JPH05500617A - 免疫処理された宿主におけるヒト末梢血液細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野は、ヒト造血細胞の生成である。

背景 単一の幹細胞から発生する種々の細胞を含んで成る血液細胞系は、哺乳類の生存 及び成長に不可欠である。細胞は、酸素を運び、残骸本体を浄化し、病原体の増 殖を阻害し、新生細胞をモニターし、そしてそれら自体及び他の細胞の増殖のた めに不可欠な種々の因子を提供するように作用する。最近、キメラ性マウスが開 発され、ここでヒト胎児組織がキメラ性血幹細胞の源により供給される場合、長 期間、ヒト胎児リンパ節及び胸腺を維持し、そして末梢血液細胞を供給すること が示された。多くの場合、ヒト末梢血液細胞の維持が長期間拡張され得るが、す べての場合、ヒト細胞は末梢血液細胞の合計数のひじょうに低い割合、時々実質 的に１％以下であった。さらに、これらの動物における循環細胞は、Ｔ細胞であ ることが示された。

多くの場合、ヒト細胞として比較的高い割合の末梢血液細胞を有し、そして所望 には、ヒト細胞である造血細胞の合計数の有意な割合を有することが所望される 。さらに、リンパ球の他に、循環性骨髄単核細胞及び赤血球細胞を有することが 所望される。

多くの用途のためには、高い絶対数のヒト細胞を有することが実質的な利点であ る。これらは、ヒト細胞からの強い免疫応答、種々の疾患の研究及び種々の造血 細胞に対するそれらの効果並びに種々の疾患に対する薬物の研究及び造血細胞に 対するそれらの効果を得るために免疫化のだめの機会を包含する。従って、非ヒ ト哺乳類が、試験、研究のために、及び種々の系統の血液細胞源としてヒト血液 細胞により供給され得る手段を提供することに実質的な興味が存在する。

けるヒト胎児組織の導入を記載する。それに引用される文献も参照のこと。

発明の要約 異種移植性骨髄が内因性骨髄除去された遺伝的免疫処理哺乳類宿主中に導入され 、ここで前記骨髄は、特に胎児源からの骨組織又は分散された骨髄として存在す ることができる。

胎児性骨組織は便利には、腹腔中に導入され、又は骨髄は免疫処理された宿主の 長管中に注入され得る。

特定の態様の記載 合計末梢血液細胞の少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％及びより好まし くは少なくとも約１５％として存在するヒト末梢血液細胞を有する非ヒト哺乳類 、特に２５ｋｇ以下の小畦乳類が供給される。ヒト細胞の増強されたレベルは、 内因性骨髄、特に幹細胞の除去により、便利には、一般的に少なくとも約２００ ラドであり、そして宿主の大きさ及び性質により変化する少なくとも致死量以下 の放射線用量による宿主の照射により達成され得る。次に、血液細胞は、特に胎 児源からヒト骨又は骨髄細胞懸濁液としてヒト骨髄により再構成される。ヒト骨 髄源は、特に照射による除去に対する宿主の生存割合を高めるために、除去の前 及び後で導入され得る。

種々の免疫処理された宿主が、使用され得、ここで免疫処理される宿主は、天然 の成熟、増殖、トランスジェニックマウスを供給するために胚細胞の形質転換又 は同様のものの結果として存在する。機能的なリンパ球系を欠く宿主が特に興味 の対象である。免疫システムの欠乏は、特定の器官の欠乏、遺伝的欠陥、たとえ ば組換え酵素（ｒ６ｃｏｍｂｉｎａｓｅ）の発現を調節する不適切な組換え酵素 又は調節遺伝子、表面へのｓＩｇ及びＴ細胞受容体の輸送、非機能的な主要組織 適合性抗原又は同様のものの結果として存在することができる。ＣＢ−１７ｓｃ 　ｉｄ／　ｓｃ　ｉｄマウス及びさらに増強された免疫欠陥性を有し、たとえば 天然のキラー（ＮＫ）細胞を欠く、前記マウスに由来するマウスが特に興味の対 象である。

宿主は、内因性骨髄を実質的に除去するのに便利ないづれかの手段で照射され又 は処理される。便利には、放射線のレベルが、適度な、好ましくは高い割合の生 存宿主を維持しながら、造血細胞システムの少なくとも実質的に完全な除去を付 与するように選択されるであろうＸ−線が使用される。宿主の個々のタイプに関 しては、照射の特定のレベルは、その除去の効力のために残存する生存性造血細 胞のレベルをスリニンすることによって選択され得る。単独で又は組合して使用 され得る骨髄除去のための他の技法は、細胞毒性薬物、免疫毒素、リンフ才力イ ン及び成長因子に対する抗体、天然のキラー細胞に対する抗体、等を包含する。

