PT2019683T - Administração de fatores de crescimento para o tratamento de distúrbios do snc - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO1/! ADMINISTRAÇÃO^E^FATORES^E^RESCIMENTO^PARA^C^TRATAMENTOVÍIE1/! DISTÚRBI OSyjWzSNC/a
DECLARAÇÃO REFERENTE A INVESTIGAÇÃO OU DESENVOLVIMENTO FINANCIADO PELO GOVERNO FEDERAL
Esta invenção foi feita com o apoio do Governo sob a Subvenção N.° NINDS U54 NS045309, concedida pelos Institutos Nacionais de Distúrbios Neurológicos e de Derrame cerebral. 0 Governo dos E.U.A. tem certos direitos nesta invenção.
AVISO DE MATERIAL SUÉEITO A PROTEÇÃO DE DIREITOS DE AUTOR
Uma porção do material neste documento de patente está sujeito a proteção de direitos de autor segundo as leis sobre direitos de autor dos Estados Unidos e de outros países. 0 titular dos direitos de autor não tem qualquer objeção à reprodução fac-símile do documento de patente ou da revelação da patente por qualquer pessoa, conforme aparece no arquivo ou em registos publicamente disponíveis no Gabinete de Patentes e Marcas Registadas dos Estados Unidos, mas, de outra forma, reserva absolutamente todos os direitos de autor. 0 titular dos direitos de autor não renuncia, por este meio, a nenhum dos seus direitos de manter este documento de patente em segredo, incluindo, sem limitação, os seus direitos de acordo com o regulamento 37 C.F.R. § 1.14. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção
Esta invenção pertence às doenças neurodegenerativas e a outras condições patológicas caracterizadas por morte e./ou disfunção neuronal no sistema nervoso central. A invenção também diz respeito a fatores de crescimento que são capazes de promover a sobrevivência de neurónios no sistema nervoso central. A invenção refere-se especificamente a composições farmacêuticas que compreendem um fator neurotrõfico para utilização em métodos de tratar doenças neurodegenerativas e condições patológicas caracterizadas por morte e/ou disfunção neuronal no sistema nervoso central. 2. Descrição da Técnica Relacionada
Fatores de crescimento são proteínas naturais que desempenham papéis importantes no sistema nervoso. Eles são encontrados dentro do tecido nervoso, bem como em muitos tecidos alvo inervados. Fatores de crescimento promovem o crescimento, sobrevivência e diferenciação fenotípica de neurónios e/ou células da glia. Fatores de crescimento também desempenham um papel na remodelação de conexões sinãpticas no sistema nervoso maduro, um processo referido, em geral, como plasticidade neuronal. Por causa destes papéis fisiológicos, os fatores de crescimento são úteis para tratar distúrbios do sistema nervoso central (SNC) nos quais está comprometida a sobrevivência e/ou função apropriada dos neurónios. Tais distúrbios do SNC podem surgir através de meios muito diferentes, incluindo: (1) lesão física, que causa a degeneração dos processos axonais e/ou dos corpos das células nervosas próximas do local da lesão, (2) cessação, temporária ou permanente, do fluxo sanguíneo (isquemia) a partes do sistema nervoso, como no derrame cerebral, (3) exposição, intencional ou acidental, a neurotoxinas, tais como os agentes quimioterapêuticos de cancro e SIDA, cisplatina e dideoxicitidina (ddC), respetivamente, (4) doenças metabólicas crónicas, tais como diabetes ou disfunção renal ou (5) doenças neurodegenerativas, tais como doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Alzheimer e esclerose lateral amiotrófica (ELA), que resultam da degeneração de populações neuronais específicas. 0 efeito terapêutico de um fator de crescimento entregue ao SNC pode derivar de múltiplos mecanismos de ação. Os fatores de crescimento podem contribuir para eficácia terapêutica promovendo a sobrevivência e/ou mantendo a diferenciação fenotípica de uma população neuronal que está comprometida num distúrbio do SNC. Além disso, os fatores de crescimento podem atuar em populações neuronals secundárias que não estão comprometidas num distúrbio do SNC particular, mas que são capazes de efetuar alterações compensatórias benéficas no SNC em resposta ao fator de crescimento, por exemplo, através de plasticidade neuronal. Para que um fator de crescimento particular seja potencialmente útil no tratamento de um distúrbio do SNC, a população neuronal comprometida no distúrbio do SNC ou uma população neuronal secundária compensatória tem de ser responsiva ao fator particular. A responsividade a um fator de crescimento particular é conferida pelo seu recetor do fator de crescimento cognato, a grande maioria dos quais pertence à família dos recetores tirosina quinase.
Fator de crescimento nervoso (FCN) ê o membro fundador de uma família definida de fatores de crescimento, designada as neurotrofinas, que inclui fator neurotrófico derivado do cérebro (FNDC), neurotrofina-3 (NT-3), NT-4/5 e NT-6. Estas neurotrofinas são conhecidas por atuar através da família de recetores tirosina quinase trk, isto é, trkA, trkB, trkC e o recetor p75 de baixa afinidade.
Fator neurotrófico derivado da linha de células da glia (FNDG) é um homodímero ligado por dissulfido glicosilado que tem a sua homologia estrutural mais próxima com a superfamília de fator de crescimento transformador (FCT) de proteínas. FNDG foi identificado e purificado utilizando ensaios baseados na sua eficácia na promoção da sobrevivência e estimulando o fenõtipo transmissor de neurónios dopaminérgicos mesencefãlicos in vitro. In vivo, o tratamento com FNDG exógeno estimula o fenótipo dopaminérgico dos neurónios da substância negra e restaura défices funcionais induzidos por axotomia ou neurotoxinas dopaminérgicas em modelos animais da doença de Parkinson. Apesar de originalmente se ter pensado ser relativamente específico dos neurónios dopaminérgicos, experiências posteriores mostraram que FNDG tem eficácia neurotrófica em neurónios colinérgicos do tronco cerebral e da medula espinhal, tanto in vitro como in vivo. FNDG, e os ligandos relacionados neurturina, artemina e persefina, mantêm várias populações neuronais no SNC, incluindo neurónios dopamina e neurónios motores do mesencéfalo. A família FNDG de ligandos liga-se a proteínas alfa de recetores da família FNDG específicas, que formam complexos de recetores e assinalam através do recetor tirosina quinase RET. FNDG também é capaz de sinalizar diretamente através do recetor alfa, bem como através da molécula de adesão celular neuronal (MACN) através da ativação de Fyn e FAK.
No SNC, a expressão de trkA, o recetor para FCN, é quase exclusivamente limitada aos neurónios colinérgicos no prosencéfalo basal. Estes neurónios colinérgicos são de interesse neurológico particular, porque a degeneração e/ou distrofia neuronal colinérgica é um distintivo da doença de Alzheimer. Os neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal podem ser prontamente identificados em preparações morfológicas utilizando histoquímica da acetilcolinesterase ou com imuno-histoquímica utilizando anticorpo para colina acetiltransferase (ChAT) , a enzima sintética para acetilcolina ou para p75. A doença de Alzheimer é uma demência progressiva caracterizada pela falha da memória recente, amnésia, perturbações no comportamento emocional e dificuldade em gerir relações espaciais ou capacidades motoras. A doença ocorre em todo o mundo e é responsável por metade a dois terços de todos os casos de falha intelectual no final da vida em muitos países desenvolvidos com populações com esperanças de vida altas. A doença de Alzheimer é diagnosticada principalmente por sintomas clínicos, após outras causas de demência terem sido excluídas. Após a morte, o diagnóstico pode ser estabelecido de forma conclusiva pela observação no cérebro de numerosos emaranhamentos neurofibrilares e placas senis característicos que acompanham a degeneração observada na doença de Alzheimer. São observadas na doença de Alzheimer perda e degeneração específicas de região progressivas de células selecionadas nas áreas da associação e da memória do córtex cerebral, juntamente com anomalias em certos núcleos subcorticais . A perda neuronal afeta especialmente as grandes células piramidais das áreas de associação parietal e frontal, o hipocampo e amígdala. Entradas hipocampais fortemente afetadas são aquelas do córtex entorrinal, neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal e neurónios noradrenérgicos do cerúleo. 0 núcleo do prosencéfalo basal de Meynert, a partir do qual surge a principal projeção colinérgica para o córtex, também sofre degeneração severa.
Evidência substancial aponta para um papel significativo dos neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal nas alterações comportamentais observadas em pacientes com Alzheimer. A perda de função colinérgica é uma das alterações iniciais na doença. A extensão do défice colinérgico está correlacionada com o grau de enfraquecimento da memória e a potenciação da função colinérgica por inibidores da acetilcolinasterase produz melhoria modesta, mas significativa, dos sintomas. Em animais, as lesões dos neurónios colinérgicos que inervam o hipocampo e córtex resultam em défices cognitivos e de memória pronunciados que são revertidos por fármacos que potenciam a função colinérgica.
Neurónios de projeção que produzem outros transmissores de monoamina (norepinefrina, serotonina e dopamina) e neurónios corticais que produzem glutamato, ácido gama-aminobutírico (GABA), somatostatina, neuropeptídeo Y, fator libertador de corticotropina, substância P e outros neuromoduladores também são afetados na doença de Alzheimer.
Enquanto que pesquisa inicial apontou para a promessa do FCN como um terapêutico para a doença de Alzheimer e outras neuropatologias, foram observados efeitos secundários insustentáveis em ensaios clínicos humanos utilizando FCN. A administração sistémica de FCN em doses baixas para o tratamento de neuropatia periférica causou dor muscular severa em alguns pacientes, ao passo que pacientes com Alzheimer tratados com infusões intracerebroventriculares de FCN experimentaram dor muscular rostral periférica semelhante à reportada com administração de FCN periférico e perda de peso considerável.
Ensaios clínicos utilizando FNDG para o tratamento da doença de Parkinson também têm sido reportados e mostraram resultados mistos . A doença de Parkinson é um distúrbio no qual a degeneração lenta de neurónios produtores de dopamina, principalmente na via nigro-estriatal, resulta em efeito neurológico. A administração intraventricular de FNDG não conduziu a um benefício clínico determinável e foram reportados múltiplos efeitos secundários adversos. A entrega local de FNDG ao corpo estriado também tem sido utilizada para tratar a doença de Parkinson. Dois ensaios clínicos envolvendo a infusão e difusão contínua de FNDG para o putâmen dorsal reportaram resultados diferentes, potencialmente devido, pelo menos em parte, a diferenças na dosagem e entrega.
De forma importante, foram detetados anticorpos anti-FNDG neutralizadores nos soros de vários pacientes humanos e, num estudo toxicológico, observou-se lesão cerebelar segmentada caracterizada por perda de células de Purkinje e granulosas em macacos que receberam infusão de FNDG.
Estudos clínicos envolvendo infusão de neurotrofina no parênquima cerebral de pacientes com doença neurodegenerativa utilizaram infusão contínua e dependeram da difusão para que o infusado atingisse os tecidos alvo. Existe um número de dificuldades associadas com a entrega baseada na difusão, sendo a mais crítica o baixo volume de distribuição no tecido. Sem meios para monitorizar a distribuição da neurotrofina infundida, é difícil determinar a eficácia terapêutica. Por exemplo, Gill et al. reportaram em Nat. Med. 9:5899-595, 2003 que, quando o fator neurotrófico derivado da linha de células da glia (FNDG) foi utilizado em estudos clínicos como tratamento para a doença de Parkinson, não foi evidente quanto o FNDG difundiria para além da ponta do cateter e reportaram que é possível que mais porções rostrais do putâmen continuassem a degenerar se não fossem atingidas pela difusão. Também verificaram que, à medida que a dose de FNDG era aumentada, se observava uma intensidade elevada do sinal T2 MRI à volta da ponta do cateter, possivelmente devido a edema vasogénico ou acúmulo proteico, o que requereu redução da dosagem e potencialmente comprometeu ainda mais as porções rostrais do putâmen. 0 documento US 2002/0114780 descreve a utilização de um agente facilitador com um agente terapêutico para aumentar o volume de distribuição do agente terapêutico num tecido durante entrega localizada, por exemplo, por EPC. Quando o agente terapêutico é FNDG, o agente facilitador pode ser heparina.
Continua a existir uma necessidade por métodos e composições terapêuticas úteis para o tratamento de distúrbios do SNC, incluindo doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer e doença de Parkinson.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção procede, em parte, da descoberta de que a taxa de eliminação tecidular de fatores de crescimento em tecido do SNC de mamíferos é mais baixa do que se pensava previamente. Em particular, a presente revelação estabelece que fatores de crescimento infundidos para o parênquima cerebral num regime de tratamento típico são detetáveis durante até cerca de 2-6 semanas após entrega.
Ensaios anteriores envolvendo infusão do fator de crescimento para o parênquima cerebral para o tratamento de doença neurodegenerativa empregaram infusão contínua. Contudo, como uma consequência de taxas de eliminação tecidulares notavelmente baixas, a infusão contínua do fator de crescimento é desnecessária para atingir um nível terapeuticamente eficaz do fator de crescimento no tecido cerebral alvo e a acumulação que resulta da administração contínua pode ter efeitos adversos. Por exemplo, a acumulação do fator de crescimento no parênquima cerebral pode conduzir ao acúmulo e vazamento da dose para locais secundários e CSF, que tem o potencial de causar efeitos secundários indesejáveis, bem como respostas imunes e produção acompanhante de anticorpos neutralizadores do fator de crescimento. Tais anticorpos anti-FNDG neutralizadores foram observados nos soros de pacientes que receberam infusão contínua de FNDG para o corpo estriado. Além disso, foi observada toxicidade celular em locais secundários num estudo de toxicidade com um animal com FNDG e foi observado fluxo do infusado do putâmen para locais secundários através do espaço perivascular em primatas. A presente invenção dirige-se a atingir e manter uma dose terapêutica eficaz do fator de crescimento em tecido alvo do SNC enquanto evita o acúmulo da dose que conduz a sobredosagem para reduzir o risco de eventos adversos, incluindo a produção de anticorpos neutralizadores e a iniciação de uma resposta imune. A invenção atinge estes objetivos com regimes de administração do fator de crescimento que contrabalançam taxas de eliminação tecidulares previamente não reconhecidas para proporcionar uma dose terapêutica eficaz prolongada do fator de crescimento em tecido do SNC comprometido. Por oposição, esforços da técnica anterior de regular a dosagem terapêutica de fatores de crescimento empregaram sensores capazes de detetar atividade elétrica indicativa de degeneração ou disfunção neuronal, Elsberry et al. , documento U.S. 6 042 579Ã um parâmetro de feedback desadequado que não consegue dirigir-se a eventos adversos, tais como os processos imuno-mediados indicados acima.
Na invenção, o regime de administração envolve entrega intermitente, em que a entrega contrabalança a eliminação tecidular.
Numa modalidade preferida, a invenção envolve o método de entrega potenciada por convexão (!!EPC'!) , preferencialmente em conjunto com uma cânula de desenho de etapa livre de refluxo para a entrega de fator de crescimento a populações de células comprometidas no SNC. Numa modalidade preferida, a invenção envolve ainda a entrega de um agente de rastreamento com o fator de crescimento e o agente de rastreamento atua como um substituto para monitorizar a distribuição de fator de crescimento infundido. Numa modalidade preferida, a invenção envolve ainda a utilização de um agente facilitador que proporciona mobilidade aumentada do fator de crescimento no parênquima cerebral. Logo, além de dirigir-se aos problemas associados com a acumulação do fator de crescimento, a presente invenção ultrapassa as limitações inerentes à entrega baseada na difusão com cateteres típicos, particularmente baixo volume de distribuição no tecido, acumulação na ponta do cateter, refluxo e vazamento para locais secundários e CSF, e proporciona a monitorização e otimização em tempo real da administração neuroterapêutica.
De acordo com os objetivos indicados anteriormente, num aspeto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende um fator neurotrófico para utilização em métodos para promover a sobrevivência de uma população neuronal responsiva a fator neurotrófico no SNC de mamíferos. Os métodos compreendem entregar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator de crescimento a uma população neuronal responsiva ao fator de crescimento, em que o fator de crescimento é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, pelo qual uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento é atingida no tecido alvo do SNC. Tal regime de administração é desenhado para evitar acumulação substancial do fator de crescimento.
