KR20140102730A - 포유류 태아 폐 세포와 이를 치료용으로 사용하는 방법 - Google Patents

Abstract

포유류 태아 폐 조직으로부터 세포 현탁액의 격리된 모집단을 활성 성분으로 포함하는 약제 조성물(pharmaceutical composition)이 개시된다. 태아 폐 조직은 약 20 내지 약 22주의 임신 범위로부터 선택된 임신 단계에서 인간 폐 기관/조직의 발달 단계에 대응하는 발달 단계에 있다. 상기 약제 조성물을 사용하는 방법이 또한 개시된다.

Description

포유류 태아 폐 세포와 이를 치료용으로 사용하는 방법{MAMMALIAN FETAL PULMONARY CELLS AND THERAPEUTIC USE OF SAME}

본 발명은, 그 일부 실시예에서, 포유류의 배아 폐 세포(embryonic pulmonary cell)에 관한 것이고, 보다 구체적으로는, 치료 용도로 이를 사용하는 방법에 관한 것이지만, 이에 제한되지는 않는다.

호흡기 질병은 세계 보건 기구에 의해 발병률(incidence), 유병률(prevalence), 이환율(morbidity), 사망률(mortality), 및 비용에서 두 번째로 평가된, 사망률과 이환율의 주요 원인이다. 가장 최근에 이용 가능한 요법은 폐 질병 환자의 삶의 질을 약간만 향상시킬 뿐이고, 다양한 폐 병리학에서 진행의 주요 결과인 가스 교환 표면(gas-exchange surface)의 손실을 예방하지 않는다. 그래서, 현재, 말기 폐 질병을 위한 유일한 치료는 손상된 기관의 교체이지만, 많은 환자들이 이식용 기관의 심각한 부족으로 인해 대기 명부에 있으면서 죽어간다.

이전의 연구는 서로 다른 기관의 인간과 돼지 배아 전구체를 이식하기 위한 최적 창(optimal window)을 한정했다. 이식을 위한 이러한 "최적 창"은 다음 세 가지 파라미터인 기형종(teratoma)에 대한 위험의 부족, 성장 조직의 기능적 특성뿐만 아니라, 낮은 면역원성(immunogenicity)으로 한정되었다. 예를 들어, 서로 다른 돼지 배아 전구체 조직의 SCID 쥐 안으로의 이식은 뚜렷한 시간 "창"을 나타내고, 그 시간 "창" 동안 조직은 이식에 적합한 특성을 나타내고, 신장과 간은 28일에서 최적의 특성을 나타내는 반면, 폐 "창"은 돼지의 임신 연령 중 56일에서 훨씬 더 늦게 발생하는 것으로 나타났다 [Eventov-Friedman S. 등, Proc Nat Acad of Sciences. (2005) 102(8): 2928]. 돼지 췌장 전구체 조직을 사용한 연구는 42일에서 그 최적을 암시했고, 그 시간에 이 조직은 면역억제 쥐와, 보다 최근에는, 비인간 영장류에서 스트렙토조톡신-유발 과혈당증(streptozotocin-induced hyperglycemia)을 고치기 위한 현저한 능력을 입증한다. 또한, 최근 연구는, 특정 임신 시점에 채취된 돼지 배아 비장 조직의 이식이 FVIII 결핍 쥐의 혈우병(hemophilia)을 치료할 수 있음을 보여주었다.

과거 십 년 동안, 줄기 세포에 기초한 치료의 잠재적인 치유 역할이 광범위하게 조사되었다. 최근의 발견은, 골수와 같은 성체 조직이나 간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)를 포함하는, 제대혈, 양수 또는 태반으로부터 유도된 초기 선조(early progenitor), 내피 선조(endothelial progenitor) 또는 순환 섬유세포(circulating fibrocyte), 및 이와 다른 여러 모집단이 기도(airway) 및 폐포 상피 세포(alveolar epithelial cell)로서, 또는 혈관 내피(vascular endothelial) 또는 간질 폐 세포(interstitial lung cell)로서 구조적으로 이식 및 분화될 수 있고, 손상되거나 질병에 걸린 폐의 수복과 재생에 사용될 수 있음을 암시한다 [Baber SR 등, American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. (2007) 292(2): H1120; Weiss DJ. Pulm Pharmacol Ther. (2008) 21(4):588-94; Weiss DJ 등, Proceedings of the American thoracic society: Am Thoracic Soc; (2008) p.637; Sueblinvong V and Weiss DJ. Translational Research. (2010) 156(3): 188-205]. 그러나, 유효 상피 전환분화(epithelial transdifferentiation)의 부족, 40개가 넘는 서로 다른 세포 유형으로 이루어진 폐의 복잡한 구조, 및 폐에서 이식 세포의 낮은 이식 속도(서로 다른 실험 모델에서)는 중대한 도전을 나타낸다.

추가 배경 기술은 다음을 포함한다:

PCT 공개 번호 WO 2006/038211은 포유류 피험자에게 췌장, 림프/조혈 또는 폐 기관 및/또는 조직 기능성을 제공하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 발달하는 포유류 췌장, 림프/조혈 또는 폐 기관/조직 이식편(graft)을 각각 피험자에게 이식하는 단계를 포함한다. WO 2006/038211에 기재되어 있는 폐 이식편은 약 42일 내지 약 80일의 임신 범위로부터 선택된 임신 단계에서 돼지의 폐 기관/조직의 이식편에 본질적으로 대응하는 발달 단계에 있다.

PCT 공개 번호 WO 2004/078022는 병리학적 기관 또는 조직 생리학 또는 형태학과 연관된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은, 피험자에게서 면역 반응을 자극 또는 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 분자를 실질적으로 발현하거나 제공하지 않는 것으로 선택된 포유류 기관 또는 조직 이식편(예를 들어, 신장, 췌장, 간, 심장 또는 림프 기관 또는 조직 이식편)을 피험자에게 이식하여 실행된다.

본 발명의 일부 실시예의 양상에 따라, 포유류의 태아 폐 조직으로부터 세포 현탁액의 격리된 모집단을 활성 성분으로 포함하는 약제 조성물(pharmaceutical composition)이 제공되어 있고, 태아 폐 조직은 약 20주 내지 약 22주의 임신 범위로부터 선택된 임신 단계에서 인간의 폐 기관/조직의 발달 단계에 대응하는 발달 단계에 있다.

본 발명의 일부 실시예의 양상에 따라, 필요로 하는 피험자에게서 상피, 간엽 및/또는 내피 조직을 재생하는 방법이 제공되어 있고, 이 방법은, 피험자에게 본 발명의 일부 실시예의 약제 조성물 치료 유효량을 투여하여, 상피, 간엽 및/또는 내피 조직을 재생하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일부 실시예의 양상에 따라, 상피, 간엽 및/또는 내피 조직의 재생이 이를 필요로 하는 피험자에게서 유익한 질병 또는 병을 치료하는 방법이 제공되어 있고, 이 방법은, 피험자에게 본 발명의 일부 실시예의 약제 조성물 치료 유효량을 투여하여, 상피, 간엽 및/또는 내피 조직의 재생이 유익한 질병 또는 병을 치료하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일부 실시예의 양상에 따라, 필요로 하는 피험자에게서 폐질환 또는 손상을 치료하는 방법이 제공되어 있고, 이 방법은, 피험자에게 본 발명의 일부 실시예의 약제 조성물 치료 유효량을 투여하여, 폐질환 또는 손상을 치료하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일부 실시예의 양상에 따라, 상피, 간엽 및/또는 내피 조직의 재생이 이를 필요로 하는 피험자에게서 유익한 질병 또는 병을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 일부 실시예의 약제 조성물이 제공되어 있다.

본 발명의 일부 실시예의 양상에 따라, 필요로 하는 피험자에게서 폐질환 또는 손상을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 일부 실시예의 약제 조성물이 제공되어 있다.

본 발명의 일부 실시예의 양상에 따라, 포유류의 태아 폐 조직으로부터 격리된 복수의 세포 모집단을 포함하는 세포 은행이 제공되어 있고, 태아 폐 조직은 약 20주 내지 약 22주의 임신 범위로부터 선택된 임신 단계에서 인간의 폐 기관/조직의 발달 단계에 본질적으로 대응하는 발달 단계에 있고, 복수의 세포 모집단은 동종 세포 은행(allogeneic cell bank)을 형성하기 위해 HLA 형으로 되었고, 각각 개별적으로 개별 용기 안에 배치된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 임신 단계는 20 내지 21주의 임신이다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 임신 단계는 21 내지 22주의 임신이다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 포유류의 태아 폐 조직은 인간의 조직이다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포 현탁액의 격리된 모집단은 세포의 이종 모집단을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포 현탁액의 격리된 모집단은 선조 세포(progenitor cell)를 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 선조 세포는 상피 선조 세포, 간엽 선조 세포, 및 내피 선조 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 시토케라틴(cytokeratin) 5+(CK5+) 표지 발현(marker expression)을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 시토케라틴 5+(CK5+) 및 시토케라틴 14+(CK14+) 표지 발현을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 c-Kit+ CD45- CD34- CD31- CD326- CD271- 표지 발현을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 c-Kit+ CD34+ CD31+ 표지 발현을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 c-Kit+ CD34+ CD326+ 표지 발현을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 CD34+ CD31+ CD14+ CD45+ 표지 발현을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 CD34+ CD31+ CD45- CD105+ 표지 발현을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 네스틴+ 및/또는 칼시토닌 유전자 관련 단백질+(CGRP+) 표지 발현을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 알파 평활근 액틴+(알파-SMA+) 및/또는 비멘틴(Vimentin)+ 표지 발현을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 구조/기능적 폐 조직을 재생시킬 수 있다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 구조/기능적 폐 조직은 키메릭 폐(chimeric lung)의 발생을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 키메릭 폐는 폐포(alveolar), 기관지 및/또는 세(細)기관지(bronchiolar) 구조, 및/또는 혈관 구조(vascular structure)의 형성을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 구조/기능적 폐 조직은 계면활성제를 합성하는 능력 및/또는 이온을 운반하는 능력을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 상피, 간엽 및/또는 내피 조직을 재생시킬 수 있다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포는 CFTR 발현 상피 세포이다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 상피 조직은, 폐 조직, 위장관 조직, 생식 기관 조직, 요로 조직, 신장 조직, 피부 조직, 심장 조직, 허혈성 조직(ischemic tissue), 및 뇌 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 간엽 조직은 림프 조직, 순환계 조직, 및 결합 조직(connective tissue)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 내피 조직은 림프 조직과 순환계 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 방법은, 투여 전에 피험자를 아치사(sublethal), 치사(lethal) 또는 과치사(supralethal) 컨디셔닝 프로토콜 하에 컨디셔닝하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 투여는 정맥 경로에 의해 실행된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 투여는, 기관내(intratracheal), 기관지내(intrabronchial), 폐포내(intraalveolar), 정맥내, 복강내(intraperitoneal), 비강내(intranasal), 피하(subcutaneous), 골수내(intramedullary), 척추강내(intrathecal), 심실내(intraventricular), 심장내(intracardiac), 근육내, 장막내(intraserosal), 점막내, 점막 관통(transmucosal), 경비(transnasal), 직장, 및 장내로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로에 의해 실행된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 방법은, 이식 전, 이식과 동시에, 또는 이식 후에 면역억제 식이요법(regimen)으로 피험자를 치료하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 조성물은, 기관내, 기관지내, 폐포내, 정맥내, 복강내, 비강내, 피하, 골수내, 척추강내, 심실내, 심장내, 근육내, 장막내, 점막내, 점막 관통, 경비, 직장, 및 장내로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 통해 투여하도록 제제화된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 약제 조성물은 아치사, 치사 또는 과치사 컨디셔닝 프로토콜을 더 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 아치사, 치사 또는 과치사 컨디셔닝 프로토콜은, 전신 조사(irradiation)(TBI), 부분적인 신체 조사, 골수 소멸 컨디셔닝(myeloablative conditioning), 동시 자극적 차단(co-stimulatory blockade), 화학 치료제 및/또는 항체 면역요법(antibody immunotherapy)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 컨디셔닝은 나프탈렌 처리를 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 컨디셔닝은 전신 조사(TBI)를 더 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 컨디셔닝은 전신 조사(TBI)를 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, TBI는 1 ~ 7.5 Gy 범위 내의 단일 또는 분할 조사 선량을 포함한다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 피험자는 인간 피험자이다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 포유류 태아 폐 조직은 인간의 조직이다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포 현탁액의 격리된 모집단은 피험자와 비동계이다(non-syngeneic).

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포 현탁액의 격리된 모집단은 피험자와 동종(allogeneic)이다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 동종 세포는 피험자와 동일한 HLA, 부분적으로 동일한 HLA, 및 동일하지 않은 HLA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포 현탁액의 격리된 모집단은 피험자와 이종(xenogeneic)이다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 폐질환 또는 손상은, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 기종(emphysema), 석면증(asbestosis), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)(COPD), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 특발성 폐 섬유증, 폐 고혈압(pulmonary hypertension), 폐암, 유육종증(sarcoidosis), 급성 폐 손상(acute lung injury)(성인 호흡 곤란 증후군), 미숙아 호흡 곤란 증후군, 미숙아 만성 폐질환(기관지 폐 형성 장애), 계면활성제 단백질 B 결핍(surfactant protein B deficiency), 선천성 횡격막 탈장(congenital diaphragmatic hernia), 폐포 단백질증(pulmonary alveolar proteinosis), 폐 형성부전(pulmonary hypoplasia), 및 폐 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 상피, 간엽 및/또는 내피 조직의 재생이 유익한 질병 또는 병은, 폐질환, 질병 또는 손상; 신장 질환, 질병 또는 손상; 간 질환, 질병 또는 손상; 심장 질환, 질병 또는 손상; 위장관 질환, 질병 또는 손상; 피부 질환, 질병 또는 손상; 뇌 장애, 질병 또는 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 상피 조직의 재생이 유익한 질병 또는 병은, 만성 궤양, 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)(IBD), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 알츠하이머병, 상처 치유 결함(wound healing defects), 암, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 폐 고혈압, 폐암, 유육종증, 급성 폐 손상(성인 호흡 곤란 증후군), 미숙아 호흡 곤란 증후군, 미숙아 만성 폐질환(기관지 폐 형성 장애), 계면활성제 단백질 B 결핍, 선천성 횡격막 탈장, 폐포 단백질증, 폐 형성부전, 폐 손상, 및 각막 변성증(corneal degeneration)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 간엽 조직의 재생이 유익한 질병 또는 병은, 심장 질병 또는 병, 당뇨병, 난청, 크론병, 자가면역 질환, 백혈병, 암, 겸상 적혈구 질환(sickle cell disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 및 대사 장애(metabolic disorder)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 내피 조직의 재생이 유익한 질병 또는 병은, 혈관 질병(vascular disease), 국소 빈혈(ischemia), 겸상 적혈구 질환, 심혈관 질환, 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 당뇨병, 및 자가면역 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시예에 따라, 세포 은행은 복수의 세포 모집단의 HLA 유형 세포에 관한 정보를 포함하는 카탈로그를 더 포함한다.

다르게 정의되지 않으면, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및/과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법과 재료가 본 발명의 실시예의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 재료가 아래에 기술된다. 충돌의 경우, 정의를 포함하는 특허 명세서가 통제할 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 예는 예만 들기 위한 것이고 반드시 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.

