WO2022191673A1 - 비타민 a로 표면개질된 엑소좀을 포함하는 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

비타민 a로 표면개질된 엑소좀을 포함하는 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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vitamin
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exosomes
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조용우
박재형
유동길
오병훈
뀌 응우엔반
임경택
최지숙
최영찬
정연제
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주식회사 엑소스템텍
성균관대학교산학협력단
한양대학교 에리카산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis.
  • Liver fibrosis is caused by excessive deposition of extracellular matrix due to chronic inflammation, and if this chronic liver disease persists, it eventually progresses to cirrhosis due to the transformation of the structure of the liver and a decrease in the number of hepatocytes.
  • Such chronic liver disease can be viewed as a continuous disease that progresses from chronic hepatitis to cirrhosis through fibrosis rather than an independent disease.
  • drug treatment or liver transplantation is being performed for various hepatitis and liver cirrhosis, but the need for a new treatment is emerging due to drug resistance or lack of liver transplant donors.
  • liver regeneration therapy using stem cells is a treatment that has recently received a lot of attention, and it is known that the injected stem cells differentiate into functional hepatocytes in the damaged liver to show therapeutic effects.
  • Functional hepatocyte differentiation using stem cells in vitro is possible, but there is a problem that the efficiency of hepatocyte differentiation is low with stem cells transplanted from animal models and humans.
  • the biggest problem of the conventional treatment using stem cells is that the cell engraftment rate and survival rate are not constant depending on the patient.
  • allogenic transplantation has limitations due to the immune response by stem cells.
  • hepatic stellate cells which are the main causative cells of liver fibrosis, in order to maximize the treatment efficiency of liver fibrosis
  • the present inventors made efforts to convert stem cells into normal cells while alleviating liver fibrosis.
  • the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis, comprising, as an active ingredient, an adipose stem cell-derived exosome surface-modified with vitamin A.
  • Embodiment 1 A composition for use in preventing or treating liver fibrosis comprising an adipose stem cell-derived exosome surface-modified with vitamin A as an active ingredient; A method for preventing or treating liver fibrosis, comprising administering to a subject in need thereof an adipose stem cell-derived exosome surface-modified with vitamin A; Or application of adipose stem cell-derived exosomes surface-modified with vitamin A for the manufacture of pharmaceuticals for the prevention or treatment of liver fibrosis.
  • Embodiment 2 The composition according to Embodiment 1, wherein the exosome is surface-modified with a vitamin A ligand comprising a vitamin A moiety and a phospholipid moiety linked by a covalent bond; Way; or application.
  • Embodiment 3 The composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the exosomes surface-modified with vitamin A selectively target hepatic stellate cells; Way; or application.
  • Embodiment 4 The composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the exosome inhibits the expression of ⁇ -SMA ( ⁇ -smooth muscle actin) in hepatic stellate cells; Way; or application.
  • ⁇ -SMA smooth muscle actin
  • Embodiment 5 The composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the exosome inhibits deposition of extracellular matrix in liver tissue; Way; or application.
  • Embodiment 6 The composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the adipose stem cell is a human adipose stem cell; Way; or application.
  • Embodiment 7 The composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the adipose stem cells are derived from autologous adipose tissue of a patient to which the exosomes are administered; Way; or application.
  • Embodiment 8 The composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the exosome is for intravenous administration; Way; or application.
  • Embodiment 9 The composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the vitamin A ligand further comprises a covalently linked polyethylene glycol (PEG) moiety; Way; or application.
  • PEG polyethylene glycol
  • Embodiment 10 The composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the vitamin A ligand has a phospholipid-PEG-vitamin A structure; Way; or application.
  • Embodiment 11 The method according to any one of the preceding embodiments, wherein the vitamin A is 1 selected from the group consisting of retinol, retinal, provitamin A carotenoids and salts thereof composition characterized in that the above; Way; or application.
  • the vitamin A is 1 selected from the group consisting of retinol, retinal, provitamin A carotenoids and salts thereof composition characterized in that the above; Way; or application.
  • a method for producing adipose stem cell-derived exosomes surface-modified with vitamin A comprising a.
  • Embodiment 13 The method of embodiment 12, wherein step (a) is carried out by converting the carboxyl group of vitamin A to an amine-reactive ester.
  • One aspect of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis comprising, as an active ingredient, an adipose stem cell-derived exosome surface-modified with vitamin A.
  • the exosome surface-modified with vitamin A, the active ingredient of the present invention contains genes, proteins, and growth factors related to cell proliferation, differentiation, and regeneration of stem cells, and does not contain antibiotics, serum, or harmful factors of culture medium. It has a remarkable effect compared to the exosomes used previously because it has the characteristic of specifically targeting hepatic stellate cells.
  • An example of such a basic concept of the present invention is shown in FIG. 1 .
  • Exosomes which are active ingredients of the present invention, may be surface-modified by a vitamin A ligand comprising a covalently linked vitamin A moiety and a phospholipid moiety.
  • the vitamin A may be at least one selected from the group consisting of retinol, retinal, provitamin A carotenoids, and salts thereof.
  • the phospholipid refers to a compound in which a fatty acid and a phosphate group are bonded to glycerol.
  • the head of phospholipids is polar, and the tail with fatty acids is hydrophobic because it does not mix well with water and is easily miscible with non-polar substances, and the region with phosphate groups is hydrophilic because it is easily miscible with water molecules or other polar molecules.
  • These phospholipids are important because they are a major component of biological membranes, and are contained in large amounts in the myelin sheaths of nerves and tissues.
  • the phospholipids include, for example, phosphorylethanolamine, Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylethanolamine (DSPE), Ceramide phosphorylethanolamine, Phosphosphingolipids, and phosphorylcholine ( phosphorylcholine), sphingomyelin, phosphoryllipid, ceramide phosphoryllipid, diacylglyceride, glycerophospholipid, phosphatidate, Phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, lecithin, phosphatidylserine, phosphoinositide, Phosphatidyl inositol, Phosphatidylinositol, Phosphatidylinositol (Phosphatidylinositol bisphosphate), phosphatidylinositol trisphosphate, etc. may be used, but is not limited thereto.
  • the vitamin A ligand of the present invention includes a covalently linked vitamin A moiety and a phospholipid moiety, it may exhibit a particularly remarkable effect in selectively targeting hepatic stellate cells.
  • adipose stem cell-derived exosomes surface-modified with the vitamin A ligand of the present invention are phospholipids Compared to adipose stem cell-derived exosomes surface-modified with only vitamin A without and without vitamin A, it exhibits an intracellular targeting rate that is at least 1.5 times, at least 1.8 times, at least 2 times, and at least 3 times higher.
  • the vitamin A ligand may further include a covalently linked polyethylene glycol (PEG) moiety. Pegylation of phospholipids can further improve blood circulation time and stability of surface-modified exosomes.
  • the vitamin A ligand may have a phospholipid-PEG-vitamin A structure.
