JPH11503828A - 複製可能なｄｎａテンプレートと抗体との接合体を用いた高感度イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 非特異的シグナルを最小化したイムノアッセイのための新規シグナル増幅システムが開示されている。イムノアッセイの方法、試薬および試験キットが、増加された感度のイムノアッセイを得るために開示されている。試薬は、抗体−変異体ＤＮＡ接合体であって、そこにおいて変異体ＤＮＡは、ＱＢレプリカーゼ等のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの基質であるものを含む。試験試料中の分析対象を検出、または検出および定量するためのイムノアッセイ方法は、分析対象に結合された前記抗体−変異体ＤＮＡ接合体の変異体ＤＮＡをＲＮＡに転写し、ＲＮＡ転写産物を複製し、そこにおいて変異体ＲＮＡ複製産物の存在または定量が試料中の分析対象の存在または定量と関連づけることが可能であるものから成る。さらに、試験試料中の２またはそれより多くの分析対象を同時に検出、あるいは検出および定量するための方法が提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】 複製可能なＤＮＡテンプレートと 抗体との接合体を用いた高感度イムノアッセイ 発明の分野 本発明は免疫化学の一般的分野にある。より詳細には、本発明は、望ましくな いバックグラウンドシグナルを最小化した新規シグナル増幅において、ＱＢレプ リカーゼ等の適当なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとともに、変異体ＤＮＡテ ンプレートと接合された抗体が用いられる高感度イムノアッセイに関する。発明の背景 特定の抗原に対するイムノアッセイは、臨床診断のための、および多様な分子 および細胞分析のための強力な道具である。本発明は、変異体ＤＮＡを増幅可能 レポーター遺伝子として用いることによるイムノアッセイの感度の促進に向けら れている。 従来のイムノアッセイの感度は、事実上、特定の抗体−分析対象の相互作用に ついては、通常解離定数として称されている平衡定数の値によって支配されてい る。平衡または解離定数は、与えられた反応物質の濃度で形成される抗体−分析 対象の濃度の量を反映している。典型的な解離定数の値は１０^-7Ｍから１０^-12 Ｍの範囲において見られる。例えば、解離定数に等しい抗体濃度においては、平 衡においては、微量分析対象の約５０％が抗体と複合化される。 イムノアッセイの感度を最大化するための努力には、酵素などの標識を、検出 可能な抗体−分析対象複合体の数が最大化されるように取り付けることが含まれ る。このような接近法の究極の目的は、単一の分析対象−抗体複合体が検出可能 であることである。 Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１ ４：５５９１（１９８６）］による記事は、ミディ変異体（ｍｉｄｉｖａｒｉａ ｎｔ）ＲＮＡを増幅可能なレポーターとして、バイオアッセイの感度を増加させ るために利用することに関する。ミディ変異体ＲＮＡは、ＱＢレプリカーゼによ り 触媒されるそれ自身の複製のテンプレートとして作用する。［Ｍｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７１：２８１（１９８３）．］ミディ変 異体ＲＮＡの単一の分子は、理論上は、ＱＢレプリカーゼによって、従来の放射 性または非放射性技術による検出を可能とするために十分なコピーを与えるよう に増幅され得る。Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，前出は、５６０２頁において「複製可 能なレポーターとして［ミディ変異体ＲＮＡを］・・・用いたアッセイシステム の理論上の感度は、標的１分子に近くなくてはならない。」と述べている。しか しながら、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．は、それらは「到達し得る実際の検出限界は、 試料に対するレセプターの、減少させることができない非特異的吸収により決定 されることが予想される」と続いて述べている。 そのようなミディ変異体ＲＮＡ標識を担持しているレセプターの非特異的吸収 の問題は、ミディ変異体ＲＮＡテンプレートが複製される効率のせいで、深刻な 欠点で有り得る。比較的少量の非特異的に吸収されたレセプター由来のミディ変 異体ＲＮＡテンプレートは、特異的に結合したレセプターからのシグナルを妨害 する極度に高いバックグラウンドシグナルという結果となり得る。ミディ変異体 ＲＮＡを増幅可能なレポーターとして用いたそのようなアッセイの感度は、それ 故に制限される。 本発明は、ミディ変異体ＲＮＡよりはむしろ、変異体ＤＮＡを、ＱＢレプリカ ーゼ等の適当なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼでのＲＮＡ合成のテンプレート として用いることによりこの問題を解決する。ナノ変異体ＤＮＡおよびミディ変 異体ＤＮＡ等の変異体ＤＮＡは、それらのＲＮＡ対応部分ほどは効率良く複製さ れないので、そのようなＤＮＡテンプレートは、変異体ＲＮＡが用いられた場合 に起こりうる、極度に高いバックグラウンドシグナルという潜在的な問題を克服 している。 本発明のイムノアッセイの方法論は、変異体ＤＮＡを、抗体または生物学的に 活性な抗体断片と接合した増幅可能な標識として用いている。本発明の増幅可能 ＤＮＡテンプレートを利用することの、抗体の標識としてのそのＲＮＡ対応部分 を凌ぐ利点は幾つかある。第１には、現在のＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成方 法は、それらのＲＮＡ対応部分よりもさらに発展している。第２に、ＤＮＡは本 質的にＲＮＡよりも安定である。同様に、上で示されたように、ＤＮＡテンプレ ートの複製の相対的な非効率性は、抗体接合体の非特異的結合によって発生され る潜在的なシグナルを隠すために効率的に利用可能であり、このように、本発明 のアッセイは、対応するＲＮＡテンプレート接合体を用いたアッセイよりも高感 度である。発明の概要 本発明は、１つの側面においては、トレーサー抗体として抗体−変異体ＤＮＡ 接合体を用いるイムノアッセイ方法であって、そこにおいて変異体ＤＮＡはＲＮ Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼの基質であるものに関連している。その接合体を用 いることにより、イムノアッセイのための新規シグナル増幅システムが提供され る。 接合体の抗体は、アッセイにおける分析対象、またはイムノアッセイにおいて 用いられる抗分析対象抗体を標的としていてもよい。保温し、未結合抗体−変異 体ＤＮＡ接合体を、アッセイにおける分析対象に結合したものから分離した後、 分析対象に結合した変異体ＤＮＡは転写され、ＲＮＡ転写産物が、変異体ＤＮＡ を基質とする適当なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとの接触により、リボヌク レオシドの存在下で複製される。 アッセイにおいて生成されたＲＮＡ複製産物の検出は、アッセイにおいて分析 対象の存在を示す。ＲＮＡ複製産物はまた定量化することが可能で、複製産物の 量とアッセイされた分析対象の量とを相関させることができる。このように、本 発明のイムノアッセイ方法は、試験試料中の分析対象を検出するため、または検 出および定量するために用いることができる。 さらには、本発明のイムノアッセイ方法は、試験試料中の２またはそれより多 くの分析対象を同時に、検出する、または検出および定量するために利用するこ とができる。そのような方法は、２またはそれより多くの異なった抗体−変異体 ＤＮＡ接合体の利用を含み、そこにおいて、異なった接合体の変異体ＤＮＡはそ の中に挿入された異なったＤＮＡ配列を含み、またそこにおいて、前記挿入され たＤＮＡ配列は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートである天然に 生じる変異体ＲＮＡ配列と一致しない。これらのＤＮＡ配列は、好ましくは、非 変異体ＤＮＡである。挿入されたＤＮＡ配列は、好ましくは、変異体ＤＮＡの３ ’末端から１０塩基以内ではない、より好ましくは３’末端から２０塩基以内で はない位置に挿入される。 試験試料中の２またはそれより多くの分析対象を同時に、検出、または検出お よび定量の方法のいくつかの実施態様において、異なった接合体の抗体、即ち、 異なった挿入されたＤＮＡ配列を含む変異体ＤＮＡに接合された抗体は、異なっ た分析対象に特異的であり、一方で、同じ挿入されたＤＮＡ配列を含む変異体Ｄ ＮＡに接合された抗体は、同じ分析対象に特異的である。核酸プローブ、好まし くはＲＮＡプローブであって、異なった変異体ＲＮＡ複製産物に相補的であるも のが、このようなイムノアッセイ方法のＲＮＡ複製産物の検出または検出および 定量に好ましくは用いられる。