본 발명의 일부 실시예는 첨부된 도면을 참조하여 예를 통해서만 본 명세서에 기술된다. 이제 상세 도면을 특정하게 참조하여, 상세 내용은 예를 통해 또한 본 발명의 실시예를 예시적으로 토의할 목적으로 도시되어 있음을 강조한다. 이 점에 관해서, 도면과 함께 기재된 설명은 본 발명의 실시예가 실행될 수 있는 방법을 이 기술 분야의 당업자에게 분명하게 한다.
도 1A ~ R은, 서로 다른 임신 시점에 채취된 인간 배아 전구체 조직의 성장과 발달을 도시한다. 인간 배아 조직은 NOD-SCID 쥐의 신피막(renal capsule) 아래에 이식되었다. 이식조직(implant)은 거시적으로 또는 면역조직학적 스테이닝에 의해 8주 후 평가되었다. 도 1A는 서로 다른 임신 시점 이식조직으로부터 이식조직의 거시적 크기에 관한 요약으로, 이식조직의 장축(L)과 단축(W) 및 높이(H)를 기준으로 한 평균(±SD) 크기, 이식 후 6~8주(도시된 데이터는 6개의 독립 실험의 평균임)이고; 도 1B는 임신 20주(w)에 채취된 이식조직의 대표적인 거시적 외관을 예시하는 사진이며; 도 1C ~ F는, 20주(w) 조직으로부터 유도된 이식조직의 미시적인 헤마톡실린과 에오신 염색(H&E) 검사의 사진으로, 폐포관(alveolar duct), 폐포(alveoli), 기관(氣管)(trachea){섬모 상피(ciliated epithelium), 근육층, 및 연골로 덮인}, 및 폐포/상피 단층(alveolar/epithelial monolayer)의 정상적인 외관을 도시하고; 도 1G ~ H는 계면활성제 단백질 C(sp-C)(적색)과 시토케라틴-18(CK-18)(녹색)에 대한 면역 염색을 예시하는 사진이며 {저 배율(도 1G)과 고 배율(도 1H)}; 도 1I는 CFTR-낭포성 섬유증 막관통 조절기(CFTR-cystic fibrosis transmembrane regulator)(적색)와 CK-18(녹색)에 대한 면역 염색을 예시하는 사진이고; 도 1J ~ R은 15주(w)(도 1J ~ L), 18주(w)(도 1P ~ R), 및 24주(w)(도 1M ~ O) 조직으로부터 각각 유도된 이식조직의 전형적인 H&E 염색을 예시하는 사진이다. 화살표는 낭포(cyst)를 나타낸다. 도 1M에 낭포의 거시적인 영상이 예시되어 있다.
도 2A ~ O는 인간 배아 폐에서 초기 선조와 그 적소(niche)의 확인을 도시한다. 도 2A ~ D는 서로 다른 임신 시점에서 인간 배아 폐 조직의 H&E 염색을 예시하는 사진으로, 임의의 폐포 구조가 없는 기관지와 세(細)기관지 구조를 보여준다; 도 2E ~ F는 넓은 기도에서 CK5+ 세포의 높은 발현과 넓은 기관지에서 CK5 및 CK14의 공동 발현을 나타내는 면역 조직학적 염색을 예시하는 사진이다. 화살표와 화살표 머리는 각각 높고 낮은 CK5 발현을 갖는 영역을 나타낸다. 기관지 및 발달하는 폐포 구조에서 CK5+ 세포는, 네스틴+ 및 CGRP+ 세포와의 접촉(도 2G)뿐만 아니라, 신경필라멘트(neurofilament)(NF)에 대한 염색(도 2H)으로 예시된 풍부한 신경분포(innervation)와 연관되어 있다; 도 2I는 알파 평활근 액틴 양성 세포를 예시하는 사진이고; 도 2J는 CK5⁺ 선조에 매우 인접하게 존재하는 비멘틴⁺ 간엽 세포를 예시하는 사진이며; 도 2K ~ N은, CK5 발현 레벨의 차이를 증명하는 15주(도 2K), 17주(도 2L), 20주(도 2M), 및 22주(도 2N)의 인간 임신을 포함하는 서로 다른 시점에서 CK5에 대한 염색(적색)을 예시하는 사진이고; 도 2O는 CK5+ 선조로 점유된 조직 영역의 정량적인 형태 분석을 나타내는 그래프로, 20 ~ 22주에서 상당히 (t-테스트) 더 높은 레벨을 보여준다 (하나의 다이아몬드는 유효하지 않은 p-값을 나타내고, 두 개의 다이아몬드는 p<0.002를 나타낸다).
도 2P ~ Z는 서로 다른 임신 시점에 채취된 인간 배아 폐 조직에서 초기 비조혈 선조의 FACS 분석을 도시한다. 도 2P ~ Q는 항-CD45 및 항-CD34를 이용한 이중 염색을 보여주는 20주(w) 폐 세포의 대표적인 FACS 분석을 예시한다. CD45-CD34^high, CD45-CD34^intermediate, 및 CD45- CD34^neg 세포를 포함해서, 비조혈 CD45- 세포 내에서 세 개의 부분 모집단(subpopulation)이 도시된다. 도 2R ~ T는 각각의 부분 모집단의 레벨을 나타내는 항-CD117(c-kit) 및 항-CD271(간엽 분화 표지)을 사용한 이중 염색을 예시하고; 도 2U ~ Z는 서로 다른 인간 배아 폐 조직에서 CD45- CD34^neg 모집단 내에 단일 양성 CD117+ 세포의 백분율을 예시한다.
도 3A ~ C는 21주에 채취된 폐 조직을 이식하기 전에 CK5, ULEX 렉틴, 및 CD117을 이용한 삼중 염색을 도시한다. 중앙 기도(도 3A)와 주 기관지(main bronchus)(도 3B)는 넓은 혈관으로 둘러싸인, 넓은 기도에서 CK5의 높은 발현을 보여준다. 희귀 CD117⁺ 세포는 혈관주변 공간(perivascular space)에 존재한다. 더 좁은 기도 영역에서(도 3C), 더 좁은 혈관과 가까이 접한 CK5의 더 낮은 발현이 관찰되는 반면, 여러 CD117⁺ 세포는 이러한 혈관 내에 존재한다 (핑크; ULEX 렉틴 및 CD117에 대해 이중 양성).
도 4A ~ K는 21주에 채취된 폐 조직을 이식하기 전에 E-카데린(cadherin), CD34, 및 CD117을 이용한 삼중 염색을 도시한다. 도 4A는 CD34에 대한 단일 염색을 도시하고; 도 4B는 CD117에 대한 단일 염색을 도시하며; 도 4C는 E-카데린 염색과의 합침(merge)을 도시한다. 넓은 기관지와 발달하는 폐포 구조를 포함하는 두 개의 인접 영역의 파노라마 영상이 도시된다. 발달하는 폐포 구조의 영역에서 대부분의 CD34⁺ 세포는 CD117을 공동 발현하는 반면(도 4D ~ G), 넓은 기도 영역에서는, 희귀한 단일 양성 CD117⁺ 세포가 혈관에 아주 인접해서 보일 수 있다 (도 4H ~ K).
도 5A ~ D는, 20주(w) 인간 폐에서 세 개의 인접한 영역의 파노라마 영상을 도시하는 사진으로서, 혈관(청색, 도 5B)과 알파-SMA 양성 세포(녹색, 도 5C)[이 두 개는 넓은 기관지와 발달 폐포에 있음(청색, 도 5B)]로 둘러싸인 서로 다른 발현 세기를 갖는 CK5 양성 영역(적색, 도 5A)의 존재를 보여주고, 개별 적소(niche)를 암시한다 (모두 3개의 구획을 겹친 것은 도 5D에 도시되어 있다). Bar = 50㎛.
도 6A ~ L은 두 개의 서로 다른 성체 인간 폐 시료의 다색(polychromatic) FACS 분석을 도시한다. 성체 인간 폐 조직의 다색 FACS 분석은 인간 배아 폐 조직에 평행하게 수행되었다. 단일 세포 현탁액은 조직의 콜라게나제(collagenase) 및 디스파제(dispase)를 이용한 효소 분해 후 염색되었고, CD34(조혈 및 내피 선조에 특정한), CD45(조혈 세포), CD31(내피 세포에 대한 표지), CD117(초기 선조를 확인하기 위한 c-KIT), CD271(NGFR- 간엽 줄기 세포 표지), 및 CD326(EPCAM- 상피 분화 표지) 특정 항체 또는 이와 동등한 동기준 대조군(isotype control)에 의해 염색되었다. 양쪽 시료에서, CD34⁺ 및 CD34^- 모집단이 확인되었다 (도 6A, 6D, 6G, 및 6J). 성체와 배아 폐 조직 사이에 두드러진 차이가 관찰되었다. CD34⁺ 세포의 훨씬 더 낮은 레벨이 성체 폐에서 확인되었다. c-kit⁺ 모집단의 존재 시험시, 매우 작은 CD34⁺CD117⁺ 및 CD34^-CD117⁺ 모집단이 확인되었고 (도 6B, 6E, 6H, 및 6K); 대부분의 CD34⁺CD117⁺ 세포는 CD31 표지에 대해 양성이었고 매우 적은 비율만이 CD31 표지에 대해 음성이었으며 (도 6C, 6F, 6I, 및 6L), 대부분의 CD34^-CD117⁺ 모집단은 CD31 및 CD326에 대해 음성으로 밝혀졌다 (도 6F 및 6L).
도 7A ~ I는, CD45-CD34+ 및 CD45-CD34- 부분 모집단을 증명하는(도 7A), 20주(w) HEL의 FACS 분석을 도시한다. CD34 양성(도 7B)과 음성(도 7C) 세포 부분 모집단 내에서 CD117⁺ 염색. 대부분의 CD34+CD117+ 부분 모집단은 CD31 또는 CD326 표지에 대해 양성이다 (도 7D, 7F ~ G). 대부분의 CD34^-CD117⁺ 세포는 CD31 및 CD326 표지에 대해 음성이다 (도 7E, 7H ~ I). 도 7F ~ I에서, 대표적인 히스토그램이 증명되고, 적색 선은 CD31과 CD326 표지의 동기준 대조군을 표시하는 반면, 청색 선은 CD34+CD31+ 부분 모집단을 나타내고 녹색 선은 CD34+CD326+ 부분 모집단을 도시한다 (도 7F ~ G); 도 7H ~ I에서, 청색 선은 CD34-CD31+ 부분 모집단을 표시하고 녹색 선은 CD34-CD326+ 부분 모집단을 표시한다. 이러한 발견은, 면역 조직 화학(immunohistochemistry)으로 증명된 바와 같이, 두 개의 서로 다른 CD117⁺ 모집단의 존재를 확실하게 한다.
도 8A ~ D는, ulix-혈관 표지(청색), CK5(녹색), 및 CD117(적색)에 대한 15주(w)(도 8A ~ B)와 17주(w)(도 8C ~ D) HEL의 면역 조직학적 염색을 도시하는데, 이중 CD117 발현 패턴을 보여준다. 여러 단일 CD117⁺ 세포는 넓은 기도와 혈관에 근접한 것으로 밝혀지지만, 이들 대부분은 발달 폐포 구조 부근의 혈관 내에 공동 편재되어 있다.
도 9A ~ D는 초기 및 후기 내피 선조(EPC)의 존재를 위한 20주(w) 인간 폐의 분석을 도시한다. 이 도면은 두 개의 소수 개별 CD34+CD31+ 부분 모집단의 존재를 확인한다 (도 9B). 첫 번째 것은 CD14 및 CD45에 대한 양성 염색에 의해 확인되는 반면(도 9C), 두 번째 부분 모집단은 CD45-CD105+이다 (도 9D).
도 10A ~ E는 동계 쥐(syngeneic mice)의 신피막 아래의 이식 전후 배아 조직의 특징을 도시한다. 도 10A ~ C는, E16 쥐 배아 이식조직(n=5)을 따라 얻어진 두드러진 성장 및 분화와 비교해서(도 10C ~ E), SCID 쥐(n=7)의 신피막 아래의 이식 후 12주에 E14(도 10A) 및 E17(도 10B) 폐 조직의 약한 성장을 증명하는 대표적인 H&E 염색을 예시하는 사진이고; 도 10D ~ E는, 넓은 기도(큰 화살표) 및 폐포 구조(작은 화살표)를 증명하는 H&E 염색과, E16 쥐 태아 폐의 이식조직에서 시토케라틴 염색을 예시하는 사진이다.
도 10F는 쥐와 인간 폐 발달에서 평행한 단계의 개략도를 도시한다. 이식을 위한 "최적 창"은 발달의 세관 단계(canalicular stage) 내에 있다.
도 11A ~ Y는 이식 전 E16 쥐 배아 폐에서 폐 선조의 특징을 도시한다. 도 11A는, 폐포 구조의 부재와 미숙 구조를 증명하는 E16 배아 폐의 H&E 염색을 예시하는 사진이고; 도 11B는, 인간 배아 폐와 유사한 E16 쥐 조직에서 CK-5 양성 세포(청색)가 넓은 기도에서 더 높은 발현을 가짐을 예시하는 사진이다. CGRP(적색)와, 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase)(TH, 녹색)에 의해 양성으로 염색된 여러 신경 상피 소체(neuroepithelial bodies)는 전체 시료 내에서 발견되고, 적소에 국한된다. 도 11C는, CCSP-양성 세포가 넓은 기도 영역에서 발견되고, 또한 네스틴-양성 세포에 풍부하며, 알파-SMA 양성 세포에 의해 둘러싸여 있음을(도 11D, 백색 화살표) 예시하는 사진으로, 줄기 세포 적소(stem cell niche)를 암시하고; 도 11E ~ G는, 콜라게나제(collagenase)와 디스파제(dispase)(n은 각각 10, 10, 12, 및 10이고, 값은 두 개의 서로 다른 실험으로부터 평균 ±SD를 나타낸다)로 처리한 후, E13, E14, E15, 및 E16 폐-유도 단일 세포 현탁액에서 CD45^-CD31^-CD326⁺ CD24⁺CD49f⁺CD104⁺의 대표적인 다색 FACS 분석이다. E15-16 폐에서 이러한 세포 모집단의 훨씬 더 큰 풍부함이 증명되고 (p<0.007); 도 11Y는, 스튜던트 t-시험(Student's t-test)으로 계산된 통계적 유의성(statistical significance)을 나타내는 CD45^-CD31^-CD326⁺ CD24⁺CD49f⁺CD104⁺ 세포 레벨의 요약이다 (하나의 다이아몬드는 p<0.037을 나타내고, 두 개의 다이아몬드는 p<0.007을 나타내며, 세포 게이팅 전략이 아래의 예 부분에 기술되어 있다).
도 12A ~ F는, 배아 쥐 폐에서 줄기 세포 적소에서의 그 발현과 유사한, 네스틴과 CGRP의 존재를 증명하는(도 12A ~ B), 성체 C57Bl 폐의 면역 조직학적 염색을 도시하는 사진이다 (도 12A - 더 낮은 배율 - bar = 50㎛, 도 12B - 더 높은 배율 - bar = 20㎛). (도 12A)에서 상자는 (도 12B)에 도시된 확대의 위치를 나타내고; 도 12C ~ F는, 알파-SMA(녹색, 도 12C), CGRP(적색, 도 12D), 및 E-카데린(알파-SMA 및 CGRP와의 청색 겹침, 도 12E)에 대한 성체 C57Bl 폐의 삼중 염색을 예시하는 도면이며, bar = 50㎛; 도 12F는 도 12E에 표시된 정사각형의 확대 영역을 예시한다, bar = 20㎛.
도 13A ~ D는, 서로 다른 컨디셔닝 식이요법(regimen) 후, 이식된 GFP⁺ 세포의 서로 다른 개수의 병소(foci)를 입증하는 낮은 파워 배율 하에서 키메릭 폐(chimeric lung)의 형광 현미경 검사를 도시한다. 도 13A ~ C는, 6 Gy TBI(도 13A), NA 유일(도 13B), 및 NA + 6 GY TBI(도 13C)로 처리된 동물의 키메릭 폐의 대표적인 영상의 사진이고; 도 13D는, 서로 다른 컨디셔닝 식이요법에 이어, ㎣당 이식된 세포(engrafted cell)의 GFP⁺ 패치의 정량 형태적 분석이다 (각각의 그룹에서 n=10). 3개의 독립된 실험의 결과가 제공된다.
도 14A ~ L은 E16 세포의 주입 전후 CCSP⁺ 세포의 염색을 도시하는 사진이다. 도 14A는 처리되지 않은 대조군 쥐의 넓은 기도의 내강(lumen)을 예시하고; 도 14B는, 나프탈렌과 6 Gy TBI로 컨디셔닝한 1일 후 실험 동물의 폐를 도시하는데, CCSP+ 세포의 벗겨짐(peeling)을 보여주고; 도 14C는, E16 세포 주입(infusion) 30일 후 나프탈렌과 6 Gy TBI로 컨디셔닝된 동물의 폐를 도시하는데, V-E 카데린에 대한 염색으로 표시된 바와 같이, 혈관 형성된(vascularized) 기관지 내강에서 이식된 GFP+ 세포(녹색)를 갖는 상피층의 두드러진 재생을 보여주며; 도 14D ~ L은, CFTR에 대한 염색으로 표시된 바와 같이(도 14J ~ L), 이식 세포(도 14D ~ F)가 상피층으로 통합되고, CCSP⁺ 세포(적색)를 재생하며, 계면활성제를 생성할 수 있고(도 14G ~ I), 이온 운반 전위를 나타냄을 도시한다.
도 15A ~ C는, 이식된 폐에서 키메리즘 레벨(chimerism level)을 보여주는 2-광자 현미경 검사법(photon microscopy)을 도시하는 사진이다. 이식 후 6주(도 15A ~ B) 및 16주(도 15C)에 이식된 쥐의 대표적인 2-광자 현미경 검사법 폐 영상 {비표적 양자점(non-targeted Quantum dot)으로 혈관을 공동 염색하지 않은 영상(도 15A)과, 공동 염색한 영상(적색)(도 15B)}.
도 16A ~ L은 이식 후 16주에 키메릭 폐의 면역 조직학적 특징을 도시하는 사진이다. 도 16A ~ D는, 흉터(scarring) 또는 섬유증(fibrosis)의 표시 없이, 이식된 폐의 혈관 및 상피 구획에서 GFP⁺ 세포의 합체를 증명하는, 항-GFP 항체(녹색), 항-CD31 항체(적색), 및 항-판시토케라틴(pancytokeratin) 항체(청색)로 염색된 키메릭 폐의 대표적인 영상이고; 도 16E ~ H는, 타입 I 폐포세포(alveocyte)의 가스 교환 표면 안으로 이식된 조직이 합체되는 것을 보여주는, 항-GFP(녹색)와 항 AQP-5 항체(적색)로 염색된 키메릭 폐의 대표적인 영상이며; 도 16I ~ L은 계면활성제 합성에 이식 세포의 타입 II 폐포세포 참여를 증명하는, 항-GFP(녹색), 항-CD31(적색), 및 항-sp-C 항체(청색)로 염색된 키메릭 폐의 영상이다.
도 17A ~ E는, 2-광자 현미경 검사법으로 분석된 대조군 비이식 C57Bl 폐의 외관 {bar = 90㎛ (대조군 폐, 도 17A)} 또는 항-GFP(녹색), 항-시토케라틴(청색), 및 항-CD31 항체를 이용한 키메릭 폐의 삼중 염색을 도시하는 사진으로, 저 배율에서, 흉터 또는 섬유증의 표시 없이, 폐의 상피와 혈관 구획 모두에서 키메리즘(chimerism), 및 구조에서 완전 합체를 증명한다, bar = 200㎛ (도 17B ~ E). 녹색 형광 채널에서, GFP+ 키메릭 병소는 점선으로 표시된다 (도 17B). 적색 및 청색 채널에서, 동일한 키메릭 영역은 또한 점선으로 표시되는데, 혈관(도 17C)과 상피(도 17D) 구획 모두에서 수용자로부터 제공자로의 매끄러운 전이를 증명하고, 모든 층의 겹침은 도 17E에 도시된다.
도 18A ~ I는, 이식 후 서로 다른 시점에서 쥐 폐 안으로 인간 유도 폐 세포의 이식과 합체를 도시하는 사진이다. 도 18A ~ C는, 이식 후 6주에 쥐 폐에서의 키메리즘을 예시하는데, 저 배율로, 쥐 MHC(적색)에 대한 염색 및 MNF-116(녹색)에 대해 양성인 인간 조직을 도시하고; 도 18D ~ F는, 이식 후 6주에 쥐 폐에서의 키메리즘을 예시하는데, 고 배율로, 쥐 MHC(적색)에 대한 염색 및 MNF-116(녹색)에 대해 양성인 인간 조직을 도시하며; 도 18G ~ I는 도 18D ~ F에서와 같이 염색된 추가 필드를 예시한다.
도 19A ~ F는, 이식 후 7주에 이식된 쥐의 폐 기관지에서 전형적인 키메리즘을 도시하는 사진이다. 도 19A와 19D는, 항-MNF(상피 표지), 항-인간 비멘틴 9{기질 세포(stromal cell)를 대표하는}, 및 데이라이트 488(녹색)로 라벨 표시된 쥐 항-인간 CD31(내피 세포 표지)을 포함하는 쥐 항-인간 항체의 칵테일로 선택적으로 염색된 인간 배아 세포에서 시작되는 인간 세포를 예시하고; 도 19B와 19E는, 알렉사-플라워(Alexa-fluor) 546(적색)으로 라벨 표시된 반데리아 렉틴(Banderia lectin)으로 염색된 쥐 폐에서 쥐 기원(origin)의 세포를 예시한다. 반데리아 렉틴은 쥐 상피 및 내피 세포 상에 발현된 a-Gal에 결합하는 것으로 알려져 있다. 상부 패널은 저 배율 하의 키메릭 필드를 도시하고 (도 19C), 하부 패널은 고 배율 하의 동일한 영역을 도시한다 (도 19F).
도 20A ~ F는 이식 후 7주에 이식된 쥐의 폐 폐포에서 전형적인 키메리즘을 도시하는 사진이다. 도 20A와 20D는, 항-MNF(상피 표지), 항-인간 비멘틴 9(기질 세포를 대표하는), 및 데이라이트 488(녹색)로 라벨 표시된 쥐 항-인간 CD31(내피 세포 표지)을 포함하는 쥐 항-인간 항체의 칵테일로 선택적으로 염색된 인간 배아 세포에서 시작되는 인간 세포를 예시하고; 도 20B와 20E는, 알렉사-플라워(Alexa-fluor) 546(적색)으로 라벨 표시된 반데리아 렉틴으로 염색된 쥐 폐에서 쥐 기원의 세포를 예시한다. 반데리아 렉틴은 쥐 상피 및 내피 세포 상에 발현되어 있지만, 그 인간 상대에는 발현되어 있지 않은 a-Gal에 결합하는 것으로 알려져 있다. 상부 패널은 저 배율 하의 키메릭 필드를 도시하고 (도 20C), 하부 패널은 고 배율 하의 동일한 영역을 도시한다 (도 20F).
도 21A ~ C는, 인간 세포가 폐 유조직(lung parenchyma) 안으로 합체되는 것을 도시하는 사진이다. 도 21A는, 상술한 바와 같이 항-MNF117, 항-V9, 항-CD31을 포함하는 항-인간 항체의 혼합물로 염색되고(녹색), 쥐와 인간 시토케라틴 모두를 염색시키는 토끼 항-시토케라틴 항체로 염색된(적색)(도 21B) 인간 세포를 예시한다. 양쪽 색의 합침(merging)은 폐 유조직 내에서 인간 세포를 증명한다 (도 21C).
도 22A ~ C는, 인간 세포가 폐 가스 교환 표면 안으로 합체되는 것을 도시하는 사진이다. 인간 세포는, 상술한 바와 같이 항-MNF117, 항-V9, 및 항-CD31을 포함하는 항-인간 항체의 혼합물로 염색되고(녹색)(도 22A), 쥐와 인간 AQP-5 모두를 염색시키는 염소 항-AQP-5로 염색되었다(적색)(도 22B). 양쪽 색의 합침은 폐 가스 교환 표면 내에서 인간 세포를 증명한다 (도 22C).
도 23A-F는, 키메릭 쥐의 폐포 내에서 이식된 인간 폐 세포가 계면활성제의 생산에 참여하는 것을 도시하는 사진이다. 인간 세포는, 상술한 바와 같이 항-MNF117, 항-V9, 항-CD31을 포함하는 항-인간 항체의 혼합물로 염색되고(녹색)(도 23A와 23D), 쥐와 인간 계면활성제 단백질 C 모두를 염색시키는 토끼 항-SPC 항체로 염색되었다(적색)(도 23B). 양쪽 색의 합침은 계면활성제의 생산에 이식된 인간 조직의 참여를 증명한다 (도 23C). 하부 패널(도 23D ~ F)은 (도 23C)에 표시된 정사각형 영역의 염색을 고 배율로 도시한다.
도 24A ~ H는, NOD-SCID 쥐의 폐에서 CMTMR로 염색된 20주(w) 인간 폐 유도 단일 세포 현탁액의 이식을 도시하는 사진이고, bar = 500㎛ (도 24A); GFP⁺ 패치는 동계 이식 모델(syngeneic transplantation model)에서 이식된 쥐 배아 폐 세포로부터 생기는 폐 세포를 나타내며, bar = 1mm (도 24B); 도 24C ~ E는, MNF116에 양성이고 쥐 MHC에 음성인 인간 배아 폐 조직의 쥐 항-인간 시토케라틴 MNF 116 항체(녹색, 도 24C)와 시궁쥐(rat) 항-쥐(anti-mouse) MHC(적색, 도 24D)를 이용한 대조군 염색을 예시하고 (둘의 겹침은 도 24E에 도시된다); 도 24F ~ H는, MNF116에 대한 음성 염색과 쥐 MHC에 대한 양성 염색을 증명하는, 항-인간 MNF116 항-쥐 MHC 항체를 이용한 쥐 폐 세포의 대조군 염색을 예시한다 (bar = 50㎛).
도 25A ~ D는, 기형종(teratoma)의 증거를 보이지 않는 E16 쥐 배아 폐 조직이 이식된 쥐의 장기간 추적을 도시하는 사진이다. 도 25A는 종양의 부재와 매끄러운 경계를 보에는 이식 일 년 후 이식된 폐의 거시적 외관을 예시하고; 도 25B ~ C는, 저 배율(도 25B)과 고 배율(도 25C) 하에서 이식된 폐의 정상 형태학(normal morphology)을 보여주는 H&E 염색을 예시하며; 도 25D는, 실험 폐의 정상 방사선학 외관을 보여주는 대표적인 이식 동물의 생체내 폐 CT 영상의 관상면 영상(coronal view)을 예시한다.

본 발명은, 그 일부 실시예에서, 포유류 배아 폐 세포에 관한 것이고, 보다 구체적으로, 전적으로는 아니지만, 치료 용도를 위해 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 원리와 작동은 도면 및 첨부된 설명을 참고로 보다 잘 이해될 수 있다.

본 발명의 적어도 하나의 실시예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 그 용도에 있어서 다음 설명에 개시되거나 예에 의해 예시된 상세 설명에 반드시 제한되지는 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시예일 수 있거나 여러 방법으로 실행되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 어법과 용어는 설명을 위한 것이고 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.

이전의 연구는, 신장, 간, 췌장, 폐, 및 심장을 포함하는, 서로 다른 기관의 인간과 돼지 배아 조직을 이식하기 위한 최적 "창(window)"을 정의했다. 그래서, 예를 들어, 폐 '창'은 돼지 임신 나이 42일 내지 80일에 생기는 것으로 나타났다 [PCT 공개 번호 WO 2006/038211; Eventov-Friedman S. 등, Proc Nat Acad of Sciences. (2005) 102(8): 2928]. 추가 연구는, 골수와 같은 성체 조직이나 간엽 줄기 세포를 포함하는, 제대혈, 양수 또는 태반으로부터 유도된 초기 선조, 내피 선조 또는 순환 섬유세포, 및 이와 다른 여러 모집단이 기도 및 폐포 상피 세포로서, 또는 혈관 내피 또는 간질 폐 세포로서 구조적으로 이식 및 분화될 수 있고, 손상되거나 질병에 걸린 폐의 수복과 재생에 사용될 수 있음을 암시한다

본 발명을 실행으로 한정하면서, 본 발명자는 20 ~ 22주의 인간 임신 연령의 '창'으로부터 얻어지고, 손상/질병 폐의 회복을 위해 사용될 수 있는 다수의 폐 선조 세포를 포함하는 배아 폐 조직의 특이 세포 모집단을 확인하였다. 놀랍게도, 조직 구조를 유지하지 않는 이러한 세포 모집단의 현탁액은 상피, 간엽, 및 내피 폐 조직을 재생하기 위해 사용될 수 있다.

아래에 나타나고 다음에 오는 예 부분에 나타난 바와 같이, 본 발명자는, 처음으로, 투여시 폐 조직을 재생하고 폐 기능성을 다시 찾기 위해, 격리된 세포 모집단 현탁액(즉, 20 ~ 22주의 인간 임신에서)(다음에 오는 예 부분에서, 예 1 참조)이 사용될 수 있음을 설명하였다.

그래서, 본 발명자는, 20 ~ 22주의 인간 임신의 격리된 세포 모집단 및 15 ~ 16일의 임신에서 한정된 쥐 배아 폐 조직의 이와 유사한 세관(canalicular) '창'(다음에 오는 예 부분에서, 예 1 참조)이, 더 초기 또는 후기 임신 시점에 채취된 조직(다음에 오는 예 부분에서, 예 1 참조)과 비교해서, 가장 높은 레벨의 추정 폐 전구체(상피, 내피, 및 간엽 선조 세포를 포함하는)를 나타냄을 보여주었다. 또한, 이 임신 창의 조직으로부터 얻어진 단일 세포 현탁액의 투여(예를 들어, 정맥 투여)가 두드러진 폐 회복을 이루었다. 구체적으로, 폐 전구 세포가 복귀하고 쥐의 손상된 폐에서 분화 및 통합되어서 새로운 상피 세포와 새로운 맥관 구조(vasculature)의 형성을 포함하는 전체 호흡 단위를 형성한다 (다음에 오는 예 부분에서 예 2 참조). 또한, 이러한 과정은, 아치사(sub-lethal) 전신 조사(TBI)를 이용하거나 이용하지 않고, 나프탈렌 처리를 사용하여 수용자 쥐를 추가 컨디셔닝하면 현저하게 향상되어, 손상된 폐의 서로 다른 세포 계보(cell lineage)에서 실질적이고 내구성이 있는 키메리즘에 이르게 한다 (다음에 오는 예 부분에서 예 2 참조). 함께 더해져서, 이러한 결과는, 폐 질병과 손상을 포함하는 상피, 간엽, 및 내피 질환을 치료하기 위해, 20 ~ 22주 임신에서 채취된 인간 배아 폐 전구체 조직의 단일 세포 현탁액의 사용을 실증한다.

