CN106794439A - 用于装载传感器衬底的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种在传感器衬底上装载珠粒的方法，其包含将包含珠粒的悬浮液施加到界定于传感器衬底上方的流槽。所述传感器衬底包含多个井。所述珠粒至少部分沉积于所述多个井中。所述方法还包含从所述流槽移除液体；(例如)通过将空气抽拉通过所述流槽从所述流槽蒸发液体；及将水合溶液施加到所述流槽。

Description

用于装载传感器衬底的方法
技术领域
本发明是关于分子生物学领域，具体来说是关于改良包含核酸及蛋白质阵列的样本到表面上的装载及保持。
背景技术
用于分析例如多核苷酸或蛋白质的生物分子的各种技术依赖于沉积各自附着到此类生物分子的颗粒阵列。示范性定序技术依赖于在井阵列中沉积包含多核苷酸或其复制品的颗粒阵列。在特定实例中，颗粒或珠粒可沉积于井内以使颗粒或珠粒与特定传感器相关联并提供分析生物分子的本地环境。在其它实例中，有序颗粒阵列沉积于表面上并在并不利用井的情况下进行分析。
发明内容
在一示范性实施例中，在传感器衬底上装载珠粒的方法包含将包含珠粒的悬浮液施加到界定于传感器衬底上方的流槽。所述传感器衬底包含多个井。所述珠粒至少部分沉积于所述多个井中。所述方法还包含从所述流槽移除液体、从所述流槽蒸发液体及将水合溶液施加到所述流槽。
附图说明
通过参考附图，可以更好地理解本发明，且使所属领域的技术人员清楚其众多特征及优势。
图1包含用于分析靶多核苷酸的示范性方法的方块流程图。
图2包含用于分析靶多核苷酸的示范性方法的图画说明。
图3包含说明用于装载的示范性方法的方块流程图。
图4及图5包含用于装载的示范性方法的图画说明。
图6包含用于定序的示范性系统的说明。
图7包含珠粒沉积之后的装置表面的图像。
图8包含说明所沉积珠粒的强度比率的图表。
在不同图式中使用相同参考符号指示相似或相同物件。
具体实施方式
在一示范性实施例中，在传感器衬底上装载珠粒的方法包含将包含珠粒的悬浮液施加到界定于传感器衬底上方的流槽。传感器衬底包含多个反应部位。示范性反应部位包含井、沟道、凹槽、凹点、凹陷、柱组(sets of posts)或其它类似功能结构。珠粒至少部分地沉积到多个反应部位中。所述方法还包含从流槽移除液体、从流槽蒸发液体及将水合溶液施加到流槽。珠粒可结合到例如核酸或蛋白质的生物分子。珠粒可为水凝胶珠粒。在一实例中，传感器衬底可为半导体定序装置。
在特定实例中，在珠粒沉积于包含井的传感器衬底上之前使珠粒与核酸结合。如图1中所说明，方法100包含将珠粒或颗粒、扩增反应剂及靶多核苷酸组合到扩增溶液中，如102处所说明。具体来说，珠粒衬底可由亲水性聚合物形成。在一实例中，珠粒可携载电荷。替代地，珠粒可是中性的。
举例来说，珠粒可由单体形成，单体包含可自由基聚合单体，例如乙烯基类单体。在一实例中，单体可包含丙烯酰胺、醋酸乙烯酯、羟烷基甲基丙烯酸酯或其任何组合。在一特定实例中，亲水性单体为丙烯酰胺，例如包含羟基、胺基、羧基或其组合的丙烯酰胺。在一实例中，亲水性单体为氨基烷基丙烯酰胺、用胺封端的聚丙二醇官能化的丙烯酰胺(D，下文说明)、丙烯哌嗪(acrylopiperazine)(C，下文说明)或其组合。在另一实例中，丙烯酰胺可为羟基烷基丙烯酰胺，例如羟基乙基丙烯酰胺。具体来说，羟基烷基丙烯酰胺可包含N-三(羟基甲基)甲基)丙烯酰胺(A，下文说明)、N-(羟基甲基)丙烯酰胺(B，下文说明)或其组合。在另一实例中，可使用单体的混合物，例如羟基烷基丙烯酰胺与胺官能化丙烯酰胺的混合物或丙烯酰胺与胺官能化丙烯酰胺的混合物。在一实例中，胺官能化丙烯酰胺可按100:1到1:1的范围，例如100:1到2:1范围、50:1到3:1范围、50:1到5:1范围或甚至50:1到10:1范围的羟基烷基丙烯酰胺:胺官能化丙烯酰胺或丙烯酰胺:胺官能化丙烯酰胺的比率包含在内。
在特定实例中，珠粒为水凝胶珠粒。
珠粒中的每一者可包含可杂交模板多核苷酸的连接部位。举例来说，连接部位可各自包含与模板多核苷酸的部分互补的连接寡核苷酸。模板多核苷酸可包含靶多核苷酸或与靶多核苷酸互补的节段，除此之外还有与连接寡核苷酸互补的节段。
连接寡核苷酸可结合到珠粒。可活化珠粒的聚合物以促进与例如寡核苷酸或多核苷酸的目标分析物的结合。举例来说，珠粒上的官能团可被增强以准许与目标分析物或分析物受体键结。在特定实例中，可用能够将亲水性聚合物官能团转化成可经历亲核或亲电取代的反应性部分的反应剂改性亲水性聚合物的官能团。举例来说，衬底上的羟基可通过用磺酸酯基或氯置换羟基的至少一部分来活化。示范性磺酸酯基可衍生自三氟乙烷磺酰氯、甲磺酰氯、甲苯磺酰氯或fosyl氯或其任何组合。磺酸酯可用以使亲核试剂置换磺酸酯。磺酸酯可进一步与释放的氯反应以提供氯化基团，其可用于结合珠粒的过程中。在另一实例中，可活化珠粒上的胺基。
举例来说，目标分析物或分析物受体可通过与磺酸酯基的亲核取代键结到亲水性聚合物。在特定实例中，用例如胺或硫醇的亲核试剂封端的目标分析物受体可经历亲核取代以置换珠粒的表面上的磺酸酯基。
在另一实例中，磺化珠粒可与单官能或多官能单亲核或多亲核反应剂(例如顺丁烯二酰亚胺)进一步反应，所述反应剂可形成与珠粒的附着同时维持针对包含亲电子基团的寡核苷酸的亲核活性。另外，残余亲核活性可通过附着到包含多亲电子基团的反应剂转化成亲电活性，所述多亲电子基团随后附着到包含亲核基团的寡核苷酸。
