブリッド化、それに続いて固有洗滌方法１た
は制限分析およびサザーン，ノーザーン１たはドソトプ
ロットによって（既知の遺伝欠陥に対して）ナ聖れるこ
とが出来る。 本発明のシステムに対する他の用途は染色体上に位置す
る特定の遺伝連鎖の一連に対して対をなす変性ポリヌク
レオチドの一連を用いること、そしてその後その上の第
１認識事象を測定することからなる染色体核型決定に存
する。 他の用途は架橋体中に存在するボルモン受容体結合成分
を受容体位置に結合すること、そしてその後本発明の信
号発信システムによって第１認識事象を測定することが
らなる細胞表面上のホルモン受容体位置の同定または位
置決定のだめの方法を含む。 他の用途は疑がいのある被検体の血液または血清中の例
えばＣＥＡ（悪性腫瘍の胚に対する抗原）のような癌に
関連する抗原の存在を検出することによる癌の診断から
なる。他の用途は本発明の手法によって正常受容体の不
存在を検出することによって悪性細胞を同定することが
らなる腫瘍捷たは癌細胞の同定捷たけ検出方法を含む。 他の用途は分子架橋体中の認識部分としてその代９に抗
原を用いることによって動物中のある伝染性疾病に対す
る抗体を検出する方法を含む。糖水準捷たは特異なグリ
コシル化されているヘモグロビン水準は分子架橋体上の
認識部分としてのレクチンを用いて糖尿病の判定をする
ことが出来る。 更に本発明の手順およびシステムに対する用途は分析物
の不溶化に存する。かくして、もし試料が分析物を含ん
でいると思われ、そして試料から該分析物を抽出および
精製することが望唸れるならば、該■信号発信体″は例
えば水性不溶性樹脂，ガラス，アクリレートまたはメタ
クリレートのようなグラスチノク，試験管内壁またはそ
の縦孔等の不溶性固体相に特別に結合することからなる
か、または結合する能力を有するように設計される。 該架橋体は固体相と共にＦ＃置され、かくして作られる
分析物のための認識位置（即ち親和性表面）はそれから
それに結合される。 本発明は検出および同定手順を行なうために必要な要素
の一つ捷たはそれ以上からなるキノト・の作成を容易に
与えるものである。かくして、キントは密閉部中に例え
ば試験管，小型びん，フラスコ２ボトル，シリンジ等の
一つまたはそれ以上の物入れ手段または一連の物入れ手
段をその中の密閉部中に受け入れるために区画された入
れ物からなるで多ろう。該物入れ手段または一連の物入
れ手段の第１のものは色々な種類の分析物のいずれかを
認識するための架橋体を含むであろう。第２物入れ手段
または一連の物入れ手段は信号発信体を含むであろう。 第３物入れ手段または一連の物入れ手段は結果が内析さ
れることが出来る標準曲線を作成することが出来るよう
にする分析物の予じめ検出された量を含むであろう。他
の物入れ千段捷たは一連の物入れ手段は例えば酵素結合
体，アピヂン結合体，フェリチン結合体，ラテックス結
合体，螢光物質結合体等の信号を発信するために必要な
要素を含むであろう。 望ましい実施例においては、該キット入れ物は予備検出
される連鎖のポリヌクレオチド部分と、分析物と関連さ
れている試験を行なうそして同定する遺伝連鎖のための
いくつかの遺伝子ブロープのいかなるものと結合するた
めに用いられ得るＤＮＡ上の制限位置または分割位置を
担持するＤＮＡである架橋システムからなる第１物入れ
手段を含む。この望ましいキノトにおける他の物入れ手
段は第１物入れ手段中に存在する該ＤＮＡ中に存在する
ポリヌクレオチド部分に対する補体となるポリヌクレオ
チド部分と、前記システムのうちのいづれかである信号
発信部分とを担持する信号発信体からなるであろう。こ
の望ましいキットにおける第３物入れ手段または一連の
物入れ手段は例えばウィルス，バクテリア，細胞等の一
つ件たはそれ以上のポリヌクレオチド含有分析物上に存
在する遺伝連鎖の補体となるＤＮＡグローブの秤々なも
のからなる。 かくして使用者は第１入れ物中のＤＮＡを開き、第３物
入れまたは一連の物入れの中に存在するいづれかの所望
のＤＮＡブローブをそれに取り入れ、ボリマーを結紮し
そしてその後分析物中に存在するいかなる所望の遺伝連
鎖の存在をも検出し同定するために該架橋体および信号
発信体を利用するための分割方法（例えば制限エンドヌ
クレアーゼの使用）を利用するであろう。単一らせんは
連結剤（該位置にか＼る）がそれに最初ハイブリッド化
され、それによってその位置において二重らせんが作成
されることなくして制限酵素によって切断されることは
出来ない。正常には遺伝子は微生物中で増巾され得るよ
うにＲＦ（二重らせん形状をなす）の中へ結紮されるで
あろう。 今一般的｛ｃ本発明を述べたが、同じことが実証のため
にのみここに含まれ限定する意図は全くない、もしそう
でない場合は明細に述べられるであろうある特別な実施
例に対する参考資料によって実証されるであろう。 実施例 実施例１〜３１は架橋および信号発信部分の調製の手順
に関するものである。該実施例は下記のカテゴリーに組
分けされるであろう調製方法を示す。 １）後続の蛋白質，サツカライドおよび低分子との対に
なる結合のためのオリゴヌクレオチドの化＃活性化。 ２）後続のＤＮＡ，サノカライドおよび低分子との対に
なる結合のための蛋白質の化学活性化。 ３）後続のＤＮＡ，蛋白質および低分子との対になる結
合のためのサツ力ライドの化学活性化。 ４）後続のＤＮＡと蛋白質との対になる結合のための低
分子の化学活性化。 ５）ＤＮＡの蛋白質，サノカライドおよび低分子との対
になる結合。 上記カテゴリーに組分けきれる実施例は下記の通りであ
る。 Ｉ）オリゴヌクレオチドの化学活性 Ａ，末端リボヌクレオチドラベル付けとそれに続く過ヨ
ウ素酸的酸化および還元アミン化による。実施例１１，
１２ｏ Ｂ．非固有ブロム化による：実施例２８，２９．３０ｏ Ｃ．５−ヨウドシトシンを介するシトシン部分の固有活
性化による．実施例１６．１７，１８ｏ Ｄ．３，４，５−｝リクロロジアゾベンゼンとの反応を
介するグアノシン部分の固有活性化による゛，実施例１
。 Ｅ．２．３−ジブロモグロパナールとの反応を介するア
デノシンおよびグアノシンー部分の固有活性化にょる：
実施例９０ ２）蛋白質の化学活性化 Ａ．プロモアセチル化による，実施例１３，１４０ ３）サツヵライドの活性化 Ａ，還元サソカライドの活性化にょる：実施例４，５，
’６ｏ Ｂ．非還元サツカライドの活性化にょる：実施例７，８
ｏ ４）低分子の活性化 Ａ．ビオチン：実施例２，３３，２３，２４，２５，２
６。 Ｂ−ＤＣＴＡ：実施例３ｏ ５）ＤＮＡと蛋白質，サツヵライド，および低分子との
対になる結合 Ａ．蛋白質への：実施例１．５，１９．２０ｏＢ．サソ
カライド：実施例１９．１８ｏＣ．低分子への．実施例
１９，１０，２１，２７。 実施例ｌ ＤＮＡのａ，４．６−１リクロロアニリンによる活性化
。 １００１１ｔ７）３，４．５−トリクロロアニリンは５
０％ＤＭＳＯ中の２．５ｍｌの０．５Ｍ｝ｉｃ＃中に溶
解されそして氷上で冷却され、激しい攪拌下で冷ＩＭ溶
液がらのＮａＮＯ２の等モル量が出来るだけ迅速に添加
せられ、そしてその後攪拌は１ｏ分間継続垢れた。３０
０Ｉｌｇの水中３Ｈ捷たけｆｄＤＮＡの１７が２Ｍカコ
ジル酸塩バノファ−ｐＩ｛６．６ノ３００１１（ｌと５
００ｄＤＭＳＯによ９混合せられた。（ＤＭＳＯの添加
にょシ溶液のｐ１■は８，３に上昇する）。２０μｌの
新たに調製されたジアゾニウム溶液がそれに添加されそ
して該混合物は室温で２時間＄＃置された。卿置の間に
現れる若干の沈澱は遠心分離で除去された。該溶液はそ
の後酢酸アンモニウムで０．４Ｍにされそして該ＤＮＡ
はエタノールで沈澱された０実施例１ａ トリクロロアニリンー活性化ＤＮＡのチオールとの反応
、ＤＣＴＡ−ＳＨとチオール活性マンノースとの反応の
例 ３，４．５−｝リクロロアニリンによって活性化された
Ｆｄ．ＤＮＡ（実施例１）は０．１Ｍカセイソーダと等
量のＣＩＩＭＫ２ＨＰＯ４中で溶解された。 この溶液は０．ｉＭＤＣＴＡ−ＳＲ（実施例３）または
チオール活性化マンノース（実施例６および９）の等量
で処理され、そしてアルゴン雰囲気で２時間６５℃で郷
置された。沈澱されたジサルフィドが遠心分離によって
除去されそして該ＤＮＡはＧ５０クロマトグラフィーＫ
よって精製されそして−２０℃て貯蔵された。誘導体化
されたＤＮＡを平均にするために放射性Ｎｉを用いて、
６０％のグアニンがラベルされていたことを測定した。 実施例２ ビオチン−ＳＨ ビオチンーＮＨＳエステルの３ミリモルは無水ＤＭＦの
ｚ５ｍｌ中に溶解されそして０．５Ｍ重炭酸ソーダの１
２ｄ中のシステアミンノ・イドロクロライドのＩＭ溶液
に混合され、そして該混合液は室温で一晩郷置された。 詳置の間に重い沈澱が生じた。該液体は４５℃、減圧下
で除去されそして残基は５０ｇｊアブソルートエタノー
ル中に懸濁され、１ｇのＮａＢＨ４が添加されそして該
懸濁液は７５℃１時間攪拌された。エタノールは除去さ
れそして冷ＩＭＭＣＩが添加されてｌ）Ｈ４，．５に調
節せられ、そして水は３５℃、減圧下で除去された。 （これら操作のすべてはチオールの酸化を防止するため
にアルゴン雰囲気下で行なわれた。固体残基は４ゴの冷
脱気された０．０１Ｍ酢酸の４ｔｎｌを加えて粉末化さ
れそして粉砕された。これらの手順は二回繰返されそし
て残基は凍結乾燥された。 ＴＬＣクロマトグラフ検定は主ビオチンスポノトはチオ
ールを含み、二つの小スボノトはチオール防性であるこ
とを示した。すべての反応において、ピオチンの量はチ
オール含有量にもとづいた。 実施例３ ＤＣＴＡ−ＳＨ ＤＣＴＡ−ブロマイドの１ミルモルが２，３−ジチオエ
チレンの０．２ｄをトリエチルアミンの０．５ｙｄｉ含
む５０％ＤＭＦ”の５ｍｌに添加された。 該混合物はアルゴン雰囲気下に２時間、６０〜７０℃で
梼置された。該溶液はそれから２０ゴの水と混合され、
９ｇ／ベッドボリュームのＤｏｗｅｘＡＧ−１カラム上
に負荷された。該カラムは流通液中Ｋチオールがなくな
るまで５０ｙｌの０．１Ｍ酢酸溶液で洗滌された。ＤＣ
ＴＡ−ＳＨはその後０．２５Ｍｎｃｌで流出された。チ
オール含有フラクションは合一せられ、蒸発せられて４
０１１１Ｃ減圧下で乾燥されそして遊離酸（ａｏｏｑ）
はアルゴン雰囲気で−２０℃で貯蔵された。 実施例４ １−０−メチル−６−０−｝シルーα−Ｄ−マンノピラ
ノシド 非還元サソカライドはトシレートを形成すること、そし
てそれをアンモニアで置換してアミン基を形成するかま
たはジオールで置換してチオール基を形成することによ
って第１級アルコール類を介して活性化せられた。この
実施例では、α−メチルーｄ−マンノシド、非遣元蔗糖
およびマンノースが還元糖として記載される。該トシル
化は刊行物に記載された手順と類似の方法で行われた（
Ｆ．Ｃｒａｍｅｒ等、Ｃｈｅｒｎ．Ｂｅｒ．９２，３８
４〜３９１（１９７９））。 ２３ｇのメチル−Ｄ−マンノシドが４００ゴのアブソリ
一一トビリジン中に溶解せられ、そして該溶液は氷一塩
混合物上で−１５℃に冷却せられた。８０ゴアブンリュ
ートビリジン中２４．６１のｐ−｝ルエンスルホン酸ク
ロライドの溶液が激しく攪拌されている混合液中に添加
されそして−１５℃、３０分間そして２０℃１２時間反
応せしめられた。ピリジンは４０℃、減圧下に除去され
そして残基はクロロホルム中に溶解された。該溶液は５
０’Ｃに加温されそして０．５Ｍ硫酸水素カリウムで連
続的に洗滌せられその後５０℃で０．５Ｍ重炭酸カリウ
ム溶液で洗滌された（ゲル形成を防止するために５０℃
代の温度が必要である）。 実施例５ ６−アミノーα−メチルーＤ−マンノシドハイドロクロ
ライド １３０Ｍｌのアブソリュートメタノール中の６ｇのトシ
レート（実施例４）の溶液は１℃で乾燥アンモニアによ
って飽和され、そして１６時間、１２０℃のオートクレ
ープ処理された。暗所反応生成物は木炭と共に還流され
そしてメタノールは蒸溜によって除去され若干黄色いシ
ロップが残った。該シロソグは水に溶解されそして置換
反応がア二オン変換体を通して溶液を通過することによ
って除去されている間スルホン酸塩が遊離される。 Ｈ（Ｊ？が流出液に添加せられてｐＩ｛５．０に調節さ
れ、そして水が減圧下４０ｔＥで除去される。残基はア
ブソリュートメタノールの１５ゴとアブソリュートエタ
ノールの１５ｙ＆の混合液とともに粉砕されそして該固
体物質は５０ｍｌのアプソリ一一トメクノール中に溶解
されそして冷却され、２５；ｔｔｌアプソリ一一トエー
テルの添加は結晶化を惹起こし、２．５ｙハイドロクロ
ライドを得た。 実施例６ Ｓ−（２−メルカプトエチル）−６−１−オーα一Ｄ−
メチル−マンノピラノシド ６ｇ（７）［｝シレート（実施例４）は２０ｉの新らし
く調製されたソジウムメトキサイドの溶液を含む２５０
ｇＪのアブソリ一一トメタノール中に溶解サれた。該混
合液に対して、５ｍｌの１、２エタンジチオ−ルが添加
された。該混合液は１２（１１０時間のオートクレープ
処理され、反応生成物は上記のようにして処理された。 収量は３１ｙであった。 実施例７ ２，３，４，６，テトラアセチルーα一Ｄ−マンノピラ
ノシルクロライド この化合物は刊行物に記載きれたと類似な方法で調製さ
れたｃ）（Ｄ．Ｈｏｒｔｏｎ，ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔ
ｈｅｓｉｓＶｏｌ４６，ｐ．１，ＷｉｌｌｅｙＮ．Ｙ．
１９６６）。 ２５ｇの乾燥マンノースは６０ｄのアセチルクロライド
に攪拌しつ＼ゆっくシ添加された。容器には還流コンデ
ンサーが接続されそして該混合液は室温で１６時間攪拌
される。クロロホルム、３００ｄ，がコンデンサーを通
して添加されそして該混合液は激しく攪拌しつつ３００
１ｊの氷と１００４の水の上へ注がれた。該混合物は別
なローｌｍうつされ、そして有機物相は出来るだけ迅速
に氷と３００ｍｌの飽和重炭酸ソーダ溶液を含むビーカ
ーの中へ注がれた。該有機物相は分離されそして無水硫
酸マグネシウムの２５９によって乾燥された。乾燥剤は
除去され乾燥アルコールフリークロロホルムで洗滌され
そして該結合クロロホルム溶液はロータリーエバポレー
ター中で減圧下３５ｘＪに濃縮された。５０℃でエーテ
ルが若干濁る寸で該溶液に添加され、該溶液は室温に放
置された。結晶はろ過によって除去されそして乾燥エー
テルで洗滌はれた。収量は３９ｇであった。 実施例８ Ｓ−（２−メノレカプトエチル冫ー１−β−Ｄ−マンノ
ピラノシルスルファイドおよヒＳ−（２−７ミノエチル
）−１−β一Ｄ−マンノピラノシルスル７アイド ６０ｓｌ無水ＤＭ−Ｆ中に１０ｆアセトクロロマンノー
ス（実施例７）の溶液に４ｙｄの１，２エタンジオール
または５ｇシステアミンハイドロクロライドおよび５ｇ
の粉末化炭酸ソーダがアルゴン雰囲気下、６時間、７０
℃で攪拌されている該懸濁液に添加された。該炭酸塩は
除去されそして該液体は減圧下４５℃で蒸発された。該
残基はアブンリュートメタノール中に溶解されそして新
らしく調節された０．１ＭソジウムメトキサイドがｐＨ
を８０に調節するために添加されそして該混合液は室温
で５時間攪拌された。２ゴの氷酢酸が添加せられそして
該溶液は減圧下に除去された。該残基は酢酸から再結晶
された。収量は３．１ｇであった。 実施例９ １，２ジブロモグロパナールによるＤＮＡの活性化 エーテル中のアクロレイン（１．７１ｉ’）の溶液が水
浴上で冷却されそして１．３ｍｌのプロムが次のプロム
