JP6732998B2 - 遺伝学的に修飾された非ヒト動物およびその使用法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、2012年9月7日出願の米国仮出願第61/698,002号および2013年3月8日出願の米国仮出願第61/775,171号に基づく優先権を主張するものであり、それらの各々の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。

発明の背景
生物医学的研究の目標は、ヒト生理学についてのよりよい理解を取得し、ヒト疾患を予防するか、処置するか、または治癒させるために、この知識を使用することである。ヒト対象における実験法に対する実務上および倫理上の障壁のため、多くの研究が、マウスのような小動物モデルにおいて実施されている。しかしながら、マウスは人間ではなく、動物実験から取得された知識は、必ずしもヒトに適用可能ではない。これに関して、ヒト血液リンパ系（HHLS）を定植されたマウスは、インビボのヒトの造血および免疫の機能の研究のために有用な小動物モデルを表す。

HHLSマウスは、免疫応答の自然アームおよび適応アームが欠損しているレシピエントマウスへのヒト造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）および／またはヒト胎児組織の移植によって生成される。HHLSマウスの最初のモデルは、1980年代後期に開発され（Mosier et al.,1988,Nature 335:256-259（非特許文献１）；McCune et al.,1988,Science 241:1632-1639（非特許文献２）；Kamel-Reid and Dick,1988,Science 242:1706-1709（非特許文献３））、それ以来、一連の改良を受けてきた（Legrand et al.,2006,Journal of Immunology 176:2053-2058（非特許文献４）；Shultz et al.,2007,Nature Reviews Immunology 7:118-130（非特許文献５））。ヒト造血系の生着のためのレシピエントとして現在使用されているマウスの系統は、三つの特徴を共有している。第一に、それらは、PRKDCタンパク質をコードする遺伝子におけるScid変異のため（Mosier et al.,1988,Nature 335:256-259（非特許文献１）；McCune et al.,1988,Science 241:1632-1639（非特許文献２））、または2種のRag遺伝子のうちの1種の欠失のため（Shultz et al.,2000,Journal of immunology 164:2496-2507（非特許文献６）；Traggiai et al.,2004,Science 304:104-107（非特許文献７））、B細胞およびT細胞を欠く。第二に、サイトカイン受容体の共通のγ鎖（γ_c）をコードするIl2rg遺伝子の欠失または変異が、IL-15シグナリングを消失させ、NK細胞の欠如をもたらす（Traggiai et al.,2004,Science 304:104-107（非特許文献７）；Ito et al.2002,Blood 100:3175-3182（非特許文献８））。第三に、マウスマクロファージ上に発現されたSIRPA受容体とヒト細胞上のCD47リガンドとの間の相互作用が、マウスマクロファージへ阻害シグナルを提供し、ヒト異種移植片に対する食作用寛容を付与する（Takenaka et al.,2007,Nature Immunology 8:1313-1323（非特許文献９）；Takizawa & Manz,2007,Nature Immunology 8:1287-1289（非特許文献１０））。Sirpa遺伝子の天然多形を含有しているNOD遺伝的背景を使用する時（Takenaka et al.,2007,Nature Immunology 8:1313-1323（非特許文献９）；Takizawa & Manz,2007,Nature Immunology 8:1287-1289（非特許文献１０）；Legrand et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:13224-13229（非特許文献１１））、またはヒトSIRPA遺伝子のBACトランスジェニック発現によって（Strowig et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:13218-13223（非特許文献１２））、マウス細胞上に発現されたSIRPAとヒトCD47との間の異種間相互作用が達成される。NOD Scidγ_c ^-/-（NOG（Ito et al.2002,Blood 100:3175-3182（非特許文献８））もしくはNSG（Ishikawa et al.,2005,Blood 106:1565-1573（非特許文献１３）））マウスまたはhSIRPA^tgRAG2^-/-γ_c ^-/-（SRG（Strowig et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:13218-13223）（非特許文献１２））マウスをレシピエントとして使用する時、ヒトHSPC移植によって、高レベルのヒト造血細胞の生着が達成される。

これらのレシピエント系統においては、ヒト多系統造血系発達が観察されるが、大部分のヒト細胞型の終末分化、ホメオスタシス、および／またはエフェクター機能が、最適でない。この状態は、マウス組織によって分泌されるサイトカインと造血細胞上に発現されたヒト受容体との間の交差反応性の低下または欠如によると仮定されている（Manz,2007,Immunity 26:537-541（非特許文献１４）；Willinger et al.,2011,Trends in Immunology 32:321-327（非特許文献１５））。この限界を超えるため、マウス宿主へヒトサイトカインを送達するための数種の戦略が開発されている。これらの方法には、組換えサイトカインの注射（Lapidot et al.,1992,Science 255:1137-1141（非特許文献１６）；van Lent et al.,2009,J.Immunol 183:7645-7655（非特許文献１７））、サイトカインをコードするcDNAのレンチウイルス送達（O'Connell et al.,2010,PloS One 5(8):e12009（非特許文献１８））、プラスミドDNAの流体力学的注射（Chen et al.,2009,Proc Natl Acad Sci USA 106:21783-21788（非特許文献１９））、cDNAのトランスジェニック発現（Nicolini et al.,et al.,2004,Leukemia 18(2):341-347（非特許文献２０）；Brehm et al.,2012,Blood 119:2778-2788（非特許文献２１）；Takagi et al.,2012,Blood 119:2768-2777（非特許文献２２））、またはサイトカインをコードする遺伝子のノックイン交換（Rongvaux et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:2378-2383（非特許文献２３）；Willinger et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:2390-2395（非特許文献２４）；Rathinam et al.,2011,Blood 118:3119-3128（非特許文献２５））が含まれる。後者の方法は、ヒト遺伝子のより生理学的な発現という利点を有する。さらに、ヒトサイトカインがマウス受容体に対して完全には交差反応性でない場合、それはマウス細胞集団において欠陥を誘導し、付加的な競合上の優越をヒト細胞へ付与することができる。ノックイン遺伝子交換戦略を使用した、トロンボポエチンをコードする遺伝子（Tpo）のヒト化は、機能性ヒト造血幹細胞のよりよい維持および骨髄における生着の増加をもたらし（Rongvaux et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:2378-2383（非特許文献２３））；インターロイキン-3およびGM-CSFをコードする遺伝子（Il3およびCsf2）の交換は、マウス肺胞マクロファージ（AM）の損失および機能性ヒトAMの発達を誘導し（Willinger et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:2390-2395（非特許文献２４））；M-CSFをコードするCsf1遺伝子の置換は、複数の組織におけるヒト単球の数の増加をもたらした（Rathinam et al.,2011,Blood 118:3119-3128（非特許文献２５））。

ヒトおよびマウスの造血リンパ系は、多くの局面において異なっている（Haley,2003,Toxicology 188:49-71（非特許文献２６）；Mestas & Hughes,2004,J Immunol 172:2731-2738（非特許文献２７））。2種の間の主要な差違のうちの一つは、白血球（WBC）百分率にある。ヒト血液は、総WBCの50〜75％を占める骨髄系細胞に富んでいる。対照的に、マウス血液においては、リンパ球が優勢であって、WBCの20〜30％のみが脊髄系統のものである。この種差は、その機能上および進化上の意義は理解されていないが、NOG/NSGまたはSRGのような従来のHHLSマウスにおいては再現されない。実際、これらの宿主においては、ヒト脊髄系の発達が特に欠損しており、骨髄系細胞はヒトWBCのわずか5〜10％を占めている。