在另一实例中，在聚合期间可添加含有官能团的单体。单体可包含(例如)含有羧酸、酯、卤素或其它胺反应性基团的丙烯酰胺。酯基可在与胺封端的寡核苷酸反应之前被水解。
其它结合技术包含使用包括胺的单体。胺为可用胺反应性双官能双亲电反应剂进一步改性的亲核性基团，所述胺反应性双官能双亲电反应剂在附着到珠粒之后产生单官能亲电子基团。此类亲电子基团可与具有亲核性基团(例如胺或硫醇)的寡核苷酸反应，从而导致寡核苷酸通过与空缺亲电子试剂反应而附着。
如果珠粒由胺基-丙烯酰胺及羟基-丙烯酰胺的组合制备，则珠粒可包含亲核胺基及中性羟基的组合。胺基可用二官能双亲电部分(例如二-异氰酸酯或双-NHS酯)改性，从而产生对亲核试剂具有反应性的亲水性颗粒。示范性双-NHS酯包含双-丁二酰亚胺基C2-C12烷基酯，例如双-丁二酰亚胺基辛二酸酯或双-丁二酰亚胺基戊二酸酯。
其它活化化学反应包含掺入转化指定官能团的多个步骤以容纳特定所要键。举例来说，磺酸酯改性的羟基可通过若干方法转化成亲核性基团。在一实例中，磺酸酯与叠氮根阴离子的反应产生叠氮取代的亲水性聚合物。叠氮化物可直接用于通过“CLICK”化学反应与乙炔取代的生物分子结合，所述化学反应可使用或不使用铜催化剂执行。任选地，叠氮化物可通过(例如)用氢催化还原或用有机磷化氢还原转化成胺。所得胺接着可用多种反应剂(例如二-异氰酸酯、双-NHS酯、三聚氯化氰或其组合)转化成亲电子基团。在一实例中，使用二-异氰酸酯在聚合物与连接基团之间产生脲键，这产生了残余异氰酸酯基，其能够与胺基取代的生物分子反应从而在连接基团与生物分子之间产生脲键。在另一实例中，使用双-NHS酯产生聚合物与连接基团之间的酰胺键及残余NHS酯基，残余NHS酯基能够与胺基取代的生物分子反应从而产生连接基团与生物分子之间的酰胺键。在另一实例中，使用三聚氯化氰产生聚合物与连接基团之间的胺基-三嗪键及两个残余氯基-三嗪基团，残余氯基-三嗪基团中的一者能够与胺基取代的生物分子反应从而产生连接基团与生物分子之间的胺基-三嗪键。其它亲核基团可通过磺酸酯活化掺入到颗粒中。举例来说，磺化颗粒与硫代苯甲酸阴离子的反应及随后硫代苯甲酸酯的水解向颗粒中掺入硫醇，其随后可与顺丁烯二酰亚胺取代的生物分子反应从而产生与生物分子的硫基-丁二酰亚胺键。硫醇还可与溴基-乙酰基基团反应。
替代地，在聚合以掺入寡核苷酸期间可使用丙烯酰化寡核苷酸。示范性丙烯酰化寡核苷酸可包含离子交换寡核苷酸。
返回到图1，珠粒可连同扩增反应剂掺入到扩增溶液中，所述扩增反应剂例如包含聚合酶或重组酶的酶、核苷酸(例如，A、T、C、G或其类似物)、各种盐或离子化合物或其组合。具体来说，例如衍生自生物源的多核苷酸的靶多核苷酸包含于扩增溶液中。
形成包含作为分散相的扩增溶液的乳液，如104中所说明。具体来说，扩增溶液为水溶液且可分散于例如油相的疏水相中。疏水相可包含经氟化液体、矿物油、硅酮油或其任何组合。任选地，疏水相可包含表面活性剂，例如非离子表面活性剂，例如下文所描述的非离子表面活性剂。
可利用膜类机制形成乳液，其中含水扩增溶液及连续相疏水性液体一或多次地穿过膜，从而在连续相疏水性液体内形成扩增溶液的液滴。替代地，可通过在疏水性液体存在的情况下搅拌扩增溶液形成乳液。在另一实例中，可通过将扩增溶液及疏水性连续相反复地抽吸及喷射通过滴管尖端形成乳液。在另一实例中，可将含水扩增溶液的液滴注入疏水性液流中。
在乳化扩增溶液之后，形成分散相的扩增溶液的液滴可包含珠粒及靶多核苷酸。液滴的一部分可包含一或多个珠粒及单个靶多核苷酸。其它液滴可包含珠粒但不包含多核苷酸。其它液滴可包含一或多个珠粒及多于一个靶多核苷酸。
举例来说，如图2中所说明，含水扩增溶液222包含靶多核苷酸202及珠粒204。乳化之后，乳液224的一些液滴206可包含单个靶多核苷酸及一或多个珠粒。乳液224的其它液滴208可包含珠粒但不包含靶多核苷酸。
返回到图1，可执行扩增反应以提供核酸珠粒，如106处所说明。核酸珠粒包含珠粒及核酸的结合复制品。扩增反应的条件可取决于如下因素，例如用于扩增溶液中的酶的性质、个别核苷酸的浓度、盐或离子化合物的浓度以及其它因素。在一实例中，扩增反应为聚合酶链式反应(PCR)，其中温度在40℃到100℃的范围内多次循环。在另一实例中，扩增反应为重组酶聚合酶扩增(RPA)。此类反应可在40℃到90℃的温度范围内等温地执行。可使用其它扩增技术，例如聚合酶循环组装(PCA)、不对称PCR、解旋酶依赖性扩增、连接介导PCR、多重PCR、纳米颗粒辅助PCR或其它扩增技术。
在一实例中，在扩增期间，包含所关注靶序列及与连接寡核苷酸互补的节段的模板多核苷酸与连接寡核苷酸杂交。连接寡核苷酸经扩展，从而形成与模板多核苷酸的互补序列。模板多核苷酸可进一步包含用于与分离衬底键结以用于稍后分离经扩增基质与未经扩增基质的捕获部分。
由于扩增，包含靶多核苷酸及珠粒的分散相液滴产生包含结合到珠粒的靶多核苷酸的一或多个复制品的核酸珠粒。相反地，包含珠粒且不具有靶多核苷酸的液滴并不产生包含靶多核苷酸的复制品且在本文中被称作未经扩增珠粒的珠粒。