添加までに色が消えるのを待ちながら攪拌下にゆっ〈や
添加された。エーテルが溶液にアルゴンを吹き込むこと
によって部分的に除去された。 以下の操作Ｋ用いられるＤＮＡはＤＭＦへの溶解を容易
にするためにトリエチルアンモニウム型にした。 ２５０ｌＩｅの水中の０．５ｑノ３Ｈｆｄ−ＤＮＡ（線
状）（部分的にトリチウム化される）が３．０ｄの７０
係エタノール中０．５Ｍ｝リエチルアンモニウムアセテ
ート、ｐＨ４．５と共に混合せられそして５０μｌのジ
プロモグロパナール溶液が添加された。該混合液は暗所
で３７℃、４０時間攪拌された。反応は螢光の発現によ
って監視された。 該反応混合液は減圧下に蒸発されて乾燥され、そして該
ＤＮＡは０．６ｍｌ水に溶解されそしてＧ５０濾過によ
って流出媒として水を用いて脱塩された。 放射能を含むフラクションは合一せられそして該容量は
０．２ゴに減小された。 実施例１０ ３，４．５−｝リクロロアニリンＤＮＡのＤＣＴＡ−Ｓ
Ｈによるラベル ０．２ｐｙｒｌの水中０．５ｑの該活性化きれたＤＮＡ
（実施例ｌ）が９０チＤＭＦ中２．０ｍｌの０．５Ｍト
リエチルアンモニウムアセテイトと混合されそしてトリ
エチルアンモニウム型のＤＣＴＡ−ＳＨの５０ｆ＋／が
添加された。該混合液は暗所で４時間、５０℃で攪拌さ
れた。該ＤＭＦは減圧下、４５ｔで除去されそして該Ｄ
ＮＡはＧ−５０濾過κよって脱塩された。ラベルの程度
はその後放射性Ｎｉ６３の使用によって測定された。計
算によれば平均して５．３塩基とと陀ラペルされていた
〇同様な手順がこれら物質（実施例２，６および８）の
チオ誘導体を用いて該活性化ＤＮＡのビオチン化および
グリコシル化のために用いられた。 ＤＮＡの化学的ラベル 原理 あるジアゾニウム塩とグアノ・ンンの対になる結合は８
位置では安定な着色生成物を与え（Ｈ．Ｆｉｓｃｈｅｒ
，Ｚ−Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，６０，６９６〜７
８（１９０９）），そして２位置では酸変性されやすい
黄色生成物を形成する（Ｈ．Ｋｏｓｓｅｌ，Ｚ−Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３４０，２１０，１９６５，Ｅ．
Ｎ．Ｍｏｕｄｒｉａｎａｋｉｓ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ−Ｂ
ｉｏｐｈ’ｌｓ．Ａｃｔａ１２３＋４２１（１９６６）
）。単一らせん形状の核酸中のグアノシン残基はジアゾ
ニウム塩と結合出来そしてこの反応は単一らせん形状の
核酸をセルロースに固定するために用いられて来た（Ｊ
．Ｃ．．Ａｌｗｉｎｅ等、Ｍｅｔｈｏｄ３ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８＋Ｔ’−２２０〜２４２．
１９７９）’）。もし該結合されたジアゾニウム化合物
がチオールまたはアミンによって容易に置換されること
が出来る活性基を含んでいるならば、これはビオチンま
たは他の基を単一らせん形状の核酸に結合するための容
易な方法を構成する。３，．４．５−トリクロロフエニ
ルジアゾニウムクロライドは本発明者等によってビオチ
ン、ＩＬ２−ジアミノシクロヘキサンーＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ
、一テトラ酢酸（ＤＣＴＡ）およびある種の糖宿壬加寺
単−らせん形状のＤＮＡに添加するために用いられて来
た物質である。 単一らせん形状の核酸をラベルするための他の可能性は
クロロアセチルアルデヒドはｐＨ４．５でアデニンと反
応して螢光ビニル誘導体を形成し（穏やかな条件下）、
Ｊ．Ｒ．Ｂａｒｒｉｏ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６，５９７〜６０４．
１９７２），シチジンはｐＨ３．５で反応しそしてグア
ニンはｐＨ６．５で反応するｏｐＨ４．５ではグアニジ
／は全く反応しない（Ｐ−Ｄ−Ｓａｔｔｓａｎｇｉ等、
Ｊ．Ｏｒｇ−Ｃｈｅｎｔ．，４２．３２９２〜３２９６
，（１９７７）。 クロロアセチルアルデヒドの代υに１，２ジプロモグロ
パナールを用いることによって、活性第１級プロム化物
と共に穏やかな反応条件下で、チオ−ルまた｛グアミン
誘導体と反応するＤＮＡを誘導化することが可能であシ
、ＤＮＡをラベルする他の方法全提供する。これら二つ
の方法は塩基固有性である。 実施例１１ ５′−ウリジンモノホスフェイｈ（ＵＭＰ’）の末端ト
ランスファラーゼおよび５′−ウリジントリホス７エイ
トによる線状３Ｈｆｄ−ＤＮＡに対する末端付加 Ｉｌｌｆｆｆａ合液ノ６００ｔｔｌｉｊ：４００μｉ／
ｔ７）ＤＮＡ，１ｍＭＣｏｃｋ２，０．２ｍＭジチオス
レイトール，０．ＩＭカコジル酸，２５ｍｍｏｌトリス
塩基，１ｍＭＵＴＰおｊ：び４００単依の末端トランス
７アラーゼを含む。該混合物の最終ｐＨは６．９〜７．
０であった。 該混合液は２時間、３５℃で評置された。該ＤＮＡはエ
タノールで沈澱されそして４００／７βの０．２Ｍ酢酸
ソーダｐＨ４、７に溶解された。 実施例１２ 末端リポ基の酸化と還元アミン化。アミノカルボキシお
よびチオー末端置換ＤＮＡの合成詳置混合液の４５０μ
βは、４００μｆの末端ラベル化されたＤＮＡ（実施例
１１）、０．２Ｍ酢酸ソーダｐＨ４．７および０．１Ｍ
ＮａＩＯ４を含む。 それは暗所で室温で２時間詳置されそして該混合液は０
．３Ｍホウ酸カリウムｐＨ９．０〜９．３中で平衡化さ
れたＧ５０カラムに通されて０．２ｄのフラクションが
集められた。すべての放射性フラクションは総量１．２
ゴに合一せられた。該ＤＮＡ溶液はアミン成分の１つ（
ε−アミノカプロン酸、システアミン、甘たは１，６−
ジアミノヘキサン、ｐＨ９．３に調節されたＩＭのスト
ノク溶液を用いる）によって０．４Ｍにされた。 得られたシソブ塩基は下記のようにＮａＢＨ４で還元で
れた。水（１ｌ）中１：０．２Ｍに新らしく溶解された
ＮａＢＨ４は３０分間隔で４つの部分に添加された。該
詳置は計３時間続けられた。塩と過剰のアミノ成分は１
ｍＭベーターメルカプトエタノールを含む０．４Ｍ酢酸
ソーダ中で平衡化され九カラム中のＧ５０濾過によって
除去され、該ＤＮＡ含有フラクションはその後合一せら
れ−７０℃でアルゴン雰囲気下に貯蔵された。使用前に
ＤＮＡｉｆ：エタノーノレで沈澱されそ１７て所望のパ
ソファーに溶解された。 実施例１３ フアモ酢酸Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドエステルの
活性化 ブロモ酢酸のＮＨＳ（Ｎ−ハイドロキシサクシンイミド
）エステルは下記の通りに調製された。 ブａモ酢酸ノｌ００ミ！Ｊモｌ（１８．９９）は５ｏｘ
ｔｌの無水ＤＭＦ中に溶解され、この溶液に対して１０
０ミリモル（２０．６ｆ）のＮ−Ｎジシクロへキシルカ
ルポジイミドが攪拌しつ＼添加せられ、次いで１００ミ
リモルのＮ−ハイドロキシサクシンイミド（１００％純
度として１１．９ｇに調節された）が添加せられ、そし
て該混合液は６時間３７℃で攪拌された。該混合液はそ
の後ハイドロキシ尿素の沈降を促進するために−２０℃
で２時間放置され、該沈澱は濾過によって除去された。 該濾過物において、ＤＩ’ｌ’ＩＦは減圧下４５℃で除
去されそして活性化エステルは２−グロバナールから再
結晶された。 実施例１４ ＩｇＧのグロモアセチル化 ０．．３ｍｏｌホウ酸パノフ７−ｐＨ９．９中のＩｇＧ
Ｍ２０巧／ｍｌ）が１）ＭＳＯ中のブロム酢酸（実施例
１３）のＮＨＳエステルの１０ｑ／ｚｌ溶液の０．０６
容量と混合された。該試料はその後０．１ＭＮａＣｊ？
０．１ｍｏｌ燐酸塩バノファ一ｐＨ７．５に対し７て透
析された。 実施例１５ ＤＮＡ−ＩｇＧ結合体の合成 ０．３Ｍホウ酸カリウムバッファ−中のプロモアセチル
化ＩｇＧ（実施例１４）の１．６ｑ／ｔｄは室温でアル
ゴン雰囲気下でチオ−置換された末端ラベルされたＤＮ
Ａ溶液（実施例１２）の３ｔｑ／ｐｄと共に２時間卿置
された。メルカプトエタノール０．０１Ｍがその後添加
されそして該混合物は更に同温度で２時間評置され未反
応プロム残基を除去された。該溶液はその後蛋白質Ａカ
ラム上で吸着ざれそして未結合ＤＮＡは１．０ＭＮａＣ
６によって流出された。該ＤＮＡ−ＩｇＧ結合体と該未
反応ＩｇＧはインチオシアナートによって流出されそし
て０．１Ｍ燐酸塩バッファ−，ｐＨ７に対して透析され
てインチオシアナートを除去された．、該結合ＩｇＧと
遊離ＩｇＧは硫酸アンモニア５ｏチでその後沈澱され、
ペレットはｉ．ｏｉ燐酸塩バッファ−中に溶解されそし
て遊離ＩｇＧは結合ＩｇＧから０．０１ＭＮａＣｌ，０
．１Ｍ燐酸塩ｐＨ７．２の中で平衡されたＢｉｏ−Ｇｅ
ｌｐ−３００カラム上で分別することによって分離され
た０ 実施例１６ ，ＢＲ３２２の水銀化 水銀酢酸（）ｕｐ，０．０１ミリモル）を含む５ｍＭ酢
酸ソーダｐＨ７．５のｌｍｌ中に溶解されたｐＢＲ３２
２ＤＮＡ（１００μｆ）はＤａｌｅ等の方法（Ｎｕｃｇ
．ＡｃｉｄＲｅｓ．２：９１５１９７５）によって５０
℃４時間反応された。５一シトシン水銀化ＤＮＡは完全
に０．０２Ｍ食塩２ｍＭＥＤＴＡを含む０．０１Ｍトリ
スＨＣｎ中で透析された。 実施例１７ 水銀化，ＢＲ３２２ＤＮＡのヨウ素化 １ｄ０．ＩＭ｝リスＨＣｌｊｐＨ７．５中の前実施例か
らの水銀化ＤＮＡへＤａｌｅ等の方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄＲｅｓ．２，９１５．１９７５）を用いて１ダのヨ
ウ素が添加された。２０℃２時間の反応の後ｉ１ＪＩ２
はクロロホルムで抽出されそしてヨウ素化逼れたＤＮＡ
は０．０２Ｍ食塩と２ｍＭＥＤＴＡを含む０．０１ｍト
リスＨ（Ｊ’に対して透析された。置換されたＤＮＡは
Ｎ．クラッサエンドヌクレアーゼ、蛇毒ホスホジエステ
ラーゼＤＮＡラーゼそしてＥ．ｃｏｌｔアルカリホスフ
ァターゼによる連続分解により分析された（Ｈ．Ｙａｍ
ａｓａｌｃｉ等ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３７：１３８９，
１．９７７）。該混合液はＤＥ−５２アミンセルロース
を介して流出され、そしてヌクレオチドは標準としてオ
ーセンティック５−ヨウドー２′−デオキシウリジンを
用いて逆相ＨＰＬＣによって分析された。 実施例１８ ５−ヨウドシトシンｐＢＲ３２２ＤＮＡのアミンとの反
応。１，６−ジアミノヘキサンとの反応の実施例 １ｄ０．ＩＭホウ酸ソーダ中に透析された前反応からの
ヨウド化ＤＮＡに１１６ｑ（１ミリモル）ジアミノヘキ
サンが添加された。該反応混合液はアルゴンで曝気せら
れそして１００℃２時間加熱された。該アミンヘキシル
置換ＤＮＡは完全に０．０１Ｍ｝リスＭＣＩｐＴ｛７．
５の中へ透析された。 アミノカプロン酸、ビス（２−アミノエタン）ジスルン
アイドおよび６−アミノーα−メチルーＤ−マンノ（実
施例５）に対する反応条件は本質的に同一である。 実施例１９ ■−エチル−３−ジイングロビルーアミノ力ルポジイミ
ド（ＥＤＡＣ）を用いたアミノおよびカルボキシー置換
核酸の蛋白質またはアミンへの対になる結合 １ｇ？０．ＯＩＭＮａＣ１ｐＨ７．５（ＨＣｆｆ）中１
溶解されているアミノーまたはーカルボキシー末端置換
ＤＮＡ（実施例１１）（５０μｌと３Ｈ−ラベルストレ
グトアピジン（５０μｆ！）に対してＳｑＥＤＡＣが添
加された、−１該反応物は暗所で２０時間詳置されそし
てＤＮＡは４ＭＣａＣＡ？２（０．０３πｌ）の添加に
よって沈澱せしめられた。ＤＮＡはＩＭｌ水中に再溶解
されそしてこの手順は未結合蛋白質を除去するために２
回以上繰返えされた。該蛋白質一結合ＤＮＡはイミノビ
オチンーセ７アローズ親和性カラム（Ｋ．Ｈｏｆｆｍａ
ｎ等、ＰＮＡＳ７７：４６６６，１９８０）中で親和性
精製された。 実施例２０ カルボキシへキシルー置換ＤＮＡのＮ−ハイドロキシサ
クシンイミド活性化および蛋白質またはアミンとの結合
、ストレグトアビジン結合ＤＮＡの実施例 カルボキシ末端置換ＤＮＡ（実施例１９）（５０μｙ）
はＤｏｗｅｘ５０−ＷＸ（Ｅｔ３Ｎ＋）と共に水溶液を
振盪テることによってトリエチルアンモニウム塩に変換
された。該溶液は凍結乾燥されそして該乾燥されたＤＮ
Ａはジンクロヘキシルカルボジイミド（１０．３ｑ，０
．０ｓモル）とＮ−ハイドロキシサクシンイミド（５−
８１Ｉｌｇ０．０５モルラが添加されている無水ジメチ
ルホルムアミド（０．５ｇＪ）中に溶解された。室温で
２０時間の詳置の後、該反応物は遠心分離されそして上
澄け２時間１０ｍＭＮａＣｊｌ？中へ透析された。０．
２Ｍホウ酸塩、ｐＩ｛８．５（Ｉｇ？）中に溶解されて
いるストレブトアピジン（５０μｇ）ぱＮ−ハイドロキ
シサクシンイミド活性化ＤＮＡに添加されそして該反応
物は２０時間卿置されそして０．０１ＭＮａＣｌの甲へ
透析された。該ストレブトアビジン結合ＤＮＡｔｒｌＣ
ａＣ（Ｊ２沈澱および前記されたと同様にイミノビオチ
ン親和性クロマトグラフによって精製された。 実施例２１ ＤＮＡのグリオキザ−ルとの反応 ＤＮＡ（１μｇ）（プラスミド，ＤＫ１４からのＢＡＭ
挿入）は０．０２５Ｍグリオキザール（０．２ｉｌ）中
に溶解されそして１００ｕ３０分密閉試験管中で加熱さ
れた。該反応物は１０ｍＭＮａＣβに対して透析された
。グアノシン上の反応の程度を評価するために、反応物
の一部分はＨＣＩで雨を１．０に低下させそして１００
℃で３０分加熱することによって酸デプリネーションを
受ける。該デプリネーションされたＤＮＡはＤＥ−５２
アミンセルロースを通しての流出によって除去されそし
て流出されたプリンは逆相上ＨＰＬＣによって分析され
た。アデノシン、グアノシンおよびグリオキザールーグ
アノシンアダクトのピーク高さの比較（Ｒ．Ｓｈａｐｉ
ｒｏ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ，５：２７９９，１９６６）は
７０チのグアノシンが置換されたことを示した。 実施例２２ Ｎ−ビオチニル−４−アミノーアセトフェノン２０ｍｌ
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解されたビオチ
ンーＮ−ハイドロキシサクシンイミドエステル（５０μ
Ｆ，０．０１４ミリモル）ノ溶液に５０ｄＤＭＦと１０
０毎ｔＯ．ＩＭホウ酸塩バッファ一ｐＨ８．５中に溶解
さルた４−アミノフェニルア宅トフェノン（４、３５／
！，０．０３モル）が添加された。室温で２０時間の反
応の後、該溶媒はロータリーエバボレーターで蒸発され
ることによって除去された。残基油状物質は先づ０．Ｉ
ＮＨＣｎですり砕かれその後５多重炭酸ソーダですシ砕
かれる。生成物はエタノールから結晶化せしめられる。 実施例２３ ビオチニル（４−アミノフェニル）グリオキザーノレ セレニウムジオキサイドＣ０．７５ｆ／，７ミリモル）
が０．１５ｙｘ７水を含む４ｄジオキサン中に溶解され
た。これへ５ｍｌジオキザン中に溶解芒れたＮ一ビオチ
ニル−４−アミノアセトフエノン（１。９＆，７暑リモ
ル）の溶液が滴加された。該反応物は３．５時間還流さ
れその後該混合液は濾過されそして真空下で濃縮された
。粗生成物はシリカゲルクロマトグラフによって精製さ
れた。 実施例２４ １，Ｎ−ビオチニル−１，６−ヘキサンジアミン ジメチルホルムアミド（５μｍ）中に溶解されているビ