Numa modalidade, o método compreende a etapa de determinar a taxa de eliminação do fator de crescimento que é para ser entregue localmente a uma população neuronal responsiva ao fator de crescimento no SNC. Numa modalidade preferida, a etapa de determinação da taxa de eliminação é executada de forma pré-clínica, preferencialmente num primata. Noutra modalidade preferida, a etapa de determinação da taxa de eliminação é executada por medição de um indicador da taxa de eliminação num sujeito humano.
Numa modalidade preferida, a composição farmacêutica é entregue por entrega potenciada por convexão (EPC).
Numa modalidade preferida, a composição farmacêutica é entregue localmente por EPC.
Numa modalidade preferida, EPC compreende uma taxa de infusão de entre cerca de 0,5 pL/min e cerca de 10 pL/min.
Numa modalidade preferida, EPC compreende uma taxa de infusão superior a cerca de 0,5 pL/rnin, mais preferencialmente superior a cerca de 0,7 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 1 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 1,2 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 1,5 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 1,7 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 2 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 2,2 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 2,5 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 2,7 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 3 pL/min, bem como preferencialmente inferior a cerca de 25 pL/min, mais preferencialmente inferior a 20 pL/min, mais preferencialmente inferior a cerca de 15 pL/min, mais preferencialmente inferior a cerca de 12 pL/min, mais preferencialmente inferior a cerca de 10 pL/min.
Numa modalidade preferida, EPC compreende aumentos incrementais na taxa de fluxo, referidos como "faseamento", durante a entrega. Preferencialmente, o faseamento compreende taxas de infusão de entre cerca de 0,5 pL/min e cerca de 10 pL/min.
Numa modalidade preferida, o faseamento compreende taxas de infusão superiores a cerca de 0,5 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 0,7 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 1 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 1,2 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 1,5 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 1,7 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 2 pL/rnin, mais preferencialmente superiores a cerca de 2,2 pL/rnin, mais preferencialmente superiores a cerca de 2,5 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 2,7 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 3 pL/min, bem como preferencialmente inferiores a cerca de 25 pL/min, mais preferencialmente inferiores a 20 pL/min, mais preferencialmente inferiores a cerca de 15 pL/min, mais preferencialmente inferiores a cerca de 12 pL/min, mais preferencialmente inferiores a cerca de 10 pL/min.
Numa modalidade preferida, a composição farmacêutica é entregue com a utilização de uma cânula de desenho de etapa livre de refluxo compatível com EPC.
Numa modalidade, a cânula de desenho de etapa é compatível com administração crónica. Tais cânulas são preferidas para utilização no tratamento de distúrbios crónicos do SNC, conforme descrito aqui.
Noutra modalidade, a cânula de desenho de etapa é compatível com administração aguda. Tais cânulas são preferidas para utilização no tratamento de distúrbios agudos do SNC, conforme descrito aqui.
Numa modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende um agente de rastreamento que proporciona entrega guiada do fator de crescimento. Preferencialmente, o agente de rastreamento é um agente de contraste de IRM, por vezes referido aqui como um "imã IRM" . Numa modalidade preferida, o agente de rastreamento compreende um lipossoma. Numa modalidade especialmente preferida, o agente de rastreamento compreende um lipossoma contendo quelato de gadolínio.
Numa modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende um agente facilitador que facilita a entrega do fator de crescimento ao tecido alvo. Numa modalidade preferida, o agente facilitador é heparina de baixa massa molecular.
Numa modalidade, a composição farmacêutica compreende um neuroterapêutico de elevada massa molecular que compreende um fator de crescimento e um veículo. Numa modalidade, o veículo é um veículo sintético. Está disponível uma ampla variedade de veículos sintéticos para utilização nos neuroterapêuticos de elevada massa molecular da invenção. Numa modalidade preferida, o veículo é um lipossoma. Noutra modalidade preferida, o veículo é uma partícula metal, tal como uma partícula de ouro ou um polímero. Noutra modalidade, o veículo é uma composição que ocorre naturalmente ou variante da mesma. Exemplos de tais veículos naturais incluem partículas de vírus, incluindo partículas de vírus modificadas (por exemplo, aquelas com um perfil proteico de superfície modificado).
Numa modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende um fator neurotrófico que ê selecionado do grupo que consiste em FCN, FNDC, NT-3, NT-4/5, NT-6 e FNDG CNTF, LIF, IGF-1, b-FGF, neurturina, persefina, artemina, TGFoí, TGFp, IGF-2 , PDGF, EGF, cardiotropina, EGF, IGF, VEGF, Sonic hedgehog (SHH), BMP, FGF20, VIP, PDGF, pleiotrofina (PTN) e HGF também poderia ser utilizado.
Conforme descrito aqui, a composição farmacêutica pode compreender um ácido nucleico que codifica um fator de crescimento. Num caso, o fator de crescimento é selecionado do grupo que consiste em FCN, FNDC, NT-3, NT-4/5, NT-6, FNDG, CNTF, LIF, IGF-1, b-FGF, neurturina, persefina, artemina, TGFoí, TGFB, IGF-2, PDGF, EGF, cardiotropina, EGF, IGF, VEGF, Sonic hedgehog (SHH), BMP, FGF20, VIP, PDGF, pleiotrofina (PTN) e HGF. Num caso, a composição farmacêutica compreende um vetor, cujo vetor compreende tal ácido nucleico que codifica um fator de crescimento sob o controlo de um promotor regulável.
Numa modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende FCN, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, e a população neuronal responsiva ao fator de crescimento compreende neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal.
Numa modalidade preferida, além de FCN, a composição farmacêutica compreende ainda um agente bioativo selecionado do grupo que consiste em agonistas colinérgicos, inibidor da colinesterase, tal como cloridrato de tacrina, neurotrofinas, indutores da síntese ou produção de fator neurotrófico endógeno, inibidores da formação da placa amiloide senil e inibidores da formação de PHF.
Noutra modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende FNDG, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, e a população neuronal responsiva ao fator de crescimento compreende neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal.
Noutra modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende FNDG, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, e a população neuronal responsiva ao fator de crescimento compreende neurónios dopaminérgicos com corpos ou processos celulares no corpo estriado e/ou mesencéfalo.
Noutro caso, a composição farmacêutica compreende VIP, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, e a população neuronal responsiva ao fator de crescimento compreende neurónios dopaminérgicos com corpos ou processos celulares no corpo estriado e/ou mesencéfalo.
Noutro caso, a composição farmacêutica compreende PTN, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, e a população neuronal responsiva ao fator de crescimento compreende neurónios dopaminérgicos com corpos ou processos celulares no corpo estriado e/ou mesencéfalo.
Será apreciado que nalgumas modalidades, os fatores de crescimento podem ser entregues a terminais neuronais a uma distância dos corpos celulares.
Noutro caso, a composição farmacêutica compreende BMP, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, e a população neuronal responsiva ao fator de crescimento compreende células de um lócus do SNC impactado por derrame cerebral.
Na invenção, o método compreende EPC intermitente da composição farmacêutica, em que os intervalos são pelo menos cerca de uma semana.
Numa modalidade preferida, a administração do fator de crescimento compreende um intervalo de desde cerca de 7 dias a cerca de 45 dias, mais preferencialmente desde cerca de 14 dias a cerca de 45 dias, mais preferencialmente desde cerca de 17 dias a cerca de 35 dias, mais preferencialmente desde cerca de 2 0 dias a cerca de 3 5 dias após entrega do fator de crescimento, cujo intervalo é seguido de outra entrega do fator de crescimento. Numa modalidade preferida, a administração do fator de crescimento compreende dois ou mais tais intervalos.
Noutro caso, a administração do fator de crescimento compreende intervalos inferiores a 7 dias, preferencialmente entre cerca de 2 dias e cerca de 6 dias ou superiores a 45 dias.
Numa modalidade preferida, a duração de dois ou mais intervalos é diferente num regime de administração intermitente que compreende três ou mais etapas de entrega. Numa modalidade preferida, a duração de um intervalo entre etapas de entrega no início de um regime de administração intermitente é substancialmente mais curta do que um intervalo entre etapas de entrega subsequentes.
Numa modalidade, a dose do fator de crescimento entregue difere entre etapas de entrega. Numa modalidade preferida, a dose do fator de crescimento entregue numa etapa de entrega inicial é superior à dose do fator de crescimento entregue numa etapa de entrega posterior num regime de administração intermitente que compreende duas ou mais etapas de entrega.
Numa modalidade preferida, a duração da EPC é desde cerca de 30 minutos a cerca de 12 horas, mais preferencialmente desde cerca de 30 minutos a cerca de 6 horas.
Noutra modalidade, a duração de EPC é inferior a cerca de 30 minutos ou superior a cerca de 12 horas.
Numa modalidade preferida, a duração da entrega é informada pela utilização de um agente de rastreamento e monitorização da distribuição do infusado.
Num aspeto, a composição farmacêutica para utilização da invenção reduz a morte de neurónios responsivos ao fator neurotrófico do SNC de mamíferos. A utilização compreende entregar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator neurotrófico a uma população neuronal do SNC responsiva ao fator de crescimento que está em risco de sofrer morte celular na ausência de intervenção, em que o fator neurotrófico é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator neurotrófico, pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator neurotrófico no tecido alvo do SNC.
Também são descritos métodos para modular a formação de sinapses por neurónios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos. Os métodos compreendem entregar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator de crescimento a uma população neuronal do SNC responsiva ao fator de crescimento, em que o fator de crescimento é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento no tecido alvo do SNC, e em que o fator de crescimento modula a formação de sinapses pela população neuronal responsiva ao fator de crescimento.
Também são descritos métodos para modular o crescimento de neurites por neurónios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos . Os métodos compreendem entregar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator de crescimento a uma população neuronal do SNC responsiva ao fator de crescimento, em que o fator de crescimento é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento no tecido alvo do SNC, e em que o fator de crescimento modula o crescimento de neurites pela população neuronal responsiva ao fator de crescimento.
Também são descritos métodos para aumentar a rotatividade de neurotransmissores em neurónios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos. Os métodos compreendem entregar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator de crescimento a uma população neuronal do SNC responsiva ao fator de crescimento, em que o fator de crescimento é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento no tecido alvo do SNC, e em que o fator de crescimento aumenta a rotatividade de neurotransmissores na população neuronal responsiva ao fator de crescimento.
Também são descritos métodos para modular a diferenciação fenotípica de neurónios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos. Os métodos compreendem entregar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator de crescimento a uma população neuronal do SNC responsiva ao fator de crescimento, em que o fator de crescimento é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento no tecido alvo do SNC, e em que o fator de crescimento modula a diferenciação fenotípica da população neuronal responsiva ao fator de crescimento.
Na invenção, os métodos são para tratar um paciente com um distúrbio do SNC caracterizado por morte e/ou disfunção neuronal. Numa modalidade, o distúrbio do SNC é um distúrbio crónico. Noutra modalidade, o distúrbio do SNC é um distúrbio agudo. Numa modalidade preferida, o distúrbio do SNC é selecionado do grupo que consiste em doença de Huntington, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Parkinson, derrame cerebral, trauma na cabeça, lesão da medula espinhal, esclerose múltipla, demência com corpos de Lewy, degeneração retinal, epilepsia, distúrbios psiquiátricos, distúrbios do equilíbrio hormonal e degeneração coclear. Estão, ainda, contemplados métodos para reduzir inflamação que está associada com um distúrbio do SNC caracterizado por morte e/ou disfunção neuronal.
Os métodos compreendem entregar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator neurotrófico a uma população neuronal do SNC responsive ao fator neurotrófico no paciente, em que tal administração do fator neurotrófico é terapeuticamente eficaz no tratamento do paciente. 0 fator neurotrófico é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator neurotrófico, pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator neurotrófico no tecido alvo do SNC.
Em modalidades em que um distúrbio agudo do SNC é tratado, existe preferencialmente um ponto final a partir do qual a administração é descontinuada.
Num aspeto, os métodos são para tratar um paciente diagnosticado como tendo um distúrbio do SNC nas suas fases iniciais, preferencialmente antes de apresentação clínica. Os métodos compreendem entregar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator neurotrófico a uma população neuronal do SNC responsiva ao fator neurotrófico no paciente, em que tal administração do fator neurotrófico previne, retarda ou reduz a severidade das manifestações clínicas associadas com o distúrbio do SNC. 0 fator neurotrófico é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator neurotrófico, pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator neurotrófico no tecido alvo do SNC.
Num aspeto, os métodos são métodos profiláticos para tratar um paciente em risco de um distúrbio do SNC. Os métodos compreendem entregar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator neurotrófico a uma população neuronal do SNC responsiva ao fator neurotrófico no paciente, em que tal administração do fator neurotrófico previne ou retarda o despoletar de um distúrbio do SNC ou reduz a severidade do distúrbio do SNC assim que este se manifesta. 0 fator neurotrófico é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator neurotrófico, pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator neurotrófico no tecido alvo do SNC. Métodos de tratamento, incluindo os métodos profiláticos aqui descritos, envolvem preferencialmente diagnóstico pré-operativo.
Numa modalidade preferida, o diagnóstico pré-operativo envolve rastreamento genético. Noutra modalidade preferida, o diagnóstico pré-operativo envolve neuroimagiologia. Numa modalidade, a neuroimagiologia realizada compreende neuroimagiologia funcional. Noutra modalidade, a neuroimagiologia realizada envolve imagiologia não funcional. Preferencialmente, a neuroimagiologia executada envolve TEP, IRM e/ou TC.
Os métodos de tratamento aqui descritos também compreendem preferencialmente neuroimagiologia, preferencialmente IRM, para localização do alvo e/ou colocação guiada da cânula. Preferencialmente, é utilizado um suporte estereotático em conjunto com neuroimagiologia para proporcionar colocação guiada da cânula em ou próximo de uma população neuronal alvo.
Os métodos de tratamento aqui descritos compreendem preferencialmente neuroimagiologia, preferencialmente IRM em conjunto com um imã de IRM administrado para monitorizar a distribuição do infusado. São descritas aqui composições farmacêuticas entregáveis localmente úteis para tratar um distúrbio do SNC caracterizado pela morte e/ou disfunção de uma população neuronal do SNC.
Numa modalidade preferida, a composição farmacêutica é entregue por EPC.
Num caso preferido, a composição farmacêutica compreende um agente de rastreamento.
Num caso preferido, o agente de rastreamento é um imã de IRM.
Num caso preferido, o agente de rastreamento compreende um lipossoma. Num caso, o agente de rastreamento compreende um lipossoma contendo um imã de IRM, preferencialmente quelato de gadolínio. Noutro caso, o agente de rastreamento consiste essencialmente de um lipossoma contendo um imã de IRM, preferencialmente quelato de gadolínio.
Num caso preferido, a composição farmacêutica compreende um agente facilitador.
Num caso, o agente facilitador é heparina de baixa massa molecular.
Noutro caso, o fator de crescimento é selecionado do grupo que consiste em FCN, FNDC, NT-3, NT-4,/5, NT-6, FNDG, CNTF, LIF, IGF-1, b-FGF, neurturina, persefina, artemina, TGFa, TGFb, IGF-2, PDGF, EGF, cardiotropina, EGF, IGF, VEGF, Sonic hedgehog (SHE), BMP, FGF20, VIP, PDGF, pleiotrofina (PTN) e HGF.
Também são descritos métodos de produzir uma composição farmacêutica.
Também é descrito um dispositivo de entrega que compreende uma composição farmacêutica conforme descrita aqui.
Também é descrito um cateter ou cânula que compreende uma composição farmacêutica conforme descrita aqui.
Também é descrito um dispositivo de entrega que compreende uma bomba uma bomba de efetuar a entrega de uma composição farmacêutica por EPC. Num caso, o dispositivo de entrega compreende uma bomba uma bomba de efetuar entrega intermitente de uma composição farmacêutica por EPC. Noutro caso, o dispositivo compreende ainda uma composição farmacêutica. Num caso adicional, o dispositivo compreende ainda uma cânula de desenho de etapa livre de refluxo, compatível com EPC, cuja cânula é compatível com administração crónica ou aguda.