  • prevention refers to any action of suppressing or delaying the onset of liver fibrosis by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which symptoms due to liver fibrosis are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • stem cell refers to a cell that is the basis of cells or tissues constituting an individual, and its characteristics are that it can self-renew by dividing repeatedly, and has a specific function depending on the environment. It refers to a cell having a multidifferentiation ability capable of differentiating into a cell. It occurs in all tissues during the development of the fetus and is found in some tissues where cells are actively replaced, such as bone marrow and epithelial tissue, even in adulthood. Stem cells are totipotent stem cells, which are formed when a fertilized egg begins dividing, and pluripotent stem cells in the blastocyst, which are formed by continuing division of these cells, depending on the type of differentiated cell.
  • the pluripotent stem cells are cells that can differentiate only into cells specific to the tissues and organs that contain these cells. It is involved in maintenance and inducing regeneration in the event of tissue damage. These tissue-specific pluripotent cells are collectively referred to as adult stem cells.
  • Mesenchymal stem cells classified as adult stem cells, are cells that are attracting attention as materials for regenerative medicine. They can be collected from tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, adipose tissue, and umbilical cord. It has the ability to differentiate into cells constituting various human tissues such as cells, osteocytes, chondrocytes, nerve cells, and cardiomyocytes.
  • stem cells isolated from human adipose tissue were used, but the present invention is not limited thereto.
  • adipose stem cells those derived from autologous adipose tissue of a patient to which the pharmaceutical composition is administered may be used.
  • exosome refers to cell-derived vesicles present in almost all eukaryotic fluids including blood, urine, and cell culture fluids. Because exosomes have been reported to perform important specific functions in processes such as aggregation, intracellular signal transduction, and cellular waste management, exosomes are secreted by fusion to the plasma membrane or directly from the plasma membrane. In general, it is attracting attention as a biomarker for specific diseases, diagnosis, and treatment. In the present invention, the exosomes may be naturally secreted from the cells by culturing human adipose stem cells.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention contains adipose stem cell-derived exosomes as an active ingredient, and may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Adipose stem cell-derived exosomes are a composition generated in the process of promoting the secretion of various factors for the treatment of liver fibrosis, and contain genetic information, proteins, and growth factors for the treatment of liver fibrosis. Absorption is also excellent. Therefore, it is possible to solve problems that can be caused by the currently used therapeutic drugs, or the limitations of stem cell cancer cellization or allogenic transplantation that can occur in treatment using stem cells that are being researched recently.
  • the adipose stem cell-derived exosome of the present invention may have a diameter of 30 to 400 nm, and in a narrower range, 100 to 300 nm.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in formulation, and includes saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, etc.
  • the present invention is not limited thereto, and may further include other conventional additives such as antioxidants and buffers, if necessary.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants, etc. may be additionally added to form an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules, or tablets.
  • formulations can be preferably made according to each component using the method disclosed in Remington's literature.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in dosage form, but may be formulated as an injection, inhalant, external preparation for skin, or oral ingestion.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, dermally, nasally, or applied to the respiratory tract) according to a desired method, preferably intravenously.
  • the dosage varies depending on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the drug form, the administration route and time, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, and drug activity of the patient. , sensitivity to the drug, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple.
  • the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and generally 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg per kg of body weight, is administered daily or every other day, or 1 It can be administered in divided doses 1 to 3 times a day. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of (a) activating the carboxyl group of vitamin A; (b) synthesizing a vitamin A ligand by coupling the phospholipid compound with the carboxyl group of the activated vitamin A; And (c) to provide a method for preparing the pharmaceutical composition of the present invention, comprising the step of modifying the surface of the adipose stem cell-derived exosomes with the synthesized vitamin A ligand.
  • step (a) may be performed by converting the carboxyl group of vitamin A into an amine-reactive ester.
  • the pharmaceutical composition of the present invention prepared as described above can effectively inhibit the expression of ⁇ -SMA ( ⁇ -smooth muscle actin) in hepatic stellate cells, and can inhibit the deposition of extracellular matrix in liver tissue. have.
  • ⁇ -SMA smooth muscle actin
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises blood aspartate aminotransferase (AST), blood alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), total bilirubin (Total bilirubin (TP), or LW/BW (Ratio of liver weight to body weight) levels.
  • AST blood aspartate aminotransferase
  • ALT blood alanine aminotransferase
  • ALP alkaline phosphatase
  • Total bilirubin Total bilirubin
  • LW/BW Ratio of liver weight to body weight
  • adipose stem cell-derived exosomes surface-modified with vitamin A of the present invention are a major cause of hepatic fibrosis, while general adipose stem cell-derived exosomes have a behavior of indiscriminate accumulation throughout the liver tissue, thus limiting efficient liver fibrosis treatment. It can specifically target hepatic stellate cells, which are causative cells.
  • exosomes extracted from adipose stem cells are surface-modified with vitamin A and used as an active ingredient of a fibrosis therapeutic composition targeting hepatic stellate cells.
  • Figure 2 shows (a) the synthesis process of vitamin A ligand for hepatic stellate cell target and (b) 1H-NMR results of retinoic acid, DSPE-PEG2000-amine, DSPE-PEG2000-Vit A.
  • Figure 3 shows (a) the size change by the surface modification of the exosome and (b) the shape change by the surface modification of the exosome.
  • Figure 5 shows (a) adipose stem cell-derived exosomes and cellular uptake evaluation of exosomes surface-modified with vitamin A ligand, and (b) fluorescence quantitative results of (a).
  • Figure 6 shows (a) adipose stem cell-derived exosomes and fibrosis factor expression inhibition evaluation of exosomes surface-modified with vitamin A ligand and (b) fluorescence quantitative results of (a).
  • Figure 8 shows (a) the distribution evaluation of adipose stem cell-derived exosomes and exosomes surface-modified with vitamin A ligand in liver tissue and (b) co-localization evaluation results of exosomes and ⁇ -SMA.
  • AST aspartate aminotransferase
  • Figure 11 shows the results of evaluation of (a) histopathological analysis of liver tissue and (b) liver tissue fibrous area distribution.
  • Human adipose stem cell-derived exosomes were extracted during culturing of human adipose stem cells. Specifically, human adipose stem cells were cultured in a general culture medium (HyClone TM , Cat#: SH30919) and replaced with a serum-free medium (HyClone TM , Cat#: SH30243) 24 hours before exosome extraction and cultured for 24 hours. After that, the cell culture supernatant was recovered. The recovered cell culture supernatant was first centrifuged at 3,000 x g, 4° C. for 20 minutes, and secondarily, 0.22 ⁇ m filtered to remove cell debris and wastes.
  • a general culture medium HyClone TM , Cat#: SH30919
  • a serum-free medium HyClone TM , Cat#: SH30243
  • the recovered supernatant was separated and purified using a tangential flow filtration (TFF) system using a 300 kDa filter to separate and purify the exosomes.
  • TNF tangential flow filtration
  • normal culture medium was added to human adipose stem cells and cultured, and this process was repeated until passage 7. In this way, the exosomes extracted in the process of proliferation until passage 7 were used as a freeze-dried formulation composition.
  • the surface of the lyophilized exosome obtained in Example 1 was modified with vitamin A, and in order to evaluate the targeting ability of hepatic stellate cells, the exosomes were first fluorescently labeled before modification (Flamma 675, red).
  • the surface of the fluorescently labeled exosomes was modified with vitamin A.
