ES2587876T3

ES2587876T3 - Células pulmonares fetales de mamífero y uso terapéutico de las mismas

Info

Publication number: ES2587876T3
Application number: ES12813990.4T
Authority: ES
Inventors: Yair Reisner; Elias Shezen; Chava ROSEN
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2012-12-06
Publication date: 2016-10-27
Anticipated expiration: 2032-12-06
Also published as: EP3034087A1; KR20140102730A; PH12014501309A1; HK1202809A1; IL233022A0; EP2788009B1; US9833482B2; US20140356335A1; MX2014006756A; SG11201402902VA; RU2014127338A; WO2013084190A1; CA2857930A1; EP2788009A1; PL2788009T3; CN104105493A; EP3034087B1; HUE030541T2; JP2015500279A; PT2788009T

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende como principio activo una población aislada de una suspensión de células procedentes de un tejido pulmonar fetal de mamífero, en la que dicho tejido pulmonar fetal está en una fase de desarrollo que se corresponde con la de un órgano/tejid o pulmonar humano en una fase de gestación seleccionada entre un intervalo de 20 y 22 semanas de gestación.

Description

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pulmonares recogidos a las 21 semanas. La Figura 4 A ilustra una tinción individual para CD34; la Figura 4 B ilustra una tinción individual para CD117; la Figura 4 C ilustra una fusión con una tinción de E-cadherina. Se representan imágenes panorámicas de dos regiones vecinas, que incluyen grandes bronquios y estructuras alveolares en desarrollo. La mayoría de las células CD34+ de la región de las estructuras alveolares en desarrollo expresan conjuntamente el CD117 (Figuras 4 D-G), mientras que en la región de las vías aéreas mayores pueden observarse raras células individuales positivas CD117+ en estrecha proximidad de los vasos sanguíneos (Figuras 4 H-K). Las FIG. 5 A-D son fotografías que representan una vista panorámica de tres campos vecinos en un pulmón humano de 20 semanas que ilustra la presencia de regiones positivas en CK5 (rojo, Figura 5 A) con una intensidad de expresión diferente, que están rodeadas por vasos sanguíneos (azul, Figura 5 B) y células positivas alfa-SMA (verde, Figura 5 C), ambas en los grandes bronquios y en los alveolos en desarrollo (azul, Figura 5 B), lo que sugiere distintos nichos (la superposición de los 3 compartimentos se muestra en la Figura 5 D). Barra = 50 μm. Las FIG. 6 A-L representan un análisis policromático de FACS de dos muestras diferentes de pulmón humano adulto. El análisis policromático de FACS de los tejidos de pulmón humano adulto se llevó a cabo en paralelo con los tejidos de pulmón humano embrionario. Se tiñó una suspensión de células individuales después de una disociación enzimática con colagenasa y dispasa de los tejidos, y se tiñó con anticuerpos específicos para CD34 (específica para progenitores hematopoyéticos y endoteliales), para CD45 (células hematopoyéticas), para CD31 (marcador de células endoteliales), para CD 117 (c-KIT, para la identificación de progenitores tempranos), CD271 (marcador de células madre mesenquimatosas NGFR) y para CD326 (marcador de diferenciación epitelial EPCAM) o controles de isotipos equivalentes. En ambas muestras se identificaron poblaciones CD34+ y CD34- (Figuras 6 A, 6 D, 6 G y 6 J). Se observaron notables diferencias entre los tejidos de pulmón adulto y embrionario. Se identificaron unos niveles mucho menores de células CD34+ en los pulmones adultos. Cuando se ensayó la presencia de la población c-kit+, se identificaron las poblaciones muy pequeñas de CD34+CD117+ y CD34-CD117+ (Figuras 6 B, 6 E, 6 H y 6 K); la mayoría de las células CD34+CD117+ eran positivas para el marcador CD31 y únicamente un pequeño porcentaje era negativo para el marcador CD31 (Figuras 6 C, 6 F, 6 I y 6 L) y se averiguó que la mayor parte de la población CD34-CD117+ era negativa para CD31 y