그래서, 본 발명의 한 가지 양상에 따라, 포유류 태아 폐 조직으로부터 세포 현탁액의 격리된 모집단을 활성 성분으로 포함하는 약제 조성물(pharmaceutical composition)이 제공되고, 태아 폐 조직은 약 20 내지 약 22주의 임신 범위로부터 선택된 임신 단계에서 인간 폐 기관/조직의 발달 단계에 대응하는 발달 단계에 있다.

본 명세서에 사용된 "세포 현탁액의 격리된 모집단"이라는 문구는, 그 본래 환경(예를 들어, 인체)으로부터 분리되고 생존력(viability)을 유지하면서 조직으로부터 추출되지만 조직 구조(즉, 혈관이 형성되지 않은 조직 구조)를 유지하지 않고 고형 지지체에 부착되지 않은 세포를 나타낸다.

용도에 따라, 방법은, 동계 또는 비동계 세포(피험자에 대해)를 포함한 세포 현탁액의 격리된 모집단을 사용하여 실행될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "동계(syngeneic)" 세포라는 용어는, 피험자 또는 본질적으로 피험자의 모든 림프구(lymphocyte)와 본질적으로 유전학적으로 동일한 세포를 가리킨다. 동계 세포의 예는, 피험자(또는 이 기술에서 '자가조직'으로도 불리는)로부터, 피험자의 클론으로부터, 또는 피험자의 동일 쌍둥이로부터 유도된 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "비동계(non-syngeneic)" 세포라는 용어는, 동종 세포(allogeneic cell) 또는 이종 세포(xenogeneic cell)와 같이, 피험자 또는 본질적으로 피험자의 모든 림프구와 본질적으로 유전학적으로 동일하지 않은 세포를 나타낸다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "동종"이라는 용어는, 피험자와 동일한 종(species)이지만, 피험자와 실질적으로 클론성이 아닌 제공자의 폐 조직으로부터 유도된 세포를 나타낸다. 전형적으로, 동일한 종의 이계 교배된(outbred), 비접합성(non-zygotic) 쌍둥이 포유류는 서로 동종이다. 동종 세포는 피험자에 대해서 HLA 동일하거나, 부분적으로 HLA 동일하거나 HLA 동일하지 않은 것으로 {즉, 하나 이상의 개별 HLA 결정기(determinant)를 나타내는} 평가될 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "이종"이라는 용어는, 피험자의 림프구 중 상당한 비율의 종에 대해 다른 종의 항원(antigen)을 실질적으로 발현하는 세포를 나타낸다. 전형적으로, 서로 다른 종의 이계 교배된 포유류는 서로 이종이다.

본 발명은, 아래에서 추가로 상세히 기술된 바와 같이, 이종 세포가 여러 종으로부터 유도되는 것으로 예견한다.

이종 기원(예를 들어, 돼지 기원)의 세포 또는 조직은, 돼지 내생 레트로바이러스(porcine endogenous retroviruses)와 같이 동물원성 감염증(zoonoses)이 없는 것으로 알려져 있는 공급원으로부터 얻어진 것이 바람직하다. 이와 유사하게, 인간 유도 세포 또는 조직은 실질적으로 병원균이 없는(pathogen-free) 공급원으로부터 얻어진 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 피험자는 인간이고 세포의 격리된 모집단은 인간 기원으로부터이다 (예를 들어, 인간 태아).

용도 및 이용 가능한 공급원에 따라, 본 발명의 세포는 순수하거나 유전자 조작될 수 있다. 이러한 결정은 이 분야의 일반적인 기술 중 하나의 능력 내에 있다.

비동계 세포는 면역 반응을 유발하기 쉽기 때문에, 피험자에게 투여시 비동계 세포의 거부 가능성을 줄이기 위해 여러 접근 방식이 개발되었다. 이러한 방식은, 이식 전에 수용자 면역 체계를 억제하거나 비-자가조직 세포(non-autologous cell)를 면역격리, 반투과성 막(immunoisolating, semipermeable membranes)에 캡슐화하는 것을 포함한다. 대안적으로, 세포는 형질전환 동물(transgenic animal)(예를 들어, 돼지)에서 발달한 것과 같이, 이종 표면 항원(xenogenic surface antigen)을 발현하지 않는 사용일 수 있다.

본 명세서에 사용된 "폐 조직"이라는 문구는 폐 조직 또는 기관을 나타낸다. 본 발명의 폐 조직은 전체 또는 부분 기관이나 조직일 수 있다. 그래서, 본 발명의 폐 조직은 우측 폐, 좌측 폐, 또는 이 모두를 포함할 수 있다. 본 발명의 폐 조직은 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 다섯 개의 엽(lobe)을 포함할 수 있다 (우측 또는 좌측 폐 중 어느 하나로부터). 또한, 본 발명의 폐 조직은 하나 이상의 폐 분절(lung segment) 또는 폐 소엽(lung lobule)을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 폐 조직은 하나 임의 개수의 기관지와 세기관지{예를 들어, 기관지 수상구조(bronchial tree)}를 포함할 수 있고 임의 개수의 폐포 또는 폐포 주머니(alveolar sacs)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 폐 조직은, 약 20 내지 약 21일의 임신, 약 20.5 내지 약 21.5일의 임신, 약 20 내지 약 22일의 임신, 약 20.5 내지 약 22.5일의 임신, 약 21 내지 약 22일의 임신, 약 21.5 내지 약 22.5일의 임신의 임신 단계에서 인간 폐 기관/조직의 발달 단계에 대응하는 발달 단계에 있다.

본 발명의 특정 실시예에 따라, 폐 조직은, 약 20 내지 약 22일의 임신의 임신 단계에서 인간 폐 기관/조직의 발달 단계에 대응하는 발달 단계에 있다.

본 발명의 다른 특정 실시예에 따라, 폐 조직은, 약 21 내지 약 22일의 임신의 임신 단계에서 인간 폐 기관/조직의 발달 단계에 대응하는 발달 단계에 있다.

본 발명의 다른 특정 실시예에 따라, 폐 조직은, 약 20 내지 약 21일의 임신의 임신 단계에서 인간 폐 기관/조직의 발달 단계에 대응하는 발달 단계에 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 폐 조직은 포유류 생물로부터 얻어진다.

그래서, 본 발명의 폐 조직은 임의의 포유류로부터 유도될 수 있다. 폐 조직을 위해 적절한 종은, 임신 단계와 분화 단계의 상관관계에 대해서 광범위하게 특징이 기술된 주요 사육 동물 또는 가축과, 영장류를 포함한다. 이러한 동물은, 돼지(porcine){예를 들어, 피그(pig)}, 소속 동물(bovine){예를 들어, 암소(cow)}, 말과 동물(equine){예를 들어, 말(horse)}, 양(ovine)(예를 들어, 염소, 양), 고양잇과(feline){예를 들어, 집고양이(Felis domestica)}, 개속 동물(canine)(예를 들어, 개(Canis domestica)}, 설치류(rodent)(예를 들어, 쥐, 시궁쥐, 토끼, 기니 피그, 게르빌, 햄스터), 및 영장류(예를 들어, 침팬지, 붉은털 원숭이, 짧은 꼬리 원숭이, 명주 원숭이)를 포함한다.

특정 실시예에 따라, 폐 조직은 인간으로부터 유도된다.

특정 실시예에 따라, 폐 조직은 인간이 아닌 생물로부터 유도된다.

현재 교시된 바와 같이, 인간 유도 폐 조직의 발달 단계에 본질적으로 대응하는 발달 단계에 있는 폐 조직을 얻기 위해 여러 방법이 사용될 수 있다. 이러한 폐 조직을 얻는 것은 이러한 임신 단계(즉, 인간의 20 ~ 22주의 임신에 대응하는)에서 발달 태아로부터, 예를 들어, 외과 수술을 통해, 폐 조직을 채취하여 실행될 수 있다. 생물의 임신 단계는 생물을 발생시키는 난모 세포(oocyte)의 수정 후에 지나간 시간 기간인 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다.

대안적으로, 원하는 발달 단계에서 폐 조직은 세포, 기관/조직의 생체외 배양으로 얻어질 수 있다. 세포, 조직 또는 기관의 이러한 제어 생체외 분화는, 예를 들어, 원하는 계통(lineage)의 세포/조직/기관을 함유하는 배양을 만들기 위해 배아 줄기 세포 라인의 배양을 사용하여, 기계적으로 수행된다. 예를 들어, 폐 계통을 생성하기 위해서는, 예를 들어, Otto WR., 1997. Int J Exp Pathol. 78:291-310을 참조한다.

다음 표는, 본질적으로 대응하는 발달 단계에 있는 폐 조직을 제공할 수 있는 인간과 돼지 폐 조직의 임신 단계의 하나의 예를 제공한다:

돼지와 인간의 대응하는 임신 단계

돼지 폐 조직의 임신 단계(일)	인간 폐 조직의 임신 단계(일*)
18	44
20	49
22	54
23	56-57
25	61-62
26	63
28	68-69
31	75
38	92
42	102
46	112
49	119
56	136
62	151
72	175
80	195
88	214

돼지 폐 조직의 발달 단계에 본질적으로 대응하는 발달 단계에 있는 주어진 종에 속하는 폐 조직의 임신 단계(일)는 다음 식에 따라 계산될 수 있다: [돼지 폐 조직의 임신 단계(일)] / [돼지의 임신 기간(일)] × [주어진 종의 폐 조직의 임신 단계(일)]. 이와 유사하게, 인간 폐 조직의 발달 단계에 본질적으로 대응하는 발달 단계에 있는 주어진 종에 속하는 폐 조직의 임신 단계(일)는 다음 식에 따라 계산될 수 있다: [인간 폐 조직의 임신 단계(일)] / [인간의 임신 기간(일)] × [주어진 종의 폐 조직의 임신 단계(일)]. 돼지의 임신 단계는 약 115일이고 인간의 임신 단계는 약 280일이다.

^*주 계산을 위해 숫자를 7로 나눈다.

태아 폐 조직이 얻어진 후, 본 발명은 이로부터 폐의 격리된 모집단의 발생을 추가로 고려한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "단일 세포 현탁액"은, 집합체(aggregate)에서 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000 세포 이하의 단일 세포 또는 세포 집합체를 포함하는 태아 폐 단일 세포 현탁액을 나타낸다.

본 발명의 단일 세포 현탁액은 임의의 기계적 또는 화학적 (예를 들어, 효소에 의한) 수단으로 얻어질 수 있다. 세포 클러스터를 분해하여 일차 조직, 배양의 부착 세포, 및 집합체로부터 단일 세포 현탁액을 형성하기 위한 여러 가지 방법, 예를 들어, 물리력{세포 스크레이퍼(cell scraper), 구멍이 좁은 피펫을 통한 배산(trituration), 미세 바늘 흡기(aspiration), 소용돌이 분해(vortex disaggregation), 및 미세한 나일론 또는 스테인리스 메시를 통한 가압 여과와 같은 기계적인 분해}, 효소{트립신, 콜라게나제, 아큐타제(Acutase) 등과 같은 효소 분해} 또는 이 둘의 조합이 존재한다.

그래서, 예를 들어, 태아 폐 조직을 격리된 세포로 효소 분해하는 것은 조직을 타입 IV 콜라게나제(미국, 뉴저지, 레이크우드, 워싱턴 바이오케미컬 코포레이션) 및/또는 디스파제(미국, 뉴욕, 그랜드 아일랜드, 인비트로겐 코포레이션 프로덕츠)와 같은 효소를 거치게 하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 폐 조직은, 약 1시간 동안 37℃에서 예를 들어, 콜라게나제, 디스파제, 및 CaCl₂의 존재시 조직을 면도날로 미세하게 썰어서 효소 분해될 수 있다. 방법은, 본질적으로 다음에 오는 예 부분의 "일반 재료와 실험 방법" 하에 기술된 것과 같이, 예를 들어, 필터를 통한 순차 여과(예를 들어, 70- 및 40-㎛ 필터)에 의해, 생성된 세포 현탁액으로부터 비특이적 부스러기를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 태아 폐 조직을 격리된 세포로 기계 분해하는 것은 조직을 미리 결정된 크기로 분쇄하도록 제작된 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 장치는 스웨덴의 셀아티스 고테보르그(CellArtis Goteborg)에서 얻을 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 기계적인 분해는 도립 현미경(inverted microscope) 아래에서 조직/세포를 관찰하면서, 27g 바늘과 같은 바늘(아일랜드, 드로그헤다, BD 마이크로랜스)을 사용하여 수동으로 수행될 수 있다.

태아 폐 조직의 효소 또는 기계 분해에 이어서, 분해된 태아 폐 세포는 200㎕ 길슨 피펫 팁을 사용하여 (예를 들어, 세포 아래 위로 피펫팅하여) 작은 덩어리(clump)로 추가 분쇄된다.

본 발명에 따라, 인간 태아 폐 세포의 단일 세포 현탁액은 생존 세포(viable cell)를 포함한다. 세포 생존력은 이 기술 분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어, 세포 생존력 분석(예를 들어, 프로메가로부터 이용 가능한 멀티톡스 멀티플렉스 어세이), 유동 세포 분석법(flow cytometry), 및 트립판 블루(Trypan blue) 등을 사용하여 감시될 수 있다.

전형적으로, 태아 폐 세포의 격리된 모집단은 이식을 위해 즉시 사용된다. 그러나, 세포가 이식 전 예를 들어, 1 ~ 12시간 동안 현탁액에 유지되어야 하는 경우에, 세포는 그 생존력을 지지할 수 있는 배지(culture medium)에서 배양될 수 있다. 이러한 배지는, 염, 광물질, 비타민, 아미노산, 핵산, 시토킨과 같은 단백질, 성장 인자, 및 호르몬과 같은 물질의 조합을 포함하는 수성 배지일 수 있고, 이들 물질은 모두 태아 폐 세포의 격리된 모집단을 생존 가능 상태로 유지하는데 필요하다. 예를 들어, 본 발명의 이러한 양상에 따른 배지는, 필요한 첨가제가 보충된, Ko-DMEM (미국, 뉴욕, 그랜드 아일랜드, 깁코-인비트로겐 코포레이션 프로덕츠), DMEM/F12(이스라엘, 베이트 헤멕, 바이오로지컬 인더스트리즈), Mab ADCB 매질(미국, 유타, 하이클론) 또는 DMEM/F12(이스라엘, 베이트 헤멕, 바이오로지컬 인더스트리즈)와 같은 합성 조직 배지일 수 있다. 본 발명의 배지에 첨가된 포함된 모든 성분은 조직 배양 등급으로 실질적으로 순수한 것이 바람직하다.

태아 폐 조직으로부터 격리된 세포는 세포의 불균질 모집단을 포함할 수 있다.

일 실시예에 따라, 세포 현탁액의 격리된 모집단은 선조 세포를 포함한다. 선조 세포는, 예를 들어, 상피 선조 세포, 간엽 선조 세포, 조혈 선조 세포 및/또는 내피 선조 세포를 포함할 수 있다.

일 실시예에 따라, 세포는 시토케라틴 5+(CK5+) 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 시토케라틴 5+(CK5+) 및 시토케라틴 14+(CK14+) 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 c-Kit+ CD45- CD34- 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 c-Kit+ CD45- CD34- CD31- CD326- CD271- 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 c-Kit+ CD34+ 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 c-Kit+ CD34+ CD31+ 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 c-Kit+ CD34+ CD326+ 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 CD34+ CD31+ CD14+ CD45+ 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 CD34+ CD31+ CD45- CD105+ 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 네스틴+ 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 칼시토닌 유전자 관련 단백질+ (CGRP+) 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 알파 평활근 액틴+ (알파-SMA+) 표지 발현을 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포는 비멘틴+ 표지 발현을 포함한다.

특정 실시예에 따라, 상술된 세포 모집단 각각은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 정화일 수 있다.

특정 세포 유형의 정화는, 이 기술 분야의 당업자에게 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 상술한 세포 표지(예를 들어, CK5, CK14, c-Kit, CD31, CD34, CD45, CD105, CD271, CD326, 등) 중 임의의 것을 인식하는 특정 항체를 사용하는 친화성에 기초한 정화{예를 들어, MACS 비즈(beads), FACS 분류기(sorter) 및/또는 캡처 ELISA 라벨 표시의 사용에 의한 것과 같은}에 의해 실행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 세포 현탁액의 격리된 모집단은 태아 폐 세포의 격리된 모집단의 정화되지 않은 혼합물을 포함한다.

본 발명의 다른 실시예에 따라, 세포 현탁액의 격리된 모집단은 태아 폐 세포의 세포 유형 특정 모집단을 포함한다 (앞에서 더 상세히 나타난 바와 같이). 이러한 세포를 격리하는 것은, 이 기술 분야의 당업자에게 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 친화성에 기초한 정화(예를 들어, 상술한 바와 같이, MACS 비즈, FACS 분류기 및/또는 캡처 ELISA 라벨 표시의 사용에 의한 것과 같은) 또는 원치 않는 세포를 이를 타깃으로 하는 특정 항체로 제거(예를 들어, 사멸)하여 실행될 수 있다.

세포 현탁액의 격리된 모집단 내의 세포는, 키메릭 폐의 생성을 포함하는, 구조/기능적 폐 조직을 재생할 수 있는 것으로 평가될 것이다. 키메릭 폐는 폐포, 기관지 및/또는 세기관지 구조, 및/또는 혈관 구조를 포함한다. 또한, 구조/기능적 폐 조직은, 특정 세포 염색, 및/또는 이온을 운반하는 능력(예를 들어, CFTR-낭포성 섬유증 막관통 조절기에 대한 염색으로 표시된 바와 같이)에 의해 감지될 수 있는, 계면활성제[예를 들어, 클라라 세포 분비 단백질(clara cell secretory protein)(CCSP), 아쿠아포린(aquaporin)-5(AQP-5), 및 계면활성제 단백질 C(sp-C)]를 합성하는 능력을 포함한다. 세포 현탁액의 격리된 모집단 내의 세포는, 상피, 간엽 및/또는 내피 조직(예를 들어, 이러한 모든 성분을 포함하는 완전한 키메릭 폐 조직의 형성으로 나타난 바와 같은, 상피, 간엽 및/또는 내피 조직)을 추가로 재생할 수 있다.

그래서, 태아 폐 조직으로부터 격리된 세포의 사용은, 폐 조직을 포함해서 상피, 간엽 및/또는 내피 조직을 재생하기 위한 필요성이 있는 상황에서 특히 유리하다.

그래서, 본 발명의 다른 양상에 따라, 필요로 하는 피험자에게서 상피, 간엽 및/또는 내피 조직을 재생하는 방법이 제공되어 있고, 이 방법은, 피험자에게, 본 발명의 일부 실시예의 약제 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 양상에 따라, 필요로 하는 피험자에게서 상피, 간엽 및/또는 내피 조직의 재생이 유익한 질병 또는 병을 치료하는 방법이 제공되어 있고, 이 방법은, 피험자에게, 본 발명의 일부 실시예의 약제 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 양상에 따라, 필요로 하는 피험자에게서 폐질환 또는 손상을 치료하는 방법이 제공되어 있고, 이 방법은, 피험자에게, 본 발명의 일부 실시예의 약제 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "상피 조직"이라는 용어는, 포유류 신체 전체에서 구조의 표면 또는 구멍(cavity) 중 임의의 것을 정렬시키는 조직을 나타낸다. 예시적인 상피 조직은, 폐 조직, 위장관 조직, 생식 기관 조직, 요로 조직, 신장 조직, 피부 조직, 허혈성 조직, 심장 조직, 내피 조직, 순환 조직, 및 뇌 조직을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "간엽 조직"이라는 용어는, 대부분 중배엽(mesoderm)으로부터 유도된 포유류 신체의 결합 조직을 나타낸다. 예시적인 간엽 조직은, 신체의 결합 조직, 혈관, 및 림프관을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "간엽 조직"이라는 용어는, 혈관과 림프관의 내부 표면을 정렬시키는 얇은 세포층을 나타낸다. 예시적인 내피 조직은, 림프 조직과 순환계 조직(예를 들어, 혈관)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "조직을 재생하는"이라는 용어는, 기능성 조직이 형성되도록 하는 (즉, 특정 영역에서 순수한 조직으로 작용하는 조직) 상피, 간엽 또는 내피 조직의 재구성을 나타낸다. 그래서, 본 발명의 일부 실시예에서, 재생은 상피, 간엽 또는 내피 조직에서 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 증가를 나타낸다.

이 기술 분야의 당업자에게 알려진 임의의 방법은, 예를 들어, X-선, 초음파, CT, MRI, 상피 조직{예를 들어, 클라라 세포 분비 단백질(CCSP), 아쿠아포린-5, 및 계면활성제 단백질 C 발현을 위한 염색에 의해}, 간엽 조직(예를 들어, 비멘틴⁺ 발현을 위한 염색에 의해) 또는 내피 조직(예를 들어, CD31 발현을 위한 염색에 의해)의 조직 샘플의 조직학적 염색을 사용함으로써 상피 조직(예를 들어, 폐 조직), 간엽 조직(예를 들어, 결합 조직) 또는 내피 조직(예를 들어, 혈관)의 재생을 평가하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "피험자(subject)" 또는 "필요로 하는 피험자(subject in need thereof)"라는 용어는, 질병, 질환 또는 손상으로 인한 상피, 간엽 또는 내피 조직 손상 또는 결핍을 겪거나 걸리기 쉬운 포유류, 바람직하게는 임의 연령의 남성 또는 여성인 인간을 나타낸다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료(treating)"라는 용어는, 병의 진행을 방해하는, 병의 진행을 실질적으로 억제하거나 늦추거나 또는 역전시키는, 병의 임상적 또는 미적 증상을 실질적으로 개선하거나 또는 병의 임상적 또는 미적 증상의 출현을 실질적으로 막는 것을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "상피, 간엽 및/또는 내피 조직의 재생이 유익한 질병 또는 병"이라는 용어는, 상피, 간엽 및/또는 내피 조직의 손실 또는 결핍을 수반하는, 임의의 질병, 질환, 병, 또는 임의의 병리학적 또는 원하지 않은 병, 상태, 또는 증후군, 또는 임의의 물리적, 형태학적 또는 생리학적 이상을 나타낸다. 전형적으로, 이러한 질병 또는 병은, 폐질환, 질병 또는 손상; 신장 질환, 질병 또는 손상; 간 질환, 질병 또는 손상; 위장관 질환, 질병 또는 손상; 피부 질환, 질병 또는 손상; 혈관 질환, 질병 또는 손상; 심장 질환, 질병 또는 손상; 또는 뇌 장애, 질병 또는 손상을 포함한다.