如108处所说明，分解乳液以恢复核酸珠粒，由此分散相的液体与连续相分离。举例来说，可将乳液施加到分解溶液上方并任选地进行搅拌或离心。具体来说，通过分解溶液离心乳液将珠粒远离分解溶液与乳液的连续相液体之间的界面驱动到分解溶液中。分解溶液可为亲水性液体，例如包含表面活性剂以辅助增强表面张力及使分散相与连续相分离的水溶液。
在一实例中，分解溶液可包含具有处于0.01重量％到20重量％的范围的总浓度的一或多种表面活性剂。举例来说，表面活性剂可以0.1重量％到15.0重量％的范围内的量包含在内，例如0.5重量％到10.0重量％的范围、0.5重量％到5.0重量％的范围或甚至0.5重量％到3重量％的范围。在另一实例中，表面活性剂可以5.0％到20.0％的范围内的总量包含在内，例如10.0％到20.0％的范围或12.0％到18.0％的范围。
表面活性剂可为离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂或其组合。离子表面活性剂可为阴离子表面活性剂。示范性阴离子表面活性剂包含硫酸盐表面活性剂、磺酸盐表面活性剂、磷酸盐表面活性剂、羧酸盐表面活性剂或其任何组合。示范性硫酸盐表面活性剂包含：烷基硫酸盐，例如月桂基硫酸铵、月桂基硫酸钠(十二烷基硫酸钠(SDS))或其组合；烷基醚硫酸酯，例如月桂醇醚硫酸钠、肉豆蔻醇醚硫酸钠或其任何组合；或其任何组合。示范性磺酸盐表面活性剂包含：烷基磺酸盐，例如十二烷基磺酸钠；琥珀辛酯，例如磺基琥珀酸酯二辛钠；烷基苯甲基磺酸盐(例如，十二烷基苯磺酸或其盐)；或其任何组合。示范性磷酸盐表面活性剂包含烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐或其任何组合。示范性羧酸表面活性剂包含：烷基羧酸盐，例如脂肪酸盐或硬脂酸钠；月桂基肌氨酸钠；胆酸盐，例如脱氧胆酸钠；或其任何组合。
在另一实例中，离子表面活性剂可为阳离子表面活性剂。示范性阳离子表面活性剂包含一级、二级或三级胺、四级铵表面活性剂，或其任何组合。示范性四级铵表面活性剂包含：烷基三甲基铵盐，例如溴化鲸蜡基三甲基铵(CTAB)或氯化鲸蜡基三甲基铵(CTAC)；氯化十六烷基吡啶(CPC)；聚乙氧基化牛油胺(POEA)；苯扎氯铵(BAC)；苄索氯铵(BZT)；5-溴基-5-硝基-1,3-二烷；二甲基二(十八烷基)氯化铵；二(十八烷基)二甲基溴化铵(DODAB)；或其任何组合。
示范性两性表面活性剂包含具有磺酸、羧酸或磷酸阴离子的一级、二级或三级胺或四级铵阳离子。示范性磺酸盐两性表面活性剂包含：(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)；磺基甜菜碱，例如椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱；或其任何组合。示范性羧酸两性表面活性剂包含胺基酸、亚胺基酸、甜菜碱(例如椰油酰胺基丙基甜菜碱)或其任何组合。示范性磷酸盐两性表面活性剂包含卵磷脂。
在另一实例中，表面活性剂可为非离子表面活性剂，例如聚乙二醇类表面活性剂、烷基吡咯啶表面活性剂、烷基咪唑啶酮表面活性剂、烷基吗啉表面活性剂、烷基咪唑表面活性剂、烷基咪唑啉表面活性剂或其组合。在特定实例中，聚乙二醇类表面活性剂包含聚乙二醇醚，例如烷基苯酚聚乙氧基化物。在另一实例中，非离子表面活性剂包含非离子氟表面活性剂，例如乙氧基化碳氟化合物。在又一实例中，表面活性剂溶液可包含辛基吡咯啶。
具体来说，表面活性剂溶液可包含此类表面活性剂的组合。举例来说，表面活性剂溶液可包含非离子表面活性剂与阴离子表面活性剂的组合。在特定实例中，表面活性剂溶液可包含非离子表面活性剂(例如聚乙二醇醚、烷基吡咯啶或非离子氟表面活性剂)及阴离子表面活性剂(例如硫酸盐表面活性剂，例如SDS)。具体来说，表面活性剂溶液可包含0.1％到20.0％的范围，例如1.0％到15.0％的范围，或5.0％到15.0％的范围，或8.0％到12.0％的范围内的量的离子表面活性剂，例如阴离子表面活性剂。另外，表面活性剂溶液可包含0.01％到10.0％的范围，例如0.05％到8.0％的范围，或1.0％到6.0％的范围内的非离子表面活性剂，例如烷基吡咯啶(例如，辛基吡咯啶)。在另一实例中，表面活性剂溶液可包含0.05％到3.0％的范围内的非离子表面活性剂。
参考图2，在乳液分解之后，剩余水溶液226包含核酸珠粒210。核酸珠粒210可包含结合到靶多核苷酸214的多个复制品的珠粒212。溶液也可包含并不包含靶多核苷酸的复制品的珠粒212(在本文中被称作未经扩增珠粒)。
返回到图1，洗涤并浓缩核酸珠粒，如110处所说明。在一实例中，可使用离心粒化珠粒且可从经粒化珠粒上方倾析或抽拉过量溶液。在另一实例中，可将核酸珠粒附着到用于紧固核酸珠粒的分离衬底同时替换环绕核酸珠粒的水溶液。
举例来说，如图2中所说明，核酸珠粒210可由分离衬底220捕获。相反地，并不包含多核苷酸的复制品的未经扩增珠粒212并不容易地附着到分离衬底220。因此，当分离衬底220被紧固且所附着核酸珠粒210固持就位时，实质上能从溶液洗涤未经紧固的未经扩增珠粒。在特定实例中，分离衬底214为可使用磁场紧固到容器壁的磁性衬底。核酸珠粒210可接着与分离衬底220分离，从而提供主要具有核酸珠粒及实质上较少未经扩增珠粒的溶液。