CD326 (Figuras 6 F y 6 L). Las FIG. 7 A-I representan el análisis de FACS de HEL de 20 semanas, que muestra subpoblaciones CD45-CD34+ y CD45-CD34- (Figura 7 A). Tinción CD117+ en las subpoblaciones de células CD34 positivas (Figura 7 B) y negativas (Figura 7 C). La mayor parte de la subpoblación CD34+CD117+ es positiva para los marcadores CD31 o CD326 (Figuras 7 D, 7 F-G). La mayor parte de las células CD34-CD117+ son negativas para los marcadores CD31 y CD326 (Figuras 7 E, 7 H-I). En las Figuras 7 F-I se muestran histogramas representativos en los que la línea roja marca el control de isotipo de los marcadores CD31 y CD326, la línea azul muestra la subpoblación CD34+CD31+ y la línea verde muestra la subpoblación CD34+CD326+ (Figuras 7 F-G); en las Figuras 7 H-I, la línea azul marca la subpoblación CD34-CD31+ y la línea verde marca la subpoblación CD34-CD326+. Estos hallazgos confirman la existencia de dos poblaciones diferentes CD117+, según se ha demostrado mediante una inmunohistoquímica. Las FIG. 8 A-D representan una tinción inmunohistológica de HEL de 15 semanas (Figuras 8 A-B) y de 17 semanas (Figuras 8 C-D) para el marcador ulix-vascular (azul), CK5 (verde) y CD 117 (rojo), que muestra el doble patrón de expresión de CD117. Se encuentran numerosas células individuales CD117+ en estrecha proximidad a las vías aéreas grandes y los vasos sanguíneos, mientras que la mayor parte de las mismas se localizan conjuntamente en el interior de los vasos sanguíneos que rodean las estructuras alveolares en desarrollo. Las FIG. 9 A-D representan el análisis de un pulmón humano de 20 semanas para evaluar la presencia de progenitores endoteliales tempranos y tardíos (EPC). Esta figura identifica la presencia de dos subpoblaciones menores distintas CD34+CD31 + (Figura 9 B). La primera es identificada mediante una tinción positiva para CD14 y CD45 (Figura 9 C), mientras que la segunda subpoblación es CD45-CD105+ (Figura 9 D). Las FIG. 10 A-E representan la caracterización de tejidos embrionarios antes y después del implante bajo la cápsula renal de ratones singénicos. Las Figuras 10 A-C son unas fotografías que ilustran una tinción típica de H&E que muestra el bajo crecimiento de tejidos pulmonares E14 (Figura 10 A) y E17 (Figura 10 B) a las 12 semanas después del trasplante bajo la cápsula renal de ratones SCID (n = 7), en comparación con el notable crecimiento y diferenciación conseguidos después de los implantes embrionarios de ratón E16 (n = 5) (Figuras 10 C-E); las Figuras 10 D-E son unas fotografías que ilustran una tinción de H&E que muestra la tinción de las vías aéreas mayores (flechas grandes) y de las estructuras alveolares (flechas pequeñas) y de citoqueratina en implantes de pulmón fetal de ratón E16. La FIG. 10 F representa una representación esquemática de estadios paralelos en el desarrollo de un pulmón de rata y humano. La "ventana óptima" para el trasplante está en la fase de desarrollo canalicular. Las FIG. 11 A-Y representan la caracterización de progenitores de pulmón en pulmón embrionario de ratón E16 antes del trasplante. La Figura 11 A es una fotografía que ilustra una tinción de H&E de pulmón embrionario E16 que muestra estructuras inmaduras y la ausencia de estructuras alveolares; la Figura 11 B es una fotografía que ilustra que las células CK-5 positivas (azul) en tejido de ratón E16, similar al tejido embrionario humano, tienen una mayor expresión en las vías aéreas mayores. Se encuentran numerosos cuerpos neuroepiteliales, teñidos positivamente mediante CGRP (rojo) e hidroxilasa de tirosina (TH, verde) por toda la muestra y están localizados en nichos; la Figura 11 C es una fotografía que ilustra que se encuentran células positivas para CCSP en las regiones de las vías aéreas mayores, también ricas en células positivas paran nestina y rodeadas por células