機能性のヒト免疫系を有するマウスの一つの適用は、ヒトワクチンの開発および試験である。歴史的に、インビボの免疫応答の誘導は、比較的非効率的であった（2004,Traggiai et al.,Science 304:104-107（非特許文献７）; 2002、Ito et al.,Blood 100:3175-3182（非特許文献８）; 2005、Ishikawa et al.,Blood 106:1565-1573（非特許文献１３）; 2005、Shultz et al.,J Immunol 174:6477-6489（非特許文献２８）;2006、Baenziger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 103:15951-15956（非特許文献２９））。いくつかの研究は、感染時の病原体特異的な免疫応答の成功を報告した。デングウイルス感染時に、マウスのおよそ50％が、ウイルス特異的なIgMおよびIgGを産生することが報告されたが（2007,Kuruvilla et al.Virology 369:143-152（非特許文献３０））、他の研究は、HIVおよびEBVの感染後に抗原特異的なIgMおよびIgGを産生するマウスの頻度が20％未満であることを報告した（2006,Baenziger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 103:15951-15956（非特許文献２９）;2008、Yajima et al.,J Infect Dis 198:673-682（非特許文献３１））。アジュバントおよび抗原によって免疫感作した時、抗原特異的な免疫グロブリンのクラススイッチも歴史的に非効率的であり、免疫感作された動物のうちの一部のみが、抗原特異的なIgG応答を示す（2004,Traggiai et al.,Science 304:104-107（非特許文献７）; 2002、Ito et al.,Blood 100:3175-3182（非特許文献８）;2005、Ishikawa et al.,Blood 106:1565-1573（非特許文献１３）; 2005、Shultz et al.,J Immunol 174:6477-6489（非特許文献２８）;2009、Watanabe et al.,Int Immunol 21:843-858（非特許文献３２）;2010、Becker et al.,PLoS ONE 5（非特許文献３３））。これらの研究は、NSGマウスおよびBALB/c RAG2^-/-γ_c ^-/-マウス、ならびに種々のアジュバント／抗原の組み合わせを含んでいた。

ヒト造血細胞の生着を支持し、持続させることができるヒト化非ヒト動物が、当技術分野において必要とされている。本発明は、当技術分野におけるこの満たされていない必要性を解決する。

Mosier et al.,1988,Nature 335:256-259 McCune et al.,1988,Science 241:1632-1639 Kamel-Reid and Dick,1988,Science 242:1706-1709 Legrand et al.,2006,Journal of Immunology 176:2053-2058 Shultz et al.,2007,Nature Reviews Immunology 7:118-130 Shultz et al.,2000,Journal of immunology 164:2496-2507 Traggiai et al.,2004,Science 304:104-107 Ito et al.2002,Blood 100:3175-3182 Takenaka et al.,2007,Nature Immunology 8:1313-1323 Takizawa & Manz,2007,Nature Immunology 8:1287-1289 Legrand et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:13224-13229 Strowig et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:13218-13223 Ishikawa et al.,2005,Blood 106:1565-1573 Manz,2007,Immunity 26:537-541 Willinger et al.,2011,Trends in Immunology 32:321-327 Lapidot et al.,1992,Science 255:1137-1141 van Lent et al.,2009,J.Immunol 183:7645-7655 O'Connell et al.,2010,PloS One 5(8):e12009 Chen et al.,2009,Proc Natl Acad Sci USA 106:21783-21788 Nicolini et al.,et al.,2004,Leukemia 18(2):341-347 Brehm et al.,2012,Blood 119:2778-2788 Takagi et al.,2012,Blood 119:2768-2777 Rongvaux et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:2378-2383 Willinger et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:2390-2395 Rathinam et al.,2011,Blood 118:3119-3128 Haley,2003,Toxicology 188:49-71 Mestas & Hughes,2004,J Immunol 172:2731-2738 2005,Shultz et al.,J Immunol 174:6477-6489 2006,Baenziger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 103:15951-15956 2007,Kuruvilla et al.Virology 369:143-152 2008,Yajima et al.,J Infect Dis 198:673-682 2009,Watanabe et al.,Int Immunol 21:843-858 2010,Becker et al.,PLoS ONE 5

本発明は概して、ヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOのうちの少なくとも1種を発現する遺伝学的に修飾された非ヒト動物、ならびにその使用法に関する。従って、一つの態様において、本発明は、プロモーターに機能的に連結されたヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群のうちの少なくとも1種をコードする少なくとも1種の核酸を含むゲノムを含み、かつヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群より選択される少なくとも1種のポリペプチドを発現する、遺伝学的に修飾された非ヒト動物である。別の態様において、本発明は、各々プロモーターに機能的に連結されたヒトM-CSFをコードする核酸、ヒトIL-3をコードする核酸、ヒトGM-CSFをコードする核酸、ヒトSIRPAをコードする核酸、およびヒトTPOをコードする核酸を含むゲノムを含み、かつヒトM-CSFポリペプチド、ヒトIL-3ポリペプチド、ヒトGM-CSFポリペプチド、ヒトSIRPAポリペプチド、およびヒトTPOポリペプチドを発現する、遺伝学的に修飾された非ヒト動物である。いくつかの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物は免疫不全である。いくつかの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、組換え活性化遺伝子2を発現しない（Rag-2-/-）。いくつかの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、IL2受容体γ鎖を発現しない（γ鎖-/-）。いくつかの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、Rag-2を発現せず、かつIL2受容体γ鎖を発現しない（Rag-2-/- γ鎖-/-）。いくつかの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物はげっ歯類である。いくつかの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物はマウスである。一つの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、少なくとも1種のヒト造血細胞も含む。一つの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、少なくとも1種のヒト癌細胞も含む。いくつかの態様において、ヒト癌細胞は白血病細胞または黒色腫細胞である。

別の態様において、本発明は、ヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群のうちの少なくとも1種を発現する遺伝学的に修飾された動物へ少なくとも1種のHSPCを投与する工程を含む、ヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群のうちの少なくとも1種を発現する遺伝学的に修飾された非ヒト動物における造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）生着の方法である。いくつかの態様において、HSPCはヒトHSPCである。一つの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物はげっ歯類である。一つの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物はマウスである。一つの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物は免疫不全である。一つの態様において、遺伝学的に修飾された免疫不全非ヒト動物は組換え活性化遺伝子2を発現しない（Rag-2-/-）。一つの態様において、遺伝学的に修飾された免疫不全非ヒト動物は内在性IL2受容体を発現しない（γ鎖-/-）。一つの態様において、遺伝学的に修飾された免疫不全非ヒト動物は、内在性Rag-2を発現せず、かつ内在性γ鎖を発現しない（Rag-2-/- γ鎖-/-）。一つの態様において、遺伝学的に修飾された動物はヒト癌細胞を含む。一つの態様において、ヒト癌細胞は白血病細胞または黒色腫細胞である。

別の態様において、本発明は、少なくとも1種のプロモーターに機能的に連結されたヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群のうちの少なくとも1種をコードする少なくとも1種の核酸を含むゲノムを有し、かつヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群より選択される少なくとも1種のポリペプチドを発現する、遺伝学的に修飾されたRag-2-/- γ鎖-/-マウスである。一つの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、各々プロモーターに機能的に連結されたヒトM-CSFをコードする核酸、ヒトIL-3をコードする核酸、ヒトGM-CSFをコードする核酸、ヒトSIRPAをコードする核酸、およびヒトTPOをコードする核酸を有するゲノムを含み、かつヒトM-CSFポリペプチド、ヒトIL-3ポリペプチド、ヒトGM-CSFポリペプチド、ヒトSIRPAポリペプチド、およびヒトTPOポリペプチドを発現する。一つの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物はげっ歯類である。一つの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物はマウスである。一つの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物はヒト造血細胞をさらに含む。一つの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物はヒト癌細胞を含む。いくつかの態様において、ヒト癌細胞は白血病細胞または黒色腫細胞である。