細胞毒性薬物の選択は、ヒト骨髄の供給の前又はそのすぐ後、非細胞毒性レベル に急速に減じられるように、リンパ及び血液循環システムからすばやく消えるそ れらの能力に基づかれるであろう。

ヒト骨髄は通常、胎児骨髄であり、そして胎児の種々の部分、たとえば大腿骨、 脛骨、上腕骨又は肋骨に起因する骨髄スライス、フラグメント、塊状物又は同様 のものとして使用され得る。ヒト骨の最長寸法は一般的に、約３ｍｍ〜２ｃｍの 範囲の大きさであり、ここで前記骨は長軸にそって、約４個よりも多くない部分 に断片化され得る。通常、宿主に導入される胎児骨の合計体積は、宿主の大きさ により変化するであろう。マウスに関しては、その体積は一般的に、約４０ｍｍ ３〜１．２００ｍｍ３の範囲である。他方、ヒト胎児骨髄細胞懸濁液は、長管、 たとえば大腿骨又は脛骨中に注入され得る。一般的に、骨髄懸濁液の体積は、マ ウスに関しては、約１０ｍ１〜５０ｍ１の範囲であろう。

宿主の年齢は一般的に、少なくとも新生期であり、そして通常生後約６カ月以下 、より普通には生後３力月以下であろう。特定の年齢は、本発明に臨界ではない が、しかしより若い動物は、操作のためにより便利であり、そしてより経済的で ある。

胎児骨部分の導入部位は、腹膜内、皮下、乳房脂肪パッド又は他の便利な部位で あり得る。

骨髄の導入後、宿主は、供給物に抗生物質の存在を伴って又は伴わないで、適切 に宿主を育てる従来の方法に従って成長せしめられる。便利には、約０．２％〜 １．２％のスルファメトキサゾール／トリメトプリム（Ｓｅｐｔｒａ）が供給物 に供給され得る。適切には、ヒト胎児骨髄、通常約２個よりも多くない追加の体 外移植組織の追加の導入が、一般的に４〜２０週間隔で行なわれ得る。

宿主は、宿主又はヒトに生来の種々の成長因子及び細胞質分裂物を受けることが できる。インターロイキン、たとえばＩＩ、１．ＩＬ−３，ＩＬ−６、コロニー 刺激因子、たとえばＧ−Ｃ３Ｆ、ホルモン又は同様のものが添加され得る。一般 的に、添加物の量は、特定の添加物、宿主及び同様のものに依存して変化するで あろう。たとえば、Ｉ　Ｌ　−３の場合、０−　５〜５μｇ／日で投与され得る 。

対象の宿主においては、骨組織は、１０〜８０％の種々の細胞性を示す。さらに 、ヒト細胞は、末梢血液における循環において有意な割合の血液細胞を含んで成 る。細胞は、リンパ球、骨髄単球及び赤血球系のメンバーを包含する。細胞は、 血液細胞上のヒトマーカー、たとえばＣＤ−３，−４，−８゜−１０，−１３， −１５，−１９，−２０，−３３，−４１，。

−４５，−５９，ＨＬＡ又は同様のものの検出のために市販されている広範囲の 種類の抗体を用いることによって検出され得る。便利には、血液サンプルが取ら れ、そして螢光活性化された細胞ソーターを用いてアルセイされ得る。他方、細 胞は溶解され、モしてウェスターンプロットが用いられる。

特定の細胞タイプの定量測定のために使用される他の技法は、ポリマラーゼ鎖反 応、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ又は同様のものを包含する。

骨髄の他に、他のヒト器官、特に胸腺、リンパ節、皮膚、肝臓、膵臓、扁桃、虫 垂、上皮、腎臓、等もまた存在することができる。１又は複数の腸間膜性又は末 梢リンパ節が導入され得る。種々の器官が、便利には腎臓カプセル、乳房脂肪パ ッド、特にマウスに関しては４番目の乳房脂肪パッド、腋窩、又は器管が血管化 され、リンパ管が連結され、そして宿主により維持され得る他の便利な部位に、 適切な期間、通常少なくとも４週間、好ましくは少なくとも６週間、導入され得 る。従って、非ヒ）Ｗ乳類は、幹細胞の連続した再生及び種々のタイプの前駆又 は成熟細胞の５０％以上の発生を伴って、ヒト造血システムの有意な部分を提供 することができる。

この態様においては、骨髄単球系、たとえばマクロファージ、肥満細胞、好中球 （ＰＭＮ）　、好酸球、好塩基球、単球、巨核球、等の細胞、又はリンパ球系、 Ｂ　ＩＪンパ球、Ｔ　Ｉ７メンバ、ＮＫ細胞、ＡＤＣＣ細胞、ＬＡＫ細胞、ＴＩ Ｌ細胞、等が、種々の目的のために増殖され、研究され又は使用され得る。