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positivas para alfa-SMA (Figura 11 D, flechas blancas), lo que sugiere nichos de células madre; las Figuras 11 E-G son unos análisis policromático representativo mediante FACS de células CD45-CD31-CD326+ CD24+CD49f+CD104+ en suspensiones de células individuales derivadas de pulmón E13, E14, E15 y E16 después del tratamiento con colagenasa y dispasa (n = 10, 10, 12 y 10 respectivamente, los valores representan la media ± DT de dos experimentos diferentes). Se muestra una abundancia significativamente mayor en esta población de células en el pulmón E15-16 (p < 0,007); la Figura 11 Y es un resumen de los niveles de las células CD45-CD31- CD326+ CD24+CD49f+CD104+ que muestran significación estadística calculada mediante la prueba de la t de Student (un rombo representa p < 0,037, dos rombos representan p < 0,007, las estrategias de clasificación celular se describen en la sección de Ejemplos del presente documento, a continuación). Las FIG. 12 A-F son fotografías que representan la tinción inmunohistoquímica de pulmón adulto C57B1 que muestran la presencia de nestina y de CGRP (Figuras 12 A-B), de forma similar a su expresión en los nichos de células madre en el pulmón embrionario de ratón (Figura 12 A - menor aumento - barra = 50 μm, Figura 12 B - mayor aumento - barra = 20 μm). La caja de la (Figura 12 A) indica la posición de la ampliación mostrada en la (Figura 12 B); las Figuras 12 C-F son unas fotografías que ilustran una tinción triple de pulmón adulto C57B1 para alfa-SMA (verde, Figura 12 C), CGRP (rojo, Figura 12 D) y E-cadherina (superposición azul con alfa-SMA y CGRP, Figura 12 E), barra = 50 μm; y la Figura 12 F ilustra un área ampliada del cuadrado marcado en la Figura 12 E, barra = 20 μm. Las FIG. 13 A-D representan una microscopía de fluorescencia de pulmones quiméricos con poca potencia de aumento que muestran diferentes cifras de focos de células GFP+ injertadas después de diferentes regímenes de acondicionamiento. Las Figuras 13 A-C son fotografías de imágenes representativas de pulmones quiméricos de animales tratados con 6 Gy de TBI (Figura 13 A), solo con NA (Figura 13 B) y con NA más 6 GY de TBI (Figura 13 C); la Figura 13 D son análisis morfométricos cuantitativos de parches GFP+ de células injertadas por mm3, después de diferentes regímenes de acondicionamiento (n = 10 en cada grupo). Se presentan los resultados de 3 experimentos independientes. Las FIG. 14 A-L son fotografías que representan una tinción de células CCSP+ antes y después de la infusión de las células E16. La Figura 14 A ilustra las luces de las vías aéreas mayores de los ratones de control sin tratar; la Figura 14 B ilustra los pulmones de los animales experimentales 1 día después del acondicionamiento con naftaleno y con 6 Gy de TBI, que muestra el desprendimiento de las células CCSP+; la Figura 14 C ilustra los pulmones de animales acondicionados con naftaleno y 6 Gy de TBI 30 días después de la infusión de las células E16, que muestran una notable regeneración de la capa epitelial con células GFP+ injertadas (verde) en las luces bronquiales, que están vascularizadas, según se indica mediante una tinción para V-E cadherina; las Figuras 14 D-L ilustran que las células trasplantadas (Figuras 14 D-F) se incorporan en la capa epitelial, regeneran las células CCSP+ (rojo), son capaces de producir tensioactivo (Figuras 14 G-I) y muestran un potencial para el transporte de iones, según se indica mediante una tinción para el CFTR (Figuras 14 J-L). Las FIG. 15 A-C son fotografías que representan la microscopía bifotónica que revela el nivel de quimerismo en los pulmones trasplantados. Imágenes representativas de microscopía bifotónica del pulmón de los ratones trasplantados a las 6 (Figuras 15 A-B) y a las 16 (Figura 15 C) semanas después del trasplante, sin (Figura 15 A) y con una tinción conjunta de los vasos sanguíneos con puntos cuánticos no dirigidos (rojo) (Figura 15 B). Las FIG. 16 A-L son fotografías que representan la caracterización inmunohistológica de pulmones quiméricos a las 16 semanas después del trasplante. Las Figuras 16 A-D son imágenes representativas de un pulmón quimérico tenido con anticuerpo anti-GFP (verde), con anticuerpo anti-CD31 (rojo) y con anticuerpo antipancitoqueratina (azul), que muestra la incorporación de células GFP+ en los compartimentos vascular y epitelial de los pulmones trasplantados, sin signos de cicatrización ni de fibrosis; las Figuras 16 E-H son imágenes representativas de pulmones quiméricos teñidos con anti-GFP (verde) y con anticuerpo anti AQP-5 (rojo), que muestran la incorporación del tejido trasplantado en la superficie de intercambio gaseoso de los alveocitos de tipo I; las Figuras 16 I-L son imágenes de un pulmón quimérico teñido con anticuerpo anti-GFP (verde), anti-CD31 (rojo) y anti-sp-C (azul), que muestran la participación de los alveocitos de tipo II de las células trasplantadas en la síntesis de tensioactivo. Las FIG. 17 A-E son fotografías que representan el aspecto del pulmón de control no trasplantado C57B1 analizado mediante microscopía bifotónica, barra = 90 μm (pulmón de control, Figura 17 A) o una tinción triple de un pulmón quimérico con anticuerpos anti-GFP (verde), anti-citoqueratina (azul) y anti-CD31, que muestra quimerismo tanto en el compartimento epitelial como en el vascular del pulmón y una total incorporación en las estructuras, sin signos de cicatrización ni de fibrosis, con pocos aumentos, barra = 200 μm (Figuras 17 B-E). En el canal fluorescente verde GFP+ los focos quiméricos están indicados por una línea de puntos (Figura 17 B). En los canales rojo y azul y también están indicadas las mismas regiones quiméricas por una línea de puntos, que muestran una transición suave desde el tejido receptor hacia el donante tanto en el compartimento vascular (Figura 17 C) como en el epitelial (Figura 17 D), y la superposición de todas las capas se muestra en la (Figura 17 E). Las FIG. 18 A-I son fotografías que representan el injerto y la incorporación de células de pulmón de origen humano en el pulmón de ratón en diferentes puntos temporales después del trasplante. Las Figuras 18 A-C ilustran el quimerismo en el pulmón de ratón a las 6 semanas después del trasplante, que muestra la tinción para el MHC de ratón (rojo) y el tejido humano positivo para MNF-116 (verde) con pocos aumentos; las Figuras 18 D-F ilustran el quimerismo en el pulmón de ratón a las 6 semanas después del trasplante, que muestra la tinción para el MHC de ratón (rojo) y el tejido humano positivo para MNF-116 (verde), con muchos aumentos; las Figuras 18 G-1 ilustran un campo adicional, teñido como en las (Figuras 18 D-F). Las FIG. 19 A-F son fotografías que representan el quimerismo típico en el bronquio pulmonar del ratón