オチンーＮ−ハイドロキシサクシンイミドエステル（１
．Ｏｆ，２．９ミリモル）が０．１Ｍホウ酸ソーダ（ｓ
ｏＯｉ）中ジアミノヘキサン（１．１５ｇ，ＩＯミＩＪ
モル）の溶液に添加された。 室温で５時間反応の後、該溶液はロータリーエバボレー
ターによって蒸発され、１０ゴ水中に再溶解されそして
Ｄｏｗｅｘ５０−ＷＸ（Ｈ＋）上でクロマトグラフにか
けられた。カラムは５０チメタノール水溶液で洗滌され
そして５０ｔｌｂメタノール水溶液（０．３Ｍ）中に溶
解しているトリエチルアミンを有する流出フラクション
が集められた。蒸発残基はエーテルで完全にすシ砕かれ
そしてＤ■゛／エーテルから再結晶させられた。 実施例２５ ＣＨ８−ＣＯ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−ビオチ
ン ２０ｓｌ無水ＤＭＦ中ピルビン酸Ｃ０．４４ｆ，５ミリ
モル）の４℃に冷却した溶液へイソブチルクロロホルム
化Ｃ０．６４１５ミリモル）およびトリーＮ−プチルア
ミン（１．４ａｙ，１．５ミリモル）が添加された。こ
の温度で２０分後、更に１．４ｙトリ−Ｎ−プチルアミ
ンが添加されそして該混合液は３０ゴＤＭＦと３０が７
０．１Ｍホウ酸ソーダ中に溶解された１，Ｎ−ビオチニ
ルーｌ，６−ヘキサンジアミン（実施例２４）の溶液に
添加された。４℃１時間の反応の後、該混合液は更に２
０時間室温で放置せられそして続いて真空中で濃縮され
た。該混合液はシリカゲル上クロマトグラフによって精
製されそして生成物はエタノールから再結晶された。 実施例２６ ＣＨＯ−Ｃｏ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−ビオチ
ン セレニウムジオキサイド（５４７ｎＱ，０．５ミリモル
）が２５μβ水を含むジオキサン（０．５ｄ）中に溶解
された。ｌｘｔｌジオキサン中に溶解されたＣＨ３−Ｃ
ｏ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）６−Ｎｕ−ビオチン（実施例
２５）（０．２１ｇ０．５ミリモル）が滴加されそして
該反応物は１００ｔＣ４時間加熱された。得られた沈澱
は遠心分離によって取除かれジオキサンで洗滌せられそ
して上澄は真空で濃縮された。該粗混合物はシリカゲル
上でクロマトグラフにかけられた。 実施例２７ ＤＮＡのビオチン化グリオキザール誘導体との反応 トリエチルアンモニウム塩としてのＤＮＡ（１μｙ）が
１００μｅ水に溶解された。これに対してジメチルホル
ムアミド中（Ｎ−ビオチニル（４ーアミノフェニル））
グリオキザール（０．０５Ｍ）またはＣＨＯ−Ｃｏ−Ｃ
ＯＮＨ−（ＣＭ２）６−ＮＨ−ビオチン（０．０５Ｍ冫
の溶液のｉｏｏｔｔｇが添加された。該混合液は密閉さ
れた試験管中１００℃３０分加熱されそして続いて０．
０１ＭＮａＣｌに対して透析された。反応物の大きさは
前に述べたプリンヌクレオシドの酸デプリフィケーショ
ンとＨＰＬＣ検定で検出された。 実施例２８ ｐＢＲ３２２ＤＮＡのブロム化 ０．５Ｍ酢酸塩バノファ一ｐＨ５．５中に溶解されたｐ
ＢＲ３２２ＤＮＡ（１００μｆ）の溶液に対してブロム
（５．５ｔＪ，０．１ミリモル）が添加された．該反応
物は６０℃３０時間詳置されそして０．０１ＭＮａＣβ
に対して完全に透析された。 実施例２９ プロム化ｐＢＲ３２２ＤＮＡのチオールとの反応。シス
テアミンと３−メルカプトプロピオン酸との反応の実施
例 ０．１Ｍホウ酸塩ｐＨ８．５（１耐）中ブロム化ｐＢＲ
ＤＮＡ（５００ｐｆ）の溶液がシステアミン捷たは３−
メルカプトプロピオン２（２０Ｆ．ｙ）のいづれかとア
ルゴン雰囲気下室温で２０時間詳置された。得られたア
ミンーまたはオルボキシー置換ＤＮＡは０．ＯＩＭＮａ
（Ｊ！ＶＣ対して透析された。 実施例３０ プロム化ｐＢＲ３２２ＤＮＡのアミンとの反応。 １，６−ジアミノヘキサンとの反応の実施例ブロム化，
ＢＲ３２２ＤＮＡ（１００μｇ）とＩＭの１．６−ジア
ミノヘキサン（Ｉｍｌ）の溶液はアルゴン雰囲気下で６
５℃３時間加熱された。得られたアミン置換ＤＮＡは０
．１ＭＮａ（Ｊ？に対して透析された○ 実施例３】 信号発信ポリヌクレオチドに結合された蛋白質の合成。 化学的に放射性ラベルされたＤＮＡＫ結合されたＩｇＧ
の実施例 ＦｄＤＮＡは実施例１１において述べられた条件下で末
端トランスファラーゼを用いてＵＭＰで末端ラベルされ
た。該末端ラベルされたＤＮＡは２，４．５−｝リクロ
ロアニリン（実施例１）で誘導化されそして実施例１ａ
に述べられたと同一な条件下でＤＣＴＡ−ＳＨと反応さ
せられた。該末端ラベルされたＤＣＴＡ誘導体化された
ＤＮＡは過ヨウ素酸ンーダによって酸化され、システア
ミンと反応されそして実施例１２で述べたようにソジウ
ムボロハイドライドで還元された。これは順番に実施例
１５において述べた条件を用いてポロアセチル化ＩｇＧ
（実施例１４）と反応せられた。 実施例３２ 架橋体としてのバクテリオファージＭｌ３の使用 組み換えＤＮＡ技術の手法を用いて、非対称ＤＮＡ連鎖
はＭ１３のような単一らせん形状のファージの複製（二
重らせん形状）の中へ挿入されることが出来る。挿入物
の一つのらせんはグアニン残基中に欠けているだろう。 本発明の一つの結果として、二つの単一らせん形状のフ
ァージは二つの極性、一つは（Ｇ−）らせん、即ち非対
称連鎖にグアニル酸残基を有してい々い、他はＧ（＋）
連鎖と呼ばれるべ＠Ｇ（→連鎖と補体をなす連鎖を含ん
でいる、で得られるであろう。該Ｇ（−＋）ファージは
例えばヘルペス単純ウィルスＩＤＮＡ連鎖のような関心
のあるＤＮＡグローブを担持するためのベクトル（架橋
体）として用いられる。 該Ｇ（→ファージ（信号発信体）Ｉ″ｉ例えば１，２一
シカルボニル試薬のようなグアノシン固有試薬と化学的
に反応せられる。該Ｇ（→ファージ中の該Ｇ（→挿入物
はグアニル酸残基を欠くので変性されない０ 単一らせん形状のＭ１３の調製のための一般的手順は次
の通）である。 １．Ｍ１３ｍｐ８ｒｆ（複製型、二重らせん形状）が培
養せられる。それは短太な末端を残したＴ｛ｉｎｃｌＩ
で切断される。 ２．１）ｄ（Ｇ−Ｔ）５とｐｄ（Ａ−Ｃ）５が与えられ
そしてハイブリソド化されて完全な二重らせんを形成す
る。該末端は完全に対になって結合されるべきである。 この条件を得るためにハイブリンド化のために高Ｃ。ｔ
条件を用いることが必要である。 ３．ハイブリノドは制限酵素ＲｓａＩの存在下で結紮さ
れる。ＲｓａＩは連鎖ＧＴＡＣを認識しそしてそれ故に
切断して短太な末端を残しそして結紮を修正するであろ
う。 ４．該結紮生成物は単離される。これらは二重らせん形
状のボリｄ（Ｇ−Ｔ）ボリｄ（Ａ−Ｃ）である（いかな
る補体、繰返し、低複雑性連鎖をも使用出来る。該連鎖
変性および化学的性質はしたがって調節せられるべきで
ある。）５．アルカリホスファタ−ゼは５′ホスフェイ
トの除去に用いられる。 ６ボリヌクレオチドキナーゼとＰ−ＡＴＰは８２ｐ−ホ
スフエイトで５′末端を置き換えるために用いられる。 ７．該反応混合物は１５〜２０条非変性ポリアクリルア
ミドゲルに展開せられて異なったサイズの断片を分離す
る。 ８該断片は放射線写真測定によってゲル上の位置を検出
される。 ９．所望のサイズのバンドはゲルを切断すること、該ゲ
ルを潰ぶしそれから高塩バソファーで抽出することによ
ってゲルから流出される。 １０．ＤＮＡは例エハエタノール沈澱、スベルミン沈澱
、凍結乾燥等の多くの可能な手法のいづれかによって濃
縮される。 １１．該断片はＨｉｎｃＩＩ一切断Ｍ１３の中へクロー
ン化されるべく用意される。 標準スタンダード手法を用いて、次の手順が行われる。 ａ．断片はＭ１３の中へ結紮さ扛る○ ｂ．細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉＪＭｉ０３）はＭ１３で
変転さｎる。 Ｃ．変転細胞は被覆せられる、そして ｄ．，（ｌみ換え体が選択される。 １２．組み換え体の選択のためには二つの可能なルート
がある。 ａ，もし、既知の寸法の組が挿入されたならば、琉点は
選ばれそして挿入物の存在をチェックするため順序付け
される。 ｂ．改変方法はステノプ４で作成された連鎖のすべてを
Ｍ１３の中へ狙い打ちすることである。この手順はよシ
多〈のクローンが選ばれそして順序付けによってチェソ
クされることを要求する。 １３．一たん適当なクローンが得られたならば（適当な
寸法の連鎖を有するＭ１３）、単一らせん複製形状の中
へＧＴＧＴ等を与えるらせんは選択されるであろう。こ
のクローンはその後複製形状の中へ種々の病原菌からの
連鎖を挿入することによって更に進んで遺伝子工学のた
めに用いられる。 １４．複製形状中の／Ｍ；ＡＣ等を与えるらせんはマス
培養中でクローン化され、Ｇ’ｓに固定な報告体（信号
発信部分）によって変性される０かくしてＧ（→ファー
ジは二官能性試薬ｐ−アジドフエニルグリオキザール（
Ａ．ＰＧ）と完全に反応せられる。ＡＰＧのジカルボニ
ル部分は只ＤＮＡの単一らせん形状部分に診けるグアノ
シン残基とのみ反応する。グアノシンを欠く挿入物はこ
の処理によっては影響されない。 １５．Ｇ（ト）そして誘導体化された（Ｇ−）ＤＮＡは
当モル濃度で混合せられそしてターゲノ｝ＤＮＡおよび
相互にハイブリッド化せしめられる。ハイブリッドの視
覚化は標準信号報告手法による。 本発明に関しては既に充分に述べたけれども、ここに述
べられた本発明もしくは実施例のいずれの精神又は範囲
にも影響することなく、同様の構成や過程を生ずる広範
囲に亘る改変の対象となりうる通常の技術によって理解
される。
相邑する一つまたは複数の相手との共有結合まだは対を
なす結合の中に含まれる化学はよく知られた技術の範囲
の中にある。 ポリヌクレオチド連鎖の蛋白質に対する共有結合はまた
文献中に充分記載されている。通常、該反応はカルポジ
イミド架橋（Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｍ．Ｋ−，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｉ，３７３（１９６６））によって、またはホル
ムアルデヒド（例えばＢｒｕｔｌａｇ，Ｄ．等、Ｅｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋８：３２１４〜３２１８（１９６
９），Ｍａｎｎｉｎｇ＋Ｊ−Ｅ．等、Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍａ，５３：１０７〜１１７（１９７５）をみよ）、（
４−アジド７エニール）グリオキザ−７レ（Ｐｏｌｉｔ
ｚ，Ｓ−Ｍ−，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０：３７
２〜３７８（１９８１）のような試薬の存在下の核酸に
対する蛋白質の架橋によってポリヌクレオチドの≠＄２
’，３’−ハイドロキシ末端の酸化、次いで１）蛋白質
のアミ７基とのシッフ塩基形成、そして１１）ボロハイ
ドライド反応（Ｓｏｄｊａ，Ａ．等、ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，５：３８５〜４０１（１９
７８））によって直接に行われる。他の方法はＤＮ八の
直接ブロム化（Ｊｏｎｅｓ，Ａ−Ｓ−，Ｎａｔｕｒｅ１
８３：１６０３（１９５９））それＫつづ〈ジアミノヘ
キサンとの反応（Ｌｏｗｅ，Ｃ．Ｒ．，Ｅｕｒ−Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ，７３：２６５〜２７４（１９７７））そ
して蛋白質カルボキシル官能基を介しての対になる結合
、またはシトシン部分の水銀化（．Ｄａｌｅ，Ｒ−Ｍ．
Ｋ．等、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７０：２２６３〜２２４２
，（１９７３）），それに続くハロゲン化（Ｄａｌｅ，
Ｒ−Ｍ．Ｋ．等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ−ｔ
２：９１’５〜９３０（１９７５’）Ｌジアミノヘキザ
ンとの反応そして蛋白質カルボキシル基との対になる結
合を含むものである。 特に興味があるのは、該信号発信体の調製において、グ
アニン塩基の化学変性のだめのジカルボニル試薬の使用
である。これは現在の多重成分検定システムの特に有用
な利点の一つを示す。もし信号発信体上のポリヌクレオ
チド部分が非常に低いＧ含量を有するならば、当のポリ
ヌクレオチド部分のア二一リング特性の非可逆変性のお
それなくして、該ポリヌクレオチド部分を例えばジヵル
ボニル化合物のような架橋剤を介していかなる物質とも
化学的Ｋ反応させることが可能である。このことはいか
なる小分子量分子のポリヌクレオチド部分とのジカルボ
ニル化合物または他の非識別架橋の使用による結合に対
して等しく好都合に適用されるものである。この手法は
個々のヌクレオチド残基を予かしめ変性しそしてその後
に酵素重合によってポリヌクレオチドらせんの中へこれ
らを取り入れると云うような労力と時間とを節約するも
のである。 ポリヌクレオチド連鎖のサツカライドに対する結合はＣ
ｒａｍｅｒ等、Ｃｈｅｍ，Ｂｅｒ９２：３８４〜３９１
（１９５９）によって行われることが出来る。２０以内
のサツカライド単位を有するサツカライドが望−ｈしい
。 ポリヌクレオチド連鎖の他のポリヌクレオチド連鎖に対
する結合は例えば短太な終端の結紮またはエンドヌクレ
アーゼ分解酵素によって生ずる結合力を有す末端の存在
にもとづく結紮を用いて、化学的または酵素的手法のい
づれかによって行なわれ得るｏＤＮＡ連鎖の相互分割お
よび結紮はＨｅｌｌｉｎｇおよびＬｏｍａｘ，’Ｔｈｅ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇｏｆＧｅｎｅｓ一Ｇ
ｅｎｅｒａｌＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ″，Ｃｈａｋｒａｂ
ａｒｔ）’による’ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ”の第１章、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９７８，Ｐａｇ
ｅｓ：Ｌ〜３０に詳細に述べられている。 ポリヌクレオチドのポリヌクレオチドに対する結合のた
めの他の方法はＳＳＤｎａ＋ＲｉｂｏｄＵＴＰ十末端ト
ランス７アラーゼ （Ｒｏｙｃｈｏｕｄｅｒｙ，Ｒ．＋Ｗｕ，Ｒ．，ｉｎＭ
ｅｔｈ．ｉｎＥｎｚ．，ＬＸＶ，４３，（１９８０））
；過ヨウ素酸塩酸化、■，６ジアミノヘキサン（１），
３−アミノグロビオン酸（２），またはビス（２−アミ
ノエタンチオール）（３）を含むアミン誘導体との還元
アミノ化（Ｐｅｒｉｋｅｈ，ＩＭａｃｈ，Ｓ，および（
？ｕａｔｒｅｃａｓａｓ，ｉｎＭｅｔｈ．ｉｎＥｎｚ．
ＸＸＸＩＶ，８２（１９７４）；マタハｃ（７）制限ク
ｏム化（水銀化を介して）（ＤａｌｅおよびＷａｒｄ上
記参照）そしてそれに続＜ＤＮＡの同様の試薬（（１）
，（２）＋（３））との反応を用いることを含む。 上記化合物（１）または（２）のＤＮＡ誘導体はこれに
続いて水溶性カルボジイミド誘導体を介して蛋白質と対