対象の宿主は、非ヒト宿主における循環性ヒト血液細胞の有意な存在により広範 囲に使用され得る。宿主は、ヒトモノクローナル抗体又は不滅化されたＴリンパ 球の生成のために使用され得る。宿主は、適切な部位で血管内注入され得る適切 な免疫原により従来の方法に従って免疫化され得る。宿主中に導入されるヒトリ ンパ節により流出される部位での注入が、特に興味の対象である。免疫化された 宿主は、１又は複数回の追加免疫を受け、その後、リンパ球気管、たとえばリン パ節が除去され、続いて便利には、適切な骨髄細胞との融合又はエプスタイン− バールウィルスによるトランスフェクションにより不滅化される。他方、細胞は 、個々のクローンを供給するために、いづれか便利な手段、たとえば限界希釈法 でクローン化され得、そして個々のクローンの上清液は、宿主に存在する抗体の 結合親和性についてスクリーンされ得る。

他方、宿主は、Ｔ及びＢ　リンパ球の刺激の態様及び免疫反応についての機構の 決定において、Ｔ及びＢ　リンパ球の相互作用を研究するために使用され得る。

個々のリンパ球は、疾患に対する疾患保護におけるそれらの役割の評価、ｓＩｇ 又はＴ細胞受容体の可変部の固定、その可変部をコードするＤＮＡの単離、又は 同様のことのためにクローン化され得る。

種々の免疫原が、病原体の中和に効果的であり得る抗体の生成においてワクチン としてのそれらの能力についてスクリーンされ、そして細胞又はＤＮＡがその応 答に関与する可変部の源を提供する。

対象の病原体は、ヒトに特に関連するもの、たとえばＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ及び −■、ヒト乳頭瘍ウィルス、サイトメガロウィルス、ニスフタイン−バールウィ ルス、Ｂ型肝炎ウィルス、非−八、非−Ｂ肝炎、クラミジア、マラリア（Ｆａ、 １ｃｉｐａｒｕｍ）等である。また、対象のシステムは、特定の癌タイプに対し て特異的な細胞毒性細胞を増殖する試みの際の癌の研究に使用され得る。

次の例は、例示目的であって、本発明を制限するものではない。

実験 骨断片を、未処理のマウス（生後６〜１０週目）又はセシウム１３７源からの放 射線により前処理されたマウス（生後６〜１０週目）中に移植した。マウスを、 全身の照射又は長管の照射のいづれかにより処理する。全身照射により処理され たマウスは、１回の投与で２００〜４００ラドを受ける。

他方、他のマウスは、鉛シートにより胸郭及び腹部をしゃ断した後、６００ラド により処理される。マウスは、しゃ断された照射の前、Ｎｅｍｂｕｔｏｌにより 麻酔をか得られる。マウスは、ＣＢ−Ｉ　Ｌ　５ｓｃｉｄ／５ｃｉｄマウスであ った。さらに、何匹かのマウスを、１日当たり２回の１Ｆｇの投与量で、外因性 ヒトＩＬ−３により処理した。胎児の骨断片を、まず骨から柔組織及び軟骨部分 のすべてを除くことによって、１８〜２２透口の妊娠の胎児から調製する。次に 、骨を２〜５闘の間隔で横断化する。マウスを、Ｎｅｍｂｕｔｏｌのｉ、　ｐ、 注入により調製する。マウスが十分に麻酔をかけられた後、１ｃｍの切開が皮膚 及び下部にある腹膜に行なわれる。次に、骨断片を、ランダムに腹腔内に入れる 。約２５Ｉｎ［１１〜１−　５ｃｍの大腿骨、脛骨又は上腕骨を個々のマウスに 移植する。照射されるマウスは、胎児の骨の続く移植の２４時間以内に照射され る。

２〜６週の後、末梢血液中のヒト細胞の％を、ヒト造血細胞マーカーに対して特 異的なモノクローナル抗体を用いることによって測定する。照射されていないマ ウスにおいては、低レベルのヒト細胞がＦＡＣ３ｃａｎにより末梢血液に観察さ れる。

腸性細胞は、約０〜１．６％である。さらに、ＩＬ−３の注入は、腸性細胞の％ を有意に影響を及ぼさない。対照的に、骨髄移植の前に照射されたマウスは、末 梢血液中に１．５〜３０％のヒト細胞を示した。これらの細胞は、骨髄単球系の ものであると思われる。それらは、Ｔ又はＢ細胞マーカー（ＣＤ３，４，８．１ ９）による染色を示さないが、但し、それらは骨髄細胞マーカー（ＣＤ３３）に よる染色は示す。