  • the fluorescence-labeled exosomes were diluted to a concentration of 1.5x10 9 cells/ml in Diluent C (sigma aldrich) as a reaction buffer.
  • vitamin A retinol, Sigma
  • exosomes derived from adipose stem cells or exosomes surface-modified with vitamin A which are fluorescently labeled (Flamma 675, red) in hepatic stellate cells activated with TGF- ⁇ 1, were treated at a concentration of 1 ⁇ 10 7 particles/dish for 12 hours. treated, and fluorescence was quantified.
  • the exosome surface was modified with a vitamin A ligand.
  • a vitamin A ligand for a hepatic stellate cell target was synthesized. Specifically, after completely dissolving 100.0 mg of retinoic acid (RA) in 1 ml DMSO, 113.7 mg of EDC ⁇ HCl and 76.7 mg of NHS were added and reacted at 40° C. for 48 hours to activate the carboxyl group of RA. Then, 836.2 mg of DSPE-PEG2000-amine was added and reacted at 40° C. for 36 hours (see FIG. 2(a)).
  • RA retinoic acid
  • the surface of human adipose stem cell exosomes was modified by a hydrophobic insertion method using the modified moiety (DSPE-PEG-Vitamin A) synthesized above. Specifically, first, the concentration of exosomes was measured using Nano Tracking Ananysis (NTA) and diluted to a concentration of 1.5x10 9 cells/ml in Diluent C (sigma aldrich) as a reaction buffer. Similarly, the modified moiety, DSPE-PEG-Vitamin A stock (anhydrous ethanol, 1 mM), was diluted in 1 ml of Diluent C to a final concentration of 400 nM.
  • NTA Nano Tracking Ananysis
  • the diluted exosomes and the modified moiety were mixed and stirred at 4°C for 15 minutes. Thereafter, unreacted modified moiety and Diluent C were removed through PD-10. Finally, through Amicon® (Sigma aldrich, Ultra-4 Centrifugal Filter Unit), centrifuged at 2600 g at 4°C for 20 min to obtain vitamin A-modified exosomes.
  • Amicon® Sigma aldrich, Ultra-4 Centrifugal Filter Unit
  • Figure 3 shows the change in the size and shape of the exosome according to the modification of the surface of the adipose stem cell-derived exosome with a vitamin A ligand in the novel method in 3 above.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • CD63-capture magnetic beads (6000 pieces) and 100ul of adipose stem cell-derived exosomes or vitamin A ligands were used to evaluate the biomarkers.
  • the modified exosomes (5 ⁇ 10 9 pieces/ml) were mixed and reacted at room temperature for 12 hours.
  • anti-CD9 antibody (1ug) or anti-CD63 (1ug) antibody was added and reacted at 4°C for 1 hour.
  • FIG. 4(a) The results of evaluation of the markers of the exosomes using a confocal microscope are shown in FIG. 4(a), and the results of evaluation of the markers of the exosomes using flow cytometry are shown in FIG. 4(b).
  • Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), hepatic stellate cells (LX-2), adipose stem cell-derived exosomes fluorescently labeled with activated hepatic stellate cells (Flamma 675, red) or vitamin A ligand according to the novel method in 3 above.
  • the surface-modified exosomes were treated with a concentration of 1 ⁇ 10 7 particles/dish for 12 hours.
  • the cells used in this experiment were used after a 60-hour stabilization process, and the activated hepatic stellate cells were activated for 48 hours with TGF- ⁇ 1 (10ng/ml) for the last 48 hours.
  • TGF- ⁇ 1 (10ng/ml
  • ⁇ -smooth muscle actin ( ⁇ -SMA) is utilized as a representative liver fibrosis indicator and is expressed by hepatic stellate cells.
  • ⁇ -SMA ⁇ -smooth muscle actin
  • liver fibrosis was induced by intraperitoneal injection of thioacetamide, a liver toxin, at a concentration of 250 mg/kg 3 times a week for 12 weeks.
  • Fluorescently stained exosomes were administered to an animal model inducing liver fibrosis, and immunohistochemistry was performed on liver tissue sections to evaluate their targeting ability to hepatic stellate cells. Specifically, the exosomes before modification were mixed with Cy5.5-NHS in a weight ratio of 200:1, stirred at 4° C. for 4 hours, and after staining, the modification step was performed as above. Unmodified exosomes were also fluorescently stained in the same way. To evaluate whole body biodistribution, the amount of fluorescence was measured using IVIS equipment for each time after treatment.
  • the main organs were removed by euthanasia, fixed with 4% neutral buffered formalin solution, and embedded in paraffin to prepare tissue sections with a thickness of 5 ⁇ m.
  • the paraffin sections were treated with an antibody targeting ⁇ -Smooth Muscle Actin ( ⁇ -SMA), a hepatic stellate cell marker, and stained with fluorescence. The stained sections were observed with a confocal fluorescence microscope to compare and evaluate the targeting ability of the modified exosomes.
  • ⁇ -SMA ⁇ -Smooth Muscle Actin
  • exosomes were administered to the animal model and sacrificed 24 hours later to extract liver tissue.
  • Liver tissue was fixed in 4% paraformaldehye solution and then made of paraffin blocks and slides with a thickness of 5 ⁇ m. Then, the liver tissue was labeled with ⁇ -SMA (Alexa 594, green) through immunohistochemistry, and the fluorescence of exosomes (Flamma 675, red) accumulated in the liver tissue was measured with a confocal microscope, and the results were analyzed. 8 shows.
  • an animal experiment plan was established for evaluating the therapeutic efficacy of the exosomes surface-modified with vitamin A ligand.
  • Adipose stem cell-derived exosomes or exosomes surface-modified with vitamin A ligands were intravenously administered 1, 2, 3 times at two-day intervals from the day after completing the production of the established animal model of liver fibrosis. After 24 hours of exosome administration, blood was collected and sacrificed, and blood analysis and histological analysis were performed.
  • TAA liver fibrosis model
  • drugs that cause liver fibrosis carbon tetrachloride (CCL 4 ), Thioacetamine (TAA), dimethylnitrosamine (DMN)
  • CCL 4 carbon tetrachloride
  • TAA Thioacetamine
  • DN dimethylnitrosamine
  • a disease model was created by intraperitoneal administration of TAA to C57BL/6 mice for 12 weeks, and the therapeutic effect of liver fibrosis was confirmed by intravenous injection of a composition containing exosomes surface-modified with vitamin A ligand.
  • liver fibrosis was confirmed by observing whether the liver cells were regenerated and fibrous septum was formed through the macroscopic observation and the Trichrome staining result indicating the degree of fibrosis.
  • AST Aspartate aminotransferase
  • AST is an enzyme secreted when liver damage occurs and decreases as liver function returns to normal.
  • the group administered with the exosomes surface-modified with a vitamin A ligand showed improved liver function values within a short period of time (FIG. 10).
  • the exosomes were administered to the animal model prepared in 9 above, and the liver tissue was removed by sacrificing 24 hours later. Liver tissue was fixed in 4% paraformaldehye solution and then made of paraffin blocks and slides with a thickness of 5 ⁇ m. The extracellular matrix of liver tissue was stained by Sirius red staining. It was evaluated based on the distribution of extracellular matrix around blood vessels, septa formation, and bridging between blood vessels, and the results are shown in FIG. 11 . As a result of the experiment, a decrease in septa and bridging was observed in exosomes surface-modified with vitamin A ligand compared to exosomes derived from adipose stem cells (FIG. 11a).
