ES2938342T3 - Ratones modificados genéticamente y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

La invención se refiere en general a animales no humanos genéticamente modificados que expresan polipéptidos humanos y sus métodos de uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ratones modificados genéticamente y métodos de uso de los mismos

Antecedentes de la invención

El objetivo de la investigación biomédica es obtener una mejor comprensión de la fisiología humana y utilizar este conocimiento para prevenir, tratar o curar enfermedades humanas. Debido a las barreras prácticas y éticas a la experimentación en seres humanos, muchos estudios se llevan a cabo en modelos de animales pequeños, tal como en ratones. Sin embargo, los ratones no son personas y el conocimiento obtenido de la experimentación con animales no siempre es aplicable a los seres humanos. En este contexto, los ratones repoblados con un sistema hematolinfoide humano (SHLH) representan un modelo animal pequeño útil para el estudio de la hematopoyesis humana y la función inmunológica in vivo.

Los ratones SHLH se generan mediante el trasplante de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas (CMPH) y/o tejidos fetales humanos en ratones receptores deficientes en las ramas innata y adaptativa de la respuesta inmunitaria. Los primeros modelos de ratones SHLH se desarrollaron a finales de la década de 1980 (Mosier et al., 1988, Nature 335:256-259; McCune et al., 1988, Science 241:1632-1639; Kamel-Reid y Dick, 1988, Science 242:1706-1709), y desde entonces se ha llevado a cabo una serie de mejoras (Legrand et al., 2006, Journal of Immunology 176: 2053-2058; Shultz et al., 2007, Nature Reviews Immunology 7:118-130). Las cepas de ratones utilizadas actualmente como receptores para el injerto hematopoyético humano comparten tres características. En primer lugar, carecen de linfocitos B y T debido a la mutación Scid en el gen que codifica la proteína PRKDC (Mosier et al., 1988, Nature 335:256-259; McCune et al., 1988, Science 241:1632-1639) o debido a la deleción de uno de los dos genes Rag (Shultz et al., 2000, Journal of immunology 164:2496-2507; Traggiai et al., 2004, Science 304:104-107). En segundo lugar, la deleción o mutación del gen Il2rg que codifica la cadena gamma común (^yc) de los receptores de citocinas suprime la señalización de IL-15 y da como resultado la ausencia de células NK (Traggiai et al., 2004, Science 304:104-107; Ito et al. 2002, Blood 100:3175-3182). En tercer lugar, la interacción entre el receptor SIRPA expresado en macrófagos de ratón y el ligando CD47 en células humanas proporciona una señal inhibitoria a los macrófagos de ratón y confiere tolerancia fagocítica al xenoinjerto humano (Takenaka et al., 2007, Nature Immunology 8:1313-1323; Takizawa y Manz, 2007, Nature Immunology 8:1287-1289). La interacción entre especies entre el SlRPA expresado en células de ratón y el CD47 humano se logra cuando se usa el fondo genético NOD que contiene un polimorfismo natural en el gen Sirpa (Takenaka et al., 2007, Nature Immunology 8:1313-1323; Takizawa y Manz, 2007, Nature Immunology 8:1287-1289; Legrand et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108:13224-13229) o por expresión transgénica BAC del gen SIRPA humano (Strowig et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108:13218-13223). Se alcanzan niveles altos de injerto de células hematopoyéticas humanas tras el trasplante de CMPH humanas cuando se usaron ratones NOD Scid Yc'7' (NOG (Ito et al. 2002, Blood 100:3175-3182) o NSG (Ishikawa et al., 2005, Blood 106:1565-1573)) o hSIRPAtg RAG2‘/‘ Yc^ (SRG (Strowig et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108:13218-13223)) como receptores.

Aunque se observa desarrollo hematopoyético humano multilinaje en estas cepas receptoras, la diferenciación terminal, la homeostasis y/o la función efectora de la mayoría de los tipos de células humanas es subóptima. Se ha planteado la hipótesis de que esta afección se debe a una reactividad cruzada reducida o ausente entre las citocinas secretadas por los tejidos del ratón y los receptores humanos expresados en las células hematopoyéticas (Manz, 2007, Immunity 26:537-541; Willinger et al., 2011, Trends in Immunology 32:321-327). Para eludir esta limitación, se han desarrollado varias estrategias para administrar citocinas humanas en el huésped ratón. Estos métodos incluyen la inyección de citocinas recombinantes (Lapidot et al., 1992, Science 255:1137-1141; van Lent et al., 2009, J. Immunol 183:7645-7655), la administración lentiviral de ADNc que codifica citocinas (O'Connell et al., 2010, PloS One 5(8):e12009), la inyección hidrodinámica de ADN plasmídico (Chen et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:21783-21788), la expresión transgénica de ADNc (Nicolini et al., et al., 2004, Leukemia 18(2):341-347; Brehm et al., 2012, Blood 119:2778-2788; Takagi et al., 2012, Blood 119:2768-2777) o el reemplazo directo de genes que codifican citocinas (Rongvaux et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108:2378-2383; Willinger et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108:2390-2395; Rathinam et al., 2011, Blood 118:3119-3128). El último método tiene la ventaja de una expresión más fisiológica del gen humano. Asimismo, si la citocina humana no es completamente cruzada en el receptor del ratón, puede inducir un defecto en las poblaciones de células de ratón y conferir una ventaja competitiva adicional a las células humanas. Usando una estrategia de reemplazo de genes por inserción (knock-in), la humanización del gen que codifica la trombopoyetina (Tpo) dio como resultado un mejor mantenimiento de las células madre hematopoyéticas humanas funcionales y un mayor injerto en la médula ósea (Rongvaux et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108:2378-2383); el reemplazo de los genes que codifican interleucina-3 y GM-CSF (Il3 y Csf2) indujo la pérdida de macrófagos alveolares (MA) de pulmón de ratón y el desarrollo de MA humanos funcionales (Willinger et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108:2390-2395); y la sustitución del gen Csf1, que codifica M-C^s F, dio como resultado un aumento del número de monocitos humanos en múltiples tejidos (Rathinam et al., 2011, Blood 118:3119-3128).

Los sistemas hematolinfoides humanos y de ratón difieren en muchos aspectos (Haley, 2003, Toxicology 188:49-71; Mestas y Hughes, 2004, J Immunol 172:2731-2738). Una de las principales diferencias entre las dos especies radica en su fórmula diferencial de glóbulos blancos (WBC). La sangre humana es rica en células mieloides que representan el 50-75 % del total de glóbulos blancos. Por el contrario, la sangre de ratón está dominada por los linfocitos y solo el 20-30 % de los glóbulos blancos son de linajes mieloides. Esta diferencia entre especies, cuyo significado funcional y evolutivo no se entiende, no se recapitula en ratones SHLH convencionales como NOG/n Sg o SRG. En efecto, el desarrollo mieloide humano es particularmente defectuoso en estos huéspedes, de modo que las células mieloides representan solo el 5-10 % de los glóbulos blancos humanos.

Una aplicación de ratones con sistemas inmunitarios humanos funcionales es el desarrollo y prueba de vacunas humanas. Históricamente, la inducción de respuestas inmunitarias in vivo ha sido relativamente ineficiente (2004, Traggiai et al., Science 304:104-107; 2002, Ito et al., Blood 100:3175-3182; 2005, Ishikawa et al., Blood 106:1565-1573; 2005, Shultz et al., J Immunol 174:6477-6489; 2006, Baenziger et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:15951-15956). Varios estudios han indicado la existencia de respuestas inmunitarias específicas de patógenos satisfactorias tras la infección. Aunque se informó que alrededor del 50 % de los ratones produjeron IgM e IgG específicas del virus tras la infección por el virus del dengue (2007, Kuruvilla et al. Virology 369:143-152), otros estudios informaron sobre frecuencias por debajo del 20 % de ratones que producen IgM e IgG específicas de antígeno después de la infección por VIH y EBV (2006, Baenziger et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:15951-15956; 2008, Yajima et al., J Infect Dis 198:673-682). Tras la inmunización con adyuvante y antígeno, el cambio de clase de las inmunoglobulinas específicas de antígeno también es históricamente ineficiente, ya que solo una fracción de los animales inmunizados muestra respuestas de IgG específicas de antígeno (2004, Traggiai et al., Science 304:104-107; 2002, Ito et al., Blood 100:3175-3182; 2005, Ishikawa et al., Blood 106:1565-1573; 2005, Shultz et al., J Immunol 174:6477-6489; 2009, Watanabe et al., Int Immunol 21:843-858; 2010, Becker et al., PLoS ONE 5). Estos estudios incluyeron ratones NSG y BALB/c RAG2-/- Ye7'y diferentes combinaciones de adyuvante/antígeno.

Existe la necesidad en la técnica de animales no humanos humanizados capaces de soportar y sostener el injerto con células hematopoyéticas humanas. La presente invención aborda esta necesidad no satisfecha en la técnica.

Sumario de la invención

La invención se refiere en general a ratones modificados genéticamente que expresan M-CSF humano, IL-3 humana, GM-CSF humano, SIRPA humano y TPO humano, así como a sus métodos de uso. Así, la invención proporciona un ratón modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1. El ratón modificado genéticamente es inmunodeficiente y no expresa la cadena gamma del receptor Rag-2 o IL2 (cadena gamma-/- Rag- 2-/-). En una realización, el ratón modificado genéticamente también incluye al menos una célula hematopoyética humana. En una realización, el ratón modificado genéticamente también incluye al menos una célula cancerosa humana. En algunas realizaciones, la célula cancerosa humana es una célula de leucemia o una célula de melanoma.

En otra realización, la invención es un método de injerto de células madre y progenitoras hematopoyéticas (CMPH) de acuerdo con la reivindicación 5. En algunas realizaciones, las CMPH son CMPH humanas. En una realización, el ratón modificado genéticamente comprende una célula cancerosa humana. En una realización, la célula cancerosa humana es una célula de leucemia o una célula de melanoma.

Breve descripción de los dibujos

La siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención se entenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. A fin de ilustrar la invención, se muestran en los dibujos las realizaciones que se prefieren actualmente. Debe entenderse, sin embargo, que la invención no está limitada a las disposiciones precisas e instrumentos de las realizaciones mostradas en los dibujos.

La Figura 1, que comprende las Figuras 1A-1E, representa los resultados de experimentos que muestran que los ratones MISTRG soportan altos niveles de injerto hematopoyético humano. Se injertaron ratones recién nacidos preacondicionados con rayos X de las cepas indicadas mediante inyección intrahepática de 100.000 células (FL-)CD34+ de hígado fetal humano. Los niveles de injerto humano (células hCD45+) se midieron en la sangre 7-9 semanas más tarde y en la MO 10-12 semanas más tarde. (Figura 1A) Análisis de citometría de flujo representativo de la frecuencia de células CD45+ de ratón y humanas en la sangre y la MO de los ratones receptores indicados. Los números junto a las áreas acotadas indican porcentajes entre el total de células CD45+. (Figura 1B) Datos combinados de niveles de injerto de sangre (% de células CD45+) de 19 experimentos independientes. En cada experimento, una sola muestra de células FL-CD34+ se dividió y se inyectó en ratones de las respectivas cepas. Cada símbolo representa un ratón individual y las barras rojas indican los valores medios (n=56-155; ns, no significativo; * p<0,05 Prueba de Tukey (véase la Figura 6 para un análisis estadístico completo). La línea horizontal gris indica el 10 % de células hCD45+. (Figura 1C) Niveles de injerto en la MO de un subconjunto representativo de ratones (Figura 6C) del panel (Figura 6B) (n=12-16; * p<0,05 prueba de Tukey; véanse también las Figuras 6D-6E). (Figura 1D) Análisis de citometría de flujo representativo de injerto de células hCD45+ en sangre y MO 3 meses después de la inyección intrahepática de 200.000 células FL-CD34+ en ratones MISTRG recién nacidos no irradiados. (Figura 1E) Niveles de injerto de células CD45+ humanas en la sangre y la MO de ratones MISTRG trasplantados como en (Figura 1D) (n = 16). En este caso, la MO de todos los ratones (incluidos los ratones con hCD45+ en sangre < 10 %).

La Figura 2, que comprende las Figuras 2A-2K, representa los resultados de los experimentos que muestran que los ratones MISTRG favorecen el desarrollo y el mantenimiento mieloides eficientes en tejidos linfoides y no linfoides. (Figura 2A) Porcentajes de células mieloides humanas (hCD33+) entre células hematopoyéticas humanas (hCD45+) en la sangre de los ratones receptores indicados, injertados como recién nacidos mediante inyección intrahepática de células FL-CD34' después del preacondicionamiento con rayos X. Cada símbolo representa un ratón individual y las barras rojas indican los valores medios (n=20-113; el análisis estadístico se muestra en la Figura 7A). (Figura 2B) Composición de glóbulos blancos humanos en los mismos ratones (n=20-113 ratones/grupo; n=8 donantes humanos; las barras de error indican el EEM). (Figura 2C) Tinción inmunohistológica de células mieloides humanas (hCD68+) en tejidos no linfoides de los ratones receptores indicados. La barra negra representa 20 pm y las imágenes que se muestran son representativas de al menos tres ratones analizados por ^{grupo. (Figura 2D y Figura 2E) Análisis de citometría de flujo representativo (Figura 2D) y frecuencias (Figura} 2^e) de subconjuntos de monocitos humanos, identificados por expresión de CD14 y CD16 entre células hCD45+CD33+ en la sangre de los ratones receptores (n=8-12 ratones/grupo; las barras de error indican el EEM). (Figura 2F y Figura 2G) Producción de citocinas por monocitos humanos aislados de la MO de receptores MITRG y estimulados in vitro con LPS (Figura 2F) o R848 (Figura 2G) (las barras de error indican la SD de los triplicados; representativo de 3 experimentos independientes). (Figura 2H) Fagocitosis in vitro de E. coli que expresa GFP por células humanas presentes en la sangre de ratones MITRG (n=7). (Figuras 2I, 2J, 2K) Producción de citocinas in vivo medida mediante ELISA en el suero o por RT-PCR en pulmón de ratones tratados con LPS (Figura I; 90 min, n=15-18), o infectados con Listeria monocytogenes (Figura 2J; día 2, n=6-15) o influenza A/PR8 H1N1 (Figura 2K; día 3, n=3-5). (Figuras 2A, 2J, 2K) Valores de p calculados mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba posthoc de Tukey (* p<0,05); (Figura 21) Valor p calculado mediante la prueba t de Student no apareado t-prueba en valores transformados log10.