Também são descritos métodos de utilizar um fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, para produzir um medicamento útil para o tratamento de um paciente com um distúrbio do SNC caracterizado por morte e/ou disfunção neuronal, em que o medicamento é entregue ao SNC do paciente com um distúrbio do SNC a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, em que o fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, está presente numa quantidade suficiente para proporcionar uma dose terapeuticamente eficaz quando o medicamento é entregue ao SNC do paciente sem produzir acumulação substancial do fator de crescimento no SNC do paciente. Num caso preferido, o medicamento é entregue por EPC. Num caso preferido, o medicamento pode ser entregue de forma intermitente.
Também são descritos métodos de utilizar um fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, para produzir um medicamento útil para reduzir a morte de neurõnios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos, em que o medicamento é entregue ao SNC do paciente com um distúrbio do SNC a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, em que o fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, está presente numa quantidade suficiente para proporcionar uma dose terapeuticamente eficaz quando o medicamento é entregue ao SNC do paciente sem produzir acumulação substancial do fator de crescimento no SNC do paciente. Num caso preferido, o medicamento é entregue por EPC. Num caso preferido, o medicamento pode ser entregue de forma intermitente.
Também são descritos métodos de utilizar um fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, para produzir um medicamento útil para modular crescimento de neurites por neurónios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos, em que o medicamento é entregue ao SNC do paciente com um distúrbio do SNC a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, em que o fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, está presente numa quantidade suficiente para proporcionar uma dose terapeuticamente eficaz quando o medicamento é entregue ao SNC do paciente sem produzir acumulação substancial do fator de crescimento no SNC do paciente. Num caso preferido, o medicamento é entregue por EPC. Num caso preferido, o medicamento pode ser entregue de forma intermitente .
Também são descritos métodos de utilizar um fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, para produzir um medicamento útil para aumentar a rotatividade de neurotransmissores em neurónios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos, em que o medicamento é entregue ao SNC do paciente com um distúrbio do SNC a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, em que o fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, está presente numa quantidade suficiente para proporcionar uma dose terapeuticamente eficaz quando o medicamento é entregue ao SNC do paciente sem produzir acumulação substancial do fator de crescimento no SNC do paciente. Num caso preferido, o medicamento é entregue por EPC. Num caso preferido, o medicamento pode ser entregue de forma intermitente.
Também são descritos métodos de utilizar um fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, para produzir um medicamento útil para modular diferenciação fenotípica de neurónios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos, em que o medicamento é entregue ao SNC do paciente com um distúrbio do SNC a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, em que o fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, está presente numa quantidade suficiente para proporcionar uma dose terapeuticamente eficaz quando o medicamento é entregue ao SNC do paciente sem produzir acumulação substancial do fator de crescimento no SNC do paciente. Num caso preferido, o medicamento é entregue por EPC. Num caso preferido, o medicamento pode ser entregue de forma intermitente.
Também são descritos métodos de utilizar um fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, para produzir um medicamento útil para tratar um paciente diagnosticado com um distúrbio do SNC nas suas fases iniciais, em que o medicamento é entregue ao SNC do paciente com um distúrbio do SNC a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, em que o fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, está presente numa quantidade suficiente para proporcionar uma dose terapeuticamente eficaz quando o medicamento é entregue ao SNC do paciente sem produzir acumulação substancial do fator de crescimento no SNC do paciente. Num caso preferido, o medicamento é entregue por EPC. Num caso preferido, o medicamento pode ser entregue de forma intermitente.
Também são descritos métodos de utilizar um fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, para produzir um medicamento útil para tratamento profilático de um paciente em risco de um distúrbio do SNC, em que o medicamento é entregue ao SNC do paciente com um distúrbio do SNC a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, em que o fator de crescimento, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, está presente numa quantidade suficiente para proporcionar uma dose terapeuticamente eficaz quando o medicamento é entregue ao SNC do paciente sem produzir acumulação substancial do fator de crescimento no SNC do paciente. Num caso preferido, o medicamento é entregue por EPC. Num caso preferido, o medicamento pode ser entregue de forma intermitente.
Num caso, um medicamento compreende ainda um agente de rastreamento.
Num caso, um medicamento compreende ainda um agente f ac i1i tador.
Num caso, métodos de produzir um medicamento envolvem a utilização de um neuroterapêutico de elevada massa molecular da invenção que compreende (i) um veículo e (ii) um fator de crescimento ou ácido nucleico que codifica o mesmo.
Também são descritos kits para o tratamento de distúrbios do SNC, cujos kits compreendem uma ou mais composições farmacêuticas, conforme descrito aqui.
Também são descritos kits úteis para reduzir a morte de neurónios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos, cujos kits compreendem uma ou mais composições farmacêuticas, conforme descrito aqui.
Também são descritos kits úteis para modular o crescimento de neurites por neurónios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos, cujos kits compreendem uma ou mais composições farmacêuticas, conforme descrito aqui.
Também são descritos kits úteis para aumentar a rotatividade de neurotransmissores em neurónios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos, cujos kits compreendem uma ou mais composições farmacêuticas, conforme descrito aqui.
Também são descritos kits úteis para modular a diferenciação fenotípica de neurónios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos, cujos kits compreendem uma ou mais composições farmacêuticas da invenção.
Também são descritos kits úteis para tratar um paciente diagnosticado com um distúrbio do SNC nas suas fases iniciais, cujos kits compreendem uma ou mais composições farmacêuticas da invenção.
Também são descritos kits úteis para tratamento profilático de um paciente em risco de um distúrbio do SNC, cujos kits compreendem uma ou mais composições farmacêuticas da invenção.
Também é descrito um kit que compreende ainda um dispositivo de entrega útil para EPC, preferencialmente uma cânula, e mais preferencialmente uma cânula de desenho de etapa livre de refluxo. Num caso, um kit compreende ainda uma bomba útil para EPC.
Também é descrito um método de tratar um mamífero com um distúrbio do sistema nervoso central (SNC) . Num caso, o método envolve administrar a um mamífero com um distúrbio do SNC, uma composição farmacêutica, tal como um fator de crescimento, correlacionando a entrega de dita composição farmacêutica com a eliminação correspondente do tecido de uma composição farmacêutica. Num caso, a composição farmacêutica é administrada utilizando entrega potenciada por convexão (EPC) . Num caso, a composição farmacêutica inclui um agente de rastreamento. Noutro caso, a composição farmacêutica compreende ainda um agente facilitador. Num caso, a composição farmacêutica é entregue de forma intermitente. Num modo, a entrega intermitente equilibra o processo de eliminação tecidular.
Outro aspeto da descrição é um método para promover a sobrevivência de uma população neuronal responsiva ao fator de crescimento no SNC de mamífero. Num caso, o método envolve entregar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator de crescimento à população neuronal responsiva ao fator de crescimento em que o fator de crescimento é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento, de tal maneira que é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento no tecido alvo do SNC. Num modo, a entrega não produz acumulação substancial do fator de crescimento. Num caso, o método envolve determinar a taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento que é para ser entregue localmente a uma população neuronal responsiva ao fator de crescimento no SNC. Num caso, determinar a taxa de eliminação tecidular é executada de forma pré-clínica num primata. Noutra modalidade, determinar a taxa de eliminação tecidular é executada medindo um indiciador da taxa de eliminação num sujeito humano.
Outro aspeto da descrição é um método para reduzir a morte de neurõnios responsivos ao fator de crescimento do SNC de mamíferos. Num caso, o método envolve entregar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator de crescimento a uma população neuronal do SNC responsiva ao fator de crescimento que está em risco de sofrer morte celular na ausência de intervenção, em que o fator de crescimento é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento e pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento no tecido alvo do SNC.
Outro aspeto da descrição é um método de tratar um distúrbio do SNC. Num caso, o método envolve administrar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator de crescimento a uma população neuronal do SNC responsiva ao fator de crescimento no paciente, em que tal administração do fator de crescimento é terapeuticamente eficaz no tratamento do paciente. Num caso, o fator de crescimento é entregue a uma taxa que opoe-se substancialmente a taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento no tecido alvo do SNC. Num caso, o distúrbio do SNC compreende um distúrbio agudo do SNC e a administração é descontinuada num ponto final.
Outro aspeto da descrição é um método para tratar um paciente diagnosticado com um distúrbio do SNC nas suas fases iniciais . Num caso, o método envolve administrar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator de crescimento a uma população neuronal do SNC responsiva ao fator de crescimento no paciente em que tal administração do fator de crescimento previne, retarda ou reduz a severidade de manifestações clínicas associadas com o distúrbio do SNC em estádios posteriores na ausência do fator de crescimento administrado. Num caso, o fator de crescimento é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento no tecido alvo do SNC.
Outro aspeto aqui descrito é um método profilático para tratar um paciente em risco de um distúrbio do SNC. Num caso, o método envolve administrar localmente uma composição farmacêutica que compreende um fator de crescimento a uma população neuronal do SNC responsiva ao fator de crescimento no paciente em que tal administração do fator de crescimento previne ou retarda o despoletar de um distúrbio do SNC ou reduz a severidade do Distúrbio do SNC assim que este se manifesta. Num caso, o fator de crescimento é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento pelo qual é atingida uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento no tecido alvo do SNC.
Aspetos adicionais da invenção serão realçados nas porções seguintes da especificação, em que a descrição detalhada é para os fins de revelar completamente as modalidades preferidas da invenção sem colocar limitações sobre as mesmas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção será melhor entendida por referência aos desenhos seguintes que são para fins ilustrativos apenas: A Figura 1 e a Figura 2 são imagens de cérebro de ratazana. LMW Hep (1 micrograma/microlitro) com FNDG é infundido em cérebro de ratazana, (hemisfério esquerdo infundido com FNDG + LMW Hep o hemisfério direito recebeu apenas FNDG com PBS como um controlo). A Figura 3 representa um gráfico que ilustra a expressão de FNDG em diferentes pontos temporais após transdução com AAV2-FNDG. AAV2-FNDG foi infundido para o corpo estriado a doses diferentes e as ratazanas foram eutanasiadas em diferentes pontos temporais para analisar a correlação com o nível de expressão de FNDG. Os resultados mostram a acumulação gradual de FNDG ao longo do tempo. A Figura 4 representa uma imagem de um cérebro de macaco tratado de acordo com um método da invenção. FNDG (30 pg/local) foi administrado por EPC num lado do cérebro de macaco normal. Um local foi atingido no caudado e 2 locais no putâmen. 0 macaco foi eutanasiado 3 semanas mais tarde. Presença significativa de proteína FNDG residual. Coloração TH revelou forte regulação para cima de fibras DA apenas no local tratado com FNDG. A Figura 5 representa um gráfico que ilustra efeitos da administração de 5 pg de neuturina (NTN) em ratazanas normais aos 4 dias. Foi observado um aumento significativo na rotatividade de DA após administração única. Também foi observada uma sinergia aparente entre NTN e heparina. A Figura 6 representa um gráfico que ilustra a eliminação tecidular de FNDG após administração única. A Figura 7 representa um gráfico que ilustra regulação dos níveis de DA após uma administração única. A Figura 8 ilustra AAV2-FNDG infundido (EPC) para o corpo estriado de ratazana a doses diferentes. A Figura 9 representa um gráfico que ilustra a expressão de FNDG no cérebro de ratazana em diferentes pontos temporais após transdução com AAV2-FNDG. Os valores médios em cada ponto temporal foram calculados a partir de 3 hemisférios. A Figura 10 ilustra parâmetros experimentais para determinar a eliminação de NF do cérebro de ratazana. A Figura 11 representa um gráfico que ilustra a eliminação de proteína FNDG no cérebro de ratazana após a sua infusão semanal por EPC. Os valores médios em cada semana foram calculados a partir de 3 ratazanas (6 hemisférios). A Figura 12 representa um gráfico que ilustra a eliminação de FNDG após a sua infusão intraestriatal para o cérebro de ratazana.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção dirige-se a métodos e composições para a entrega local de fatores de crescimento a populações neuronais responsivas ao fator de crescimento do SNC de mamíferos. A invenção procede, em parte, da descoberta de que a eliminação tecidular de fatores de crescimento no SNC é lenta em relação às taxas às quais fatores de crescimento exógenos foram tipicamente administrados previamente. A infusão de um fator de crescimento a uma taxa superior à eliminação tecidular resulta numa acumulação desnecessária e potencialmente tóxica de fator de crescimento. Na presente invenção, é feita a entrega do fator de crescimento a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular para evitar acumulação tóxica do fator de crescimento e para atingir níveis no tecido alvo que são mantidos dentro de uma janela terapeuticamente eficaz ao longo do tempo. Na invenção, é feita a entrega intermitente do fator de crescimento. 0 fenómeno de eliminação tecidular lenta não se limita a um fator de crescimento ou região do cérebro particular. Consequentemente, o benefício associado com os métodos de administração presentes não se limita a um fator de crescimento particular, a uma população neuronal no SNC particular ou a uma indicação particular. Em princípio, dada a capacidade de entregar uma ampla variedade de fatores de crescimento a uma ampla variedade de populações neuronais no SNC, qualquer indicação caracterizada pela morte e/ou disfunção de uma população neuronal que é responsiva ao fator de crescimento, ou que pode ser funcionalmente compensada por uma população neuronal responsiva ao fator de crescimento, pode ser tratada. Administração do fator de crescimento
Conforme utilizado aqui com respeito à invenção, "fator de crescimento" significa um fator neurotrófico.
Um número de fatores de crescimento foram entregues por vários meios na tentativa de tratar uma variedade de doenças neurodegenerativas. Para revisão, ver, por exemplo, Dawbarn et al. , Neuropathol and App. Neurobiol, 29:211-230, 2003. A presente invenção proporciona meios inovadores de entregar fatores de crescimento a populações neuronais responsivas ao fator de crescimento nestas doenças com eficácia melhorada. Em particular, a invenção proporciona métodos e composições para entregar fatores de crescimento a populações neuronais alvo a uma taxa que contrabalança as taxas de eliminação tecidulares para atingir uma dose terapêutica eficaz prolongada sem efeitos adversos indesejados.
Nos métodos da invenção, o fator de crescimento é entregue a uma taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento. Por "taxa que opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular" quer-se dizer uma taxa de entrega que é aproximadamente contra a taxa de eliminação tecidular. Taxa refere-se à quantidade do fator de crescimento ao longo do tempo. A taxa de entrega não precisa de contrapor exatamente a taxa de eliminação tecidular e a quantidade do fator de crescimento no tecido alvo não precisa de permanecer constante. Por exemplo, na invenção, a administração envolve entrega intermitente do fator de crescimento. Será apreciado que tais protocolos de administração resultarão em quantidades variadas do fator de crescimento no tecido alvo, com um máximo aproximadamente no início de um intervalo e um mínimo aproximadamente no final de um intervalo. Aquilo que se requere nos presentes métodos é uma taxa de entrega que proporciona a manutenção de uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento (dentro de uma janela terapêutica) no tecido alvo ao longo do tempo. Ao considerar a taxa de eliminação determinada empiricamente de um fator de crescimento particular no tecido alvo, alguém habilitado na técnica pode determinar prontamente uma taxa de entrega apropriada sem experimentação indevida. A taxa de entrega do fator de crescimento nos presentes métodos é informada pela taxa de eliminação tecidular do fator de crescimento e opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular. A taxa desejada de entrega do fator de crescimento pode ser atingida com entrega contínua ou intermitente e concentrações apropriadas do fator de crescimento. EPC é o meio de entrega na presente invenção, com entrega intermitente de uma composição farmacêutica com uma concentração apropriada do fator de crescimento. Contudo, em casos, pode ser feita a entrega a uma taxa de infusão inferior a 0,5 μΐ/min e um regime de administração que compreende entrega intermitente com intervalos muito curtos (dias, horas, minutos) e mesmo a entrega contínua pode ser feita com concentrações apropriadas do fator de crescimento, de tal maneira que a taxa de entrega opõe-se substancialmente à taxa de eliminação tecidular.