[本発明1001]
プロモーターに機能的に連結されたヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群のうちの少なくとも1種をコードする少なくとも1種の核酸を含むゲノムを含み、かつヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群より選択される少なくとも1種のポリペプチドを発現する、遺伝学的に修飾された非ヒト動物。
[本発明1002]
各々プロモーターに機能的に連結されたヒトM-CSFをコードする核酸、ヒトIL-3をコードする核酸、ヒトGM-CSFをコードする核酸、ヒトSIRPAをコードする核酸、およびヒトTPOをコードする核酸を含むゲノムを含み、かつヒトM-CSFポリペプチド、ヒトIL-3ポリペプチド、ヒトGM-CSFポリペプチド、ヒトSIRPAポリペプチド、およびヒトTPOポリペプチドを発現する、本発明1001の遺伝学的に修飾された非ヒト動物。
[本発明1003]
免疫不全である、本発明1001の遺伝学的に修飾された非ヒト動物。
[本発明1004]
組換え活性化遺伝子2を発現しない（Rag-2^-/-）、本発明1003の遺伝学的に修飾された免疫不全非ヒト動物。
[本発明1005]
IL2受容体γ鎖を発現しない（γ鎖^-/-）、本発明1003の遺伝学的に修飾された免疫不全非ヒト動物。
[本発明1006]
Rag-2を発現せず、かつIL2受容体γ鎖を発現しない（Rag-2^-/- γ鎖^-/-）、本発明1003の遺伝学的に修飾された免疫不全非ヒト動物。
[本発明1007]
げっ歯類である、本発明1001の遺伝学的に修飾された非ヒト動物。
[本発明1008]
マウスである、本発明1001の遺伝学的に修飾された非ヒト動物。
[本発明1009]
ヒト造血細胞をさらに含む、本発明1001の遺伝学的に修飾された動物。
[本発明1010]
ヒト癌細胞をさらに含む、本発明1001の遺伝学的に修飾された動物。
[本発明1011]
ヒト癌細胞が白血病細胞または黒色腫細胞である、本発明1010の遺伝学的に修飾された動物。
[本発明1012]
ヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群のうちの少なくとも1種を発現する遺伝学的に修飾された動物へ少なくとも1種のHSPCを投与する工程を含む、ヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群のうちの少なくとも1種を発現する遺伝学的に修飾された非ヒト動物における造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）生着の方法。
[本発明1013]
遺伝学的に修飾された非ヒト動物がげっ歯類である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
遺伝学的に修飾された非ヒト動物がマウスである、本発明1012の方法。
[本発明1015]
遺伝学的に修飾された非ヒト動物が免疫不全である、本発明1012の方法。
[本発明1016]
遺伝学的に修飾された免疫不全非ヒト動物が組換え活性化遺伝子2を発現しない（Rag-2^-/-）、本発明1015の方法。
[本発明1017]
遺伝学的に修飾された免疫不全非ヒト動物が内在性IL2受容体を発現しない（γ鎖^-/-）、本発明1015の方法。
[本発明1018]
遺伝学的に修飾された免疫不全非ヒト動物が、内在性Rag-2を発現せず、かつ内在性γ鎖を発現しない（Rag-2^-/- γ鎖^-/-）、本発明1015の方法。
[本発明1019]
遺伝学的に修飾された動物がヒト癌細胞を含む、本発明1012の方法。
[本発明1020]
ヒト癌細胞が白血病細胞または黒色腫細胞である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
少なくとも1種のプロモーターに機能的に連結されたヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群のうちの少なくとも1種をコードする少なくとも1種の核酸を含むゲノムを有し、ヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOからなる群より選択される少なくとも1種のポリペプチドを発現する、遺伝学的に修飾されたRag-2^-/-γ鎖^-/-マウス。
[本発明1022]
各々プロモーターに機能的に連結されたヒトM-CSFをコードする核酸、ヒトIL-3をコードする核酸、ヒトGM-CSFをコードする核酸、ヒトSIRPAをコードする核酸、およびヒトTPOをコードする核酸を含むゲノムを含み、かつヒトM-CSFポリペプチド、ヒトIL-3ポリペプチド、ヒトGM-CSFポリペプチド、ヒトSIRPAポリペプチド、およびヒトTPOポリペプチドを発現する、本発明1021の遺伝学的に修飾された非ヒト動物。
[本発明1023]
げっ歯類である、本発明1021の遺伝学的に修飾された非ヒト動物。
[本発明1024]
マウスである、本発明1021の遺伝学的に修飾された非ヒト動物。
[本発明1025]
ヒト造血細胞をさらに含む、本発明1021の遺伝学的に修飾された動物。
[本発明1026]
ヒト癌細胞をさらに含む、本発明1021の遺伝学的に修飾された動物。
[本発明1027]
ヒト癌細胞が白血病細胞または黒色腫細胞である、本発明1026の遺伝学的に修飾された動物。
本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に参照された時、よりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的のため、現在好ましい態様が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示された態様の正確な配置および手段に限定されないことが、理解されるべきである。