La Figura 3, que comprende las Figuras 3A-3I, representa los resultados de los experimentos que muestran que los ratones MISTRG soportan de manera eficiente el desarrollo y la función de las células NK humanas. (Figura 3A) Análisis por RT-PCR cuantitativa de la expresión de ARNm de IL-15 e IL-15Ra humanas en el hígado de ratones NSG MITRG y MISTRG injertados (n=7-8; valores de p calculados por ANOVA unidireccional; *, p<0,05 prueba post hoc de Tukey). La expresión se normalizó a ratón. Hprt. (Figura 3B) Análisis por RT-PCR cuantitativa de la expresión de ARNm de IL-15 e IL-15Ra humanas en poblaciones de células humanas purificadas de médula ósea de MITRG injertado (n = 4-5, las barras de error indican el EEM). La expresión se normalizó a HPRT humanos y se muestra en relación con células hCD14+hCD16. (Figura 3C y Figura 3D) Análisis de citometría de flujo representativo (acotado en células hCD45+mCD45‘, acotado de linfocitos; los números junto a las áreas delineadas indican porcentajes de células) (Figura 3C) y número absoluto o frecuencia (Figura 3D) de células NK humanas ^{(hNKp46+ hCD3‘) en ratones} NS^g, MIT^rG ^{y MISTRG injertados (n=8-16; valores de p calculados por ANOVA} unidireccional; *, p<0,05 prueba post hoc de Tukey). (Figura 3E) Número absoluto de NK de hígado humano (hNKp46+hCD3) y linfocitos s T (hCD3+, mostrado como control) de ratones MISTRG injertados que se dejaron sin tratar o se trataron durante 3 días consecutivos con clodronato encapsulado en liposomas para agotar las células fagocíticas (n=8; valor p calculado mediante prueba t de Student no pareada; ns, no significativo). (Figura 3F) Se inyectaron i.v. células LCL721.221 (HLA clase I negativas) y LCL721.45 (clase I positivas) marcadas en una proporción de 1:1, y las proporciones de HLA clase I positivas o negativas, entre las células marcadas recuperadas 12 horas más tarde en el bazo, se usaron para calcular la citotoxicidad específica de las células NK (n = 8, valor p calculado mediante prueba t de Student no pareada). (Figura 3G) Análisis por RT-PCR cuantitativa de la expresión ^{de ARNm de} IFN^{y humano en el hígado de ratones NSG y MISTRG 2 días después de la infección por Listeria} (n=8-9, valor p calculado mediante prueba t de Student no pareada). La expresión se normalizó a ratón. Hprt. (Figura 3H y Figura 3I) Análisis de citometría de flujo representativo (Figura 3H) y frecuencia (Figura 3I) de ^{expresión y desgranulación de IFNy (CD107a+) células n}K ^{de hígado humano de ratones NSG y MISTRG no} infectados o infectados con Listeria (n=4-11; valor p calculado por ANOVA unidireccional). Los resultados se combinan de dos (Figuras 3A, 3E-3I), tres (Figura 3B) o cuatro (Figuras 3C, 3D) experimentos.

La Figura 4, que comprende las Figuras 4A-4F, representa los resultados de experimentos que muestran que las células mieloides humanas en MISTRG se infiltran en un tumor y soportan su crecimiento. La línea celular de melanoma humano Me290 se implantó en el flanco de ratones NSG y MISTRG injertados o no injertados. Algunos ratones fueron tratados con el inhibidor de VEGF Avastin™. Los tumores se midieron y diseccionaron para su análisis 11 días después. (Figura 4A) Infiltración de células hematopoyéticas humanas en el tumor, determinada por la expresión de ARNm que codifica marcadores hematopoyéticos humanos (PTPRC, que codifica CD45) y mieloide (ITGAM, que codifica CD11b) (n=6-7; valor p calculado mediante prueba t de Student no pareada). (Figura 4B y Figura 4D) Imágenes representativas de inmunohistoquímica de marcadores de células mieloides humanas en tumores de ratones NSG, MISTRG y pacientes. (Figura 4C) Cuantificación de la densidad de células CD163+ (n=3 muestras/grupo, 3 portaobjetos contados/muestra). (Figura 4E y Figura 4F) Imágenes representativas (Figura 4E) y volumen (Figura 4F) de los tumores en los grupos de ratones indicados (n=7-24 ratones/grupo). Los valores de p se calcularon mediante prueba t de Student (Figura 4A) o por ANOVA unidireccional (Figuras 4C, 4E) seguido de la prueba posthoc de Tukey (* p<0,05).

La Figura 5 representa las citocinas implicadas en la función de las CMH y el desarrollo mieloide. Representación esquemática del desarrollo de células madre hematopoyéticas en células mieloides y una lista no exhaustiva de citocinas que se sabe que regulan este proceso. El sombreado indica los porcentajes de identidad de aminoácidos entre las citocinas humanas y de ratón. El porcentaje de identidad de aminoácidos es la medida más objetiva de la conservación de proteínas entre especies, pero no siempre se correlaciona con la reactividad cruzada funcional entre especies In vivo. Los rectángulos negros indican citocinas que están genéticamente humanizadas en MISTRG. CMH, células madre hematopoyéticas; PMP, progenitores multipotenciales; CMP, progenitores mieloides comunes; PMG, progenitores de macrófagos/granulocitos; PME, progenitores de megacariocitos/eritrocitos. La Figura 6, que comprende las Figuras 6A-6E, representa los resultados del análisis estadístico de los niveles de injerto en ratones receptores. (Figura 6A) Análisis estadístico (ANOVA unidireccional seguido de prueba post-hoc de Tukey; ns, no significativo) de los datos presentados en la Figura 1A (porcentaje de células hCD45+ en la sangre de los ratones receptores). (Figura 6B) Número de ratones receptores que alcanzan un nivel de injerto de al menos 10 % de células hCD45+ en la sangre 7-9 semanas después del trasplante. (Figura 6C) Niveles de injerto de sangre de los ratones utilizados en la Figura 1C para el análisis de la MO. (Figura 6D) Análisis estadístico, similar a (Figura 6A), de los datos presentados en la Figura 1C (porcentaje de células hCD45+ en la MO de los ratones receptores). (Figura 6E) Números absolutos de células hCD45+ en la MO (2 fémures y 2 tibias) de los ratones receptores que se muestran en la Figura 1C. El número reducido de células en la MO de MISTRG se debe al menor tamaño de los ratones a esa edad (10-12 semanas después del trasplante) y es causado por los primeros signos clínicos de anemia descritos en detalle en la Figura 10.

La Figura 7, que comprende las Figuras 7A-7H, representa los resultados de los experimentos que evalúan el desarrollo mieloide humano mejorado en ratones MISTRG. (Figura 7A) Análisis estadístico (ANOVA unidireccional seguido de prueba post-hoc de Tukey; ns, no significativo) de los datos presentados en la Figura 2A (porcentaje de células hCD33+ en la sangre de los ratones receptores). (Figura 7B y Figura 7C) Frecuencias (Figura 7B) y análisis estadístico (Figura 7C) de células mieloides humanas (hCD33+) en la MO de los ratones receptores. (Figura 7D) Análisis de citometría de flujo representativo de linajes linfoides y mieloides humanos en la sangre de MISTRG. (Figura 7E y Figura 7F) Análisis de citometría de flujo representativo de monocitos humanos (CD33alSSCbaCD66‘) y granulocitos (CD33+SSCalCD66+) en la MO (Figura 7E) y sangre (Figura 7F) de MISTRG y donante humano. (Figura 7G y Figura 7H) Números absolutos de células mieloides humanas (hCD33+) en el pulmón (Figura 7G) y el hígado (Figura 7H) de ratones receptores (n=8-12; valores de p calculados mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba posthoc de Tukey, * p<0,05).

La Figura 8, que comprende las figuras 8a y 8B, representa los resultados de experimentos que muestran un desarrollo mejorado de subconjuntos de monocitos humanos en ratones MISTRg . (Figura 8A) Análisis de citometría de flujo representativo de subconjuntos de monocitos humanos, identificados por expresión de CD14 y CD16 entre las célulashCD45+CD33+ en MO, bazo, pulmón e hígado de los ratones receptores indicados. (Figura 8B) Frecuencias (las barras de error representan SEM) entre células hCD33+ y números absolutos de subconjuntos de monocitos en el pulmón y el hígado de los ratones receptores (n = 12 ratones/grupo; valores de p calculados por ANOVA unidireccional; *, p<0,05 prueba post hoc de Tukey).

La Figura 9, que comprende las figuras 9A y 9B, describe los resultados de experimentos que muestran que los subconjuntos de monocitos humanos son similares en MISTRG y en donantes humanos. Inmunofenotipo extendido de los subconjuntos indicados de monocitos humanos en la sangre (Figura 9A) y la MO (Figura 9B) de receptores MISTRG y donantes humanos. Se muestra la tinción con anticuerpos de control de isotipo y anticuerpos específicos.

La Figura 10, que comprende las Figuras 10A-10I, representa los resultados de experimentos que muestran que las células mieloides humanas violan la tolerancia fagocítica de humano a ratón. (Figura 10A) Los glóbulos rojos de ratón marcados con CFSE se transfirieron a los ratones indicados y la frecuencia de las células marcadas se midió en los puntos de tiempo indicados. (Figura 10B) Los ratones MISTRG injertados se pretrataron o no con clodronato para agotar las células fagocíticas y los glóbulos rojos de ratón marcados con CFSE se transfirieron y monitorizaron como en la (Figura 10A) (valor p, efecto de clodronato medido por ANOVA de medidas repetidas para los días 1-3). Estos resultados muestran que los glóbulos rojos de ratón transferidos se eliminan rápidamente in vivo por células fagocíticas que están presentes en MISTRG pero no en NSG. (Figura 10C) Recuentos de glóbulos rojos en la sangre de ratones no injertados (n = 9-15) u 8-10 semanas después del injerto con FL-CD34+ humano células (n=11-37). Los valores de p indican la comparación entre ratones no injertados y ratones injertados de cada genotipo (prueba t de Student no pareada). (Figura 10D) Correlación entre los niveles de injerto humano (porcentaje de células hCD45+ en la sangre) y recuentos de glóbulos rojos (n = 13-22). (Figura 10E) Análisis de citometría de flujo de células eritroides de ratón (mTer119+) y humanas (hCD235a+) en la sangre de ratones MISTRG no injertados o injertados, mostrando que casi todas las células eritroides en la sangre de ratones MISTRG injertados son de origen de ratón, y las células eritroides humanas son apenas detectables. (Figura 10F) Imágenes representativas y peso del bazo de ratones injertados de las cepas indicadas (n=3-22), que muestran esplenomegalia en ratones MISTRG injertados. Se usaron bazos de ratones Balb/c como control (valor p, ANOVA unidireccional; *, p<0,05 en comparación con todos los demás grupos, prueba post hoc de Tukey). (Figura 10G) Corte histológico del bazo de ratones NSG injertado y MISTRG injertados teñido con H&E, que ilustra el agrandamiento de la pulpa roja en ratones MISTRG con esplenomegalia. (Figura 10H) Análisis de citometría de flujo de progenitores eritroides de ratón (mTer119+mCD71+), que representan hasta el 80 % de las células en el bazo de ratones MISTRG injertados. (Figura 10I) Los frotis de sangre de ratones MISTRG no injertados e injertados ilustran el enriquecimiento en reticulocitos. Considerados en conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que la anemia en MISTRG es el resultado de la ausencia de tolerancia fagocítica de humano a ratón y la eritropoyesis extramedular masiva de ratón no logra compensar la destrucción de mRBC. Los resultados son representativos de al menos 5 ratones examinados en cada grupo (Figuras 10C, 10E-10I) y 2 experimentos independientes (Figuras 10A, 10B).

La Figura 11, que comprende las figuras 11A y 11B, representa los resultados de experimentos que muestran que los ratones MISTRG proporcionan IL-15/IL-15Ra humana. (Figura 11A) Análisis por RT-PCR cuantitativa de la expresión de ARNm de IL-15 e IL-15Ra humana en el pulmón de ratones NSG iMITRG y MISTRG injertados (n=7-8; valores de p calculados por ANOVA unidireccional; *, p<0,05 prueba post hoc de Tukey). La expresión se normalizó a ratón. Hprt. (Figura 11B) Análisis de citometría de flujo de la expresión de IL-15Ra en poblaciones de células humanas (hCD45+mCD45-) de sangre de ratones MISTRG injertados (representativos de n=4). Los histogramas representan tinción con control de isotipo o con anticuerpo lL-15Ra, respectivamente. Los resultados son representativos o combinados de dos experimentos.

La Figura 12, que comprende las figuras 12A y 12B, representa los resultados de experimentos que muestran un desarrollo mejorado de células NK humanas en ratones MISTRG. (Figura 12A y Figura 12B) Frecuencia (Figura 12A) y número absoluto (Figura 12B) de células NK humanas (hNKp46+ hCD3-) en ratones Ns G, MITRG y MISTRG injertados (n=8-16; valores de p calculados por ANOVA unidireccional; *, p<0,05 prueba post hoc de Tukey). Los resultados se combinan a partir de cuatro experimentos.

La Figura 13, que comprende las Figuras 13A-13F, representa los resultados de experimentos que muestran que las células NK humanas de buena fe que exhiben una maduración mejorada están presentes en ratones MISTRG. (Figura 13A) Análisis de citometría de flujo de la expresión de CD94 y CD161 en células NK de sangre humana de un donante humano y ratones MISTRG injertados (n=3). Los histogramas representan la tinción con Ac de control de isotipo o con Ac CD94/CD161. (Figura 13B) Análisis de citometría de flujo de la expresión de KIR en células NK de sangre humana de un donante humano o de ratones MISTRG injertados (n=3). Los números indican frecuencias de células KIR+. (Figura 13C y Figura 13D) Expresión en superficie de CD16 en células NK humanas de ratones NSG, MITRG y MISTRG (n=4-8; valores de p calculados por ANOVA unidireccional; *, p<0,05 prueba post hoc de Tukey). (Figura 13E y Figura 13F) Expresión de perforina intracelular por NK de hígado humanas (hNKp46+hCD3-) y linfocitos T (hCD3+) de ratones NSG y MISTRG injertados (n=3; valor p calculado mediante prueba t de Student no pareada). IFM, intensidad de fluorescencia media. Los resultados son representativos o combinados de uno (Figura 13A y Figura 13B), dos (Figura 13E y Figura 13F) o cuatro (Figura 13C y Figura 13D) experimentos. La figura l4 representa los resultados de los experimentos que muestran el efecto de la depleción de monocitos/macrófagos humanos sobre la homeostasis de las células NK humanas en ratones MISTRG. Los ratones MISTRG injertados se dejaron sin tratar o se trataron durante 3 días consecutivos con clodronato encapsulado en liposomas para agotar las células fagocíticas. Se muestra el análisis de citometría de flujo de monocitos/macrófagos humanos (panel superior, acotado en células hCD33+) y células NK (hNKp46+hCD3-) en hígado (n=8). Los resultados son representativos de dos experimentos. En 1 de cada 8 ratones, la depleción de clodronato de monocitos/macrófagos no fue efectiva, y no se observó reducción en el número de células NK en ese ratón.