상피 조직의 재생이 유익한 예시적인 질병 또는 병은, 만성 궤양, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 알츠하이머병, 파킨슨병, 피부 화상, 피부 궤양, 피부 상처, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증, 기종(emphysema), 석면증(asbestosis), 폐 섬유증(예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 폐 고혈압, 폐암, 유육종증, 폐 기능부전(lung failure), 급성 폐 손상(성인 호흡 곤란 증후군), 선천성 횡격막 탈장(congenital diaphragmatic hernia), 미숙아 호흡 곤란 증후군, 미숙아 만성 폐질환(기관지 폐 형성 장애), 계면활성제 단백질 B 결핍(예를 들어, 동형 계면활성제 단백질 B 결핍), 폐포 단백질증, 폐 형성부전 및 폐 손상 각막 변성증과 암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

간엽 조직의 재생이 유익한 예시적인 질병 또는 병은, 심장 질병 또는 병, 당뇨병, 난청, 크론병, 자가면역 질환, 백혈병과 림프종(lymphoma), 암(예를 들어, 유방암), 겸상 적혈구 질환, 근위축성 측삭 경화증, 및 대사 장애를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

내피 조직의 재생이 유익한 예시적인 질병 또는 병은, 혈관 질병, 국소 빈혈, 겸상 적혈구 질환, 심혈관 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 당뇨병, 및 자가면역 질환[예를 들어, 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)(SLE)과 항인지질 항체 증후군(antiphospholipid antibody syndrome)(aPS)]을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

암의 예는, 암종(carcinoma), 림프종, 아세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 및 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암성 질환의 특별한 예는, 만성 골수성 백혈병, 성숙한 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 호염기성 세포(basophils)가 증가한 급성 비림프성 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 호산 백혈구 증가증(eosinophilia)을 동반한 급성 골수단구성 백혈병과 같은 골수성 백혈병(myeloid leukemia); 버킷의 비호지킨 림프종(Birkitt's non-Hodgkin's)과 같은 악성 림프종; 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병과 같은 림프성 백혈병; 고형 종양 양성 수막종(solid tumors benign meningioma), 침샘의 혼합 종양, 대장 선종과 같은 골수 증식성 질환(myeloproliferative diseases); 소 세포 폐암, 신장, 자궁, 전립선, 방광, 난소, 결장, 육종(sarcomas), 지방 육종(liposarcoma), 점액성(myxoid), 활막 육종(synovial sarcoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma)(폐포의), 골외 점액성 연골육종(extraskeletal myxoid chonodrosarcoma), 유잉 종양(Ewing's tumor)과 같은 선암종(adenocarcinomas)을 포함하지만, 이에 제한되지 않고; 다른 것은, 고환과 난소 미분화세포종(dysgerminoma), 망막아종(retinoblastoma), 윌름즈 종양(Wilms' tumor), 신경아세포종(neuroblastoma), 악성 흑색종(malignant melanoma), 중피종(mesothelioma), 유방, 피부, 전립선, 및 난소의 종양을 포함한다.

자가면역 질환/질병의 예는, 심혈관계 질환(예를 들어, 아테롬성 동맥 경화증, 혈전증, 심근 경색 등), 류머티스성 질환{예를 들어, 류머티스성 관절염과 강직성 척추염(ankylosing spondylitis)}, 선상 질환(glandular disease){예를 들어, 췌장 질병, 제 1형 당뇨병, 갑상선 질환, 그레이브스 질환(Graves'disease), 갑상선염 등}, 소화기 질환{예를 들어, 만성 염증성 장 질환, 소아 지방변증(celiac disease), 대장염, 회장염(ileitis), 및 크론병}, 피부병(cutaneous disease){예를 들어, 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 및 낙엽성 천포창(pemphigus foliaceus)과 같지만, 이에 제한되지 않는 자가면역 수포성 피부 질병}, 간장 질병{예를 들어, 간염, 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 및 자가면역 간염}, 신경 질병{예를 들어, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 알츠하이머병, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 신경병증(neuropathies), 운동 신경병증(motor neuropathies); 귈랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)과 자가면역 신경병증, 근무력증(myasthenia), 램버트-이튼 근무력 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome); 방종양성 신경 질병(paraneoplastic neurological diseases), 소뇌 위축증(cerebellar atrophy), 방종양성 소뇌 위축증, 및 강직 인간 증후군(stiff-man syndrome); 비방종양성(non-paraneoplastic) 강직 인간 증후군, 진행성 소뇌 위축증, 뇌염, 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis), 근위축성 측삭 경화증, 시드함 무도병(Sydeham chorea), 질레 드 라 뚜렛 증후군(Gilles de la Tourette syndrome), 및 자가면역 다발성 내분비병증(autoimmune polyendocrinopathies); 면역불량 신경병증(dysimmune neuropathies); 후천성 신경근 긴장증(acquired neuromyotonia), 선천성 다발 관절굽음증(arthrogryposis multiplex congenita), 신경염(neuritis), 시신경염(optic neuritis), 및 신경병성 질병(neurodegenerative diseases)}, 근육 질병{예를 들어, 근염, 자가면역 근염, 원발성 쇼그렌 증후군(primary Sjogren's syndrome), 및 평활근 자가면역 질병}, 신장 질병(예를 들어, 신염 및 자가면역 간질성 신염), 생식 관련 질병(예를 들어, 반복된 유산), 결합 조직 질병(예를 들어, 귀 질병, 자가면역 귀 질병, 및 내이 자가면역 질병), 및 전신 질병{예를 들어, 전신성 홍반성 낭창과 전신성 경화증(systemic sclerosis)}을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "폐질환 또는 손상"이라는 용어는, 폐 조직의 손실 또는 결핍을 수반하는, 임의의 질병, 질환, 병, 또는 임의의 병리학적 또는 원하지 않은 병, 상태, 또는 증후군, 또는 임의의 물리적, 형태학적 또는 생리학적 이상을 나타낸다.

폐질환 또는 손상과 연관된 예시적인 질병 또는 병은, 낭포성 섬유증, 기종, 석면증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐 섬유증(예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 폐 고혈압, 폐암, 유육종증, 폐 기능부전, 급성 폐 손상(예를 들어, 성인 호흡 곤란 증후군), 선천성 횡격막 탈장, 미숙아 호흡 곤란 증후군, 미숙아 만성 폐질환(기관지 폐 형성 장애), 계면활성제 단백질 B 결핍(예를 들어, 동형 계면활성제 단백질 B 결핍), 폐포 단백질증, 폐 형성부전, 및 폐 손상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

피험자에 대한 세포 현탁액의 격리된 모집단의 투여는, 여러 파라미터, 예를 들어, 치료될 질병의 유형, 단계 또는 심각성, 개별 피험자, 및/또는 원하는 치료 성과에 특정한 물리적 또는 생리학적 파라미터에 따라, 많은 방법으로 실행될 수 있다. 예를 들어, 용도와 목적에 따라서, 세포 현탁액의 격리된 모집단의 투여는, 기관내, 기관지내, 폐포내, 정맥내, 복강내, 비강내, 피하, 골수내, 척추강내, 심실내, 심장내, 근육내, 장막내, 점막내, 점막 관통, 경비, 직장, 및 장내로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로에 의해 실행될 수 있다.

일 실시예에 따라, 투여는 정맥 경로에 의해 일어날 수 있다.

대안적으로, 피험자에 대한 세포 현탁액의 격리된 모집단의 투여는, 치료 효과가 있도록 하기 위해, 여러 적절한 해부학적 위치로 그 투여를 통해 실행될 수 있다. 그래서, 용도와 목적에 따라서, 태아 폐 세포의 격리된 모집단은 동일한 곳의 해부학적 위치(세포의 기관 또는 조직 유형에 대한 정상적인 해부학적 위치)로 투여되거나, 이소성(ectopic) 해부학적 위치(세포의 기관 또는 조직 유형에 대한 비정상적인 해부학적 위치)로 투여될 수 있다.

따라서, 용도와 목적에 따라서, 태아 폐 세포의 격리된 모집단은, 신피막 아래, 또는 신장, 고환 지방(testicular fat), 피하 조직(sub cutis), 장막(omentum), 간문맥, 간, 비장, 심강(heart cavity), 심장, 흉강, 폐, 췌장, 피부 및/또는 복부내 공간으로 이식(implant){예를 들어, 이식(transplant)}되는 것이 유리할 수 있다.

예를 들어, 위장 질병 또는 병을 치료하기 위해, 본 발명의 세포 현탁액의 격리된 모집단은 간, 간문맥, 신피막, 피하 조직, 장막, 비장, 복부내 공간, 췌장, 고환 지방 및/또는 장 루프{소장의 U자 루프의 장막하조직(subserosa)} 안으로 투여될 수 있다. 폐 질병 또는 병을 치료하기 위해, 본 발명의 세포 현탁액의 격리된 모집단은 폐 안으로, 신피막 하에, 간, 간문맥, 피하 조직, 장막, 비장, 복부내 공간, 췌장 및/또는 고환 지방 안으로 투여될 수 있다.

본 발명의 일부 실시예의 태아 폐 세포의 격리된 모집단은 생물 그 자체에 투여되거나, 또는 적절한 캐리어(carrier) 또는 부형제(excipient)와 혼합된 경우 약제 조성물에서 투여될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제 조성물"은, 생리학적으로 적절한 캐리어 및 부형제와 같은 다른 화학 성분을 갖는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 활성 성분의 제조물을 나타낸다. 약제 조성물의 목적은, 생물에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.

본 명세서에서 "활성 성분"이라는 용어는, 생물학적 효과를 설명할 수 있는 포유류 태아 폐 조직으로부터 세포 현탁액의 격리된 모집단을 나타낸다.

이후, 호환 가능하게 사용될 수 있는 "생리학적으로 허용 가능한 캐리어"와 "약제학적으로 허용 가능한 캐리어"라는 문구는, 생물체에 큰 자극을 일으키지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성과 특성을 폐기하지 않는 캐리어 또는 희석제를 나타낸다. 보조제(adjuvant)는 이러한 문구에 포함된다.

본 명세서에서 "부형제"라는 용어는, 활성 성분의 투여를 더 용이하게 하도록 약제 조성물에 첨가된 비활성 물질을 나타낸다. 부형제의 예는, 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 전분의 여러 당과 유형, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

약물의 제제화와 투여를 위한 기술은, 본 명세서에 참조로 포함되어 있는 "레밍턴 약학(Remington's Pharmaceutical Sciences)" (맥 퍼블리싱 컴퍼니, 펜실베이니아, 이스턴, 최신판)에서 발견될 수 있다.

적절한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 직장, 점막 관통(transmucosal), 특히 경비(transnasal), 창자 또는 비경구 전달(근육내, 피하, 및 골수내 주사뿐만 아니라, 척추강내, 직접 심실내, 심장내, 예를 들어, 우실 또는 좌실 강으로, 공통 관상 동맥으로, 정맥, 복강내, 비강내, 또는 안구내 주사를 포함하는)을 포함할 수 있다.

중추 신경계(CNS)에 약물을 전달하기 위한 종래의 접근방식은, 신경외과적 전략{예를 들어, 대뇌내 주사(intracerebral injection) 또는 대뇌실내 주입(intracerebroventricular infusion)}; BBB의 내생 운반 경로 중 하나를 개발하기 위한 시도로, 약제의 분자 조작(molecular manipulation)(예를 들어, 그 자체가 BBB를 크로싱할 수 없는 약제와 공동으로 내피 세포 표면 분자에 친화성을 갖는 운반 펩티드를 포함한 키메릭 융합 단백질의 생성); 약제의 지질 용해도를 증가시키도록 설계된 약리학적 전략(예를 들어, 지질 또는 콜레스테롤 캐리어에 대한 수용성 약제의 컨쥬게이션); 및 고삼투압성 분열(hyperosmotic disruption)에 의한 BBB의 무결성(integrity)의 일시적인 분열(경동맥으로 만니톨 용액을 주입하거나, 앤지오텐신 펩티드와 같은 생물학적으로 활성인 약제를 사용하여서 생기는)을 포함한다. 그러나, 각각의 이러한 전략은, 침입성 외과 수술과 연관된 고유 위험, 내생 운반 시스템에 고유한 제한에 의해 부과된 크기 제한, CNS의 외부에서 활성일 수 있는 캐리어 모티프(carrier motif)로 이루어진 키메릭 분자의 조직적인 투여와 연관된 잠재적으로 바람직하지 않은 생물학적 부작용, 및 BBB가 분열된 경우 뇌의 영역 내에서 뇌 손상의 가능한 위험(이를 차선의 전달 방법이 되게 한다)과 같은 한계를 갖는다.

대안적으로, 약제 조성물을 체계적인 방식보다는 국부적으로, 예를 들어, 환자의 조직 영역(예를 들어, 폐 조직)에 직접 약제 조성물을 주사하여 약제 조성물을 투여할 수 있다.

본 발명의 일부 실시예의 약제 조성물은 이 기술 분야에 잘 알려진 공정으로, 예를 들어, 종래의 혼합, 용해, 과립화, 드라제 제조(dragee-making), 분쇄(levigating), 에멀션화, 캡슐화, 포획(extrapping) 또는 냉동 건조에 의해 제조될 수 있다.

그래서, 본 발명의 일부 실시예에 따라 사용하기 위한 약제 조성물은, 약학적으로 사용될 수 있는 제조물로 활성 성분을 처리하는 것을 용이하게 하는, 부형제와 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 캐리어를 사용하는 종래의 방식으로 제제화될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여의 경로에 의존한다.

주입을 위해, 약제 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는, 행크액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 또는 생리 염 완충액과 같이 생리학적으로 적합한 완충액으로 제제화될 수 있다. 점막 관통 투여를 위해, 투과될 장벽에 적합한 침투제(penetrant)는 제제로 사용된다. 이러한 침투제는 이 기술 분야에 일반적으로 알려져 있다.

경구 투여를 위해, 약제 조성물은 활성 화합물을 이 기술 분야에 잘 알려진 약제학적으로 허용 가능한 캐리어와 결합시켜 용이하게 제제화될 수 있다. 이러한 캐리어는 약제 조성물이 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등과 같이 환자에 의한 경구 섭취를 위해 제제화되도록 할 수 있다. 경구 사용을 위한 약리학적 조합제는, 정제 또는 당의정 심(core)을 얻기 위해 필요한 경우 적절한 보조제를 첨가한 후, 고형 부형제를 사용하여, 선택적으로, 생성된 혼합물을 분쇄하고, 과립 혼합물을 가공 처리하여 만들어질 수 있다. 적절한 부형제는, 특히, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함하는 당과 같은 충전제; 예를 들어, 옥수수 전분(maize starch), 밀 전분(wheat starch), 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가간트, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 소듐 카보메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 조합제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)와 같이 생리학적으로 허용 가능한 중합체이다. 필요하면, 교차 결합 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 일긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 그 염과 같은 분해제가 첨가될 수 있다.

당의정 심은 적절한 코팅을 갖는다. 이러한 목적을 위해, 선택적으로 검 아라빅, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 젤, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화 티타늄, 래커 용액 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축 설탕 용액이 사용될 수 있다. 확인을 위해 또는 활성 화합물 용량의 서로 다른 배합을 나타내기 위해 색소 또는 안료가 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구 사용될 수 있는 약제 조성물은, 젤라틴으로 만들어진 밀어 맞추는 캡슐(push-fit capsule)뿐만 아니라, 젤라틴과 가소제(글리세롤 또는 소르비톨과 같은)로 만들어진 연질의 밀봉 캡슐을 포함한다. 밀어 맞추는 캡슐은, 락토오스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 및 선택적으로 안정화제를 구비한 혼합물(admixture)에 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 성분은 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 용액에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제제는 선택된 투여 경로에 적합한 제형으로 있어야만 한다.

구강 투여를 위해, 조성물은 종래의 방식으로 제제화된 정제 또는 마름모꼴 정제(lozenge)의 형태를 취할 수 있다.

비강 흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명의 일부 실시예에 따라 사용하기 위한 활성 성분은, 적절한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용하여 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 프리젠테이션의 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위(dosage unit)는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공하여 결정될 수 있다. 화합물의 분말 믹스와 락토오스 또는 전분과 같이 적절한 분말 베이스를 함유하는 캡슐과 카트리지(예를 들어, 디스펜서에 사용하기 위한 젤라틴의)가 제제화될 수 있다.

본 명세서에 기술된 약제 조성물은, 예를 들어, 볼루스 주사(bolus injection) 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 단위 제형(unit dosage form), 예를 들어, 앰플 또는 선택적으로 방부제가 첨가된 다중 투약 용기(multidose container)로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클(vehicle)의 현탁액, 용액 또는 에멀션일 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화 약품(formulatory agent)을 함유할 수 있다.

비경구 투여를 위한 약제 조성물은 수용성 형태인 활성 조합제의 수용액을 포함한다. 또한, 활성 성분의 현탁액은 적절한 유성 또는 수성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 비히클은, 참기름과 같은 지방유, 또는 올레산 에틸, 트리글리세리드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주사 현탁액은, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은, 매우 농축된 용액의 제조를 허용하기 위해 활성 성분의 용해도를 증가시키는 적절한 안정화제 또는 약품을 또한 함유할 수 있다.

대안적으로, 활성 성분은 사용 전 적절한 비히클, 예를 들어, 멸균 무발열원(pyrogen-free) 수용액과 함께 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.

본 발명의 일부 실시예의 약제 조성물은, 예를 들어, 코코아 버터 또는 이와 다른 글리세리드와 같은 종래의 좌약 베이스를 사용하여, 좌약 또는 보류 관장(retention enemas)과 같은 직장 조성물로 또한 제제화될 수 있다.

본 발명의 일부 실시예의 환경에서 사용하는데 적합한 약제 조성물은 조성물을 포함하고, 여기서, 활성 성분은 의도한 목적을 이루는데 유효한 양으로 함유되어 있다. 보다 구체적으로, 치료 유효량은, 질환(예를 들어, 폐 질병 또는 병과 같은 상피 질병)의 증후군을 방지, 완화 또는 개선하거나 또는 치료 중인 피험자의 생존을 연장하는데 효과적인 활성 성분(즉, 태아 폐 세포를 포함하는 세포 현탁액의 격리된 모집단)의 양을 의미한다.

치료 유효량의 결정은, 특히, 본 명세서에 제공된 상세한 기재 내용에 비추어, 이 기술분야의 당업자의 능력 내에 있다.

본 발명의 방법에 사용된 임의의 조제를 위해, 치료 유효량 또는 용량은 처음부터 생체외 및 세포 배양 분석으로부터 예측될 수 있다. 예를 들어, 일 회 용량은 원하는 농도 또는 역가(titer)를 이루기 위해 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에 유용한 용량을 더 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다.

태아 폐 세포의 격리된 모집단의 치료 유효량을 평가하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 동물 모델은, 다음에 오는 예 부분에 상세히 기술된 바와 같이, 추가 조사(irradiation)를 사용하거나 사용하지 않고(예를 들어, 나프탈렌 투여 후 40~48시간), 예를 들어, 나프탈렌(예를 들어, 99% 이상 순수한)의 복강내 주사에 의해 폐 손상이 유발되는 쥣과 동물 모델(예를 들어, 쥐)을 포함한다.

본 명세서에 기술된 활성 성분의 독성과 치료 효능은 생체외, 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제 절차에 의해 결정될 수 있다. 생체외, 세포 배양 분석, 및 동물 연구에서 이러한 것으로부터 얻어진 데이터는 인간에 사용하기 위한 용량의 범위를 만드는데 사용될 수 있다. 용량은 사용된 제형 및 사용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제제, 투여 경로, 및 용량은 환자의 상태를 보고 개별 의사에 의해 선택될 수 있다 (예를 들어, Fingl 등, 1975, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p.1 참조).

용량 및 간격은 생물학적 효과를 유발 또는 억제하는데 충분한 활성 성분의 앰플 레벨(최소 유효 농도, MEC)을 제공하기 위해 개별적으로 조절될 수 있다. MEC는 각각의 조제에 대해서 달라지지만, 생체외 데이터로부터 예측될 수 있다. MEC를 이루는데 필요한 용량은 개별 특징 및 투여 경로에 의존할 것이다. 감지 분석은 플라즈마 농도를 결정하기 위해 사용될 수 있다.

치료될 병의 심각성 및 반응성에 따라, 수 일 내지 수 주 동안 지속하는 치료 경과와 함께 또는 치유가 나타나거나 질병 상태의 감소가 이루질 때까지, 투약은 단일 또는 복수의 투여일 수 있다.

투여될 조성물의 양은, 물론, 치료 중인 피험자, 고통의 심각성, 투여의 방식, 진단하는 의사의 판단 등에 의존할 것이다.

일 실시예에 따라, 세포 현탁액의 격리된 모집단은, 피험자의 킬로그램 체중당 적어도 약 0.5 × 10⁵, 1 × 10⁵, 0.5 × 10⁶, 1 × 10⁶, 1.5 × 10⁶, 2 × 10⁶, 2.5 × 10⁶, 3 × 10⁶, 3.5 × 10⁶, 4 × 10⁶, 4.5 × 10⁶, 5 × 10⁶, 5.5 × 10⁶, 6 × 10⁶, 6.5 × 10⁶, 7 × 10⁶, 7.5 × 10⁶, 8 × 10⁶, 8.5 × 10⁶, 9 × 10⁶, 9.5 × 10⁶, 10 × 10⁶ 세포를 포함한다.

특정 실시예에 따라, 세포 현탁액의 격리된 모집단은, 피험자의 킬로그램 체중당 적어도 약 1 × 10⁶ 세포를 포함한다.

본 발명의 일부 실시예의 조성물은, 원할 경우, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단일 제형을 포함할 수 있는, FDA 승인 키트와 같은, 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은, 예를 들어, 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 설명이 동반될 수 있다. 팩 또는 디스펜서는 약품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 용기와 관련된 통지서가 또한 제공될 수 있고, 상기 통지서는 기관에 의한 조성물 또는 인간 또는 가축 투여의 형태 승인을 반영한다. 이러한 통지서는, 예를 들어, 처방 약물을 위해 미국 식품 의약국에 의해 승인된 라벨 표시(labeling) 또는 승인된 제품 삽입물의 통지서일 수 있다. 융화성 약제 캐리어에서 제제화된 본 발명의 조합제를 포함하는 조성물은 또한 제조되어 적절한 용기에 담기고, 앞에서 더 상세히 기술된 바와 같이, 표시된 병의 치료를 위해 라벨 표시될 수 있다.

일반적으로, 캡슐화 기술은, 작은 구형 비히클을 필요로 하는 마이크로캡슐화와, 이보다 더 큰 편평한 판과 중공 섬유 멤브레인을 필요로 하는 마크로캡슐화로 분류된다 {Uludag, H. 등 (2000). 포유류 세포 캡슐화의 기술(Technology of mammalian cell encapsulation). Adv Drug Deliv Rev 42, 29-64}.

마이크로캡슐을 제조하는 방법은 이 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어, 다음에 기재된 것을 포함한다 {Lu, M. Z. 등 (2000). 알긴산염과 알파-페녹시신나밀리덴 아세틸화 폴리(알릴아민)을 이용한 세포 캡슐화(Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine)). Biotechnol Bioeng 70, 479-483; Chang, T. M. 및 Prakash, S. (2001) 효소, 세포, 및 유전 공학 미생물을 마이크로캡슐화하는 절차(Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms). Mol Biotechnol 17, 249-260; 및 Lu, M. Z., 등 (2000). 감광성 폴리(알릴아민 알파-시아노신나밀리덴아세테이트)를 사용하는 신규한 세포 캡슐화 방법(A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate)). J Microencapsul 17, 245-521}.