在特定实例中，核酸珠粒210可包含与分离衬底220上的部分相互作用的捕获部分。未经扩增珠粒可实质上不含捕获部分。举例来说，模板多核苷酸可用捕获部分封端。不与模板多核苷酸杂交的未经扩增珠粒没有捕获部分，且因此不与分离衬底键结。一旦核酸珠粒210与未经扩增珠粒分离，可(例如)通过从结合到核酸珠粒210的经扩展连接寡核苷酸解链或拆离模板多核苷酸使核酸珠粒210与分离衬底分离。
返回到图1，可将经浓缩核酸珠粒装载到生物传感器上，如112处所说明。取决于生物传感器的性质，生物传感器可提供可附着核酸珠粒的表面。所述表面可是平坦的，且任选地可包含较吸引核酸珠粒或经修改以紧固核酸珠粒的区域。在另一实例中，生物传感器可包含如下表面：其包含核酸珠粒在其中对准的离散部位或图案化表面，例如凹陷、凹口、孔、井、隆脊或沟道。在另一实例中，如图2中所说明，生物传感器可包含界定其中沉积核酸珠粒210的井218的表面结构216。
在特定实例中，井界定于传感器上方。井壁或传感器可具有由金属、半金属、其氧化物、其氮化物或其组合形成的表面。在一实例中，井壁可由例如硅的半金属、例如二氧化硅的其氧化物、例如氮化硅的其氮化物或其组合形成。在另一实例中，井壁可至少部分由金属或金属氧化物形成。示范性金属包含钛、钨、钽、铪、铝、锆、锌或其组合。井壁的一部分可由此类金属的氧化物或氮化物形成，例如氧化钛、氧化钽、二氧化铪、氧化铝、氧化锆、氮化钛，以及其它或其组合。另外，形成井的底部的传感器可具有金属、金属氧化物或金属氮化物表面或其组合。示范性金属包含钛、钨、钽、铪、铝、锆、锌或其组合。示范性金属氧化物或氮化物包含氧化钛、氧化钽、二氧化铪、氧化铝、氧化锆、氮化钛，以及其它或其组合。
在特定实例中，井壁或传感器的表面可以(例如)8OH/nm2到20OH/nm2的范围内(例如8OH/nm2与16OH/nm2之间)的浓度具有羟基。任选地，所述表面可用硫酸盐、磷酸盐或含有硅烷的化合物处理。所述化合物可键结到驻留于井壁或传感器的表面上的OH基团的至少一部分。在特定实例中，所述化合物包含含有硅烷的化合物，例如丁基铵三甲氧基硅烷(BATS)，或含有膦酸的化合物，例如咪唑烷基膦酸，例如，(1-甲基-3-(十二烷基膦酸)咪唑鎓溴化物)(ImPA)。
如图1的114处所说明，生物传感器可感测核酸珠粒的方面。取决于生物传感器的性质，传感器可用以检测靶多核苷酸内的特定序列的存在或可用于定序靶多核苷酸。举例来说，生物传感器可利用基于荧光的合成定序法。在另一实例中，生物传感器可利用包含感测核苷酸掺入的副产物(例如pH)或焦磷酸盐或磷酸盐的存在的定序技术。在另一实例中，生物传感器可利用温度或热量检测。
返回到图2，在一实例中，井阵列中的井218可以可操作地连接到测量装置。举例来说，对于荧光发射法，井218可以可操作地耦合到光检测装置。在离子检测的情况下，井218的下部表面可安置在离子传感器(例如场效应晶体管)的传感器垫上。
一种涉及通过检测核苷酸掺入的离子副产物定序的示范性系统包含半导体定序平台，例如通过检测作为核苷酸掺入的副产物产生的氢离子来定序核酸模板的基于离子的定序系统。通常，氢离子作为使用聚合酶的模板依赖性核酸合成期间发生的核苷酸掺入的副产物释放。此定序器通过检测核苷酸掺入的氢离子副产物来检测核苷酸掺入。此定序器可包含待定序的多个模板多核苷酸，每一模板安置于阵列中的各别定序反应井内。阵列的井可各自耦合到至少一个离子传感器，所述传感器可检测作为核苷酸掺入的副产物产生的H+离子的释放或溶液pH的改变。离子传感器包括耦合到离子敏感性检测层的场效应晶体管(FET)，所述检测层可感测H+离子的存在或溶液pH的改变。离子传感器可提供指示核苷酸掺入的输出信号，其可表示为量值与各别井或反应室中的H+离子浓度相关的电压改变。不同核苷酸类型可连续流入反应室，且可通过聚合酶以由模板序列测定的顺序掺入到扩展底涂剂(或聚合部位)中。每一核苷酸掺入可伴随着反应井中的H+离子释放，连同局部pH的伴随改变。可通过感测器的FET登记H+离子的释放，所述FET产生指示发生核苷酸掺入的信号。特定核苷酸流动期间未未掺入的核苷酸不产生信号。来自FET的信号的幅值也可与掺入到扩展核酸分子中的特定类型的核苷酸数目相关，由此允许解析均聚物区域。因此，在定序器运行期间，多个核苷酸流入反应室中，连同多个井或反应室上的掺入监测可允许仪器同时解析许多核酸模板的序列。
在特定实例中，生物传感器包含传感器衬底及界定于传感器衬底上方的流槽。核酸珠粒可施加到传感器衬底以沉积于传感器衬底的井中。在施加到利用生物传感器的检测系统(例如定序系统)之前，珠粒可暴露于流过流槽的气体，任选地暴露于凝结反应剂并经历额外处理。举例来说，如图3中所说明，方法300包含将珠粒施加到传感器衬底，如302处所说明。可通过流槽施加包含珠粒及(任选地)盐、缓冲剂或表面活性剂的悬浮液。任选地，生物传感器可进行涡旋或离心以进一步促进珠粒沉积于传感器衬底的井内。在特定实例中，生物传感器相对于旋转平面以至少30°的角度(例如30°与90°之间的角度)进行离心，其中井开口大体上朝向旋转轴向内面向。流槽内包含悬浮液的生物传感器可历时在30秒与15分钟之间变化的周期进行离心，例如在1分钟与10分钟之间变化的周期。
如图3的304处所说明，可对传感器衬底进行洗涤，从而从流槽冲洗悬浮液并留下沉积于传感器衬底的井中的珠粒。在一实例中，在洗涤期间，气体/液体界面可流动于衬底上方。可通过间歇性地使气体及液体流过流槽来施加气体/液体界面，从而形成气泡。在另一实例中，可形成通过流槽施加的泡沫，从而致使多个气体/液体界面流动于传感器衬底的井上方。