Por "acumulação substancial" ou "acumulação prejudicial" do fator de crescimento quer-se dizer que se atingiu uma quantidade do fator de crescimento que é superior à quantidade terapeuticamente eficaz mínima do fator de crescimento e capaz de produzir efeitos deletérios indesejáveis, o que está tipicamente bem acima da quantidade terapêutica eficaz máxima do fator de crescimento (isto é, superior à quantidade teto eficaz do fator de crescimento) durante um período de tempo. Por "entrega intermitente" quer-se dizer entrega descontínua. De acordo com a invenção, o fator de crescimento particular é administrado à medida que o seu nível no tecido alvo diminui para manter uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator no tecido alvo. 0 fator de crescimento é infundido para a população alvo durante um período de tempo, tipicamente desde cerca de 30 minutos a cerca de 12 horas, mais preferencialmente desde cerca de 3 0 minutos a cerca de 6 horas, momento em que a entrega cessa. A duração da entrega será informada por um agente de rastreamento em modalidades preferidas. Durante a entrega, o nível do fator de crescimento no tecido alvo aumenta. Preferencialmente, a cessação da entrega ocorre quando a dose terapêutica eficaz máxima (teto de dosagem terapêutica) é atingida no tecido alvo. Apesar de menos preferida, a cessação da entrega pode ocorrer quando a dose terapêutica eficaz máxima foi ultrapassada. Preferencialmente, a cessação da entrega ocorre quando o infusado é distribuído por todo o tecido alvo substancial, conforme pode ser monitorizado com um agente de rastreamento, conforme revelado aqui. Preferencialmente, a cessação da entrega ocorre enquanto o infusado permanece substancialmente confinado ao tecido alvo. Após a cessação, mecanismos de eliminação tecidular atuam para diminuírem lentamente o nível do fator de crescimento no tecido alvo. A entrega é repetida quando o fator de crescimento no tecido alvo diminui, preferencialmente enquanto uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento permanece no tecido alvo, mais preferencialmente quando o fator de crescimento está acima ou ligeiramente acima da quantidade terapeuticamente eficaz mínima do fator de crescimento. Apesar de menos preferido, a entrega pode ser repetida quando o fator de crescimento está abaixo da quantidade terapeuticamente eficaz mínima do fator de crescimento. Numa modalidade, uma dose terapeuticamente eficaz não é mantida continuamente sem interrupção.
Numa modalidade preferida, a administração do fator de crescimento compreende um intervalo de desde cerca de 7 dias a cerca de 45 dias, mais preferencialmente desde cerca de 14 dias a cerca de 45 dias, mais preferencialmente desde cerca de 17 dias a cerca de 35 dias, mais preferencialmente desde cerca de 20 dias a cerca de 35 dias após entrega do fator de crescimento, cujo intervalo é seguido de outra entrega do fator de crescimento. Numa modalidade preferida, a administração do fator de crescimento compreende dois ou mais tais intervalos.
Noutro caso, a administração do fator de crescimento compreende intervalos inferiores a cerca de 7 dias ou superiores a cerca de 45 dias.
Nos métodos aqui descritos, os fatores de crescimento são entregues localmente a uma população alvo de neurónios responsivos ao fator de crescimento no SNC de mamíferos pelo método de EPC. Por "EPC" quer-se dizer infusão a uma taxa superior a 0,5 μΐ/min. Numa modalidade preferida, o fator de crescimento é entregue por EPC através de um cateter ou cânula adequados, preferencialmente uma cânula de desenho de etapa livre de refluxo. Numa modalidade preferida, o método de EPC é executado com uma cânula de desenho de etapa livre de refluxo compatível com EPC. Ver Krauze et al. , É. Neurosurg., 103:923-929, 2005. Ver também, Publicação do Pedido de Patente U.S. N.° 2007/0088295 Al e 2006/0135945 Al. 0 método envolve posicionar a ponta da cânula pelo menos em proximidade estreita com o tecido alvo. Depois da cânula estar posicionada, é ligada a uma bomba que entrega o fator de crescimento através da ponta da cânula ao tecido alvo. É mantido um gradiente de pressão da ponta da cânula durante a infusão.
Por "próximo a" uma população alvo quer-se dizer dentro de uma distância efetiva da população alvo. Em particular, em relação ao posicionamento de uma cânula em relação ao tecido alvo, proximidade refere-se a uma distância de tal modo que o infusado atingirá o tecido alvo. Como o meio altamente preferido de entregar uma composição farmacêutica é EPC, a proximidade na maioria das ocasiões aqui refere-se a estar dentro de uma distância do tecido alvo que é atingida pela EPC da composição farmacêutica.
Numa modalidade preferida, uma cânula de desenho de etapa livre de refluxo é unida com uma bomba que retira o fator de crescimento de um recipiente e produz pressão suficiente para fazer com que o fator de crescimento flua através do cateter para o tecido alvo a taxas controladas. Pode ser utilizada qualquer taxa de fluxo adequada de maneira que a pressão intracranial é mantida a níveis adequados para que não lesione o tecido cerebral. Pode ser utilizada mais de uma única cânula. A penetração do fator de crescimento no tecido alvo é grandemente facilitada por infusão de pressão positiva durante um período de horas. A penetração é aumentada ainda mais pela utilização de um agente facilitador, tal como heparina de baixa massa molecular. Além disso, a inclusão de um agente de rastreamento, preferencialmente um imã de IRM, proporciona a monitorização em tempo real de penetração no tecido pelo infusado e informa a cessação da entrega.
Qualquer quantidade adequada do fator de crescimento pode ser administrada desta forma. Quantidades adequadas são quantidades que são terapeuticamente eficazes e, portanto, capazes de provocar uma resposta dos neurónios responsivos ao fator de crescimento no tecido alvo, sem causar uma sobreabundância de efeitos secundários indesejados.
Tipicamente, a quantidade de fator de crescimento será entre cerca de 1 pg e cerca de 1000 pg, mais preferencialmente entre cerca de 1 pg e cerca de 500 pg, mais preferencialmente entre cerca de 1 pg e cerca de 250 pg, mais preferencialmente entre cerca de 1 pg e cerca de 100 pg. Numa modalidade especialmente preferida, a quantidade de fator de crescimento está entre cerca de 10 pg e cerca de 100 pg. Numa modalidade preferida, EPC compreende uma taxa de infusão de entre cerca de 0,5 pL/min e cerca de 10 pL/min.
Numa modalidade preferida, EPC compreende uma taxa de infusão superior a cerca de 0,5 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 0,7 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 1 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 1,2 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 1,5 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 1,7 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 2 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 2,2 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 2,5 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 2,7 pL/min, mais preferencialmente superior a cerca de 3 pL/min, bem como preferencialmente inferior a cerca de 25 pL/min, mais preferencialmente inferior a 20 pL/min, mais preferencialmente inferior a cerca de 15 pL/min, mais preferencialmente inferior a cerca de 12 pL/min, mais preferencialmente inferior a cerca de 10 pL/min,
Numa modalidade preferida, EPC compreende aumentos incrementais na taxa de fluxo, referidos como "faseamento", durante a entrega. Preferencialmente, o faseamento compreende taxas de infusão de entre cerca de 0,5 pL/min e cerca de 10 pL/min.
Numa modalidade preferida, o faseamento compreende taxas de infusão superiores a cerca de 0,5 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 0,7 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 1 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 1,2 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 1,5 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 1,7 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 2 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 2,2 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 2,5 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 2,7 pL/min, mais preferencialmente superiores a cerca de 3 pL/min, bem como preferencialmente inferiores a cerca de 25 pL/min, mais preferencialmente inferiores a 20 pL/min, mais preferencialmente inferiores a cerca de 15 pL/min, mais preferencialmente inferiores a cerca de 12 pL/min, mais preferencialmente inferiores a cerca de 10 pL/min.
Para mais ensinamentos sobre o método de EPC, ver, por exemplo, Saito et al. , Exp. Neurol., 196:3891-389, 2 00 5Â Krauze et al., Exp . Neurol., 196:104-111, 2005Â Krauze et al., Brain Res. Brain Res. Protocol., 16:20-26, 2005Â Publicação do Pedido de Patente U.S. N.° 2006/0073101Â Patente U.S. N.° 5 720 720.
Os presentes métodos de tratamento preferencialmente envolvem uma ou mais determinações diagnósticas pré-operativas para a presença ou risco de um distúrbio do SNC. "Distúrbio do SNC", conforme utilizado aqui, refere-se a distúrbios do SNC de mamíferos caracterizados pela morte e/ou disfunção de uma ou mais populações neuronais. Distúrbios do SNC incluem distúrbios crónicos, tais como doenças neurodegenerativas, por exemplo, doença de Alzheimer, bem como distúrbios agudos, tais como derrame cerebral. São conhecidos muitos biomarcadores associados a vários distúrbios do SNC. Por exemplo, ver Henley et al., Curr. Opin. Neurol., 18:698-705, 2005. A determinação diagnóstica executada inclui preferencialmente neuroimagiologia. Por exemplo, ver Mathis et al., Arch. Neurol., 62:, 196-200, 2005. Numa modalidade preferida, a determinação diagnóstica envolve um teste genético.
Os métodos envolvem também preferencialmente imagiologia pré-operativa para definirem estereotaticamente a localização da população neuronal alvo.
Numa modalidade altamente preferida, os métodos compreendem adicionalmente imagiologia durante a administração para monitorizar o posicionamento da cânula. Numa modalidade, o método compreende a utilização de um sistema de neuronavegação, por exemplo, ver Publicação do Pedido de Patente U.S. N.° 2002/0095081. Numa modalidade preferida, os métodos compreendem ainda neuroimagiologia para monitorizar a distribuição do infusado.
Num aspeto, a invenção proporciona métodos para o tratamento de um distúrbio do SNC.
Numa modalidade preferida, a invenção proporciona métodos para o tratamento da doença de Alzheimer. Os métodos compreendem administrar FCN, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, localmente, e preferencialmente de forma intermitente, a neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal.
Numa modalidade preferida, a invenção proporciona métodos para o tratamento da doença de Alzheimer. Os métodos compreendem administrar FNDG, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, localmente, e preferencialmente de forma intermitente, a neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal.
Numa modalidade preferida, a invenção proporciona métodos para o tratamento da doença de Parkinson. Os métodos compreendem administrar FNDG, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, localmente, e preferencialmente de forma intermitente, ao corpo estriado e/ou mesencéfalo.
Numa modalidade preferida, a invenção proporciona métodos para o tratamento da doença de Parkinson. Os métodos compreendem administrar VIP, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, localmente, e preferencialmente de forma intermitente, ao corpo estriado e/ou mesencéfalo.
Numa modalidade preferida, a invenção proporciona métodos para o tratamento da doença de Parkinson. Os métodos compreendem administrar PTN, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, localmente, e preferencialmente de forma intermitente, ao corpo estriado e/ou mesencéfalo.
Numa modalidade preferida, a invenção proporciona métodos para o tratamento de derrame cerebral. Os métodos compreendem administrar BMP, ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, localmente, e preferencialmente de forma intermitente, ao lócus do SNC impactado pelo derrame cerebral. 0 Quadro 1 proporciona uma lista de fatores de crescimento que podem ser utilizados na presente invenção para produzir efeitos desejados numa variedade de populações neuronais alvo. Esta descrição é exemplar e não se pretende que seja limitante.
Mais geralmente, o Quadro 2 proporciona uma lista de fatores de crescimento que são geralmente capazes de produzir efeitos benéficos, tais como sobrevivência, crescimento de neurites e manutenção fenotípica, nos tipos particulares de neurónios listados. Esta descrição é exemplar e não se pretende que seja limitante. A dose do fator de crescimento entregue é determinada pelo fator de crescimento particular, pela densidade do tecido alvo, do volume do tecido alvo e pela taxa de eliminação tecidular. Tipicamente, a quantidade de fator de crescimento estará entre cerca de 1 pg e cerca de 1000 pg, mais preferencialmente entre cerca de 1 pg e cerca de 500 pg, mais preferencialmente entre cerca de 1 pg e cerca de 250 pg, mais preferencialmente entre cerca de 1 pg e cerca de 100 pg. Numa modalidade especialmente preferida, a quantidade de fator de crescimento está entre cerca de 10 pg e cerca de 100 pg. Numa modalidade preferida, após um intervalo de desde cerca de 7 dias a cerca de 4 5 dias, mais preferencialmente desde cerca de 14 dias a cerca de 45 dias, mais preferencialmente desde cerca de 17 dias a cerca de 35 dias, mais preferencialmente desde cerca de 20 dias a cerca de 3 5 dias, a entrega, se necessária, é repetida a uma dose de novo designada para manter uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de crescimento no tecido sem produzir acumulação prejudicial.
Numa modalidade preferida, a administração do fator de crescimento compreende dois ou mais tais intervalos.
Numa modalidade preferida, a duração de um intervalo que ocorre posteriormente é mais longo do que a duração de um intervalo que ocorre mais cedo num regime de administração que compreende três ou mais etapas de entrega.
Numa modalidade preferida, a dose do fator de crescimento dada numa entrega inicial é superior à dose do fator de crescimento dada numa entrega posterior num regime de administração que compreende duas ou mais etapas de entrega.
Está, ainda, contemplado que o fator de crescimento seja administrado com uma quantidade eficaz de um segundo agente terapêutico. Por exemplo, no tratamento da doença de Alzheimer, tal segundo agente terapêuticos pode incluir: agonistas colinérgicos, particularmente aqueles específicos do SNC e não dos músculos periféricos, inibidores da colinesterase, tais como cloridrato de tacrina, neurotrofinas tais como FCN, FNDC, NT-3, NT-4/5, fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), inibidores da formação da placa amiloide senil, inibidores da formação de PHF e indutores da síntese ou produção de fator neurotrófico endógeno.
De acordo com esta invenção, os produtos proteicos do fator de crescimento podem ser isolados ou gerados por quaisquer meios conhecidos daqueles habilitados na técnica.
Os produtos proteicos do fator de crescimento que ocorrem naturalmente podem ser isolados a partir de preparações de células neuronais de mamíferos ou a partir de uma linha de células de mamífero que segrega ou expressa um fator de crescimento. Por exemplo, a publicação Internacional PCT N.° WO93/06116, descreve o isolamento de FNDG a partir de meio condicionado de crescimento isento de soro de células do glioblastoma B49. Os produtos proteicos de FNDG também podem ser sintetizados quimicamente por quaisquer meios conhecidos daqueles habilitados na técnica. Os produtos proteicos de FNDG são preferencialmente produzidos através de técnicas recomfoinantes, porque sao capazes da atingir quantidades comparativamente superiores de proteína com maior pureza. Formas de produtos proteicos de FNDG recombinantes incluem formas glicosiladas e não glicosiladas da proteína e proteína expressa em sistemas de células bacterianas, de mamíferos ou de insetos.
Em geral, técnicas recombinantes envolvem isolar os genes responsáveis por codificar o fator de crescimento, clonar o gene em vetores e tipos de células adequados, modificar o gene se necessário para codificar uma variante desejada e expressar o gene para produzir o produto proteico do fator de crescimento. Em alternativa, uma sequência nucleotídica que codifica o produto proteico do fator de crescimento pode ser sintetizada quimicamente. Está contemplado que o produto proteico do fator de crescimento possa ser expresso utilizando sequências nucleotídicas que diferem na utilização de codão devido às degenerações do código genético ou variações alélicas.
Nalguns casos, o fator de crescimento é administrado na forma de um ácido nucleico codificador que pode ser expresso numa célula transduzida. Num caso, um neuroterapêutico de elevada massa molecular é administrado a um paciente a um paciente, em que o neuroterapêutico de elevada massa molecular compreende um ácido nucleico que codifica um fator de crescimento, em que o ácido nucleico é expresso numa célula do SNC transduzida do paciente e é produzido o fator de crescimento codificado. Assim, o fator de crescimento é produzido in situ. Ácidos nucleicos que codificam proteínas do fator de crescimento da invenção são bem conhecidos na técnica.
Num exemplo preferido, o ácido nucleico que codifica um fator de crescimento é regulável in situ. Num caso, é administrada uma composição farmacêutica que compreende um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica um fator de crescimento sob o controlo de um promotor regulável. Será apreciado que a expressão regulável de um ácido nucleico que codifica um fator de crescimento proporciona entrega intermitente do fator de crescimento.