  • the ratio of the stained part (red) in the liver tissue of the exosome administration group 3 times among the animal models prepared in step 9 was quantified using the Image J program.
  • a decrease in the extracellular matrix was clearly observed in the group administered with the exosomes surface-modified with vitamin A ligand compared to the adipose stem cell-derived exosomes (FIG. 11b).
  • hydroxyproline contained in the liver tissue of the exosome administration group 3 times was quantified.
  • an essential amino acid constituting collagen it is possible to show the collagen content in liver tissue.
  • a decrease in hydroxyproline was observed in the group administered with the exosomes surface-modified with vitamin A ligand compared to the adipose stem cell-derived exosomes (FIG. 13).

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Abstract

본 발명은 비타민 A로 표면개질된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 비타민 A로 표면개질된 엑소좀은 줄기세포의 세포증식, 분화, 재생과 관련된 유전자, 단백질, 성장인자 등을 함유하고 있으며 항생제나 혈청, 배양액의 유해 인자들이 포함되지 않은 정제된 성분으로서, 간성상 세포를 특이적으로 표적하는 특성을 지니고 있기 때문에 기존에 사용되던 엑소좀과 비교해 현저한 효과를 가진다.

Description

비타민 A로 표면개질된 엑소좀을 포함하는 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 출원은 2021년 03월 12일 출원된 대한민국출원 제10-2021-0032997호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
본 발명은 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.　
간 섬유화는 만성 염증으로 인한 세포외 기질(extracellular matrix)의 과다한 침착에 의한 것으로서, 이러한 만성 간질환이 지속되는 경우 결국 간내 구조의 변형과 간세포수의 감소로 인해 간경변으로 진행된다. 이러한 만성 간질환은 하나의 독립적인 질환이기보다는 만성 간염에서부터 섬유화를 거쳐 간경변증으로 진행하는 연속적인 질환으로 볼 수 있다. 현재, 여러 가지 간염 및 간경변증에 대하여 약물치료 또는 간이식이 시행되고 있으나, 약물에 대한 치료저항성이나 간이식 공여자의 부족으로 인해 새로운 치료법의 필요성이 대두되고 있다.
한편, 줄기세포를 이용한 간 재생 치료법은 최근 들어 많은 주목을 받고 있는 치료법으로써 주입된 줄기세포가 손상 받은 간에서 기능적 간세포로 분화하여 치료 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 시험관 내에서 줄기세포를 이용한 기능성 간세포 분화는 가능하지만, 동물 모델과 사람에서 이식된 줄기세포로는 간세포 분화의 효율성이 낮다는 문제점이 존재한다. 이외에도 종래의 줄기세포를 이용한 치료의 가장 큰 문제점은 세포의 체내 생착률 및 생존률이 환자에 따라 일정하지 않다는 한계가 있다. 또한, 줄기세포에 의한 면역반응으로 인해 allogenic 이식이 한계를 지니고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 간 섬유증 치료 효율을 극대화하기 위해 간 섬유증의 주요 원인 세포인 간성상 세포를 특이적으로 표적할 수 있는 기술을 개발하고자 연구 노력한 결과, 줄기세포에서 간 섬유증을 완화시키면서 정상세포로의 전환을 위한 다양한 성장인자 및 유효한 단백질 성분을 포함하는 엑소좀을 추출하고, 이를 비타민 A로 표면개질한 결과 간성상 세포를 선택적으로 표적화하고 간 섬유증 치료 효율이 현저하게 증가한다는 사실을 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 비타민 A로 표면개질된 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
더 상세하게는 본 발명의 목적은 다음의 구현예들을 제공하는 데 있다.
구현예 1. 비타민 A로 표면개질된 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물; 비타민 A로 표면개질된 지방줄기세포유래 엑소좀을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간 섬유증 예방 또는 치료 방법; 또는 간 섬유증 예방 또는 치료용 의약품 제조를 위한 비타민 A로 표면개질된 지방줄기세포유래 엑소좀의 응용.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 상기 엑소좀은 공유 결합으로 연결된 비타민 A 모이어티 및 인지질 모이어티를 포함하는 비타민 A 리간드로 표면개질된 것을 특징으로 하는 조성물; 방법; 또는 응용.
구현예 3. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 비타민 A로 표면개질된 엑소좀은 간성상 세포를 선택적으로 표적화하는 것을 특징으로 하는 조성물; 방법; 또는 응용.
구현예 4. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 간성상 세포 내 α-SMA(α-smooth muscle actin)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물; 방법; 또는 응용.
구현예 5. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 간 조직 내 세포외 기질(extracellular matrix)의 침착을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물; 방법; 또는 응용.
구현예 6. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 지방줄기세포는 인간 지방줄기세포인 것을 특징으로 하는, 조성물; 방법; 또는 응용.
구현예 7. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 지방줄기세포는 상기 엑소좀이 투여되는 환자의 자가 지방조직에서 유래한 것을 특징으로 하는 조성물; 방법; 또는 응용.
구현예 8. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 정맥 투여용인 것을 특징으로 하는 조성물; 방법; 또는 응용.
구현예 9. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 비타민 A 리간드는 공유 결합으로 연결된 PEG(Polyethylene glycol) 모이어티를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물; 방법; 또는 응용.
구현예 10. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 비타민 A 리간드는 인지질-PEG-비타민 A 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물; 방법; 또는 응용.
구현예 11. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 비타민 A는 레티놀(retinol),　레티날(retinal),　프로비타민　A　카로티노이드(provitamin　A　carotenoids) 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 조성물; 방법; 또는 응용.
구현예 12.
(a) 비타민 A의 카르복실기를 활성화시키는 단계;
(b) 인지질 화합물과 상기 활성화된 비타민 A의 카르복실기를 커플링하여 비타민 A 리간드를 합성하는 단계; 및
(c) 상기 합성된 비타민 A 리간드로 지방줄기세포유래 엑소좀의 표면을 개질하는 단계
를 포함하는, 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 비타민 A로 표면개질된 지방줄기세포유래 엑소좀을 제조하는 방법.
구현예 13. 구현예 12에 있어서, 단계 (a)는 비타민 A의 카르복실기를 아민 반응성 에스테르로 전환시키는 것에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 하나의 관점은 비타민 A로 표면개질된 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 유효성분인 비타민 A로 표면개질된 엑소좀은 줄기세포의 세포증식, 분화, 재생과 관련된 유전자, 단백질, 성장인자 등을 함유하고 있으며 항생제나 혈청, 배양액의 유해 인자들이 포함되지 않은 정제된 성분으로서, 간성상 세포를 특이적으로 표적하는 특성을 지니고 있기 때문에 기존에 사용되던 엑소좀과 비교해 현저한 효과를 가진다. 이러한 본 발명의 기본 개념의 예시를 도 1에 나타내었다.
본 발명의 유효성분인 엑소좀은 공유 결합으로 연결된 비타민 A 모이어티 및 인지질 모이어티를 포함하는 비타민 A 리간드에 의해 표면 개질될 수 있다.