如图4中所说明，当包含珠粒的悬浮液被施加于传感器衬底上方时，珠粒418部分沉积于井416内，如402处所说明。在洗涤及气体/液体界面的任选施加之后，如404处所说明，珠粒可泡胀，但仍部分啮合于井416内。
如图3的306处所说明，可遍及流槽施加气体，从而将液体蒸发出流槽。气体可被推送通过流槽。替代地，可将气体抽拉通过流槽以蒸发液体。当将气体推送通过流槽时，相对于大气压力，流槽内的压力可增加。当将气体抽拉通过流槽时，相对于大气压力，流槽内的压力可降低。人们相信使气体流过流槽且特定来说将气体抽拉通过流槽将珠粒进一步驱动到井中并部分干燥井，从而从井蒸发液体。替代地，可使用离心使液体自旋出流槽。气体可为氮气、例如氦气或氩气的惰性气体或空气。如图4中的406处所说明，气体流过流槽(特定来说将气体抽拉通过流槽)进一步将珠粒抽拉到井中。
在一实例中，气体可历时至少15秒的周期流过流槽(例如抽拉通过流槽)，例如至少30秒、至少45秒、至少一分钟、至少1.5分钟、至少2分钟或甚至至少5分钟的周期。一般来说，气体并不长于30分钟(例如不长于20分钟)流过流槽。可以100μL/min到100mL/min范围内的速率施加气体，例如500μL/min到60mL/min的范围、500μL/min到40mL/min的范围，或甚至1mL/min到20mL/min的范围。
任选地，可在气体流动之后将凝结剂施加于传感器衬底上方，如图3的308处所说明。凝结反应剂可降低珠粒的直径，从而将珠粒进一步推送于井内。如图4中的408处所说明，凝结反应剂的施加导致珠粒收缩并将珠粒进一步抽拉于井内。
示范性凝结反应剂包含凝结剂，例如金属复合物、碱或碱土金属盐、非离子聚合物、乙醇或其组合。在一实例中，凝结剂包含(例如)包含钴的金属错合物，从而形成例如钴-胺错合物的钴有机错合物。
替代地或另外，凝结反应剂可包含影响珠粒的聚合物基质的密度的凝结剂。举例来说，溶液可包含可影响珠粒的聚合物基质的密度的醇，例如甲醇、乙醇或异丙醇(IPA)。具体来说，溶液可以0.1vol.％到60vol.％的范围内的浓度包含例如甲醇的醇，例如0.1vol.％到50vol.％的范围、0.1vol.％到30vol.％的范围、0.1vol.％到20vol.％的范围，或甚至0.1vol.％到10vol.％的范围。举例来说，溶液内的醇的浓度可在0.1vol.％到5vol.％，例如1vol.％到5vol.％的范围内。在另一实例中，溶液可以0.1vol.％到60vol.％的范围内的浓度包含例如乙醇或IPA的醇，例如1.0vol.％到60vol.％的范围、5.0vol.％到60vol.％的范围、10vol.％到60vol.％的范围，或甚至40vol.％到60vol.％的范围。
在另一实例中，凝结剂包含浓缩的碱或碱土金属盐，例如卤盐。在另一实例中，凝结剂可以(例如)20mM到1M的范围内的浓度包含氯化镁，例如100mM到800mM的范围，或甚至100mM到500mM的范围。
凝结剂可进一步为非离子聚合物，例如聚乙二醇类聚合物。在特定实例中，聚乙二醇类聚合物具有在2000与20000之间的范围内的分子量，例如5000与15000之间或8000与12000之间。非离子聚合物可以0.1wt％到20.0wt％的范围内的浓度包含，例如0.5wt％到15.0wt％的范围、0.5wt％到10wt％的范围或2.5wt％到7.5wt％的范围。
凝结反应剂的剩余部分可包含缓冲溶液，例如缓冲盐水溶液。举例来说，凝结反应剂的剩余部分可包含磷酸盐缓冲盐水溶液。具体来说，溶液可包含卤化钠或卤化钾盐、磷酸钠或磷酸钾盐或聚山梨醇酯。此类盐可以(例如)1mM到500mM的范围内的量包含在内，例如50mM到350mM的范围或150mM到250mM的范围。在一实例中，氯化钾可以0.5M到2M的范围内的浓度包含在内，例如0.8M到1.5M的范围或甚至0.8M到1.2M的范围。另外或替代地，可使用其它缓冲剂，例如胺类缓冲剂，例如三(羟基甲基)胺基甲烷。此胺缓冲剂可以10mM到1M的范围内的浓度使用，例如100mM到1M的范围、100mM到800mM的范围，或甚至150mM到500mM的范围。任选地，凝结反应剂可包含其它离子组分，例如衍生自盐的钙或镁。另外，溶液可具有6与9之间的pH，例如6.5与8.5之间或7与8.5之间。
凝结反应剂可包含表面活性剂。举例来说，表面活性剂可为非离子聚合物表面活性剂，例如聚乙二醇的醚，例如聚乙二醇的辛基苯基醚。非离子聚合物表面活性剂可以0.01％到1.0％的范围包含在内，例如0.05％到0.8％的范围、0.05％到0.5％的范围或甚至0.08％到0.15％的范围。示范性表面活性剂为TritonX-100。
在一实例中，凝结反应剂包含凝结剂，例如在20mM到500mM范围内的MgCl2；盐，例如在0.8M到1M范围内的KCl；缓冲剂，例如在150mM到500mM范围内的三(羟基甲基)胺基甲烷；及表面活性剂，例如在0.05％到0.5％范围内的TritonX-100。pH处于7到9的范围。