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trasplantado a las 7 semanas después del trasplante. Las Figuras 19 A y 19 D ilustran células humanas procedentes de células embrionarias humanas que fueron teñidas selectivamente con un cóctel de anticuerpos de ratón anti-humanos que incluyen anti-MNF (marcador epitelial), anti-Vimentina 9 humana (típica de las células estromales) y anti-CD31 humano de ratón (marcador de células endoteliales) marcado con Daylight 488 (verde); las Figuras 19 B y 19 E ilustran células procedentes de ratón en el pulmón del ratón que fueron teñidas con lectina Banderia marcada con Alexa-flúor 546 (rojo). Se sabe que esta última se une a la a-Gal expresada en las células epiteliales y endoteliales de ratón. El panel superior muestra un campo quimérico con pocos aumentos (Figura 19 C), el panel inferior muestra la misma región con un elevado aumento (Figura 19 F). Las FIG. 20 A-F son fotografías que representan el quimerismo típico en los alveolos pulmonares de un ratón trasplantado a las 7 semanas después del trasplante. Las Figuras 20 A y 20 D ilustran células humanas procedentes de células embrionarias humanas que fueron teñidas selectivamente con un cóctel de anticuerpos de ratón anti-humanos que incluyen anti-MNF (marcador epitelial), anti-Vimentina 9 humana (típica de las células estromales) y anti-CD31 humano de ratón (marcador de células endoteliales) marcado con Day light 488 (verde); las Figuras 20 B y 20 E ilustran células procedentes de ratón en el pulmón del ratón que fueron teñidas con lectina Banderia marcada con Alexa-flúor 546 (rojo). Se sabe que esta última se une a la a-Gal expresada en las células epiteliales y endoteliales de ratón, pero no en sus homólogos humanos. El panel superior muestra un campo quimérico con pocos aumentos (Figura 20 C); el panel inferior muestra la misma región con un elevado aumento (Figura 20 F). Las FIG. 21 A-C son fotografías que representan la incorporación de células humanas en el parénquima pulmonar. La Figura 21 A ilustra células humanas que se tiñeron (verde) con una mezcla de anticuerpos antihumanos que incluyen anti-MNF 117, anti-V9, anti-CD31 como se ha descrito anteriormente y con anticuerpo de conejo anti-citoqueratina (rojo), que tiñe la citoqueratina tanto de ratón como humana (Figura 21 B). La fusión de ambos colores muestra células humanas en el interior del parénquima pulmonar (Figura 21 C). Las FIG. 22 A-C son fotografías que representan la incorporación de células humanas en la superficie de intercambio gaseoso del pulmón. Las células humanas se tiñeron (verde) con una mezcla de anticuerpos antihumanos que incluyen anti-MNF117, anti-V9 y anti-CD31, como se ha descrito anteriormente (Figura 22 A) y con anti-AQP-5 de cabra (rojo), que tiñe la AQP-5 tanto de ratón como humana (Figura 22 B). La fusión de ambos colores muestra células humanas en el interior de la superficie de intercambio gaseoso del pulmón (Figura 22 C). Las FIG. 23 A-F son fotografías que representan que las células de pulmón humanas injertadas en el interior de los alveolos de un ratón quimérico participan en la producción de tensioactivo. Las células humanas se tiñeron (verde) con una mezcla de anticuerpos anti-humanos que incluyen anti-MNF117, anti-V9 y anti-CD31 como se ha descrito anteriormente (Figuras 23 A y 23 D) y con anticuerpo anti-SPC de conejo (rojo), que tiñe la proteína C tensioactiva tanto de ratón como humana (Figura 23 B). La fusión de ambos colores muestra la participación del tejido humano trasplantado en la producción de tensioactivo (Figura 23 C). El panel inferior (Figuras 23 D-F) muestra la tinción con un gran aumento del área del cuadrado indicado en la (Figura 23 C). Las FIG. 24 A-H son fotografías que representan el injerto de una suspensión de células individuales derivadas de pulmón humano de 20 semanas teñidas con CMTMR en el pulmón de un ratón NOD-SCID, barra = 500 μm (Figura 24 A); los parches de GFP+ indican las células del pulmón procedentes de células de pulmón embrionario de ratón trasplantadas en el modelo de trasplante singénico, barra = 1 mm (Figura 24 B); las Figuras 24 C-E ilustran una tinción de control con anticuerpo de ratón anti-citoqueratina MNF 116 humana (verde, Figura 24 C) y anti-MHC de ratón de rata (rojo, Figura 24 D) de tejido pulmonar embrionario humano, que es positivo para el MNF116 y negativo para el MHC de ratón (la superposición de las dos se muestra en la Figura 24 E); las Figuras 24 F-H ilustran una tinción de control de células pulmonares de ratón con anticuerpos anti-MNF116 humana anti-MHC de ratón, mostrando una tinción negativa para el MNF116 y una tinción positiva para el MHC de ratón, barra = 50 μm. Las FIG. 25 A-D son fotografías que representan el seguimiento a largo plazo de ratones implantados con tejido pulmonar embrionario de ratón E16 que no muestra signos de teratoma. La Figura 25 A ilustra un aspecto macroscópico de un pulmón trasplantado un año después del trasplante, que muestra unos bordes lisos y una ausencia de tumores; las Figuras 25 B-C ilustran una tinción de H&E que muestra una morfología normal del pulmón trasplantado con pocos (Figura 25 B) y con muchos aumentos (Figura 25 C) un año después del trasplante; la Figura 25 D ilustra vistas en corona de imágenes de CT del pulmón in vivo de un animal trasplantado típico, que muestra un aspecto radiológico normal del pulmón experimental.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a células pulmonares embrionarias de mamífero y proporciona el uso de las mismas para aplicaciones terapéuticas.