La figura 15 representa los resultados de experimentos que muestran inmunohistoquímica de células mieloides humanas infiltrando melanoma. Tinción inmunohistoquímica representativa de células mieloides humanas en tumores de ratones NSG, MISTRG o pacientes humanos. Se muestran tres sujetos por grupo y 3 imágenes por sujeto.

La figura 16 muestra una comparación de los niveles de injerto y el desarrollo y la función de las células inmunitarias en ratones receptores con reemplazo de un solo gen, en ratones NSG, MISTRG y en seres humanos.

La Figura 17, que comprende las Figuras 17A-17D, representa los resultados de experimentos que demuestran que las muestras aisladas de pacientes con LMA, LMM^c y SMD se pueden injertar en ratones MISTRG. (Figura 17A) Características de las muestras utilizadas (incluido el tipo de enfermedad y la anomalía genética encontrada en las muestras de los pacientes), protocolo experimental (método de purificación celular, número de células inyectadas por ratón y tiempo posterior al trasplante en el que se analizaron los ratones) y resultados del injerto (incluido el número de ratones con injerto humano detectable, porcentaje de células CD45+ hematopoyéticas humanas y células CD33+ mieloides, y anormalidad genómica observada en células humanas aisladas de ratones). (Figura 17^b ) Análisis de citometría de flujo representativo de la granularidad (SSC) de células CD33+ mieloides aisladas de un ratón trasplantado con células RAEB I de paciente o de donantes normales, mostrando granularidad deficiente en muestras de RAEB I. (Figura 17C) Análisis de peces representativos de células humanas aisladas de ratones trasplantados con muestra RAEB II y que muestra la ausencia del cromosoma 5q. (Figura 17D) Cariotipo de células humanas aisladas de ratones trasplantados con muestra de LMMC y que muestran deleción en el cromosoma 6.

Descripción detallada

La invención se refiere en general a un ratón modificado genéticamente que expresa M-CSF humano, IL-3 humana, GM-CSF humano, SIRPA humano y TPO humano. La invención también se refiere a métodos de generación y métodos de uso de ratones modificados genéticamente descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el ratón modificado genéticamente descrito en el presente documento se injerta con células hematopoyéticas humanas. En diversas realizaciones, los ratones modificados genéticamente injertados con células hematopoyéticas humanas son útiles para la evaluación in vivo del crecimiento y la diferenciación de células hematopoyéticas e inmunitarias, para la evaluación in vivo de la hematopoyesis humana, para la evaluación in vivo de células cancerosas, para la evaluación in vivo de una respuesta inmunitaria, para la evaluación in vivo de vacunas y regímenes de vacunación, para el uso en la prueba del efecto de los agentes que modulan el crecimiento o la supervivencia de las células cancerosas, para la evaluación in vivo de un tratamiento del cáncer, para la producción in vivo y recolección de mediadores inmunitarios, incluidos anticuerpos humanos, y para su uso en la prueba del efecto de los agentes que modulan la función de las células hematopoyéticas e inmunitarias.

Definiciones

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Dichos términos y expresiones se encuentran definidos y se usan en contexto en varias referencias estándar que incluyen ilustrativamente a J. Sambrook y D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3a ed., 2001; F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5.a Ed., 2002; B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4a Ed., Garland, 2002; D. L. Nelson y M. M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4a Ed., W. H. Freeman & Company, 2004; y Herdewijn, P. (Ed.), Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2004. Aunque puede utilizarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos.

Como se usa en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con él en esta sección.

En el presente documento, los artículos "un" y "uno(a)" se usan para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Como ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

"Aproximadamente", como se usa en el presente documento, cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ± 20 % o ± 10 %, más preferentemente ±5 %, incluso más preferentemente ±1 % y aún más preferentemente ±0,1 % del valor especificado, ya que tales variaciones son adecuadas para realizar los métodos desvelados.

El término "anormal" cuando se usa en el contexto de organismos, tejidos, células o componentes de las mismas, se refiere a los organismos, tejidos, células o componentes de las mismas que se diferencian al menos en una característica observable o detectable (por ejemplo, edad, tratamiento, momento del día, etc.) de los organismos, tejidos, células o componentes de las mismas que presentan la respectiva característica "normal" (esperada). Características que son normales o esperadas para una célula o tipo de tejido, podrían ser anormales para un tipo diferente de célula o tejido.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que es capaz de unirse específicamente a un epítopo específico en un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos en la presente invención pueden existir en diversas formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos intracelulares ("intracuerpos"), Fv, Fab y F(ab)2, así como anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos de cadena pesada, tal como anticuerpos de camélidos y anticuerpos humanizados (Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).

El término "cáncer", como se usa en el presente documento, se define como una enfermedad caracterizada por el crecimiento y/o la proliferación rápida e incontrolada de células aberrantes. Las células cancerosas se pueden diseminar localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. El cáncer como el de este caso incluye en el presente documento tanto tumores sólidos como neoplasias malignas hematopoyéticas. Los ejemplos de varios cánceres susceptibles de la invención incluyen, pero sin limitaciones, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello del útero, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, síndromes mielodisplásicos, trastornos mieloproliferativos y similares.

La expresión "constitutivo/a" es un estado en el que se produce un producto génico en una célula viva en la mayoría o en todas las condiciones fisiológicas de la célula.

Una "región codificante" de un gen consiste en los restos nucleotídicos de la cadena codificante del gen y los nucleótidos de la cadena no codificante del gen que son homólogos o complementarios a, respectivamente, la región codificante de una molécula de ARNm que se produce mediante la transcripción del gen.

Una "región codificante" de una molécula de ARNm también consiste en los restos nucleotídicos de la molécula de ARNm que se emparejan con una región anticodón de una molécula de ARN de transferencia durante la traducción de la molécula de ARNm o que codifican un codón de terminación. Por tanto, la región codificante puede incluir restos nucleotídicos que comprenden codones para residuos de aminoácidos que no están presentes en la proteína madura codificada por la molécula de ARNm (por ejemplo, residuos de aminoácidos en una secuencia señal de exportación de proteína).

Una "enfermedad" es un estado de salud de un animal en donde el animal no puede mantener la homeostasia, y en donde si la enfermedad no mejora, la salud del animal continúa deteriorándose.

Por el contrario, un "trastorno" en un animal es un estado de salud en el que el animal es capaz de mantener la homeostasia, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Si se deja sin tratar, un trastorno no necesariamente causa una disminución adicional en el estado de salud del animal.

Una enfermedad o trastorno se "alivia" si se reduce la gravedad de un síntoma de la enfermedad o trastorno, la frecuencia con la que un paciente experimenta dicho síntoma, se reduce.

Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto es la cantidad de compuesto que es suficiente para proporcionar un efecto beneficioso al sujeto al que se administra el compuesto. Una "cantidad eficaz" de un vehículo de administración es la cantidad suficiente para unirse o suministrar eficazmente un compuesto.

"Que codifica" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia de nucleótidos definida (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia de aminoácidos definida y las propiedades biológicas resultantes de las mismas. Así, un gen codifica una proteína si la transcripción y la traducción del ARNm correspondiente a ese gen producen la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y por lo general se proporciona en listados de secuencias, como la cadena no codificante, utilizada como molde para la transcripción de un gen o ADNc, pueden denominarse codificantes de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

Como se usa en el presente documento, "endógeno" se refiere a cualquier material de o producido dentro de un organismo, célula, tejido o sistema.

Como se usa en el presente documento, el término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido desde o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.

Las expresiones "construcción de expresión" y "casete de expresión" se usan en el presente documento para hacer referencia a una molécula de ADN recombinante de doble cadena que contiene una secuencia codificante humana de ácido nucleico deseada y que contiene uno o más elementos reguladores necesarios o deseables para la expresión de la secuencia codificante operativamente unida.

Como se usa en el presente documento, el término "fragmento", aplicado a un ácido nucleico o polipéptido, se refiere a una subsecuencia de un polipéptido o ácido nucleico más grande. Un "fragmento" de un ácido nucleico puede tener al menos unos 15 nucleótidos de longitud; por ejemplo, al menos de aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos; al menos de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 500 nucleótidos, al menos de aproximadamente 500 nucleótidos a aproximadamente 1000 nucleótidos, al menos de aproximadamente 1000 nucleótidos a aproximadamente 1500 nucleótidos; o de aproximadamente 1500 nucleótidos a aproximadamente 2500 nucleótidos; o aproximadamente 2500 nucleótidos (y cualquier valor entero intermedio). Un "fragmento" de un polipéptido puede tener al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud; por ejemplo, al menos de aproximadamente 50 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos; al menos de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 aminoácidos, al menos de aproximadamente 500 aminoácidos a aproximadamente 1000 aminoácidos, al menos de aproximadamente 1000 aminoácidos a aproximadamente 1500 aminoácidos; o de aproximadamente 1500 aminoácidos a aproximadamente 2500 aminoácidos; o aproximadamente 2500 aminoácidos (y cualquier valor entero intermedio).

Como se usa en el presente documento, las expresiones "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido. Estas variaciones alélicas naturales normalmente pueden dar como resultado una variación del 1 al 5 % en la secuencia de nucleótidos de un gen determinado. Pueden identificarse alelos alternativos secuenciando el gen de interés en varios individuos diferentes. Esto puede llevarse a cabo fácilmente usando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético en diversos individuos. Todas y cada una de dichas variaciones de nucleótidos y los polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional pretenden estar dentro del alcance de la invención.

"Homólogo" como se usa en el presente documento, se refiere a la similitud de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición de subunidad en ambas moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si en cada una de las dos moléculas de ADN una posición está ocupada por adenina, son homólogos en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas, por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias compuestas son homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas en un 50 %, si el 90 % de las posiciones, por ejemplo, 9 de 10, son iguales u homólogas, las dos secuencias comparten un 90 % de homología. Como ejemplo, las secuencias de ADN 5-ATTGCC-3' y 5-TATGGC-3' comparten un 50 % de homología.

Las expresiones "células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas" y "CMPH humanas" como se usan en el presente documento, se refieren a células madre hematopoyéticas multipotenciales autorrenovables y células progenitoras hematopoyéticas.

La expresión "inducible" es un estado en el que se produce un producto génico en una célula viva en respuesta a la presencia de una señal en la célula.

Como se usa en el presente documento, un "material de formación" incluye una publicación, un registro, un diagrama, o cualquier otro medio de expresión que pueda usarse para comunicar la utilidad de un compuesto, composición, vector o sistema de administración de la invención en el kit para efectuar el alivio de las diversas enfermedades o trastornos citados en el presente documento. De forma opcional o alternativa, el material de formación puede describir uno o más métodos para aliviar las enfermedades o trastornos en una célula o tejido de un mamífero. El material de formación del kit de la invención puede, por ejemplo, adherirse a un recipiente que contenga el compuesto identificado, composición, vector, o sistema de administración de la invención o enviarse junto con un contenedor que contenga el compuesto identificado, composición, vector o sistema de administración. De manera alternativa, el material de formación se puede enviar por separado del contenedor con la intención de que el receptor utilice el material de formación y el compuesto de manera cooperativa.

El término "unido operativamente", como se usa en el presente documento, se refiere a un polinucleótido en relación funcional con un segundo polinucleótido. Al describir dos polinucleótidos como "unidos operativamente" se entiende que un resto de ácido nucleico de cadena simple o doble comprende los dos polinucleótidos dispuestos dentro del resto de ácido nucleico de tal manera que al menos uno de los dos polinucleótidos es capaz de ejercer un efecto fisiológico por el que se caracteriza, sobre el otro. Como ejemplo, un promotor unido operativamente a la región codificante de un gen puede promover la transcripción de la región codificante. Preferentemente, cuando el ácido nucleico que codifica la proteína deseada comprende además una secuencia promotora/reguladora, la secuencia promotora/reguladora se sitúa en el extremo 5' de la secuencia codificante de la proteína deseada de manera que dirige la expresión de la proteína deseada en una célula. En conjunto, el ácido nucleico que codifica la proteína deseada y su secuencia promotora/reguladora comprenden un "transgén".

El término "polinucleótido" como se usa en el presente documento se define como una cadena de nucleótidos. Asimismo, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Así, los ácidos nucleicos y los polinucleótidos como se usan en el presente documento son intercambiables. Un experto en la materia tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que pueden hidrolizarse en "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos pueden hidrolizarse en nucleósidos. Como se usa en el presente documento, los polinucleótidos incluyen, pero sin limitaciones, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen por cualquier medio disponible en la técnica, incluidos, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico de una biblioteca recombinante o un genoma celular, utilizando tecnología de clonación ordinaria y PCR, y similares, y por medios de síntesis.

Como se usa en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido", y "proteína", se usan indistintamente y se refieren a un compuesto comprendido por restos de aminoácido unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o un péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se establece ninguna limitación en cuanto al número máximo de aminoácidos que puede comprender la secuencia de una proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Como se usa en el presente documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, y a cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica proteínas, de las cuales hay tres tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos. El término "péptido" normalmente se refiere a polipéptidos cortos. El término "proteína" normalmente se refiere a polipéptidos grandes.

El término "progenie", como se usa en el presente documento, se refiere a un descendiente o descendencia e incluye la célula difunta diferenciada o indiferenciada derivada de una célula progenitora. En un uso, el término progenie se refiere a una célula descendiente que es genéticamente idéntica a la progenitora. En otro uso, el término progenie se refiere a una célula descendiente que es genética y fenotípicamente idéntica a la progenitora. En otro uso más, el término progenie se refiere a una célula descendiente que se ha diferenciado de la célula madre.