に結合される（Ｉｎｍａｎ，Ｊ．Ｋ−ｉｎＭｅｔｈｉｎ
Ｅｎｚ．，ＸＸＸＩＶ，５２〜５３，（１９７４））。 （３）の場合には、該蛋白質はブロモ酢酸のＮ−ハイド
ロキシサクシンイミドエステルによグて活性化され得る
。得られた活性化蛋白質は室温でチオール化核酸と共有
的に結合させることが出来る。 例えば８２Ｐのような放射性ラベルのＤＮＡ連鎖の中へ
の共有結合による取ｐ入れは例えば酵素重合による放射
性ラベルされているヌクレオチドの直接結合、遷移罎訳
等のような種々の方法のいつれによってもなされること
が出来る（Ｒｉｇｂｙ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１
３：２３７〜２５１（１９７７Ｌ）０ 例えば蛋白質／ラテックス結合体、蛋白質／フェリチン
結合体、抗体／酵素結合体、螢光物質／抗体結合体、ア
ビジン／酵素結合体等のような信号発信７ステムの個々
の要素の調製はこの技術分野ではよく知られておシそし
て以下の詳細な説明には記述されないであろう。 個々のポリヌクレオチド連鎖の特別な調製はまた当業者
にはよく知られている。例えば、もし一つのポリヌクレ
オチド連鎖が１つまたは複数の遺伝子からなっているな
らば、合成方法または逆トランスクリブターゼを用いて
ｍＲＮＡを逆転写して補体ＤＮＡを生ずることによって
それが調整され得る。もし該ポリヌクレオチド連鎖がい
かなるヌクレオチドのらせん（例えばボリｄＧまたはポ
リｄＣ）またはいかなるジヌクレオチド対（例えばポＩ
ＪｄＧＴ等）からなるものであれば、それは例えばＤＮ
Ａポリメラーゼを用いることによシ、また合成方法論に
よって容易に調整され得る。 使用方法 検出されるべき分析物は例えば血液、尿糞便、だ液、う
み、精液、血清、その他の組織、発酵肉汁、培地等の臨
床試料のようないかなる生物学的または非生物学的試料
中に存在し得る。もし必要でろれば、該分析物はその混
合成分から分析物の特別なタイプのものを濃縮するため
に知られた方法によって予；１抽出または精製される。 例えば、もし分析物が蛋白質または蛋白質含有フラクシ
ョンであれば、例えば塩沈澱、アルコール沈澱またはク
ロマトグラフのような蛋白質抽出方法が利用され得る。 もし分析物が同定されるべき核酸セグメントからなって
いれば、例えばフェノール抽出のような核酸抽出方法が
利用され得る。該分析物は、もしこのような場合もある
ならば精製されていない材料と共に、精製されながら該
混合物中で試験されることが出来、捷た特にそれが核酸
セグメントである場合には固定されることが出来る（例
えば、Ｗａｈ１等、米国特許出願４，３０２，２０４を
みよ）。 該分析物を含むと思われる細成物はある時間、分析物の
認識可能部分と架橋体上の認識部分との間の複合化を行
わしめるに充分な条件下で評置される。これらの条件は
分析物と架橋体の性質および量によって種々に変化する
。通常は複合化が起った後に、該試料は中性溶液で洗滌
して過剰の架橋体を除去する。これに代えて、このステ
ージでは洗滌を行わずに信号発信体は混合物に添加して
そして架橋体上のポリヌクレオチドらせんと信号発信体
上のそれとの間にア二一リングが起った後に洗滌が行わ
れる。該架橋体らせんの該信号発信らせんとのハイブリ
ノド化はハイブリッド化条件下でそして厳密な条件のい
かなる組み合せの下で行われる。最後の洗滌は信号の発
信に先立って必要であろう。 信号発信は信号発信システムの性質によっていづれかの
与えられた手法によって行なう。かくしてもし酵素結合
検定が利用されるならば、分析物架橋体そして信号発信
体間の三成分からなる複合体は酵素担持試薬（例えば酵
素／抗体結合体）と共に卿置せしめられ、そして基質は
発色のためにそこへ添加される。それに代えて、酵素は
信号発信体上のポリヌクレオチドらせんに直接に結合さ
れ、この場合には基質は直接に添加されてその後発色が
得られる６もし該信号発信体の信号発信部分がビオチン
部分であれば、アビジン，ストレブトアビジン：または
抗−ビオチン抗体のようなビオチン反応分子がそれに添
加される。該ピオチン反応分子は酵素，螢光化合物，高
電子密度化合物、捷たけ不溶性固体相と対になって結合
してそして検出が適当な方法で行われる。 本発明のシステムの応用は制限されない。試料中の検出
されそして分析されることが望まれるいかなる分析物に
も本発明の方法を行なうことが出来る。例えば該システ
ムは分析物中の認識可能部分および認識部分、および架
橋体の夫々いかなる種類のものを用いることによっても
微生物検出および同定のために用いられ有る。 特に興味あることは、ウィルスおよびバクテリアＤＮＡ
連鎖の検出および同定である。 該方法は遺伝的不調が併なわれるＤＮＡ遺伝子連鎖に対
するポリヌクレオチド補体を調整し、そしていづれかの
第１認識事象の存在を測定することによって遺伝的不調
の診断に利用することが出来る。これら遺伝的疾病とし
ては、例えば、サラセミアをあげることが出来る。ザラ
セミアの判定はオリゴヌクレオチドのゲノームＤＮＡに
対するハイブリッド化、それに続いて固有洗滌方法１た
は制限分析およびサザーン，ノーザーン１たはドソトプ
ロットによって（既知の遺伝欠陥に対して）ナ聖れるこ
とが出来る。 本発明のシステムに対する他の用途は染色体上に位置す
る特定の遺伝連鎖の一連に対して対をなす変性ポリヌク
レオチドの一連を用いること、そしてその後その上の第
１認識事象を測定することからなる染色体核型決定に存
する。 他の用途は架橋体中に存在するボルモン受容体結合成分
を受容体位置に結合すること、そしてその後本発明の信
号発信システムによって第１認識事象を測定することが
らなる細胞表面上のホルモン受容体位置の同定または位
置決定のだめの方法を含む。 他の用途は疑がいのある被検体の血液または血清中の例
えばＣＥＡ（悪性腫瘍の胚に対する抗原）のような癌に
関連する抗原の存在を検出することによる癌の診断から
なる。他の用途は本発明の手法によって正常受容体の不
存在を検出することによって悪性細胞を同定することが
らなる腫瘍捷たは癌細胞の同定捷たけ検出方法を含む。 他の用途は分子架橋体中の認識部分としてその代９に抗
原を用いることによって動物中のある伝染性疾病に対す
る抗体を検出する方法を含む。糖水準捷たは特異なグリ
コシル化されているヘモグロビン水準は分子架橋体上の
認識部分としてのレクチンを用いて糖尿病の判定をする
ことが出来る。 更に本発明の手順およびシステムに対する用途は分析物
の不溶化に存する。かくして、もし試料が分析物を含ん
でいると思われ、そして試料から該分析物を抽出および
精製することが望唸れるならば、該■信号発信体″は例
えば水性不溶性樹脂，ガラス，アクリレートまたはメタ
クリレートのようなグラスチノク，試験管内壁またはそ
の縦孔等の不溶性固体相に特別に結合することからなる
か、または結合する能力を有するように設計される。 該架橋体は固体相と共にＦ＃置され、かくして作られる
分析物のための認識位置（即ち親和性表面）はそれから
それに結合される。 本発明は検出および同定手順を行なうために必要な要素
の一つ捷たはそれ以上からなるキノト・の作成を容易に
与えるものである。かくして、キントは密閉部中に例え
ば試験管，小型びん，フラスコ２ボトル，シリンジ等の
一つまたはそれ以上の物入れ手段または一連の物入れ手
段をその中の密閉部中に受け入れるために区画された入
れ物からなるで多ろう。該物入れ手段または一連の物入
れ手段の第１のものは色々な種類の分析物のいずれかを
認識するための架橋体を含むであろう。第２物入れ手段
または一連の物入れ手段は信号発信体を含むであろう。 第３物入れ手段または一連の物入れ手段は結果が内析さ
れることが出来る標準曲線を作成することが出来るよう
にする分析物の予じめ検出された量を含むであろう。他
の物入れ千段捷たは一連の物入れ手段は例えば酵素結合
体，アピヂン結合体，フェリチン結合体，ラテックス結
合体，螢光物質結合体等の信号を発信するために必要な
要素を含むであろう。 望ましい実施例においては、該キット入れ物は予備検出
される連鎖のポリヌクレオチド部分と、分析物と関連さ
れている試験を行なうそして同定する遺伝連鎖のための
いくつかの遺伝子ブロープのいかなるものと結合するた
めに用いられ得るＤＮＡ上の制限位置または分割位置を
担持するＤＮＡである架橋システムからなる第１物入れ
手段を含む。この望ましいキノトにおける他の物入れ手
段は第１物入れ手段中に存在する該ＤＮＡ中に存在する
ポリヌクレオチド部分に対する補体となるポリヌクレオ
チド部分と、前記システムのうちのいづれかである信号
発信部分とを担持する信号発信体からなるであろう。こ
の望ましいキットにおける第３物入れ手段または一連の
物入れ手段は例えばウィルス，バクテリア，細胞等の一
つ件たはそれ以上のポリヌクレオチド含有分析物上に存
在する遺伝連鎖の補体となるＤＮＡグローブの秤々なも
のからなる。 かくして使用者は第１入れ物中のＤＮＡを開き、第３物
入れまたは一連の物入れの中に存在するいづれかの所望
のＤＮＡブローブをそれに取り入れ、ボリマーを結紮し
そしてその後分析物中に存在するいかなる所望の遺伝連
鎖の存在をも検出し同定するために該架橋体および信号
発信体を利用するための分割方法（例えば制限エンドヌ
クレアーゼの使用）を利用するであろう。単一らせんは
連結剤（該位置にか＼る）がそれに最初ハイブリッド化
され、それによってその位置において二重らせんが作成
されることなくして制限酵素によって切断されることは
出来ない。正常には遺伝子は微生物中で増巾され得るよ
うにＲＦ（二重らせん形状をなす）の中へ結紮されるで
あろう。 今一般的｛ｃ本発明を述べたが、同じことが実証のため
にのみここに含まれ限定する意図は全くない、もしそう
でない場合は明細に述べられるであろうある特別な実施
例に対する参考資料によって実証されるであろう。 実施例 実施例１〜３１は架橋および信号発信部分の調製の手順
に関するものである。該実施例は下記のカテゴリーに組
分けされるであろう調製方法を示す。 １）後続の蛋白質，サツカライドおよび低分子との対に
なる結合のためのオリゴヌクレオチドの化＃活性化。 ２）後続のＤＮＡ，サノカライドおよび低分子との対に
なる結合のための蛋白質の化学活性化。 ３）後続のＤＮＡ，蛋白質および低分子との対になる結
合のためのサツ力ライドの化学活性化。 ４）後続のＤＮＡと蛋白質との対になる結合のための低
分子の化学活性化。 ５）ＤＮＡの蛋白質，サノカライドおよび低分子との対
になる結合。 上記カテゴリーに組分けきれる実施例は下記の通りであ
る。 Ｉ）オリゴヌクレオチドの化学活性 Ａ，末端リボヌクレオチドラベル付けとそれに続く過ヨ
ウ素酸的酸化および還元アミン化による。実施例１１，
１２ｏ Ｂ．非固有ブロム化による：実施例２８，２９．３０ｏ Ｃ．５−ヨウドシトシンを介するシトシン部分の固有活
性化による．実施例１６．１７，１８ｏ Ｄ．３，４，５−｝リクロロジアゾベンゼンとの反応を
介するグアノシン部分の固有活性化による゛，実施例１
。 Ｅ．２．３−ジブロモグロパナールとの反応を介するア
デノシンおよびグアノシンー部分の固有活性化にょる：
実施例９０ ２）蛋白質の化学活性化 Ａ．プロモアセチル化による，実施例１３，１４０ ３）サツヵライドの活性化 Ａ，還元サソカライドの活性化にょる：実施例４，５，
’６ｏ Ｂ．非還元サツカライドの活性化にょる：実施例７，８
ｏ ４）低分子の活性化 Ａ．ビオチン：実施例２，３３，２３，２４，２５，２
６。 Ｂ−ＤＣＴＡ：実施例３ｏ ５）ＤＮＡと蛋白質，サツヵライド，および低分子との
対になる結合 Ａ．蛋白質への：実施例１．５，１９．２０ｏＢ．サソ
カライド：実施例１９．１８ｏＣ．低分子への．実施例
１９，１０，２１，２７。 実施例ｌ ＤＮＡのａ，４．６−１リクロロアニリンによる活性化
。 １００１１ｔ７）３，４．５−トリクロロアニリンは５
０％ＤＭＳＯ中の２．５ｍｌの０．５Ｍ｝ｉｃ＃中に溶
解されそして氷上で冷却され、激しい攪拌下で冷ＩＭ溶
液がらのＮａＮＯ２の等モル量が出来るだけ迅速に添加
せられ、そしてその後攪拌は１ｏ分間継続垢れた。３０
０Ｉｌｇの水中３Ｈ捷たけｆｄＤＮＡの１７が２Ｍカコ
ジル酸塩バノファ−ｐＩ｛６．６ノ３００１１（ｌと５
００ｄＤＭＳＯによ９混合せられた。（ＤＭＳＯの添加
にょシ溶液のｐ１■は８，３に上昇する）。２０μｌの
新たに調製されたジアゾニウム溶液がそれに添加されそ
して該混合物は室温で２時間＄＃置された。卿置の間に
現れる若干の沈澱は遠心分離で除去された。該溶液はそ
の後酢酸アンモニウムで０．４Ｍにされそして該ＤＮＡ
はエタノールで沈澱された０実施例１ａ トリクロロアニリンー活性化ＤＮＡのチオールとの反応
、ＤＣＴＡ−ＳＨとチオール活性マンノースとの反応の
例 ３，４．５−｝リクロロアニリンによって活性化された
Ｆｄ．ＤＮＡ（実施例１）は０．１Ｍカセイソーダと等
量のＣＩＩＭＫ２ＨＰＯ４中で溶解された。 この溶液は０．ｉＭＤＣＴＡ−ＳＲ（実施例３）または
チオール活性化マンノース（実施例６および９）の等量
で処理され、そしてアルゴン雰囲気で２時間６５℃で郷
置された。沈澱されたジサルフィドが遠心分離によって
除去されそして該ＤＮＡはＧ５０クロマトグラフィーＫ
よって精製されそして−２０℃て貯蔵された。誘導体化
されたＤＮＡを平均にするために放射性Ｎｉを用いて、
６０％のグアニンがラベルされていたことを測定した。 実施例２ ビオチン−ＳＨ ビオチンーＮＨＳエステルの３ミリモルは無水ＤＭＦの
ｚ５ｍｌ中に溶解されそして０．５Ｍ重炭酸ソーダの１
２ｄ中のシステアミンノ・イドロクロライドのＩＭ溶液
に混合され、そして該混合液は室温で一晩郷置された。 詳置の間に重い沈澱が生じた。該液体は４５℃、減圧下
で除去されそして残基は５０ｇｊアブソルートエタノー
ル中に懸濁され、１ｇのＮａＢＨ４が添加されそして該
懸濁液は７５℃１時間攪拌された。エタノールは除去さ
れそして冷ＩＭＭＣＩが添加されてｌ）Ｈ４，．５に調
節せられ、そして水は３５℃、減圧下で除去された。 （これら操作のすべてはチオールの酸化を防止するため
にアルゴン雰囲気下で行なわれた。固体残基は４ゴの冷
脱気された０．０１Ｍ酢酸の４ｔｎｌを加えて粉末化さ
れそして粉砕された。これらの手順は二回繰返されそし
て残基は凍結乾燥された。 ＴＬＣクロマトグラフ検定は主ビオチンスポノトはチオ
ールを含み、二つの小スボノトはチオール防性であるこ
とを示した。すべての反応において、ピオチンの量はチ
オール含有量にもとづいた。 実施例３ ＤＣＴＡ−ＳＨ ＤＣＴＡ−ブロマイドの１ミルモルが２，３−ジチオエ
チレンの０．２ｄをトリエチルアミンの０．５ｙｄｉ含
む５０％ＤＭＦ”の５ｍｌに添加された。 該混合物はアルゴン雰囲気下に２時間、６０〜７０℃で
梼置された。該溶液はそれから２０ゴの水と混合され、
９ｇ／ベッドボリュームのＤｏｗｅｘＡＧ−１カラム上
に負荷された。該カラムは流通液中Ｋチオールがなくな
るまで５０ｙｌの０．１Ｍ酢酸溶液で洗滌された。ＤＣ
ＴＡ−ＳＨはその後０．２５Ｍｎｃｌで流出された。チ
オール含有フラクションは合一せられ、蒸発せられて４
０１１１Ｃ減圧下で乾燥されそして遊離酸（ａｏｏｑ）
はアルゴン雰囲気で−２０℃で貯蔵された。 実施例４ １−０−メチル−６−０−｝シルーα−Ｄ−マンノピラ