Los principios y el manejo de la presente invención pueden comprenderse mejor con referencia a los dibujos y las descripciones anexas.

Antes de explicar con detalle al menos una realización de la invención, debe entenderse que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles establecidos en la siguiente descripción o ejemplificados mediante los Ejemplos. La invención es susceptible de otras realizaciones o de llevarse a la práctica o llevarse a cabo de diversas formas. También debe entenderse que la fraseología y la terminología empleadas en el presente documento son con fines descriptivos y no deben interpretarse como limitantes.

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sujeto. Normalmente, los mamíferos no consanguíneos gemelos no cigóticos de la misma especie son alogénicos entre sí. Se apreciará que una célula alogénica puede ser idéntica en el HLA, parcialmente idéntica en el HLA o no idéntica en el HLA (es decir, que muestra uno o más determinantes del HLA diferentes) con respecto al sujeto.

Según se usa en el presente documento, el término "xenogénica" se refiere a una célula que sustancialmente expresa antígenos de una especie diferente con respecto a la especie de una proporción sustancial de los linfocitos del sujeto. Normalmente, los mamíferos no con sanguíneos de diferentes especies son xenogénicos entre sí.

La presente invención contempla que las células xenogénicas deriven de diversas especies, según se describe con mayor detalle a continuación en el presente documento.

Las células con los tejidos de origen xenogénico (por ejemplo, de origen porcino) se obtienen preferentemente a partir de una fuente que se sabe que está exenta de zoonosis, tal como de retrovirus endógenos porcinos. De forma análoga, las células o los tejidos de origen humano se obtienen preferentemente a partir de fuentes sustancialmente exentas de patógenos.

Según una realización de la presente invención, el sujeto es un ser humano y la población aislada de células es de origen humano (por ejemplo, de un feto humano).

Dependiendo de la aplicación y de las fuentes disponibles, las células de la presente invención pueden ser naturales

o estar modificadas genéticamente. Dichas determinaciones están en la capacidad del experto habitual en la materia.

Dado que es probable que las células no singénicas induzcan una reacción inmunitaria cuando son administradas a un sujeto, se han desarrollado varias metodologías para reducir la probabilidad de rechazo de las células no singénicas. Estas incluyen bien la supresión del sistema inmunitario del receptor o bien la encapsulación de las células no autólogas en membranas semipermeables inmunoaislantes antes del trasplante. Alternativamente, pueden usarse células que no expresan antígenos de superficie xenogénicos, tales como las desarrolladas en animales transgénicos (por ejemplo, cerdos).

La expresión "tejido pulmonar", según se usa en el presente documento, se refiere a un tejido o a un órgano pulmonar. El tejido pulmonar de la presente invención puede ser un órgano o un tejido completo o parcial. Por lo tanto, el tejido pulmonar de la presente invención puede comprender el pulmón derecho, el pulmón izquierdo o ambos. El tejido pulmonar de la presente invención puede comprender uno, dos, tres, cuatro o cinco lóbulos (tanto del pulmón derecho como del izquierdo). Además, el tejido pulmonar de la presente invención puede comprender uno o más segmentos pulmonares o lóbulos pulmonares. Adicionalmente, el tejido pulmonar de la presente invención puede comprender cualquier cantidad de bronquios y bronquiolos (por ejemplo, el árbol bronquial) y cualquier cantidad de alveolos o de sacos alveolares.

Según una realización de la presente invención, el tejido pulmonar está en una fase de desarrollo que se corresponde con la de un órgano/tejido pulmonar humano en una fase de gestación de entre 20 y aproximadamente 21 días de gestación, de entre aproximadamente 20,5 y aproximadamente 21,5 días de gestación, de entre aproximadamente 20 y 22 días de gestación, de entre aproximadamente 21 y 22 días de gestación.

Según la invención el tejido pulmonar está en una fase de desarrollo que se corresponde con la de un órgano/tejido pulmonar humano en una fase de gestación de entre 20 y 22 días de gestación.

Según otra realización específica, el tejido pulmonar está en una fase de desarrollo que se corresponde con la de un órgano/tejido pulmonar humano en una fase de gestación de entre aproximadamente 21 y 22 días de gestación.

Según otra realización específica, el tejido pulmonar está en una fase de desarrollo que se corresponde con la de un órgano/tejido pulmonar humano en una fase de gestación de entre 20 y aproximadamente 21 días de gestación.

Como se ha mencionado, el tejido pulmonar de la presente invención se obtiene a partir de un organismo mamífero.