예를 들어, 마이크로캡슐은, 2-하이드록시에틸 메틸아크릴레이트(HEMA), 메타크릴산(MAA), 및 메틸 메타크릴레이트(MMA)의 ter-중합체 셸(shell)을 갖는 착물(complex)에서 변형된 콜라겐을 사용하여 제조되어, 2 ~ 5㎛의 캡슐 두께를 가져온다. 이러한 마이크로캡슐은 음 전하의 매끄러운 표면을 부여하고 플라즈마 단백질 흡수를 최소화하기 위해 ter-중합체 셸의 추가 2 ~ 5㎛로 추가 캡슐화될 수 있다 {Chia, S. M. 등 (2002). 세포 캡슐화를 위한 다층 마이크로캡슐(Multi-layered microcapsules for cell encapsulation). Biomaterials 23, 849-856}.

다른 마이크로캡슐은 알긴산염, 해양 다당류{(Sambanis, A. (2003). 당뇨병 치료에서 캡슐화된 아이릿(Encapsulated islets in diabetes treatment). Diabetes Thechnol Ther 5, 665-668), 또는 그 유도체를 기초로 한다. 예를 들어, 마이크로캡슐은, 염화 칼슘 존재 하에, 다가 음이온 알긴산 나트륨과 셀룰로오스 황산 나트륨(sodium cellulose sulphate)과 다가 양이온 폴리(메틸렌-코-구아니딘) 염산염 사이에서 고분자 전해질 착물화(polyelectrolyte complexation)에 의해 제조될 수 있다.

세포 캡슐화는, 더 작은 캡슐이 사용되면 향상되는 것으로 평가될 것이다. 그래서, 예를 들어, 캡슐화 세포의 품질 관리, 기계적 안정성, 확산 특성, 및 생체외 활성은 캡슐 크기가 1mm에서 400㎛로 감소되었을 때 개선된다 {Canaple, L. 등 (2002). 크기 제어를 통한 세포 캡슐화 개선(Improving cell encapsulation through size control). J Biomater Sci Polym Ed 13, 783-96}. 또한, 7nm 정도로 작은 잘 제어된 공동 크기를 갖는 나노다공성 생체캡슐, 맞춤 표면 화학물질, 및 정확한 마이크로아키텍쳐는, 세포를 위한 미세환경을 성공적으로 면역격리시키는 것으로 밝혀졌다 {See: Williams, D. (1999). 작은 것이 아름답다: 의료 장비에서 마이크로입자와 나노입자 기술(참조: Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices). Med Device Technol 10, 6-9; and Desai, T. A. (2002). 췌장 세포 캡슐화를 위한 마이크로제조 기술(Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation). Expert Opin Biol Ther 2, 633-646}.

언급한 바와 같이, 비동계 세포의 이식을 용이하게 하기 위해, 본 발명은, 세포 현탁액의 격리된 모집단의 투여 전, 투여와 동시, 또는 투여 후에 피험자를 면역억제 요법(regimen)으로 처리하는 것을 추가로 고려한다.

이식을 위한 적절한 면역억제 요법을 선택 및 실행하기 위한 앰플 지침이 이 기술 분야의 문헌에 제공되어 있다 (예를 들어, 다음을 참조한다: Kirkpatrick CH. and Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. 등, 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. and Strom TB., 1996. New Engl. J. Med. 331, 365; Midthun DE. 등, 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. 등, 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. 등, 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. 등, 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. 등 1998. Lancet 351, 623).

일 실시예에 따라, 면역억제 요법은 피험자에게 적어도 하나의 면역억제제를 투여하는 단계로 이루어진다.

면역억제제의 예는, 메토트렉세이트(methotrexate), 타크로리무스(tacrolimus), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시클로스포린(cyclosporine), 시클로스포린 A, 클로로퀴논(chloroquine), 하이드록시클로로퀴논(hydroxychloroquine), 설파살라진(sulfasalazine)(설파살라조피린), 금염(gold salts), D-페니실라민(penicillamine), 레플루노마이드(leflunomide), 아자티오프린(azathioprine), 아나킨라(anakinra), 인플릭시맵(infliximab)(REMICADE), 에타네르셉트(etanercept), 코팍손(Copaxone), 프레드니손(prednisone), 메틸 프레드니솔론, 아자티오프렌, 시클로포스파미드와 플루다라빈(fludarabin), CTLA4-Ig, 항 CD40 항체, 항 CD40 리간드 항체, 항 B7 항체, 항 CD3 항체(예를 들어, 항 인간 CD3 항체 OKT3), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 다클리주맵(daclizumab)[인간화된 (IgG1 Fc) 항-IL2R 알파 사슬 (CD25) 항체], 및 톡신{예를 들어, 콜레라 A 사슬, 또는 슈도모나스 톡신(Pseudomonas toxin)}에 컨쥬게이트된 항 T 세포 항체, TNF 알파 차단제, 염증성 시토킨을 표적으로 하는 생물학제, 및 비스테로이드성 항-염증성 약물(NSAIDs){아세틸 살리실산, 콜린성 살리실산 마그네슘, 디플루니살)(diflunisal), 살리실산 마그네슘, 살사레이트(salsalate), 살리실산 나트륨, 디클로페낙(diclofenac), 에토도락(etodolac), 페노프로펜(fenoprofen), 플루비프로펜(flurbiprofen), 인도메타신(indomethacin), 케토프로펜(ketoprofen), 케토로락(ketorolac), 메클로페나메이트(meclofenamate), 나프록센(naproxen), 나부메톤(nabumetone), 페닐부타존(phenylbutazone), 피록시캄(piroxicam), 설린닥(sulindac), 톨메틴(tolmetin), 아세트아미노펜, 이부프로펜(ibuprofen), Cox-2 억제제, 트라마돌(tramadol), 라파마이신(rapamycin){시로리무스(sirolimus)}, 및 라파마이신 유사체(CCI-779, RAD001, AP23573과 같은)를 포함하는}을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 약품은 개별적으로 또는 조합해서 투여될 수 있다.

세포의 유형과 치료될 질병 또는 병에 따라서, 태아 폐 세포의 격리된 모집단의 이식을 용이하게 하기 위해, 이 방법은, 세포 현탁액의 격리된 모집단을 투여하기 전에, 아치사, 치사 또는 과치사 상태의 피험자를 컨디셔닝하는 단계를 더 포함하는 것이 유리할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "아치사", "치사", 및 "과치사"라는 용어는, 본 발명의 피험자의 컨디셔닝에 관한 것일 때, 골수독성(myelotoxic) 및/또는 림프구독성 치료를 나타내고, 이는, 각각 피험자의 대표적인 모집단에 적용시, 전형적으로, 본질적으로 모집단의 모든 구성원에 비치명적이고; 모집단의 모든 구성원은 아니지만 일부 구성원에게는 치명적이거나; 또는 정상 멸균 조건에서는 본질적으로 모집단의 모든 구성원에게 치명적이다.

일 실시예에 따라, 컨디셔닝은, 전신 조사(TBI), 전체 림프 조사{TLI, 즉, 모든 림프절, 흉선(thymus), 및 비장의 노출}, 부분 신체 조사(예를 들어, 폐, 신장, 뇌 등의 특정 노출), 골수 소멸성 컨디셔닝(myeloablative conditioning), 동시 자극적 차단(co-stimulatory blockade), 화학치료제(chemotherapeutic agent) 및/또는 항체 면역 요법을 포함한다.

다음에 오는 예 부분에 예시된 바와 같이, 나프탈렌을 사용하여 피험자를 컨디셔닝하는 것은 호흡 세기관(respiratory bronchioles)과 기관지-폐포 접합부(broncho-alveolar junction)에서 클라라 세포의 위치 특이성 절제를 유발하여, 태아 폐 세포의 격리된 모집단의 이식을 용이하게 한다. 정주(residential) 폐 줄기 세포(나프탈렌 처리 후 신속하게 증식할 수 있는)를 효과적으로 추가 제거하기 위해, 피험자는 태아 폐 세포의 격리된 모집단을 투여하기 전에 (다음에 오는 예 부분의 예 2 참조) 추가로 아치사 TBI(예를 들어, 6 Gy)를 받았다.

그래서, 본 발명의 일 실시예에 따라, 컨디셔닝 프로토콜은 나프탈렌 처리를 포함한다.

일 실시예에 따라, 나프탈렌 처리는 세포 현탁액의 격리된 모집단을 투여하기 전에 피험자에게 1~10일 동안(예를 들어, 3일) 투여되었다.

일 실시예에 따라, 컨디셔닝은 나프탈렌 처리와 TBI 처리를 포함한다.

일 실시예에 따라, TBI는, 0.5-1 Gy, 0.5-1.5 Gy, 0.5-2.5 Gy, 0.5-5 Gy, 0.5-7.5 Gy, 0.5-10 Gy, 0.5-15 Gy, 1-1.5 Gy, 1-2 Gy, 1-2.5 Gy, 1-3 Gy, 1-3.5 Gy, 1-4 Gy, 1-4.5 Gy, 1-1.5 Gy, 1-7.5 Gy, 1-10 Gy, 2-3 Gy, 2-4 Gy, 2-5 Gy, 2-6 Gy, 2-7 Gy, 2-8 Gy, 2-9 Gy, 2-10 Gy, 3-4 Gy, 3-5 Gy, 3-6 Gy, 3-7 Gy, 3-8 Gy, 3-9 Gy, 3-10 Gy, 4-5 Gy, 4-6 Gy, 4-7 Gy, 4-8 Gy, 4-9 Gy, 4-10 Gy, 5-6 Gy, 5-7 Gy, 5-8 Gy, 5-9 Gy, 5-10 Gy, 6-7 Gy, 6-8 Gy, 6-9 Gy, 6-10 Gy, 7-8 Gy, 7-9 Gy, 7-10 Gy, 8-9 Gy, 8-10 Gy, 10-12 Gy or 10-15 Gy 범위 내의 단일 또는 분할된 조사 선량(irradiation dose)을 포함한다.

특정 실시예에 따라, TBI는, 1-7.5 Gy 범위 내의 단일 또는 분할된 조사 선량을 포함한다.

일 실시예에 따라, TBI 처리는, 세포 현탁액의 격리된 모집단을 투여하기 전 1~10일(예를 들어, 1~3일) 피험자에게 가해진다.

일 실시예에 따라, 나프탈렌 처리는, 세포 현탁액의 격리된 모집단을 투여하기 전 2~10일(예를 들어, 3일) 피험자에게 가해지고, TBI 처리는 세포 현탁액의 격리된 모집단을 투여하기 전 40~48시간 이후(예를 들어, 1일) 피험자에게 가해진다.

일 실시예에 따라, 부분 신체 조사가 사용되면, 노출은 처리될 기관 또는 조직에 특정하다 (예를 들어, 폐, 신장, 간, 췌장, 뇌 등). 이러한 경우, 원치 않는 기관/조직 손상을 막기 위해 조사되지 않은 신체 기관을 가리는 것이 적당하다.

일 실시예에 따라, 컨디셔닝은 화학치료제를 포함한다 {예를 들어, 골수 소멸제(myeloablative agent)}. 예시적인 화학치료제는, 부설판(Busulfan), 미레란(Myleran), 부설펙스(Busulfex), 플루다라빈(Fludarabine), 멜파란(Melphalan), 디메틸 미레란, 티오테파(Thiotepa), 및 시클로포스파미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 화학치료제(들)는 이식 전 단일 용량 또는 여러 용량, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 용량(예를 들어, 일일 용량)으로 피험자에게 투여될 수 있다.

일 실시예에 따라, 컨디셔닝은, 항체 면역요법을 포함한다. 예시적인 항체는, 항-CD52 항체{예를 들어, Campath, MabCampath, Campath-1H, 및 Lemtrada의 상표명으로 판매되는 알렘투주맵(Alemtuzumab)}와, 항-흉선세포 글로불린(thymocyte globulin)(ATG) 약품[예를 들어, 티모글로불린{젠자임(Genzyme)에서 구입 가능한, 토끼 ATG, rATG}과 Atgam{파이저(Pfizer)로부터 구입 가능한, 말 ATG, eATG}]을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 실시예에 따라, 항체는 이식 전 단일 용량 또는 여러 용량, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 용량(예를 들어, 일일 용량)으로 피험자에게 투여된다.

일 실시예에 따라, 컨디셔닝은 동시 자극적 차단을 포함한다. 그래서, 예를 들어, 컨디셔닝은 피험자에게 적어도 하나의 T-세포 동시 자극 억제제(costimulation inhibitor)와 적어도 하나의 CD40 리간드 억제제를 일시적으로 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 바람직하게는, 피험자에게 T-세포 증식의 억제제를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 따라, T-세포 동시 자극 억제제는 CTLA4-Ig이고, CD40 리간드 억제제는 항-CD40 리간드 항체이며, T-세포 증식의 억제제는 라파마이신이다. 대안적으로, T-세포 동시 자극 억제제는 항-CD40 항체일 수 있다. 대안적으로, T-세포 동시 자극 억제제는, B7-1, B7-2, CD28, 항-LFA-1 및/또는 항-LFA3에 특정한 항체일 수 있다.

본 교시에 따라 피험자에게 세포 현탁액의 격리된 모집단을 이식한 후, 표준 의료 업무에 따라, 여러 표준 기술 중 어느 하나에 따라 이식된 세포의 성장 기능성과 면역 적합성을 감시하는 것이 타당하다. 예를 들어, 재생된 폐 조직의 기능성은 표준 폐 기능 시험에 의해 이식 후에 감시될 수 있다 {예를 들어, 계면활성제 단백질 C(sp-C)에 대한 염색에 의해 검출 가능한, 계면활성제를 합성하는 능력과, CFTR-낭포성 섬유증 막관통 조절기에 대한 염색으로 표시된 바와 같이, 이온을 운반하는 능력으로 표시된 바와 같은, 발달 이식조직의 기능 특성의 분석}.

본 명세서에 기술된 태아 폐 세포의 격리된 모집단은 개별적으로 저장되거나 은행(bank) 안에 포함될 수 있고, 각각의 모집단은 특별한 파라미터(예를 들어, HLA 타입)에 따라 분류되어 있다.

그래서, 본 발명의 또 다른 양상에 따라, 포유류 태아 폐 조직으로부터 격리된 복수의 세포 모집단을 포함하는 세포 은행이 제공되어 있고, 태아 폐 조직은 약 20 내지 약 22주의 임신 범위로부터 선택된 임신 단계에서 인간의 폐 기관/조직의 발달 단계에 본질적으로 대응하는 발달 단계에 있으며, 복수의 세포 모집단은 동종 세포 은행을 형성하도록 HLA 유형이 되었고, 각각은 개별적으로 개별 용기 내에 배치된다.

일 실시예에 따라, 인간 폐 기관/조직은 앞에서 상세히 기술된 임신 단계에 있다.

일 실시예에 따라, 은행은 상술한 것과 다른 임신 단계의 세포를 포함하지 않는다.

일 실시예에 따라, 은행은 상기 20~22주의 임신과 다른 임신 단계의 세포를 포함하지 않는다.

일 실시예에 따라, 은행은 폐와 다른 조직의 세포를 포함하지 않는다.

일 실시예에 따라, 은행은 출생 후(postnatal) 또는 성체 조직의 세포를 포함하지 않는다.

본 발명의 이러한 양상의 포유류 태아 폐 세포 은행은, 인간의 20~22주의 임신에 해당하는 임신 연령에서 태아로부터 얻어진 하나 이상의 포유류 태아 폐 세포 모집단의 물리적인 수집물이다. 이러한 은행은 각 태아 폐 세포 모집단의 하나 이상의 시료{즉, 부분 표본(aliquot)}를 함유하는 것이 바람직하다. 태아 폐 세포 모집단을 채취하는 것은 위에 기술되어 있다. 태아 폐 세포 모집단은 상술한 바와 같이 여러 포유류 생물로부터 얻어질 수 있다.

태아 폐 세포 모집단은, 세포(예를 들어, 선조 세포)가 생존하여 기능을 유지하도록 하는 적절한 조건(전형적으로 동결에 의해) 하에 저장된다. 일 실시예에 따라, 태아 폐 세포 모집단은 냉동 보존된 모집단으로 저장된다. 다른 보존 방법은 미국 특허 번호 5,656,498, 5,004,681, 5,192,553, 5,955,257, 및 6,461,645에 기술되어 있다. 줄기 세포를 뱅킹(banking)하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개번호 2003/0215942에 기술되어 있다.

일 실시예에 따라, 은행에 저장된 태아 폐 세포 모집단은, 형태적 특징, 분화 프로파일(differentiation profile), 혈액형, 주요 조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex)[인간 백혈구 항원(HLA)], 제공자의 질병 상태, 또는 질병 또는 병과 연관되거나 연관되지 않은 유전자형 정보(genotypic information)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 미리 결정된 특징에 따라 특징이 기술된다.

일 실시예에 따라, 은행에 저장된 태아 폐 세포 모집단은, HLA 유형 분류에 따라 특징이 기술된다.

일 실시예에 따라, 세포 은행은, 태아 폐 세포 모집단의 미리 결정된 특징에 관한 정보(예를 들어, HLA 유형 세포)를 포함하는 목록을 더 포함한다.

목록은, 집합된 작성 기록 또는 정보가 입력되어 있는 컴퓨터 데이터베이스와 같지만, 이에 제한되지 않는 각각의 세포 모집단에 대해 얻어진 특징의 중앙 기록을 생성하는 단계를 구성할 수 있다. 태아 폐 세포 은행은 연구원 또는 임상의의 요구에 적합한 특정한 태아 폐 세포 시료의 복수의 시료로부터 선택하는 것을 용이하게 한다.

본 발명의 또 다른 양상에 따라, 포유류 태아 폐 선조 세포를 격리하는 방법이 제공되어 있고, 상기 방법은: (a) 포유류 태아 폐 조직을 얻는 단계로서, 상기 태아 폐 조직은 약 20 내지 약 22주의 임신 범위로부터 선택된 임신 단계에서 인간 폐 기관/조직의 발달 단계에 본질적으로 대응하는 발달 단계에 있는, 단계와, (b) CK5, CK14, CD271, CD34, c-Kit, CD326, CD31, 및 CD45와 그 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표지의 태아 폐 조직 세포 상에서 표지 발현을 검출하는 단계와, (c) 상기 표지 발현을 나타내는 세포를 격리하여, 포유류 태아 폐 선조 세포를 격리하는 단계를 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포의 격리된 모집단은, 약 15 또는 17주의 임신으로부터 얻어진 폐 조직 또는 기관과 비교해서 적어도 두 배 이상의 CK5+ 세포를 포함한다.

일 실시예에 따라, 세포의 격리된 모집단은 피험자 폐의 작은 세기관지에 새롭게 형성된 상피 세포를 생기게 한다.

일 실시예에 따라, 세포의 격리된 모집단은 피험자 폐의 폐포에서 폐포세포(pneumocyte) 유형 1 세포 및/또는 폐포세포 유형 2 세포의 발현을 일으킨다.

일 실시예에 따라, 세포의 격리된 모집단은 피험자 폐의 혈관에서 CD31⁺ 세포의 발현을 일으킨다.

일 실시예에 따라, 세포의 격리된 모집단은 약 18주의 임신으로부터 얻어진 폐 조직 또는 기관에 비해 더 넓은 폐포관(alveolar duct)을 생기게 한다.

일 실시예에 따라, 세포의 격리된 모집단은 약 18주의 임신으로부터 얻어진 폐 조직 또는 기관에 비해 더 얇은 폐포벽(alveolar duct)을 생기게 한다.

일 실시예에 따라, 세포의 격리된 모집단은 약 18주의 임신으로부터 얻어진 폐 조직 또는 기관에 비해 기관지 및 세기관지 구조를 더 생기게 한다.

일 실시예에 따라, 세포의 격리된 모집단은 약 15 또는 24주의 임신으로부터 얻어진 폐 조직 또는 기관에 비해 낭포의 형성을 가져오지 않는다.

일 실시예에 따라, 세포의 격리된 모집단은 약 15 또는 24주의 임신으로부터 얻어진 폐 조직 또는 기관에 비해 계면활성제 단백질 C(sp-C) 및/또는 CFTR의 양성 발현을 일으킨다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "약"이라는 용어는, ±10%를 나타낸다.

"구비한다", "구비하는", "포함한다", "포함하는", "갖는"이라는 용어와 그 동근어(conjugate)는, "~을 포함하지만, 이에 제한되지 않는"을 의미한다.

"~로 이루어진"이라는 용어는, "~을 포함하고 이에 제한된"을 의미한다.

"~로 필수 구성된"이라는 용어는, 추가 성분, 단계 및/또는 부분이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적이고 신규한 특징을 크게 바꾸지 않는 경우에만, 조성물, 방법 또는 구조가 추가 성분, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있음을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태는, 맥락이 그렇지 않다고 분명하게 나타내지 않으면 복수 참조를 포함한다. 예를 들어, "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"이라는 용어는, 혼합물을 포함해서, 복수의 화합물을 포함할 수 있다.

이 출원 전체에서, 이 발명의 여러 실시예는 범위 포맷으로 제공될 수 있다. 범위 포맷에서 설명은 단지 편의와 간결함을 위한 것으로 이해되어야 하고, 본 발명의 범위에 대한 강한 제한으로는 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위 범위뿐만 아니라, 이 범위 내에 있는 개별 수치 값을 구체적으로 기재한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6, 등과 같은 하위 범위뿐만 아니라, 이 범위 내의 개별 수치, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 구체적으로 기재한 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다.

수치 범위가 본 명세서에 나타날 때마다, 임의의 인용된 수(분수 또는 정수)를 표시된 범위 내에 포함하는 것으로 의미된다. 제 1 표시 수 내지 제 2 표시 수 "범위의/범위이다"라는 문구와, 제 1 표시 수부터 제 2 표시 수까지 "범위의/범위이다"라는 문구는, 본 명세서에서 교환 가능하게 사용되고, 제 1 및 제 2 표시 수와 이 사이에 있는 모든 분수 및 정수를 포함하는 것으로 의미된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "방법"이라는 용어는, 화학, 약학, 생물학, 생화학, 및 의학 기술의 전문가에게 공지되어 있거나, 이들에 의해 알려진 방식, 수단, 기술, 및 절차로부터 용이하게 개발된 이러한 방식, 수단, 기술, 및 절차를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 주어진 업무를 수행하기 위한 방식, 수단, 기술, 및 절차를 나타낸다.

명료함을 위해, 개별 실시예의 맥락으로 기술된 본 발명의 특정한 특징은, 단일 실시예에서 공동으로 또한 제공될 수 있는 것으로 이해된다. 이와 반대로, 간결함을 위해, 단일 실시예의 맥락으로 기술된 본 발명의 여러 특징은, 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 기술된 실시예에서 적절하게 또한 제공될 수 있다. 여러 실시예의 맥락에서 기술된 특정한 특징은, 실시예가 이러한 요소 없이 작용하지 않으면, 이러한 실시예의 본질적인 특징인 것으로 간주되지 않아야 한다.

앞에서 기술되고 아래 청구항 부분에서 청구된 같이 본 발명의 여러 실시예와 양상은 다음의 예에서 실험적인 지지를 발견한다.

예

이제 다음 예에 대한 참조가 이루어지고, 이는 상기 상세한 설명과 함께 본 발명을 비제한적인 방식으로 예시한다.