ノシド 非還元サソカライドはトシレートを形成すること、そし
てそれをアンモニアで置換してアミン基を形成するかま
たはジオールで置換してチオール基を形成することによ
って第１級アルコール類を介して活性化せられた。この
実施例では、α−メチルーｄ−マンノシド、非遣元蔗糖
およびマンノースが還元糖として記載される。該トシル
化は刊行物に記載された手順と類似の方法で行われた（
Ｆ．Ｃｒａｍｅｒ等、Ｃｈｅｒｎ．Ｂｅｒ．９２，３８
４〜３９１（１９７９））。 ２３ｇのメチル−Ｄ−マンノシドが４００ゴのアブソリ
一一トビリジン中に溶解せられ、そして該溶液は氷一塩
混合物上で−１５℃に冷却せられた。８０ゴアブンリュ
ートビリジン中２４．６１のｐ−｝ルエンスルホン酸ク
ロライドの溶液が激しく攪拌されている混合液中に添加
されそして−１５℃、３０分間そして２０℃１２時間反
応せしめられた。ピリジンは４０℃、減圧下に除去され
そして残基はクロロホルム中に溶解された。該溶液は５
０’Ｃに加温されそして０．５Ｍ硫酸水素カリウムで連
続的に洗滌せられその後５０℃で０．５Ｍ重炭酸カリウ
ム溶液で洗滌された（ゲル形成を防止するために５０℃
代の温度が必要である）。 実施例５ ６−アミノーα−メチルーＤ−マンノシドハイドロクロ
ライド １３０Ｍｌのアブソリュートメタノール中の６ｇのトシ
レート（実施例４）の溶液は１℃で乾燥アンモニアによ
って飽和され、そして１６時間、１２０℃のオートクレ
ープ処理された。暗所反応生成物は木炭と共に還流され
そしてメタノールは蒸溜によって除去され若干黄色いシ
ロップが残った。該シロソグは水に溶解されそして置換
反応がア二オン変換体を通して溶液を通過することによ
って除去されている間スルホン酸塩が遊離される。 Ｈ（Ｊ？が流出液に添加せられてｐＩ｛５．０に調節さ
れ、そして水が減圧下４０ｔＥで除去される。残基はア
ブソリュートメタノールの１５ゴとアブソリュートエタ
ノールの１５ｙ＆の混合液とともに粉砕されそして該固
体物質は５０ｍｌのアプソリ一一トメクノール中に溶解
されそして冷却され、２５；ｔｔｌアプソリ一一トエー
テルの添加は結晶化を惹起こし、２．５ｙハイドロクロ
ライドを得た。 実施例６ Ｓ−（２−メルカプトエチル）−６−１−オーα一Ｄ−
メチル−マンノピラノシド ６ｇ（７）［｝シレート（実施例４）は２０ｉの新らし
く調製されたソジウムメトキサイドの溶液を含む２５０
ｇＪのアブソリ一一トメタノール中に溶解サれた。該混
合液に対して、５ｍｌの１、２エタンジチオ−ルが添加
された。該混合液は１２（１１０時間のオートクレープ
処理され、反応生成物は上記のようにして処理された。 収量は３１ｙであった。 実施例７ ２，３，４，６，テトラアセチルーα一Ｄ−マンノピラ
ノシルクロライド この化合物は刊行物に記載きれたと類似な方法で調製さ
れたｃ）（Ｄ．Ｈｏｒｔｏｎ，ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔ
ｈｅｓｉｓＶｏｌ４６，ｐ．１，ＷｉｌｌｅｙＮ．Ｙ．
１９６６）。 ２５ｇの乾燥マンノースは６０ｄのアセチルクロライド
に攪拌しつ＼ゆっくシ添加された。容器には還流コンデ
ンサーが接続されそして該混合液は室温で１６時間攪拌
される。クロロホルム、３００ｄ，がコンデンサーを通
して添加されそして該混合液は激しく攪拌しつつ３００
１ｊの氷と１００４の水の上へ注がれた。該混合物は別
なローｌｍうつされ、そして有機物相は出来るだけ迅速
に氷と３００ｍｌの飽和重炭酸ソーダ溶液を含むビーカ
ーの中へ注がれた。該有機物相は分離されそして無水硫
酸マグネシウムの２５９によって乾燥された。乾燥剤は
除去され乾燥アルコールフリークロロホルムで洗滌され
そして該結合クロロホルム溶液はロータリーエバポレー
ター中で減圧下３５ｘＪに濃縮された。５０℃でエーテ
ルが若干濁る寸で該溶液に添加され、該溶液は室温に放
置された。結晶はろ過によって除去されそして乾燥エー
テルで洗滌はれた。収量は３９ｇであった。 実施例８ Ｓ−（２−メノレカプトエチル冫ー１−β−Ｄ−マンノ
ピラノシルスルファイドおよヒＳ−（２−７ミノエチル
）−１−β一Ｄ−マンノピラノシルスル７アイド ６０ｓｌ無水ＤＭ−Ｆ中に１０ｆアセトクロロマンノー
ス（実施例７）の溶液に４ｙｄの１，２エタンジオール
または５ｇシステアミンハイドロクロライドおよび５ｇ
の粉末化炭酸ソーダがアルゴン雰囲気下、６時間、７０
℃で攪拌されている該懸濁液に添加された。該炭酸塩は
除去されそして該液体は減圧下４５℃で蒸発された。該
残基はアブンリュートメタノール中に溶解されそして新
らしく調節された０．１ＭソジウムメトキサイドがｐＨ
を８０に調節するために添加されそして該混合液は室温
で５時間攪拌された。２ゴの氷酢酸が添加せられそして
該溶液は減圧下に除去された。該残基は酢酸から再結晶
された。収量は３．１ｇであった。 実施例９ １，２ジブロモグロパナールによるＤＮＡの活性化 エーテル中のアクロレイン（１．７１ｉ’）の溶液が水
浴上で冷却されそして１．３ｍｌのプロムが次のプロム
添加までに色が消えるのを待ちながら攪拌下にゆっ〈や
添加された。エーテルが溶液にアルゴンを吹き込むこと
によって部分的に除去された。 以下の操作Ｋ用いられるＤＮＡはＤＭＦへの溶解を容易
にするためにトリエチルアンモニウム型にした。 ２５０ｌＩｅの水中の０．５ｑノ３Ｈｆｄ−ＤＮＡ（線
状）（部分的にトリチウム化される）が３．０ｄの７０
係エタノール中０．５Ｍ｝リエチルアンモニウムアセテ
ート、ｐＨ４．５と共に混合せられそして５０μｌのジ
プロモグロパナール溶液が添加された。該混合液は暗所
で３７℃、４０時間攪拌された。反応は螢光の発現によ
って監視された。 該反応混合液は減圧下に蒸発されて乾燥され、そして該
ＤＮＡは０．６ｍｌ水に溶解されそしてＧ５０濾過によ
って流出媒として水を用いて脱塩された。 放射能を含むフラクションは合一せられそして該容量は
０．２ゴに減小された。 実施例１０ ３，４．５−｝リクロロアニリンＤＮＡのＤＣＴＡ−Ｓ
Ｈによるラベル ０．２ｐｙｒｌの水中０．５ｑの該活性化きれたＤＮＡ
（実施例ｌ）が９０チＤＭＦ中２．０ｍｌの０．５Ｍト
リエチルアンモニウムアセテイトと混合されそしてトリ
エチルアンモニウム型のＤＣＴＡ−ＳＨの５０ｆ＋／が
添加された。該混合液は暗所で４時間、５０℃で攪拌さ
れた。該ＤＭＦは減圧下、４５ｔで除去されそして該Ｄ
ＮＡはＧ−５０濾過κよって脱塩された。ラベルの程度
はその後放射性Ｎｉ６３の使用によって測定された。計
算によれば平均して５．３塩基とと陀ラペルされていた
〇同様な手順がこれら物質（実施例２，６および８）の
チオ誘導体を用いて該活性化ＤＮＡのビオチン化および
グリコシル化のために用いられた。 ＤＮＡの化学的ラベル 原理 あるジアゾニウム塩とグアノ・ンンの対になる結合は８
位置では安定な着色生成物を与え（Ｈ．Ｆｉｓｃｈｅｒ
，Ｚ−Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，６０，６９６〜７
８（１９０９）），そして２位置では酸変性されやすい
黄色生成物を形成する（Ｈ．Ｋｏｓｓｅｌ，Ｚ−Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３４０，２１０，１９６５，Ｅ．
Ｎ．Ｍｏｕｄｒｉａｎａｋｉｓ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ−Ｂ
ｉｏｐｈ’ｌｓ．Ａｃｔａ１２３＋４２１（１９６６）
）。単一らせん形状の核酸中のグアノシン残基はジアゾ
ニウム塩と結合出来そしてこの反応は単一らせん形状の
核酸をセルロースに固定するために用いられて来た（Ｊ
．Ｃ．．Ａｌｗｉｎｅ等、Ｍｅｔｈｏｄ３ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６８＋Ｔ’−２２０〜２４２．
１９７９）’）。もし該結合されたジアゾニウム化合物
がチオールまたはアミンによって容易に置換されること
が出来る活性基を含んでいるならば、これはビオチンま
たは他の基を単一らせん形状の核酸に結合するための容
易な方法を構成する。３，．４．５−トリクロロフエニ
ルジアゾニウムクロライドは本発明者等によってビオチ
ン、ＩＬ２−ジアミノシクロヘキサンーＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ
、一テトラ酢酸（ＤＣＴＡ）およびある種の糖宿壬加寺
単−らせん形状のＤＮＡに添加するために用いられて来
た物質である。 単一らせん形状の核酸をラベルするための他の可能性は
クロロアセチルアルデヒドはｐＨ４．５でアデニンと反
応して螢光ビニル誘導体を形成し（穏やかな条件下）、
Ｊ．Ｒ．Ｂａｒｒｉｏ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６，５９７〜６０４．
１９７２），シチジンはｐＨ３．５で反応しそしてグア
ニンはｐＨ６．５で反応するｏｐＨ４．５ではグアニジ
／は全く反応しない（Ｐ−Ｄ−Ｓａｔｔｓａｎｇｉ等、
Ｊ．Ｏｒｇ−Ｃｈｅｎｔ．，４２．３２９２〜３２９６
，（１９７７）。 クロロアセチルアルデヒドの代υに１，２ジプロモグロ
パナールを用いることによって、活性第１級プロム化物
と共に穏やかな反応条件下で、チオ−ルまた｛グアミン
誘導体と反応するＤＮＡを誘導化することが可能であシ
、ＤＮＡをラベルする他の方法全提供する。これら二つ
の方法は塩基固有性である。 実施例１１ ５′−ウリジンモノホスフェイｈ（ＵＭＰ’）の末端ト
ランスファラーゼおよび５′−ウリジントリホス７エイ
トによる線状３Ｈｆｄ−ＤＮＡに対する末端付加 Ｉｌｌｆｆｆａ合液ノ６００ｔｔｌｉｊ：４００μｉ／
ｔ７）ＤＮＡ，１ｍＭＣｏｃｋ２，０．２ｍＭジチオス
レイトール，０．ＩＭカコジル酸，２５ｍｍｏｌトリス
塩基，１ｍＭＵＴＰおｊ：び４００単依の末端トランス
７アラーゼを含む。該混合物の最終ｐＨは６．９〜７．
０であった。 該混合液は２時間、３５℃で評置された。該ＤＮＡはエ
タノールで沈澱されそして４００／７βの０．２Ｍ酢酸
ソーダｐＨ４、７に溶解された。 実施例１２ 末端リポ基の酸化と還元アミン化。アミノカルボキシお
よびチオー末端置換ＤＮＡの合成詳置混合液の４５０μ
βは、４００μｆの末端ラベル化されたＤＮＡ（実施例
１１）、０．２Ｍ酢酸ソーダｐＨ４．７および０．１Ｍ
ＮａＩＯ４を含む。 それは暗所で室温で２時間詳置されそして該混合液は０
．３Ｍホウ酸カリウムｐＨ９．０〜９．３中で平衡化さ
れたＧ５０カラムに通されて０．２ｄのフラクションが
集められた。すべての放射性フラクションは総量１．２
ゴに合一せられた。該ＤＮＡ溶液はアミン成分の１つ（
ε−アミノカプロン酸、システアミン、甘たは１，６−
ジアミノヘキサン、ｐＨ９．３に調節されたＩＭのスト
ノク溶液を用いる）によって０．４Ｍにされた。 得られたシソブ塩基は下記のようにＮａＢＨ４で還元で
れた。水（１ｌ）中１：０．２Ｍに新らしく溶解された
ＮａＢＨ４は３０分間隔で４つの部分に添加された。該
詳置は計３時間続けられた。塩と過剰のアミノ成分は１
ｍＭベーターメルカプトエタノールを含む０．４Ｍ酢酸
ソーダ中で平衡化され九カラム中のＧ５０濾過によって
除去され、該ＤＮＡ含有フラクションはその後合一せら
れ−７０℃でアルゴン雰囲気下に貯蔵された。使用前に
ＤＮＡｉｆ：エタノーノレで沈澱されそ１７て所望のパ
ソファーに溶解された。 実施例１３ フアモ酢酸Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドエステルの
活性化 ブロモ酢酸のＮＨＳ（Ｎ−ハイドロキシサクシンイミド
）エステルは下記の通りに調製された。 ブａモ酢酸ノｌ００ミ！Ｊモｌ（１８．９９）は５ｏｘ
ｔｌの無水ＤＭＦ中に溶解され、この溶液に対して１０
０ミリモル（２０．６ｆ）のＮ−Ｎジシクロへキシルカ
ルポジイミドが攪拌しつ＼添加せられ、次いで１００ミ
リモルのＮ−ハイドロキシサクシンイミド（１００％純
度として１１．９ｇに調節された）が添加せられ、そし
て該混合液は６時間３７℃で攪拌された。該混合液はそ
の後ハイドロキシ尿素の沈降を促進するために−２０℃
で２時間放置され、該沈澱は濾過によって除去された。 該濾過物において、ＤＩ’ｌ’ＩＦは減圧下４５℃で除
去されそして活性化エステルは２−グロバナールから再
結晶された。 実施例１４ ＩｇＧのグロモアセチル化 ０．．３ｍｏｌホウ酸パノフ７−ｐＨ９．９中のＩｇＧ
Ｍ２０巧／ｍｌ）が１）ＭＳＯ中のブロム酢酸（実施例
１３）のＮＨＳエステルの１０ｑ／ｚｌ溶液の０．０６
容量と混合された。該試料はその後０．１ＭＮａＣｊ？
０．１ｍｏｌ燐酸塩バノファ一ｐＨ７．５に対し７て透
析された。 実施例１５ ＤＮＡ−ＩｇＧ結合体の合成 ０．３Ｍホウ酸カリウムバッファ−中のプロモアセチル
化ＩｇＧ（実施例１４）の１．６ｑ／ｔｄは室温でアル
ゴン雰囲気下でチオ−置換された末端ラベルされたＤＮ
Ａ溶液（実施例１２）の３ｔｑ／ｐｄと共に２時間卿置
された。メルカプトエタノール０．０１Ｍがその後添加
されそして該混合物は更に同温度で２時間評置され未反
応プロム残基を除去された。該溶液はその後蛋白質Ａカ
ラム上で吸着ざれそして未結合ＤＮＡは１．０ＭＮａＣ
６によって流出された。該ＤＮＡ−ＩｇＧ結合体と該未
反応ＩｇＧはインチオシアナートによって流出されそし
て０．１Ｍ燐酸塩バッファ−，ｐＨ７に対して透析され
てインチオシアナートを除去された．、該結合ＩｇＧと
遊離ＩｇＧは硫酸アンモニア５ｏチでその後沈澱され、
ペレットはｉ．ｏｉ燐酸塩バッファ−中に溶解されそし
て遊離ＩｇＧは結合ＩｇＧから０．０１ＭＮａＣｌ，０
．１Ｍ燐酸塩ｐＨ７．２の中で平衡されたＢｉｏ−Ｇｅ
ｌｐ−３００カラム上で分別することによって分離され
た０ 実施例１６ ，ＢＲ３２２の水銀化 水銀酢酸（）ｕｐ，０．０１ミリモル）を含む５ｍＭ酢
酸ソーダｐＨ７．５のｌｍｌ中に溶解されたｐＢＲ３２
２ＤＮＡ（１００μｆ）はＤａｌｅ等の方法（Ｎｕｃｇ
．ＡｃｉｄＲｅｓ．２：９１５１９７５）によって５０
℃４時間反応された。５一シトシン水銀化ＤＮＡは完全
に０．０２Ｍ食塩２ｍＭＥＤＴＡを含む０．０１Ｍトリ
スＨＣｎ中で透析された。 実施例１７ 水銀化，ＢＲ３２２ＤＮＡのヨウ素化 １ｄ０．ＩＭ｝リスＨＣｌｊｐＨ７．５中の前実施例か
らの水銀化ＤＮＡへＤａｌｅ等の方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄＲｅｓ．２，９１５．１９７５）を用いて１ダのヨ
ウ素が添加された。２０℃２時間の反応の後ｉ１ＪＩ２
はクロロホルムで抽出されそしてヨウ素化逼れたＤＮＡ
は０．０２Ｍ食塩と２ｍＭＥＤＴＡを含む０．０１ｍト
リスＨ（Ｊ’に対して透析された。置換されたＤＮＡは
Ｎ．クラッサエンドヌクレアーゼ、蛇毒ホスホジエステ
ラーゼＤＮＡラーゼそしてＥ．ｃｏｌｔアルカリホスフ
ァターゼによる連続分解により分析された（Ｈ．Ｙａｍ
ａｓａｌｃｉ等ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３７：１３８９，
１．９７７）。該混合液はＤＥ−５２アミンセルロース
を介して流出され、そしてヌクレオチドは標準としてオ