Por lo tanto, el tejido pulmonar de la presente invención puede proceder de cualquier un mamífero. Algunas especies de origen adecuadas para el tejido pulmonar comprenden la mayor parte de los animales domésticos o de granja y primates, que han sido ampliamente caracterizados con respecto a la correlación entre la fase de diferenciación y la fase de gestación. Dichos animales incluyen porcinos (por ejemplo, cerdo), bovinos (por ejemplo, vaca), equinos (por ejemplo, caballo), ovinos (por ejemplo, cabra, oveja), felinos (por ejemplo, Felis domestica), caninos (por ejemplo, Canis domestica), roedores (por ejemplo, ratón, rata, conejo, cobaya, gerbo, hámster) y primates (por ejemplo, chimpancé, mono rhesus, mono macaco, tití).

Según una realización específica, el tejido pulmonar deriva de un ser humano.

Según una realización específica, el tejido pulmonar deriva de un organismo no humano.

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Pueden emplearse diversos métodos para la obtención de un tejido pulmonar en una fase de desarrollo que se corresponda esencialmente con la de un tejido pulmonar de origen humano, como acabamos de enseñar. La obtención de dicho tejido pulmonar puede efectuarse mediante la recolección del tejido pulmonar a partir de un feto en desarrollo en dicha fase de gestación (es decir, la correspondiente a un ser humano de 20-22 semanas de

5 gestación), por ejemplo, mediante un procedimiento quirúrgico. Los expertos en la materia comprenderán que la fase de gestación de un organismo es el periodo de tiempo transcurrido después de la fertilización del ovocito que genera el organismo.

Alternativamente, un tejido pulmonar en una fase de desarrollo deseada puede obtenerse mediante el cultivo in vitro

10 de células, órganos/tejidos. Dicha diferenciación de células, tejidos u órganos controlada in vitro se realiza de forma rutinaria, por ejemplo, mediante el uso del cultivo de líneas de células madre embrionarias para la generación de cultivos que contienen células/tejidos/órganos de las estirpes deseadas. Por ejemplo, para la generación de estirpes pulmonares, consúltese, por ejemplo, Otto WR., 1997. Int J Exp Pathol. 78: 291-310.

15 La siguiente tabla proporciona un ejemplo de las fases de gestación de tejidos pulmonares humanos y porcinos en las que éstos pueden proporcionar tejidos pulmonares que están esencialmente en las correspondientes etapas de desarrollo:

Tabla 1: correspondientes fases de gestación de cerdos y de seres humanos

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Fase de gestación de tejido pulmonar porcino (días): Fase de gestación de tejido pulmonar humano (días *)

18: 44

20: 49

22: 54

23: 56-57

25: 61-62

26: 63

28: 68-69

31: 75

38: 92

42: 102

46: 112

49: 119

56: 136

62: 151

72: 175

80: 195

88: 214

La fase de gestación (en días) de un tejido pulmonar perteneciente a una especie dada que está en una fase de desarrollo que se corresponde esencialmente con la de un tejido pulmonar porcino puede calcularse según la siguiente fórmula: [fase de gestación del tejido pulmonar porcino en días] / [periodo de gestación del cerdo en días] x [fase de gestación del tejido pulmonar de una especie dada en días]. De forma análoga, la fase de gestación (en días) de un tejido pulmonar perteneciente a una especie dada que está en una fase de desarrollo que se corresponde esencialmente con la de un tejido pulmonar humano puede calcularse según la siguiente fórmula: [fase de gestación de tejido pulmonar humano en días] / [periodo de gestación de los seres humanos en días] x [fase de gestación del tejido pulmonar de una especie dada en días]. La fase de gestación de los cerdos es de aproximadamente 115 días y la de los seres humanos es de aproximadamente 280 días. * para el cálculo de las semanas dividir las cifras entre 7.

Después de la obtención del tejido pulmonar fetal, la presente invención contempla la adicionalmente la generación de una población aislada de células a partir del mismo.

25 Según se usa en el presente documento, "suspensión de células individuales" se refiere a una suspensión de células individuales pulmonares fetales que comprende células individuales o agregados de células de no más de 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1.000, 1.500, 2.000 células en un agregado.

La suspensión de células individuales de la presente invención puede obtenerse mediante cualquier medio mecánico

30 o químico (por ejemplo, enzimático). Existen diversos métodos para disociar los grupos de células para formar una suspensión de células individuales a partir de tejidos primarios, célula unidas en cultivo y agregados, por ejemplo, fuerzas físicas (una disociación mecánica tal como un raspador de células, trituración a través de una pipeta de diámetro estrecho, una aspiración con una aguja fina, una desagregación vorticial y una filtración forzada a través de una malla fina de nailon o de acero inoxidable), enzimas (una disociación con enzimas tales como tripsina,

35 colagenasa, acutasa y similares ) o una combinación de ambos.

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aguda. Leucemia linfocítica crónica; enfermedades mieloproliferativas, tales como tumores sólidos, meningioma benigno, tumores mixtos de las glándulas salivales, adenomas de colon; adenocarcinomas, tales como cáncer de pulmón microcítico, de riñón, de útero, de próstata, de vejiga, de ovario, de colon, sarcomas, liposarcoma, mixoide, sarcoma sinovial, rabdomiosarcoma (alveolar), condrosarcoma mixoide extraesquelético, tumor de ewing; otros incluyen disgerminoma testicular y de ovario, retinoblastoma, tumor de wilms, neuroblastoma, melanoma maligno, mesotelioma, de mama, de piel, de próstata y de ovario.