상기 비타민 A는 레티놀(retinol),　레티날(retinal),　프로비타민　A　카로티노이드(provitamin　A　carotenoids) 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상일 수 있다.
상기, 인지질(phospholipid)은 글리세롤에 지방산과 인산기가 결합되어 있는 화합물을 의미한다. 인지질의 머리 부분은 극성을 띠는데, 지방산이 있는 꼬리 부위는 물과 잘 섞이지 않고 비극성 물질들과 쉽게 섞이는　소수성이고, 인산기가 있는 부위는 물 분자 또는 다른 극성분자들과 쉽게 섞이는　친수성이다. 이러한 인지질은　생체막의 주요 구성 성분이 되므로 중요하며,　신경　조직의　미엘린 수초에 다량 함유되어 있다.
상기 인지질로는 예컨대, 포스포릴에탄올아민(phosphorylethanolamine), DSPE(Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylethanolamine), 세라마이드 포스포릴에탄올 아민(Ceramide phosphorylethanolamine), 포스포 스핑고리피드(Phosphosphingolipids), 포스포릴콜린(phosphorylcholine), 스핑고미엘린(Sphingomyelin), 포스포릴리피드(phosphoryllipid), 세라마이드 포스포릴리피드(Ceramide phosphoryllipid), 디아글리세리드(Diacylglyceride), 글리세로포스포리피드(Glycerophospholipid), 포스파티데이트(phosphatidate), 포스파티딜 에탄올아민(Phosphatidylethanolamine), 포스파티딜 콜린(Phosphatidylcholine), 레시틴(lecithin), 포스파티딜 세린(Phosphatidylserine), 포스포이노시티드(Phosphoinositides), 포스파티딜 이노시톨(Phosphatidylinositol), 포스파티딜 이노시톨 포스페이트(Phosphatidylinositol phosphate), 포스파티딜 이노시톨 비스 포스페이트(Phosphatidylinositol bisphosphate), 포스파티딜 이노시톨 트리스 포스페이트(Phosphatidylinositol trisphosphate) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 비타민 A 리간드는 공유 결합으로 연결된 비타민 A 모이어티 및 인지질 모이어티를 포함함으로 인하여, 간성상 세포를 선택적으로 표적화하는 데 있어서 특히 현저한 효과를 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, TGF-β로 활성화된 간성상 세포 내에 축적되는 엑소좀 입자 개수를 기준으로 표적화률을 평가하는 경우, 본 발명의 비타민 A 리간드로 표면개질된 지방줄기세포유래 엑소좀은, 인지질 없이 비타민 A만으로 표면개질된 지방줄기세포유래 엑소좀과 비교하여, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 3배 높은 세포 내 표적화률을 나타낸다.
상기 비타민 A 리간드는 공유 결합으로 연결된 PEG(Polyethylene glycol) 모이어티를 더 포함할 수도 있다. 인지질의 페길화는 혈액 순환 시간 및 표면 개질화된 엑소좀의 안정성을 더욱 개선시킬 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 비타민 A 리간드는 인지질-PEG-비타민 A 구조를 가질 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 간 섬유증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 간 섬유증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "줄기세포"란, 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서 그 특징은 반복 분열하여 자가 재생(self-renewal)할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 세포를 의미한다. 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견된다. 줄기세포는 분화 가능한 세포의 종류에 따라 수정란이 첫 분열을 시작할 때 형성되는 전능성 줄기세포(totipotent stem cells)와, 이 세포들이 계속 분열해 만들어진 포배 내막에 있는 만능성 줄기세포(pluripotent stem cells), 그리고 성숙한 조직과 기관 속에 존재하는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류된다. 이때, 다능성 줄기세포는, 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포로써 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있다. 이러한 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라고도 한다.
성체 줄기세포로 분류되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 재생의학의 재료로 각광받고 있는 세포로, 골수, 제대혈, 지방조직, 탯줄 등의 조직에서 채취될 수 있으며, 혈액 줄기세포와 달리 지방세포, 골세포, 연골세포, 신경세포, 심근세포 등 다양한 인체 조직을 구성하는 세포로의 분화능을 가진다.
본 발명에서는 인간 지방조직으로부터 분리한 줄기세포를 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 지방줄기세포로는 약학적 조성물이 투여되는 환자의 자가 지방조직에서 유래한 것을 사용할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "엑소좀(exosome)"이란, 혈액, 소변, 및 세포의 배양액을 포함하는 거의 모든 진핵세포액에 존재하는 세포유래 소포(vesicles)이다. 엑소좀은 세포의 다소포체(multivesicular body)가 원형질막에 융합되어 분비되거나 원형질막으로부터 직접적으로 분비되며, 응집, 세포 내 신호전달, 세포 노폐물 관리 등의 과정에서 중요한 특정 기능을 수행한다고 보고되어 왔기 때문에 임상적으로 특정 질환의 바이오마커, 진단, 치료 용도로 주목받고 있다. 본 발명에 있어서, 엑소좀은 인간 지방줄기세포를 배양함으로써 상기 세포로부터 자연적으로 분비된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
지방줄기세포 유래 엑소좀은 간 섬유증 치료를 위한 다양한 인자를 분비하도록 촉진하는 과정에서 발생되는 조성물로 간 섬유증 치료를 위한 유전정보, 단백질, 성장인자가 담지되어 있으며, 세포 유래 물질로서 생체적합성이 좋고 흡수율 또한 뛰어나다. 따라서 현재 사용되고 있는 치료 약품이 유발시킬 수 있는 문제점이나, 최근 연구되고 있는 줄기세포를 이용한 치료에서 발생할 수 있는 줄기세포의 암세포화 또는 allogenic 이식의 한계를 해결할 수 있다.
본 발명의 지방줄기세포유래 엑소좀은 30 내지 400 nm, 더 좁은 범위로는 100 내지 300 nm의 직경을 가지는 것일 수 있다.
한편, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 정맥 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다.
상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 관점은 (a) 비타민 A의 카르복실기를 활성화시키는 단계; (b) 인지질 화합물과 상기 활성화된 비타민 A의 카르복실기를 커플링하여 비타민 A 리간드를 합성하는 단계; 및 (c) 상기 합성된 비타민 A 리간드로 지방줄기세포유래 엑소좀의 표면을 개질하는 단계를 포함하는, 본 발명의 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일 구현예에서, 상기 단계 (a)는 비타민 A의 카르복실기를 아민 반응성 에스테르로 전환시키는 것에 의하여 수행될 수 있다.
이와 같이 제조한 본 발명의 약학적 조성물은 간성상 세포 내 α-SMA(α-smooth muscle actin)의 발현을 효과적으로 억제할 수 있고, 간 조직 내 세포외 기질(extracellular matrix)의 침착을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 혈중 아스파르트산염 아미노기 전달 효소(Aspartate aminotransferase; AST), 혈중 알라닌 아미노기전달효소(Alanine aminotransferase; ALT), 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase; ALP), 총 빌리루빈(Total bilirubin; TP), 또는 LW/BW(Ratio of liver weight to body weight) 수준을 감소시킬 수 있다.