El término "promotor", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ADN unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir, tal como una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula deseada. Un promotor generalmente se coloca cadena arriba de una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y proporciona un sitio para la unión específica por la ARN polimerasa y otros factores de transcripción. En realizaciones específicas, un promotor generalmente se coloca cadena arriba de la secuencia de ácido nucleico transcrita para producir la molécula deseada y proporciona un sitio para la unión específica por la ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Un promotor incluido puede ser un promotor constitutivo o puede proporcionar una expresión inducible; y puede proporcionar expresión omnipresente, específica de tejido o de tipo celular.

Intervalos: a lo largo de la presente divulgación, se pueden presentar diversos aspectos de la invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es únicamente por conveniencia y brevedad y no debería interpretarse como una limitación inflexible sobre el alcance de la invención. En consecuencia, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha desvelado específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 ha divulgado específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.

Un "polipéptido recombinante" es uno, que se produce tras la expresión de un polinucleótido recombinante.

La expresión "elemento regulador", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos que controla algún aspecto de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos. Los elementos reguladores de ejemplo incluyen ilustrativamente un potenciador, sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), un intrón; un origen de replicación, una señal de poliadenilación (pA), un promotor, un potenciador, una secuencia de terminación de la transcripción y un dominio regulador cadena arriba, que contribuyen a la replicación, transcripción, procesamiento postranscripcional de una secuencia de ácido nucleico. Los expertos en la técnica son capaces de seleccionar y usar estos y otros elementos reguladores en una construcción de expresión sin más que experimentación rutinaria. Los constructos de expresión se pueden generar de forma recombinante o sintética utilizando una metodología bien conocida.

Por la expresión "se une específicamente", como se usa en el presente documento con respecto a un anticuerpo, se entiende un anticuerpo que reconoce un antígeno específico, pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas de una muestra. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de una especie también puede unirse a ese antígeno de una o más especies. Pero, tal reactividad cruzada entre especies no modifica por sí misma la clasificación de un anticuerpo como específico. En otro ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno también puede unirse a distintas formas alélicas del antígeno. Sin embargo, tal reactividad cruzada no modifica por sí misma la clasificación de un anticuerpo como específico.

En determinados casos, las expresiones "unión específica" o "que se une específicamente", pueden utilizarse en referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido con una segunda especie química, para referirse a que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteínica específica en lugar de a proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para el epítopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epítopo A (o A libre, sin marcar), en una reacción que contiene la "A" marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.

Por la expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se entiende un anticuerpo que se genera utilizando tecnología de ADN recombinante, tales como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago como se describe en el presente documento. El término también debe interpretarse en el sentido de un anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo, molécula de ADN que expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, en donde la secuencia de aminoácidos o ADN se ha obtenido utilizando tecnología de secuencia de aminoácidos o ADN sintética que está disponible y se conoce bien en la técnica.

Como se usa el término "variante" en el presente documento, es una secuencia de ácido nucleico o una secuencia peptídica que difiere en secuencia de una secuencia de ácido nucleico o secuencia peptídica de referencia, respectivamente, pero conserva las propiedades biológicas esenciales de la molécula de referencia. Los cambios en la secuencia de una variante de ácido nucleico pueden no alterar la secuencia de aminoácidos de un péptido codificado por el ácido nucleico de referencia, o pueden dar lugar a sustituciones de aminoácidos, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos. Los cambios en la secuencia de variantes peptídicas suelen ser limitados o conservadores, de modo que las secuencias del péptido de referencia y la variante sean muy similares en general y, en muchas regiones, idénticos. Una variante y un péptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Una variante de un ácido nucleico o péptido puede ser una variante natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe que ocurre de forma natural. Las variantes no naturales de ácidos nucleicos y péptidos pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

Como se usa en el presente documento, la expresión "modificado genéticamente" significa un animal, cuyas células germinales comprenden un ácido nucleico humano exógeno o una secuencia de ácido nucleico humano. A modo de ejemplos no limitativos, un animal modificado genéticamente puede ser un animal transgénico o un animal knockin, siempre que el animal comprenda una secuencia de ácido nucleico humano.

Como se usa en el presente documento, "knock-in" significa una modificación genética que reemplaza la información genética codificada en un locus cromosómico en un animal no humano con una secuencia de ADN diferente.

Descripción

La invención se refiere a un ratón modificado genéticamente que expresa M-CSF humano, IL-3/GM-CSF humano, SIRPA humano y TPO humano y que no expresa RAG2 o ^yc (referido en el presente documento como MISTRG). En algunas realizaciones, los ratones modificados genéticamente descritos en el presente documento están injertados con una célula hematopoyética humana.

En diversas realizaciones, los ratones modificados genéticamente injertados con células hematopoyéticas humanas son útiles para la evaluación in vivo del crecimiento y la diferenciación de células hematopoyéticas e inmunitarias, para la evaluación in vivo de la hematopoyesis humana, para la evaluación in vivo de células cancerosas, para la evaluación in vivo de una respuesta inmunitaria, para la evaluación in vivo de vacunas y regímenes de vacunación, para el uso en la prueba del efecto de los agentes que modulan el crecimiento o la supervivencia de las células cancerosas, para la evaluación in vivo de un tratamiento del cáncer, para la producción in vivo y recolección de mediadores inmunitarios, incluidos anticuerpos humanos, y para su uso en la prueba del efecto de los agentes que modulan la función de las células hematopoyéticas e inmunitarias.

Ratones modificados genéticamente

En el presente documento se describe solo con fines ilustrativos y no de acuerdo con la invención, un animal no humano modificado genéticamente que expresa al menos uno de M-CSF humano, IL-3/GM-CSF humano, SIRPA humano, TPO humano y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones no de acuerdo con la invención, el animal no humano modificado genéticamente que expresa un ácido nucleico humano también expresa el correspondiente ácido nucleico animal no humano. En otras realizaciones no de acuerdo con la invención, el animal no humano modificado genéticamente que expresa un ácido nucleico humano no expresa también el correspondiente ácido nucleico animal no humano. El animal modificado genéticamente es un animal que tiene uno o más genes eliminados para convertirlo en un animal inmunodeficiente, como se describe en otra parte del presente documento. Para crear un animal no humano modificado genéticamente, un ácido nucleico que codifica una proteína humana puede incorporarse en un vector de expresión recombinante en una forma adecuada para la expresión de la proteína humana en una célula huésped no humana. En diversas realizaciones, el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras unidas operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína humana de una manera que permite la transcripción del ácido nucleico en ARNm y la traducción del ARNm en proteína humana. La expresión "secuencia reguladora" está reconocido en la técnica y pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras son conocidas por los expertos en la materia y se describen en 1990, Goeddel, "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transfectar y/o la cantidad de proteína humana a expresar.

Se puede crear un no humano modificado genéticamente, por ejemplo, mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica la proteína humana (normalmente unido a elementos reguladores apropiados, como un potenciador constitutivo o específico de tejido) en un ovocito, por ejemplo, por microinyección, y permitiendo que el ovocito se desarrolle en un animal adoptivo hembra. Las secuencias intrónicas y las señales de poliadenilación también pueden incluirse en el transgén para aumentar la eficacia de la expresión del transgén. Los métodos para generar animales modificados genéticamente, particularmente animales como ratones, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos. n.° 4.736.866, 4.870.009 y 1986, Hogan et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory. Un animal fundador modificado genéticamente se puede utilizar para criar animales adicionales que lleven el transgén. Los animales modificados genéticamente que portan un transgén que codifica la proteína humana de la invención pueden cruzarse además con otros animales modificados genéticamente que portan otros transgenes, o cruzarse con animales defectivos (knockout), por ejemplo, un animal knockout que no expresa uno o más de sus genes. El no humano modificado genéticamente de la invención es un ratón,

En algunas realizaciones, el no humano modificado genéticamente expresa uno o más ácidos nucleicos humanos del promotor nativo del animal no humano y los elementos reguladores nativos. En otras realizaciones, el animal no humano modificado genéticamente expresa un ácido nucleico humano a partir del promotor humano nativo y los elementos reguladores nativos. El experto en la materia comprenderá que el no humano modificado genéticamente incluye animales no humanos modificados genéticamente que expresan al menos un ácido nucleico humano de cualquier promotor. Los ejemplos de promotores útiles en la invención incluyen, pero sin limitaciones, el promotor de la ADN pol II, el promotor de la PGK, el promotor de la ubiquitina, el promotor de la albúmina, el promotor de la globina, el promotor de la ovoalbúmina, el promotor temprano de SV40, el promotor RSV del virus del sarcoma de Rous, LTR retroviral y LTR lentiviral. Los sistemas de expresión de promotores y potenciadores útiles en la invención también incluyen sistemas de expresión inducibles y/o específicos de tejido.

La invención incluye ratones modificados genéticamente, ratones inmunodeficientes que tienen un genoma que incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido humano unido operativamente a un promotor, en donde el ratón expresa el polipéptido humano codificado. En diversas realizaciones, la invención incluye ratones inmunodeficientes modificados genéticamente que tienen un genoma que comprende un casete de expresión que incluye un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido humano, en donde el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor ya una señal de poliadenilación y además contiene un intrón, y en el que el ratón expresa el polipéptido humano codificado.

En diversas realizaciones, se usan varios métodos para introducir una secuencia de ácido nucleico humano en un ratón inmunodeficiente para producir un ratón inmunodeficiente modificado genéticamente que exprese un gen humano. Dichas técnicas son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero sin limitaciones, microinyección pronuclear, transformación de células madre embrionarias, técnicas de recombinación homóloga y knock-in. Los métodos para generar animales modificados genéticamente que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitaciones, los descritos en Sundberg e Ichiki (2006, Genetically Engineered Mice Handbook, CRC Press), Hofker y van Deursen (2002, Genetically modified Mouse Methods and Protocols, Humana Press), Joyner (2000, Gene Targeting: A Practical Approach, Oxford University Press), Turksen (2002, Embryonic stem cells: Methods and Protocols in Methods Mol Biol., Humana Press), Meyer et al. (2010, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 107:15022-15026), y Gibson (2004, A Primer Of Genome Science 2a ed. Sunderland, Massachusetts: Sinauer), patente de Estados Unidos N.° 6.586.251, Rathinam et al. (2011, Blood 118:3119-28), Willinger et al., (2011, Proc Natl Acad Sci USA, 108:2390-2395), Rongvaux et al., (2011, Proc Natl Acad Sci USA, 108:2378-83) y Valenzuela et al. (2003, Nat Biot 21:652-659).

En el presente documento se describen animales inmunodeficientes modificados genéticamente deficientes en el número y/o función de linfocitos B y/o linfocitos T, solos, o en combinación con una deficiencia en el número y/o función de las células NK (por ejemplo, debido a una deficiencia de la cadena gamma del receptor de IL2 (es decir, Y^c'/' )), y que tiene un genoma que comprende un ácido nucleico humano ligado operativamente a un promotor, en donde el animal expresa el polipéptido humano codificado. La generación del ratón modificado genéticamente de la invención se puede lograr mediante métodos como la inyección de ADN de una construcción de expresión en un embrión previo a la implantación o mediante el uso de células madre, tales como células madre embrionarias (ME) o células madre pluripotenciales inducidas (MPi).

En una realización, el ácido nucleico humano es expresado por los elementos reguladores nativos del gen humano. En otras realizaciones, el ácido nucleico humano es expresado por los elementos reguladores nativos del ratón. En otras realizaciones no de acuerdo con la invención, el ácido nucleico humano se expresa a partir de un promotor ubicuo. Los ejemplos no limitantes de promotores ubicuos útiles en el constructo de expresión de las composiciones y métodos de la invención incluyen, un promotor de 3-fosfoglicerato quinasa (PGK-1), un promotor de beta-actina, un promotor ROSA26, un promotor de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70), un gen EF-1 alfa que codifica el promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1), un promotor del factor de iniciación eucariota 4A (eIF-4A1), un promotor de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y un promotor de CMV (citomegalovirus).

En otras realizaciones no de acuerdo con la invención, el ácido nucleico humano se expresa a partir de un promotor específico de tejido. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido útiles en el constructo de expresión de las composiciones y métodos de la invención incluyen un promotor de un gen expresado en el sistema hematopoyético, tal como un promotor de M-CSF, un promotor de IL-3, un promotor de GM-CSF, un promotor de SIRPA, un promotor de TPO, un promotor de IFN-p, un promotor de la proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich (WASP), un promotor de CD45 (también llamado antígeno leucocitario común), un promotor de Flt-1, un promotor de endoglina (CD105) y un promotor de ICAM-2 (molécula de adhesión intracelular 2). Estos y otros promotores útiles en las composiciones y métodos de la invención son conocidos en la técnica como se ejemplifica en Abboud et al. (2003, J. Histochem & Cytochem. 51:941-949), Schorpp et al. (1996, NAR 24:1787-1788), McBurney et al. (1994, Devel. Dynamics, 200:278-293) y Majumder et al. (1996, Blood 87:3203-3211). Además de comprender un promotor, uno o más elementos reguladores adicionales, tal como un elemento potenciador o una secuencia de intrones, está incluido en varias realizaciones de la invención. Los ejemplos de potenciadores útiles en las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero sin limitaciones, un elemento potenciador temprano de citomegalovirus (CMV) y un elemento potenciador de SV40. Los ejemplos de secuencias intrónicas útiles en las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero sin limitaciones, el intrón de beta globina o un intrón genérico. Otros elementos reguladores adicionales útiles en algunas realizaciones de la invención incluyen, pero sin limitaciones, una secuencia de terminación de la transcripción y una secuencia de poliadenilación (pA) de ARNm.

En algunas realizaciones, los métodos de introducción del constructo de expresión de ácido nucleico humano en un embrión de preimplantación incluyen la linealización del constructo de expresión antes de inyectarlo en un embrión de preimplantación. En realizaciones preferidas, el constructo de expresión se inyecta en ovocitos fertilizados. Los ovocitos fertilizados pueden recolectarse de hembras superovuladas el día después del apareamiento e inyectarse con el constructo de expresión. Los ovocitos inyectados se cultivan durante la noche o se transfieren directamente a oviductos de 0,5 días p.c. hembras pseudopreñadas. En la técnica se conocen métodos para la superovulación, recolección de ovocitos, la inyección del constructo de expresión y la transferencia de embriones y se describen en Manipulating the Mouse Embryo (2002, A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press). La descendencia se puede evaluar para determinar la presencia del ácido nucleico introducido mediante análisis de ADN (por ejemplo, PCR, transferencia Southern, secuenciación de ADN, etc.) o por análisis de proteínas (por ejemplo, ELISA, transferencia Western, etc.).