Uma composição do infusado terapêutica é um volume da composição farmacêutica a ser entregue por EPC numa administração única. 0 volume do infusado será determinado, em geral, pelo tecido alvo e seu volume. Volumes típicos estarão entre cerca de 10 μΐ e cerca de 10 cc, apesar de poderem ser utilizados volumes maiores e mais pequenos. 0 termo "tecido alvo" refere-se a um alvo físico (normalmente anatómico) no SNC que compreende uma população neuronal de interesse.
Um agente de rastreamento é preferencialmente detetável por imagem por ressonância magnética (IRM) ou tomografia computadorizada de raios X. A distribuição do agente de rastreamento é monitorizada e utilizada como uma medida indireta da distribuição do fator de crescimento ou neuroterapêutico de elevada massa molecular. Esta monitorização é feita para verificar que o fator de crescimento atinge o tecido alvo e uma concentração eficaz no mesmo e para detetar entrega indesejada do infusado a tecido não alvo.
Numa modalidade preferida, um agente de rastreamento está separado do fator de crescimento. 0 agente de rastreamento é distribuído de uma maneira que se correlaciona com a do fator de crescimento e, portanto, é um indicador indireto da distribuição do fator de crescimento.
Numa modalidade preferida, o agente de rastreamento e o fator de crescimento estão cada na forma de composições veículo, o que confere características de distribuição altamente semelhantes aos mesmos.
Numa modalidade altamente preferida, o agente de rastreamento e o fator de crescimento estão na forma de composições lipossómicas. Agentes de rastreamento baseados em lipossoma são indicadores indiretos altamente precisos da distribuição de neuroterapêuticos baseados em lipossoma de elevada massa molecular. 0 ato de "monitorizar" refere-se a obter imagens em série do agente de rastreamento ao longo do tempo. Ao monitorizar a distribuição do agente de rastreamento, pode ser determinada em qualquer altura durante o processo de infusão a localização e volume da distribuição do neuroterapêutico de elevada massa molecular dentro do tecido. As imagens em série poem ser obtidas a qualquer taxa até à taxa máxima a que o instrumento de imagem pode obter imagens. Por exemplo, podem ser obtidas imagens em série a intervalos que oscilam de uns poucos milissegundos a horas, mas mais tipicamente a intervalos de minutos, tais como intervalos de 1,2 , 5, 10, 15, 20 ou 30 minutos . 0 intervalo entre imagens em série pode ser variado durante a infusão. Nalgumas ocasiões, pode ser desejável obter imagens a intervalos curtos (por exemplo, cada 5, 10 ou 15 segundos) no início do processo de infusão para detetar refluxo ao longo da cânula ou para verificar que o infusado está a entrar no tecido alvo desejado. Assim que tenha sido confirmada a entrega ao local adequado, o intervalo entre imagens pode ser estendido e as imagens utilizada para seguir o progresso de infusão.
Num aspeto, a invenção proporciona métodos de tratamento que compreendem entregar uma composição farmacêutica da invenção por EPC, em que a composição farmacêutica compreende um agente de rastreamento, monitorizar a distribuição do agente de rastreamento à medida que este se move pelo SNC e cessar a entrega da composição farmacêutica quando o neuroterapêutico de elevada massa molecular é distribuído num volume pré-determinado dentro do SNC. 0 movimento do agente de rastreamento pelo tecido sólido pode ser monitorizado por uma técnica de imagem, tal como imagem por ressonância magnética (IRM) ou tomografia computadorizada de raios X (TC) . 0 agente de rastreamento tem uma mobilidade no tecido do SNC que é substancialmente semelhante ao agente terapêutico e a entrega é cessada quando se observa o agente de rastreamento a atingir uma região desejada ou atingir um volume de distribuição desejado ou a atingir ou quase a atingir ou exceder as fronteiras do tecido alvo. 0 volume pré-determinado pode corresponder a uma região particular do cérebro. 0 volume de distribuição pré-determinado é "substancialmente semelhante" ao volume de distribuição observado para um agente de rastreamento que está a ser monitorizado para seguir a infusão. "Substancialmente semelhante" refere-se a uma diferença no volume inferior a 20%. Mais preferencialmente, a diferença de volume é inferior a 15%, mais preferencialmente inferior a 10%, mais preferencialmente inferior a 5%. Ao monitorizar a distribuição do agente de rastreamento, a infusão pode ser cessada quando o volume de distribuição pré-determinado é atingido. 0 volume da distribuição pode ser determinado, por exemplo, utilizando programa de imagem que é padrão na técnica, por exemplo, iFLOW™. Ver também, por exemplo, Krautze et al., Brain Res. Protocols, 16:20-26, 2005Ã e Saito et al., Exp.
Neurol., 196:3891-389, 2005.
Variantes do fator de crescimento 0 termo "variante do fator de crescimento", conforme utilizado aqui, inclui polipeptídeos dos quais aminoácidos foram apagados ("variantes de deleção"), inseridos em ("variantes de adição") ou substituídos por ("variantes de substituição ") resíduos dentro da sequência de aminoácidos de fator de crescimento que ocorre naturalmente. Tais variantes são preparadas introduzindo alterações nucleotídicas apropriadas no ADN que codifica o polipeptídeo ou por síntese química in vitro do polipeptídeo desejado. Será apreciado por aqueles habilitados na técnica que muitas combinações de deleções, inserções e substituições podem ser feitas desde que a molécula final seja biologicamente ativa. 0 termo "biologicamente ativa", conforme utilizado aqui, significa que o fragmento da variante demonstra propriedades semelhantes, mas não necessariamente todas as mesmas propriedades, e não necessariamente no mesmo grau, que o fator de crescimento no qual é baseado. Técnicas de mutagénese para a substituição, inserção ou deleção de um ou mais resíduos de aminoãcidos selecionados são bem conhecidas de alguém habilitado na técnica (por exemplo, Patente U.S. N.° 4 518 584.) Existem duas variáveis principais na construção de variantes: a localização do local de mutação e a natureza da mutação. Ao desenhar as variantes do fator de crescimento, a seleção do local de mutação e da natureza da mutação dependerão da(s) característica(s) do fator de crescimento a ser modificado. Os locais para mutação podem ser modificados individualmente ou em séries, por exemplo, (1) substituindo primeiro com escolhas de aminoácidos conservativos e depois com seleções mais radicais dependendo dos resultados atingidos (2) apagar o resíduo de aminoãcido alvo ou (3) inserir resíduos de aminoãcido adjacentes ao local localizado. São preferidas alterações conservativas em de 1 a 2 0 aminoãcidos . Assim que a sequência de aminoãcidos do produto proteico do fator de crescimento desejado seja determinada, a sequência de ácido nucleico a ser utilizada na expressão da proteína é determinada prontamente. Variantes de deleção N-terminal e C-terminal também podem ser geradas por enzimas proteolíticas.
Para as variantes de deleção do fator de crescimento, as deleções geralmente oscilam desde cerca de 1 a 30 resíduos, mais normalmente desde cerca de 1 a 10 resíduos e tipicamente desde cerca de 1 a 5 resíduos contíguos. Estão contempladas deleções de intra-sequência interna, N-terminal e C-terminal. As deleções podem ser introduzidas em regiões de baixa homologia com outros membros da família para modificar a atividade de um fator de crescimento particular. Deleções em áreas de homologia substancial com outras sequências da família modificarão mais provavelmente de forma mais significativa a atividade biológica do fator de crescimento particular. 0 número de deleções consecutivas serã selecionado para preservar a estrutura terciária do produto proteico do fator de crescimento o domínio afetado.
Exemplos de variantes incluem aquelas reveladas nas
Patentes U.S. N, ° s 6 723 701Â 6 468 970Â 6 440 702Â 5 741 778Ã 5 731 284Ã 5 830 857Ã 5 733 875.
Para variantes de adição do fator de crescimento, adições de sequências de aminoácidos tipicamente incluem fusões N- e/ou C-terminal que oscilam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como adições de intra-sequência interna de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Adições internas podem oscilar geralmente desde cerca de 1 a 10 resíduos, mais tipicamente desde cerca de 1 a 5 resíduos e normalmente desde cerca de 1 a 3 resíduos de aminoácidos. Exemplos de variantes de adição N-terminal incluem fator de crescimento com um resíduo metionilo N-terminal (um artefacto da expressão direta do FNDG em cultivos de células recombinantes bacterianas) e fusão de uma sequência sinal N-terminal heteróloga para o terminal N do fator de crescimento para facilitar a secreção do fator de crescimento maduro das células hospedeiras recombinantes. Tais sequências sinal serão, geralmente, obtidas das, e, portanto, serão homólogas a, espécies de células hospedeiras pretendidas. As adições também podem incluir sequências de aminoácidos derivadas da sequência de outros fatores de crescimento.
Variantes de substituição do fator de crescimento têm pelo menos um resíduo de aminoácido da sequência de aminoácidos do fator de crescimento removida e um resíduo diferente inserido no seu lugar. Tais variantes de substituição incluem variantes alélicas que são caracterizadas por alterações de sequências nucleotídicas que ocorrem naturalmente na população da espécie que pode ou não resultar numa alteração de aminoácidos.
Mutações específicas da sequência de aminoácidos do fator de crescimento podem envolver modificações a um local de glicosilação (por exemplo, serina, treonina ou asparagina). A ausência de glicosilação ou glicosilação apenas parcial resulta de substituição ou deleção de aminoácidos em qualquer local de reconhecimento de glicosilação ligado a asparagina ou em qualquer local da molécula que é modificado por adição de um carbohidrato ligado a 0. Um local de reconhecimento de glicosilação ligado a asparagina compreende uma sequência tripeptídica que é reconhecida especificamente pelas enzimas de glicosilação celulares apropriadas. Estas sequências tripeptídicas ou são Asn-Xaa-Thr ou são Asn-Xaa-Ser, onde Xaa pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro. Uma variedade de substituições ou deleções de aminoácidos em uma ou em ambas das primeira ou terceira posições do aminoácido de um local de reconhecimento de glicosilação (e/ou deleção do aminoácido na segunda posição) resultam em não glicosilação na sequência tripeptídica modificada. Logo, a expressão das sequências nucleotídicas alteradas apropriadas produz variantes que não são glicosiladas naquele local. Em alternativa, a sequência de aminoácidos do fator de crescimento pode ser modificada para adicionar locais de glicosilação.
Um método de identificar resíduos ou regiões do fator de crescimento aminoácido para mutagénese é designado "mutagénese de varredura de alanina", conforme descrito por Cunningham e Wells (Science, 244:1081-1085, 1989). Neste método, são identificados um resíduo de aminoácido ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp, His, Lys e Glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (mais preferencialmente alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o ambiente aquoso circundante dentro ou fora da células. Aqueles domínios que demonstram sensibilidade funcional às substituições são depois refinados introduzindo resíduos adicionais ou alternados nos locais de substituição. Assim, é determinado o local alvo para introduzir uma variação da sequência de aminoácidos, é conduzida mutagénese de varredura de alanina ou aleatória no codão ou região alvo da sequência de ADN correspondente e as variantes expressas do fator de crescimento são varridas para combinação ótima da atividade e grau de atividade desejada.
Os locais de maior interesse para mutagénese substitutiva incluem locais onde os aminoácidos encontrados num fator de crescimento particular de várias espécies são substancialmente diferentes em termos de volume de cadeia lateral, carga e/ou hidrofobicidade. Outros locais de interesse são aqueles nos quais os resíduos particulares de proteínas relacionadas com o fator de crescimento, obtidas de várias espécies, são idênticos. Tais posições são geralmente importantes para a atividade biológica de uma proteína. Inicialmente, estes locais são substituídos de uma forma relativamente conservative. Tais substituições conservatives são mostradas no Quadro 3 sob o cabeçalho de substituições exemplares. Se tais substituições resultam numa alteração na atividade biológica, então mais alterações substanciais (substituições exemplares) são introduzidas e/ou podem ser feitas outras adições ou deleções e os produtos resultantes rastreados para atividade.
Espera-se que modificações conservativas à sequência de aminoácidos (e as modificações correspondentes às sequências de ácido nucleico codificadoras) produzam produtos proteicos do fator de crescimento com características funcionais e químicas semelhantes às do correlacionado do fator de crescimento natural. Por oposição, modificações substanciais nas características funcionais e/ou químicas dos produtos proteicos do fator de crescimento podem ser conseguidas selecionando substituições que diferem significativamente no seu efeito em manter (a) a estrutura do esqueleto polipeptídico na área da substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) o volume da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos com base em propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr (3) acídicos: Asp, Glu (4) básicos: Asn, Gin, His, Lys, Arg (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro e (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Substituições não conservativas podem envolver a troca de um membro de uma destas classes por outro. Tais resíduos substituídos podem ser introduzidos em regiões da proteína do fator de crescimento que são homólogas com outras proteínas do fator de crescimento ou nas regiões não homólogas da molécula. Derivados do fator de crescimento
Podem ser preparados derivados quimicamente modificados do fator de crescimento ou de variantes do fator de crescimento por alguém habilitado na técnica dadas as revelações aqui. As frações químicas mais adequadas para derivatização incluem polímeros solúveis em água. Um polímero solúvel em água é desejável, porque a proteína à qual é ligado não precipita num ambiente aquoso, tal como num ambiente fisiológico. Preferencialmente, o polímero será farmaceuticamente aceitável para a preparação de um produto ou composição terapêutica. Alguém habilitado na técnica será capaz de selecionar o polímero desejado com base em tais considerações como se o conjugado polímero/proteína será utilizado terapeuticamente, e em caso afirmativo, a dosagem desejada, tempo de circulação, resistência à proteólise e outras considerações. A eficácia da derivatização pode ser avaliada administrando o derivado, na forma desejada (isto é, por bomba osmótica ou, mais preferencialmente, por injeção ou infusão, ou, ainda formulado para vias de entrega oral, pulmonar ou outras) e determinando a sua eficácia.
Polímeros solúveis em água adequados incluem, mas não se limitam a, polietilenoglicol, copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli -1,3,6 - trioxano, copolímero de anidrido etileno/maleico, poliaminoácidos (sejam homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinilpirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/etileno, poliois polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. Polietilenoglicol propionaldeído pode ter vantagens no fabrico devido à sua estabilidade em água. 0 polímero pode ser de qualquer massa molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. Para polietilenoglicol, a massa molecular preferida está entre cerca de 2 kDa e cerca de 100 kDa para facilidade de manipulação e fabrico (o termo "cerca de" indicando que em preparações de polietilenoglicol, algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, do que a massa molecular indicada) . Podem ser utilizados outros tamanhos, dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração da libertação prolongada desejada, os efeitos, se quaisquer, na atividade biológica, a facilidade de manipulação, o grau ou ausência de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polietilenoglicol numa variante ou proteína terapêutica). 0 número de moléculas de polímero anexadas pode variar e alguém habilitado na técnica será capaz de avaliar o efeito na função. Uma pessoa pode mono-derivar ou pode proporcionar uma di, tri, tetra ou alguma combinação de derivatização, com as mesmas frações químicas ou diferentes (por exemplo, polímeros, tais como diferentes pesos de polietilenoglicois) . A proporção de moléculas de polímero para moléculas de proteína (ou péptido) variará, assim como as suas concentrações na mistura da reação. Em geral, a razão ótima (em termos de eficiência da reação de modo que não há proteína ou polímero não reagido em excesso) será determinada por fatores, tais como o grau desejado de derivatização (por exemplo, mono, di, tri, etc.), a massa molecular do polímero selecionado, se o polímero é ramificado ou não ramificado e as condições da reação.
As moléculas de polietilenoglicol (ou outras frações químicas) deveriam ser anexadas à proteína com consideração pelos efeitos nos domínios funcional ou antigénico da proteína.