ーセンティック５−ヨウドー２′−デオキシウリジンを
用いて逆相ＨＰＬＣによって分析された。 実施例１８ ５−ヨウドシトシンｐＢＲ３２２ＤＮＡのアミンとの反
応。１，６−ジアミノヘキサンとの反応の実施例 １ｄ０．ＩＭホウ酸ソーダ中に透析された前反応からの
ヨウド化ＤＮＡに１１６ｑ（１ミリモル）ジアミノヘキ
サンが添加された。該反応混合液はアルゴンで曝気せら
れそして１００℃２時間加熱された。該アミンヘキシル
置換ＤＮＡは完全に０．０１Ｍ｝リスＭＣＩｐＴ｛７．
５の中へ透析された。 アミノカプロン酸、ビス（２−アミノエタン）ジスルン
アイドおよび６−アミノーα−メチルーＤ−マンノ（実
施例５）に対する反応条件は本質的に同一である。 実施例１９ ■−エチル−３−ジイングロビルーアミノ力ルポジイミ
ド（ＥＤＡＣ）を用いたアミノおよびカルボキシー置換
核酸の蛋白質またはアミンへの対になる結合 １ｇ？０．ＯＩＭＮａＣ１ｐＨ７．５（ＨＣｆｆ）中１
溶解されているアミノーまたはーカルボキシー末端置換
ＤＮＡ（実施例１１）（５０μｌと３Ｈ−ラベルストレ
グトアピジン（５０μｆ！）に対してＳｑＥＤＡＣが添
加された、−１該反応物は暗所で２０時間詳置されそし
てＤＮＡは４ＭＣａＣＡ？２（０．０３πｌ）の添加に
よって沈澱せしめられた。ＤＮＡはＩＭｌ水中に再溶解
されそしてこの手順は未結合蛋白質を除去するために２
回以上繰返えされた。該蛋白質一結合ＤＮＡはイミノビ
オチンーセ７アローズ親和性カラム（Ｋ．Ｈｏｆｆｍａ
ｎ等、ＰＮＡＳ７７：４６６６，１９８０）中で親和性
精製された。 実施例２０ カルボキシへキシルー置換ＤＮＡのＮ−ハイドロキシサ
クシンイミド活性化および蛋白質またはアミンとの結合
、ストレグトアビジン結合ＤＮＡの実施例 カルボキシ末端置換ＤＮＡ（実施例１９）（５０μｙ）
はＤｏｗｅｘ５０−ＷＸ（Ｅｔ３Ｎ＋）と共に水溶液を
振盪テることによってトリエチルアンモニウム塩に変換
された。該溶液は凍結乾燥されそして該乾燥されたＤＮ
Ａはジンクロヘキシルカルボジイミド（１０．３ｑ，０
．０ｓモル）とＮ−ハイドロキシサクシンイミド（５−
８１Ｉｌｇ０．０５モルラが添加されている無水ジメチ
ルホルムアミド（０．５ｇＪ）中に溶解された。室温で
２０時間の詳置の後、該反応物は遠心分離されそして上
澄け２時間１０ｍＭＮａＣｊｌ？中へ透析された。０．
２Ｍホウ酸塩、ｐＩ｛８．５（Ｉｇ？）中に溶解されて
いるストレブトアピジン（５０μｇ）ぱＮ−ハイドロキ
シサクシンイミド活性化ＤＮＡに添加されそして該反応
物は２０時間卿置されそして０．０１ＭＮａＣｌの甲へ
透析された。該ストレブトアビジン結合ＤＮＡｔｒｌＣ
ａＣ（Ｊ２沈澱および前記されたと同様にイミノビオチ
ン親和性クロマトグラフによって精製された。 実施例２１ ＤＮＡのグリオキザ−ルとの反応 ＤＮＡ（１μｇ）（プラスミド，ＤＫ１４からのＢＡＭ
挿入）は０．０２５Ｍグリオキザール（０．２ｉｌ）中
に溶解されそして１００ｕ３０分密閉試験管中で加熱さ
れた。該反応物は１０ｍＭＮａＣβに対して透析された
。グアノシン上の反応の程度を評価するために、反応物
の一部分はＨＣＩで雨を１．０に低下させそして１００
℃で３０分加熱することによって酸デプリネーションを
受ける。該デプリネーションされたＤＮＡはＤＥ−５２
アミンセルロースを通しての流出によって除去されそし
て流出されたプリンは逆相上ＨＰＬＣによって分析され
た。アデノシン、グアノシンおよびグリオキザールーグ
アノシンアダクトのピーク高さの比較（Ｒ．Ｓｈａｐｉ
ｒｏ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ，５：２７９９，１９６６）は
７０チのグアノシンが置換されたことを示した。 実施例２２ Ｎ−ビオチニル−４−アミノーアセトフェノン２０ｍｌ
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解されたビオチ
ンーＮ−ハイドロキシサクシンイミドエステル（５０μ
Ｆ，０．０１４ミリモル）ノ溶液に５０ｄＤＭＦと１０
０毎ｔＯ．ＩＭホウ酸塩バッファ一ｐＨ８．５中に溶解
さルた４−アミノフェニルア宅トフェノン（４、３５／
！，０．０３モル）が添加された。室温で２０時間の反
応の後、該溶媒はロータリーエバボレーターで蒸発され
ることによって除去された。残基油状物質は先づ０．Ｉ
ＮＨＣｎですり砕かれその後５多重炭酸ソーダですシ砕
かれる。生成物はエタノールから結晶化せしめられる。 実施例２３ ビオチニル（４−アミノフェニル）グリオキザーノレ セレニウムジオキサイドＣ０．７５ｆ／，７ミリモル）
が０．１５ｙｘ７水を含む４ｄジオキサン中に溶解され
た。これへ５ｍｌジオキザン中に溶解芒れたＮ一ビオチ
ニル−４−アミノアセトフエノン（１。９＆，７暑リモ
ル）の溶液が滴加された。該反応物は３．５時間還流さ
れその後該混合液は濾過されそして真空下で濃縮された
。粗生成物はシリカゲルクロマトグラフによって精製さ
れた。 実施例２４ １，Ｎ−ビオチニル−１，６−ヘキサンジアミン ジメチルホルムアミド（５μｍ）中に溶解されているビ
オチンーＮ−ハイドロキシサクシンイミドエステル（１
．Ｏｆ，２．９ミリモル）が０．１Ｍホウ酸ソーダ（ｓ
ｏＯｉ）中ジアミノヘキサン（１．１５ｇ，ＩＯミＩＪ
モル）の溶液に添加された。 室温で５時間反応の後、該溶液はロータリーエバボレー
ターによって蒸発され、１０ゴ水中に再溶解されそして
Ｄｏｗｅｘ５０−ＷＸ（Ｈ＋）上でクロマトグラフにか
けられた。カラムは５０チメタノール水溶液で洗滌され
そして５０ｔｌｂメタノール水溶液（０．３Ｍ）中に溶
解しているトリエチルアミンを有する流出フラクション
が集められた。蒸発残基はエーテルで完全にすシ砕かれ
そしてＤ■゛／エーテルから再結晶させられた。 実施例２５ ＣＨ８−ＣＯ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−ビオチ
ン ２０ｓｌ無水ＤＭＦ中ピルビン酸Ｃ０．４４ｆ，５ミリ
モル）の４℃に冷却した溶液へイソブチルクロロホルム
化Ｃ０．６４１５ミリモル）およびトリーＮ−プチルア
ミン（１．４ａｙ，１．５ミリモル）が添加された。こ
の温度で２０分後、更に１．４ｙトリ−Ｎ−プチルアミ
ンが添加されそして該混合液は３０ゴＤＭＦと３０が７
０．１Ｍホウ酸ソーダ中に溶解された１，Ｎ−ビオチニ
ルーｌ，６−ヘキサンジアミン（実施例２４）の溶液に
添加された。４℃１時間の反応の後、該混合液は更に２
０時間室温で放置せられそして続いて真空中で濃縮され
た。該混合液はシリカゲル上クロマトグラフによって精
製されそして生成物はエタノールから再結晶された。 実施例２６ ＣＨＯ−Ｃｏ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−ビオチ
ン セレニウムジオキサイド（５４７ｎＱ，０．５ミリモル
）が２５μβ水を含むジオキサン（０．５ｄ）中に溶解
された。ｌｘｔｌジオキサン中に溶解されたＣＨ３−Ｃ
ｏ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）６−Ｎｕ−ビオチン（実施例
２５）（０．２１ｇ０．５ミリモル）が滴加されそして
該反応物は１００ｔＣ４時間加熱された。得られた沈澱
は遠心分離によって取除かれジオキサンで洗滌せられそ
して上澄は真空で濃縮された。該粗混合物はシリカゲル
上でクロマトグラフにかけられた。 実施例２７ ＤＮＡのビオチン化グリオキザール誘導体との反応 トリエチルアンモニウム塩としてのＤＮＡ（１μｙ）が
１００μｅ水に溶解された。これに対してジメチルホル
ムアミド中（Ｎ−ビオチニル（４ーアミノフェニル））
グリオキザール（０．０５Ｍ）またはＣＨＯ−Ｃｏ−Ｃ
ＯＮＨ−（ＣＭ２）６−ＮＨ−ビオチン（０．０５Ｍ冫
の溶液のｉｏｏｔｔｇが添加された。該混合液は密閉さ
れた試験管中１００℃３０分加熱されそして続いて０．
０１ＭＮａＣｌに対して透析された。反応物の大きさは
前に述べたプリンヌクレオシドの酸デプリフィケーショ
ンとＨＰＬＣ検定で検出された。 実施例２８ ｐＢＲ３２２ＤＮＡのブロム化 ０．５Ｍ酢酸塩バノファ一ｐＨ５．５中に溶解されたｐ
ＢＲ３２２ＤＮＡ（１００μｆ）の溶液に対してブロム
（５．５ｔＪ，０．１ミリモル）が添加された．該反応
物は６０℃３０時間詳置されそして０．０１ＭＮａＣβ
に対して完全に透析された。 実施例２９ プロム化ｐＢＲ３２２ＤＮＡのチオールとの反応。シス
テアミンと３−メルカプトプロピオン酸との反応の実施
例 ０．１Ｍホウ酸塩ｐＨ８．５（１耐）中ブロム化ｐＢＲ
ＤＮＡ（５００ｐｆ）の溶液がシステアミン捷たは３−
メルカプトプロピオン２（２０Ｆ．ｙ）のいづれかとア
ルゴン雰囲気下室温で２０時間詳置された。得られたア
ミンーまたはオルボキシー置換ＤＮＡは０．ＯＩＭＮａ
（Ｊ！ＶＣ対して透析された。 実施例３０ プロム化ｐＢＲ３２２ＤＮＡのアミンとの反応。 １，６−ジアミノヘキサンとの反応の実施例ブロム化，
ＢＲ３２２ＤＮＡ（１００μｇ）とＩＭの１．６−ジア
ミノヘキサン（Ｉｍｌ）の溶液はアルゴン雰囲気下で６
５℃３時間加熱された。得られたアミン置換ＤＮＡは０
．１ＭＮａ（Ｊ？に対して透析された○ 実施例３】 信号発信ポリヌクレオチドに結合された蛋白質の合成。 化学的に放射性ラベルされたＤＮＡＫ結合されたＩｇＧ
の実施例 ＦｄＤＮＡは実施例１１において述べられた条件下で末
端トランスファラーゼを用いてＵＭＰで末端ラベルされ
た。該末端ラベルされたＤＮＡは２，４．５−｝リクロ
ロアニリン（実施例１）で誘導化されそして実施例１ａ
に述べられたと同一な条件下でＤＣＴＡ−ＳＨと反応さ
せられた。該末端ラベルされたＤＣＴＡ誘導体化された
ＤＮＡは過ヨウ素酸ンーダによって酸化され、システア
ミンと反応されそして実施例１２で述べたようにソジウ
ムボロハイドライドで還元された。これは順番に実施例
１５において述べた条件を用いてポロアセチル化ＩｇＧ
（実施例１４）と反応せられた。 実施例３２ 架橋体としてのバクテリオファージＭｌ３の使用 組み換えＤＮＡ技術の手法を用いて、非対称ＤＮＡ連鎖
はＭ１３のような単一らせん形状のファージの複製（二
重らせん形状）の中へ挿入されることが出来る。挿入物
の一つのらせんはグアニン残基中に欠けているだろう。 本発明の一つの結果として、二つの単一らせん形状のフ
ァージは二つの極性、一つは（Ｇ−）らせん、即ち非対
称連鎖にグアニル酸残基を有してい々い、他はＧ（＋）
連鎖と呼ばれるべ＠Ｇ（→連鎖と補体をなす連鎖を含ん
でいる、で得られるであろう。該Ｇ（−＋）ファージは
例えばヘルペス単純ウィルスＩＤＮＡ連鎖のような関心
のあるＤＮＡグローブを担持するためのベクトル（架橋
体）として用いられる。 該Ｇ（→ファージ（信号発信体）Ｉ″ｉ例えば１，２一
シカルボニル試薬のようなグアノシン固有試薬と化学的
に反応せられる。該Ｇ（→ファージ中の該Ｇ（→挿入物
はグアニル酸残基を欠くので変性されない０ 単一らせん形状のＭ１３の調製のための一般的手順は次
の通）である。 １．Ｍ１３ｍｐ８ｒｆ（複製型、二重らせん形状）が培
養せられる。それは短太な末端を残したＴ｛ｉｎｃｌＩ
で切断される。 ２．１）ｄ（Ｇ−Ｔ）５とｐｄ（Ａ−Ｃ）５が与えられ
そしてハイブリソド化されて完全な二重らせんを形成す
る。該末端は完全に対になって結合されるべきである。 この条件を得るためにハイブリンド化のために高Ｃ。ｔ
条件を用いることが必要である。 ３．ハイブリノドは制限酵素ＲｓａＩの存在下で結紮さ
れる。ＲｓａＩは連鎖ＧＴＡＣを認識しそしてそれ故に
切断して短太な末端を残しそして結紮を修正するであろ
う。 ４．該結紮生成物は単離される。これらは二重らせん形
状のボリｄ（Ｇ−Ｔ）ボリｄ（Ａ−Ｃ）である（いかな
る補体、繰返し、低複雑性連鎖をも使用出来る。該連鎖
変性および化学的性質はしたがって調節せられるべきで
ある。）５．アルカリホスファタ−ゼは５′ホスフェイ
トの除去に用いられる。 ６ボリヌクレオチドキナーゼとＰ−ＡＴＰは８２ｐ−ホ
スフエイトで５′末端を置き換えるために用いられる。 ７．該反応混合物は１５〜２０条非変性ポリアクリルア
ミドゲルに展開せられて異なったサイズの断片を分離す
る。 ８該断片は放射線写真測定によってゲル上の位置を検出
される。 ９．所望のサイズのバンドはゲルを切断すること、該ゲ
ルを潰ぶしそれから高塩バソファーで抽出することによ
ってゲルから流出される。 １０．ＤＮＡは例エハエタノール沈澱、スベルミン沈澱
、凍結乾燥等の多くの可能な手法のいづれかによって濃
縮される。 １１．該断片はＨｉｎｃＩＩ一切断Ｍ１３の中へクロー
ン化されるべく用意される。 標準スタンダード手法を用いて、次の手順が行われる。 ａ．断片はＭ１３の中へ結紮さ扛る○ ｂ．細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉＪＭｉ０３）はＭ１３で
変転さｎる。 Ｃ．変転細胞は被覆せられる、そして ｄ．，（ｌみ換え体が選択される。 １２．組み換え体の選択のためには二つの可能なルート
がある。 ａ，もし、既知の寸法の組が挿入されたならば、琉点は
選ばれそして挿入物の存在をチェックするため順序付け
される。 ｂ．改変方法はステノプ４で作成された連鎖のすべてを
Ｍ１３の中へ狙い打ちすることである。この手順はよシ
多〈のクローンが選ばれそして順序付けによってチェソ
クされることを要求する。 １３．一たん適当なクローンが得られたならば（適当な
寸法の連鎖を有するＭ１３）、単一らせん複製形状の中
へＧＴＧＴ等を与えるらせんは選択されるであろう。こ
のクローンはその後複製形状の中へ種々の病原菌からの
連鎖を挿入することによって更に進んで遺伝子工学のた
めに用いられる。 １４．複製形状中の／Ｍ；ＡＣ等を与えるらせんはマス
培養中でクローン化され、Ｇ’ｓに固定な報告体（信号
発信部分）によって変性される０かくしてＧ（→ファー
ジは二官能性試薬ｐ−アジドフエニルグリオキザール（
Ａ．ＰＧ）と完全に反応せられる。ＡＰＧのジカルボニ
ル部分は只ＤＮＡの単一らせん形状部分に診けるグアノ
シン残基とのみ反応する。グアノシンを欠く挿入物はこ
の処理によっては影響されない。 １５．Ｇ（ト）そして誘導体化された（Ｇ−）ＤＮＡは
当モル濃度で混合せられそしてターゲノ｝ＤＮＡおよび
相互にハイブリッド化せしめられる。ハイブリッドの視
覚化は標準信号報告手法による。 本発明に関しては既に充分に述べたけれども、ここに述
べられた本発明もしくは実施例のいずれの精神又は範囲
にも影響することなく、同様の構成や過程を生ずる広範
囲に亘る改変の対象となりうる通常の技術によって理解
される。
本発明は添付図面と参照することによってより良く理解
されるであろう。 第１図は本発明の検定システムに対する一般化図式を表
わす０分子的に認識可能な部分２を有する分析物ｌには
分析物１上の分子的認識可能部分２を認識することが出
来る部分４を有する分子架橋体３との接触がもたらされ
る。加うるに架橋体３は一般にＡＴＣＧＡＴＣ・・・・
として記されるポリヌクレオチド連鎖がらなる部分５を
担持する。 またシステムにおける存在は架橋体３のポリヌクレオチ
ド部分５にアニーリングし得るポリヌクレオチド部分７
を有する信号発信体６である。信号発信体６は寸だ信号
発信部分８を担持する。分析物が分析ざれる試料中Ｋ存