En otras realizaciones, el constructo de expresión se puede transfectar en células madre (células ME o células MPi) usando métodos bien conocidos, tal como electroporación, precipitación calcio-fosfato y lipofección. Las células se pueden evaluar para determinar la presencia del ácido nucleico introducido mediante análisis de ADN (por ejemplo, PCR, transferencia Southern, secuenciación de ADN, etc.) o por análisis de proteínas (por ejemplo, ELISA, transferencia Western, etc.). A continuación, se pueden microinyectar células que se ha determinado que han incorporado el constructo de expresión en embriones de preimplantación. Para una descripción detallada de los métodos conocidos en la técnica útiles para las composiciones y métodos de la invención, véase Nagy et al., (2002, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Nagy et al. (1990, Development 110:815-821), patente de Estados Unidos N.° 7.576.259, patente de Estados Unidos N.° 7.659.442, patente de Estados Unidos N.° 7,294,754 y Kraus et al. (2010, Genesis 48:394-399).

Los animales no humanos modificados genéticamente descritos en el presente documento pueden cruzarse con animales inmunodeficientes para crear un animal inmunodeficiente que exprese al menos un ácido nucleico humano. Varias divulgaciones proporcionan animales modificados genéticamente que incluyen un ácido nucleico humano en sustancialmente todas sus células, así como animales modificados genéticamente que incluyen un ácido nucleico humano en algunas, pero no todas sus células. Una o varias copias, adyacentes o distantes entre sí, del ácido nucleico humano puede integrarse en el genoma de las células de los animales modificados genéticamente.

En algunas realizaciones, la invención es un ratón modificado genéticamente injertado con al menos una célula hematopoyética humana. En otras realizaciones, la invención es un método para injertar células hematopoyéticas humanas en un ratón modificado genéticamente. Las células hematopoyéticas humanas injertadas útiles en las composiciones y métodos de la invención incluyen cualquier célula hematopoyética humana. Los ejemplos no limitantes de células hematopoyéticas humanas útiles en la invención incluyen, pero sin limitaciones, c Mh , CMPH, células iniciadoras de leucemia (CIL) y células hematopoyéticas de cualquier linaje en cualquier etapa de diferenciación, incluyendo células hematopoyéticas diferenciadas terminalmente de cualquier linaje. Tales células hematopoyéticas pueden derivarse de cualquier tejido o ubicación de un donante humano, incluidos, pero sin limitaciones, médula ósea, sangre periférica, hígado, hígado fetal o sangre del cordón umbilical. Tales células hematopoyéticas se pueden aislar de cualquier donante humano, incluyendo donantes sanos, así como donantes con enfermedad, tales como cáncer, entre las que se incluyen leucemia.

En otras realizaciones, la invención es un método de injerto de células hematopoyéticas humanas en un ratón modificado genéticamente según la reivindicación 5. El ratón modificado genéticamente en el que se injertan células hematopoyéticas humanas es un animal inmunodeficiente. El injerto de células hematopoyéticas en el ratón modificado genéticamente de la invención se caracteriza por la presencia de células hematopoyéticas humanas en el ratón injertado. En realizaciones particulares, el injerto de células hematopoyéticas en un ratón inmunodeficiente se caracteriza por la presencia de células hematopoyéticas humanas diferenciadas en el ratón injertado en el que se proporcionan células hematopoyéticas, en comparación con los ratones de control apropiados.

En algunas realizaciones, los ratones de la invención se trasplantan con células cancerosas humanas (por ejemplo, tumores sólidos humanos, etc.) además de células hematopoyéticas humanas. En diversas realizaciones, las células cancerosas humanas pueden ser una línea celular cancerosa o una célula cancerosa humana primaria aislada de un paciente, de cualquiera de los muchos tipos diferentes de cáncer (incluidos, a modo de ejemplos no limitativos, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, etc.) En algunas realizaciones, la célula cancerosa humana y la CMPH se aíslan del mismo paciente y se trasplantan al mismo ratón.

Los ratones modificados genéticamente proporcionados en varias realizaciones de la presente invención tienen varias utilidades tales como, pero sin limitaciones, para su uso como modelos de crecimiento y diferenciación de células hematopoyéticas, para la evaluación in vivo de la hematopoyesis humana, para la evaluación in vivo de células cancerosas, para el estudio in vivo de una respuesta inmunitaria, para la evaluación in vivo de vacunas y regímenes de vacunación, para el uso en la prueba del efecto de los agentes que modulan el crecimiento o la supervivencia de las células cancerosas, para la evaluación in vivo de un tratamiento del cáncer, para la producción in vivo y recolección de mediadores inmunitarios, tales como un anticuerpo y para su uso en la prueba del efecto de los agentes que modulan la función de las células hematopoyéticas e inmunitarias.

Tradicionalmente, el injerto de células hematopoyéticas humanas en ratones modificados genéticamente y/o inmunodeficientes ha requerido un acondicionamiento previo a la administración de las células hematopoyéticas, ya sea irradiación subletal del animal receptor con radiación electromagnética de alta frecuencia, generalmente usando radiación gamma o rayos X, o tratamiento con un fármaco radiomimético como busulfán o mostaza nitrogenada. Se cree que el acondicionamiento reduce el número de células hematopoyéticas del huésped, crea factores microambientales apropiados para el injerto de células hematopoyéticas humanas y/o crea nichos microambientales para el injerto de células hematopoyéticas humanas. Los métodos estándar para el acondicionamiento son conocidos en la técnica, tal como se describe en el presente documento y en J. Hayakawa et al, 2009, Stem Cells, 27(1):175-182. Se proporcionan métodos para el injerto de células hematopoyéticas humanas en ratones inmunodeficientes según realizaciones de la presente invención que incluyen proporcionar células hematopoyéticas humanas a los ratones inmunodeficientes, con o sin irradiación de los animales antes de la administración de las células hematopoyéticas. Se proporcionan métodos para el injerto de células hematopoyéticas humanas en ratones inmunodeficientes según realizaciones de la presente invención que incluyen proporcionar células hematopoyéticas humanas a los ratones modificados genéticamente de la invención, con o sin, administración de un fármaco radiomimético, tal como busulfán o mostaza nitrogenada, a los animales antes de la administración de las células hematopoyéticas.

En algunas realizaciones, los métodos de injerto de células hematopoyéticas en un ratón modificado genéticamente según realizaciones de la presente invención incluyen proporcionar células hematopoyéticas humanas a un ratón modificado genéticamente de la invención como se describe en otro lugar en el presente documento. En algunas realizaciones, el ratón modificado genéticamente de la invención es un animal inmunodeficiente que es deficiente en el número y/o función de linfocitos B no humanos, el número y/o función de linfocitos T no humanos y/o el número y/o función de células NK no humanas. En otras realizaciones no de acuerdo con la invención), el animal inmunodeficiente tiene inmunodeficiencia combinada severa (SCID). SCID se refiere a una afección caracterizada por la ausencia de linfocitos T y la falta de función de los linfocitos B. Los ejemplos de SCID incluyen: SCID ligada a X, que se caracteriza por mutaciones en el gen de la cadena gamma en el gen IL2RG y el fenotipo linfocitario T(-) B(+) NK(-); y SCID autosómica recesiva caracterizada por mutaciones en el gen Jak3 y el fenotipo de linfocitos T(-) B(+) NK(-), mutaciones del gen ADA y fenotipo de linfocitos T(-) B(-) NK(-), mutaciones de la cadena alfa de IL-7R y fenotipo de linfocitos T(-) B(+) NK(+), mutaciones CD3 delta o epsilon y fenotipo linfocitario T(-) B(+) NK(+), mutaciones RAG1/RAG2 y fenotipo linfocitario T(-) B(-) NK(+), mutaciones del gen Artemis y fenotipo de linfocito T(-) B(-) NK(+ ), mutaciones del gen CD45 y el fenotipo de linfocitos T(-) B(+) NK(+). En algunas realizaciones no según la invención, el animal no humano modificado genéticamente es RAG1'/_.

En algunas realizaciones, los métodos de injerto de células hematopoyéticas en un ratón modificado genéticamente incluyen proporcionar células hematopoyéticas humanas a un ratón modificado genéticamente que tiene la mutación de inmunodeficiencia combinada severa (Prkdcscid), comúnmente conocida como la mutación scid. La mutación scid es bien conocida y se localiza en el cromosoma 16 del ratón como se describe en Bosma et al. (1989, Immunogenetics 29:54-56). Los ratones homocigotos para la mutación scid se caracterizan por la ausencia de linfocitos T y linfocitos B funcionales, linfopenia, hipoglobulinemia y un microambiente hematopoyético normal. La mutación scid se puede detectar, por ejemplo, por detección de marcadores de la mutación scid utilizando métodos bien conocidos.

Los métodos de injerto de células hematopoyéticas en un ratón modificado genéticamente según realizaciones de la presente invención incluyen proporcionar células hematopoyéticas humanas a ratones inmunodeficientes modificados genéticamente que tienen una deficiencia de la cadena gamma del receptor de IL2, ya sean solos o en combinación, la mutación de inmunodeficiencia combinada severa (scid). La expresión "deficiencia de la cadena gamma del receptor de IL2" se refiere a la disminución de la cadena gamma del receptor de IL2. La disminución de la cadena gamma del receptor de IL2 puede deberse a una eliminación o mutación del gen. Se puede detectar una disminución de la cadena gamma del receptor de IL2, por ejemplo, mediante la detección de la deleción o mutación del gen de la cadena gamma del receptor de IL2 y/o la detección de la expresión disminuida de la cadena gamma del receptor de IL2 utilizando métodos bien conocidos.

Además de las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos humanos naturales, el término abarca variantes de secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos humanos. Como se usa en el presente documento, el término "variante" define un mutante genético natural aislado de un ser humano o una variación de un ser humano preparada de forma recombinante, cada uno de los cuales contiene una o más mutaciones en comparación con el humano de tipo salvaje correspondiente. Por ejemplo, dichas mutaciones pueden ser una o más sustituciones adiciones y/o deleciones de aminoácidos. El término "variante" también incluye ortólogos no humanos. En algunas realizaciones, un polipéptido variante de la presente invención tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad con un polipéptido humano de tipo salvaje.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias se determina usando técnicas como las descritas en otra parte del presente documento. Las mutaciones se pueden introducir utilizando técnicas estándar de biología molecular, tales como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden introducir una o más mutaciones de aminoácidos sin alterar las propiedades funcionales de las proteínas humanas.

Se pueden realizar sustituciones conservativas de aminoácidos en proteínas humanas para producir variantes de proteínas humanas. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son sustituciones reconocidas en la técnica de un aminoácido por otro aminoácido que tiene características similares. Por ejemplo, cada aminoácido puede describirse como poseedor de una o más de las siguientes características: electropositivos, electronegativos, alifáticos, aromáticos, polares, hidrófobos e hidrófilos. Una sustitución conservativa es una sustitución de un aminoácido que tiene una característica estructural o funcional específica por otro aminoácido que tiene la misma característica. Los aminoácidos ácidos incluyen aspartato, glutamato; los aminoácidos básicos incluyen histidina, lisina, arginina; los aminoácidos alifáticos incluyen isoleucina, leucina y valina; los aminoácidos aromáticos incluyen fenilalanina, glicina, tirosina y triptófano; los aminoácidos polares incluyen aspartato, glutamato, histidina, lisina, asparagina, glutamina, arginina, serina, treonina y tirosina; y los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, fenilalanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, prolina, valina y triptófano; y las sustituciones conservadoras incluyen la sustitución entre aminoácidos dentro de cada grupo. Los aminoácidos también se pueden describir en términos de tamaño relativo, alanina, cisteína, aspartato, glicina, asparagina, prolina, treonina, serina, valina, todos normalmente considerados pequeños.

Las variantes humanas pueden incluir análogos de aminoácidos sintéticos, derivados de aminoácidos y/o aminoácidos no estándar, incluyendo ilustrativamente, sin limitación, ácido alfa-aminobutírico, citrulina, canavanina, cianoalanina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopimélico, dihidroxifenilalanina, ácido diencólico, homoarginina, hidroxiprolina, norleucina, norvalina, 3-fosfoserina, homoserina, 5-hidroxitriptófano, 1 -metilhistidina, metilhistidina y ornitina.

Las variantes humanas están codificadas por ácidos nucleicos que tienen un alto grado de identidad con un ácido nucleico que codifica un humano de tipo salvaje. El complemento de un ácido nucleico que codifica una variante humana se hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica un humano de tipo salvaje en condiciones de alta rigurosidad.

La expresión "ácido nucleico" se refiere a moléculas de ARN o ADN que tienen más de un nucleótido en cualquier forma, incluyendo monocatenarias, bicatenarias, oligonucleotídicas o polinucleotídicas. La expresión "secuencia de nucleótidos" se refiere al orden de los nucleótidos en un oligonucleótido o polinucleótido en una forma de ácido nucleico monocatenario.

Los ácidos nucleicos que codifican una variante humana pueden aislarse o generarse de forma recombinante o sintética usando una metodología bien conocida.

El aislamiento de células hematopoyéticas humanas, la administración de células hematopoyéticas humanas a un animal huésped y los métodos para evaluar el injerto de las mismas son bien conocidos en la técnica. Las células hematopoyéticas para la administración al animal huésped pueden obtenerse de cualquier tejido que contenga células hematopoyéticas tales como, pero sin limitaciones, sangre de cordón umbilical, médula ósea, sangre periférica, sangre periférica movilizada por citocinas o quimioterapia e hígado fetal. Las células hematopoyéticas se pueden administrar a animales recién nacidos o adultos mediante la administración a través de varias vías, tales como, pero sin limitaciones, intravenosa, intrahepática, intraperitoneal, intrafemoral y/o intratibial.

El injerto de células hematopoyéticas humanas en el animal modificado genéticamente de la invención puede evaluarse mediante cualquiera de varios métodos, tales como, pero sin limitaciones, análisis de citometría de flujo de células en los animales a los que se administran células hematopoyéticas humanas en uno o más puntos de tiempo después de la administración de células hematopoyéticas.