Existe um número de métodos de anexação disponíveis àqueles habilitados na técnica. Ver, por exemplo, documento EP 0 401 384, (unindo PEG a G-CSF) , ver também Malik et al. , Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (que reportam peguilação de GM-CSF utilizando cloreto de tresilo). Por exemplo, o polietilenoglicol pode ser ligado de forma covalente pelos resíduos de aminoácido através de um grupo reativo, tal como um grupo amino livre ou carboxilo. Grupos reativos são aqueles aos quais uma molécula de polietilenoglicol ativada pode ser ligada. Os resíduos de aminoácido com um grupo amino livre podem incluir resíduos lisina e o resíduo de aminoãcidos N-terminal. Aqueles com um grupo carboxilo livre podem incluir resíduos de ácido aspártico, resíduos de ácido glutâmico e o resíduo de aminoácidos C-terminal. Também podem ser utilizados grupos sulfidrilo como um grupo reativo para anexar a(s) molécula (s) de polietilenoglicol. Para fins terapêuticos, é preferida a anexação a um grupo amino, tal como anexação ao N-terminal ou grupo lisina. A anexação a resíduos importantes para ligação do recetor deveria ser evitada se a ligação do recetor é desej ada.
Uma pessoa pode desejar especificamente uma proteína N-terminal quimicamente modificada. Utilizando polietilenoglicol como uma ilustração das presentes composições, uma pessoa pode selecionar de uma variedade de moléculas de polietilenoglicol (pela massa molecular, ramificação, etc.), a proporção de moléculas de polietilenoglicol para moléculas de proteína (ou péptido) na mistura da reação, o tipo de reação de peguilação a ser realizada e o método de obter a proteína peguilada N-terminalmente selecionada. 0 método de obter a preparação peguilada N-terminalmente (isto é, separando esta fração de outras frações monopeguiladas, se necessário) pode ser por purificação do material peguilado N-terminalmente de uma população de moléculas de proteína peguiladas. A modificação química N-terminal seletiva pode ser conseguida por alquilação redutiva que explora a reatividade diferencial de diferentes tipos de grupos amino primários (lisina versus o N-terminal) disponíveis para derivatização numa proteína particular. Nas condições de reação apropriadas, é conseguida derivatização substancialmente seletiva da proteína no N-terminal com um grupo carbonilo contendo polímero. Por exemplo, alguém pode peguilar N-terminalmente seletivamente a proteína realizando a reação a um pH que permite tirar partido das diferenças de pKa entre o grupo e-amino dos resíduos de lisina e o do grupo a-amino do resíduo N-terminal da proteína. Através de tal derivatização seletiva, é controlada a anexação de um polímero solúvel em água a uma proteína: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no N-terminal da proteína e não ocorre modificação significativa de outros grupos reativos, tais como os grupos amino da cadeia lateral da lisina. Utilizando alquilação redutiva, o polímero solúvel em água pode ser do tipo descrito anteriormente e deveria ter um único aldeído reativo para acoplar à proteína. Pode ser utilizado polietilenoglicol propionaldeído, contendo um único aldeído reativo. A presente invenção contempla a utilização de derivados que são fator de crescimento expresso por procariontes, ou variantes dos mesmos, ligados a pelo menos uma molécula de polietilenoglicol, bem como a utilização do fator de crescimento, ou variantes dos mesmos, anexado a uma ou mais moléculas de polietilenoglicol através de uma ligação acilo ou alquilo. A peguilação pode ser realizada por qualquer uma das reações de peguilação conhecidas na técnica. Ver, por exemplo: Focus on Growth Factors, , 3 (2) :4-10 (1992)Â documento EP 0 154 316Â documento EP 0 401 384Â e as outras publicações citadas aqui que se relaciona com peguilação, as revelações das quais são incorporadas aqui na sua totalidade por referência. A peguilação pode ser realizada através de uma reação de acilaçâo ou de uma reação de alquilação com uma molécula de polietilenoglicol reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo).
Peguilação por acilação envolve geralmente reagir um derivado éster ativo de polietilenoglicol (PEG) com o fator de crescimento ou variante. Qualquer molécula PEG reativa conhecidas ou subsequentemente descoberta pode ser utilizada para realizar a peguilação da proteína ou variante do fator de crescimento. Um éster PEG ativado preferido é PEG esterifiçado a N-hidroxisuccinimida ("NITS"). Conforme utilizado aqui, contempla-se que "acilação" inclua, sem limitação, os seguintes tipos de ligações entre a proteína terapêutica e um polímero solúvel em água, tal como PEG: amida, carbamato, uretano e afins. Ver Bioconjugate Chem., 5:133-140 (1994). As condições de reação podem ser selecionadas de quaisquer das conhecidas 11a técnica de peguilação ou das subsequentemente desenvolvidas, mas deveriam evitar condições, tais como temperatura, solvente e pH que desativariam o fator de crescimento ou variante a ser modificada.
Peguilação por acilação resultará, geralmente, numa proteína ou variante do fator de crescimento polipeguilada. Preferencialmente, a ligação de conexão será uma amida. Também preferencialmente, o produto resultante será substancialmente apenas (por exemplo, >95%) mono, di ou tripeguilado. Contudo, podem ser formadas algumas espécies com graus mais elevados de peguilação em quantidades dependendo das reações de reação específicas utilizadas. Se desejado, mais espécies peguiladas purificadas podem ser separadas da mistura, particularmente espécies não reagidas, por técnicas de purificação convencionais, incluindo, entre outras, diálise, relargagem, ultrafiltração, cromatografia de troca de iões, cromatografia de filtração em gel e eletroforese.
Peguilação por alquilação envolve, geralmente, reagir um derivado aldeído terminal de PEG com a proteína ou variante do fator de crescimento na presença de um agente redutor. Peguilação por alquilação também pode resultar em proteína ou variante do fator de crescimento polipeguilada. Além disso, é possível manipular as condições de reação para favorecer substancialmente a peguilação apenas no grupo a-amino do N-terminal proteína ou variante do fator de crescimento (isto é, uma proteína monopeguilada). Em qualquer um dos casos de monopeguilação ou polipeguilação, os grupos PEG são preferencialmente anexados à proteína através de um grupo --CH2--NH--. Com referência particular ao grupo --CH2--, este tipo de ligação é referida aqui como uma ligação "alquilo", A derivatização através de alquilação redutiva para produzir um produto monopeguilado explora a reatividade diferencial de diferentes tipos de grupos amino primários (lisina versus o N-terminal) disponíveis para derivatização. A reação é realizada a um pH que permite tirar partido das diferenças de pKa entre os grupos e-amino dos resíduos de lisina e a do grupo a-amino do resíduo N-terminal da proteína. Através de tal derivatização seletiva, é controlada a anexação de um polímero solúvel em água que contém um grupo reativo, tal como um aldeído, a uma proteína: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no N-terminal da proteína e não ocorre modificação significativa de outros grupos reativos, tais como os grupos amino da cadeia lateral da lisina. Num aspeto importante, a presente invenção contempla a utilização de uma preparação substancialmente homogénea de conjugado de monopolímero/proteína (ou variante) do fator de crescimento moléculas (o que significa proteína ou variante do fator de crescimento ao qual uma molécula de polímero foi anexada apenas substancialmente (isto é, >95%) numa única localização). Mais especificamente, se for utilizado polietilenoglicol, a presente invenção também abrange a utilização de proteína ou variante do fator de crescimento peguilada carecendo possivelmente de grupos de ligação antigénicos e com a molécula de polietilenoglicol acoplada diretamente à proteína ou variante do fator de crescimento.
Assim, produtos proteicos do fator de crescimento preferidos presentemente, de acordo com a presente invenção, são proteínas ou variantes do fator de crescimento peguiladas, em que o(s) grupo(s) PEG é(são) anexado(s) através de grupos acilo ou alquilo. Conforme discutido anteriormente, tais produtos podem ser monopeguilados ou polipeguilados (por exemplo, contendo 2-6, e preferencialmente 2-5, grupos PEG). Os grupos PEG são geralmente anexados à proteína nos grupos a-ou e-amino de aminoácidos, mas também está contemplado que os grupos PEG possam ser anexados a qualquer grupo amino anexado à proteína, que seja suficientemente reativo para se anexar a um grupo PEG em condições da reação adequadas.
As moléculas de polímero utilizadas em ambas as abordagens de acilação e alquilação podem ser selecionadas de entre polímeros solúveis em água, conforme descrito anteriormente. 0 polímero selecionado deveria ser modificado para ter um único grupo reativo, tal como um éster ativo para acilação ou um aldeído para alquilação, preferencialmente, para que o grau de polimerização possa ser controlado conforme salvaguardado nos presentes métodos. Um aldeído de PEG reativo exemplar é polietilenoglicol propionaldeído, que é estável em água, ou derivados mono Cl-CIO alcoxi ou ariloxi do mesmo (ver, Patente U.S. M.° 5 252 714). 0 polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Para as reações de acilação, o(s) polímero(s) selecionado(s) deveria(m) ter um único grupo éster reativo. Para a presente alquilação redutiva, o(s) polímero(s) selecionado(s) deveria(m) ter um único grupo aldeído reativo. Em geral, o polímero solúvel em água não será selecionado de resíduos glicosilo que ocorrem naturalmente, uma vez que estes são normalmente feitos, de forma mais conveniente, por sistemas de expressão recombinantes de mamíferos. 0 polímero pode ter qualquer massa molecular e pode ser ramificado ou não ramificado.
Um polímero solúvel em água particularmente preferido para utilização aqui é polietilenoglicol. Conforme utilizado aqui, pretende-se que polietilenoglicol abranja quaisquer das formas de PEG que foram utilizadas para derivar outras proteínas, tais como mono-(C1-C10) alcoxi- ou ariloxi-polietilenoglicol.
Em geral, a derivatização química pode ser realizada sob qualquer condição adequada utilizada para reagir uma substância biologicamente ativa com uma molécula de polímero ativada. Métodos para preparar proteína ou variante do fator de crescimento peguilada compreenderão, geralmente, as etapas de (a) reagir uma proteína ou variante do fator de crescimento com polietilenoglicol (tal como um éster reativo ou derivado aldeído de PEG) em condições através das quais a proteína se anexa a um ou mais grupos PEG e (b) obter o(s) produto(s) da reação. Em geral, as condições de reação ótimas para as reações de acilação serão determinadas caso a caso com base em parâmetros conhecidos e no resultado desejado. Por exemplo, quanto maior a razão de PEG:proteína, maior a percentagem de produto polipeguilado.
Alquilação redutiva para produzir uma população substancialmente homogénea de molécula de conjugado monopolímero/proteína (ou variante) do fator de crescimento compreenderão, geralmente, as etapas de: (a) reagir uma proteína ou variante do fator de crescimento com uma molécula PEG reativa em condições de alquilação redutiva, a um pH adequado para permitir a modificação seletiva do grupo a-amino no terminal amino de dita proteína ou variante do fator de crescimento e (b) obter o(s) produto(s) da reação.
Para uma população substancialmente homogénea de moléculas de conjugado monopolímero/proteína (ou variante) do fator de crescimento, as condições da reação de alquilação redutiva são aquelas que permitem a anexação seletiva da fração do polímero solúvel em água ao N-terminal da proteína ou variante do fator de crescimento. Tais condições de reação proporcionam, geralmente, diferenças de pKa entre os grupos amino da lisina e o grupo a-amino no N-terminal (sendo o pKa o pH ao qual 50% dos grupos amino são protonados e 50% não o são) . 0 pH também afeta a razão de polímero para proteína a ser utilizada. Em geral, se o pH é inferior, será desejado um excesso maior de polímero para proteína (isto é, quanto menos reativo o grupo a-amino N-terminal, mais polímero é necessário para atingir as condições ótimas) . Se o pH é superior, a razão polímero:proteína não precisa de ser tão alta (isto é, mais grupos reativos estão disponíveis, logo são necessárias menos moléculas de polímero). Para os fins da presente invenção, o pH cairá, em geral, no intervalo de 3-9, preferencialmente 3-6.
Outra consideração importante é a massa molecular do polímero. Em geral, quanto mais alta a massa molecular do polímero, menos moléculas de polímero podem ser anexadas à proteína. Da mesma forma, a ramificação do polímero deveria ser levada em conta na otimização destes parâmetros. Em geral, quanto mais alta a massa molecular (ou quantos mais ramos) , mais alta a razão polímero:proteína. Em geral, para as reações de peguilação contempladas aqui, a massa molecular média preferida é cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa. A massa molecular média preferida é cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, particularmente preferencialmente cerca de 12 kDa a cerca de 25 kDa. A razão de polímero solúvel em água para proteína ou variante FNDG oscilará, em geral, entre 1:1 e 100:1, preferencialmente (para polipeguilação) 1:1 e 20:1 e (para monopeguilação) 1:1 e 5:1.
Utilizando as condições indicadas anteriormente, a alquilação redutiva proporcionará anexação seletiva do polímero a qualquer proteína ou variante do fator de crescimento com um grupo a-amino no terminal amino e proporciona uma preparação substancialmente homogénea de conjugado de monopolímero/proteína (ou variante) do fator de crescimento. O termo "conjugado de monopolímero/proteína (ou variante) do fator de crescimento" é utilizado aqui para significar uma composição composta de uma única molécula de polímero anexada a uma molécula de proteína do fator de crescimento ou proteína variante do fator de crescimento. 0 conjugado de monopolímero/proteína (ou variante) do fator de crescimento terá preferencialmente uma molécula de polímero localizada no N-terminal, mas não em grupos laterais amino de lisina. A preparação será preferencialmente superior a 90% de conjugado de monopolímero/proteína (ou variante) do fator de crescimento, e mais preferencialmente superior a 95% de conjugado de monopolímero/proteína (ou variante) do fator de crescimento, sendo o restante das moléculas observáveis não reagidas (isto é, proteína carece da fração de polímero).
Para a presente alquilação redutiva, o agente redutor deveria ser estável em solução aquosa e preferencialmente ser capaz de reduzir apenas a base de Schiff formada no processo inicial de alquilação redutiva. Agentes redutores preferidos podem ser selecionados de borohidreto de sódio, cianoborohidreto de sódio, dimetilamina borano, trimetilamina borano e piridina borano. Um agente redutor particularmente preferido é cianoborohidreto de sódio. Outros parâmetros da reação, tais como solvente, tempos de reação, temperaturas, etc., e meios de purificação de produtos, podem ser determinados caso a caso com base na informação publicada relativa à derivatização de proteínas com polímeros solúveis em água (ver as publicações citadas aqui).
Composições farmacêuticas do fator de crescimento
As composições farmacêuticas do fator de crescimento incluem tipicamente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um produto proteico do fator de crescimento em mistura com um ou mais materiais de formulação farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis. Materiais de formulação adequados incluem, mas não se limitam a, antioxidantes, conservantes, corantes, agentes de diluição, agentes emulsionantes, agentes de suspensão, solventes, preenchidores, agentes espessantes, tampões, veículos de entrega, diluentes e excipientes. Por exemplo, um veículo adequado pode incluir água, solução salina fisiológica ou CSF artificial, possivelmente suplementado com outros materiais. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina do soro são veículos exemplares adicionais.
Assim que composição terapêutica é formulada, pode ser armazenada em frascos de vidro estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, pó sólido ou desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas ou numa forma pronta a utilizar ou numa forma, por exemplo, liofilizada, requerendo reconstituição antes da administração. A formulação farmacêutica ótima será determinada por alguém habilitado na técnica. Ver, por exemplo, Pharmaceutical Sciences de Remington, 18a Edição (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) páginas 1435-1712. 0 regime de dosagem final envolvido num método para tratar as condições patológicas anteriormente descritas será determinado pelo médico responsável, considerando vários fatores que modificam a ação dos fármacos, por exemplo, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a severidade de qualquer infeção, tempo de administração e outros fatores clínicos. Ã medida que os estudos são conduzidos, mais informação emergirá relativamente aos níveis de dosagem apropriados para o tratamento de várias doenças e condições patológicas. A composição farmacêutica pode incluir tipicamente uma quantidade eficaz do respetivo fator de crescimento em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável e, além disso, pode incluir outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, veículos, diluentes, etc. Por "farmaceuticamente aceitável" quer-se dizer um material que não é biologicamente, nem de outra forma, indesejável, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo juntamente com o agente selecionado sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejados ou interagir de uma forma deletéria com quaisquer dos outros componentes da composição farmacêutica na qual está contido.
Numa modalidade preferida, o fator neurotrófico é selecionado do grupo que consiste em FCN, FNDC, NT-3, MT- 4/5, NT-6, FNDG, neurturina, persefina e artemina.
Numa modalidade preferida, uma composição farmacêutica é entregue localmente ao SNC do mamífero por EPC.