在する時、認識可能および認識部分２と４を夫々介して
架橋体３との相互作用が起る。それによって形成される
複合体はそれからポリヌクレオチド部分５を介して分析
物１とのある化学量論的関係の中へ信号発信部分８を持
って来る信号発信体上の補体ポリヌクレオチド部分７に
対してアニ−リングされる。 第２図は分析物９がＤＮＡ連鎖１０（一般的にＡＴＣＧ
ＡＴＣＧＡＴＣとして示される）からなる本発明のより
広い概念の下のよ）望ましいシステムを示す。単一ら、
ぜん形状の環状ポリヌクレオチドポリマーとして示され
る架橋体１１は分析物のＤＮＡ連鎖と補体をなすＤＮＡ
連鎖である認識部分１２を担持する。加うるに架橋体１
１は寸た信号発信体１４上の補体ポＩＪＣ連鎖１５との
安定なハイブリッドをアニーリングしそして形成するこ
との出来るポＩＪＧ連鎖１３を担持する。信号発信体１
４は１たその信号発信基としてビオチン部分１６を担持
丁る。分析される試料の中のＤＮＡ連釧の存在は架橋体
１１へのハイブリ，ド化を惹起し、そコ１，に続く信号
発信体のかくして形成された複合体へのアニーリングは
網状形状を介してビオチン部分を分析物に結合ずる。該
ビオチン部分１６はぞの後例えばアビジン／酵素結合体
の添加、次いで酵素基質の添加、セして色検出によって
検出されることが出来る。 −２９４＋１ −２９５−
されるであろう。 第１図は本発明の検定システムに対する一般化図式を表
わす０分子的に認識可能な部分２を有する分析物ｌには
分析物１上の分子的認識可能部分２を認識することが出
来る部分４を有する分子架橋体３との接触がもたらされ
る。加うるに架橋体３は一般にＡＴＣＧＡＴＣ・・・・
として記されるポリヌクレオチド連鎖がらなる部分５を
担持する。 またシステムにおける存在は架橋体３のポリヌクレオチ
ド部分５にアニーリングし得るポリヌクレオチド部分７
を有する信号発信体６である。信号発信体６は寸だ信号
発信部分８を担持する。分析物が分析ざれる試料中Ｋ存
在する時、認識可能および認識部分２と４を夫々介して
架橋体３との相互作用が起る。それによって形成される
複合体はそれからポリヌクレオチド部分５を介して分析
物１とのある化学量論的関係の中へ信号発信部分８を持
って来る信号発信体上の補体ポリヌクレオチド部分７に
対してアニ−リングされる。 第２図は分析物９がＤＮＡ連鎖１０（一般的にＡＴＣＧ
ＡＴＣＧＡＴＣとして示される）からなる本発明のより
広い概念の下のよ）望ましいシステムを示す。単一ら、
ぜん形状の環状ポリヌクレオチドポリマーとして示され
る架橋体１１は分析物のＤＮＡ連鎖と補体をなすＤＮＡ
連鎖である認識部分１２を担持する。加うるに架橋体１
１は寸た信号発信体１４上の補体ポＩＪＣ連鎖１５との
安定なハイブリッドをアニーリングしそして形成するこ
との出来るポＩＪＧ連鎖１３を担持する。信号発信体１
４は１たその信号発信基としてビオチン部分１６を担持
丁る。分析される試料の中のＤＮＡ連釧の存在は架橋体
１１へのハイブリ，ド化を惹起し、そコ１，に続く信号
発信体のかくして形成された複合体へのアニーリングは
網状形状を介してビオチン部分を分析物に結合ずる。該
ビオチン部分１６はぞの後例えばアビジン／酵素結合体
の添加、次いで酵素基質の添加、セして色検出によって
検出されることが出来る。 −２９４＋１ −２９５−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．（１）分析物（５）上の分子的認識可能部分を認識
することが出来る部分および （１リボリヌクレオチド連鎖からなる部分を有する分子
架橋体（Ｂ） および （１）該架橋体の該ポリヌクレオチド部分にアニーリン
グすることが出来、それによって安定なポリヌクレオチ
ドノ）−イブリツドを形成するポリヌクレオチド部分、
および （１１）信号発信部分 を有する信号発信体（０を提供すること、および （１）該分子的認識可能部分を介して複合化されている
該分析物（４） （２）該架橋体（Ｂ）の認識部分（該架橋体（Ｂ）は該
ポリヌクレオチド部分を介してそれに複合化されている
。） （３）該信号発信体（Ｃ）のポリヌクレオチド部分から
なる複合体を形成すること、 および 該複合体中に存在する該信号発信部分によシ信号を検出
すること、 からなる分子的認識可能部分を有する分析物（Ａ）を試
料中で検出する方法。 ２．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
分析物は生物学的または非生物学的試料に存在する。 ３．「特許請求の範囲１、」に記載の方法において、該
分析物の分子的認識可能部分は蛋白質様物質である。 ４．［許錆求の範囲１．」に記載の方法において、該分
析物の分子的認識可能部分は核酸からなる。 ５．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
分析物の分子的認識可能部分はサソカライドからなる。 ６．１特許請求の範囲３，４または５．」に記載のいか
なる方法においても、該分析物は抗原、抗体、受容体、
ウイルス、ウイルス構成要素、ノ《クテリア、バクテリ
ア構成要素、細胞、細胞構成要素、咬たけ試料のいかな
る病原性、あるいは非病原性構成要素からなる群から選
択される。 ７．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
架橋体上の該昭識部分はポリヌクレオチド連鎖からなる
。 ８．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、、
該架橋体上の該認識部分は抗原からなるＯ９「特許請求
の範囲１．」に記載の方法において、該架橋体上の該認
識部分は抗体からなる。 １０．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該架橋体上の該認識部分はサツカライドからなる０ １１．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該架橋体上の該認識部分はレクチンからなる。 １２．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該架橋体上の該認識部分はホルモンからなる。 １３．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該架橋体上の該認識部分は受容体からなる。 １４，「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該架橋体上の該認識部分は酵素阻害物質寸たは酵素補助
因子からなる。 ｌ５．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該架橋体上の該認識部分は酵素活性位置、補助因子結合
位置、一または受容体蛋白質からなる。 １６「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
架橋体上の該ポリヌクレオチド連鎖は遺伝子生成物また
はそれらの断片に対するコードを有する。 １７．「特許請求の範囲１，」に記載の方法において、
該架橋体上の該ポリヌクレオチド連鎖は遺伝子連鎖捷た
けそれらの断片に対するコードを有しない０ １８「特許請求の範囲１，」に記載の方法において、該
架橋体上の該ポリヌクレオチド連鎖はポリデオキシＧ１
ポリデオキシＣ１ボリデオキシＴ″ｔ！たはポリデオキ
シＡ連鎖、またはポリーリボまたはーデオキシリボプリ
ン、ピリミジンまたは類似物からなる。 １９．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該架橋体上の該ポリヌクレオチド連鎖はグアノシン残基
の豊富な連鎖部分から々る。 肋．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖は他のポリヌクレオ
チド連鎖に共有結合されている。 ２１．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖は抗体に共有結合
烙れている。 ｎ．「特許請求の範囲１」に記載の方法において、該架
橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖は抗原に共有結合され
ている。 膿．［特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
架橋体甲の該ポリヌクレオチド連鎖はサツカライドに共
有結合されている。 「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該架橋
体中の該ポリヌクレオチド連鎖はレクチンに共有結合さ
れている。 ５．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖はホルモンに共有結
合されている。 「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該架橋
体中の該ポリヌクレオチド連鎖は受容体に共有結合され
ている。 ２７．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖は酵素阻害物質ま
たは酵素補助因子に共有結合されているＯ 「特許請求の範囲１，」に記載の方法において、該架橋
体中の該ポリヌクレオチド連鎖は酵素に共有結合されて
いる。 「特許請求の範囲７，」に記載の方法において、該架橋
体は環状ＤＮＡボリマーである。 ［特許請求の範囲２９，」に記載の方法において、該Ｄ
ＮＡは単一らせん形状をなす。 「特許請求の範囲２９．」に記載の方法において、該環
状ＤＮＡポリマーは線状ファージから誘導される。 ［特許請求の範囲３１．」に記載の方法において、線状
ファージはＭ１３またはそれの変種である。 「特許請求の範囲３２．」に記載の方法において、該Ｍ
１３ファージはグアノシン残基またはシトシン残基の豊
富な連鎖部分を担持する。 ［特許請求の範囲１．Ｊに記載の方法において、該信号
発信体上の該ポリヌクレオチド部分け遺伝子生成物また
はその断片に対するコードを有する。 「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該信号
発信体上の該ポリヌクレオチド部分は遺伝子生成物また
はその断片に対するコードを有しない。 「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該信号
発信体上の該ポリヌクレオチド部分はポリデオキシＣ１
ボリデオキシＧ１ボリデオキシＡ、ポリデオキシＴ連鎖
、または低度複雑性の繰返し連鎖からなる。 「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該信号
発信体上の該ポリヌクレオチド部分はシトシン残基壕た
はグアノシン残基の豊富な連鎖部分からなる。 「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該信号
発信体はポリヌクレオチドポリマーである０ 「特許請求の範囲３８，」に記載の方法において、該ポ
リヌクレオチドポリマ−は自然発生変性ＤＮＡである。 「特許請求の範囲３９，」に記載の方法において、該ポ
リヌクレオチドボリマーはＴ（均等）ファージから誘導
される。 「特許請求の範囲４０，」に記載の方法において、該Ｔ
（均等）ファージはＴ４である。 「特許請求の範囲３９．」に記載の方法におい、、該変
性ＤＮＡは，宮化挿い物オ？持す．。 「特許請求の範囲３８．」に記載の方法において、該ボ
リマーは単一らせん形状をなす。 ４４「特許請求の範囲４３．」に記載の方法において、
該ポリマーは線状ファージから誘導される。 ４５，「特許請求の範囲４４．」に記載の方法において
、該フ７−ジはＭ１３またはそれの変種である０ ４６「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
信号発信体の該信号発信部分は放射性ラベル付される。 ４７．「特許請求の範囲１，」に記載の方法において、
該信号発信体の該信号発信部分は放射性ラベル付されな
い。 ４８，「特許請求の範囲４７．」に記載の方法において
、該信号発信部分は酵素からなる。 ４９．「特許請求の範囲４７．」に記載の方法において
、該信号発信部分はビオチン部分からなる。 刃，「特許請求の範囲４７，」に記載の方法において、
該信号発信部分は螢光化合物からなる。 ５１．「特許請求の範囲４７．」に記載の方法において
、該信号発信部分は高電子密度化合物からなる。 ５２．「特許請求の範囲４７．」に記載の方法におい−
て、該信号発信部分は不溶性相からなるがまたはそれと
結合している。 ５３．置特許請求の範囲５２，」に記載の方法において
、該不溶性相はラテノクス粒子、樹脂、またはバクテリ
アからなる。 ５４．ｒ特許請求の範囲４７．」に記載の方法において
、該信号発信部分は抗体または抗原からなる。 ５５．「特許請求の範囲４７．」に記載の方法において
、該信号発信部分はサツヵライドまたはレクチンからな
る。 ５６．［特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該信号発信部分による信号を検出する該ステップは放射
能測定からなる。 ５７．「特許請求の範囲１，」に記載の方法において、
該信号発信部分による信号を検出する該ステップは酵素
反応からなる。 ５８「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
信号発信部分による信号を検出する該ステップは螢光測
定または電子顕微鏡的測定からなる。 ５９「特許請求の範囲４７．」に記載の方法において、
該信号発信部分は信号を含んでいる部分を確認すること
が出来るポリヌクレオチド連鎖である。 ６０．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該信号発信部分による信号を検出する該ステップは抗体
／抗原複合化反応からなる０ ６１．１特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該信号発信部分による信号を検出する該ステップはビオ
チンとビオチン結合部分との間の複合化反応からなる。 区，「特許請求の範囲６１，」に記載の方法において、
該部分はアビジン、ストレプトアビジンまたは抗一ビオ
チン抗体である。 ６３．「特許請求の範囲１」に記載の方法において、該
信号発信部分による信号を検出する該ステップは高電子
密度化合物の検出からなる。 鑓．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
信号発信部分による信号を検出する該ステップはサツカ
ライドとレクチンとの間の複合化反応からなる。 ６５．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該信号発信部分による信号を検出する該ステップは不溶
性相上に結合するステップからなる。 ６６．「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該信号発信部分による信号を検出する該ステップは自然