Los ejemplos de métodos para aislar células hematopoyéticas humanas, de administrar células hematopoyéticas humanas a un animal huésped, y de evaluar el injerto de las células hematopoyéticas humanas en el animal huésped se describen en el presente documento y en Pearson et al. (2008, Curr. Protoc. Immunol. 81:1-15), Ito et al. (2002, Blood 100:3175-3182), Traggiai et al. (2004, Science 304:104-107), Ishikawa et al. (2005, Blood 106:1565-1573), Shultz et al. (2005, J. Immunol. 174:6477-6489) y Holyoake et al. (1999, Exp Hematol. 27:1418-27).

En algunas realizaciones de la invención, las células hematopoyéticas humanas se aíslan de un material fuente original para obtener una población de células enriquecidas para una población de células hematopoyéticas particular (por ejemplo, CMH, CMPH, CIL, CD34+, CD34-, marcador específico de linaje, etc.). Las células hematopoyéticas aisladas pueden o no ser una población pura. En una realización, las células hematopoyéticas útiles en las composiciones y métodos de la invención están desprovistas de células que tienen un marcador particular, tal como CD34. En otra realización, las células hematopoyéticas útiles en las composiciones y métodos de la invención se enriquecen mediante la selección de un marcador, tal como CD34. En algunas realizaciones, las células hematopoyéticas útiles en las composiciones y métodos de la invención son una población de células en la que las células CD34+ constituyen aproximadamente el 1-100 % de las células, aunque en ciertas realizaciones, también se puede utilizar una población de células en la que las células CD34+ constituyen menos del 1 % del total de células. En determinadas realizaciones, las células hematopoyéticas útiles en las composiciones y métodos de la invención son una población de células desprovistas de células T en la que las células CD34+ constituyen aproximadamente el 1-3 % del total de células, una población de células con linaje agotado en la que las células CD34+ constituyen aproximadamente el 50 % del total de células, o una población seleccionada de células positivas para CD34+ en la que las células CD34+ constituyen aproximadamente el 90 % del total de células.

El número de células hematopoyéticas administradas no se considera limitativo con respecto a la generación de un sistema hematopoyético y/o inmunitario humano en un animal no humano modificado genéticamente que expresa al menos un gen humano. Así, a modo de ejemplo no limitante, el número de células hematopoyéticas administradas puede oscilar entre aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 107, aunque en varias realizaciones, también se puede usar más o menos. A modo de otro ejemplo no limitante, el número de CMPH administradas puede oscilar entre aproximadamente 3x103 a aproximadamente 1x106 Células CD34+ cuando el receptor es un ratón, aunque en varias realizaciones, también se puede usar más o menos. Para otras especies de receptores, el número de células que deben administrarse puede determinarse usando solo experimentación de rutina.

En general, el injerto puede considerarse exitoso cuando el número (o porcentaje) de células hematopoyéticas humanas presentes en el animal no humano modificado genéticamente es mayor que el número (o porcentaje) de células humanas que se administraron al animal no humano, en un momento más allá de la vida útil de las células hematopoyéticas humanas administradas. La detección de la progenie de las células hematopoyéticas administradas se puede lograr mediante la detección de ADN humano en el animal receptor, por ejemplo, o por detección de células hematopoyéticas humanas intactas, como por la detección del marcador de superficie celular humana, tal como CD45, por ejemplo. La transferencia en serie de células hematopoyéticas humanas de un primer receptor a un receptor secundario e injerto de células hematopoyéticas humanas en el segundo receptor, es una prueba opcional adicional de injerto en el receptor primario. El injerto se puede detectar mediante citometría de flujo como un 0,05 % o más de células CD45+ humanas en sangre, bazo o médula ósea entre 1 y 4 meses después de la administración de las células hematopoyéticas humanas. Se puede usar una citocina (por ejemplo, GM-CSF) para movilizar células madre, por ejemplo, como se describe en Watanabe (1997, Bone Marrow Transplantation 19:1175-1181).

EJEMPLOS EXPERIMENTALES

La invención se describe adicionalmente con detalle con referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique otra cosa. Así, la invención no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a los siguientes ejemplos, sino que, en cambio, debe interpretarse que abarca todas y cada una de las variaciones que se hagan evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en el presente documento.

Sin más descripción, se cree que un experto en la materia puede, utilizando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, fabricar y utilizar los compuestos de la presente invención y practicar los métodos reivindicados. Los siguientes ejemplos de trabajo por lo tanto, señalan específicamente las realizaciones preferidas de la presente invención, y no deben interpretarse como limitantes de ninguna manera del resto de la descripción.

Ejemplo 1: Respuestas inmunitarias innatas funcionales y soporte de tumores sólidos en ratones con sistema hematolinfoide humano

Como se describe en el presente documento, los ratones repoblados con un sistema hematolinfoide humano (SHLH) representan una poderosa herramienta para la investigación in vivo preclínica humana predictiva. Una limitación importante de los ratones SHLH actuales es el desarrollo defectuoso de células humanas críticas para la inmunidad innata. En este caso, se informa sobre una nueva cepa de ratón en la que se humanizan genéticamente múltiples genes que codifican citocinas. Estas citocinas humanizadas actúan quirúrgicamente para apoyar de manera eficiente la hematopoyesis humana y el desarrollo y función de monocitos/macrófagos humanos y células NK. En un microambiente tumoral, los macrófagos humanos adquieren un fenotipo inmunosupresor y apoyan el crecimiento de un cáncer humano. Con un sistema inmunitario innato humano más completo y funcional, este nuevo modelo de ratones SHLH tiene un potencial excepcional para facilitar el estudio de la fisiología y la patología de la inmunidad innata humana in vivo.

Los monocitos y macrófagos son los principales componentes celulares de la respuesta inmunitaria innata (Auffray et al., 2009, Annual review of immunology 27, 669). Por un lado, estas células son capaces de detectar una infección y de mediar funciones antimicrobianas directas, por diversos mecanismos como la fagocitosis o la secreción de factores proinflamatorios. Por otro lado, los monocitos/macrófagos pueden adquirir funciones inmunosupresoras, importante para la resolución de la inflamación y para la reparación de tejidos. Asimismo, estas propiedades antiinflamatorias pueden ser cooptadas por los macrófagos infiltrantes de tumores y proporcionan una ventaja de supervivencia a los tumores en evolución a través de diversos mecanismos (Allavena y Mantovani, 2012, Clinical and experimental immunology 167, 195; Qian y Pollard, 2010, Cell 141, 39).

Los modelos de animales pequeños, como los ratones, se usan con frecuencia para estudiar in vivo respuestas inmunitarias de los mamíferos. Sin embargo, existen diferencias fundamentales en la función inmunológica entre especies (Mestas y Hughes, 2004, Journal of Immunology 172, 2731; Rongvaux et al., 2013, Annual review of immunology 31,635). En particular, existen importantes diferencias fenotípicas y funcionales específicas de especie entre las poblaciones de monocitos/macrófagos y, en general, el conocimiento obtenido de los estudios con ratones solo es parcialmente aplicable a los seres humanos (Auffray et al., 2009, Annual review of immunology 27, 669; Rongvaux et al., 2013, Annual review of immunology 31,635; Chow et al., 2011, Nature reviews Immunology 11, 788). Un enfoque prometedor para estudiar las especificidades de la función inmunológica y hematopoyética humana en vivo consiste en utilizar ratones portadores de un sistema hematolinfoide humano (SHLH) (Rongvaux et al., 2013, Annual review of immunology 31, 635; Shultz et al., 2012, Nature reviews Immunology 12, 786). Sin embargo, el desarrollo y la función de varios tipos de células inmunitarias humanas, tales como monocitos/macrófagos y células NK, es en gran parte defectuoso en los ratones SHLH actuales (Rongvaux et al., 2013, Annual review of immunology 31,635). Es muy probable que estos defectos se deban a la reducción de la reactividad cruzada de las citocinas de ratón en los receptores humanos correspondientes (Manz, 2007, Immunity 26, 537). Para eludir esta limitación, se desarrolló una estrategia para reemplazar genes de ratón que codifican citocinas por su homólogo humano (Willinger et al., 2011, Trends in immunology 32, 321) y este enfoque resultó en mejoras significativas en el desarrollo y la función de los tipos de células humanas individuales (Figura 16) (Rathinam et al., 2011, Blood 118, 3119; Willinger et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 2390; Rongvaux et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 2378).

La hematopoyesis es un proceso de desarrollo estrechamente regulado en el que las células madre hematopoyéticas multipotenciales se diferencian en progenitores más comprometidos y luego en células sanguíneas maduras (Kondo et al., 2003, Annual review of immunology 21,759; Doulatov et al., 2012, Cell stem cell 10, 120). Este proceso requiere citocinas específicas que apoyen los pasos de desarrollo sucesivos (Figura 5). Quizás sería necesaria la sinergia entre múltiples citocinas humanizadas para recapitular completamente la mielopoyesis humana en el ratón. Así, se generó una nueva cepa de ratón, llamado MISTRG, en el que los genes que codifican M-CSF (Rathinam et al., 2011, Blood 118, 3119), iL-3/GM-CSF (Willinger et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 2390) and TPO (Rongvaux et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 2378) fueron sustituidos por sus homólogos humanos (Willinger et al., 2011, Trends in immunology 32, 321) en el fondo hSlRPAtg RAG2-/- IL-2Ry-/-(Traggiai et al., 2004, Science 304, 104; Strowig et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 13218).

Los ratones MISTRG recién nacidos y sus compañeros de camada MITRG (que carecen del transgén hSIRPA) fueron irradiados de forma subletal y trasplantados con células CD34+ derivadas de hígado fetal humano, siguiendo un protocolo estándar (Traggiai et al., 2004, Science 304, 104). Los ratones RAG2-/- IL2-R^y-/- (RG) que comparten el mismo fondo genético pero carecen de todos los alelos humanizados, y los ratones NOD-Scid IL2-Ry-/- (NSG) disponibles comercialmente sirvieron como controles. Los niveles de injerto de sangre (porcentaje de células hCD45+; (Figuras 1A y 1B; y la Figura 6A) fueron más bajos en los receptores R^g y más altos en los receptores NSG como se ha indicado anteriormente (Strowig et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 13218; Brehm et al., 2010, Clinical immunology 135, 84). El porcentaje de células hCD45+ en sangre fue similar en MISTRG y en NSG. El injerto de sangre también aumentó significativamente en MITRG en comparación con RG, lo que sugiere que la humanización combinada de genes supera la necesidad de inducir tolerancia fagocítica a través de la reactividad cruzada SIRPa/CD47 (Strowig et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 13218; Takenaka et al., 2007, Nature immunology 8, 1313; Legrand et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 13224), posiblemente al debilitar la respuesta innata del ratón. Se seleccionaron ratones con al menos un 10 % de células CD45+ humanas en la sangre para continuar con la experimentación (Figura 6B). En la médula ósea (MO), los porcentajes de células hCD45+ superaron el 90 % y alcanzaron hasta el 99 % en la mayoría de los dos receptores de MISTRG (Figuras 1A y 1C; y Figuras 6C a 6E), y la alta eficiencia del injerto en la MO fue independiente de la interacción SIRPa/CD47. Para probar la capacidad de las citocinas humanizadas para apoyar la hematopoyesis humana en condiciones más competitivas, se trasplantaron células CD34+ humanas en MISTR^g no irradiados. Este protocolo dio como resultado células CD45+ humanas en la sangre y en la médula ósea de todos los receptores (Figuras 1D y 1E) y, sorprendentemente, la mitad de los ratones mostró quimerismo tan alto como los niveles más altos medidos en receptores injertados después del preacondicionamiento de rayos X (compare la Figura 1E con las Figuras 1B y 1C). Los datos descritos en el presente documento muestran que el reemplazo genético de múltiples citocinas en MISTRG crea un microambiente en el que la hematopoyesis humana puede desplazar casi por completo a la hematopoyesis de ratón en la médula ósea y obviar la necesidad de irradiación inductora de patología.

A continuación, se evaluó la capacidad de los ratones MISTRG para apoyar la mielopoyesis humana. Las células mieloides humanas (hCD33+) estaban presentes en proporciones significativamente más altas en la sangre y la médula ósea de MISTRG en comparación con RG y NSG (Figura 2A; y Figuras 7A a 7C). El aumento de la proporción de células mieloides en MISTRG resultó en una composición sanguínea que se asemeja a la composición fisiológica de la sangre humana, que es rica en células mieloides y radicalmente diferente a la de la sangre de ratón rica en linfoides (Mestas y Hughes, 2004, Journal of Immunology 172, 2731; Rongvaux et al., 2013, Annual review of immunology 31,6354) (Figure 2B; y Figura 7D). Si bien tanto los monocitos (CD33hiSSCloCD66-) como los granulocitos (CD33+SSChiCD66+) estaban presentes en la MO (Figura 7E), las poblaciones de células mieloides humanas en la sangre periférica estaban compuestas principalmente por monocitos (Figura 7F), lo que sugiere que la diferenciación terminal y la salida de la MO o la supervivencia periférica de los granulocitos humanos sigue siendo subóptima en este entorno de ratón. No obstante, cabe destacar que las células mieloides humanas estaban presentes en grandes cantidades en tejidos no linfoides como pulmón, hígado y colon de MISTRG como se muestra mediante inmunohistoquímica (células hCD68+; (Figura 2C) o por citometría de flujo (hCD33+; (Figuras 7G y 7H), y superó significativamente el número de células mieloides humanas encontradas en ratones NSG por un factor de ~10.