同じ変異体ＲＮＡ複製産物に相補的なプローブは 同じように標識され、一方で異なった変異体ＲＮＡ複製産物に相補的なプローブ は異なるように標識される。 本発明の抗体−変異体ＤＮＡ接合体を含むイムノアッセイ試薬を、以下に、そ のような接合体を調製する代表的な方法とともに記述する。典型的なイムノアッ セイ試薬は、前述の抗体−変異体ＤＮＡ接合体の変異体ＤＮＡが、前記接合体の 抗体に、アビジン−ビオチン、好ましくはストレプトアビジン−ビオチン、ブリ ッジ、プロテインＡを介して、または異種二重機能性結合剤を用いて接合されて いる。この他の典型的な試薬には、アビジンおよび／またはプロテインＡに接合 された変異体ＤＮＡが含まれてもよい。 上述のように、異なったＤＮＡ配列が本発明のイムノアッセイ試薬の変異体Ｄ ＮＡ中に、別々の増幅可能なシグナルを発生する試薬を提供するために挿入され てもよい。このような挿入されたＤＮＡ配列を有する変異体ＤＮＡを含む試薬は 、本発明の方法において、試験試料中の２またはそれより多くの分析対象を同時 に検出、または検出および定量するために用いられてもよい。 イムノアッセイ試験キットもまた開示されている。このようなイムノアッセイ 試験キットは、本発明のイムノアッセイ試薬および適当なＲＮＡ依存性ＲＮＡポ リメラーゼを含み、そこにおいて、試薬の変異体ＤＮＡはポリメラーゼの基質と なっている。このような試験キットはさらに、抗分析対象抗体またはアッセイに おける分析対象のレセプターが取り付けられている固相を含んでいてもよい。こ のようなイムノアッセイ試験キットの他の実施態様は、アビジン、好ましくはス トレプトアビジンおよび／またはプロテインＡに接合された変異体ＤＮＡを含ん でいてもよい。略語 ＡＴＰ − アデノシン３リン酸 ＣＤＲ − 相補的決定領域 ｃｐｍ − １分あたりの計数 ＣＴＰ − シチジン３リン酸 ｄＡＴＰ − デオキシアデノシン３リン酸 ｄＣＴＰ − デオキシシチジン３リン酸 ｄＧＴＰ − デオキシグアノシン３リン酸 ＤＮＡ − デオキシリボ核酸 ＤＴＴ − ジチオスレイトール ｄＴＴＰ − デオキシチミジン３リン酸 ＥＤＣ − １−エチル−３−（３−ジエチルアミノプロピル） カルボジイミド ＥＤＴＡ − エチレンジアミン４酢酸 ＧＴＰ − グアノシン３リン酸 ｈｒ − 時間 Ｍ − モル濃度 ＭＢＳ − ｍ−マレイミドベンゾイル Ｎ−ヒドロキシルサク シニミド エステル ｍｌ − ミリリットル ｍＭ − ミリモル濃度 ｎｍｏｌ − ナノモル ＰＢＳ − リン酸緩衝生理食塩水（５０ｍＭＮａＰＯ₄、１５ ０ｍＭＮａＣｌ） ＰＢＳＥ − １ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ ＰＭＰ − 常磁性粒子 ＲＮＡ − リボ核酸 ＳＭＣＣ − サクシニミジル ４−（Ｎ−マレイミド−メチル） シクロヘキサン−１−カルボキシレート ＳＰＤＰ − Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルチオ）− プロピオン酸 ＵＴＰ − ウリジン３リン酸 μＭ − マイクロモル濃度 μｇ − マイクログラム詳細な説明 本発明の側面は、イムノアッセイ試薬である抗体−変異体ＤＮＡ接合体を考慮 している。この接合体はイムノアッセイシグナル増幅システムの構成要素である 。 促進されたイムノアッセイの感度のために、分析対象分子に関するシグナルは 、特に分析対象が微量の濃度である場合には、シグナルが可視であり、それ故に 検出可能であるように増幅される必要がある。本発明はそのようなシグナル増幅 システムを提供する。このシステムは、本発明の方法にしたがってアッセイされ た試料中の分析対象分子の数を示す増幅されたシグナルを生成することが可能で ある。 本発明に従って免疫複合体に結合された場合、接合体の変異体ＤＮＡはＲＮＡ に転写され、続いてＲＮＡ転写産物は、リボヌクレオチドの存在下で適当なＲＮ Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼとの接触により複製され、ＲＮＡ複製産物が生成さ れる。このように、各々の結合した変異体ＤＮＡテンプレート分子は転写され、 多くのＲＮＡ変異体分子が生成され得る。これらのＲＮＡ複製産物は適当な手段 、特に、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質等での標識、または酵素または挿 入染料による染色によって（以下に議論されるように）可視化される。 以下の実施例１−３は、本発明の抗体−変異体ＤＮＡ接合体の調製のためのい くつかの代表的な方法を示している。 実施例４は抗体に接合された変異体ＤＮＡの、ＲＮＡを合成するためのＲＮＡ 依存性ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートとして機能する能力を示している。実 施例４において、抗体に、代表的な架橋試薬ＳＰＤＰを介して接合されたナノ変 異体ＤＮＡが、ＱＢレプリカーゼに触媒されたナノ変異体ＲＮＡ合成のテンプレ ートとして機能する能力を保持していることを示している。このように、本発明 の代表的な抗体−変異体ＤＮＡ接合体は、増加された感度のイムノアッセイに用 いられ得ることを示すための証拠が提供されている。 全体の抗体の濃度は、接合された抗体の非特異的結合量、および、ＱＢレプリ カーゼ等のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって増幅可能であるのは、約１ ０００から１００００分子である。現在の、溶液中のナノ変異体ＤＮＡまたはミ ディ変異体ＤＮＡテンプレートの複製感度は、本発明者らによって、約１０００ ０分子であると発見されている。このレベル以下のＤＮＡテンプレートのレベル は、ＲＮＡ合成の検出可能なレベルを生成するとは見えないので、これらのレベ ルの非特異的結合からはバックグラウンドシグナルは期待されないであろう。こ のように１０００から１００００の分子は、本発明のイムノアッセイの理論上の 限界感度であろう。 システムの感度を、接合体の濃度、および抗体の濃度、ポリメラーゼ濃度、お よび検出方法等の他の重要な要素を変えることによりある程度制御することが可 能である。特定のイムノアッセイは、当業者に公知の方法により最適化すること ができる。 分析対照の抗体−変異体ＤＮＡ接合体への直接的または間接的結合ののち、例 えば、固相に取り付けられた第２の抗体等の、第２の試薬との結合が、従来のイ ムノアッセイフォーマットとして行われ得る。このような固相試薬は、結合およ び非結合抗体−接合体の分離を実現する。 部分的に調製された固相は、常磁性粒子（ＰＭＰ）を含む［Ｃｉｂａ Ｃｏｒ ｎｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．；Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，Ｍａｓｓ ａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＵＳＡ）］。捕捉抗体または分析対照に対するアッセイに おいてのレセプターがこのようなＰＭＰに取り付けられている場合は、捕捉され た免疫複合体は、非結合抗体−変異体ＤＮＡ接合体から、磁場を応用することに よって分離することができる。 分離および従来のイムノアッセイにおけるような洗浄の後、吸収された抗体接 合体を有する固相は、ＱＢレプリカーゼ等のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと ともに、増幅されたシグナルを提供するために保温される。ナノ変異体ＲＮＡ、 ミディ変異体ＲＮＡ等の、増幅工程において合成された変異体ＲＮＡが、十分量 生成され、それを従来用いられているように、放射性または非放射性の多様な方 法によってそれを検出とする。 本発明の実施のための好ましい態様は、例えば、検出されるべき、または検出 および定量されるべき分析対象を含んでいる試料を、分析対象と特異的に結合し 、ナノ変異体またはミディ変異体ＤＮＡと接合されている抗体とともに十分な時 間量保温することを含む。他の好ましい態様は、そのような本発明に従った抗体 −変異体ＤＮＡ接合体を、決定されるべき分析対象に特異的な接合されていない 抗体と混合することであろう。このように、この実施態様においては、抗体によ り結合された分析対象の量は保持されるが、標識の量は減少され、それにより潜 在的バックグラウンドシグナルのレベルを減少させている。接合されたＤＮＡテ ンプレートは、微量の分析対象の検出を可能とするための増幅可能な標識として 機能する。 