在另一实例中，凝结反应剂包含凝结剂(例如在20mM到500mM的范围内的MgCl2)与在0.5wt％到10.0wt％的范围内的聚乙二醇的组合。聚乙二醇可具有在1000到15000的范围内的分子量。凝结反应剂还可包含盐，例如在0.8M到1M的范围内的KCl；缓冲剂，例如在10mM到500mM的范围内的三(羟基甲基)胺基甲烷；或表面活性剂，例如在0.05％到0.5％的范围内的TritonX-100。pH处于7到9的范围。
响应于暴露于凝结反应剂，包含核酸链的核酸珠粒的直径可降低。举例来说，响应于暴露于溶液，珠粒或颗粒直径可降低至少1％。在一实例中，直径降低至少5％，例如至少10％、至少15％或甚至至少19％。在特定实例中，直径降低不超过75％。另外，响应于暴露于凝结剂，珠粒或颗粒的密度可增加。举例来说，密度可增加至少2％，例如至少8％、至少14％、至少21％、至少25％、至少50％、至少65％或甚至至少80％。具体来说，密度增加不超过7500％。
任选地，可一或多次全部重复洗涤传感器衬底的过程(如图3的304处所说明)，使气体流过流槽(如306处所说明)或施加凝结反应剂(如308处所说明)，或部分重复上述过程。
在定序应用或涉及使用酶的其它生物分子应用的情况下，可将酶装载到沉积于传感器衬底上的珠粒上，如310处所说明。具体来说，可遍及流槽施加包含酶的溶液并使其与沉积于井内的珠粒接触。一般来说，与酶的此接触导致珠粒的动态直径或大小增加。
任选地，在装载酶之后，可再次使用如上文所描述的流动速率及周期执行使气体流过流槽的过程(如312处所说明)，(例如)以从流槽蒸发液体。由于装载了酶，珠粒大小增加。举例来说，如图4中的410处所说明，装载酶可带来珠粒的初始溶胀，且在酶存在情况下的进一步培养可带来珠粒的进一步溶胀，如412处所说明。在珠粒响应于酶存在情况下的培养溶胀之后将气体进一步抽拉通过流槽可将珠粒部分抽拉回到井中，如图4的414处所说明。
如图3的314处所说明，额外反应剂或其它溶液可流过流槽以制备传感器衬底用于进一步处理或作为测试例程的部分。举例来说，包含核苷酸的反应剂溶液可在定序反应期间流动于传感器衬底上方。
在图5中所说明的又一示范性方法中，珠粒520可最初自旋于传感器衬底上的井518中，如502处所说明。可对珠粒520进行洗涤，如504处所说明，且任选地可将气体/液体界面(例如，呈泡沫形式)施加到传感器衬底，从而最初增加珠粒520的大小。可如506处所说明地施加凝结剂，且可移除液体且接着可蒸发液体(如508处所说明)以收缩珠粒520并将其更深地驱动到井518中。移除液体可包含施加空气气泡以从流槽驱动液体或使流槽自旋以将液体迫出并将空气抽入。可通过将空气或干燥氮气抽拉通过传感器衬底的流槽或将空气或氮气推送通过流槽来实现从流槽蒸发液体。
在移除液体之后，可对珠粒520进行洗涤，如510处所说明。可再次施加凝结剂并蒸发液体(例如，施加气体)，如512处所说明。可以0次与2次之间的次数重复洗涤、凝结及蒸发(522)。
如514处所说明，可将酶装载到珠粒520中，且任选地可对珠粒进行洗涤并施加气体，如516处所说明。
用于将珠粒装载到包含井的传感器衬底上的上文所描述方法的实施例提供将珠粒(特定来说结合到核酸或蛋白质的珠粒)抽拉到传感器衬底的井中的技术优势。将此类珠粒较好安放并沉积于井中增加关键信号或降低信噪比。另外，此过程尤其适于掺入水凝胶珠粒的系统及利用表面上展现OH基团的井壁或传感器表面的系统。即使在此类OH基团由表面涂层部分阻挡的情况下，上文所描述方法的实施例仍提供经改良装载、较高关键信号或较高信噪比。
如上文所描述，可将核酸珠粒装载到用于测定核酸珠粒的特性的生物传感器中。具体来说，核酸珠粒可用于定序结合到核酸珠粒的靶序列。举例来说，定序可包含免标记DNA定序，且具体来说，基于pH的DNA定序。将包含DNA模板且具有底涂剂及可操作地键结的聚合酶的衬底装载到反应室(例如微孔)中，之后进行去氧核苷三磷酸(dNTP)添加及洗涤的重复循环。此类模板通常作为克隆种群附着到衬底，例如，微粒、珠粒或其类似者，且将此类克隆种群装载到反应室中。在所述循环的每一添加步骤中，当模板中的下一碱基为所添加dNTP的互补序列时，聚合酶通过掺入所添加dNTP来扩展底涂剂。当存在一个互补碱基时，存在一次掺入，当存在两个互补碱基时，存在两次掺入，当存在三个互补碱基时，存在三次掺入，以此类推。伴随着每一次此掺入，存在释放的氢离子，且总体来说释放氢离子的模板种群使反应室的局部pH发生非常轻微的改变，这由电子传感器检测到。
图6图解说明用于进行基于pH的核酸定序的设备。设备的每一电子传感器产生取决于参考电压的值的输出信号。在图6中，含有流体回路(602)的外壳(600)由入口连接到反应剂储槽(604、606、608、610及612)、到废料储槽(620)并由通路(632)连接到流槽(634)，所述通路将流体节点(630)连接到流槽(634)的入口(638)。来自储槽(604、606、608、610及612)的反应剂可由多种方法(包含压力、例如注射泵的泵、重力供给及其类似者)驱动到流体回路(602)并通过阀(614)的控制来选择。控制系统(618)包含用于阀(614)的控制器，其产生用于通过电连接(616)打开及闭合的信号。控制系统(618)还包含用于系统的其它组件的控制器，所述组件例如由(622)连接到其上的洗涤溶液阀(624)及参比电极(628)。控制系统(618)还可包含用于流槽(634)的控制及数据获取功能。在一个操作模式中，流体回路(602)在控制系统(618)的编程控制下将一序列选定反应剂(1、2、3、4或5)输送到流槽(634)，使得在选定反应剂流动之间，流体回路(602)被底涂及洗涤，且洗涤流槽(634)。进入流槽(634)的流体通过出口(640)离开并沉积于废料容器(636)中。在此操作过程中，发生于流槽(634)中的反应或测量具有稳定参考电压，这是因为参比电极(628)具有与流槽(634)的连续(亦即不间断)电解质路径，但仅与洗涤溶液物理接触。