図1A〜1Eを含む図1は、MISTRGマウスが高レベルのヒト造血系の生着を支持することを示す実験の結果を示す。示された系統の、X線によって前処理された新生仔マウスに、肝臓内注射によって、100,000個のヒト胎児肝臓-（FL-）CD34⁺細胞を生着させた。7〜9週後の血液および10〜12週後のBMにおいて、ヒト生着レベル（hCD45⁺細胞）を測定した。（図1A）示されたレシピエントマウスの血液およびBMにおけるマウスおよびヒトのCD45⁺細胞の頻度の代表的なフローサイトメトリー分析。ゲートエリアの隣の数字は、総CD45⁺細胞に対する百分率を示す。（図1B）19回の独立した実験から組み合わせられた血中生着レベル（％hCD45⁺細胞）のデータ。各実験において、単一のFL-CD34⁺細胞試料を分割し、それぞれの系統のマウスへ注射した。各記号は、個々のマウスを表し、赤色のバーは平均値を示す（n＝56〜155；ns、非有意；^* p＜0.05 チューキー法（完全な統計分析については図6を参照のこと）。灰色の水平線は10％hCD45⁺細胞を示す。（図1C）パネル（図6B）からの代表的なマウスのサブセット（図6C）のBMにおける生着レベル（n＝12〜16；^* p＜0.05 チューキー法；図6D〜6Eも参照のこと）。（図1D）未照射新生仔MISTRGマウスへの200,000個のFL-CD34⁺細胞の肝臓内注射の3ヶ月後の血液およびBMにおけるhCD45⁺細胞生着の代表的なフローサイトメトリー分析。（図1E）（図1D）のように移植されたMISTRGマウスの血液およびBMにおけるヒトCD45⁺細胞生着レベル（n＝16）。この場合、（血中hCD45⁺＜10％のマウスを含む）全てのマウスのBMが示されている。 図1Aの説明に記載のとおりである。 図1Aの説明に記載のとおりである。 図1Aの説明に記載のとおりである。 図1Aの説明に記載のとおりである。 図2A〜2Kを含む図2は、MISTRGマウスが、リンパ組織および非リンパ組織における効率的な骨髄系の発達および維持を支持することを示す実験の結果を示す。（図2A）新生仔の時にX線による前処理の後で肝臓内注射によってFL-CD34⁺細胞を生着させられた示されたレシピエントマウスの血中のヒト造血細胞（hCD45⁺）のうちのヒト骨髄系細胞（hCD33⁺）の百分率。各記号は、個々のマウスを表し、赤色のバーは平均値を示す（n＝20〜113；統計分析は図7Aに示される）。（図2B）同一マウスにおけるヒトWBC組成（n＝20〜113マウス／群；n＝8ヒトドナー；エラーバーはSEMを示す）。（図2C）示されたレシピエントマウスの非リンパ組織におけるヒト骨髄系細胞（hCD68⁺）の免疫組織学的染色。黒色のバーは20μmを表し、示された画像は、各群少なくとも3匹の分析されたマウスの代表である。（図2Dおよび図2E）レシピエントマウスの血中のhCD45⁺CD33⁺細胞のうちの、CD14およびCD16の発現によって同定されたヒト単球サブセットの代表的なフローサイトメトリー分析（図2D）および頻度（図2E）（n＝8〜12マウス／群；エラーバーはSEMを示す）。（図2Fおよび図2G）MITRGレシピエントのBMから単離され、LPS（図2F）またはR848（図2G）によってインビトロで刺激されたヒト単球によるサイトカイン産生（エラーバーは、トリプリケートのSDを示す；3回の独立した実験の代表）。（図2H）MITRGマウスの血中に存在するヒト細胞によるGFP発現大腸菌のインビトロ食作用（n＝7）。（図2I、2J、2K）LPSによって処理されたマウス（図I；90分、n＝15〜18）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）に感染したマウス（図2J；2日目、n＝6〜15）、またはインフルエンザA/PR8 H1N1に感染したマウス（図2K；3日目、n＝3〜5）の血清におけるELISAまたは肺におけるRT-PCRによって測定されたインビボサイトカイン産生。（図2A、2J、2K）一元配置のANOVA後のチューキーの事後検定によって計算されたp値（^* p＜0.05）；（図2I）log10変換値に対する独立スチューデントt検定によって計算されたp値。 図2Aの説明に記載のとおりである。 図2Aの説明に記載のとおりである。 図2Aの説明に記載のとおりである。 図2Aの説明に記載のとおりである。 図2Aの説明に記載のとおりである。 図2Aの説明に記載のとおりである。 図2Aの説明に記載のとおりである。 図2Aの説明に記載のとおりである。 図2Aの説明に記載のとおりである。 図2Aの説明に記載のとおりである。 図3A〜3Iを含む図3は、MISTRGマウスがヒトNK細胞の発達および機能を効率的に支持することを示す実験の結果を示す。（図3A）生着NSGマウス、生着MITRGマウス、および生着MISTRGマウスの肝臓におけるヒトIL-15およびヒトIL-15RαのmRNA発現の定量的RT-PCR分析（n＝7〜8；一元配置のANOVAによって計算されたp値；^* p＜0.05 チューキーの事後検定）。発現はマウスHprtに対して標準化された。（図3B）生着MITRGの骨髄から精製されたヒト細胞集団におけるヒトIL-15およびヒトIL-15RαのmRNA発現の定量的RT-PCR分析（n＝4〜5、エラーバーはSEMを示す）。発現は、ヒトHPRTに対して標準化されており、hCD14⁺hCD16^-細胞に対して相対的に示される。（図3Cおよび図3D）生着NSG、生着MITRG、および生着MISTRGにおけるヒトNK細胞（hNKp46⁺hCD3^-）の代表的なフローサイトメトリー分析（hCD45⁺mCD45^-細胞、リンパ球ゲートに対してゲーティング；輪郭付きのエリアの隣の数字は細胞の百分率を示す）（図3C）および絶対数または頻度（図3D）（n＝8〜16；一元配置のANOVAによって計算されたp値；^* p＜0.05 チューキーの事後検定）。（図3E）未処理のままにされたか、または食細胞を枯渇させるためリポソームに封入されたクロドロン酸によって3日間連続で処理された生着MISTRGマウスからのヒト肝臓NK細胞（hNKp46⁺hCD3^-）およびT細胞（hCD3⁺、対照として示される）の絶対数（n＝8；独立スチューデントt検定によって計算されたp値；ns、非有意）。（図3F）標識されたLCL721.221（HLAクラスI陰性）細胞およびLCL721.45（クラスI陽性）細胞を1:1比で静脈内注射し、脾臓において12時間後に回収された標識された細胞のうちのHLAクラスI陽性または陰性の割合を使用して、特異的なNK細胞による細胞傷害を計算した（n＝8、独立スチューデントt検定によって計算されたp値）。（図3G）リステリア感染の2日後のNSGマウスおよびMISTRGマウスの肝臓におけるヒトIFNγmRNA発現の定量的RT-PCR分析（n＝8〜9、独立スチューデントt検定によって計算されたp値）。発現はマウスHprtに対して標準化された。（図3Hおよび図3I）未感染のまたはリステリアに感染したNSGマウスおよびMISTRGマウスからのIFNγ発現脱顆粒（CD107a⁺）ヒト肝臓NK細胞の代表的なフローサイトメトリー分析（図3H）および頻度（図3I）（n＝4〜11；一元配置のANOVAによって計算されたp値）。結果は、2回（図3A、3E〜3I）、3回（図3B）、または4回（図3C、3D）の実験から組み合わせられたものである。 図3Aの説明に記載のとおりである。 図3Aの説明に記載のとおりである。 図3Aの説明に記載のとおりである。 図3Aの説明に記載のとおりである。 図3Aの説明に記載のとおりである。 図3Aの説明に記載のとおりである。 図3Aの説明に記載のとおりである。 図3Aの説明に記載のとおりである。 図4A〜4Fを含む図4は、MISTRGにおけるヒト骨髄系細胞が、腫瘍に浸潤し、その増殖を支持することを示す実験の結果を示す。生着あるいは非生着NSGマウスおよびMISTRGマウスの側腹部に、ヒト黒色腫細胞株Me290を植え込んだ。数匹のマウスをVEGF阻害剤Avastin（商標）によって処理した。11日後に腫瘍を測定し、分析のため解剖した。（図4A）ヒト造血系マーカー（CD45をコードするPTPRC）および骨髄系マーカー（CD11bをコードするITGAM）をコードするmRNAの発現によって決定された、腫瘍へのヒト造血細胞の浸潤（n＝6〜7；独立スチューデントt検定によって計算されたp値）。（図4Bおよび図4D）NSG、MISTRG、および患者からの腫瘍におけるヒト骨髄系細胞マーカーの代表的な免疫組織化学画像。（図4C）CD163⁺細胞の密度の定量化（n＝3試料／群、各試料について3枚のスライドを計数した）。（図4Eおよび図4F）示されたマウスの群における腫瘍の代表的な画像（図4E）および体積（図4F）（n＝7〜24マウス／群）。p値は、スチューデントt検定（図4A）または一元配置のANOVA（図4C、4E）後のチューキーの事後検定によって計算された（^* p＜0.05）。 図4Aの説明に記載のとおりである。 図4Aの説明に記載のとおりである。 図4Aの説明に記載のとおりである。 図4Aの説明に記載のとおりである。 図4Aの説明に記載のとおりである。 HSC機能および骨髄系発達に関与するサイトカインを示す。造血幹細胞の骨髄系細胞への発達の概略図およびこの過程を制御することが公知のサイトカインの非網羅的なリスト。影は、ヒトサイトカインとマウスサイトカインとの間のアミノ酸同一性の百分率を示す。アミノ酸同一性の百分率は、異種間のタンパク質保存の最も客観的な尺度であるが、インビボの機能的な異種間交差反応性とは必ずしも相関しない。黒色の長方形は、MISTRGにおいて遺伝学的にヒト化されたサイトカインを示す。HSC、造血幹細胞；MPP、多能性前駆細胞；CMP、共通骨髄系前駆細胞；GMP、顆粒球／マクロファージ前駆細胞；MEP、巨核球／赤血球前駆細胞。 図6A〜6Eを含む図6は、レシピエントマウスにおける生着レベルの統計分析の結果を示す。（図6A）図1Aに提示されたデータ（レシピエントマウスの血中のhCD45⁺細胞の百分率）の統計分析（一元配置のANOVA後のチューキーの事後検定；ns、非有意）。（図6B）移植の7〜9週後に少なくとも10％の血中hCD45⁺細胞という生着レベルに到達するレシピエントマウスの数。（図6C）BMの分析のために図1Cにおいて使用されたマウスの血中生着レベル。（図6D）図1Cに提示されたデータ（レシピエントマウスのBMにおけるhCD45⁺細胞の百分率）の（図6A）に類似した統計分析。（図6E）図1Cに示されたレシピエントマウスのBM（2大腿骨および2頸骨）におけるhCD45⁺細胞の絶対数。