試験試料中の分析対象の検出のための、または検出および定量のための本発明 の典型的な方法は： （ａ）前記試験試料を抗体−変異体ＤＮＡ接合体を接触させるが、そこにおい て、前記接合体の前記抗体はアッセイにおいて分析対象に特異的か、または前記 試験試料に添加されたアッセイにおいて分析対象に特異的である第２の抗体に特 異的であり、またそこにおいて前記接合体の前記変異体ＤＮＡはＲＮＡ依存性Ｒ ＮＡポリメラーゼの基質であり； （ｂ）前記試験試料を、前記抗体−変異体ＤＮＡ接合体、および存在する場合 は前記第２の抗体と適切な時間量保温し； （ｃ）アッセイにおいて分析対象と結合していない抗体−変異体ＤＮＡ接合体 を除去し； （ｄ）前記分析対象に結合した接合体の変異体ＤＮＡをＲＮＡに転写し、ＲＮ Ａ転写産物を、前記変異体ＤＮＡおよびＲＮＡ転写産物を十分量の適当なＲＮＡ 依存性ＲＮＡポリメラーゼとリボヌクレオチドの存在下で接触させることにより 複製し；そして、 （ｅ）段階（ｄ）において何れかの変異体ＲＮＡが複製されたか否かを決定し 、前記ＲＮＡ複製産物の存在を前記分析対象の存在と関連づける；または段階（ ｄ）において複製された変異体ＲＮＡを検出、定量し、前記ＲＮＡ複製産物の量 を前記分析対象の量と関連づける、 各段階を含むものである。 このような方法はさらに、段階（ｃ）の前に、または段階（ｃ）と同時に、前 記試験試料を前記分析対象のレセプターと、または、第２の抗体が存在する場合 にはそれが標的としている以外の、または前記接合体の抗体が前記分析対象上の エピトープ部位を標的としている場合には前記接合体が標的としている以外の、 前記分析対象上の異なったエピトープ部位を標的としている付加的な抗分析対象 抗体と接触させる工程を含んでもよい。 このような好ましい実施態様の前記分析対象レセプターまたは前記抗分析対象 抗体は固相上に固定化されていてもよい。典型的な分析対象レセプターは、特に 、エストロゲンレセプター、黄体ホルモンレセプター、増殖因子レセプターであ る。２またはそれより多くの分析対象 他の好ましい実施態様は、そこにおいて試験試料中の２またはそれより多くの 分析対象が検出され、または同時に検出および定量されるものである。２または それより多くの、異なった抗体−変異体ＤＮＡ接合体がこのような実施態様にお いて用いられ、そこにおいて異なった接合体の変異体ＤＮＡは、それ自身に挿入 された異なったＤＮＡ配列を、好ましくは変異体ＤＮＡの３’末端から１０塩基 以外の、更に好ましくは３’末端から２０塩基以外の場所での位置に含んでいる 。 このような挿入されたＤＮＡ配列は、その変異体ＲＮＡ対応部分が、ＱＢレプ リカーゼ等のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの基質である変異体ＲＮＡテンプ レートにおいて天然には生じない配列である。より好ましくは、そのような挿入 された配列は、非変異体ＤＮＡである。［Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ，ヨーロッパ特許出願刊行物第４８１７０４号、「ミディ変異体テンプレートの 増幅」と題されたもの（１９９２年４月２２日刊行）を参照。］ このような挿入ＤＮＡ配列の長さは約１０ヌクレオチドから約１２０ヌクレオ チドであってもよい。好ましくは、変異体ＤＮＡはナノ変異体またはミディ変異 体ＤＮＡであり、そこにおいて挿入されたＤＮＡ配列の長さは好ましくは約１０ ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１０ヌクレオチドから 約３０ヌクレオチドである。 本発明に従って異なったＤＮＡ配列中に挿入するために、ミディ変異体ＤＮＡ は特に好ましい。ミディ変異体ＲＮＡにおいては天然に生じるＲＮＡ対応部分を 有していない挿入されたＤＮＡ配列であって、ＱＢレプリカーゼのテンプレート であり、約１０から約１２０塩基の長さを有するもの、はミディ変異体ＤＮＡか ら転写され、複製されることが判明している。このような配列は、好ましくは、 ミディ変異体ＤＮＡテンプレートの中程の位置に、またはミディ変異体ＤＮＡの ５’末端から１／４くらい、即ち５’末端から約５５から７０塩基の位置に挿入 されている。更に好ましくは、このような挿入されたＤＮＡ配列は、ミディ変異 体ＤＮＡの陽性鎖［ＭＤＶ−１（＋）ＤＮＡ］の約ヌクレオチド１３０から１３ １、または約ヌクレオチド６１から６４、より好ましくはヌクレオチド６３の位 置に挿入されている。 このような、試験試料中の２またはより多くの分析対象を同時に検出、または 検出および定量する実施態様は、そこにおいて、異なった挿入されたＤＮＡ配列 を有する変異体ＤＮＡに接合された抗体は異なった分析対象に特異的であり、一 方で同じ挿入されたＤＮＡ配列を有する変異体ＤＮＡに接合された抗体は同じ分 析対象に特異的である。当業者は、このような抗分析対象抗体を用いた他の機能 的に相当であるもの、例えば、アッセイにおいて１つの分析対象である場合、こ こに記載されているものに相当するアナログが、本発明に従って成功して用いら れ得ることを理解するであろう。 本発明の、２またはそれ以上の分析対象を同時に検出、または検出および定量 するためのアッセイにおいて、異なった変異体ＤＮＡが、異なった分析対象との 免疫複合体にそれぞれ結合されている場合、適当なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ ーゼとの接触により、転写され、そしてＲＮＡ転写産物は複製される。異なった 変異体ＲＮＡ複製産物は、異なるように標識された核酸プローブ、好ましくはＲ ＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによって検出される。好ましくは、プ ローブは接合体の変異体ＤＮＡ内部に挿入されたＤＮＡ配列のＲＮＡ対応部分に 相補的である。 プローブは変異体ＲＮＡ複製産物と標準的なハイブリダイゼーション条件でハ イブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、特定の構想されて いるイムノアッセイ、検出されるべき分析対象の数または標的ＲＮＡ複製産物の 配列に対するプローブの選択性等に応じて変化させることが好ましい。高い程度 の選択性が好ましい場合は、比較的厳密なハイブリダイゼーション条件、例えば 比較的低い塩濃度および／または高い温度条件、が用いられるであろう。このよ うな条件のもとでは、プローブと標的配列との間のミスマッチはほとんど有り得 ない。特定のイムノアッセイの条件を最適化する場合には、通常より厳密ではな い条件が望まれることも有り得る。 このように、本発明に従った代表的な、試験試料中の２またはそれより多くの 分析対象を同時に検出、または検出および定量するための方法は、上に概略を述 べた単一の分析対象に関して、同時に２またはそれより多くの異なった抗体変異 体ＤＮＡ接合体について典型的なイムノアッセイを行うことを含むが、そこにお いて、異なった接合体の変異体ＤＮＡはその中に挿入された異なったＤＮＡ配列 を含むという点で差違があるものである。特定のイムノアッセイの状況において 、変異体ＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡ配列は、接合された抗体が同じ結合特異性 を有している場合は同じであり、一方で、異なった結合特異性を有する抗体に接 合された変異体ＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡ配列は異なっている。 さらに、試験試料中の２またはそれより多くの分析対象を同時に検出、または 検出および定量するための典型的な本発明のイムノアッセイ方法は： （ａ）前記試験試料を２またはそれより多くの抗体−変異体ＤＮＡ接合体と接 触させるが、そこにおいて、異なった接合体の変異体ＤＮＡは、それ自身に挿入 された異なったＤＮＡ配列を有し；そこにおいて、異なった挿入されたＤＮＡ配 列を有する変異体ＤＮＡに接合された抗体は異なった分析対象に特異的であり、 一方で同じ挿入されたＤＮＡ配列を含む変異体ＤＮＡに接合された抗体は同じ分 析対象に特異的であり；そしてそこにおいて、前記接合体の変異体ＤＮＡはＲＮ Ａ依存性のＲＮＡポリメラーゼの基質であり； （ｂ）前記試験試料を前記２またはそれより多くの異なった抗体−変異体ＤＮ Ａ接合体とともに適当な時間量にわたって保温し； （ｃ）アッセイにおいて分析対象に結合しなかった抗体−変異体ＤＮＡ接合体 を除去し； （ｄ）分析対象に結合した接合体の変異体ＤＮＡおよび挿入されたＤＮＡ配列 をＲＮＡへ転写し、前記変異体ＤＮＡテンプレートおよびＲＮＡ転写産物を十分 量の適当なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとリボヌクレオチドの存在下で接触 させることにより複製し；そして （ｅ）段階（ｄ）で何れかの変異体ＲＮＡが複製されたかを決定し、もしそう であれば、何れのＤＮＡ変異体テンプレートまたはテンプレート群から、前記変 異体ＲＮＡが転写されたかを決定し、特定の変異体ＤＮＡから生成されたＲＮＡ 複製産物の存在を対応する分析対象、即ち、その特定の変異体ＤＮＡが接合され ている抗体が特異的である分析対象の存在と関連付ける；または、何れの変異体 ＤＮＡテンプレートまたはテンプレート群から、複製された前記変異体ＲＮＡが 段階（ｄ）において転写されたかを決定し、各々の異なった変異体ＲＮＡ複製産 物を定量し、各々のＲＮＡ複製産物の量を各々の対応する分析対象の量と関連付 ける。 