일반적인 지방줄기세포 유래 엑소좀은 간 조직 전체에 무분별하게 축적되는 거동이 있어 효율적인 간 섬유증 치료에 제한이 있는 반면에, 본 발명의 비타민 A로 표면 개질한 지방줄기세포 유래 엑소좀은 간 섬유증의 주요 원인 세포인 간성상 세포를 특이적으로 표적할 수 있다.
도 1은 지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 비타민 A로 표면개질하고, 간성상 세포를 표적하는 섬유증 치료제 조성물의 유효성분으로 사용하는 본 발명의 기본 개념의 예시를 도시한 것이다.
도 2는 (a) 간성상 세포 표적을 위한 비타민A 리간드의 합성 과정 및 (b) Retinoic acid 및 DSPE-PEG2000-amine, DSPE-PEG2000-Vit A의 1H-NMR 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 (a) 엑소좀 표면 개질에 의한 크기 변화 및 (b) 엑소좀 표면 개질에 의한 형태 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 (a) 공초점 현미경을 이용한 엑소좀의 바이오마커(bio marker) 평가 및 (b) 유세포 분석을 이용한 엑소좀의 마커 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 (a) 지방줄기세포 유래 엑소좀과 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀의 세포내 축적(cellular uptake) 평가 및 (b) (a)의 형광 정량 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 (a) 지방줄기세포 유래 엑소좀과 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀의 섬유화 인자 발현 억제 평가 및 (b) (a)의 형광 정량 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 (a) 지방줄기세포 유래 엑소좀과 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀의 생체분포거동 평가 및 (b) (a)의 간 조직 내 실시간 형광 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 (a) 간 조직 내 지방줄기세포 유래 엑소좀과 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀의 분포 평가 및 (b) 엑소좀과 α-SMA의 co-localization 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀의 치료 효능 평가를 위한 동물 실험 계획을 나타낸 것이다.
도 10은 간 섬유증 동물 모델에서의 aspartate aminotransferase (AST) 혈액분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 (a) 간 조직의 조직병리학적 분석 및 (b) 간 조직 냐ㅐ섬유성 면적 분포 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 간 조직 내 콜라겐Ⅰ분포 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 간 조직의 hydroxyproline assay 평가 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 인간지방줄기세포로부터 간 섬유증 치료에 유효한 엑소좀의 추출
인간지방줄기세포유래 엑소좀은 인간지방줄기세포를 배양하는 과정에서 추출하였다. 구체적으로, 인간지방줄기세포를 일반 배양배지(HyClone™, Cat#: SH30919)에서 배양하고 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청 배지(HyClone™, Cat#: SH30243)로 교체하여 24시간 동안 배양한 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 세포배양 상층액은 일차적으로 3,000 xg, 4 ℃에서 20분간 원심분리하는 단계 및 이차적으로 0.22 ㎛ 필터하는 단계를 거쳐 세포 잔해물 및 노폐물을 제거해주었다. 이후, 회수한 상층액을 300kDa 필터를 이용한 접선 흐름 여과(Tangential Flow Filtration, TFF) 시스템을 이용하여 엑소좀을 분리 및 정제하였다. 상층액을 회수한 이후 다시 일반 배양배지를 인간지방줄기세포에 첨가하여 배양하였고, 이러한 과정을 계대 7까지 반복하였다. 이렇게 계대 7까지 증식시키는 과정에서 추출한 엑소좀을 동결건조 제형 조성물로 이용하였다.
2. 종전 방법에 따라 비타민 A로 표면 개질된 지방줄기세포 유래 엑소좀의 제조 및 간성상 세포 표적능 평가
상기 실시예 1에서 얻어진 동결 건조된 엑소좀의 표면을 비타민 A로 개질하고, 간성상 세포의 표적능을 평가하기 위하여, 우선 개질 전 엑소좀을 형광 표지하였다(Flamma 675, red).
그 다음, 종전에 알려진 방법(Sato et al, NATURE BIOTECHNOLOGY, VOLUME 26 NUMBER 4 APRIL 2008, pp. 431-442)에 따라, 형광 표지된 엑소좀의 표면을 비타민 A로 개질하였다. 구체적으로, 반응버퍼인 Diluent C(sigma aldrich)에 상기 형광 표지한 엑소좀을 1.5x109 개/ml의 농도로 희석하였다. VA-커플링된 엑소좀을 준비하기 위해, 비타민 A (레티놀, Sigma)를 엑소좀 현탁액과 혼합하였다. 엑소좀에 부착되지 않은 유리 비타민 A는 마이크로 파티션 시스템(VIVASPIN 2 농축기 30,000 MWCO PES, VIVASCIENCE)을 사용하여 엑소좀 제제로부터 분리하였다. 최종적으로 Amicon® (Sigma aldrich, Ultra-4 Centrifugal Filter Unit)을 통해 4℃에서 2600g로 20 min간 원심분리하여 Vitamin A로 표면 개질된 엑소좀을 획득하였다.
그 다음, 상기 Vitamin A로 표면 개질된 엑소좀과 개질되지 않은 엑소좀을 사용하여 세포내 축적(cellular uptake)을 평가하였다. 구체적으로, TGF-β1으로 활성화된 간성상 세포에 형광 표지된(Flamma 675, red) 지방줄기세포 유래 엑소좀 또는 비타민 A로 표면개질된 엑소좀을 1×107 particles/dish의 농도로 12시간 처리하고, 형광을 정량하였다.
실험 결과, 지방줄기세포 유래 엑소좀의 경우 활성화된 간성상 세포에서 약 2000 a.u.의 형광 강도가 얻어졌고, 비타민 A로 표면 개질된 엑소좀의 경우 활성화된 간성상 세포에서 약 2200 a.u.의 형광 강도가 확인되어 엑소좀이 간성상 세포에 축적되는 것이 확인되었다.
3. 비타민 A 리간드를 이용한 엑소좀의 표면 개질(도 2 및 도 3)
종래 알려진 것과 다른 새로운 방법으로서, 엑소좀 표면을 비타민 A 리간드로 개질하였다.
우선 도 2(a)에 도시된 바와 같이 간성상 세포 표적을 위한 비타민 A 리간드를 합성하였다. 구체적으로, 1ml DMSO에 retinoic acid(RA) 100.0mg를 완전히 녹인 후, EDC·HCl 113.7mg, NHS 76.7mg을 첨가하여 40℃에서 48시간 동안 반응시켜 RA의 카르복실기를 활성화하였다. 그리고 DSPE-PEG2000-amine 836.2mg을 넣고 40℃에서 36시간 동안 반응시켰다(도 2(a) 참조). 반응 종료 후, 투석용 튜브(MWCO = 1kDa)에 담아 이틀 동안 메탄올 : 초순수 = 1:1 용액에서 투석하였다. 그 후, 초순수에서 이틀 동안 추가로 투석을 진행하였다. 상기 사용 또는 제조한 Retinol, DSPE-PEG2000-amine, DSPE-PEG2000-Vit A의 1H-NMR 결과는 도 2(b)에 타내었다.