発生変性ＤＮＡ上のクローン挿入物と架橋体との間の複
合化、それに続く変性レクチンの該信号発信体への結合
からなる。 ６７．［特許請求の範囲６６．」に記載の方法において
、該変性ＤＮＡはＴ４ファージから誘導される。 ６８．「特許請求の範囲６５．」に記載の方法において
、該不溶性相はラテックス粒子である。 ６９，「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
該分析物の該認識可能部分はポリヌクレオチド連鎖であ
シ、該架橋体上一猛識部分はそれに対して安定にアニー
リングすることが出来るボリヌクレオチド連鎖であシ、
該架橋体は単一らせん形状をなすＤＮＡボリマーであシ
、そして該信号発信体上の該信号発信部分による検出の
該ステップは非放射性検出にもとづく。 ７０．「特許請求の範囲６９．」に記載の方法において
、該架橋体は線状ファージから誘導される。 ７１．「特許請求の範囲６９．」に記載の方法において
、該信号発信体は線状ファージから誘導される。 ７２．抗体に共有結合されるポリヌクレオチド連鎖。 ７３．「特許請求の範囲７２．」に記載の方法において
、該抗体は単一クローンである。 ７４．ｖクチンに共有結合されるポリヌクレオチド連鎖
。 ７５．２０までのサツカライド単位を有するサツヵライ
ドに共有結合されるポリヌクレオチド連鎖。 ７６．受容体に共有結合されるポリヌクレオチド連鎖。 ７７．＊ルモンに共有結合されるポリヌクレオチド連鎖
。 ７８．ポリｄＧＴ，ポリｄＡＣ，ポリｄＣＴ，ポリｄＡ
ｔ，；ｔ”！ＪｄＧＣ，，Ｉ−”ＩＪｄＧＡ，ポ！Ｊｄ
Ｇ，ポリｄＣ，ｆ？Ｉ）ｄＴ、ボｌＪｄＡ、そして繰返
し低複雑性ポリヌクレオチドからなる群から選択された
連鎖からなるポリヌクレオチド部分を担持しているＤＮ
Ａ分子。 ７９線状ファージである「特許請求の範囲７８．」のＤ
ＮＡ分子。 （資）．Ｍ１３またはそれの変種である「特許請求の範
囲７９．」のファージ。 ８１．「特許請求の範囲７８．または７９．」に記載の
いかなるＤＮＡ分子Ｋおいても、該連鎖は少くとも一つ
のオリゴヌクレオチドである。 ８２．また核酸を含んでいる生物体の遺伝子連鎖の全体
の部分と対をなすポリヌクレオチド連鎖を担持する「特
許請求の範囲７８．または７９．」の該ＤＮＡ分子。 羽．「特許請求の範囲８２．」に記載のＤＮＡ分子にお
いて、該生物体はウィルス、原子核または真生核細胞で
ある。 ８．「特許請求の範囲８３．ＪＫ記載のＤＮＡ分子にお
いて、該原始核細胞はバクテリアである。 あ．「特許請求の範囲８３．」に記載のＤＮＡ分子にお
いて、該真生核細胞は啼乳動物細胞である。 あ．線状ファージである「特許請求の範囲８２−」のＤ
ＮＡ分子。 ８７．Ｍ１３またはそれの変種である「特許請求の範囲
８２，」のＩＩ）ＮＡ分子。 滋非放射性ラベルされた信号発信部分に共有結合される
環状ＤＮＡ分子０ ８９．線状ファージである「特許請求の範囲８８．」の
ＤＮＡ分子。 （イ）ボリｄＧＴ，ボリｄＡＣ，ボリｄＣＴ，ポリｄＡ
Ｔ，ポリｄＧＣ，ボリｄＧＡ，ポリｄＧ，ボリｄＣ，ボ
リｄＴ、ポｌＪｄＡ、そして繰返し低複雑性ポリヌクレ
オチドからなる群から選ばれた連鎖からなるポリヌクレ
オチド部分を担持する「特許請求の範囲８８，または８
９．」のＤＮＡ分子。 ９１．シトシン残基の豊富なポリヌクレオチド部分を担
持する「特許請求の範囲８８．または８９」のＤＮＡ分
子。 η「特許請求の範囲９０．」に記載のＤＮＡ分子におい
て、該連鎖はオリゴヌクレオチドである。 ９３．遺伝子の部分もしくは全体に対するニードを有す
る連鎖からなるポリヌクレオチド部分を担持する「特許
請求の範囲８８．または８９．」のＤＮＡ分子。 鳴．「特許請求の範囲８８．または８９．」に記載のＩ
）ＮＡ分子において、該信号発信部分は放射性ラベルか
らなる。 ９５．「特許請求の範囲８８．または８９」に記載のＤ
ＮＡ分子Ｋおいて、該信号発信部分は非放射性ラベル付
けされる。 ％．［特許請求の範囲９３．」に記載のＤＮＡ分子にお
いて、該信号発信部分は酵素からなる。 ９７．「特許請求の範囲９３．」に記載のＤＮＡ分子に
おいて、該信号発信部分はビオチン部分からなる０ ９８．「特許請求の範囲９３．」に記載のＤＮＡ分子に
おいて、該信号発信部分は抗体からなる。 ９９．「特許請求の範囲９３，」に記載のＤＮＡ分子に
おいて、該信号発信部分は螢光物質からなる。 １００．Ｉ）密閉部中に１個またはそれ以上の物入れ手
段を受け入れるために区画された入れ物■）（り分析物
囚上の分子的認識可能部分を認識することが出来る部分
、および （Ｉ１）ポリヌクレオチド連鎖からなる部分を有する分
子架橋体（Ｂ）を含む第１物入れ手段および ■）（り該架橋体の該ポリヌクレオチド部分にアニーリ
ングすることが出来、それによって安定なポリヌクレオ
チド／１イプリツドを形成するポリヌクレオチド部分、
および （１１）信号発信部分 を有する信号発信体（Ｃ）を含む第２物入れ手段からな
る分子的認識可能部分を有する分析物囚の検出のために
有用カキット。 １０１．ＩＶ）該信号発信手段からの信号を検出するた
めに必要とされる構成要素を含む第３物入れ手段 を更に設けた「特許請求の範囲ｉｏｏ．Ｊのキット０ １０２．ｒ特許請求の範囲１００−Ｊに記截のキットに
おいて、該架橋体上の該認識部分はポリヌクレオチド連
鎖からなる。 １０３．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体上の該認識部分は抗原からなる０ １０４［特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットにお
いて、該架橋体上の該認識部分は抗体からなる０ １０５．’ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキット
において、該架橋体上の該認識部分はサツカライドから
なる。 １０６「特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットにお
いて、該架橋体上の該認識部分はレクチンからなる。 １０７．ｒ特許請求の範囲１００．ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体上の該認識部分はホルモンからなる。 １０８［特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットにお
いて、該架橋体上の該認識部分は受容体からなる。 １０９．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体上の該認識部分は酵素阻害物質または
酵素補助因子からなる。 ｉ１Ｑ．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体上の該認識部分は酵素活性位置または
補助因子結合位置からなる。 １１１．ｒ特許請求の範囲１００。」に記載のキットに
おいて、該架橋体上のポリヌクレオチド連鎖は遺伝子生
成物またはその断片に対するコードを有する。 １１２．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体上のポリヌクレオチド連鎖は遺伝子生
成物１たはその断片に対するコードを有しない。 １１３．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体上のポリヌクレオチド連ｇＩＪｄＧ，
ポリｄＣ、ポリｄＴ，ポリｄＡ連鎖または低度複雑性（
繰返し）ポリヌクレオチドからなる０ １１４．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体上のポリヌクレオチド連鎖はグアノシ
ン残基金豊富に含む連鎖部分からなる。 １１５．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖は他のポ
リヌクレオチド連鎖に共有結合される。 １１６．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖は抗体に
共有結合される。 １１７．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖は抗原に
共有結合される０ １１８．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖はサツカ
ライドに共有結合される。 １１９．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖はレクチ
ンに共有結合される。 １２０．ｒ特許請求の範囲１００」に記載のキットにお
いて、該架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖はホルモン
に共有結合される。 ＩＺＬ．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖は受容体
に共有結合される。 １２２．ｒ特許請求の範囲１００．４に記載のキットに
おいて、該架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖は酵素阻
害物質または酵素補助因子に共有結合される。 １２３．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体中の該ポリヌクレオチド連鎖は酵素に
共有結合される。 １２４．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該架橋体は環状ＤＮＡボリマーである。 １２５．ｒ特許請求の範囲１２４．Ｊに記載のキットに
おいて、該環状ＤＮＡは単一らせん形状をなす。 １２６．ｒ特許請求の範囲１２５．Ｊに記載のキットに
おいて、該環状ＤＮＡポリマーは線状ファージから誘導
される。 １２７．ｒ特許請求の範囲１２４．Ｊに記載のキットに
おいて、該線状ファージはＭ１３またはそれの変種であ
る。 １．２８．ｒ特許請求の範囲１２５．４に記載のキット
において、該Ｍ１３ファージはグアノシンまたはシトシ
ン残基を豊富に含む連鎖部分を担持する０１２９．ｒ特
許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットにおいて、該信
号発信体上の該ポリヌクレオチド部分は遺伝子生成物ま
たはその断片に対するコードを有する。 １３０．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該信号発信体上の該ヌクレオチド部分は、遺伝
子生成物またはその断片に対するコードを有しない。 １３１．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該信号発信体上の該ポリヌクレオチド部分はボ
リｄＣ，ボリｄＧ、ボリｄＡ，ボリｄＴ連鎖または繰返
し低複雑性ポリヌクレオチドからなる。 １３２、［特求請求の範囲ｉｏｏ．Ｊに記載のキノトに
おいて、該信号発信体上の該ポリヌクレオチド部分はシ
トシンまたはグアノシン残基を豊富に含む連鎖部分から
なる。 １３３．ｒ特許請求の範囲１００．４に記載のキノトに
おいて、該信号発信体は環状ＤＮＡポリマーである。 １３４．ｒ特許請求の範囲１３３．４に記載のキットに
おいてあＮＡは単一らせん状をなす。 １３５．ｒ特許請求の範囲１３４．Ｊに記載のキットに
おいａＮＡは線状ファージから誘導される。 １３６．ｒ特許請求の範囲１３５．Ｊに記載のキットに
おいて、該ファージはＭ１３またはそれの変種である。 １３７．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該信号発信体上一箸号発信部分は放射性ラベル
付される。 １３Ｂ．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
湾 おいて、該信号発信体上号発信部分は放射性ラベル付さ
れない。 １３９．ｒ特許請求の範囲１３８．Ｊに記載のキットに
おいて、該信号発信部分は酵素からなる。 １４０．ｒ特許請求の範囲１３８．Ｊに記載のキットに
おいて、該信号発信部分はビオチン部分からなる０ １４ｉ．ｒ特許請求の範囲１３Ｂ．」Ｋ記載のキットに
おいて、該信号発信部分は螢光物質がらなる。 １４２．ｒ褥許請求の範囲１３８．Ｊに記載のキットに
おいて、該信号発信部分は高電子密度化合物からなる。 １４３．ｒ特許請求の範囲１３８．Ｊに記載のキットに
おいて、該信号発信部分は不溶性相からなるがまたはそ
れと結合している。 １４４．ｒ特許請求の範囲１３８」に記載のキットにお
いて、該不溶性相はラテックス粒子、樹脂、またはバク
テリアからなる。 １４５「特許請求の範囲１３８．４に記載のキットにお
いて、該信号発信部分は抗体からなる。 １４６，ｒ特許請求の範囲１３８．４に記載のキットに
おいて、該信号発信部分はサツヵライドからなる。 １４７．ｒ特許請求の範囲１００．Ｊに記載のキットに
おいて、該分析物上の該認識可能な部分はポリヌクレオ
チド連鎖であシ、該架橋体上の該認識可能な部分はそれ
に安定にアニーリングすることの出来るポリヌクレオチ
ド連鎖であシ、該架橋体は単一らせん形状をなすＤＮＡ
ボリマーであシ、そして該信号発信体上の該信号発信部
分は非放射性検出にもとづく。 １４８．ｒ特許請求の範囲１４７．Ｊに記載のキットに
おいて、該信号発信体は線状ファージから誘導される。 １４９．ｒ特許請求の範囲１４７．Ｊに記載のキットに
おいて、該信号発信体は線状ファージから誘導される。 １５０．Ｉ）（り分析物（４）上の分子的認識可能部分
を認識することが出来る部分、および （１１）認識可能な変性剤よシなる部分を有する分子架
橋体（６） および （り該架橋体（Ｂ）の該認識可能な変性剤に対して付着
または結合することが出来、それによって安定な複合体
を形成する該認識可能な変性剤に対する受容体、および （り信号発信部分 を有する信号発信体（Ｏ を提供するとと および （１）該分子的認識可能部分を介してそれに結合されて
いる該分析物囚 （２）分析物（４）の該分子的認識可能部分を認識する
ことが出来る該分子架橋体の）の該部分（該分子架橋体
の）は該認識可能変性剤を介してそれに複合化される。 ） （３）該受容体を介して該架橋体（Ｂ）の該認識可能な
変性剤に付着または結合することの出来る信号発信体Ω からなる複合体を形成すること からなる分子的認識可能部分を有する分析物（４）を試
料中で検出する方法。 １５１．ＩＩ）ターゲット分析物、受容体部分を介して
それに結合された変性第１受容体（その変性部分は該第
１受容体の該変性部分に対して第２受容体に結合され、
該第２受容体はそれに結合された信号発信体を有する）
からなる安定な検出可能複合体。 １５２．（４）該蛋白質受容体に結合可能な蛋白質、お
よび ■）該蛋白質受容体に結合可能な該蛋白質に結合してい
るポリヌクレオチド からなる蛋白質受容体を検出可能な物質。 １５３，更に該ポリヌクレオチドに結合している信号発
信部分からなる「特許請求の範囲＋５２．Ｊに記載の物
質。
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