異なった変異体ＤＮＡテンプレートからの複製された異なった変異体ＤＮＡは 、好ましくは段階（ｅ）で、２またはそれより多くの、複製された異なった変異 体ＲＮＡに相補的である異なるように標識された核酸プローブを用いて検出され るが、そこにおいて１つの型の複製された変異体ＲＮＡに相補的なプローブは同 じように標識される。好ましくは、異なるように標識された核酸プローブはＲＮ Ａプローブであり、前記異なった変異体ＤＮＡ中に挿入された異なったＤＮＡ配 列にそれぞれ相補的である。一般的試薬 本発明の抗体−変異体ＤＮＡ接合体は、一般的イムノアッセイ試薬でもよく、 または特定の分析対象を標的にしていてもよい。抗体−変異体ＤＮＡ接合体が一 般型である実施態様は、特定のイムノアッセイのためには好ましい。 典型的な一般的試薬は、接合体の抗体が、接合体の抗体が生成されたもの以外 の属の哺乳類を免疫化することにより生成された抗体を標的としているものであ ろう。例えば、接合体の抗体は、ヤギ抗マウス抗体であり得、そして、このよう に、マウス抗体を用いた何れのイムノアッセイのためのシグナル増幅システムの 成分として有用である。また、このような一般的試薬抗体の範囲には、このよう な抗体と機能的に相当である抗体、例えば、遺伝子的に操作されたものまたは他 の方法で調製されたもの等のヤギ抗マウス抗体に代表されるもの、および生物学 的に活性な抗体の断片が含まれる。 抗体−変異体ＤＮＡ接合体が一般型イムノアッセイ試薬と考えられる他の実施 態様は、変異体ＤＮＡがアビジンに結合され、ビオチニル化抗分析対象抗体が用 いられる場合である。この実施態様においては、一般的イムノアッセイ試薬は実 際にはアビジンに結合された変異体ＤＮＡ、好ましくはストレプトアビジンに結 合された変異体ＤＮＡである。その実施例の変異体ＤＮＡ−抗体接合体は、イム ノアッセイ手順の間に調製される。 本発明の多様な側面に関する詳細が以下に続く。一般的方法 ここにおいて、標準的な分子生物学および免疫学の教科書であって、本発明の 基本的な技術を実行するための方法および定義、例えば、イムノアッセイ技術、 ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ媒介増幅プロトコル、増幅された核酸の検出、 および自動触媒複製の機構と方法論等を含むものを参照した。例えば、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒ ｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｎ．Ｙ．１９９０）；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １５２［Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｎｄｏｎ）Ｌｔｄ． （１９８７）］；およびＧｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ： Ｐ ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏ ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ［Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ ｓ Ｉｎｃ．（Ｌｏｎｄｏｎ）Ｌｔｄ．；１９８３］を参照されたい。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ここにおいてしばしば「レプリカーゼ」 として言及される。この分野で知られていることは、このようなレプリカーゼは ＲＮＡ転写産物およびそれらの相補体を、それらのコピーが増大するように複製 、即ち再生産する酵素であるということであると考えられている。転写の過程に おいてレプリカーゼが存在する場合、転写の間に生成された複数の転写産物は、 それら自身で、ＲＮＡ転写産物の量を指数関数的に増加させるための複製を経る ことができることが予想される。 レプリカーゼは、そのレプリカーゼが生成されたＲＮＡ鎖よりもモル過剰であ る限りＲＮＡ転写産物を指数関数的に複製するために機能する。本発明の接合体 の変異体ＤＮＡはこのように、相補的ＲＮＡ鎖の合成のテンプレートとして機能 する。Ｎラウンド目の複製の後、各々の最初のテンプレート鎖について生成され た２^Nの鎖が存在するであろう。 レプリカーゼを用いるための条件はこの分野で良く知られている。例えば、Ｋ ｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８９：７１９（１９７４ ；およびＬｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６： １１９７（１９８８）を参照されたい。 ＲＮＡレプリカーゼはエッシリシア・コリＲＮＡファージから［Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，３： ７９０−８２４（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；１９７７）］；植物ＲＮＡウイルスから［Ｍｉｌ ｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８７：５３７（１９８６］ およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ中に存在する２次的触媒活性として［Ｋｏｎａｒ ｓｋａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｃｅｌｌ，５７：４２７（１９８９）］単離され ている。ＱＢレプリカーゼは、ＲＮＡポリメラーゼのもっとも良く特徴づけされ たものである。 ＱＢレプリカーゼは、本発明のイムノアッセイ方法において用いるためには特 に好ましいレプリカーゼである。［Ｍｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，”Ａｕｔｏｃａ ｔａｌｙｔｉｃ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮＡ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７１：２８１（１９８３）を参照され たい。］ＱＢレプリカーゼは、バクテリオファージＱＢ感染エッシリシア・コリ から、Ｅｏｙａｎｇ ａｎｄ Ａｕｇｕｓｔ ｉｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉ ｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２：８２９−８３９，［ｅ ｄｓ．Ｃａｎｔｏｎｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ ，Ｎ．Ｙ．；１９７１）］の手順により単離することが可能である。 ＱＢウイルスは約４４００リボヌクレオチドのＲＮＡウイルスである。［Ｂｌ ｕｍｅｎｔｈａｌ ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ，Ｖｏｌ．ＸＶ，Ｐａｒｔ Ｂ ，ｐ．２６７，ｅｄ．Ｐ．Ｄ．Ｂｏｙｅｒ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ ．Ｙ．；１９８２）を参照されたい。］ＱＢレプリカーゼはＱＢ ＲＮＡのみを 複製し、他のウイルスＲＮＡ配列を複製しないが、より短い、ＲＮＡ配列はまた 複製の基質として機能しうる。これらの短いテンプレートは長さ９０リボヌクレ オチドの「ナノ変異体」ＲＮＡおよび長さ２２０リボヌクレオチドの「ミディ変 異体」ＲＮＡである。 ミディ変異体ＲＮＡ、ＭＤＶ−１は、幅広く特徴づけられており、複製に必要 な特定の配列および構造を含むことが判明している。「１分子のＭＤＶ−１ Ｒ ＮＡは指数関数的複製反応を開始するために十分であり．．．酵素が過剰なまま である限り３０秒ごとにＲＮＡ鎖の数は倍増する。」［Ｌｉｚａｒｄｉ ａｎｄ Ｋｏｒａｍｅｒ，ＴｉｂＴｅｃｈ，９：５３，ｐａｇｅ５４（Ｆｅｂ．１９９ １）．］ 本発明のイムノアッセイのシグナル増幅システムの一部として用いることがで きる他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼには、ＲＮＡファージレプリカーゼＳ Ｐ、ＭＳ２、およびＧＡ含まれる。［Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２０５：７５１（１９８８）を参照されたい。