Numa modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende um agente de rastreamento.
Um agente de rastreamento compreende preferencialmente um ião paramagnético para utilização com IRM. Iões de metal adequados incluem aqueles com números atómicos de 22-29 (inclusive), 42, 44 e 58-70 (inclusive) e têm estados de oxidação de +2 ou +3. Exemplos de tais iões de metal são crómio (III), manganês (II), ferro (II), ferro (III), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), praseodímio (III), neodímio (III), samãrio (III) , gadolínio (III), térbio (III) , disprósio (III) , hólmio (III), êrbio (III) e itérbio (III).
Numa modalidade preferida, o agente de rastreamento compreende um imã de IRM que pode ser utilizado em conjunto com IRM para monitorizar a distribuição da composição farmacêutica infundida.
Numa modalidade preferida, o imã de IRM é quelato de gadolínio.
Numa modalidade preferida, o agente de rastreamento compreende um lipossoma que compreende um imã de IRM. Numa modalidade preferida, o imã de IRM é quelato de gadolínio.
Em modalidades em que é utilizada imagiologia de raios X (tais como TC) para monitorizar EPC, o rastreador pode compreender um material radiopaco. Materiais radiopacos adequados são bem conhecidos e incluem compostos de iodo, compostos de bário, compostos de gálio, compostos de tãlio e afins. Exemplos específicos de materiais radiopacos incluem bário, diatrizoato, óleo etiodizado, citrato de gálio, ácido iocãrmico, ácido iocetâmico, iodamida, iodipamida, ácido iodoxâmico, iogulamida, iohexol, iopamidol, ácido iopanõico, ácido ioprocémico, ácido iosefâmico, ácido iosérico, iosulamida meglumina, ácido iosumético, iotasul, ácido iotétrico, ácido iotalâmico, ácido iotróxico, ácido ioxãglico, ácido ioxotriróico, ipodato, meglumina, metrizamida, metrizoato, propiliodona e cloreto taloso.
Numa modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende um agente facilitador. Um agente facilitador é capaz de facilitar a entrega do fator de crescimento ao tecido alvo, preferencialmente quando ambos agente facilitador e fator de crescimento são entregues por EPC. Numa modalidade preferida, um agente facilitador é uma biomolécula que é eliminada eficientemente do tecido. Numa modalidade preferida, um agente facilitador tem uma meia vida curta em relação ao fator de crescimento. Numa modalidade preferida, um agente facilitador é capaz de competir com o fator de crescimento pela ligação aos locais de ligação do fator de crescimento no parênquima cerebral, cujos locais de ligação são outos que não os recetores do fator de crescimento cognatos. Para descrição adicional de agentes facilitadores, ver documento U.S. 2002/0114780.
Um agente facilitador especialmente preferido para utilização na presente invenção é a heparina de baixa massa molecular. A heparina de baixa massa molecular (LMW Hep) potência de forma eficiente o volume de distribuição de FNDG infundida, tem uma janela terapêutica ampla e é mais segura do que a heparina de elevada massa molecular (o que pode causar hemorragia à mesma dose) . Quando a LMW Hep (1 micrograma/microlitro) com FNDG é infundida, observa-se uma grande melhoria da distribuição do FNDG (Figuras 1 e 2) . A heparina de elevada massa molecular é uma forma não fracionada com uma massa molecular que oscila de 5,000-35,000 daltones Neuroterapêuticos de elevada massa molecular
Numa modalidade, os fatores de crescimento são proporcionados como neuroterapêuticos de elevada massa molecular. Composições de neuroterapêuticos de elevada massa molecular da invenção compreendem um fator de crescimento e um veículo. Num aspeto, a invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem neuroterapêuticos de elevada massa molecular. Além disso, em relação aos neuroterapêuticos de elevada massa molecular, ver Pedido de Patente provisório U. S. número de série 60/795 371, submetido a 26 de abril de 2006, e Pedido de Patente provisório U.S. número de série 60/900 492, submetido a 9 de fevereiro de 2007.
Os neuroterapêuticos de elevada massa molecular da invenção têm uma massa molecular superior a cerca de 200kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 500kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 1000 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 1500 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 2000 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 2500 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 3000 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 3500 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 4000 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 4500 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 5000 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 5500 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 6000 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 6500 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 7000 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 7500 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 8000 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 8500 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 9000 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 9500 kDa, mais preferencialmente superior a cerca de 10000 kDa.
Numa modalidade, um neuroterapêutico de elevada massa molecular da invenção tem um diâmetro ou comprimento superior a cerca de 10 nm, mais preferencialmente superior a cerca de 20 nm, mais preferencialmente superior a cerca de 30 nm, mais preferencialmente superior a cerca de 40 nm, mais preferencialmente superior a cerca de 50 nm, mais preferencialmente superior a cerca de 60 nm, mais preferencialmente superior a cerca de 70 nm, mais preferencialmente superior a cerca de 80 nm, mais preferencialmente superior a cerca de 90 nm, mais preferencialmente superior a cerca de 100 nm, mais preferencialmente superior a cerca de 110 nm, mais preferencialmente superior a cerca de 120 nm. Nalgumas modalidades, um neuroterapêutico de elevada massa molecular da invenção tem um diâmetro ou comprimento superior a cerca de 13 0 nm, ou superior a cerca de 140 nm, ou superior a cerca de 150 nm, ou superior a cerca de 160 nm, ou superior a cerca de 170 nm, ou superior a cerca de 180 nm, ou superior a cerca de 190 nm ou superior a cerca de 200 nm.
Numa modalidade, o veículo é um veículo sintético.
Uma ampla variedade de veículos sintéticos está disponível para utilização nos neuroterapêuticos de elevada massa molecular da invenção. Numa modalidade preferida, o veículo é um lipossoma. Noutra modalidade preferida, o veículo é um partícula metal, tal como uma partícula de ouro ou um polímero. Em relação aos veículos, ver, por exemplo, Feigner et al., Ann N Y Acad Sei. 2 7 de novembro de 19 95Â772:126-39Â Ramsay et al., Curr Drug Deliv. Outubro de 2005Â2(4):341-51Â Allen et al. , Anticancer Agents Med Chem. Novembro de 2006Â6Í6):513-23Â Mitra et al., Curr Pharm Des. 2006Â12(36):4729-49.
Numa modalidade, o veículo é uma composição que ocorre naturalmente ou variante da mesma. Exemplos de tais veículos incluem partículas vírus, incluindo partículas vírus modificadas (por exemplo, aquelas com um perfil de proteína de superfície modificado) . Por exemplo, ver de Éonge, et al. , Gene Therapy (2006) 13, 400-411 .
Numa modalidade, o neuroterapêutico de elevada massa molecular é maior do que um vírus AAV.
Numa modalidade, o neuroterapêutico de elevada massa molecular tem uma massa molecular superior a um vírus AAV.
Numa modalidade, o neuroterapêutico de elevada massa molecular compreende um veículo que não AAV.
Kits São descritos kits que compreendem uma ou mais composições farmacêuticas da invenção. Num caso, um kit compreende ainda um dispositivo de entrega útil para EPC, preferencialmente uma cânula e mais preferencialmente uma cânula de desenho de etapa livre de refluxo. Num caso, um kit compreende ainda uma bomba útil para EPC. Os kits podem ainda compreender partes conetoras, tubagem, material de embalamento, panfletos de instruções e outros materiais úteis para praticar o tratamento de um distúrbio do SNC.
Compilação de dados São descritos aqui métodos de compilar dados obtidos a partir da monitorização baseada em imagiologia da distribuição do infusado, conforme entregue a pacientes com um distúrbio do SNC. Os dados podem incluir, mas não se limitam a, volume do infusado, volume de distribuição, distribuição neuroanatõmica, localização neuroanatómica da população alvo, dados genéticos, parâmetros de infusão, parâmetros da cânula e dados de colocação da cânula. Num caso é uma base de dados que compreende tais dados. Num caso, a base de dados é útil para derivar algoritmos que descrevem a distribuição do infusado no SNC de um paciente com um distúrbio do SNC e pode ser útil para modelar a entrega terapêutica.
Dispositivos de entrega
Também é descrito um dispositivo de entrega que compreende uma bomba que é capaz de entregar uma composição farmacêutica, preferencialmente por EPC, preferencialmente por EPCintermitente. 0 dispositivo compreende ou é utilizado em conjunto com um cateter ou cânula que facilita a entrega localizada a um população neuronal do SNC. É utilizada preferencialmente uma cânula de desenho de etapa livre de refluxo, compatível com EPC que é compatível com a administração crónica ou aguda. Num caso preferido, o dispositivo compreende ainda uma composição farmacêutica.
Qualquer dispositivo de entrega potenciado por convexão pode ser apropriado para utilização. Num caso preferido, o dispositivo é uma bomba osmõtica ou uma bomba de infusão. Ambas bombas osmótica e de infusão estão disponíveis comercialmente de uma variedade de fornecedores, por exemplo, Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc., Paio Alto, Califórnia). 0 cateter ou cânula é inserido no tecido do SNC no sujeito escolhido. Alguém habilitado na técnica poderia determinar prontamente que área geral do SNC é um alvo apropriado. Por exemplo, quando se trata de doença de Parkinson, o corpo estriado é uma área adequada do cérebro para dirigir. Estão disponíveis mapas estereotáticos e dispositivos de posicionamento, por exemplo, de ASI Instruments, Warren, Mich. 0 posicionamento também pode ser conduzido utilizando mapas anatómicos obtidos por imagiologia TC e/ou IRM do cérebro do sujeito para ajudar aa guiar o dispositivo de injeção ao alvo escolhido.
Numa modalidade altamente preferida, o método de EPC é executado com uma cânula de desenho de etapa livre de refluxo compatível com EPC. Tais cânulas altamente preferidas são reveladas em Krauze et al., É Neurosurg. Novembro de 2005Â103(5):923-9.
Tratamento de distúrbios do SNC. 0 tratamento geralmente resulta na redução ou prevenção da severidade ou sintomas do distúrbio do SNC no sujeito, isto é, uma melhoria na condição do sujeito ou um !! efeito terapêutico." Assim, o tratamento pode reduzir a severidade ou prevenir um ou mais sintomas do distúrbio do SNC, inibir a progressão ou agravamento do distúrbio do SNC e, nalgumas ocasiões, reverter o distúrbio do SNC.
Conforme utilizado aqui, o termo "melhorar" significa uma melhoria na condição do sujeito, uma redução na severidade da condição patológica ou uma inibição da progressão ou agravamento da condição patológica.
No caso de um distúrbio agudo do SNC, o tratamento melhorará a condição do sujeito para um ponto final clínico, que pode ser melhoria do distúrbio, recuperação completa ou parcial do distúrbio, em cujo ponto, a administração do fator de crescimento é preferencialmente descontinuada.
Um distúrbio agudo do SNC é um que pode ser tratado eficazmente com administração do fator de crescimento, de tal forma que a condição do sujeito melhora para um ponto clínico em que a administração pode ser descontinuada. Exemplos de distúrbios agudos do SNC podem incluir derrame cerebral e trauma do SNC, embora dependendo da severidade, o derrame cerebral e trauma podem ser considerados distúrbios crónicos do SNC em necessidade de tratamento crónico (administração crónica do fator de crescimento).
Os métodos da invenção para tratar um sujeito são aplicáveis para profilaxia para prevenir um distúrbio do SNC num sujeito em risco de um distúrbio do SNC ou para prevenir apresentação clínica num sujeito diagnosticado com um distúrbio do SNC numa fase inicial.
Os métodos da invenção para tratar um sujeito também podem ser suplementados com outras formas de terapêutica. Terapêuticas suplementares incluem tratamento com fármacos, uma alteração da dieta, etc. Terapêuticas suplementares podem ser administradas antes de, ao mesmo tempo que ou após os métodos de tratamento da invenção. 0 artesão habilitado pode avaliar prontamente terapêuticas que podem ser utilizadas num regime em combinação com os métodos de tratamento da invenção.
De notar que as composições farmacêuticas descritas aqui podem ser utilizadas para aplicações veterinárias, bem como para humanas, e que o termo "paciente" não deve ser interpretado de uma forma limitante.
EXEMPLOS
Exemplo 1 : EXPRESSÃO DE FNDG NO CORPO ESTRIADO DE RATAZANA APOS EPC DE AAV2-FNDG AAV2-FNDG foi infundido para o corpo estriado a doses diferentes e as ratazanas foram eutanasiadas em diferentes pontos temporais para analisar a acumulação da expressão do FNDG. 0 FNDG foi medido por ELISA. AAV2-FNDG (de Avigen) = 1,1 el3 vg/ml (PBS + 0,001% F6S plurõnico)
Foram escolhidas 3 doses diferentes: 15 ml# max = 1,65 ellvg [l,lel3 vg/ml] 15 ml # % log = 9,07el0vg [6,05el2 vg/ml] 15 ml # log -1 = l,65el0 vg [l,lel2 vg/ml] 7 ratazanas por ponto temporal: grupo A: 4 ratazanas HemisfE: max / HemisfD: % log [3 para ELISA, 1 para IHC] grupo B: 3 ratazanas HemisfE: log"* / HemisfD: AAV2-LacZ (controlo) [3 para ELISA] EPC - taxa de infusão: 0,2 μΐ/min = 11 min 0,5 μΐ/min = 8 min 0,8 μΐ/min = 11 min 15 μΐ 30 min
Os resultados são proporcionados no Quadro 4 e na Figura 3, que demostram uma acumulação gradual de FNDG ao longo do tempo.
Exemplo 2 : AVALIAÇÃO DA ENTREGA DA PROTEÍNA FNDG NO TRATAMENTO DA DOENÇA DE PARKINSON A administração de dose única de FNDG em putâmen de macaco resulta em níveis de FNDG no tecido prolongados que poem durar por mais do que várias semanas (Figura 4).
Para compreender a frequência e nível de dose da administração local de FNDG com entrega potenciada por convexão (EPC), é estabelecida a relação entre a administração de uma única dose e a meia vida do tecido e efeitos biológicos (Figura 4) . Estudos adicionais em macacos MPTP com avaliação funcional e imagiologia PET são também feitos opcionalmente para caracterizar adicionalmente a farmacocinética de FNDG administrado localmente em macacos PD. É realizado um estudo exploratório de dose em macacos Rhesus normais para estabelecer a magnitude e duração da resposta de forma dependente da dose. Trinta e nove (39) animais são utilizados e divididos em coortes de 3 animais. Cada coorte recebe unilateralmente uma dose de 10, 50 ou 100 pg de FNDG em 2 locais no putâmen. 0 lado oposto é infundido com PBS ou excipiente (ver Quadro 5 e Figura 5) . Heparina de baixa massa molecular é incluída na formulação. A heparina de baixa massa molecular aumenta significativamente a distribuição de FNDG no cérebro após EPC, estabiliza a proteína do FNDG na solução e aumenta os efeitos de FNDG na rotatividade DA que pode aumentar os efeitos funcionais de FNDG. (Hamilton É.F., Morrison P.F., Chen Μ.Y., Harvey-White É, Pernaute R.S., Phillips H.S., Oldfield E.H. e Bankiewicz K.S. Heparin Co-infusion during
Convection-Enhanced Delivery (CED) increases the distribution of the glial derived neurotrophic factor (GDNF) ligand family in rat striatum and enhances the pharmacological activity of neurturin. (2001) Experimental Neurology 168, 155-161).
Cada animal recebe administração unilateral de FNDG em 2 locais no putâmen. PBS é entregue no lado oposto. EPC será utilizada para administração do fãrmaco. Três macacos normais são eutanasiadas às 6 semanas para determinar os níveis normais de FNDG e a razão DOPAC/DA, uma vez que pode haver efeito oposto da administração de FNDG. Métodos abreviados:
Cirurgia
Cada animal recebe FNDG ou PBS/'excipiente em 2 locais (50 μΐ por local) no putâmen com EPC. São estabelecidas coordenadas estereotãticas com base em IRM e cânulas de sílica fundidas resistentes ao refluxo são colocadas nos locais alvo. EPC is controlled by external pump. Após administração de FNDG, CSF é recolhido através de punção cisternal e os animais são devolvidos às suas jaulas. CSF é recolhido na linha de base e cada 2 semanas de todos os macacos (animais com 6 semanas CSF recolhido na linha de base e às 0, 2, 4, 6 semanasà animais com 4 semanas na linha de base, 0, 2 e 4 semanasà animais com 2 semanas na linha de base, 0, 2 semanasà 0 semanas e linha de base e às 0 semanas. Sã colhidas amostras de sangue juntamente com amostras CSF. Imediatamente após a administração de FNDG (0 semanas) ou às 2, 4 ou 6 semanas mais tarde, animais são eutanasiados e os seus cérebros são removidos (frescos). Os cérebros são bloqueados em placas de 3 mm e congelados imediatamente. Os órgãos vitais são recolhidos para avaliações patológicas futuras.