En seres humanos, se han descrito fenotípica y funcionalmente tres subconjuntos de monocitos, en función de la expresión de los marcadores CD14 y CD16 (Auffray et al., 2009, Annual review of immunology 27, 669; Cros et al., 2010, Immunity 33, 375). Las tres subpoblaciones de monocitos humanos (CD14+CD16-, CD14+CD16+and CD14dimCD16+) estaban presentes en los tejidos linfoides y no linfoides, tal como pulmón e hígado, de MISTRG (Figuras 2D y 2E; y Figuras 8A y 8B). En contraste con NSG, además de la menor frecuencia de células mieloides, solo se pudieron detectar de forma consistente monocitos CD14+CD16 y hasta cierto punto CD14+CD16+, mientras que las células CD14dimCD16+ solo estuvieron marginalmente representadas. El inmunofenotipo extendido (CD33, CD11b, CD115, CD62L y CX3CR1) de las subpoblaciones de monocitos encontradas en MISTRG en comparación cercana con los subconjuntos equivalentes en sangre periférica humana (Figura 9). Los monocitos humanos CD14+CD16- y CD14+CD16+ aislados de la BM de MIt Rg produjeron altos niveles de citocinas inflamatorias en respuesta a los ligandos TLR4 y TLR7/8 (LPS y R848, respectivamente) (Figuras 2F y sG). En un ensayo in vitro realizado en glóbulos blancos de MITRG, tanto las células CD14+CD16- como CD14+CD16+ tenían una alta capacidad para fagocitar E. coli que expresa GFP, mientras que los monocitos CD14dimCD16+ tenían una capacidad fagocítica limitada (Figura 2H), lo que nuevamente refleja las propiedades fisiológicas de las subpoblaciones correspondientes en la sangre humana (Cros et al., 2010, Immunity 33, 375). Cuando fueron expuestos in vivo a LPS o infectados con los patógenos humanos bacterianos y víricos Listeria monocytogenes e influenza A, respectivamente, Los ratones MISTRG respondieron con una producción robusta de citocinas inflamatorias humanas (TNFa, IL-6 e IFN^y, respectivamente), mientras que los ratones NSG mostraron respuestas significativamente menor, aproximadamente un log más bajo, (Figuras 2I a es2K). Estos resultados demuestran que los subconjuntos de monocitos humanos que se desarrollan en MISTRG son funcionales in vitro e in vivo. Sin embargo, un inconveniente de la presencia de células fagocíticas humanas funcionales en el ratón es una violación de la tolerancia fagocítica de humano a ratón, a los que los glóbulos rojos de ratón son particularmente susceptibles (Figura 10A y 10B). Esta destrucción de glóbulos rojos de ratón dio como resultado anemia (Figuras 10C a 10I) y limitó la vida útil de los ratones injertados a 10-12 semanas (MISTRG) o 12-16 semanas (MITRG).

Las células mieloides pueden apoyar el desarrollo y la diferenciación de otras células inmunitarias mediante la producción de citocinas. Si el compartimento mieloide de los ratones MISTRG era una fuente de citocinas humanas, tales como IL-15, se evaluó. De manera coherente con esta idea, se encontró que la expresión de ARNm de IL-15 humana e IL-15Ra aumentó en un factor de más de 10 en MISTRG en comparación con NSG (Figura 3A; y Figura 11A). Para definir con más detalle la fuente celular de IL-15/ IL-15Ra humana en MISTRG, se midió la abundancia de transcritos de IL-15 e IL-15Ra humanos en poblaciones de células humanas purificadas. La expresión de ARNm de IL-15Ra humana fue mayor en células mieloides humanas (hCD33+) que en células no mieloides (hCD33-) (Figura 3B). En particular, los monocitos CD14+CD16+ mostraron un enriquecimiento de las transcripciones de IL-15 e IL-15Ra (Figura 3B). La expresión de la proteína IL-15Ra humana en la superficie de las células mieloides humanas de MISTRG se confirmó mediante citometría de flujo (Figura 11B).

Según estos hallazgos, se evaluó si los ratones MISTRG apoyan el desarrollo de células inmunitarias humanas dependientes de la presentación trans de IL-15, tal como células NK (Ma et al., 2006, Annual review of immunology 24, 657; Soderquest et al., 2011, Sangre 117, 4511). El desarrollo eficiente de las células NK humanas en los modelos de ratón SHLH actuales requiere la administración farmacológica exógena de IL-15/IL-15Ra humana (Huntington et al., 2009, Journal of experimental medicine 206, 25; Chen et al., 2009, Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 21783; Pek et al., 2011, Immunobiology 216, 218)23-25), ya que la IL-15 de ratón no es suficiente para apoyar las células NK humanas in vivo. Como se ha indicado anteriormente (Huntington et al., 2009, Journal of experimental medicine 206, 25; Chen et al., 2009, Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 21783; Pek et al., 2011, Immunobiology 216, 218), se observaron muy pocas células NK humanas (hNKp46+hCD3-) en NSG injertados (Figuras 3C y 3D; y Figuras 12A y 12B). Por el contrario, las células NK humanas se detectaron fácilmente en múltiples tejidos de MISTRG injertado y aumentaron en un factor de ~10 en comparación con NSG (Figura 3C y 3D; y Figura 12A y 12B). Además de la médula ósea, los ratones MITRG tenían menos células NK humanas que MISTRG, lo que probablemente se deba al requisito previamente informado de SIRPa humana para la supervivencia de las células n K humanas en la periferia (Legrand et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 13224). Las células hNKp46+hCD3- en ratones MISTRG representaban células NK de buena fe porque expresaban los marcadores de superficie de células NK típicas CD94, CD161 y receptores inhibidores asesinos (KIR) que imitan estrechamente a los controles humanos (Figuras 12A y 12B). Además de su efecto sobre el desarrollo, LA IL-15 también promueve la maduración de las células NK. Sistemáticamente, se encontró que la expresión superficial del marcador de maduración CD 16 y las cantidades de la proteína perforina del gránulo lítico eran mayores en las células NK de MISTRG en comparación con las de NSG (Figura 13C a 13F).

En la actualidad se desconoce la fuente celular de trans-presentación de IL-15 in vivo en seres humanos, pero las células mieloides humanas pueden apoyar la proliferación de células NK humanas in vitro (Huntington et al., 2009, Journal of experimental medicine 206, 25). Para probar si la trans-presentación de IL-15 humana por monocitos/macrófagos humanos subyace al desarrollo mejorado de células NK humanas en MISTRG, los ratones se trataron con clodronato encapsulado en liposomas para reducir las células fagocíticas (Figura 14). El agotamiento de las células fagocíticas también indujo una reducción significativa de las células NK humanas (Figura 3E), lo que sugiere que los monocitos/macrófagos humanos son de hecho un tipo de célula crítica que presenta IL-15 en trans para apoyar la homeostasis de las células NK humanas in vivo.

Las células NK participan en la defensa innata contra los patógenos al matar células que carecen de la expresión de MHC clase I (missing-self) (Raulet, 2006, Seminars in immunology 18, 145), y produciendo la citocina clave IFNy (Vivier et al., 2008, Nature immunology 9, 503). De acuerdo con una mayor expresión de perforina (Figuras 13E y 13F), se observó una actividad citotóxica de células NK significativamente mejorada contra células humanas que carecen de MHC de clase I en vivo en MISTRG en comparación con NSG (Figura 3F). Las células NK son una fuente temprana de IFNy después de la infección por Listeria. En consecuencia, se encontró que la expresión de ARNm de IFNy humano en el hígado era más de 10 veces mayor en MISTRG que en NSG dos días después de la infección (Figura 3G). En la resolución de una sola célula, las células NK de MISTRG infectadas con Listeria mostraron producción de IFN^y humano sin reestimulación ex-vivo (Figura 3H), a frecuencias significativamente más altas que en NSG (Figura 3I), Las células NK en MISTRG también tuvieron actividad lítica (desgranulación) después de la infección por Listeria, como se muestra por la exposición de la membrana plasmática de CD107a (Figura 3H). Globalmente, MISTRG a través de la producción eficiente de células mieloides humanas apoya el desarrollo, diferenciación y función de las células NK humanas, superando así una limitación importante de los modelos de ratón SHLH actuales.

A continuación, se evaluó el papel de las células mieloides humanas en el contexto de un microambiente tumoral. Por lo tanto, la línea celular de melanoma humano Me290 se utilizó como modelo tumoral (Valmori et al., 1998, Journal of immunology 160, 1750). Las observaciones clínicas muestran que las células mieloides infiltran tumores en varios tumores sólidos, y las altas densidades de macrófagos infiltrantes se correlacionan con un mal pronóstico del paciente en la mayoría de los tipos de cáncer (Qian y Pollard, 2010, Cell 141, 39; Coussens et al., Science 339, 286; Egeblad et al., 2010, Developmental cell 18, 884; Nelson y Bissell, 2006, Annual review of cell and developmental biology 22, 287; Bingle et al., 2002, T Journal of pathology 196, 254). En consecuencia, se detectó una mayor infiltración de células mieloides humanas en tumores en MISTRG que en NSG, como se muestra por la expresión de ARNm de PTPRC e ITGAM humanos (que codifican respectivamente CD45 y CD11b) (Figura 4A). Muy parecido a los tumores humanos en pacientes, las células que expresan los marcadores de macrófagos CD163 y c D14 fueron abundantes en tumores en MISTRG, pero eran casi indetectables en los mismos tumores en NSG (Figuras 4B y 4C; y Figura 15). La mayoría de las células CD163+ también expresaron niveles bajos de HLA-DR y niveles altos de CD206 (Figura 4B y 4D), un inmunofenotipo generalmente asociado con macrófagos "similares a M2" (Hao et al., 2012, Clinical & developmental immunology 2012, 948098; Tang, 2013, Cancer Lett 332, 3).

El subtipo M2 de macrófagos promueve la progresión tumoral a través de diversos mecanismos efectores, incluyendo señales proliferativas a las células cancerosas, señales antiapoptóticas, actividad proangiogénica, permitiendo la salida de células cancerosas de los tumores primarios y la formación de metástasis (Qian y Pollard, 2010, Cell 141, 39; Coussens et al., Science 339, 286; Egeblad et al., 2010, Developmental cell 18, 884). Se evaluó la infiltración de macrófagos en los tumores que podría promover el crecimiento tumoral en MISTRG. De forma notable, se observó que el tamaño de los tumores en MISTRg injertados con CD34+, que están fuertemente infiltrados por macrófagos humanos CD163+ HLA-DRbajo CD206+, fue significativamente mayor que los tumores en NSG, que no están infiltrados por macrófagos humanos y tienen el mismo tamaño pequeño que se observa en ratones NSG o MISTRG no injertados (Figuras 4E y 4F). Uno de los mecanismos por los cuales los macrófagos apoyan el crecimiento tumoral es a través de la producción de citocinas o enzimas que promueven la vascularización y la inmunosupresión. El VEGF es una importante molécula polifuncional de soporte tumoral (Kandalaft et al., Current topics in microbiology and immunology 344, 129; Motz y Coukos, Immunity 39, 61) y para comprobar si este factor estaba implicado en el crecimiento tumoral en MISTRG, los ratones fueron tratados con el inhibidor de VEGF humano Avastin™. Este tratamiento revirtió por completo el fenotipo de crecimiento tumoral (Figura 4F), lo que demuestra que las células mieloides en MISTRg respaldan el crecimiento del melanoma a través de un mecanismo dependiente de VEGF. Globalmente, estos resultados muestran que los ratones MISTRG recapitulan el papel de los macrófagos humanos en el desarrollo de tumores y satisfacen una necesidad crítica de modelos que permitan estudios de la interacción entre tumores humanos y macrófagos humanos in vivo, especialmente al inicio del desarrollo del tumor.

Los datos descritos en el presente documento han demostrado que la provisión de múltiples citocinas humanas en ratones MISTRG resultó en efectos sinérgicos (Figura 16) en la hematopoyesis humana y en el apoyo directo o indirecto para la función de las células inmunitarias humanas. El modelo MISTRG de ratones SHLH ofrece una oportunidad única para estudiar las respuestas inmunitarias innatas humanas in vivo.

A continuación se describen los materiales y métodos.

Cepas de ratón

La generación de ratones con reemplazo knockin de los genes que codifican TPO, IL-3/GM-CSF y M-CSF o con expresión transgénica BAC de SIRPa humano en el antecedente genético RAG2-/-yc-/- Balb/cx 129 (Rathinam et al., 2011, Blood 118, 3119; Willinger et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 2390; Rongvaux et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 2378; Strowig et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 13218). Estas cepas se cruzaron para obtener ratones MITRG (M-CSFh/hIL-3/GM-CSFh/hT-POh/hRAG2-/-yc-/-) y MISTRG (M-CSFh/hIL-3/GM-CSFh/hhSIRPAtgTPOh/hRAG2-/-Yc-/-). Esos ratones son viables, saludables y fértiles. Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con tratamiento continuo con enrofloxacino en el agua de bebida (Baytril, 0,27 mg/ml). Se obtuvieron ratones NOD Scid Yc-/-(NSG) de Jackson Laboratory.

Preparación e injerto de CMPH humano en ratones receptores

Los ratones receptores se injertaron con células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas como se describe (Rathinam et al., 2011, Blood 118, 3119; Willinger et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 2390; Rongvaux et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 2378; Traggiai et al., 2004, Science 304, 104; Strowig et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 13218). Las muestras de hígado fetal se cortaron en pequeños fragmentos, se trataron durante 45 minutos a 37 °C con Colagenasa D (Roche, 100 ng/ml) y se preparó una suspensión celular. Las células CD34+ humanas se purificaron mediante centrifugación en gradiente de densidad (Lymphocyte Separation Medium, MP Biomedicals) seguido de selección inmunomagnética positiva con microesferas c D34 antihumanas (Miltenyi Biotec). Las células se congelaron en FBS que contenía DMSO al 10 % y se mantuvieron en nitrógeno líquido.

Para el injerto, los cachorros recién nacidos (dentro de los primeros 2 días de vida) fueron irradiados de forma subletal (irradiación con rayos X; RG, 2 x 180 cGy con 4 horas de diferencia; NSG, 1 x 100 cGy; MISTRG, 1 x 150 cGy) y 100.000 células FL-CD34+ en 20 pl de PBS se inyectaron en el hígado con una aguja de calibre 22 (Hamilton Company). En experimentos específicos (Figuras ID y 1E), se inyectaron 200000-300000 células en recién nacidos MISTRG no irradiados. Se extrajo sangre de los ratones 7-9 semanas más tarde y se midió el porcentaje de células CD45+ humanas mediante citometría de flujo. Se seleccionaron ratones en los que las células CD45 humanas representaban al menos el 5 % (RG) o el 10 % (NSG, MITRG y MISTRG) del total (ratón y humano combinados) de las poblaciones de CD45+ para experimentación adicional. Los ratones fueron sacrificados o usados para experimentos 9-12 semanas después del trasplante.

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los protocolos del Comité de Investigación Humana de la Universidad de Yale y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Yale.

Análisis inmunofenotípico de poblaciones de células humanas

Para preparar glóbulos blancos, la sangre heparinizada se trató dos veces con tampón de lisis ACK para eliminar los glóbulos rojos. La suspensión de células individuales del bazo y la médula ósea (lavados del fémur y la tibia) se trataron con tampón de lisis ACK. Los leucocitos de hígado y pulmón se aislaron mediante disociación mecánica y digestión de tejidos con 100 U/ml de colagenasa IV y 0,02 mg/ml de ADNasa I (Sigma) durante 1 hora a 37 °C, seguido de centrifugación en gradiente de densidad.