Algunos ejemplos de trastornos/enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, aterosclerosis, trombosis, infarto de miocardio, etc.), enfermedades reumatoides (por ejemplo, artritis reumatoide y espondilitis anquilosante), enfermedades glandulares (por ejemplo, enfermedad pancreática, diabetes de tipo I, enfermedad tiroidea, enfermedad de Graves, tiroiditis, etc.), enfermedades gastrointestinales (por ejemplo, enfermedades intestinales inflamatorias crónicas, enfermedad celíaca, colitis, ileítis y enfermedad de Crohn), enfermedades cutáneas (por ejemplo, enfermedades cutáneas vesiculares autoinmunes, tales como, pero no se limitan a, pénfigo vulgar, penfigoide vesicular y pénfigo foliáceo), enfermedades hepáticas (por ejemplo, hepatitis, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria y hepatitis autoinmune), enfermedades neurológicas (por ejemplo, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, miastenia gravis, neuropatías, neuropatías motoras; síndrome de Guillain-Barre y neuropatías autoinmunes, miastenia de Lambert-Eaton, síndrome miasténico; enfermedades neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelosa, atrofia cerebelosa paraneoplásica y síndrome de la persona rígida; síndrome de la persona rígida no paraneoplásico, atrofias cerebelosas progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Sydeham, síndrome de Gilles de la Tourette y poliendocrinopatías autoinmunes; neuropatías disinmunes; neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple congénita, neuritis, neuritis óptica y enfermedades neurodegenerativas), enfermedades musculares (por ejemplo, miositis, miositis autoinmune, síndrome de Sjogren primario y enfermedad autoinmune del músculo liso), enfermedades nefríticas (por ejemplo, nefritis y nefritis intersticial autoinmune), enfermedades relacionadas con la reproducción (por ejemplo, pérdidas fetales repetidas), enfermedades del tejido conectivo (por ejemplo, enfermedades del oído, enfermedades autoinmunes del oído y enfermedades autoinmunes del oído interno) y enfermedades sistémicas (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico y esclerosis sistémica). Según se usa en el presente documento, el término "trastorno o lesión pulmonar" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno, afección o a cualquier afección, estado o síndrome patológico o no deseado, o a cualquier anomalía física, morfológica o fisiológica que implique una pérdida o una deficiencia en el tejido pulmonar.

Algunos ejemplos de una enfermedad o una afección asociada con un trastorno o una lesión pulmonar incluyen, pero no se limitan a, fibrosis quística, enfisema, asbestosis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática), hipertensión pulmonar, cáncer de pulmón, sarcoidosis, insuficiencia pulmonar, lesión pulmonar aguda (por ejemplo, síndrome de dificultad respiratoria del adulto), hernia diafragmática congénita, síndrome de dificultad respiratoria del prematuro, enfermedad pulmonar crónica del prematuro (displasia broncopulmonar), deficiencia en la proteína B tensioactiva (por ejemplo, deficiencia homocigótica de proteína tensioactiva B), proteinosis alveolar pulmonar, hipoplasia pulmonar y lesión pulmonar.

La administración de la población aislada de la suspensión de células al sujeto puede efectuarse de varias formas, dependiendo de diversos parámetros, tales como, por ejemplo, el tipo, la fase o la gravedad de la enfermedad que se va a tratar, los parámetros físicos y fisiológicos específicos del sujeto individual y/o el resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, dependiendo de la aplicación y del fin, la administración de la población aislada de la suspensión de células puede efectuarse mediante una vía seleccionada entre el grupo que consiste en intratraqueal, intrabronquial, intraalveolar, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intracardiaca, intramuscular, intraserosal, intramucosal, transmucosal, transnasal, rectal e intestinal.

Según una realización, la administración se efectúa mediante una vía intravenosa.

Alternativamente, la administración de la población aislada de la suspensión de células al sujeto puede efectuarse mediante la administración de la misma en diversas ubicaciones anatómicas adecuadas, de forma que tenga un efecto terapéutico. Por lo tanto, dependiendo de la aplicación y del fin, la población aislada de células pulmonares fetales puede ser administrada en una ubicación anatómica homotópica (una ubicación anatómica normal para el tipo de órgano o de tejido de las células), o en una ubicación anatómica ectópica (una ubicación anatómica anormal para el tipo de órgano o de tejido de las células).

Consecuentemente, dependiendo de la aplicación y del fin, la población aislada de células pulmonares fetales puede implantarse ventajosamente (por ejemplo, trasplantarse) bajo la cápsula renal o en el riñón, la grasa testicular, el subcutis, el epiplón, la vena porta, el hígado, el bazo, la cavidad cardíaca, el corazón, la cavidad torácica, el pulmón, el páncreas, la piel y/o el espacio intraabdominal.