MISTRGのBMにおける細胞の数の低下は、その齢（移植後10〜12週）におけるマウスのより小さいサイズによるものであり、図10に詳細に記載される貧血の最初の臨床的徴候によって引き起こされる。 図6Aの説明に記載のとおりである。 図6Aの説明に記載のとおりである。 図6Aの説明に記載のとおりである。 図6Aの説明に記載のとおりである。 図7A〜7Hを含む図7は、MISTRGマウスにおける増強されたヒト骨髄系発達を査定した実験の結果を示す。（図7A）図2Aに提示されたデータ（レシピエントマウスの血中のhCD33⁺細胞の百分率）の統計分析（一元配置のANOVA後のチューキーの事後検定；ns、非有意）。（図7Bおよび図7C）レシピエントマウスのBMにおけるヒト骨髄系細胞（hCD33⁺）の頻度（図7B）および統計分析（図7C）。（図7D）MISTRGの血中のヒトリンパ系統および骨髄系統の代表的なフローサイトメトリー分析。（図7Eおよび図7F）MISTRGおよびヒトドナーのBM（図7E）および血液（図7F）におけるヒト単球（CD33^hiSSC^loCD66^-）および顆粒球（CD33⁺SSC^hiCD66⁺）の代表的なフローサイトメトリー分析。（図7Gおよび図7H）レシピエントマウスの肺（図7G）および肝臓（図7H）におけるヒト骨髄系細胞（hCD33⁺）の絶対数（n＝8〜12；一元配置のANOVA後のチューキーの事後検定によって計算されたp値、* p＜0.05）。 図7Aの説明に記載のとおりである。 図7Aの説明に記載のとおりである。 図7Aの説明に記載のとおりである。 図7Aの説明に記載のとおりである。 図7Aの説明に記載のとおりである。 図7Aの説明に記載のとおりである。 図7Aの説明に記載のとおりである。 図8Aおよび8Bを含む図8は、MISTRGマウスにおけるヒト単球サブセットの増強された発達を示す実験の結果を示す。（図8A）示されたレシピエントマウスのBM、脾臓、肺、および肝臓におけるhCD45⁺CD33⁺細胞におけるCD14およびCD16の発現によって同定されたヒト単球サブセットの代表的なフローサイトメトリー分析。（図8B）レシピエントマウスの肺および肝臓における単球サブセットのhCD33⁺細胞中の頻度（エラーバーはSEMを表す）および絶対数（n＝12マウス／群；一元配置のANOVAによって計算されたp値；* p＜0.05 チューキーの事後検定）。 図8Aの説明に記載のとおりである。 図9Aおよび9Bを含む図9は、ヒト単球サブセットがMISTRGおよびヒトドナーにおいて類似していることを示す実験の結果を示す。MISTRGレシピエントおよびヒトドナーの血液（図9A）およびBM（図9B）におけるヒト単球の示されたサブセットの拡張的な免疫表現型。アイソタイプ対照抗体および特異的抗体による染色が示される。 図9Aの説明に記載のとおりである。 図10A〜10Iを含む図10は、ヒト骨髄系細胞がヒト-マウス食作用寛容を突破することを示す実験の結果を示す。（図10A）CFSEによって標識されたマウスRBCを、示されたマウスへ移入し、標識された細胞の頻度を、示された時点で測定した。（図10B）生着MISTRGを、食細胞を枯渇させるためクロドロン酸によって前処理するか、または前処理せずに、CFSEによって標識されたマウスRBCを移入し、（図10A）と同様にモニタリングした（p値、1〜3日間の反復測定ANOVAによって測定されたクロドロン酸効果）。これらの結果は、移入されたマウスRBCが、MISTRGに存在する食細胞によって急速にインビボで除去されるが、NSGにおいては除去されないことを示す。（図10C）非生着マウス（n＝9〜15）またはヒトFL-CD34⁺細胞の生着の8〜10週後（n＝11〜37）の血中のRBC数。p値は、各遺伝子型の非生着マウスと生着マウスとの間の比較を示す（独立スチューデントt検定）。（図10D）ヒト生着レベル（血中のhCD45⁺細胞の百分率）とRBC数との間の相関（n＝13〜22）。（図10E）生着MISTRGの血中の赤血球細胞がほぼ全てマウス起源であり、ヒト赤血球細胞はほとんど検出不可能であることを示している、非生着MISTRGまたは生着MISTRGの血中のマウス（mTer119⁺）およびヒト（hCD235a⁺）赤血球細胞のフローサイトメトリー分析。（図10F）生着MISTRGマウスにおける脾腫を示す、示された系統の生着マウス（n＝3〜22）の代表的な写真および脾臓重量。Balb/cマウス由来の脾臓を、対照として使用した（p値、一元配置のANOVA；* p＜0.05 他の全ての群との比較、チューキーの事後検定）。（図10G）脾腫を有するMISTRGマウスにおける赤色髄の拡大を例証している、H＆Eによって染色された生着NSGおよび生着MISTRGの脾臓の組織学的断面像。（図10H）生着MISTRGの脾臓における細胞の最大80％を占めるマウス赤血球前駆細胞（mTer119⁺mCD71⁺）のフローサイトメトリー分析。（図10I）非生着MISTRGおよび生着MISTRGの血液塗抹標本は、網状赤血球の濃縮を例示する。総合すると、これらの結果は、MISTRGにおける貧血がヒト-マウス食作用寛容の欠如に起因し、大量の髄外マウス赤血球生成がmRBCの破壊を補償し得ないことを強く示唆する。結果は、各群において調査された少なくとも5匹のマウス（図10C、10E〜10I）および2回の独立した実験（図10A、10B）の代表である。 図10Aの説明に記載のとおりである。 図10Aの説明に記載のとおりである。 図10Aの説明に記載のとおりである。 図10Aの説明に記載のとおりである。 図10Aの説明に記載のとおりである。 図10Aの説明に記載のとおりである。 図10Aの説明に記載のとおりである。 図10Aの説明に記載のとおりである。 図11Aおよび11Bを含む図11は、MISTRGマウスがヒトIL-15/IL-15Rαを提供することを示す実験の結果を示す。（図11A）生着NSGマウス、生着MITRGマウス、および生着MISTRGマウスの肺におけるヒトIL-15およびヒトIL-15RαのmRNA発現の定量的RT-PCR分析（n＝7〜8；一元配置のANOVAによって計算されたp値；* p＜0.05 チューキーの事後検定）。発現はマウスHprtに対して標準化された。（図11B）生着MISTRGマウス（n＝4の代表）の血液に由来するヒト細胞集団（hCD45⁺mCD45^-）におけるIL-15Rα発現のフローサイトメトリー分析。ヒストグラムは、それぞれアイソタイプ対照またはIL-15Rα抗体による染色を表す。結果は2回の実験の代表または組み合わせである。 図12Aおよび12Bを含む図12は、MISTRGマウスにおける増強されたヒトNK細胞発達を示す実験の結果を示す。（図12Aおよび図12B）生着NSGマウス、生着MITRGマウス、および生着MISTRGマウスにおけるヒトNK細胞（hNKp46⁺hCD3^-）の頻度（図12A）および絶対数（図12B）（n＝8〜16；一元配置のANOVAによって計算されたp値；* p＜0.05 チューキーの事後検定）。結果は4回の実験からの組み合わせである。 図12Aの説明に記載のとおりである。 図13A〜13Fを含む図13は、増強された成熟を示す真のヒトNK細胞がMISTRGマウスに存在することを示す実験の結果を示す。（図13A）ヒトドナーおよび生着MISTRG（n＝3）に由来するヒト血中NK細胞におけるCD94およびCD161の発現のフローサイトメトリー分析。ヒストグラムは、アイソタイプ対照AbまたはCD94/CD161 Abによる染色を表す。（図13B）ヒトドナーまたは生着MISTRGマウス（n＝3）からのヒト血中NK細胞におけるKIR発現のフローサイトメトリー分析。数は、KIR⁺細胞の頻度を示す。（図13Cおよび図13D）生着NSGマウス、生着MITRGマウス、および生着MISTRGマウスからのヒトNK細胞におけるCD16表面発現（n＝4〜8；一元配置のANOVAによって計算されたp値；* p＜0.05 チューキーの事後検定）。（図13Eおよび図13F）生着NSGマウスおよび生着MISTRGマウスに由来するヒト肝臓NK細胞（hNKp46⁺hCD3^-）およびT細胞（hCD3⁺）による細胞内パーフォリン発現（n＝3；独立スチューデントt検定によって計算されたp値）。MFI、平均蛍光強度。結果は、1回（図13Aおよび図13B）、2回（図13Eおよび図13F）、または4回（図13Cおよび図13D）の実験の代表または組み合わせである。 図13Aの説明に記載のとおりである。 図13Aの説明に記載のとおりである。 図13Aの説明に記載のとおりである。 図13Aの説明に記載のとおりである。 図13Aの説明に記載のとおりである。 MISTRGマウスにおけるヒトNK細胞ホメオスタシスに対するヒト単球／マクロファージ枯渇の効果を示す実験の結果を示す。生着MISTRGマウスを、未処理のままにするか、または食細胞を枯渇させるため、リポソームに封入されたクロドロン酸によって3日連続で処理した。肝臓（n＝8）におけるヒト単球／マクロファージ（上パネル、hCD33⁺細胞に対してゲーティング）およびNK細胞（hNKp46⁺hCD3^-）のフローサイトメトリー分析が示される。結果は2回の実験の代表である。8匹のマウスのうちの1匹において、単球／マクロファージのクロドロン酸による枯渇が有効でなく、NK細胞数の低下が、そのマウスにおいては観察されなかった。 黒色腫に浸潤するヒト骨髄系細胞の免疫組織化学を示す実験の結果を示す。NSG、MISTRG、またはヒト患者からの腫瘍におけるヒト骨髄系細胞の代表的な免疫組織化学染色。各群3対象および各対象3画像が示される。 単一遺伝子交換を有するレシピエントマウス、NSG、MISTRG、およびヒトにおける生着レベルならびに免疫細胞の発達および機能の比較を示す。 図17A〜17Dを含む図17は、AML、CMML、およびMDSを有する患者から単離された試料をMISTRGに生着させることが可能であることを証明する実験の結果を示す。（図17A）（疾患の型および患者試料において見出された遺伝的異常を含む）使用された試料の特徴、実験プロトコル（細胞精製の方法、各マウスに注射された細胞の数、およびマウスが分析された移植後の時点）、ならびに（検出可能なヒト生着を有するマウスの数、ヒト造血CD45⁺細胞および骨髄系CD33⁺細胞の百分率、ならびにマウスから単離されたヒト細胞において観察されたゲノム異常を含む）生着結果。（図17B）RAEB I試料における粒度減少を示す、RAEB I患者または正常ドナーの細胞を移植されたマウスから単離された骨髄系CD33+細胞の粒度（SSC）の代表的なフローサイトメトリー分析。（図17C）RAEB II試料を移植されたマウスから単離され、染色体5qの欠如を示すヒト細胞の代表的なfish分析。（図17D）CMML試料を移植されたマウスから単離され、染色体6の欠失を示すヒト細胞の核型。