］本発明の方法にお いて有用な他のレプリカーゼは、ブロムモザイクウイルスレプリカーゼである。 ［Ｍａｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ Ｖｉ ｒｕｓｅｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ；Ｎ．Ｙ．；１９８７）］他のレプリカー ゼおよびそれらの関連した基質は、Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（Ｕ ＳＡ），６８：２０２２（１９７１）中に見られる。抗体−変異体ＤＮＡ接合体 （１）変異体ＤＮＡ 変異体ＤＮＡは、レプリカーゼの基質である変異体ＲＮＡに対応する。例えば 、ミディ変異体ＤＮＡはミディ変異体ＲＮＡに対応する。［Ｍｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７１：２８１（１９８３）を参照されたい 。］本発明に従った好ましい変異体ＤＮＡは、ナノ変異体、ミディ変異体、ミク ロ変異体およびミニ変異体ＤＮＡ；より好ましくはナノ変異体およびミディ変異 体、最も好ましくはこれらはＱＢレプリカーゼの基質であり；そしてさらに好ま しくはＱＢレプリカーゼの基質であるナノ変異体ＤＮＡである。 （２）抗体 用語「抗体」は、ここにおいて、抗体全体のみならず生物学的に活性な抗体の 断片、好ましくは抗原結合領域を含む断片をも含むものと定義される。そのよう な抗体は、公知の方法論および／または遺伝子的操作で調製されてもよい。抗体 断片は、好ましくは、ライトおよび／またはヘビー鎖（ＶＬおよびＶＨ）の、超 変異可能領域を含む変異可能領域、さらに好ましくはＶＬおよびＶＨ領域の両方 から遺伝子的操作をされていてもよい。 このように、ここにおいて用いられる用語「抗体」は、ポリクローナルおよび モノクローナル抗体および、その他の可能性の中で「一価」の抗体を含む生物学 的に活性なそれらの断片［Ｇｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９ ５：７１２（１９８２）］；共有結合的または非共有結合的に凝集したＦａｂ’ およびＦ（ａｂ’）₂を含むＦａｂタンパク質；ライトまたはヘビー鎖単独、好 ましくは変異可能ヘビーおよびライト鎖領域（ＶＨおよびＶＬ領域）、およびさ らに好ましくは超変異可能領域［他には前述のＶＨおよびＶＬ領域の相補的決定 領域（ＣＤＲ）として知られている］を含む；Ｆｃプロテイン；１より多くの抗 原に結合可能な「ハイブリッド」抗体；不変−変異可能領域キメラ；異なった起 源のヘビーおよびライト鎖についての「複合」イムノグロブリン；改善された特 異性およびその他の特徴を有する、標準的な組換え技術により、またオリゴヌク レオチド標的変異技術［Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． ，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７９：６４０９（１９８２）］により調製された「改変さ れた」抗体を意味する。 本発明の多くのイムノアッセイのためには、全体の抗体よりも生物学的に活性 な断片が用いられる方が好ましい場合もある。本発明に従えば、非特異的結合を 避けるためにはＦａｂ断片が特に好ましい。 本発明において用いるための抗体は遺伝子的に操作されていてもよい。［例え ば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３４：１６６８ （１９８８）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４４：６５（１９８９）；Ｒｏｄｗｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：９９（１９ ８９）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４７：４９７（１９９０ ）；Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３ （１９９１）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９ ：５４５（１９９１）；Ｗｅｔｚｅｌ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，４： ３７１（１９９１）；Ｇｅｉｓｏｗ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌ．，１０：７５（１９９２）；およびＣｈｉｓｗｅｌｌ ａｎｄ ＭｃＣ ａｆｆｅｒｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：８５（１９９２ ）を参照されたい。］さらに、二重特異性およびその他の型の抗体［例えば、Ｌ ｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｔｒａｍａｎｔｏ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃ ｉ．，１２：４２７（１９８７）；Ｓｈｏｋａｔ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ ｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：３３５（１９９０）；Ｓｃｈｕｌｔｚ ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：４２６（１９８８）；Ｂｅｎｋａｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：１１３５（１９９０）；およびＬｅｒ ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：６５９（１９９１）；Ｎｏｌ ａｎｄ ａｎｄ Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ ｔａ．，１０４０：１（１９９０）；およびＢｏｌｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃ ｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：３０６（１９９１）］もまた、複製可能な変 異体ＤＮＡテンプレートと、本発明に従った利用のために接合されることができ る。 （３）接合体の調製 当業者に知られている接合方法を、本発明の抗体−変異体ＤＮＡ接合体の調製 のために用いることができる。［例えばＧｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．前出を参照され たい。］２つの一般的な、本発明の抗体−変異体ＤＮＡ接合体を調製するための 接近法が以下の実施例１および２に記載されている。 実施例１に詳述されているように、そのような１つの接近法においては、ＰＭ ４４４（配列番号１）［Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ（ＵＳＡ）］等 の、第１級アミンを含んでいるナノ変異体ＤＮＡが、穏やかに還元された抗体に 、ＳＰＤＰ等の異種二重機能性基を介して接合されている。第２のこのような一 般的接近法においては、実施例２に詳述されているように、アミノ派生ナノ変異 体ＤＮＡが、抗体のアミン基に、ＳＰＤＰ等の異種二重機能性基を用いて結合さ れていてもよい。 好ましくは、実施例３で実証されているように、アミノ基が５’末端にあるア ミノ派生変異体ＤＮＡを調製する。ＱＢレプリカーゼ等のＲＮＡレプリカーゼは ３’末端から生成鎖合成を開始する。更に好ましいこのようなアミノ派生変異体 ＤＮＡを調製するための方法は、ＤＮＡシンセサイザーの利用を含む。 当業者に知られている他のカップリング剤、好ましくは異種二重機能性結合剤 には、ｍ−マレイミドベンゾイル Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル［Ｋｉ ｔａｇａｗａ，Ｔ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ｅｄｓ．Ｉ ｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．）（Ｉｇａｋｕ−Ｓｈｏｉｎ；Ｔｏｋｙｏ ａｎ ｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；１９８１）］または関連した化合物、１−エチル−３− （３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等のカルボジイミド が含まれ、なかでも、サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ サン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）およびグルタールアルデヒド架橋剤を 、本発明の抗体−変異体ＤＮＡ接合体の調製に用いることができる。 