实例
将结合到核酸的水凝胶聚丙烯酰胺珠粒沉积于具有0.7μm的井直径的传感器衬底上。井由氮化硅壁形成。底层传感器垫及所述壁的一部分由用ImPA表面处理的钛形成。珠粒具有大约0.68μm的平均直径且染色有可从生命技术公司获得的SYBR金荧光染料。
将包含珠粒的悬浮液施加于衬底表面上方以将珠粒至少部分沉积于井内，如图7中的图像1所说明。图像包含不含井且表示沉积于填隙式表面上的珠粒的较亮中心条带。具有较低强度的沉积于中心条带的两侧上的珠粒至少部分沉积于井内。井内的珠粒的平均强度与填隙式中心条带上的珠粒的平均强度的比率指示珠粒沉积的井内的深度。如图8中的条柱1所说明，平均珠粒具有0.3与0.35之间的强度比率(平均沉积珠粒强度与填隙式表面上的珠粒的平均强度的比率)。在将气体抽拉通过流槽以从井蒸发液体之后，井内沉积的平均珠粒展现较低强度比率，如图7中的图像2及图8中的条柱2所说明。强度比率的此减少表示珠粒被又一次抽拉到井中。
用包含100mmol的氯化镁及具有大约10,000的分子量的5wt％聚乙二醇的凝结反应剂进一步处理珠粒。如图7的图像3及图8的条柱3处所说明，在用凝结剂处理之后，强度比率明显下降。
可在凝结反应剂存在情况下通过离心使珠粒进一步自旋，如图7的图像4或图8的条柱4处所说明。在凝结剂存在情况下的此自旋对强度比率具有受限的影响且可实际上增加强度比率。
可在酶存在情况下培养珠粒。如图7的图像5及图8的条柱5处所说明，在酶存在情况下的此培养导致珠粒溶胀且因此增加强度比率。在装载酶之后可进一步将气体抽拉通过流槽以从井蒸发液体，从而导致珠粒具有略微较低的强度比率，如图7的图像6及图8的条柱6处所说明。
在第一方面中，一种将珠粒装载到传感器衬底上的方法包含：将包含珠粒的悬浮液施加到界定于传感器衬底上方的流槽，传感器衬底包括多个井，珠粒至少部分沉积于多个井中；从流槽移除液体；从流槽蒸发液体；及将水合溶液施加到流槽。
在第一方面的一实例中，施加悬浮液包含在珠粒存在情况下离心传感器衬底。
在第一方面的另一实例及上文实例中，所述方法进一步包含在从流槽蒸发液体之前，使一或多个气泡流过流槽并在传感器衬底上方流动。
在第一方面的另一实例及上文实例中，从流槽蒸发液体包含历时至少15秒且不长于30分钟的周期将气体抽拉通过流槽。
在第一方面的额外实例及上文实例中，从流槽蒸发液体包含以100μL/min到100mL/min的范围内的速率将气体抽拉通过流槽。
在第一方面的另一实例及上文实例中，所述方法进一步包含将凝结溶液施加于传感器衬底上方。举例来说，施加凝结溶液包含在从流槽蒸发液体之后施加凝结溶液。在一实例中，施加凝结溶液包含在从流槽蒸发液体之前施加凝结溶液。在另一实例中，凝结溶液包含凝结剂。举例来说，凝结剂包含镁、聚乙二醇聚合物或其组合。
在第一方面的另一实例及上文实例中，所述方法进一步包含遍及流槽施加酶溶液并在传感器衬底上方施加酶溶液。举例来说，所述方法进一步包含在施加酶溶液之后从流槽移除液体及从流槽蒸发液体。
在第一方面的额外实例及上文实例中，传感器衬底包含半导体定序装置。在一实例中，半导体定序装置包含pH传感器的阵列。举例来说，所述方法进一步包含使用半导体定序装置进行定序。
在第一方面的另一实例及上文实例中，珠粒包含水凝胶珠粒。
在第二方面中，一种将珠粒装载到传感器衬底上的方法包含：将包含核酸珠粒的悬浮液施加到界定于传感器衬底上方的流槽，传感器衬底包括多个井，珠粒至少部分沉积于多个井中；使气体/液体界面流动通过流槽及传感器衬底上方；历时至少15秒且不长于30分钟的周期以100μL/min到100mL/min的范围内的速率从流槽蒸发液体；及遍及流槽施加凝结溶液。
在第二方面的一实例中，凝结溶液包含镁盐及聚乙二醇聚合物。
在第二方面的另一实例及上文实例中，使气体/液体界面流动包含使泡沫流过流槽。
在第二方面的另一实例及上文实例中，所述方法进一步包含在施加凝结溶液之后遍及流槽施加酶溶液。
应注意，并不要求上文在一般描述或实例中所描述的所有活动，可能不要求特定活动的一部分且除所描述内容之外可执行一或多个其它活动。再者，活动所列的顺序未必是执行顺序。
在前文说明书中，所述概念已经参考特定实施例来描述。然而，所属领域的一般技术人员了解，可在不脱离如下文权利要求书中所阐述的本发明范围的情况下进行各种修改及改变。因此，本说明书及图式应该以说明性而非限制性意义来看待，且所有此类修改意图包含在本发明的范围内。
如本文中所使用，术语“包括(comprises、comprising)”、“包含(includes、including)”、“具有(has、having)”或其任何其它变化旨在涵盖非排它性的包含。举例来说，包括一列特征的过程、方法、制品或设备未必仅限于那些特征，俄式可包含没有明确列出或此类过程、方法、制品或设备所固有的其它特征。另外，除非明确陈述为相反，否则“或”是指包含性的或而不是排它性的或。举例来说，通过以下中的任一者来满足条件A或B：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，及A及B都为真(或存在)。