詳細な説明
本発明は概して、ヒトM-CSF、ヒトIL-3、ヒトGM-CSF、ヒトSIRPA、またはヒトTPOのうちの少なくとも1種を発現する遺伝学的に修飾された非ヒト動物に関する。本発明は、本明細書に記載された遺伝学的に修飾された非ヒト動物を生成する方法および使用する方法にも関する。いくつかの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物はマウスである。いくつかの態様において、本明細書に記載された遺伝学的に修飾された非ヒト動物には、ヒト造血細胞が生着している。様々な態様において、本発明のヒト造血細胞が生着した、遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、造血細胞および免疫細胞の増殖および分化のインビボ評価のため、ヒト造血系のインビボ評価のため、癌細胞のインビボ評価のため、免疫応答のインビボ査定のため、ワクチンおよび予防接種計画のインビボ評価のため、癌細胞の増殖または生存をモジュレートする薬剤の効果の試験において使用するため、癌の処置のインビボ評価のため、ヒト抗体を含む免疫メディエーターのインビボの作製および収集のため、そして造血細胞および免疫細胞の機能をモジュレートする薬剤の効果の試験において使用するため、有用である。

定義
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有している。そのような用語は、J.Sambrook and D.W.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press;3rd Ed.,2001；F.M.Ausubel,Ed.,Short Protocols in Molecular Biology,Current Protocols;5th Ed.,2002；B.Alberts et al.,Molecular Biology of the Cell,4th Ed.,Garland,2002；D.L.Nelson and M.M.Cox,Lehninger Principles of Biochemistry,4th Ed.,W.H.Freeman & Company,2004；およびHerdewijn,P.(Ed.),Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications,Methods in Molecular Biology,Humana Press,2004を例示的に含む様々な標準的な参考書に見出され、定義され、文脈中に使用されている。本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である任意の方法および材料を、本発明の実施または試行において使用することができるが、好ましい方法および材料が記載される。

本明細書において使用されるように、以下の用語の各々は、このセクションにおいてそれに関連している意味を有する。

冠詞「一つ（a）」および「一つ（an）」は、その冠詞の文法上の目的語の一つまたは複数（即ち少なくとも一つ）をさすために本明細書において使用される。例えば、「要素」とは、一つの要素または複数の要素を意味する。

「約」とは、本明細書において使用されるように、量、時間的長さ等のような測定可能な値をさす時、指定された値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらに好ましくは±1％、さらに好ましくは±0.1％の変動を包含することを意味するが、それは、そのような変動が開示された方法を実施するのに適切であるためである。

「異常」という用語は、生物、組織、細胞、またはそれらの成分に関して使用される時、「正常な」（期待される）それぞれの特徴を示す生物、組織、細胞、またはそれらの成分と、少なくとも一つの観察可能または検出可能な特徴（例えば、齢、処理、時刻等）が異なる生物、組織、細胞、またはそれらの成分をさす。ある細胞または組織型について正常であるかまたは期待される特徴が、異なる細胞または組織型については異常であり得る。

「抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、抗原上の特異的なエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子をさす。抗体は、天然起源または組換え起源に由来する完全な免疫グロブリンであってもよいし、完全な免疫グロブリンの免疫反応性の部分であってもよい。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（「イントラボディ（intrabodies）」）、Fv、Fab、およびF(ab)2、ならびに単鎖抗体（scFv）、ラクダ科抗体のような重鎖抗体、およびヒト化抗体を含む多様な形態で存在し得る（Harlow et al.,1999,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426）。

「癌」という用語は、本明細書において使用されるように、異常細胞の無調節の増殖および／または成長を特徴とする疾患として定義される。癌細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を通って、他の身体部分へ蔓延し得る。本明細書において、癌には、固形腫瘍および造血系悪性疾患の両方が含まれる。本発明が適用可能な様々な癌の例には、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、骨癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害等が含まれるが、これらに限定されない。