さらに、当業者に知られているその他の方法を、本発明の抗体−変異体ＤＮＡ 接合体を調製するために用いることができる。例えば、変異体ＤＮＡ、好ましく はナノ変異体またはミディ変異体ＤＮＡが、アビジン、好ましくはストレプトア ビジンに接合されてもよく、続いてビオチニル化された抗体に結合されてもよい 。さらに、例えば、前出のＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，に記載された方法と類似の方 法 によって、ビオチンはミディ変異体またはナノ変異体ＤＮＡの５’末端にジスル フィドリンカーを介して取り付けることが可能で、そしてビオチニル化されたＤ ＮＡはアビジンと結合し、ＤＮＡ−ビオチン−アビジン内転物を形成しうるが、 これは続いてビオチニル化された抗体と接合されてもよい。アビジンを変異体Ｄ ＮＡに取り付けるための別の方法はプロテインＡを用いる方法などが当業者に知 られている。［例えば、Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：（ ２ Ｏｃｔ． １９９２）を参照されたい。］複製産物の検出および定量 本発明のイムノアッセイ方法において生成されるＲＮＡ複製産物を検出するた めの数多くの従来の技術がある。それらには、例えばＨａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，８３：４３１−４３９（１９８４）等の放射性標識 の取り込み；例えばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １３：２３９９−２４１２（１９８５）およびＣｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ． ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１３：４４８５−４５０２（１９８５）等の蛍 光色素または酵素の直接的取り付け；および、それらを免疫的に検出可能とする 多様な核酸の化学修飾またはその他の吸着反応によるもの、例えばＴｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ Ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，”ＰＮＡＳ，８１：３ ４６６−３４７０（１９８４）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｂｉ ｏｔｉｎ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ Ｕｓｉｎｇ Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ，”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １１：６１６７−６１８４（１９８３）；Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，”Ｅｎ ｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａ ｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｒｏｂｅｓ，”ＰＮＡＳ，７８：６６３３−６６３７（１９ ８１）；Ｂｒｉｇａｔｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒ ａｌ Ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｐａｒ ａｆｆｉｎ−Ｅｍｂｅｄｄｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｅｃｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ｂｉ ｏｔｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ，”Ｖ ｉｒｏｌ．，１２６：３２−５０（１９８３）；Ｂｒｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔＲＮＡ Ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｆｅｒｒｉｔｉｎ−Ａｖｉｄｉｎ：Ｂ ｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｓ，”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，５：３６３−３８ ４（１９７８）；Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖｉｄｉｎ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓ ａ Ｔｏｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ ．Ａｎａｌｙｓｉｓ，２６：１−４５（１９８０）；Ｋｕｈｌｍａｎｎ，Ｉｍｍ ｕｎｏｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｂａｓｅｌ，１９８４）；Ｌａｎｇｅｒ−Ｓａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），７９：４３８１（１９８２）；Ｌａｎｄｅ ｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１５３：６１（１９８ ４）；およびＨｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１６ ９：３５７（１９８７）が含まれる。 典型的な検出手段には、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光、化学発光、色原体 、酵素基質、酵素コファクター、酵素阻害剤、フリーラジカル、粒子、色素およ びそのようなものが含まれる。さらに、典型的な標識手段には、ＲＮＡ複製産物 がビオチニル化、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレンでの修飾 、フルオレセインイソチオシアネートでの修飾、スルホン化、ジゴキシゲニン化 、Ｔ−Ｔダイマーを含有するよう修飾、または挿入型色素での染色が含まれる。 好ましい実施態様においては、ＲＮＡ複製産物は化学発光方法論によって検出 される。米国特許第４７４５１８１号を参照されたい。化学発光体としてアクリ ジニウムエステルを使用することが特に好ましい。 実施例４は、代表的な検出手段で、放射性標識されたリボヌクレオチド（³²Ｐ −ＣＴＰ）がＲＮＡ複製産物に取り込まれているものを詳細に記述している。こ れと類似して、色原体、酵素またはその他の標識が複製産物に取り込まれてもよ い。別の代表的な蛍光ヌクレオチドを複製されたＲＮＡに取り込ませるための方 法が、Ｃｏｓｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２： １７９１（１９８４）に示されている。 同様に、電気泳動的手段、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用す ることが、ＲＮＡ複製産物を検出および／または定量するために用いることがで きる。［例えばＳａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１２０（２ Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９２）を参照されたい。］ その他の検出方法論には、「総内部反射（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒ ｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）」により、装置のインターフェースおよびより低い反射率 を有する試験媒体において消えてゆく波を発生させるための照射を増幅するため に、光学的装置を用いることを含む。Ｈａｒｒｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｉｎｔｅｒｎ ａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｈａｒｒｉｃｋ Ｓ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ；Ｎ．