Por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad o de una afección gastrointestinal, la población aislada de la suspensión de células de la presente invención puede ser administrada en el hígado, la vena porta, la cápsula renal, el subcutis, el epiplón, el bazo, el espacio intraabdominal, el páncreas, la grasa testicular y/o un asa intestinal (la subserosa de un asa en U del intestino delgado). Para el tratamiento de una enfermedad o de una afección pulmonar, la población aislada de la suspensión de células de la presente invención puede ser administrada en el

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durante 1 h. La eliminación de los desechos no específicos se consiguió mediante una filtración secuencial a través de filtros de 70 y de 40 μm.

Después del acondicionamiento con naftaleno (NA), TBI, o ambos, a cada animal se le trasplantaron 1 x 106 células 5 embrionarias de pulmón positivas para la GFP, inyectadas en la vena de la cola 4-8 horas después de la irradiación.

Citometría de flujo

Las suspensiones de células individuales derivadas de pulmón embrionario humano (15-24 semanas) y de ratón (14

10 17 semanas) y las suspensiones de células individuales humanas adultas y de ratón adultas fueron analizadas mediante una citometría de flujo policromática. Todas las muestras se tiñeron con anticuerpos conjugados o con controles de isotipo concordante según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos procedían de Bioscience, BD y de Biolegend. La lista completa de los anticuerpos usados en el estudio se resume en la Tabla 2, a continuación en el presente documento. Los datos se adquirieron con un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences) y

15 se analizaron mediante el uso del programa informático Flow Jo (versión 7.6.5).

Inmunohistoquímica

Los animales fueron sacrificados en diferentes puntos temporales después del trasplante; los pulmones se inflaron

20 con una solución de PFA al 4 % y se conservaron durante 24 horas, después se criopreservaron en sacarosa al 30 % y se ultracongelaron en isopentano enfriado previamente con aire líquido, o se procesaron para una inclusión en parafina. Los bloques de parafina se cortaron en secciones de 4 μm y se tiñeron después de una desparafinización con xileno y se rehidrataron como se ha descrito previamente [Hecht G et al., Proc Nat Acad of Sci. (2009) 106 (21): 8659]. El resumen de los anticuerpos usados en el estudio se representa en la Tabla 2, a

25 continuación en el presente documento. Todos los anticuerpos secundarios procedían de Jackson Immunoresearch Laboratories.

Las imágenes fueron adquiridas con una cámara digital Olympus (DP70) y en ocasiones se procesaron con Adobe photoshop 7.0. En todas las tinciones inmunohistoquímicas se analizó un control negativo mediante el uso de la

30 misma técnica, pero omitiendo el anticuerpo primario y añadiendo el anticuerpo secundario marcado.

Tabla 2: lista de los anticuerpos usados en el estudio

Anticuerpos primarios: Anticuerpos secundarios

Anticuerpo anti CK de conejo (Abeam): Anti-Daylight 488 de ratón

Anticuerpo anti CK18 humana de ratón (Daco): Anti-Daylight 594 de ratón

Anticuerpo anti CK14 humana de ratón (Daco): Anti-Daylight 488 de rata

Anti MNF humano de ratón (Santa Cruz): Anti-Daylight 594 de rata

Anticuerpo anti Ki-67 humano de ratón (Daco): Anti-AMCA de rata

Anticuerpo anti nestina humana de ratón (MBL): Anti-Alexa Fluor 488 de conejo

Anticuerpo anti nestina de ratón de cabra (Santa Cruz): Anti-Cy5 de conejo

Anticuerpo anti CCSP de ratón de conejo (Abeam): Anti-AMCA de conejo

Anti GFP de conejo (Abeam): Anti-Alexa Fluor 488 de cabra

Anti GFP de pollo (Abeam): Anti-rojo de rodamina de cabra

Anti CGRP humana de cabra (Santa Cruz): Anti-AMCA de cabra

Anticuerpo anti hidroxilasa de tirosina de pollo (Abeam): Anti-Alexa Fluor 488 de pollo

Anticuerpo anti proteína tensioactiva C de conejo (Santa Cruz)

Anti CFTR de conejo (Abeam)

Anticuerpo anti CD31 humano de rata (Daco)

Anticuerpo anti CD31 de ratón de conejo (Daco)

Anticuerpo anti CD11c humano de ratón (Daco)

Anticuerpo anti CD20 de conejo (Daco)

Anticuerpo anti CD3 de ratón (Daco)

Anticuerpo anti Sca-PE de ratón; Anti Sca-FITC de ratón (Biolegend)

Anticuerpo anti CD45-APC de ratón (Biolegend)

Anticuerpo anti CD31-APC de ratón; anti CD31-PE-Cy7 de ratón (Biolegend)

Anti CD326-Percp-Cy5.5 de ratón (Biolegend)

Anti CD49f-FITC de ratón (Biolegend)

Anti CD24-PE-Cy7 de ratón (Biolegend)

Anti CD104-Pacific blue de ratón (Biolegend)

Anti CD9O-Pacific blue de ratón (Biolegend)

Anti CD73-PE de ratón (Biolegend)

Anti CD45-APC-Cy77 humano (Biolegend)

Anti CD326-APC humano (Biolegend)

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Claims

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