Para el análisis FACS, se usaron anticuerpos contra los siguientes antígenos:

Antígenos de ratón: CD45 (clon 30-F11), CD71 (RI7217), Ter119

Antígenos humanos: CDlc (BDCA1, clon L161), CD3 (UCHT1), CD11b (ICRF44), CD11c (3,9), CD14 (M5E2), CD16 (3G8), CD19 (HIB19), CD33 (WM53), CD45 (HI30), CD62L (DREG-56), CD66 (ASL-32), CD94 (DX22), CD107a (H4A3), CD115 (9-4D2-1E4), CD123 (6H6), CD141 (BDCA3, M80), CD161 (HP-3G10), CD235a (HI264), CD303 (BDCA2, 201A), NKp46 (9E2), IL-15Ra (JM7A4), CX3CR1 (2A9-1), HLA-A,B,C (W6/32), HLA-DR (L243), IFN^y (B27) KIR2DL1/S1 (HP-MA4), KIR2DL2/L3 (DX27), KIR3DL1 (DX9), perforina (dG9).

Cóctel de linaje humano: CD3, CD15, CD19, Cd 56, NKp46

Todos los anticuerpos se obtuvieron de Biolegend, BD Biosciences o Miltenyi Biotec. Los datos se adquirieron con FACSDiva en un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo.

Para el análisis histológico, se fijaron tejidos de bazo, pulmón, hígado y el colon durante la noche en fijador de cinc IHC (BD Biosciences) o paraformaldehído al 4 % y se incluyeron en parafina. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina, o con anticuerpo anti-CD68 humano (clon PGM1) seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP y se revelaron con el sustrato de peroxidasa 3, 3'-diaminobencidina.

Ensayo de fagocitosis in vitro

Se cultivó E. Coli que expresa GFP en medio LB durante la noche a 37 °C hasta una DO600 de 1,5-1,8, momento en el que las bacterias se diluyeron y se cultivaron durante 1-2 horas hasta una DO600 de aproximadamente 1,0. Los cultivos de E. Coli se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con leucocitos de ratones MITRG durante 4 horas a 37 °C en un volumen de 200 pl con aproximadamente 2 x 108 de E. Coli por 1 x 107 glóbulos blancos. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se analizaron por citometría de flujo.

Estimulación TLR in vitro e infección in vivo

Se aislaron subconjuntos de monocitos humanos de la MO de ratones. Brevemente, se recuperaron y agruparon células de MO de las patas traseras y la columna vertebral de seis ratones. Las células CD33+ humanas se enriquecieron mediante aislamiento magnético (kit de selección EasySep CD33, StemCell Technologies). Los subconjuntos CD14+CD16- y CD14+CD16+ se purificaron en un clasificador de células FACSAria (BD Biosciences). Se cultivaron 100.000 células en 200 pl de medio durante la noche en presencia del ligando LPS de TLR4 (E. Coli 0111:B4, Sigma-Aldrich, 100 ng/ml) o el ligando TLR7/8 R848 (Invivogen, 10 pg/ml).

Para la estimulación in vivo, 35 pg de LPS (E. Coli 0111:B4, Sigma-Aldrich) en 100 pl de PBS se inyectaron por vía intraperitoneal y el suero se recogió 90 minutos después.

Los ratones fueron infectados con 3x103 unidades formadoras de colonias (UFC) de Listeria monocytogenes (cepa 10403S) por inyección intravenosa. Cuarenta y ocho horas después de la infección, se recogieron los sueros y tejidos para la realización de ELISA y qPCR, respectivamente. Se incubaron linfocitos hepáticos de ratones no infectados o infectados a 37 °C/5 % CO² durante 4 horas en medio que contenía monensina (GolgiStop, BD Biosciences) y anticuerpo anti-CD107a humano. A continuación, las células se tiñeron para antígenos de superficie, se permeabilizaron utilizando el kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) y se tiñeron para IFN^y humano intracelular.

Los ratones se infectaron por vía intranasal con 2 x 104 UFP del virus de la influenza A/PR8 (H1N1) y los pulmones se recogieron el día 3 después de la infección para el análisis de qPCR.

Las concentraciones de citocinas (TNFa humano, IL-6 e IL-1p) en suero de ratón y en sobrenadantes de cultivo se midieron utilizando kits estándar ELISA MAX (Biolegend), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Análisis de los RBC

Los recuentos de glóbulos rojos se midieron en un Hemavet 950 (Drew Scientific). Los frotis de sangre se tiñeron con Wright-Giemsa. Para experimentos de transferencia de glóbulos rojos de ratón, se obtuvo sangre de ratones RG, se marcaron con CFSE (20 jM , 15 minutos a 37 °C), se lavaron tres veces con PBS y se inyectaron 200 j l de glóbulos rojos marcados mediante inyección intravenosa retroorbital. Se extrajo sangre de los ratones 5 minutos más tarde para determinar la frecuencia inicial (día 0, 100 %) de células CFSE positivas entre las células Ter119+ mediante citometría de flujo. Luego se extrajo sangre en los puntos de tiempo indicados y se calculó el mantenimiento de las células Ter119+ marcadas con CFSE como un porcentaje de los valores del Día 0.

Agotamiento de las células fagocíticas in vivo

Las células fagocíticas se agotaron mediante inyección retroorbital intravenosa de 100 j l de liposomas cargados con clodronato (Van Rooijen y Sanders, 1994, Journal of immunological methods 174, 83). Se inyectaron clodronatoliposomas 3 veces al día y se analizaron células NK humanas en hígado de ratón 24 horas después de la última inyección. Para el ensayo de fagocitosis de glóbulos rojos, se inyectaron liposomas de clodronato 3 días y 1 día antes de la transferencia de glóbulos rojos marcados con CFSE.

RT-PCR cuantitativa

El ARN total se extrajo de tejidos o células purificadas con reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante y se usó para la síntesis de ADNc con el sistema de síntesis SuperScript First-Strand (Invitrogen). La RT-PCR cuantitativa se realizó en un sistema 7500 Fast Real-Time PCR con juegos de cebador-sonda adquiridos de ABI. Los valores de expresión se calcularon utilizando el método de ciclo de umbral comparativo y se normalizaron a Hprt de ratón o HPRT humano, como se indica.

Ensayos de citotoxicidad de células NK in vivo

La citotoxicidad de células NK humanas in vivo se determinó siguiendo un protocolo previamente informado (Strowig et al., 2010, Blood 116, 4158). Se mezclaron células LCL721.221 (HLA clase I negativas) y LCL721.45 (clase I positivas) en una proporción de 1:1, marcadas con CellTrace Violet (Invitrogen) e inyectado por vía intravenosa (1x107 células/ratón) en ratones NSG o MISTRG injertados. Se sacrificó a los ratones 12 horas más tarde y se preparó una suspensión de células individuales de los bazos y se analizó mediante citometría de flujo. Se midieron las proporciones de HLA clase I positivo y negativo entre las células violetas y se calculó la lisis específica como (MHC clase I positivo - MHC clase I negativo) x 100/MHC clase I positivo.

Tumorigénesis

La línea celular de melanoma humano Me290 (Valmori et al., 1998, Journal of immunology 160, 1750) se cultivó a ~90 % de confluencia y las células (~7 millones de células por ratón) se inyectaron por vía subcutánea bajo anestesia en el flanco del ratón. Para algunos experimentos, los ratones fueron tratados cada dos días, comenzando el día del implante del tumor, con el anticuerpo anti-VEGF humano Avastin™ (Roche; 100 jg por vía intravenosa). El tamaño de los tumores se midió 11 días después y se calculó el volumen utilizando la siguiente fórmula: Volumen = 0,5 * Longitud2 * Anchura.

Los pacientes y los tejidos de los ratones se congelaron en temperatura de corte óptima (OCT, Sakura Finetek). Las criosecciones (7 jm ) se trataron consecutivamente con Triton-100X 0,1 % durante 15 minutos, hialuronidasa al 0,03 % durante 15 minutos, Background Buster (Innovex bioscience) durante 15 minutos, bloqueo del receptor Fc (Innovex bioscience) durante 15 minutos y Background Buster durante 15 min adicionales. Luego, las secciones se tiñeron con anticuerpos primarios, se diluyeron en PBS suplementado con BSA al 5 % y saponina al 0,01 % durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron y tiñeron con los anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 40 minutos. Los núcleos se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (1 jg/m l) durante 2 minutos.

Anticuerpos primarios: CD14 humano (1:200, UCHM1, AbD Serotec); CD163 humano (1:200, EDHu-1, AbD Serotec); CD206 humano (1:100, 15-2, AbD Serotec); DR-HLA humano (1:100, LN3, Biolegend). Para la tinción combinada de CD163/CD206, ambos anticuerpos se marcaron con Alexa Fluor 488 o 568 Antibody Labeling Kit (Molecular Probes) antes de la tinción del tejido.

Anticuerpos secundarios: Alexa Fluor 568 de cabra anti-rata; Alexa Fluor 488 de cabra anti-ratón; Alexa Fluor 588 de cabra anti-ratón o Alexa Fluor 647 de cabra anti-ratón (1:700, Molecular Probes).

Las imágenes de inmunofluorescencia se realizaron en un sistema de microscopio invertido Eclipse Ti (Nikon Instruments Inc.) operado a través del software NIS-Element Ar (Nikon Instruments Inc).

Para la cuantificación de la densidad de la infiltración de células CD163+, se seleccionaron tumores de 3 pacientes con melanoma diferentes, 3 NSG y 3 MISTRG. De cada tumor, se tiñeron 3 criosecciones para CD163 humano. De cada sección teñida se adquirieron 3 imágenes representativas, totalizando 27 imágenes representativas de cada grupo (Pacientes, MISTRG y NSG). Para cada imagen, las células CD163+ se contaron usando el software NIS-Element Ar (Niko Instruments Inc.). Cada imagen se analizó usando la visualización de "superposición de canales divididos" y haciendo zoom simultáneamente en cada canal separado y en la superposición.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con el programa informático GraphPad Prism 5, utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey, prueba t de Student no pareada de dos colas o ANOVA de medidas repetidas.

Ejemplo 2: Las neoplasias mieloides humanas se pueden injertar en MISTRG

La leucemia mieloide es una forma de cáncer que afecta a las células del linaje mieloide. Las leucemias mieloides se clasifican en diferentes tipos, incluyendo leucemia mieloide aguda (LMA), trastorno mieloproliferativo (TMP), leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) y síndrome mielodisplásico (SMD). El riesgo de desarrollar leucemias mieloides aumenta con la edad y es probable que la incidencia de estas enfermedades aumente con el envejecimiento de la población. Aunque los enfoques terapéuticos y de atención de apoyo están disponibles en la clínica, se necesita una mejor comprensión de este grupo de enfermedades y nuevas terapias.

Uno de los métodos utilizados para estudiar las leucemias humanas se basa en el xenotrasplante de muestras de pacientes en ratones inmunodeficientes. Sin embargo, los ratones receptores actualmente disponibles no son óptimos para este propósito: solo se puede injertar con éxito un subconjunto de muestras de AML; y robusto injerto de TMP, LMMC o SMD (incluidos RCUD, RAEB I y RAEB II) no se han informado hasta el momento. Así, se necesitan cepas optimizadas de ratones receptores para un mejor injerto de la leucemia mieloide humana.

Se demuestra en el presente documento que MISTRG apoya un mejor injerto de células hematopoyéticas humanas, conduciendo al reemplazo casi completo de la hematopoyesis de ratón por hematopoyesis humana en la médula ósea. También se muestra en el presente documento que las muestras aisladas de pacientes con LMA, LMMC y SMD se pueden injertar en ratones MISTRG (la Figura 17,.

Por lo tanto, los animales no humanos modificados genéticamente descritos en el presente documento representan una nueva en vivo modelo animal de leucemia mieloide humana que será útil para (i) estudiar la patogenia celular y molecular de la enfermedad; (ii) identificar biomarcadores con valor predictivo o pronóstico; (iii) identificar nuevos objetivos para las terapias; y (iv) probar terapias en un entorno preclínico y específico del paciente.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un ratón modificado genéticamente que comprende en su genoma:

un ácido nucleico que codifica M-CSF humano que reemplaza el ácido nucleico que codifica M-CSF de ratón y está unido operativamente al promotor y a elementos reguladores de M-CSF de ratón, un ácido nucleico que codifica IL-3 humana que reemplaza el ácido nucleico que codifica IL-3 de ratón y está unido operativamente al promotor y a elementos reguladores de IL-3 de ratón, un ácido nucleico que codifica el GM-CSF humano que reemplaza al ácido nucleico que codifica el GM-CSF de ratón y está unido operativamente al promotor y a los elementos reguladores del GM-CSF de ratón, un ácido nucleico que codifica SIRPA humano unido operativamente a un promotor de SIRPA humano y a una secuencia reguladora de SIRPA humano, y un ácido nucleico que codifica TPO humana que reemplaza el ácido nucleico que codifica la TPO de ratón y está unido operativamente al promotor y a elementos ^{reguladores de TPO de ratón, en donde el ratón expresa el polipéptido M-CSF humano, el polipéptido i}L-3 ^{humano, el} polipéptido GM-CSF humano, el polipéptido SIRPA humano y el polipéptido TPO humano, y en donde el ratón comprende un gen de activación de la recombinación 2 (Rag2) inactivado y un gen inactivado de la cadena gamma del receptor de IL2 (IL2rg).

2. El ratón modificado genéticamente de la reivindicación 1, que comprende además células hematopoyéticas humanas.

3. El ratón modificado genéticamente de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además una célula cancerosa humana.

4. El ratón modificado genéticamente de la reivindicación 3, en donde la célula cancerosa humana es una célula de leucemia o una célula de melanoma.

5. Un método de injerto de células madre y progenitoras hematopoyéticas (CMPH) en un ratón modificado genéticamente, en donde el ratón expresa M-CSF humano, IL-3 humana, GM-CSF humano, SIRPA humano y TPO humano, comprendiendo el método la etapa de: administrar al menos una CMPH al ratón modificado genéticamente de la reivindicación 1.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el ratón modificado genéticamente comprende una célula cancerosa humana.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la célula cancerosa humana es una célula de leucemia o una célula de melanoma.