Ｙ；３ｒｄ ｐｒｉｎｔｉｎｇ １９８７ ）および米国特許第４８８０７５２号を参照されたい。 本発明に従って、複製産物から生成されたシグナルは、アッセイにおいて分析 対象の存在を示す。そのシグナルはアッセイにおいて存在する分析対象の量の定 量にも、当業者に公知の方法で用いられてもよい。 例えば、レプリカーゼ過剰の条件下で、特定の、しかし任意の、変異体ＤＮＡ テンプレートから増幅されたＲＮＡの集団を合成するために必要な時間量は、ア ッセイの開始時（時間ゼロ）に存在していたＤＮＡ分子の数の対数に関連してい る。増幅されたＤＮＡの量は、例えば、エチジウムブロミド等の挿入型色素の蛍 光により測定できる。アッセイにおいて存在するＤＮＡテンプレートの量とレプ リカーゼ酵素によって合成されたＲＮＡの量との間には、半対数的関係がある。イムノアッセイフォーマット 本発明のシグナル増幅システムが、多様なイムノアッセイフォーマット、例え ばサンドイッチアッセイ、競合アッセイ、ブリッジフォーマット、他の当業者に おいてよく知られたもので利用できることは当業者には明白である。［例えば米 国特許第５２９６３４７号、第４２３３４０２号、第４０３４０７４号および第 ４０９８８７９号を参照されたい。］ 以下の実施例は、主題の発明の理解を助けるために示されており、説明の目的 のためのみのものである。如何なるやり方によっても、実施例は本発明を制限し ているとは解釈されない。実施例１ ここに記載されている実施例で用いられたナノ変異体ＤＮＡはＰＭ４４４［Ｐ ｒｏｍｅｇａ］である。ＰＭ４４４は以下のヌクレオチド配列を有する： 第１級アミン基を、ＰＭ４４４中にその３’末端で、ターミナルトランスフェ ラーゼをアミノヘキシルＡＴＰまたはアミノヘキシルＡＴＰおよびｄＡＴＰの組 合せの何れかとともに用いて導入した。この反応生成物は、その５’末端で³²Ｐ で、ポリヌクレオチドキナーゼおよびガンマ³²Ｐ−ＡＴＰにより標識した。 ５’³²Ｐおよび３’アミノヘキシルＡＴＰを有するＰＭ４４４（２０ｎＭ）を 、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルチオ）−プロピオン酸（ＳＰＤＰ） （１００μＭ）［Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ］ととも に室温で１時間保温した。ＳＰＤＰ派生オリゴマーを、５０ｍＭ ＮａＰＯ₄、 １５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＰＢＳ）中のセファデックスＧ２５［Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ］上で脱塩した。 ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを標的としたモノクローナル抗体（１００ｎＭ） を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（２０ｍＭ）で、室温で３０分間５０ｍＭ ＮａＰＯ₄、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＢＳＥ）中で還元し た。還元された抗体はＰＢＳＥ中のセファデックスＧ−２５上で脱塩した。 ＳＰＤＰ派生オリゴマーを還元抗体とともに室温で１晩保温した。この反応に よって形成された抗体−ＤＮＡ接合体が、アフィゲル プロテインＡ［Ｂｉｏｒ ａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ（ＵＳＡ）］上での吸着クロマトグラフィーによ り精製した。カラムに結合した³²Ｐ標識オリゴマーは、その抗体への接合により そうなった。結合した物質はカラムから、０．１Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ ３で溶出させ、ｐＨ９の１Ｍトリスの添加により中性化させた。³²Ｐを含む画分 は液体シンチレーションカウントにより同定した。実施例２ 抗ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドモノクローナル抗体（１５μＭ）およびＳＰＤ Ｐ（１００μＭ）は室温で１時間反応させた。派生抗体はセファデックスＧ２５ 上で脱塩した。 アミノオリゴマー（１０ｎＭ）、即ち、実施例１のように調製されたアミノ派 生ＰＭ４４４もまた、ＳＰＤＰ（１００μＭ）と１時間室温で保温された。この 溶液に、ＤＴＴを終濃度０．１Ｍとなるように添加し、還元を１０分間進行させ た。反応によって生成されたチオール派生オリゴマーは、セファデックスＧ２５ 上で脱塩した。 オリゴマーは続いてＳＰＤＰ派生抗体とともに室温で１晩保温された。形成さ れた抗体−オリゴマー接合体は、アフィゲル プロテインＡ上での吸着クロマト グラフィーにより上記の実施例１記載のように精製した。実施例３ ５’末端にアミン基を含むＰＭ４４４の変化型を調製し、その３’末端を³²Ｐ ジデオキシＡＴＰでターミナルトランスフェラーゼにより標識した。このＰＭ４ ４４の変化型は、ＰＭ６５３［Ｐｒｏｍｅｇａ］と呼ばれるが、これもまた抗体 とＳＰＤＰを介して、上記の実施例１および２に記載されている方法をそれぞれ 用いてカップリングさせた。実施例４ 抗体接合変異体ＤＮＡの、ＱＢレプリカーゼに触媒される変異体ＲＮＡ合成の ためのテンプレートとして機能する能力を試験した。典型的なこのような抗体接 合変異体ＤＮＡは抗体接合ナノ変異体ＤＮＡ、すなわち、実施例１および２で記 載されているように調製された抗体−ＰＭ４４４接合体である。 抗体−ＰＭ４４４接合体はＱＢレプリカーゼ（２０μｇ／ｍｌ）とともに、１ ００ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ 、ＣＴＰ、およびＵＴＰの各々、において室温で保温した。この反応はまた、２ ．６ ｘ １０⁵−４．２８ ｘ １０⁵ｃｐｍ／ｎｍｏｌ ＣＴＰを与えるに十 分なアルファ³²Ｐ−ＣＴＰを含んでいた。取り込まれたＣＴＰはＲＮＡ産物のグ ラスファイバーフィルター［Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｋ ｅｎｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ］上への、１０％トリクロロ酢酸／１％ピロリン酸の存 在下での沈殿により検出した。 ＲＮＡ合成がナノ変異体の混入によるものかどうかを決定するための対照とし て、抗体をレプリカーゼ反応に添加しないか、または抗体接合体をデオキシリボ ヌクレアーゼ［ＤＮＡｓｅ；Ｐｒｏｍｅｇａ］により３７℃で１時間、レプリカ ーゼ反応に先立って消化させた。 実験の結果は表１にまとめられている。各々の場合、抗体−ナノ変異体ＤＮＡ 接合体はＲＮＡ合成のためのテンプレートとして機能することが可能であった。 ＤＮＡｓｅでの接合体の処理は顕著に合成されたＲＮＡの量を減少させた。表１ に示された結果は、抗体と接合されていてもＲＮＡ合成のためのテンプレートと して機能しうるナノ変異体ＤＮＡの能力と一致している。 これまでの本発明の実施態様の記述は、説明および記述のために示されている 。これらは包括的なものとして、または本発明を開示された詳細な型に制限する ものとして意図されてはおらず、明らかに数多くの改変および変化型が、上記の 技術から可能である。実施態様は、本発明の原理およびその実際の応用を説明し 、それにより他の当業者が本発明を、多様な型で、構想されている特定の用途に 適するように多様な改変を伴って、多様な型で利用することを可能とするように 選択、記述されている。本発明の範囲はここに添付したクレームにより定義され ることが意図されている。 ここにおいて引用された全ての文献は、ここにおいて参考文献として取り込ま れている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 キャロル，エディー サード アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02154 ウォルサム エディー ストリー ト 24