일반적으로, 본 명세서에 사용된 용어와 본 발명에 사용된 실험 절차는, 분자, 생화학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 충분하게 설명되어 있다. 예를 들어, 다음을 참조한다: "분자 클로닝: 실험실 메뉴얼(Molecular Cloning: A laboratory Manual)" Sambrook 등, (1989); "분자 생물학에서 현재 프로토콜(Current Protocols in Molecular Biology)" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel 등, "분자 생물학에서 현재 프로토콜", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "분자 클로닝에 대한 실용 안내서(A Practical Guide to Molecular Cloning)", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson 등, "재조합(Recombinant) DNA", Scientific American Books, New York; Birren 등. (eds) "게놈 분석: 실험실 메뉴얼 시리즈(Genome Analysis: A Laboratory Manual Series)", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659, 및 5,272,057에 개시된 바와 같은 방법론; "세포 생물학: 실험실 핸드북(Cell Biology: A Laboratory Handbook)", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "면역학에서 현재 프로토콜(Current Protocols in Immunology)" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites 등 (eds), "기본 및 임상 면역학(Basic and Clinical Immunology)" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "세포 면역학에서 선택된 방법(Selected Methods in Cellular Immunology)", W. H. Freeman and Co., New York (1980); 이용 가능한 면역분석은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기술되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771, 및 5,281,521을 참조한다; "올리고뉴클레오티드 합성(Oligonucleotide Synthesis)" Gait, M. J., ed. (1984); "핵산 하이브리드 형성(Nucleic Acid Hybridization)" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "전사와 번역(Transcription and Translation)" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "동물 세포 배양(Animal Cell Culture)" Freshney, R. I., ed. (1986); "고정 세포와 효소(Immobilized Cells and Enzymes)" IRL Press, (1986); "분자 클론닝에 대한 실용 안내서(A Practical Guide to Molecular Cloning)" Perbal, B., (1984) 및 "효소학 방법(Methods in Enzymology)" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR 프로토콜: 방법과 용도에 대한 안내서(PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications)", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak 등, "단백질 정제 및 특징화를 위한 전략 - 실험실 코스 매뉴얼(Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual)" CSHL Press (1996); 이들 모두는 본 명세서에 완전히 개시된 것과 같이 참조로 포함되어 있다. 다른 일반 참조는 이 문서 전반에서 제공된다. 본 명세서의 절차는 이 기술 분야에서 잘 알려져 있는 것으로 인정되고 독자의 편의를 위해 제공된다. 여기에 포함된 모든 정보는 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.

일반 재료와 실험 절차

태아 폐 이종 이식( xenograft )

동물

동물은, 바이즈만 연구소(Weizmann Institute)에서 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 조건 하에 유지되었다: 사용된 쥐 균주(strain)는, NOD-SCID, RAG-/-, Balb- Nude, C57BL/6J(CD45.2), 및 C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J를 포함했다. 모든 쥐는 6~10주의 연령이었다. 이 쥐들은 작은 우리 안에 있고(각 우리 안에서 최대 5마리) 멸균 식품과 산성수가 공급되었다.

동물 절차

이식 절차

배아 전구체 조직의 이식은 이전에 기술된 것과 같이 일반 마취법(anesthesia)으로 수행되었다 (2.5% 2,2,2-트리브로모에탄올, 97% in PBS, 10 ml/kg 복강내 투여) [Katchman H. 등, Stem Cells. (2008) 26(5):1347-55].

신장 캡슐 하의 이식

호스트 신장(host kidney)은 좌측면 절개를 통해 노출되었다. 신장 캡슐(kidney capsule)의 꼬리 단부에서 1.5mm 절개가 이루어지고, 공여 전구체 조직은 신장 캡슐 아래에 직경 1~2mm 단편으로 이식되었다.

15 내지 24주 임신 범위의 인간 태아 폐 조직은 합법적인 유산으로부터 얻어지고 폐 조직을 사용하기 위한 작성된 고지에 입각한 동의서(informed consent)는 헬싱키 윤리 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 얻어졌다. 태아 연령은 임상 정보를 기초로 결정되고 태아 발 길이 측정을 통해 확인되었다. 이식편 조직이 태아 폐로부터 얻어졌음을 확인하기 위해, 오직 전체 폐엽(informed consent)이 이종이식편(xenograft) 조직의 제조를 위해 사용되었다. 새로운 하부 기도가 멸균 조건 하에 1~3mm³ 단편으로 절단되었다. 마취된 면역결핍 쥐에 대해 수술이 수행되고, 인간 태아 폐 조직이 각각의 쥐의 신피막 아래 놓여졌다 (하나의 단편). 이종이식편은 이식 후 서로 다른 시점에 채취되었다.

C57BL 쥐의 신장 캡슐 아래에서 쥐 배아 폐의 동계 이식을 위해, 서로 다른 임신 연령 배아(14~17일 임신)의 폐가 채취되고, 직경 1~2mm 단편으로 신장 캡슐 아래 이식되었다. 이식편 조직이 태아 폐에서 얻어졌음을 확인하기 위해, 오직 전체 폐엽이 이식편 조직의 제조를 위해 사용되었다.

이식을 받은 동물은 이식 후 2~20주에 희생되었다. 이식된 이식편을 갖는 신장이 제거되고 4% 파라포름알데히드에 고정되거나 냉동 보존되었다.

조직 단면은 헤마톡실린과 에오신(H&E)에 의해 일반적으로 염색되었다. 이식편 분화 및 기능의 평가는 조직화학 및 면역조직화학적 라벨 표시로 수행되었다.

형태적 분석( Morphometric analysis )

서로 다른 임신 연령의 인간 배아 폐는 최적의 절단 온도 화합물(OCT)에서 동결되고, 냉동 절단되었다. 연속적인 12 im 절단면이 일차 토끼 항-인간 CK5 항체(Abcam)와, 이차 당나귀 항-토끼 데이 라이트 594 항체로 염색되었다. 해당 영역은 이미지 프로 프로그램(Image Pro program)(미디어 사이버네틱스, 메릴랜드, 크로프톤)을 사용하여 정량되었다. 동일 임신 연령 폐의 적어도 3~4개 서로 다른 시료가 분석되었다.

나프탈렌 폐 손상

폐 손상 연구를 위해, 쥐는, 체중 1kg당 200㎎의, 옥수수 기름에 용해된 나프탈렌(99% 이상 순수; 시그마 알드리찌)의 복강내 주사를 맞았다 (이식 전 40~48시간).

"이중 폐" 손상에 대해서, 나프탈렌 처리 동물은 추가 조사되었다 (나프탈렌 투여 후 40~48시간): C57BL 쥐는 6 Gy TBI로 조사되고; NOD-SCID 쥐는 3-4 Gy TBI로 조사되었다.

폐 단일 세포 현탁액과 이식

세포 제조와 주사

세포 현탁액은 효소 소화된 15~24주 폐로 얻어졌다. 간략히, 폐 소화는, 0.1% 콜라게나제, 2.4 U/㎖ 디스파제(로슈 다이아그노스틱스, 인디애나, 인디애나폴리스), 및 2.5 mM CaCl₂ 존재 하에, 1시간 동안 37℃에서, 면도날로 조직을 미세하게 다져서 수행되었다. 비특이성 부스러기의 제거는 70- 및 40-㎛ 필터를 통한 순차적인 연속 여과에 의해 수행되었다.

나프탈렌(NA), TBI, 또는 이 모두를 이용한 컨디셔닝 후에, 각 동물은 조사 4~8시간 후 꼬리 혈관에 주사된, 1×10⁶ GFP-양성 배아 폐 세포로 이식되었다.

유동 세포 분석법( flow cytometry )

인간(15~24주)과 쥐(14~17주) 배아 폐 유도 단일 세포 현탁액과, 성체 쥐와 성체 인간의 단일 세포 현탁액은 다색성 유동 세포 분석법으로 분석되었다. 모든 시료는 제조업자의 설명서에 따라 결합 항체 또는 적합한 아이소타입 대조군(matching isotype control)으로 염색되었다. 항체는 바이오사이언스, BD, 및 바이오레전드의 것이었다. 연구에 사용된 항체의 완전한 목록은 아래 표 2에 요약되어있다. 데이터는 LSRII(BD 바이오사이언스) 유동 세포 분석기(flow cytometer) 상에서 얻어지고, 플로우 조 소프트웨어(Flow Jo software)(버전 7.6.5)를 사용하여 분석되었다.

면역 조직 화학( Immunohistochemistry )

동물은 이식 후 서로 다른 시점에 희생되었다; 폐는 4% PFA 용액으로 팽창되고 24시간 동안 보관된 다음, 30% 수크로오스에 냉동 보존되고 액체 공기에 의해 미리 냉각된 이소펜탄에 스냅 동결되거나(snap frozen), 또는 파라핀 포매(paraffin embedding)를 위해 처리되었다. 파라핀 블록은 4㎛ 절단부로 절단되고, 이전에 기술된 바와 같이 자일렌 탈파라핀화(deparaffinization) 및 재수화(rehydration) 후 염색되었다 [Hecht G 등, Proc Nat Acad of Sci. (2009) 106(21): 8659]. 연구에 사용된 항체의 요약은 아래 표 2에 나타나 있다. 모든 이차 항체는 잭슨 이뮤노리서치 레보러터리즈(Jackson Immunoresearch Laboratories)의 것이었다.

영상은 올림퍼스 디지털 카메라(DP70)에 의해 얻어졌고, 때로 어도비 포토샵 7.0으로 처리되었다. 모든 면역조직화학 염색을 위해, 음성 대조군은, 일차 항체를 생략하지만 라벨 표시된 이차 항체를 추가한 동일 기술을 사용하여 가동되었다.

연구에 사용된 항체의 목록

일차 항체	이차 항체
토끼 항 CK 항체 (Abcam)	항-쥐-Daylight 488
쥐 항 인간 CK18 항체 (Daco)	항-쥐-Daylight 594
쥐 항 인간 CK14 항체 (Daco)	항-시궁쥐-Daylight 488
쥐 항 인간 MNF (Santa Cruz)	항-시궁쥐-Daylight 594
쥐 항 인간 Ki-67 항체 (Daco)	항-시궁쥐-AMCA
쥐 항 인간 네스틴 항체 (MBL)	항-토끼-Alexa Fluor 488
염소 항 쥐 네스틴 항체 (Santa Cruz)	항-토끼-Cy5
토끼 항 쥐 CCSP 항체 (Abcam)	항-토끼-AMCA
토끼 항 GFP (Abcam)	항-염소-Alexa Fluor 488
닭 항 GFP (Abcam)	항-염소-Rhodamine Red
염소 항 인간 CGRP (Santa Cruz)	항-염소-AMCA
닭 항 티로신 하이드록시라제 항체 (Abcam)	항-닭-Alexa Fluor 488
토끼 항 계면활성제 단백질 C 항체 (Santa Cruz)
토끼 항 CFTR (Abcam)
Rat 항 인간 CD31 항체 (Daco)
토끼 항 쥐 CD31 항체 (Daco)
쥐 항 인간 CD11c 항체 (Daco)
토끼 항 CD20 항체 (Daco)
쥐 항 CD3 항체 (Daco)
항 쥐 Sca-PE; 항 쥐 Sca-FITC 항체 (Biolegend)
항 쥐 CD45-APC 항체 (Biolegend)
항 쥐 CD31-APC; 항 쥐 CD31-PE-Cy7 항체 (Biolegend)
항 쥐 CD326-Percp-Cy5.5 (Biolegend)
항 쥐 CD49f-FITC (Biolegend)
항 쥐 CD24-PE-Cy7 (Biolegend)
항 쥐 CD104-Pacific blue (Biolegend)
항 쥐 CD90-Pacific blue (Biolegend)
항 쥐 CD73-PE (Biolegend)
항 인간 CD45-APC-Cy77 (Biolegend)
항 인간 CD326-APC (Biolegend)
항 인간 CD117-PE (Biolegend)
항 인간 CD271-FITC (Biolegend)
항 인간 CD31-Pacific blue (Biolegend)
항 인간 CD34-Percp (Biolegend)
항 인간 CD14-PE (Mylteni)
항 인간 CD105-Pacific blue (Mylteni)
항 인간 CD2-FITC (BD)
항 인간 CD20-PE (BD)

(기록 중, 모든 이차 항체는 Jackson Immunoresearch 또는 Abcam으로부터 구입되었다)

이광자 현미경 검사법( Two - photon microscopy )

영상 촬영 전, 쥐는 안락사되거나, 또는 혈관 레이블링(vascular labeling)을 위해 혈액 트레이서(blood tracer) 퀀텀(Quantom) 도트 655 나노 입자로 주사된 다음 (I.V.) (인비트로겐 - 분자 프로브), 안락사 폐가 절개되고 유리 덮개 영상 챔버 아래에 놓였다.

펄스형 Mai Tai™ Ti-사파이어 레이저{캘리포니아, 뉴포트 코포레이션(Newport Corp.)}를 통합한 Ultima™ 다중 광자 현미경{위스콘신, 프레어리 테크놀러지스 미들턴(Prairie Technologies Middleton)}이 사용되었다. 레이저는 EGFP와 혈액 트레이서를 동시에 들뜨게 하도록 850nm로 조정되었다. 물에 잠긴 20X (NA 0.95) 또는 40X 대물렌즈(objective)(NA 0.8) 또는 10X 공기 대물렌즈(air objective)(NA 0.3)(올림푸스 사의)가 사용되었다.

대표적인 Z 스택을 생성하기 위해, GFP 세포를 함유하는 폐의 절단면은 3㎛ Z-스텝을 갖고 약 30 ~ 150㎛의 깊이에서 스캔되었다. 데이터는 Volocity^®소프트웨어(퍼킨-엘머, 영국, 코벤트리)를 사용하여 분석되었다.

마이크로- CT 영상 촬영( Micro - CT imaging )

마이크로-CT 영상 촬영은, 일반 마취법으로 수행되었다 (2.5% 2,2,2-트리브로모에탄올, 97% in PBS, 10 ml/kg 복강내 투여).

생체내 마이크로-CT 실험은 두 개의 광원-검출기(source-detector) 시스템이 장착된 TomoScope^® 30S 듀오 스캐너(CT 영상 촬영, 독일) 상에서 수행되었다. 양 튜브에서 작동 전압은 40 kV였다. 제 1 및 제 2 프로토콜의 적분 시간은 90 ms(360 회전)와 5분(3600 회전)이었고, 축방향 영상은 80㎛의 등방성 해상도(isotropic resolution)에서 얻어졌다. CT 데이터의 처리는 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.

통계 분석

그룹 사이의 차이는 스튜던츠 t-테스트에 의해 평가되었다. 데이터는, 표시된 바와 같이, 평균 ±SD 또는 평균 ±SEM으로 표시되고, 0.05 이하의 p 값에 대해 통계적으로 유효한 것으로 간주되었다.

예 1

인간 배아 폐 전구체 조직을 채취하기 위한 최적의 '창'

서로 다른 임신 시점에 채취된 인간 배아 폐 조직의 성장 잠재력

성장 및 분화 잠재력에 대한 배아 단계의 영향을 평가하기 위해, 15- 내지 24-주 인간 태아로부터 생긴 폐 배아 선조 조직이 먼저 NOD-SCID 쥐의 신피막 아래에 이식되었다. 전체적으로, 이식 후 8주 검사에서, 모든 연령의 제공자 조직의 이식편 중 98% 이상이 생존했고 모든 회복된 이식편은 증가된 크기를 입증하였으며, 회복된 이식편 어디에서도 종양 형성(neoplasia)의 증거가 없었다. 그렇지만, 제공자 조직으로 초기 또는 후기 임신 폐를 사용하여 유사한 이식이 시도되면 결과는 분명하게 달랐다.

도 1A에서 볼 수 있는 바와 같이, 20~22주에 채취된 조직(n=25, 크기는 1~3mm)은, 임신 15~19 또는 23~24주에 채취된 조직에 비해서 (각각, 61.6 +/- 3.5 mm와 10.6 +/- 2.0 mm), 이식 후 8주에 향상된 성장을 보여주었다 (300.7 +/- 15.2 mm 크기에 도달).

성장하는 폐 이식조직에서 서로 다른 구조적 특성의 정량 평가를 얻기 위해(도 1B에서 거시적으로 도시된), 형태적 분석(morphometric analysis)이 사용되었다.

도 1C ~ F에 도시된 바와 같이, 성체 인간의 폐 조직과 그 외관이 유사한, 호흡수(respiratory tree)의 모든 요소가 20~22주 조직으로부터 성장하는 이식조직에서 검출되었다. 그래서, 폐포를 갖는 폐포관(도 1C ~ F), 섬모 상피(ciliated epithelium)로 덮인 기관(trachea)(도 1E), 근육층과 연골(도 1E), 및 폐포 상피 단일층(도 1F)의 형성은 모두 성장하는 이식조직으로 표시되었다. 이와 같이, 계면활성제 단백질 C(sp-C)에 대한 염색으로 검출 가능한 (도 1G ~ H), 계면활성제를 합성하는 능력과, CFTR-낭포성 섬유증 막관통 조절기에 대한 염색으로 표시된 바와 같은 (도 1I), 이온을 운반하는 능력으로 표시된 바와 같이, 발달 이식조직의 기능 특성을 한정하는 파라미터가 분명하게 표현되었다. 전형적으로, 성숙 과정 동안 비교적 나중에 나타나는 이러한 기능 표지는 시토케라틴 18(CK 18)을 발현하는 더 분화된 요소와 일치하고, 이식 전에는 20주(w) 조직에서 발현되지 않는다 (데이터 미도시).

놀랍게도, 상기 결과와 반대로, 15주(도 1J ~ L) 또는 24주(도 1M ~ O)에 채취된 조직에서 생긴 이식조직은 낭포를 발생시켰고, sp-C와 CFTR 염색에 대해서 음성인 반면(데이터 미도시), 18주 조직에서 생긴 이식조직은, sp-C 및 CFTR에 대한 염색을 포함해서(데이터 미도시), 분화와 성숙의 모든 패턴을 나타내지만, 형성된 폐포관이 더 좁고 폐포벽이 더 두껍다는 점에서 (도 1P ~ R) 여전히 결함이 있었다. 종합하면, 이러한 결과는, 이식용 인간 배아 폐 조직을 채취하기 위한 최적의 '창'은 20 ~ 22주의 임신인 것을 제안한다.

서로 다른 임신 시점에 인간의 배아 폐 조직에서 줄기 세포 선조와 그 적소의 확인

이식을 위한 최적 '창' 인간 배아 폐 조직을 확인한 다음, 이러한 '창' 조직에서 추정 줄기 세포의 존재는 초기 또는 후기 임시 시점에 채취된 조직과 비교해서 평가되었다.

도 2A ~ D에 도시된 바와 같이, H&E 염색은, 기관지 및 세기관지 구조가 초기 시점에 채취된 조직과 비교해서 20 ~ 22주에 채취된 조직에서 더 발견되었음을 보여주었다. 이러한 조직에서 선조 레벨의 잠재력 차이를 한정하기 위해, 이전에 시토케라틴 5(CK5)와 14(CK14)를 발현하는 것으로 나타난, 기저 상피 폐 세포의 추정상 선조 부분 모집단의 존재가 검사되었다. 이러한 두드러진 표지는, 더 성숙한 CK8/CK18 양성 표현형(phenotype)의 발현과 평행하게, 발현시 하향 조정된다.

도 2E에서 볼 수 있는 바와 같이, CK5 양성 세포의 뚜렷한 빈도는 CK14의 발현과 함께 넓은 기도에서 발견되는 반면 (도 2F), 다소 더 적은 풍부함은 발달 폐포에서 발견되었다. 또한, 이러한 면역 조직학적 염색은 CK5+ 세포가 네스틴⁺ 세포로 둘러싸이고 (도 2G), 이들 중 일부는 칼시토닌 유전자 관련 단백질(CGRP)에 의해 표시된 신경 상피 소체의 특성을 나타냄을 보여주었다. 도 2H에서 볼 수 있는 바와 같이, 이러한 신경 분포(innervation)는 신경사상체(neurofilament)(NF)에 대한 염색에 의해 추가로 드러났으며, 골수와, 성체 쥐 기도에서 조혈 줄기 세포에 대해 이전에 정의된 것과 유사한 줄기 세포 적소의 아키덱쳐를 제안한다. 또한, BM 적소에 관한 최신 리포트와 일치하여, 상피 CK5⁺ 적소는 또한 알파-평활근 액틴 양성 세포(도 2I와 도 5A ~ D)와 비멘틴⁺ 간엽 세포(도 2J)를 함유했다.

중요하게, 형태 분석은, 20~22주 임신의 '창' 조직에서 CK5⁺ 선조의 상대적인 풍부함을 증명했고, 이는, 최적의 창이 보다 많은 수의 이러한 선조와 관련이 있을 수 있음을 제안한다. 그래서, 20~22주의 임신에서 채취된 조직에서, CK5⁺ 영역은, 각각 15주(w) 및 17주(w) 조직에서, 5.26%±1.06(P=0.0006) 또는 6.05%±0.18(P=0.002)와 비교해서, 평균 14.1%±5.6의 전체 폐 조직을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 2K ~ O).

종합하면, 이식을 위한 공급원으로 배아 폐를 채취하기 위한 "기회의 창"은 CK5 양성 상피 선조 세포와, 그 각각의 적소의 빈도(frequency)에 의해 부분적으로 설명될 수 있다. 다른 배아 조직에서 다른 추정 선조를 추가 조사하기 위해, FACS 분석은 다능성의(pluripotential) 인간 폐 줄기 세포에 최근 기인한 여러 표현형의 존재를 결정하기 위해 사용되었다. 특히, 두 개의 표현형에 주의가 기울여졌다. c-kit(CD117)에 대해 양성 염색되고 CD34를 포함한 많은 분화 표지에 대해서는 음성 염색된 제 1의 희귀 하부 모집단은, 주로 성체 폐 조직에서, 그러나 또한 배아 조직에서 Kajstura 등에 의해 최근 기술되었고, 저자는 이러한 세포가 모든 폐 계통에 대해서 자가 재생 능력(self-renewing capacity)[Kajstura J. 등, N Engl J Med. (2011) 364(19):1795-806; Anversa P. 등, Nat Med. (2011) 17(9):1038-9]과 재생 잠재력을 갖고, 다능성(multipotent) 폐 줄기 세포를 나타내는 것으로 제안하였다. 그러나, Suzuki 등은, 배아 폐에서, C-Kit⁺ 세포가 또한 CD34를 발현하고 내피 선조일 수 있음을 주장하여 [Moodley Y. 등, N Engl J Med. (2011) 365(5):464-6; Suzuki T. 등, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine (2010) 181 (1 Meeting Abstracts): A4898], C-Kit⁺CD34⁺ 세포의 존재가 또한 평가되었다 (도 2P ~ Z).

이를 위해, 임신 16, 18, 및 20주에 채취된, 효소 처리된 인간 배아 폐 조직으로부터 얻어진 단일 세포 현탁액은, CD34 (조혈 및 내피 선조에 대해 특이성인), CD45 (조혈 세포), CD31 (내피 세포에 대한 표지), CD117 (초기 선조를 확인하기 위한, c-KIT), CD271 (NGFR, 간엽 줄기 세포 표지), 및 CD326 (EPCAM, 상피 분화 표지)를 포함하는 여러 분화 표지의 발현을 위해 분석되었다.