さらに、ヒト細胞は、それらが骨髄単球系のものであることを示す高い側面散乱 プロフィールを有する。さらに、移植の前に照射された４匹のマウスのうち２匹 は、６週間後、低いが、但し有意なレベルの血清免疫グロブリンを示す。

上記結果は、比較的多量のヒト骨髄、特に支質骨組織を移植することによって、 内因性骨髄の少なくとも一部除去された、免疫処理されたマウスに高レベルのヒ ト細胞を得ることができることを示す。照射の後に移植されたヒト骨髄は、実質 的な数のヒト骨髄単球系の細胞をもたらすマウスを供給し、そして他の系統、た とえばリンパ球の細胞もまた供給することができる。骨髄と組織との適切な組合 せにより、免疫処理されたマウスの内部に、ヒト造血システムに類似する造血シ ステムを供給することができる。従って、種々の方法、化合物、薬物又は同様の もの、並びにヒト造血システムに対するそれらの効果を、細胞学的又は組織学的 分析、選択、染色又は同様のものにより研究することができる。

本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は、本発明が関与する当業者 の熟練のレベルを示す。すべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に 組込まれる。

前記発明は、例示的及び測的にいくらか詳細に説明されて来たが、一定の変更及 び変性が、請求の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。

要　約　書 ヒト末梢血液細胞循環が、宿主の内因性造血細胞を実質的に除去するために、宿 主の照射の後、宿主中へのヒト胎児骨髄の導入により異種移植性免疫処理された 宿主に達成される。

宿主は、末梢血液に実質的なレベルのヒト血液細胞を示しながら、長期間、生存 する。

国際調査報告 −１−一＾−〇−ｍ　、　ｐ（テ／ＩＩ＜Ｑｌ　／ｌ’ｌ’１ｖＩ４Ｓｅａｒｃ ｈ　Ｔｅｒｍｓ°５ＣＩＤ、　ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｃｎｊｓｅｄ、　ｉｍ ｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ、　ｔｒｓｎｇｐｌ高煤B ｂｏｎｅ　ｃａａｒｒｏｖ、　ｈｕｍａｎ、　ｍ１ｃｅ、　ｚｅｎｏｇｅｎｅｉ ｃ、　ｒｅｖｉｅｖ、　「ｒｉｄｉａｔｅ、　１ｎｖｅｎｔ盾窒刀f　ｎａｍｅ ｓ。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．宿主の血流における循環性血液細胞の合計数の少なくとも２％の循環性ヒト 血液細胞を含んで成る遺伝的に免疫処理された非霊長類哺乳類宿主であって、前 記宿主が内因性骨髄を実質的に除去し、そしてヒト骨髄を移植することによって 生成される非霊長類宿主。
2. ２．前記除去が少なくとも致死量以下の照射による請求の範囲第１項記載の非霊 長類宿主。
3. ３．前記ヒト骨髄が骨組織である請求の範囲第１項記載の非霊長類宿主。
4. ４．前記ヒト骨髄が分散された骨髄である請求の範囲第１項記載の非霊長類宿主 。
5. ５．前記宿主がネズミである請求の範囲第１項記載の非霊長類宿主。
6. ６．遺伝的に免疫処理されたネズミ宿主であって、前記宿主が、遺伝学的欠陥の 結果として機能的なＢ及びＴリンパ球を欠き、前記宿主が前記宿主の血流におけ る循環血液細胞の合計数の少なくとも５％の循環性ヒト血液細胞を含んで成り、 前記宿主が内因性骨髄を実質的に除去し、そしてヒト骨髄を移植することによっ て生成されることを特徴とするネズミ宿主。
7. ７．前記宿主がＣＢ−１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス又はその子孫である請求の 範囲第６項記載のネズミ宿主。
8. ８．少なくとも２５％の循環性ヒト血液細胞を含んで成る請求の範囲第７項記載 のネズミ宿主。
9. ９．ヒト胎児骨髄を含んで成る請求の範囲第６項記載のネズミ宿主。
10. １０．少なくとも１種のヒトリンパ節、肝臓又は胸腺組織を含んで成る請求の範 囲第６項記載のネズミ宿主。
11. １１．前記宿主が、前記ヒト骨髄の移植の時点から少なくとも６週目である請求 の範囲第６項記載のネズミ宿主。
12. １２．循環性ヒト免疫グロブリンを含んで成る請求の範囲第６項記載のネズミ宿 主。
13. １３．前記ネズミ宿主が少なくとも２００ラドにより照射される請求の範囲第６ 頂記載のネズミ宿主。