「構成性」発現とは、細胞の大部分または全ての生理学的条件の下で、生存細胞において遺伝子産物が産生される状態である。

遺伝子の「コード領域」は、遺伝子の転写によって産生されるmRNA分子のコード領域に対して、それぞれ、相同であるかまたは相補的である、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基および遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる。

mRNA分子の「コード領域」も、mRNA分子の翻訳の間にトランスファーRNA分子のアンチコドン領域と対合するか、または終止コドンをコードする、mRNA分子のヌクレオチド残基からなる。従って、コード領域は、mRNA分子によってコードされた成熟タンパク質に存在しないアミノ酸残基（例えば、タンパク質排出シグナル配列内のアミノ酸残基）のためのコドンを構成するヌクレオチド残基を含み得る。

「疾患」とは、動物がホメオスタシスを維持することができず、疾患が寛解しない場合には、動物の健康が悪化し続ける動物の健康の状態である。

対照的に、動物における「障害」とは、動物がホメオスタシスを維持することができるが、動物の健康の状態が、障害が存在しない場合より不都合である健康の状態である。未処置のままにされた場合、障害は、必ずしも、動物の健康の状態のさらなる減少を引き起こさない。

疾患または障害は、疾患または障害の症状の重症度、そのような症状を患者が経験する頻度、または両方が低下する場合、「軽減される」。

化合物の「有効量」または「治療的に有効な量」とは、化合物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な化合物の量である。送達媒体の「有効量」とは、効果的に化合物に結合するかまたは化合物を送達するのに十分な量である。

「コードする」とは、定義されたヌクレオチドの配列（即ち、rRNA、tRNA、およびmRNA）または定義されたアミノ酸の配列のいずれか、ならびにそれらに起因する生物学的特性を有する、生物学的過程における他の重合体および高分子の合成のための鋳型として役立つ、遺伝子、cDNA、またはmRNAのようなポリヌクレオチドの特異的なヌクレオチドの配列の固有の特性をさす。従って、遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が、細胞またはその他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はそのタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、一般的に配列表に提供されるコード鎖、および遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはcDNAのタンパク質またはその他の産物をコードすると呼ばれ得る。

本明細書において使用されるように、「内在性」とは、生物、細胞、組織、もしくは系に由来するか、または生物、細胞、組織、もしくは系の内部で産生された任意の材料をさす。

本明細書において使用されるように、「外来性」という用語は、生物、細胞、組織、もしくは系から導入されたか、または生物、細胞、組織、もしくは系の外部で産生された任意の材料をさす。

「発現構築物」および「発現カセット」という用語は、所望の核酸ヒトコード配列を含有しており、機能的に連結されたコード配列の発現のために必要であるかまたは望ましい1種または複数種の制御要素を含有している二本鎖組換えDNA分子をさすため、本明細書において使用される。

本明細書において使用されるように、「断片」という用語は、核酸またはポリペプチドに適用されるように、より大きい核酸またはポリペプチドの部分配列をさす。核酸の「断片」は、少なくとも約15ヌクレオチド長；例えば、少なくとも約50ヌクレオチド〜約100ヌクレオチド；少なくとも約100〜約500ヌクレオチド、少なくとも約500〜約1000ヌクレオチド、少なくとも約1000ヌクレオチド〜約1500ヌクレオチド；または約1500ヌクレオチド〜約2500ヌクレオチド；または約2500ヌクレオチド（および中間の任意の整数値）であり得る。ポリペプチドの「断片」は、少なくとも約15ヌクレオチド長；例えば、少なくとも約50アミノ酸〜約100アミノ酸；少なくとも約100〜約500アミノ酸、少なくとも約500〜約1000アミノ酸、少なくとも約1000アミノ酸〜約1500アミノ酸；または少なくとも約1500アミノ酸〜約2500アミノ酸；または約2500アミノ酸（および中間の任意の整数値）であり得る。

本明細書において使用されるように、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさす。そのような天然の対立遺伝子の変動は、典型的には、所定の遺伝子のヌクレオチド配列の1〜5％の変動をもたらし得る。代替対立遺伝子は、多数の異なる個体において関心対象の遺伝子を配列決定することによって同定され得る。これは、多様な個体において同一の遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを使用することによって、容易に実施され得る。天然の対立遺伝子の変動の結果であり、機能的活性を改変しない、そのようなヌクレオチドの変動およびその結果としてのアミノ酸の多形または変動は、全て、本発明の範囲内に含まれるものとする。

「相同」とは、本明細書において使用されるように、2種の重合体分子の間、例えば、2種の核酸分子、例えば、2種のDNA分子もしくは2種のRNA分子の間、または2種のポリペプチド分子の間のサブユニット配列類似性をさす。2種の分子の両方において、あるサブユニット位置が同一の単量体サブユニットによって占有されている時、例えば、2種のDNA分子の各々において、ある位置がアデニンによって占有されている場合、それらはその位置において相同である。2種の配列の間の相同性は、一致するかまたは相同である位置の数の一次関数であり、例えば、2種の化合物の配列内の位置の半分（例えば、10サブユニット長の重合体においては5個の位置）が相同である場合、それらの2種の配列は50％相同であり、位置の90％、例えば、10個のうちの9個が一致するかまたは相同である場合、それらの2種の配列は90％の相同性を共有している。例えば、DNA配列5'-ATTGCC-3'および5'-TATGGC-3'は、50％の相同性を共有している。

「ヒト造血幹細胞・前駆細胞」および「ヒトHSPC」という用語は、本明細書において使用されるように、ヒトの自己再生性の多能性の造血幹細胞および造血前駆細胞をさす。

「誘導可能な」発現とは、細胞におけるシグナルの存在に応答して、生存細胞において遺伝子産物が産生される状態である。

本明細書において使用されるように、「説明材料」には、本明細書に記された様々な疾患または障害の軽減を達成するための、キット内の本発明の化合物、組成物、ベクター、または送達系の有用性を通知するために使用され得る、出版物、記録、図表、またはその他の表現媒体が含まれる。任意でまたは代替的に、説明材料は、哺乳動物の細胞または組織における疾患または障害を軽減する一つまたは複数の方法を記載することができる。本発明のキットの説明材料は、例えば、本発明の同定された化合物、組成物、ベクター、もしくは送達系を含有している容器に添付されるか、または同定された化合物、組成物、ベクター、もしくは送達系を含有している容器と共に出荷され得る。あるいは、説明材料は、説明材料および化合物がレシピエントによって協力的に使用されることを意図して、容器とは別に出荷されてもよい。

「機能的に連結された」という用語は、本明細書において使用されるように、第2のポリヌクレオチドと機能的な関係にあるポリヌクレオチドをさす。2種のポリヌクレオチドを「機能的に連結された」と記載することは、2種のポリヌクレオチドのうちの少なくとも1種が特徴的な生理学的効果を他方に対して及ぼすことができるような様式で、核酸部分内に配置された2種のポリヌクレオチドを、一本鎖または二本鎖の核酸部分が含むことを意味する。例えば、遺伝子のコード領域に機能的に連結されたプロモーターは、コード領域の転写を促進することができる。好ましくは、所望のタンパク質をコードする核酸がプロモーター／制御配列をさらに含む時、プロモーター／制御配列は、細胞における所望のタンパク質の発現を駆動するよう、所望のタンパク質をコードする配列の5'末端に位置付けられる。所望のタンパク質をコードする核酸およびそのプロモーター／制御配列は、合わせて、「トランスジーン」を構成する。

「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において使用されるように、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドの重合体である。従って、核酸およびポリヌクレオチドは、本明細書において使用されるように、交換可能である。当業者は、核酸が単量体「ヌクレオチド」へ加水分解され得るポリヌクレオチドであるという一般知識を有している。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドへ加水分解され得る。本明細書において使用されるように、ポリヌクレオチドには、組換え手段、即ち、通常のクローニングテクノロジーおよびPCR等を使用した、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段を含むが、これらに限定されない、当技術分野において入手可能な任意の手段によって入手される全ての核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書において使用されるように、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸残基から構成された化合物をさす。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2個のアミノ酸を含有していなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数は限定されない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互に接合された2個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書において使用されるように、その用語は、当技術分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも一般的に呼ばれる短鎖、ならびに多くの型が存在する当技術分野においてタンパク質と一般に呼ばれる、より長い鎖の両方をさす。「ポリペプチド」には、とりわけ、例えば、生物学的活性を有する断片、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾型ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。「ペプチド」という用語は、典型的には、短いポリペプチドをさす。「タンパク質」という用語は、典型的には、大きいポリペプチドをさす。