놀랍게도, 비조혈, CD45 음성 모집단은, CD34^고, CD34^중간, 및 CD34^음성 세포를 포함하는, 세 개의 개별 C-Kit⁺ 선조 모집단을 포함하는 것으로 밝혀졌다 (도 2P ~ T). 후자 모집단은 초기 다능성의 성체 폐 줄기 세포와 적합하지만, 다른 CD34⁺ 세포는 높은 레벨의 CD31을 또한 발현하는 내피 계통을 향하여 더 강력하게 분화될 수 있다 (도 5A ~ I).

흥미롭게도, C-Kit⁺ CD34^음성 하부 모집단은, 초기 임신 연령(0.15% 미만) 또는 대조군으로 사용된 성체 폐 조직(0.45% 미만, 도 6A ~ L)에 비해, 20주에 채취된 조직에서 확실히 더 풍부하다 (CD34^음성 모집단의 약 2~3% 이하). Kajstura 등과 일치하여, CD31과 CD326에 대해서 또한 음성인(도 7A ~ I) 이러한 독특한 C-Kit⁺CD45^-CD34^-CD271^- 세포는 또한 면역조직학에 의해 확인될 수 있다. 그래서, 도 3A ~ C에 도시된 바와 같이, 이러한 추정 선조는, 주로 혈관주변 공간에서, 넓은 기도에 매우 인접하여 낮은 레벨로 존재하였다.

중요하게, 폐 조직이 CD117과 CD34에 대한 면역 조직학적 염색에 의하여 분석되었을 때, 여러 개별 세포 하부 모집단은 FACS 분석에 의해 발견된 것과 유사한 것으로 밝혀졌다. 20주 인간 폐의 분석은 도 4A ~ K에 나타나 있고; 대부분의 CD117⁺ 세포는 CD34를 공동 발현했고 발달 폐포를 둘러싸는 (도 4D ~ G) 혈관에 존재하는 반면 (도 4A ~ C), 소수의 CD117⁺ 단일 양성 세포 부분 모집단은 넓은 혈관 및 넓은 기도에 매우 인접한 것으로 밝혀졌다 (도 4H ~ K). FACS에 의해 드러난 전체 백분율은 20주(w) 조직에서 훨씬 더 크지만 (도 2A ~ Z), CD117+ 세포 분포의 유사한 패턴은 초기 임신 연령 폐 조직에서 발견되었다 (도 8A ~ D), 또한, 도 9A ~ D에 도시된 바와 같이, 20주 배아 조직은 폐 미세혈관 회복에서 독특한 역할을 가질 수 있는 초기 및 후기 내포 선조 세포(EPC)를 또한 나타낸다. 그래서, 이러한 조직은 두 개의 개별 CD34+CD31+ 부분 모집단을 나타내는 것으로 또한 밝혀졌다. 인간의 말초 혈액에서 이러한 두 가지 주요 유형의 EPCs 존재를 제안하는 이전 연구에 따라, 제 1 부분 모집단은 CD14와 CD45에 대한 양성 염색으로 확인된 반면, 제 2 부분 모집단은 CD45^-CD105+이다 [Yoder MC 등, Blood. (2007) 109(5):1801-9]. '초기 EPCs'라고 불린 이전의 것은, 생체외 초기 성장, CD34/CD31/CD14 양성(positivity), 마트리겔 관 형성 분석(Matrigel tube forming assay)에서 관 형성 불능, 및 높은 레벨의 시토킨 분비를 특징으로 한다. '늦은 과성장(late outgrowth) EPC', '과성장 내피 세포(OECs)' 또는 '내피 군락 형성 세포(ECFC)'라고 불린 다른 유형의 EPC는, CD31과 CD105 양성, CD45와 CD14 부족, 및 면역결핍 쥐에 젤로 이식되었을 때 인간 혈관을 자발적으로 형성하는 독특한 능력(체순환의 쥣과 동물의 혈관과 통합되는)을 특징으로 한다.

예 2

'창' 배아 폐 이식의 재생 잠재력을 위한 쥐 모델에서 개념의 증명

이식용 쥐 배아 폐 전구체 조직을 채취하기 위한 최적의 '창'

적절한 쥐 모델에서 배아 폐 유도 조직의 치료 잠재력을 평가하기 위해, 이식용 쥐 배아 폐를 채취하기 위한 최적의 '창'이, 그 인간 상대에 관해서, 초기에 정의되었다. 그래서, 쥐 폐 배아 조직은 서로 다른 임신 시점에 채취되었고 (E14 ~ E17), 동계 쥐의 신장 캡슐 아래에 이식되었으며, 이식 후 8주, 이식조직은 폐 유조직, 기관지 및 폐포 구조의 존재뿐만 아니라, 원치 않는 섬유증과 낭포의 존재를 위해 평가되었다.

도 10A ~ E에서 볼 수 있는 바와 같이, 피막 아래(sub-capsular) 신장 이식 12주 후, E14와 E17 폐 조직은 낭포성 및 섬유증 조직의 형성을 일으키는 반면(도 10A ~ B), E15 ~ E16 쥐 배아 폐는 추가 분화하고 폐포 단계에 도달하기 위한 두드러진 잠재력을 나타내었다 (도 10C ~ E). 그래서, 인간 폐 조직과 유사하게, 폐 발달의 세관 단계(canalicular stage)는 이식용 조직을 채취하기 위한 최적의 창을 제공한다 (도 10F). 또한, 인간 '창' 조직과 유사하게, E16 폐 조직은 폐포를 나타내지 않았다 (도 11A); CK-5 양성 세포는 넓은 기도에 풍부하고, 여러 신경상피 소체는 CGRP에 대해 양성으로 염색된 전체 시료 내에서 발견되고 골수 및 성체 쥐 폐와 유사하게 (도 12A ~ F) 적소에 국한되었다 (도 11B). 이와 마찬가지로, CCSP-양성 세포는, 네스틴-양성 세포에 풍부한 (도 11C) (줄기 세포 적소를 암시함) 넓은 기도 영역에서 발견되었고, 알파-SMA 양성 세포에 의해 둘러싸였다 (도 11D).

또한, 이들의 인간 대상과 유사하게, E15 ~ E16 조직은, 최근에 성체 쥐 폐에서 추정상의 폐 선조로 확립된 CD45^-CD31^-EpCAM⁺CD24⁺CD49f⁺CD104⁺ 세포의 FACS 분석에 의해 나타난 바와 같이, 초기 또는 후기의 임신 조직과 비교해서 추정상의 선조가 풍부하였다 [McQualter JL 등, Proceedings of the National Academy of Sciences. (2010) 107(4):1414]. 그래서, E13, E14, E15, 및 E16 단일 세포 현탁액의 대표적인 FACS 분석을 도시하는 도 3E ~ Y에서 볼 수 있는 바와 같이, E13과 E14 조직에서의 레벨과 비교해서 (각각, 0.002±0.00057%와 0.012±0.0057%), 두드러지게 더 높은 레벨의 CD45^-CD31^- EpCAM⁺ CD24⁺CD49f⁺CD104⁺ 세포가 E15와 E16 폐 조직에서 발견되었다 (각각, 0.062%±0.007과 0.073%±0.005).

폐 손상을 치료하기 위한 E16 쥐 배아 폐 세포의 이식

E15 ~ 16 조직이 이식시 분명한 성장과 분화 잠재력을 나타내는 것을 고려하면, 이러한 '창' 조직은 폐 손상을 위한 쥐 모델에서 추가로 평가되었다.

이를 위해, 이러한 세포는 처음에는 이전에 기술된 바와 같이 나프탈렌을 이용한 손상 유발에 기초한 모델에서 평가되었다 [Stripp B 등, American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. (1995) 269(6):791]. 이러한 폐 손상 모델은 폐의 클라라 세포의 발현의 변화에 의해 검출될 수 있는 경미한 상피 손상에 의해 발생한 폐 질병을 모의한다.

호흡 기관지 및 기관지-폐포 연결부에서 클라라 세포의 특별한 해부학적 국부화는, 나프탈렌 노출 후 손상 부위를 정확하게 배치하고, 동계 수용자에서 손상된 상피층을 군락으로 만들고 복구하기 위해 배아 "창" 세포의 단일 세포 현탁액의 능력을 시험할 수 있도록 한다.

나프탈렌 투여 이틀 후에, 수용자 C57BL 쥐는 GFP 양성 임신 쥐로부터 얻어진 1 × 10⁶ E16 폐 세포가 주입되었다. 이후, 처리된 쥐의 폐는 GFP 양성 세포의 존재를 위해 서로 다른 시점에 조직학적으로 평가되었다. 이러한 초기 실험(나타나지 않음)은 나프탈렌에 의한 클라라 세포의 제거가 일시적이고 제공자 유도 클라라 세포의 중요한 이식과 발달을 가능하게 할 수 없음을 드러냈다. 그래서, 본 발명자는, 더 공격적인 컨디셔닝 요법, 보다 효과적으로 제거하는 고유 줄기 세포 증식은, 골수 이식 후 키메리즘 유발을 측정하는 연구에서 일반적으로 발견된 바와 같이, 제공자 세포의 재생 능력을 평가하기 위해 필요할 것으로 가정하였다.

이러한 가정을 시험하기 위해, 나프탈렌 손상에 이어 40시간, 동물들은, 이전의 나프탈렌 처리에 의해 증식하도록 잠재적으로 유도된 정주 폐 줄기 세포를 제거하기 위해 아치사 TBI(6 Gy)로 추가 처리되었다.

1일 후, 쥐는 E16 폐 세포를 투여받고, 이들의 폐에서 제공자-유도 세포의 이식 및 발달을 위해, 형태적 분석과 결합된 면역 조직학적 염색뿐만 아니라, 2-광자 현미경 검사법이 이어졌다.

도 13A ~ C에 도시된 바와 같이, 수용자 폐에서 제공자-유도 세포의 이식(engraftment)을 보여주는 GFP 양성 '패치'는, TBI 단독(도 13A), 또는 나프탈렌 단독(도 13B)에 비해서, 나프탈렌과 6 Gy TBI(도 13C) 모두로 컨디셔닝된 쥐에서, 이식 후 30일에 현저하게 향상되었다. 폐 키메리즘 레벨에 대한 컨디셔닝의 이러한 현저한 영향은, 각 그룹에 총 9마리의 쥐를 포함하는 세 개의 독립된 실험에서 발견된 GFP 패치의 형태적인 분석을 도시하는, 도 13D에서 정량적으로 입증되었다. 그래서, 55 foci/mm³ 제공자-유도 병소(foci)는 나프탈렌과 6 Gy TBY로 컨디셔닝된 쥐에서 발견되었고, 오직 10~12 foci/mm³ 및 2~3 foci/mm³은 각각 나프탈렌 또는 TBI 단독으로 컨디셔닝된 쥐에서 발견되었다.

키메릭 폐를 나타내는 쥐의 면역 조직학적 검사는, 수용자 쥐에서 기능적 요소 안으로의 통합 레벨을 추가로 보여주었다. 도 14A에 도시된 바와 같이, 미처리된 대조군 쥐의 넓은 기도의 내강(lumen)은 CCSP⁺ 클라라 세포의 존재를 나타내었고, 이러한 세포는 컨디셔닝 후 즉시 절제 및 박피(peeling)를 거쳤다 (도 14B). 그러나, 이식받은 쥐는, 선택 컨디셔닝 후, 이식 후 30일에, 새로운 상피층의 형성을 나타냈고, 이식된 GFP⁺ 세포는 기관지 내강에서 발견되었다. 이러한 제공자 유도 GFP⁺ 세포는 호스트 기관지 및 폐포 기도 안으로 통합되고, V-카데린(cadherin)에 대한 염색에 의해 나타난 바와 같이, 혈관이 형성되었다 (도 14C); 이들은 또한 CCSP를 발현하였고 (도 14D ~ F), Sp-c (도 14G ~ I) 및 CFTR 발현 (도 14J ~ L)에 대해서 양성이었으며, 이는, 계면활성제를 생성하고 이온 운반에 참여하는 이들의 능력을 암시한다. 예상된 바와 같이, 이러한 특정한 기능 표지는 이들의 위치에 따라 이식된 GFP⁺ 세포에 의해 다르게 나타났다. 그래서, 넓은 기도에서는, 세포는 CCSP에 대해 양성이었고, 폐포에서, 이식된 세포는 sp-C에 대해 양성이었지만, 모든 세포는 CFTR을 발현하는 것으로 밝혀졌고, 이는 남포성 섬유증(CF)의 잠재적인 교정을 위해 특히 중요하다.

흥미롭게도, 이식 후 추후 시험시, 초기 병소는 분명히 크기가 성장하여 이식된 폐의 더 많은 부분을 점유한다. 이는, 2-광자 현미경 검사법에 의해 추가 증명되었고, 2-광자 현미경 검사법은 형광 혈관 레이블링을 위해 적색 퀀텀(Quantom) 도트로 혈관을 생체 공동 염색(intravital co-staining)하거나 하지 않고 (데이터 미도시), 희생 후 즉시 폐의 직접적인 관찰을 가능하게 한다. 도 15A ~ C에서 볼 수 있는 바와 같이, 제공자 유형 세포에 의한 폐의 적절한 이식은 이식 후 6주에 발견되었지만, 기관지-폐포와 혈관 구조에서 이식된 GFP⁺ 세포의 뚜렷한 통합을 갖고 (도 15A ~ B), 폐 조직의 거의 3분의 1을 차지하는 제공자 유형 세포의 추가 진행은 이식 후 4개월에 발견되었다 (도 15C).

또한, 이식 후 16주에 이러한 키메릭 폐의 면역 조직학적 평가는, 혈관 계면의 가스 교환 표면과 폐포 상피 구조에서, 제공자 유도 세포의 완전 통합을 보여주었다 (도 16A ~ L). 그래서, GFP⁺ 세포는, CD31 및 항-팬-시토케라틴 항체를 이용한 삼중 염색에 의해 이식된 폐의 혈관 및 상피 구획에 통합된 것으로 밝혀졌다 (흉터 또는 섬유증의 표시 없이) (도 16A ~ D 및 도 17A ~ E). 마찬가지로, AQP(도 16E ~ H)와 SP-C(도 16I ~ L) 염색은, 각각, 타입 I과 타입 II 폐포세포의 가스 교환 표면에서 제공자 유도 세포의 통합을 나타내었다.

종합적으로, 이러한 결과는, '창' 조직으로부터 채취된 배아 폐 세포가 폐 조직 회복을 위한 새로운 세포 공급원을 공급할 수 있음을 강력하게 암시한다. 또한, 이러한 세포를 이용한 치료는, 호스트 폐 선조가 진행성 손상에 의해 현저하게 제거된 임상 상황에서는 덜 치명적일 수 있지만, 아치사 컨디셔닝과 결합되면 더 효과적일 것으로 예상된다.

나프탈렌 및 TBI 를 이용한 폐 손상 유발에 이어, 20~22주(w) 인간 배아 폐에서 얻어진 단일 세포 현탁액을 NOD - SCID 쥐에 이식하기

손상된 폐 안으로 통합되는 '창' 인간 배아 폐 세포의 능력을 조사하기 위해, 폐 손상 모델이 면역 결핍성 SCID 쥐에 정하여 졌다.

NOD-SCID 쥐가 TBI에 더 민감한 것을 고려하면, 상술한 바와 같이, 쥐 제공자-조직을 이용한 연구에서 6.0 Gy TBI 대신 3.0 GY TBI가 사용되었다. 또한, 유전자 GFP 레이블링에 대한 대체물로, 호스트와 제공자 상피, 내피, 및 간엽 세포를 구분하기 위해 쥐와 인간 특이성 항체를 이용한 면역 조직학이 사용되었다.

그래서, NA 단독으로 컨디셔닝된 NOD-SCID 쥐에 20주(w) 인간 배아 폐 세포의 효소 소화 후 채취된 1×10⁶ 세포를 주입하는 것은 임의의 감지할 수 있는 정도의 이식 레벨을 나타내지는 않지만 (데이터 미도시), 나프탈렌으로 컨디셔닝되고 3.0 GY TBI로 후속 처리된 NOD-SCID 쥐에 동일한 수의 세포를 주입한 후 (도 18A ~ I 및 19A ~ F), 현저한 키메리즘이 얻어졌다.

처음 단기간의 실험에서, 인간 배아(20주) 폐-유도 단일 세포 현탁액은 트래킹 형광 염료인, 5-(and-6)(((4-클로로메틸)벤조일)아미노)테트라메틸로다민)(CMTMR)으로 염색되고, 세포는 컨디셔닝된 NOD-SCID 쥐에 주입되었다. 2주 후 검사시, 이식된 인간 세포는, 동계 이식 모델에서 발견된 GFP⁺ 패치와 유사하게 (도 24B), 수용자 쥐의 폐에서 개별 패치 내에 보일 수 있었다 (도 24A). CMTMR 염색은 일시적이기 때문에, 대조군 인간 조직과 교차 반응성이 없는 항-쥐 MHC 항체를 사용하고 (도 24C ~ E), 대조군 쥐 조직과 교차 반응성이 없는 항-인간 시토케라틴 MNF 116 항체(인간 상피 세포를 염색하는)를 사용하는 (도 24F ~ H에서 이중 염색에 의해 입증된 바와 같이) 면역 조직학적 염색에 의해, 이식 후 나중 시점에 인간 세포와 쥐 세포를 구별하기 위해 제 2 세트의 실험이 실행되었다.

중요하게도, 이식 후 6주에, 이러한 항체를 사용한 이중 염색은 분명하게 유효 레벨의 키메리즘을 나타내었다. 저 배율의 쥐 기관지를 도시하는 도 18A ~ C에서 볼 수 있는 바와 같이, 쥐와 인간 표지를 이용한 이중 염색은, 인간 유도 세포가 폐 구조로 통합되는 것을 분명하게 입증하고, 이것은 고 배율의 두 개의 서로 다른 영역 아래에서 추가로 인식될 수 있다 (각각, 도 18D ~ F 및 18G ~ I).

제 3 세트의 실험에서, 20주(w)에 채취된 인간 배아 폐 세포는 NA 및 약간 더 많은 TBI(4 Gy)로 처리된 NOD-SCID로 이식되었다.

쥐 폐는 이식 후 7주에 추가 구분 항-쥐 및 항-인간 표지로 염색되었다. 그래서, 쥐 항-인간 시토케라틴 MNF 116 항체(인간 상피 세포를 염색하는), 쥐 항-인간 V9(기질 세포를 대표하는 비멘틴 9를 염색하는), 및 쥐 항-인간 CD31(내피 세포를 염색하는)은 함께 혼합되고 조직 절단면에 놓였다; 다음으로, 절단면은 데이라이트 488(녹색)로 라벨 표시된 제 2 항-쥐 IgG 항체로 배양되었다. 도 19A와 19D는 쥐 폐의 기관지 구조에서 인간 조직의 이러한 항체 칵테일에 의한 선택적인 염색을 보여준다. 쥐 폐에서 쥐 기원의 세포는 반데리아 렉틴으로 염색되었다. 후자는 쥐 상피 및 내피 세포 상에 발현된 α-Gal 부분에 결합하는 것으로 알려져 있고, 볼 수 있는 바와 같이, 단독으로 감시되거나 (도 19B와 19E), MNF 염색과 함께 감시될 때 (도 19C와 19F) 인간 조직과 교차 반응성이 없다. 또한, 유사한 표지를 사용하면, 두드러진 키메리즘이 이식된 쥐의 폐포에서 또한 검출될 수 있었다 (도 20A ~ F). 중요하게도, 인간 배아 세포의 이식으로부터 유도된 인간 폐 세포는 또한 여러 중요 기능성 표지를 나타내는 것으로 밝혀졌다.

도 21A ~ C에서 볼 수 있는 바와 같이, 시토케라틴의 일반적인 표지와 함께 상술한 칵테일에 의해 녹색으로 표시된 인간 세포의 이중 염색은(도 21A), 쥐와 인간 모두의 기원의 모든 상피 세포의 염색을 일으키고(도 21B), 이는, 이식된 폐에서 인간 세포 모집단 내에 개별 상피 세포를 예시한다 (도 21C). 이와 마찬가지로, 타입 I 폐포세포를 대표하는 아쿠아포린-5(AQP-5)에 대해 양성인 인간 세포와(도 22A ~ C), 타입 II 폐포세포를 특징을 이루는 계면활성제 단백질 C(SP-C)에 대해 양성인 인간 세포(도 23A ~ F)는, 이식 후 7주에 이식된 동물의 키메릭 폐 내에서 분명하게 구별되었다.

그래서, 인간 유도 폐 세포는 손상된 쥐 폐와 통합될 뿐만 아니라, 가스 교환을 수행하는데 필요한 AQP-5, 또는 SP-C를 발현하고, 이는, 폐포에 의한 계면활성제의 생성을 나타낸다.

배아 폐 유도 줄기 세포로 처리하는 것은 기형종 발달과 관련이 없다

배아 줄기 세포 이식에서 그 임상 적용을 제한하는 가장 논쟁점 가운데 하나는, 이식된 조직의 잠재적인 종양 형성(tumorigenicity)이다. 본 발명자가 서로 다른 돼지 배아 전구체 조직에 대해 최적의 '창'을 정의하도록 시도한 이전 연구에서, 결과는, E28 이상에서, 시험한 어느 조직도 기형종 형성에 대한 어떠한 위험도 나타내지 않았음을 보여주었다 [Eventov-Friedman S 등, Proceedings of the National Academy of Sciences. (2005) 102(8):2928]. 그래서, 배아 폐가 배아 발생(embryogenesis)에서 늦게 발생하고, 이에 따라, 쥐, 돼지, 또는 인간 배아 폐 조직에 대한 선택의 '창'이 비교적 늦은 단계의 임신을 대표함을 고려하면, 이러한 전구체 조직과 연관된 기형종 유발에 대한 위험은 매우 낮을 것 같다. 그러나, 이러한 중요한 문제를 추가 검증하기 위해, 이식 후 12개월까지 이식된 쥐(n=30)의 상세한 조직학적 분석이 수행되었고; 이식된 폐 조직에서 임의의 종양의 증거가 발견되지 않았다. 또한, 폐 마이크로-CT(해상도 80㎛)에 의한 이식된 쥐의 장기간 추적은 이러한 쥐에서 의심되는 어떠한 공간 점유 병변도 나타내지 않았다. 대표적인 영상을 이용한 이러한 결과의 요약은 도 25A ~ D에서 증명된다.