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗体−変異体ＤＮＡ接合体をシグナル増幅システムの成分として用いること を含み、そこにおいて前記変異体ＤＮＡがＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの基 質であることを特徴とするイムノアッセイ方法。 ２．前記変異体ＤＮＡが、ナノ変異体、ミディ変異体、ミクロ変異体およびミニ 変異体ＤＮＡから成る群より選択され、そして前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ ーゼポリメラーゼが、ＲＮＡファージレプリカーゼおよびブロムモザイクウイル スレプリカーゼから成る群より選択されたことを特徴とする請求の範囲第１項記 載の方法。 ３．前記接合体の抗体がモノクローナル抗体またはファブ断片の何れかであり； そこにおいて前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、ＱＢレプリカーゼ、ＳＰ レプリカーゼ、ＭＳ２レプリカーゼおよびＧＡレプリカーゼから成る群より選択 されたことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ４．試験試料中の２またはそれより多くの分析対象を同時に検出、または検出お よび定量するためのイムノアッセイ方法であって、前記試験試料を２またはそれ より多くの異なった抗体−変異体ＤＮＡ接合体と接触させることを含み、そこに おいて異なった接合体の前記変異体ＤＮＡが、それ自身に挿入された異なったＤ ＮＡ配列を含み、異なった挿入されたＤＮＡ配列を有する変異体ＤＮＡに接合さ れた前記抗体は異なった分析対象に特異的であり、一方で、同じ挿入されたＤＮ Ａ配列を含む変異体ＤＮＡに接合された抗体は、同じ分析対象に特異的であるこ とを特徴とする方法。 ５．試験試料中の分析対象を検出するための、または試験試料中の分析対象を検 出および定量するための方法であって： (a) 前記試験試料を抗体−変異体ＤＮＡ接合体と接触させるが、ここにおいて 前記接合体の前記抗体はアッセイにおける分析対象、または前記試験試料に添加 された、前記分析対象に特異的である第２の抗体の何れかに特異的であり、また ここにおいて、前記接合体の前記変異体ＤＮＡはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー ゼの基質であり； (b) 前記試料を前記抗体−変異体ＤＮＡ接合体および、存在する場合には前記 第２の抗体とともに、適当な時間量にわたって保温し； (c) アッセイにおいて前記分析対象に結合していない抗体−変異体ＤＮＡ接合 物を除去し； (d) 前記分析対象に結合した接合体の前記変異体ＤＮＡを、ＲＮＡに転写させ 、ＲＮＡ転写産物を、前記変異体ＤＮＡテンプレートおよびＲＮＡ転写産物を十 分量の適当なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとリボヌクレオチドの存在下で接 触させることにより複製させ；そして、 (e) 段階（ｄ）において何れかの変異体ＲＮＡが複製されたか否かを決定し、 そしてＲＮＡ複製産物の存在を分析対象の存在と相関させる；または段階（ｄ） において複製された変異体ＲＮＡを検出および定量し、そして前記ＲＮＡ複製産 物の量を分析対象の量と関連させる、 各段階を含むことを特徴とする方法。 ６．段階（ｃ）の前、または段階（ｃ）と同時に、前記試験試料を、前記分析対 象のレセプターと、または付加的な抗分析対象抗体であって、前記分析対象上の 異なったエピトープ部位で、第２の抗体が存在する場合はそれが標的としている 以外のもの、また前記接合体抗体が前記分析対象上のエピトープ部位を標的とし ている場合にはそれ以外のものを標的としているものと接触させることをさらに 含むことを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。 ７．前記変異体ＲＮＡ複製産物が検出および／または定量に先立って標識されて いることを特徴とする請求の範囲第５項または第６項何れか１項記載の方法。 ８．前記複製産物が複製工程の間に標識されることを特徴とする請求の範囲第７ 項記載の方法。 ９．試験試料中の２またはそれより多くの異なった分析対象を同時に検出、また は検出および定量するためのイムノアッセイ方法であって； ２またはそれより多くの異なった抗体−変異体ＤＮＡ接合体について請求の 範囲第５項記載の方法を実行するが、そこにおいて前記接合体の前記変異体ＤＮ Ａが、それ自身に挿入されたＤＮＡ配列を有し、そこにおいて前記挿入されたＤ ＮＡ配列が、同じ結合特異性を有する抗体に接合された変異体ＤＮＡにお いては同じであり、さらにそこにおいて前記挿入されたＤＮＡ配列が、その抗体 が異なった結合特異性を有する接合体の間では異なっているものであることを含 むことを特徴とする方法。 10．試験試料中の２またはそれより多くの異なった分析対象を同時に検出、また は検出および定量するためのイムノアッセイ方法であって； (a) 前記試験試料を２またはそれより多くの異なった抗体−変異体ＤＮＡ接合 体と接触させるが、ここにおいて前記接合体の前記変異体ＤＮＡが、それ自身に 挿入された異なったＤＮＡ配列を有し；ここにおいて異なった挿入されたＤＮＡ 配列を含む変異体ＤＮＡに接合された前記抗体が異なった分析対象に特異的であ り、一方で同じ挿入されたＤＮＡ配列を有する変異体ＤＮＡに接合された前記抗 体は同じ分析対象に特異的であり；そして前記接合体の前記変異体ＤＮＡはＲＮ Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼの基質であり； (b) 前記試験試料を前記２またはそれより多くの異なった抗体−変異体ＤＮＡ 接合体と適当な時間量にわたって保温し； (c) アッセイにおいて分析対象に結合していない抗体−変異体ＤＮＡ接合体を 除去し； (d) 分析対象に結合している接合体の前記変異型ＤＮＡおよび前記挿入された ＤＮＡ配列を、ＲＮＡに転写させ、そのＲＮＡ転写産物を、前記変異型ＤＮＡテ ンプレートおよび前記ＲＮＡ転写産物を、十分量の適当なＲＮＡ依存性ＲＮＡポ リメラーゼとリボヌクレオチドの存在下で接触させることにより複製し；そして 、 (e) 何れかの変異体ＲＮＡが段階（ｄ）において複製されているか否かを決定 し、そうであれば何れの変異型ＤＮＡテンプレートもしくはテンプレート群から 前記変異体ＲＮＡが転写されているかを決定し、特定の変異体ＤＮＡテンプレー トから生成されたＲＮＡ複製産物の存在を、対応する分析対象の存在と関連づけ る；または、何れの変異型ＤＮＡテンプレートもしくはテンプレート群から前記 変異体ＲＮＡが段階（ｄ）において転写されているかを決定し、異なった変異体 ＲＮＡ複製産物の各々を定量し、各々のＲＮＡ複製産物の量を、対応する分析対 象の量と関連づける、 各段階を含むことを特徴とする方法。 11．段階（ｅ）が、２またはそれより多くの異なった核酸プローブを用いること を含み、そこにおいて前記プローブの各々のが前記２またはそれより多くの異な った抗体−変異体ＤＮＡ接合体の１つと相補的であり；そこにおいて、同じ分析 対象に特異的である前記接合体の前記変異体に相補的である前記プローブは、同 じ様に標識されており；そして、そこにおいて、異なった分析対象に特異的であ る前記接合体の前記変異体ＤＮＡに相補的である前記プローブは、互いに異なる ように標識されているものである、 ことを特徴とする請求の範囲第１０項記載の方法。 12．（ａ）抗体−変異体ＤＮＡ接合体であって、前記変異体ＤＮＡがＲＮＡ依存 性ＲＮＡポリメラーゼの基質であるもの；および （ｂ）適当なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、 を含むことを特徴とするイムノアッセイ試験キット。 13．前記接合体の前記抗体が、前記接合体抗体がそれから得られた哺乳類の属以 外の属の哺乳類を免疫化することによって作成された抗体を標的としたものであ るか、または前記接合体抗体がそのように標的とした抗体の機能的相当体である ことを特徴とする請求の範囲第１２項記載の試験キット。 14．（ａ）２またはそれより多くの異なった抗体−変異体ＤＮＡ接合体であって 、そこにおいて前記異なった接合体の前記変異体ＤＮＡが、それ自身に挿入され た異なったＤＮＡ配列を含み；そして、そこにおいて、異なった挿入されたＤＮ Ａ配列を含む変異体ＤＮＡに接合された抗体は異なった分析対象に特異的であり 、一方で同じ挿入されたＤＮＡ配列を含む変異体ＤＮＡに接合された抗体は同じ 分析対象に特異的である； （ｂ）２またはそれより多くの異なるように標識された核酸プローブであって 、それぞれ、２またはそれより多くの異なった変異体ＤＮＡ群（ａ）と相補的で あり；そこにおいて、同じ挿入されたＤＮＡ配列を含む変異体ＤＮＡに相補的な 前記プローブは同じ様に標識され；そして、そこにおいて、異なった挿入された ＤＮＡ配列を含む変異体ＤＮＡに相補的な前記プローブは、互いに異なるように 標識されている；そして、 （ｃ）適当なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ を含むことを特徴とするイムノアッセイ試験キット。 15．変異体ＤＮＡと接合された抗体を含むイムノアッセイ試薬であって、前記変 異体ＤＮＡがＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの基質であることを特徴とする試 薬。 16．アミノ派生変異体ＤＮＡを、異種二重機能性結合剤を介して抗体に接合させ ることを含む方法により調製されたことを特徴とする請求の範囲第１５項記載の 試薬。