同样，使用“一(a/an)”是用来描述本文中描述的要素及组分。这样做只是为方便起见且给出本发明范围的一般性意义。除非显而易见指的是其它情况，否则此描述应该理解为包含一个或至少一个，且单数也包含多个。
上文已关于特定实施例描述了益处、其它优势及对问题的解决方案。然而，所述益处、优势、对问题的解决方案及任何特征(它们可能引起任何益处、优势或解决方案出现或变得更突出)不应该被理解为任何或所有权利要求的一关键、所要求或必需特征。
在阅读本说明书之后，本领域技术人员将了解，为了清楚起见，在单独实施例的情况下描述的本文中的某些特征也可在单个实施例中以组合形式提供。相反地，为了简洁起见，在单个实施例的情况下所描述的各种特征也可单独地或以任何次组合形式提供。另外，对以范围陈述的值的参考包含在那个范围内的每一个值。

Claims (20)

1.一种在传感器衬底上装载珠粒的方法，所述方法包括：
将包含珠粒的悬浮液施加到界定于传感器衬底上方的流槽，所述传感器衬底包括多个井，所述珠粒至少部分沉积于所述多个井中；
从所述流槽移除液体；
从所述流槽蒸发液体；及
将水合溶液施加到所述流槽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中施加所述悬浮液包含在所述珠粒存在的情况下离心所述传感器衬底。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其进一步包括在从所述流槽移除所述液体之前使一或多个气泡流过所述流槽及所述传感器衬底上方。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中从所述流槽蒸发液体包含历时至少15秒且不长于30分钟的周期将气体抽拉通过所述流槽。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中从所述流槽蒸发液体包含以100μL/min到100mL/min的范围内的速率将气体抽拉通过所述流槽。
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其进一步包括将凝结溶液施加于所述传感器衬底上方。
7.根据权利要求6所述的方法，其中施加所述凝结溶液包含在将气体抽拉通过所述流槽之后施加所述凝结溶液。
8.根据权利要求6所述的方法，其中施加所述凝结溶液包含在从所述流槽蒸发液体之前施加所述凝结溶液。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述凝结溶液包含凝结剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述凝结剂包含镁、聚乙二醇聚合物或其组合。
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的方法，其进一步包括遍及所述流槽施加酶溶液并将所述酶溶液施加于所述传感器衬底上方。
12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括在施加所述酶溶液之后从所述流槽移除液体及从所述流槽蒸发液体。
13.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的方法，其中所述传感器衬底包含半导体定序装置。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述半导体定序装置包含pH传感器的阵列。
15.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括使用所述半导体定序装置进行定序。
16.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中所述珠粒包含水凝胶珠粒。
17.一种在传感器衬底上装载珠粒的方法，所述方法包括：
将包含核酸珠粒的悬浮液施加到界定于传感器衬底上方的流槽，所述传感器衬底包括多个井，所述珠粒至少部分沉积于所述多个井中；
使气体/液体界面流过所述流槽及所述传感器衬底上方；
历时至少15秒且不长于30分钟的周期以100μL/min到100mL/min的范围内的速率从所述流槽蒸发液体；及
遍及所述流槽施加凝结溶液。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述凝结溶液包含镁盐及聚乙二醇聚合物。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中使所述气体/液体界面流动包含使泡沫流过所述流槽。
20.根据权利要求17到19中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在施加所述凝结溶液之后遍及所述流槽施加酶溶液。
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