토의

본 결과는, 세관 단계에서 얻어진 쥐 또는 인간의 폐 배아 조직이 이식에 의해 조직 교체를 위한 최적의 공급원을 제공할 수 있음을 예시한다. 또한, 초기 선조에 풍부한 인간 배아 폐는 그 특성이 골수 및 제대혈의 조직과 유사하고, 조혈 질병에서 이식을 위한 그 사용은 지난 10년간 극적으로 증가했다. 동계 또는 SCID 쥐에 이식시 최적의 성장과 분화를 나타낸 '창' 배아 조직은, 초기 또는 후기 임신 시점의 조직과 비교해서, 여러 상피, 간엽, 및 내피 선조에 대해 매우 풍부했다. 또한, 그 각각의 배아 조직에서 이러한 초기 선조의 상세한 분석은, 골수에서 조혈 줄기 세포 적소에 대해 광범위하게 기술된 것과 유사하게, 상피 선조가 특정 적소에 존재함을 보여주었다. 그래서, 본 결과는, 추정상의 폐 선조 세포에 인접하게, CGRP 및 신경사상체를 위한 양성 염색에 의해 발견된 바와 같이, 전형적으로 신경이 분포되어 있는 내피 세포, 네스틴-양성 세포, 및 간엽 세포의 회합을 증명하였다. 이러한 결과는 성체 쥐 폐에서 줄기 세포 적소의 잠재력 존재를 나타내는 연구와 일치한다 [Engelhardt JF. American journal of respiratory cell and molecular biology. (2001) 24(6): 649-52].

인간의 배아 폐 선조 적소의 외관과 서로 관련시키는, 이식에서 태아 조직을 사용하기 위한 최적의 창을 한정하는 것 외에, 본 연구는 또한 인간 폐 선조의 표현형에 관해서 계속되는 논쟁을 강조한다. 그래서, Kajstura 등은 [Kajstura 등 2011, supra] 다른 모든 표지에 대해 음성이고 넓은 기도 구조에 인접한 독립된 혈관 주변 영역에 존재하는 c-kit⁺ 세포의 작은 모집단을 기술하였지만, 본 발명자는 발달 폐포에서, Suzuki 등(Suzuki 등 2010, supra)에 의해 제안된 바와 같이, CD34와 CD31 항원 모두를 발현하는 CK5⁺ 선조에 인접하게 혈관에 존재하는 다른 c-kit⁺ 세포 모집단을 발견하였다. 그래서, 여기에 특징이 기술된 '창' 폐 배아 조직은 추정상의 c-kit 양성 선조 모집단 모두를 함유한다. CK5⁺ 상피 선조와 c-kit 양성 세포의 근접성 및 잠재적인 상호작용은, c-kit 트리거링이 폐포 구조의 정상적인 발달과 유지에 아주 중요하다는 최근의 제안과 일치한다 [Lindsey JY 등, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. (2011) 183 (1 MeetingAbstracts): A2445].

중요하게도, "최적의 세관 창" 조직은 초기 발달 단계의 폐 조직에 대해서 모든 유형의 선조의 가장 높은 레벨을 나타내고; 그래서, 본 발명자는, 골수 이식에 사용된 방법론과 유사하게, 분할되지 않은 세포 혼합물의 정맥 이식이 바람직한 접근일 수 있음을 가정하였다. 실제, E15 ~ E16 쥐 폐 또는 20~22주(w) 인간 폐 조직의 단일 세포 현탁액의 이식은 나프탈렌과 6.0 Gy 아-치사 TBI를 결합시켜 유발된 폐 손상 후에 이러한 세포의 현저한 재생 능력을 증명하였다. 결정적으로, 이식 전 이러한 레벨의 컨디셔닝은, 나프탈렌을 이용한 손상 유발 후에 발견된 바와 같이, 호스트 폐 선조가 유효 레벨로 존재시 키메리즘을 설정하는데 필요하였다. 유사한 관찰은 최근에 Duchesneau 등에 의해 이루어졌는데 [Duchesneau P 등, Molecular Therapy. (2010) 18(10): 1830-6], 이는 폐 구조에서 골수 유도 세포의 이식이 나프탈렌 외에 골수 소멸제인 부설판(busulfan)을 사용하는 컨디셔닝의 강화에 의해 현저히 향상될 수 있음을 입증하였다. 명백히, 컨디셔닝을 위한 이러한 요건은, 병리학적 과정에 의해 영향을 받은 호스트 선조에 대한 폐 손상의 레벨에 따라, 서로 다른 임상 상황에서 그 세기가 달라질 수 있다.

종합하면, 본 결과는, 호스트 폐의 서로 다른 구획에서 강력한 이식과 다음 요소를 포함하는 전체 호흡 단위의 형성을 보여주었다: a) GFP⁺ CCSP⁺ 세포에 의해 드러난 바와 같이, 좁은 세기관지에 새롭게 형성된 상피 세포, b) 폐포 내에서 가스 교환 표면을 위해 중요한 폐포세포 타입 1 세포(GFP⁺AQP-5⁺), c) 폐포에서 계면활성제 생성을 위해 중요한 폐포세포 타입 2 세포(GFP⁺ Sp-C⁺), d) 맥관 구조(vasculature)에서 GFP⁺ CD31⁺ 세포의 확고한 존재. 또한, 이식된 조직은 호흡 요소와 함께 이온 운반(특히, CF 환자에 결정적인)에 필요한 CFTR의 발현을 나타낸다.

각각의 약품 단독으로 컨디셔닝하는 것과 반대로, "이중 손상" 후 이러한 다소 극적인 이식은, 그 각각의 적소에 대해 호스트와 제공자 선조 사이의 경쟁으로 설명될 수 있다. Reynolds 등은 [Reynolds SD 등, American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. (2004) 287(6): L1256-65], 나프탈렌에 의한 CCSP-발현 세포 모집단의 제거가 2차 폐포 염증, 부종, 및 폐포 타입 II 세포 모집단의 소모를 일으킴을 증명하였다. 그래서, 선택성 기도 손상은 심각하게 손상된 폐포 기능을 특징으로 하는 질병에서 손상을 자극하는 것으로 작용할 수 있다. 또한, Volscaert 등은 [Volckaert T 등, J Clin Invest. (2011) 121(11):4409], Wnt/Fgf10 배아 신호 캐스캐이드(embryonic signaling cascade)는, 노치 신호(Notch signaling) 및 후속하는 상피 대 간엽 전이를 활성화하는 방식으로, 나프탈렌 유발 손상 후 성숙한 부기관지(parabronchial) 평활근 세포(PSMCs)에서 재활성화되는 것을 증명하였다; 이러한 발견은, 이러한 배아 경로의 활성화가 서로 다른 폐 구획에서 배아 폐-유도 조직의 효율적인 통합을 위한 트리거로 작용할 수도 있음을 가리킨다. 마찬가지로, 방사선-유발 폐 손상은 혈액-허파꽈리 장벽의 고장과 미소 순환 기능 장애(microcirculation dysfunction)를 일으켜서, 제공자-유도 내피 세포(45-47)의 지배를 가능하게 할 수 있는 것으로 보였다.

관련된 메커니즘에 관계없이, 기관지와 폐포 구조 모두에서 얻어진 제공자 유도 세포의 쥐 모델에서 현저한 이식이 두드러진다. 시간에 따라 증가하는 이러한 키메리즘은, 초기 자가-재생 다능성 줄기 세포의 자손(progeny)이 더 나중의 전구체로부터 유도된 호스트 또는 제공자 세포를 점진적으로 대체할 수 있도록 하는, 이식된 배아 폐 조직에서 다중 제공자 선조에 기인할 수 있다.

이 시스템에서, 쥐 시토킨과 크로스토크(cross-talk)의 잠재적인 손실이 이식을 감소시킬 수 있지만, NOD-SCID 쥐에서 인간 폐 선조를 시험하면 유사한 폐 통합과 발달이 또한 관찰되었다. 그래서, 3 세트의 실험에서, 본 결과는, 제공자-유도 인간 세포가 기관지와 폐포 구조 모두에 결합하는 것을 예시하고, 이는 동계 배아 쥐 폐 세포에 대해 상술한 것과 유사한 특징을 나타낸다.

추가 연구는 동종 수용자에게서 성공적인 이식을 가능하도록 하는 최적의 면역 억제 프로토콜을 한정하기 위해 필요하다. 일반적으로, 초기 배아 단계는 이식된 제공자 조직이 면역성이 약해지도록 할 수 있지만, 배아 조직 이식은 간접적인 거부 경로를 벗어날 수 없다. 그렇지만, 이러한 도전은 동시 자극 차단을 유발하는 약품을 포함하는 프로토콜에 의해 처리될 수 있다. 대안적으로, 배아 폐 조직에서 조혈 선조의 명료한 레벨(공개되지 않은 결과)은 이식 후 제공자 유도-폐 세포를 향하여 중앙 내성(central tolerance)을 유발할 수 있는 조혈 키메리즘을 생기게 할 수 있다. 또한, 이식 이용 가능성을 크게 향상시킬 수 있는 20~22주(w) 폐 조직의 냉동 보존 단일 세포 현탁액의 가능성은, 제대혈에 관하여 HLA 유형 제공자의 은행을 또한 설립할 수 있도록 하여, 면역 억제 요건을 잠재적으로 줄일 수 있다.

마지막으로, 본 발명의 '창' 쥐 배아 조직은, 이식 후 연장된 기간 동안 따르면, 고 해상도(80㎛) 마이크로-CT뿐만 아니라, 추적 기간의 종료시 병리학적 검사에 의한 기형종의 위험을 나타내지 않았다.

요약하면, 본 결과는 처음으로, 임신의 세관 단계가 재생 이식을 위해 쥐와 인간 배아 폐 전구체 조직을 채취하기 위한 최적의 '창'을 제공함을 증명한다. 기형종 위험이 없는 이 조직은, 골수에서 HSCs와 유사하게, 그 각각의 적소에서 면역 조직학에 의해 확인된 여러 선조 유형에 대해 매우 풍부하다. 분명한 이식, 분화, 및 손상된 폐에 대한 이러한 선조의 강력한 통합은, 배아 폐 조직의 효소 소화에 의해 제조된 단일 세포 현탁액의 주입에 의해 제공될 수 있다. 골수 이식에서와 같이, 폐 키메리즘의 유발은 호스트 유형의 내생 전구체와의 경쟁을 줄이기 위해 컨디셔닝의 일부 형태에 의존한다. 다능성 줄기 세포를 성체 폐로부터 격리하고 이러한 세포를 재생 이식을 위한 배양에서 확대하기 위한 여러 시도가 옹호되었지만, 본 결과는 임신 20~22주에 채취된 배아 폐 조직이 잠재적으로 폐 회복을 위해 보다 간단한 대안적 양식을 제공할 수 있음을 증명한다.

본 발명은 그 특정 실시예와 함께 기술되었지만, 많은 대안, 수정, 및 변형은 이 기술 분야의 당업자에게 명백할 것이 분명하다. 따라서, 첨부된 청구항의 사상과 넓은 범위 내에 속하는 이러한 모든 대안, 수정, 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다.

이 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원서는 완전히 이 명세서에 의해/이 명세서로, 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원서가 본 명세서에 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 같은 정도로, 본 명세서에 포함된다. 또한, 이 출원서에서 임의의 참조를 인용 또는 확인하는 것은 이러한 참조가 본 발명에 대한 종래 기술로 이용 가능함을 인정하는 것으로 해석되지 않을 것이다. 섹션 제목이 사용된 정도까지, 반드시 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

Claims (55)

1. 포유류 태아 폐 조직으로부터 세포 현탁액의 격리된 모집단을 활성 성분으로 포함하는 약제 조성물(pharmaceutical composition)에 있어서,
   상기 태아 폐 조직은, 약 20 내지 약 22주의 임신 범위로부터 선택된 임신 단계에서 인간 폐 기관/조직의 발달 단계에 대응하는 발달 단계에 있는, 약제 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 임신 단계는 20 내지 21주의 임신인, 약제 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 임신 단계는 21 내지 22주의 임신인, 약제 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 포유류 태아 폐 조직은 인간의 조직인, 약제 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 세포 현탁액의 상기 격리된 모집단은 세포의 불균질 모집단을 포함하는, 약제 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 세포 현탁액의 상기 격리된 모집단은 선조 세포(progenitor cell)를 포함하는, 약제 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 선조 세포는, 상피 선조 세포(epithelial progenitor cell), 간엽 선조 세포(mesenchymal progenitor cell), 및 내피 선조 세포(endothelial progenitor cell)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제 조성물.
8. 제 5항에 있어서, 상기 세포는, 시토케라틴(cytokeratin) 5+(CK5+) 표지 발현(marker expression)을 포함하는, 약제 조성물.
9. 제 5항에 있어서, 상기 세포는, 시토케라틴 5+(CK5+) 및 시토케라틴 14+(CK14+) 표지 발현을 포함하는, 약제 조성물.
10. 제 5항에 있어서, 상기 세포는, c-Kit+ CD45- CD34- CD31- CD326- CD271- 표지 발현을 포함하는, 약제 조성물.
11. 제 5항에 있어서, 상기 세포는, c-Kit+ CD34+ CD31+ 표지 발현을 포함하는, 약제 조성물.
12. 제 5항에 있어서, 상기 세포는, c-Kit+ CD34+ CD326+ 표지 발현을 포함하는, 약제 조성물.
13. 제 5항에 있어서, 상기 세포는, CD34+ CD31+ CD14+ CD45+ 표지 발현을 포함하는, 약제 조성물.
14. 제 5항에 있어서, 상기 세포는, CD34+ CD31+ CD45- CD105+ 표지 발현을 포함하는, 약제 조성물.
15. 제 5항에 있어서, 상기 세포는, 네스틴(nestin)+ 및/또는 칼시토닌(calcitonin) 유전자 관련 단백질+(CGRP+) 표지 발현을 포함하는, 약제 조성물.
16. 제 5항에 있어서, 상기 세포는, 알파 평활근 액틴(alpha smooth muscle actin)+(알파-SMA+) 및/또는 비멘틴(Vimentin)+ 표지 발현을 포함하는, 약제 조성물.
17. 제 5항에 있어서, 상기 세포는, 구조/기능적 폐 조직을 재생시킬 수 있는, 약제 조성물.
18. 제 17항에 있어서, 상기 구조/기능적 폐 조직은, 키메릭 폐(chimeric lung)의 발생을 포함하는, 약제 조성물.
19. 제 18항에 있어서, 상기 키메릭 폐는, 폐포(alveolar), 기관지 및/또는 세(細)기관지(bronchiolar) 구조, 및/또는 혈관 구조(vascular structure)의 형성을 포함하는, 약제 조성물.
20. 제 17항에 있어서, 상기 구조/기능적 폐 조직은, 계면활성제를 합성하는 능력 및/또는 이온을 운반하는 능력을 포함하는, 약제 조성물.
21. 제 5항에 있어서, 상기 세포는, 상피, 간엽 및/또는 내피 조직을 재생할 수 있는, 약제 조성물.
22. 제 21항에 있어서, 상기 세포는, CFTR 발현 상피 세포인, 약제 조성물.
23. 필요로 하는 피험자에게서 상피, 간엽 및/또는 내피 조직을 재생하는 방법에 있어서,
    상기 방법은, 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 약제 조성물 치료 유효량을 상기 피험자에게 투여하여, 상기 상피, 간엽 및/또는 내피 조직을 재생하는 단계를
    포함하는, 방법.
24. 제 23항에 있어서, 상기 상피 조직은, 폐 조직, 위장관 조직, 생식 기관 조직, 요로 조직, 신장 조직, 피부 조직, 심장 조직, 허혈성 조직(ischemic tissue), 및 뇌 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
25. 제 23항에 있어서, 상기 간엽 조직은, 림프 조직, 순환계 조직, 및 결합 조직(connective tissue)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
26. 제 23항에 있어서, 상기 내피 조직은, 림프 조직과 순환계 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
27. 상피, 간엽 및/또는 내피 조직의 재생이 이를 필요로 하는 피험자에게서 유익한 질병 또는 병을 치료하는 방법에 있어서,
    상기 방법은, 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 약제 조성물 치료 유효량을 상기 피험자에게 투여하여, 상기 상피, 간엽 및/또는 내피 조직의 재생이 유익한 상기 질병 또는 병을 치료하는 단계를
    포함하는, 방법.
28. 필요로 하는 피험자에게서 폐질환 또는 손상을 치료하는 방법에 있어서,
    상기 방법은, 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 약제 조성물 치료 유효량을 상기 피험자에게 투여하여, 상기 폐질환 또는 손상을 치료하는 단계를
    포함하는, 방법.
29. 제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 전에 상기 피험자를 아치사(sublethal), 치사(lethal) 또는 과치사(supralethal) 컨디셔닝 프로토콜 하에 컨디셔닝하는 단계를 더 포함하는, 방법.
30. 제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥 경로에 의해 실행되는, 방법.
31. 제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는, 기관내(intratracheal), 기관지내(intrabronchial), 폐포내(intraalveolar), 정맥내, 복강내(intraperitoneal), 비강내(intranasal), 피하(subcutaneous), 골수내(intramedullary), 척추강내(intrathecal), 심실내(intraventricular), 심장내(intracardiac), 근육내, 장막내(intraserosal), 점막내, 점막 관통(transmucosal), 경비(transnasal), 직장, 및 장내로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로에 의해 실행되는, 방법.
32. 제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 전, 상기 투여와 동시에, 또는 상기 투여 후에 면역억제 식이요법(regimen)으로 상기 피험자를 치료하는 단계를 더 포함하는, 방법.
33. 상피, 간엽 및/또는 내피 조직의 재생이 이를 필요로 하는 피험자에게서 유익한 질병 또는 병을 치료하는데 사용하기 위한 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 약제 조성물.
34. 필요로 하는 피험자에게서 폐질환 또는 손상을 치료하는데 사용하기 위한 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 약제 조성물.
35. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화되는, 약제 조성물.
36. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 조성물은, 기관내, 기관지내, 폐포내, 정맥내, 복강내, 비강내, 피하, 골수내, 척추강내, 심실내, 심장내, 근육내, 장막내, 점막내, 점막 관통, 경비, 직장, 및 장내로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로를 통해 투여하도록 제제화되는, 약제 조성물.
37. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 아치사, 치사 또는 과치사 컨디셔닝 프로토콜을 더 포함하는, 약제 조성물.
38. 제 29항 또는 제 37항에 있어서, 상기 아치사, 치사 또는 과치사 컨디셔닝은, 전신 조사(irradiation)(TBI), 부분적인 신체 조사, 골수 소멸 컨디셔닝(myeloablative conditioning), 동시 자극적 차단(co-stimulatory blockade), 화학 치료제 및/또는 항체 면역요법(antibody immunotherapy)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법 또는 약제 조성물.
39. 제 29항 또는 제 37항에 있어서, 상기 컨디셔닝은 나프탈렌 처리를 포함하는, 방법 또는 약제 조성물.
40. 제 39항에 있어서, 상기 컨디셔닝은 전신 조사(TBI)를 더 포함하는, 방법 또는 약제 조성물.
41. 제 29항 또는 제 37항에 있어서, 상기 컨디셔닝은 전신 조사(TBI)를 포함하는, 방법 또는 약제 조성물.
42. 제 40항 또는 제 41항에 있어서, 상기 TBI는 1 ~ 7.5 Gy 범위 내의 단일 또는 분할 조사 선량(irradiation dose)을 포함하는, 방법 또는 약제 조성물.
43. 제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항 또는 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 피험자는 인간 피험자인, 방법 또는 약제 조성물.
44. 제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항 또는 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 포유류 태아 폐 조직은 인간의 조직인, 방법 또는 약제 조성물.
45. 제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항 또는 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 세포 현탁액의 상기 격리된 모집단은 상기 피험자와 비동계(non-syngeneic)인, 방법 또는 약제 조성물.
46. 제 45항에 있어서, 세포 현탁액의 상기 격리된 모집단은 상기 피험자와 동종(allogeneic)인, 방법 또는 약제 조성물.
47. 제 46항에 있어서, 상기 동종 세포는, 상기 피험자와 동일한 HLA, 부분적으로 동일한 HLA, 및 동일하지 않은 HLA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법 또는 약제 조성물.
48. 제 45항에 있어서, 세포 현탁액의 상기 격리된 모집단은 상기 피험자와 이종(xenogeneic)인, 방법 또는 약제 조성물.
49. 제 28항 또는 제 34항에 있어서, 상기 폐질환 또는 손상은, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 기종(emphysema), 석면증(asbestosis), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)(COPD), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 특발성 폐 섬유증, 폐 고혈압(pulmonary hypertension), 폐암, 유육종증(sarcoidosis), 급성 폐 손상(acute lung injury)(성인 호흡 곤란 증후군), 미숙아 호흡 곤란 증후군, 미숙아 만성 폐질환(기관지 폐 형성 장애), 계면활성제 단백질 B 결핍(surfactant protein B deficiency), 선천성 횡격막 탈장(congenital diaphragmatic hernia), 폐포 단백질증(pulmonary alveolar proteinosis), 폐 형성부전(pulmonary hypoplasia), 및 폐 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법 또는 약제 조성물.
50. 제 27항 또는 제 33항에 있어서, 상피, 간엽 및/또는 내피 조직의 재생이 유익한 상기 질병 또는 병은, 폐질환, 질병 또는 손상; 신장 질환, 질병 또는 손상; 간 질환, 질병 또는 손상; 심장 질환, 질병 또는 손상; 위장관 질환, 질병 또는 손상; 피부 질환, 질병 또는 손상; 뇌 장애, 질병 또는 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법 또는 약제 조성물.
51. 제 27항 또는 제 33항에 있어서, 상피 조직의 재생이 유익한 상기 질병 또는 병은, 만성 궤양, 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)(IBD), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 알츠하이머병, 상처 치유 결함(wound healing defects), 암, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 폐 고혈압, 폐암, 유육종증, 급성 폐 손상(성인 호흡 곤란 증후군), 미숙아 호흡 곤란 증후군, 미숙아 만성 폐질환(기관지 폐 형성 장애), 계면활성제 단백질 B 결핍, 선천성 횡격막 탈장, 폐포 단백질증, 폐 형성부전, 폐 손상, 및 각막 변성증(corneal degeneration)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법 또는 약제 조성물.
52. 제 27항 또는 제 33항에 있어서, 간엽 조직의 재생이 유익한 상기 질병 또는 병은, 심장 질병 또는 병, 당뇨병, 난청, 크론병, 자가면역 질환, 백혈병, 암, 겸상 적혈구 질환(sickle cell disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 및 대사 장애(metabolic disorder)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법 또는 약제 조성물.
53. 제 27항 또는 제 33항에 있어서, 내피 조직의 재생이 유익한 상기 질병 또는 병은, 혈관 질병(vascular disease), 국소 빈혈(ischemia), 겸상 적혈구 질환, 심혈관 질환, 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 당뇨병, 및 자가면역 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법 또는 약제 조성물.
54. 포유류 태아 폐 조직으로부터 격리된 복수의 세포 모집단을 포함하는 세포 은행(cell bank)에 있어서,
    상기 태아 폐 조직은 약 20 내지 약 22주의 임신 범위로부터 선택된 임신 단계에서 인간의 폐 기관/조직의 발달 단계에 본질적으로 대응하는 발달 단계에 있고, 상기 복수의 세포 모집단은 동종 세포 은행을 형성하도록 HLA 유형이 되었으며, 각각은 개별적으로 개별 용기 내에 배치된, 세포 은행.
55. 제 54항에 있어서, 상기 복수의 세포 모집단의 상기 HLA 유형 세포에 관한 정보를 포함하는 카탈로그를 더 포함하는, 세포 은행.

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