Processamento do cérebro:
Os cérebros são processados para: 1- níveis de FNDG por Elisa 2- níveis de DOPAC/DA por HPLC 3-FNDG, TH. CD68, imunocoloração GFAP 4-H&E
Blocos de cérebro congelado são montados no criostato e 6 secções coronais (20 μιτι) são recolhidas de cada bloco que contém o putâmen. As secções são fixadas posteriormente e coradas para imunoquímica de FNDG para determinar a extensão da entrega de FNDG. Putâmen em ambos lados do cérebro é dissecado e pesado para obter o peso húmido. 0 tecido é homogeneizado e processado para conteúdo em FNDG por ELISA, e DA e metabolitos por HPLC. 0 conteúdo proteico das amostras também é medido.
Resultados A imunoquímica de FNDG deteta proteína FNDG no putâmen em todos os pontos temporais. Volume de distribuição (Vd) do FNDG é reduzido como uma função do tempo. A confirmação de coloração de FNDG é utilizada para validar de forma cruzada os dados de ELISA e HPLC. 1. Eliminação tecidular de FNDG apôs administração única
Em referência à Figura 6, após uma administração única de 3 doses de FNDG no putâmen, os níveis no tecido de FNDG diminuem como uma função da dose e do tempo
2. Regulação para cima de níveis de DA após administração única de FNDG A Figura 7 descreve um resultado possível de uma administraçao de dose unica no putâmen. Sao possíveis vários cenários, (i) o padrão da regulação para cima de DA seguirá estreitamente o dos níveis no tecido de FNDG, em cujo caso o efeito biológico de FNDG depende da presença de proteína FNDG. (ii) FNDG despoleta efeitos biológicos e eles persistem para lá dos níveis detetáveis no tecido de FNDG.
3. Níveis CSF de FNDG
Pode haver um pequeno aumento no FNDG às 0 semanas com níveis indetetáveis em todos os outros momentos.
4. Anticorpos FNDG Não foram detetados anticorpos FNDG em nenhum dos pontos temporais no CSF ou soro5.
Observações neuropatolôgicas
Apesar dos animais não serem perfundidos com formalina, o cerebelo poderia ser examinado para qualquer patologia. Não foi observada qualquer patologia.
Utilizando os métodos anteriores, são determinados a relação entre uma dose única de FNDG, a sua meia-vida tecidular e os seus efeitos biológicos no sistema DA em macacos. SUEEITOS:
Espécie: Macacos (cynomolgus ou rhesus)
Sexo: Macho ou fêmea Idade: jovem adulto a adulto Número: 39 Peso: 3-8 kg AGENTE EXPERIMENTAL:
Fator neurotrófico derivado da glia (FNDG)
Os grupos de tratamento são mostrados no Quadro 6 e os parâmetros de infusão são mostrados no Quadro 7. CALENDÁRIO DE AVALIAÇAO:
Imagem de ressonância magnética (IRM)
Administração intracranial de PBS/GDNF (via EPC) CSF e colheita de sangue:
Sobrevivência às 0 semanas: linha de base e pós-EPC Sobrevivência às 2 semanas: linha de base, pós-EPC e às 2 semanas pós-cirurgia
Sobrevivência às 4 semanas: linha de base, pós-EPC e às 2 e 4 semanas pós-cirurgia
Sobrevivência às 6 semanas: linha de base, pós-EPC e às 2, 4 e 6 semanas pós-cirurgia Eutanásia:
Nove (9) animais eutanasiados após procedimentos EPC
Nove (9) animais eutanasiados às 2 semanas pós-cirurgia
Nove (9) animais eutanasiados às 4 semanas pós-cirurgia
Nove (9) animais eutanasiados às 6 semanas pós-cirurgia
Três (3) animais (PBS) eutanasiados às 6 semanas pós-cirurgia NECROPSIA E PROCESSAMENTO DO TECIDO:
Após a eutanásia, é realizada uma perfusão cardíaca para introduzir sistemicamente 1 L de solução salina tamponada com fosfato. 0 cérebro é colhido, bloqueado em placas de 3 mm e congelado a fresco em isopentano arrefecido em gelo seco. Amostras representativas dos órgãos vitais são colhidas e processadas para exame histológico.
Processamento do tecido cerebral:
Blocos de cérebro congelado são montados num criostato e seis (6) secções coronais (20 pm de espessura) são colhidas de cada bloco que contém o putâmen. As secções são pós-fixadas e coradas para imuno-histoquímica de FNDG para avaliar a distribuição de FNDG.
As disseções são realizadas no tecido cerebral congelado remanescente para colher o núcleo do putâmen de cada bloco. 0 tecido do putâmen é pesado, homogeneizado e processado para conteúdo em FNDG por ELISA. Níveis de DA e metabolitos serão medidos por HPLC. DURAÇÃO DO ESTUDO:
Esperança de vida: 0 a 6 semanas após infusão EPC PARÂMETROS DE AVALIAÇAO DE VIDA:
IRM
Administração intracranial de PBS/FNDG Exames clínicos pós-cirurgia
Exames de saúde semanais
Colheita de sangue (5 ml, soro): pré-cirurgia, põs-EPC e às 2, 4 e 6 semanas pós-EPC
Colheita de CSF (1 ml) : pré-cirurgia, pós-EPC e às 2, 4 e 6 semanas pós-EPC NEUROPATOLOGIA E PARÊMTROS BIOQUÍMICOS:
É realizado ensaio de anticorpo de FNDG no soro e são colhidas amostras de CSF na pré-cirurgia, pós-EPC e às 2, 4 e 6 semanas pós-EPC 0 ensaio de FNDG é realizado em amostras de CSF recolhidas na pré-cirurgia, pós-EPC e às 2, 4 e 6 semanas pós- EPC Análise do tecido cerebral Nível de FNDG determinado por ELISA (ponto final primário) Razão DOPAC/DA determinada por HPLC (ponto final primário)
Imunocoloração de FNDG (ponto final primário) Imunocoloração de GFAP, TH, CD68 (ponto final secundário) Coloração com H&E (ponto final primário)
Ver também Hadaczek et al. , Human Gene Therapy, 17:1-12, 2006, incorporado aqui por referência na sua totalidade. Exemplo 3 : AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO FNDG NO CORPO ESTRIADO DE RATAZANA AAV2-FNDG foi infundido (EPC) para o corpo estriado de ratazana a doses diferentes e as ratazanas foram eutanasiadas em diferentes pontos temporais para analisar a correlação com o nível de expressão de FNDG ao longo do tempo. Ambos hemisférios foram infundidos com uma quantidade apropriada de AAV2-FNDG num volume total de 15 μΐ. Os grupos teste são ilustrados na Figura 8.
Foram realizados procedimentos cirúrgicos convencionais para EPC intraestriatal com as seguintes taxas de infusão: 0,2 μΐ/min durante 11 min, 0,5 μΐ/min durante 8 min e 0,8 μΐ/min durante 11 min. A concentração da proteína FNDG no tecido estriatal foi determinada por ELISA. Após a eutanásia, os cérebros foram rapidamente removidos e o corpo estriado foi dissecado bilateralmente e congelado imediatamente. As amostras foram homogeneizadas e expostas a tratamento por acidifícação. 0 nível tecidular de FNDG foi determinado em homogenados por Sistema de Imuno-ensaio de FNDG Emax® (Promega) . Para confirmar a expressão de FNDG, uma ratazana do grupo A foi utilizada para avaliação imuno-histoquímica (coloração DAB convencional com anticorpo policlonal de FNDG anti humano foi utilizadaà R&D Systems, 1:50)
Resultados: A transdução do corpo estriado de ratazana com AAV2-FNDG resultou na expressão da proteína FNDG no tecido cerebral numa forma dependente da dose (Figura 9). 0 nível da expressão do FNDG foi aumentando até 1 mês, momento em que atingiu a sua concentração constante dentro do tecido estriatal. A partir desse ponto temporal, para a dose máxima do vírus infundido (1,6511 vg), a quantidade média de FNDG detetada por ELISA foi ~ 11 ng/mg proteína tecidular. Doses mais baixas do vetor, 9,0710 vg e 1,6510 vg, resultaram em concentrações tecidulares de FNDG inferiores: ~ 6-7 ng/mg proteína tecidular e ~ 2-3 ng/mg proteína tecidular, respetivamente.
Exemplo 4 : AVALIAÇÃO DA ELIMINAÇÃO DE FNDG DO CÉREBRO DE RATAZANA Métodos: Para examinar a eliminação de FNDG do cérebro de ratazana desenhámos a experiência na qual entregámos proteína FNDG no corpo estriado através de EPC. Ambos hemisférios foram infundidos com 1 pg de FNDG num volume total de 15 μΐ. Realizámos 4 infusões semanais para verificar se existe algum efeito cumulativo. Cada semana 3 animais foram eutanasiadas para colheita de tecido cerebral. Ver Figura 10.
Foram realizados procedimentos cirúrgicos convencionais para EPC intraestriatal com as seguintes taxas de infusão: 0,2 μΐ/min durante 11 min, 0,5 μΐ/min durante 8 min e 0,8 μΐ/min durante 11 min. A concentração da proteína FNDG no tecido estriatal foi determinada por ELISA. Após eutanásia, os cérebros foram rapidamente removidos e o corpo estriado foi dissecado bilateralmente e congelado imediatamente. As amostras foram homogeneizadas e expostas a tratamento por acidifícação. 0 nível tecidular de FNDG foi determinado em homogenados por Sistema de Imuno-ensaio de FNDG Emax ® (Promega).
Resultados: Entrega semanal de proteína FNDG para o corpo estriado de ratazana resultou no seu nível constante no tecido cerebral. As concentrações médias foram 32,9Ã 26,6Â 29,OÃ e 28,8 pg/mg proteína na semana 1, 2, 3 e 4, respetivamente. (Figura 11)
Exemplo 5: CURSO DE TEMPO DA ELIMINAÇÃO DE FNDG DE CÉREBRO DE RATAZANA A proteína FNDG foi infundida para o corpo estriado e as ratazanas foram eutanasiadas em diferentes pontos temporais para analisar o curso de tempo da eliminação de FNDG do cérebro. A quantidade de FNDG foi medida por ELISA. FNDG (de NIHÂ 10 pg/30 μΐ) : 0,33 pg/μΐ Foi escolhida uma dose:
O stock original foi diluído 1:2 com PBS 40 μΐ + 80 μΐ PBS = 120 μΐ por linha (0,11 μg/μl) 15 μΐ será infundido em cada hemisfério (quantidade total: 1.65 μg FNDG por hemisfério) 2 ratazanas por ponto temporal (4 hemisférios) taxa de infusão EPC: 0,2 μΐ/min = 11 min 0,5 μΐ/min = 8 minà 0,8 μΐ/min = 11 minà 15 μΐ, 30 min total. (Figura 12) . As publicações seguintes são descritas Varon et al. , Ann. Rev. Neuroscience, 1:327, 1979à Thoenen et al. , Science, 229:238, 1985) Thoenen, Trends. Neurosci. 14:165-170, 1991 Lapchak et at., Rev. Neurosci., 3:1-10, 1993 Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18:223-253, 1995à Lapchak et al. , Rev.
Neurosci. 3:1-10, 1993Ã Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18:223-253, 1995Â Chao et al., TINS 18:321-326, 1995Â Lin et al., Science 260:1130-1132, 1993Ã Krieglstein et al. , EMBO 0 . 14:736-742, 1995Ã Poulsen et al. , Neuron 13:1245-1252, 1994Ã Lin et al., Science 260:1130-1132, 1993Â Hudson et al., Brain
Res. Bull. 36:425-432Â 1995Ã Beck et al., Nature 373:339-341, 1995Â Tomac et al., Nature 373:335-339, 1995Â Hoffer et al., Neurosci. Lett. 182:107-111, 1994Â Qppenheim et al. , Nature 373:344-346, 1995Ã Zurn et al., Neuroreport 6:113-118, 1994Â Yan et al. , Nature 373 : 341-344 , 1995Â Henderson et. al. , Science 266:1062-1064, 1994Ã Sariola et al., É. Cell Sci., 2003 Oct 1 Ã116(Pt 19):3855-62Ã Venero et al., Neuroreport 4:959-962, 1993Ã Hefti, É, Neurobiol. 25:1418-1435, 1994Â Olson,
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Quadro 1
Quadro 2
Quadro 3
Quadro 4
Quadro 5
_Quadro 6_
Quadro 7
REFERÊNCIAS/zCITADAS/aNA^DESCRIÇÃO/z A lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. Não constitui uma parte integrante do documento de patente europeu. Embora a compilação das referências tenha sido feita com grande cuidado, não são de excluir erros ou omissões e o EPO não aceita qualquer responsabilidade a esse respeito.
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Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES1/!
    1. Uma composição farmacêutica para utilização num método de tratar um mamífero com um distúrbio do sistema nervoso central (SNC) , em que dita composição compreende um fator neurotrófico e é administrada por entrega potenciada por convecção (EPC) intermitente ao SNC de dito mamífero a uma taxa que opõe a taxa de eliminação tecidular de dito fator neurotróf ico e em que dita administração mantém uma dose terapêutica eficaz do fator neurotrófico, em que as intervalos entre administração do dito fator neurotrófico são pelo menos cerca de uma semana.
  2. 2. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que dita composição farmacêutica compreende ainda um agente de rastreamento.
  3. 3. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que dito método compreende ainda determinar a taxa de eliminação tecidular de dito fator neurotrófico.
  4. 4. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que dita EPC compreende aumentos incrementais na taxa de fluxo.
  5. 5. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a composição farmacêutica é entregue com a utilização de uma cânula de desenho de etapa livre de refluxo compatível com EPC.
  6. 6. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o agente de rastreamento compreende um imã MRI ou um agente detetável por CT.
  7. 7. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 6, em que dito agente de rastreamento é um quelato de gadolínio.
  8. 8. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que dito agente de rastreamento está encapsulado num lipossoma.
  9. 9. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que dito fator neurotrõfico é selecionado do grupo que consiste em FNDG, FCN, FNDC, NT-3, NT-4/5, NT-6, neurturina, persefina e artemina.
  10. 10. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que dito distúrbio do SNC é selecionado do grupo que consiste em doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica (ELA), derrame cerebral, trauma na cabeça, lesão da medula espinhal, esclerose múltipla, demência com corpos de Lewy, degeneração retinal, epilepsia, distúrbios psiquiátricos, distúrbios do equilíbrio hormonal e degeneração coclear.
  11. 11. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1 em que dito fator neurotrõfico é FNDG e dito distúrbio do SNC é doença de Parkinson.
  12. 12. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o tratamento é para promover a sobrevivência de uma população neuronal responsiva a fator neurotrõfico no SNC de mamífero, em que dita composição é administrada conforme definido na reivindicação 1 e em que dito método compreende: entregar localmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um fator neurotrõfico a um tecido alvo do SNC que compreende uma população neuronal responsiva a dito fator neurotrófico.
  13. 13 . A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o tratamento é para reduzir a morte de neurónios responsivos a fator neurotrófico do SNC de mamífero, em que dita composição é administrada conforme definido na reivindicação 1 e em que dito método compreende: entregar localmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um fator neurotrófico a um tecido alvo do SNC que compreende uma população neuronal responsiva a dito fator neurotrófico, cuja população neuronal está em risco de sofrer morte celular na ausência de intervenção.
  14. 14 . A composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que dita utilização compreende três ou mais administrações, em que as durações de duas ou mais intervalos são variadas em duração.
  15. 15. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, em que a duração das intervalos aumenta com o tempo.
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