상기 합성한 개질 moiety(DSPE-PEG-Vitamin A)를 사용한 소수성 삽입 방식으로, 인간지방줄기세포 엑소좀의 표면을 개질하였다. 구체적으로, 먼저 Nano Tracking Ananysis (NTA)를 이용하여 엑소좀의 농도를 측정하고 반응버퍼인 Diluent C(sigma aldrich)에 1.5x109 개/ml의 농도로 희석하였다. 마찬가지로 개질 moiety인 DSPE-PEG-Vitamin A stock (anhydrous ethanol, 1mM)를 1ml의 Diluent C에 최종 농도가 400nM가 되도록 희석하였다. 희석한 엑소좀과 개질 moiety를 섞고 4℃에서 15분간 교반하였다. 이후 PD-10를 통해 미반응된 개질 moiety와 Diluent C를 제거하였다. 최종적으로 Amicon® (Sigma aldrich, Ultra-4 Centrifugal Filter Unit)을 통해 4℃에서 2600g로 20 min간 원심분리하여 Vitamin A로 개질된 엑소좀을 획득하였다.
도 3은 상기 3에서 새로운 방법으로 지방줄기세포 유래 엑소좀의 표면을 비타민 A 리간드로 개질함에 따른 엑소좀 크기 및 형태 변화를 나타낸 것이다. Nanoparticle tracking analysis(NTA) 장비로 개질 전후의 엑소좀의 크기를 확인한 결과, 표면 개질에 의해 엑소좀의 평균 크기가 10nm정도 증가한 것으로 확인되었다(도 3a). 또한, TEM으로 관찰한 결과 표면 개질에 의한 엑소좀 형태 변화는 없는 것으로 확인되었다(도 3b).
4. 엑소좀의 바이오 마커 평가(도 4)
지방줄기세포 유래 엑소좀과 상기 3에서 비타민A로 표면개질한 엑소좀의 바이오 마커를 평가하기 위하여, CD63-capture magnetic bead(6000개)와 100ul의 지방줄기세포 유래 엑소좀 또는 비타민 A 리간드로 표면개질한 엑소좀(5×109개/ml)을 섞어 상온에서 12시간 반응시켰다. 그 후, anti-CD9 항체(1ug) 또는 anti-CD63(1ug) 항체를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응하였다. 그리고 Alexa Fluor 488의 2차 항체로 표지하여 공초점 현미경 및 유세포 분석으로 측정하였다. 공초점 현미경을 이용한 엑소좀의 마커 평가 결과는 도 4(a)에, 유세포 분석을 이용한 엑소좀의 마커 평가 결과는 도 4(b)에 나타내었다.
5. 지방줄기세포 유래 엑소좀과 비타민 A 리간드로 표면 개질된 엑소좀의 간성상 세포 표적능 평가(도 5)
인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC), 간성상 세포(LX-2), 활성화된 간성상 세포에 형광 표지된(Flamma 675, red) 지방줄기세포 유래 엑소좀 또는 상기 3에서 새로운 방법에 따라 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀을 1×107 particles/dish의 농도로 12시간 처리하였다. 본 실험에 사용된 세포는 60시간의 안정화 과정을 거친 후 사용되었으며, 활성화된 간성상 세포의 경우 마지막 48시간 동안 TGF-β1(10ng/ml)으로 48시간 동안 활성화되었다. 형광을 정량한 결과를 도 5에 나타내었다.
실험 결과, 지방줄기세포 유래 엑소좀 대비 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀이 효과적으로 활성화된 간성상 세포에 축적되는 것이 확인되었다. 구체적으로 활성화된 간성상 세포의 경우 지방줄기세포 유래 엑소좀의 경우 약 2000 a.u.의 형광 강도가 얻어졌고, 상기 3에서 비타민 A 리간드로 개질된 엑소좀의 경우 활성화된 간성상 세포에서 약 3500 a.u.의 형광 강도가 얻어져 지방줄기세포 유래 엑소좀 대비 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀이 효과적으로 활성화된 간성상 세포에 축적되는 것이 확인되었다(도 5). 그리하여, 이후 모든 실험에서는 상기 새로운 방법에 따라 비타민 A 리간드로 표면 개질된 엑소좀을 사용하였다.
6. 지방줄기세포 유래 엑소좀과 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀의 섬유화 인자 발현 억제 평가 및 형광 정량(도 6)
α-smooth muscle actin(α-SMA)는 대표적인 간 섬유증의 지표로 활용되며 간성상 세포에 의해 발현된다. 전술한 바와 같이 준비된 간성상 세포 또는 활성화된 간성상 세포에 지방줄기세포 유래 엑소좀 또는 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀을 1×107 particles/dish 또는 1×108 particles/dish의 농도로 24시간 처리하였다. 그 후, α-SMA를 형광표지(Alexa 594)하여 공초점 현미경으로 측정하고 그 결과를 도 6에 나타내었다. 실험 결과, 지방줄기세포 유래 엑소좀 대비 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀을 처리한 군에서 효과적으로 α-SMA(red)의 발현이 억제됨이 확인되었다(도 6).
7. 지방줄기세포 유래 엑소좀과 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀의 생체분포거동 평가(도 7)
소동물 광학영상장비를 통해 형광표지한(Flamma 675) 두 종류의 엑소좀의 생체분포거동을 실시간으로 평가하였다. 간 섬유증 동물 모델에 엑소좀을 1×109 particles/200ul/head의 양으로 꼬리를 통해 정맥 투여하여 체내에 잔류 시간을 평가하였다. 본 실험에서 사용된 동물 모델은 간 독소인 thioacetamide를 12주간 주 3회 250mg/kg의 농도로 복강 주사하여 간 섬유증을 유도하였다. 간 조직 내 실시간 형광 변화를 측정하고, 동물 모델의 간을 ROI(region of interest)로 설정한 후, 해당 영역의 형광 세기를 정량하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. 실험 결과, 엑소좀의 비타민 A 리간드 표면 개질에 의해 생체분포거동이 유의미하게 변하지 않음을 확인할 수 있었다(도 7).
8. 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀의 간성상 세포 표적능 평가(도 8)
형광염색된 엑소좀을 간 섬유증을 유발한 동물모델에 투여하고 간조직 절편에 immunohistochemistry를 시행하여 간성상 세포로의 표적능을 평가하였다. 구체적으로, 개질 전 엑소좀을 Cy5.5-NHS와 200:1의 무게비로 섞어 4시간 4℃에서 교반하며 염색 후 개질단계를 위와 같이 진행하였다. 개질하지 않은 엑소좀 또한 동일한 방법으로 형광염색하였다. whole body biodistribution을 평가하기 위해 처리 후 시간별로 IVIS 장비를 이용하여 형광량을 측정하였다. 마지막 측정 후 안락사하여 주요 장기를 적출하여 4% 중성완충포르말린액으로 고정하고 파라핀으로 포매하여 5 um 두께의 조직절편을 제작하였다. 파라핀 절편은 deparaffination 및 protein retrieval 과정 후 간성상세포 marker인 α-Smooth Muscle Actin (α-SMA)를 타겟하는 antibody로 처리되어 형광염색하였다. 염색된 절편은 공초점 형광현미경으로 관찰하여 개질한 엑소좀의 표적능을 비교평가 하였다.
또한, 동물 모델에 엑소좀을 투여하고 24시간 후 희생하여 간조직을 적출하였다. 간 조직은 4% paraformaldehye 용액에 고정된 후 파라핀 블록으로 제작되어 5μm 두께의 슬라이드로 제작되었다. 그 후 간 조직을 면역 조직 화학(immunohistochemistry)을 통해 α-SMA를 표지(Alexa 594, green)하여 간 조직 내 축적된 엑소좀(Flamma 675, red)의 형광을 공초점 현미경으로 측정하고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 엑소좀과 α-SMA의 co-localization을 평가한 결과, 지방줄기세포 유래 엑소좀이 간 조직 내 무분별하게 축적되는 거동을 보이는 반면 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀이 선택적으로 간성상 세포 내에 축적되었음을 확인하였다(도 8).
9. 질병 동물 모델을 이용한 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀기반 간 섬유증 치료효능 평가(도 9)
도 9에 도시한 바와 같이 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀의 치료 효능 평가를 위한 동물 실험 계획을 정립하였다. 상기 정립된 간 섬유증 동물 모델의 제작을 마친 다음 날부터 이틀 간격으로 지방줄기세포 유래 엑소좀 또는 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀을 1, 2, 3회 정맥 투여하였다. 엑소좀 투여 24시간 후 채혈 및 희생하여 혈액분석과 조직학적 분석을 진행하였다.
동물 모델의 제작은 다음과 같이 수행하였다. 간 섬유증 모델을 만들기 위하여 간에 섬유화를 일으키는 약물 중 (사염화탄소(CCL4), Thioacetamine(TAA), dimethylnitrosamine(DMN)) TAA를 이용하였다. 구체적으로, C57BL/6 mouse에 TAA를 12주간 복강투여 하여 질병모델을 만들고 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀을 포함한 조성물을 정맥 주사하여 간 섬유증 치료효과를 확인하였다. 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀에 의한 치료효과 확인을 위해 엑소좀을 처리한 후 이틀 뒤 혈액을 채취하여 4℃에서 12000 rpm으로 15분 원심분리 후 상층액인 혈청을 취하여 주식회사 켐온에 간기능 검사를 의뢰하였다. 자동혈액분석기(ADVIA2120, SIEMENS, USA)를 이용하여 생화학적 지표인 총단백(Total protein), ALP(Alkaline phosphatase), GPT(glutamic pyruvate transminase) 등을 간수치를 측정하여 간 기능 개선 효과를 확인하였다. 또한, 육안 검사 및 조직 병리학적 검사를 위해 간을 적출하여 10% 중성완충포르말린액에 고정 후 파라핀으로 포매를 거쳐 4 um 두께의 조직절편을 제작한 후 조직학적 소견의 비교를 위해 Hematoxilin-Eosin 염색, Masson's trichrome 염색을 하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 육안적인 관찰과 섬유화정도를 나타내는 Trichrome 염색 결과를 통해 간세포 재생결졀 형성 및 섬유성 격막의 형성 여부를 관찰함으로써, 간 섬유증 치료효과를 확인하였다.
10. 간 섬유증 동물 모델에서의 aspartate aminotransferase (AST) 혈액분석(도 10)
상기 제작한 동물 모델 중 엑소좀 1회 투여군의 혈액을 상온에서 응고시킨 후 원심분리방법으로 혈청을 얻어 분석하고 그 결과를 도 10에 나타내었다. AST는 간에 손상이 일어났을 때 분비되는 효소로 간 기능이 정상으로 돌아옴에 따라 감소한다. 실험 결과, 지방줄기세포 유래 엑소좀 대비 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀을 투여한 군에서 단기간 내에 개선된 간 기능 수치를 보이는 것이 확인되었다(도 10).
11. 간 조직의 조직병리학적 분석(도 11)
상기 9에서 제작한 동물 모델에 엑소좀을 투여하고 24시간 후 희생하여 간 조직을 적출하였다. 간 조직은 4% paraformaldehye 용액에 고정된 후 파라핀 블록으로 제작되어 5μm 두께의 슬라이드로 제작되었다. Sirius red 염색법을 통해 간 조직의 세포외기질을 염색하였다. 혈관 주변의 세포외기질 분포와 septa 형성 및 혈관 간의 브릿징(bridging)을 기준으로 평가하고 그 결과를 도 11에 나타내었다. 실험 결과, 지방줄기세포 유래 엑소좀 대비 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀에서 septa 및 브릿징의 감소가 관찰되었다(도 11a).
또한, 간 조직 내 섬유성 면적 분포를 평가하기 위하여, 상기 9에서 제작한 동물 모델 중 엑소좀 3회 투여군의 간 조직 내 염색된 부분(red)의 비율을 Image J 프로그램으로 정량하였다. 실험 결과, 지방줄기세포 유래 엑소좀 대비 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀을 투여한 군에서 세포외기질의 감소가 뚜렷하게 관찰되었다(도 11b).
12. 간 조직 내 콜라겐Ⅰ(colⅠ) 분포 평가(도 12)
상기 9에서 제작한 동물 모델 중 엑소좀 3회 투여군의 간 조직 내 콜라겐Ⅰ 분포를 면역 조직 화학법(Alexa 594, red)을 통해 평가하였다. 실험 결과, 지방줄기세포 유래 엑소좀 대비 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀을 투여한 군에서 colⅠ의 감소가 뚜렷히 관찰되었다(도 12),
13. 간 조직의 hydroxyproline assay 평가(도 13)
상기 9에서 제작한 동물 모델 중 엑소좀 3회 투여군의 간 조직에 포함된 hydroxyproline을 정량하였다. 콜라겐을 이루는 필수 아미노산인 hydroxyproline을 정량함으로 간 조직 내에 콜라겐 함량을 보여줄 수 있다. 실험 결과, 지방줄기세포 유래 엑소좀 대비 비타민 A 리간드로 표면개질된 엑소좀을 투여한 군에서 hydroxyproline의 감소가 관찰됨이 확인되었다(도 13).

Claims (13)

  1. 비타민 A로 표면개질된 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 공유 결합으로 연결된 비타민 A 모이어티 및 인지질 모이어티를 포함하는 비타민 A 리간드로 표면개질된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비타민 A로 표면개질된 엑소좀은 간성상 세포를 선택적으로 표적화하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 간성상 세포 내 α-SMA(α-smooth muscle actin)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 간 조직 내 세포외 기질(extracellular matrix)의 침착을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 지방줄기세포는 인간 지방줄기세포인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 지방줄기세포는 상기 약학적 조성물이 투여되는 환자의 자가 지방조직에서 유래한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 투여용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 상기 비타민 A 리간드는 공유 결합으로 연결된 PEG(Polyethylene glycol) 모이어티를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비타민 A 리간드는 인지질-PEG-비타민 A 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 비타민 A는 레티놀(retinol),　레티날(retinal),　프로비타민　A　카로티노이드(provitamin　A　carotenoids) 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. (a) 비타민 A의 카르복실기를 활성화시키는 단계;
    (b) 인지질 화합물과 상기 활성화된 비타민 A의 카르복실기를 커플링하여 비타민 A 리간드를 합성하는 단계; 및
    (c) 상기 합성된 비타민 A 리간드로 지방줄기세포유래 엑소좀의 표면을 개질하는 단계
    를 포함하는, 제1항에 따른 약학적 조성물을 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단계 (a)는 비타민 A의 카르복실기를 아민 반응성 에스테르로 전환시키는 것에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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