「子孫」という用語は、本明細書において使用されるように、後代または派生物をさし、親細胞に由来する分化したまたは未分化の後代細胞を含む。一つの使用法において、子孫という用語は、親と遺伝学的に同一である後代細胞をさす。別の使用において、子孫という用語は、親と遺伝学的にかつ表現型的に同一である後代細胞をさす。さらに別の使用法において、子孫という用語は、親細胞から分化した後代細胞をさす。

「プロモーター」という用語は、本明細書において使用されるように、所望の分子をコードする核酸配列のような、転写される核酸配列に、機能的に連結されるDNA配列をさす。プロモーターは、一般に、転写される核酸配列の上流に位置付けられ、RNAポリメラーゼおよびその他の転写因子による特異的な結合のための部位を提供する。具体的な態様において、プロモーターは、一般に、所望の分子を産生するために転写される核酸配列の上流に位置し、RNAポリメラーゼおよびその他の転写因子による特異的な結合のための部位を提供する。含まれるプロモーターは、構成性プロモーターであってもよいし、または誘導可能な発現を提供してもよく；偏在性の発現、組織特異的な発現、または細胞型特異的な発現を提供することができる。

範囲：この開示の全体にわたって、本発明の様々な局面が、範囲フォーマットで提示され得る。範囲フォーマットでの記載は、便宜および簡潔のためのものに過ぎず、本発明の範囲に対する柔軟性を欠く限定として解釈されるべきでないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等のような部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示していると見なされるべきである。これは範囲の幅に関わらず当てはまる。

「組換えポリペプチド」とは、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたものである。

「制御要素」という用語は、本明細書において使用されるように、核酸配列の発現のいくつかの局面を調節するヌクレオチド配列をさす。例示的な制御要素には、例示的に、核酸配列の複製、転写、転写後プロセシングに寄与する、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位（IRES）、イントロン；複製開始点、ポリアデニル化シグナル（pA）、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、および上流制御ドメインが含まれる。当業者は、ルーチンの実験法のみを用いて、これらおよびその他の制御要素を選択し、発現構築物において使用することができる。発現構築物は、周知の方法論を使用して、組換えまたは合成によって生成され得る。

「特異的に結合する」という用語は、抗体に関して本明細書において使用されるように、特異的な抗原を認識するが、試料中の他の分子は実質的に認識せず結合しない抗体を意味する。例えば、ある種に由来する抗原に特異的に結合する抗体は、一つまたは複数の種に由来するその抗原にも結合することができる。しかし、そのような異種間交差反応性は、それ自体、抗体の特異的としての分類を改変しない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかしながら、そのような交差反応性は、それ自体、抗体の特異的としての分類を改変しない。

いくつかの状況において、「特異的な結合」または「特異的に結合すること」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドの、第2の化学種との相互作用に関して、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存性であること；例えば、抗体がタンパク質全体ではなく特異的なタンパク質構造を認識しそれに結合することを意味するために使用され得る。抗体がエピトープ「A」に特異的である場合、標識された「A」および抗体を含有している反応において、エピトープAを含有している分子（または遊離の未標識のA）の存在は、抗体に結合する標識されたAの量を低下させるであろう。

「合成抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、例えば、本明細書に記載されるようなバクテリオファージによって発現された抗体のような、組換えDNAテクノロジーを使用して生成された抗体を意味する。その用語は、当技術分野において入手可能であり周知であるDNAまたはアミノ酸配列の合成テクノロジーを使用して入手された、抗体をコードし、抗体タンパク質を発現するDNA分子、または抗体を指定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体も意味するものと解釈されるべきである。

「バリアント」という用語は、本明細書において使用されるように、それぞれ参照核酸配列または参照ペプチド配列とは配列が異なるが、参照分子の本質的な生物学的特性を保持している核酸配列またはペプチド配列である。核酸バリアントの配列の変化は、参照核酸によってコードされたペプチドのアミノ酸配列を改変しない場合もあるし、またはアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および短縮をもたらす場合もある。ペプチドバリアントの配列の変化は、典型的には、限定されているかまたは保存的であるため、参照ペプチドおよびバリアントの配列は、全体的によく類似しており、多くの領域において、同一である。バリアントペプチドおよび参照ペプチドは、1個または複数個の置換、付加、欠失の任意の組み合わせによってアミノ酸配列が異なっていてよい。核酸またはペプチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントのような天然に存在するものであってもよいし、または天然に存在することは公知でないバリアントであってもよい。核酸およびペプチドの天然に存在しないバリアントは、変異誘発技術または直接合成によって作製され得る。

本明細書において使用されるように、「遺伝学的に修飾された」という用語は、その生殖細胞が外来性のヒト核酸またはヒト核酸配列を含む動物を意味する。非限定的な例として、遺伝学的に修飾された動物は、ヒト核酸配列を含む限り、トランスジェニック動物またはノックイン動物であり得る。

本明細書において使用されるように、「ノックイン」とは、非ヒト動物の染色体遺伝子座にコードされた遺伝子情報を異なるDNA配列に交換する遺伝学的修飾を意味する。

説明
本発明は、（本明細書においてMISTと呼ばれる）ヒトM-CSF、ヒトIL-3/GM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOを発現する遺伝学的に修飾された非ヒト動物に関する。本発明は、本明細書に記載された遺伝学的に修飾された非ヒト動物を生成する方法および使用する方法にも関する。いくつかの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物はマウスである。いくつかの態様において、遺伝学的に修飾された非ヒト動物は免疫不全マウスである。具体的な態様において、免疫不全マウスはRAG2^-/-γ_c ^-/-マウスである。別の具体的な態様において、本発明の遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、ヒトM-CSF、ヒトIL-3/GM-CSF、およびヒトTPOを発現し、RAG2およびγ_cを発現しない（本明細書においてMITRGと呼ばれる）。別の具体的な態様において、本発明の遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、ヒトM-CSF、ヒトIL-3/GM-CSF、ヒトSIRPA、およびヒトTPOを発現し、RAG2およびγ_cを発現しない（本明細書においてMISTRGと呼ばれる）。いくつかの態様において、本明細書に記載された遺伝学的に修飾された非ヒト動物には、ヒト造血細胞が生着している。

様々な態様において、本発明のヒト造血細胞が生着した遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、造血細胞および免疫細胞の増殖および分化のインビボ評価のため、ヒト造血系のインビボ評価のため、癌細胞のインビボ評価のため、免疫応答のインビボ査定のため、ワクチンおよび予防接種計画のインビボ評価のため、癌細胞の増殖または生存をモジュレートする薬剤の効果の試験において使用するため、癌の処置のインビボ評価のため、ヒト抗体を含む免疫メディエーターのインビボの作製および収集のため、そして造血細胞および免疫細胞の機能をモジュレートする薬剤の効果の試験において使用するため、有用である。

遺伝学的に修飾された非ヒト動物
本発明は、ヒトM-CSF、ヒトIL-3/GM-CSF、ヒトSIRPA、ヒトTPO、およびそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも一つを発現する、遺伝学的に修飾された非ヒト動物を含む。いくつかの態様において、ヒト核酸を発現する遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、対応する非ヒト動物核酸も発現する。他の態様において、ヒト核酸を発現する遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、対応する非ヒト動物核酸を発現しない。いくつかの態様において、遺伝学的に修飾された動物は、本明細書中に別記されるように、動物を免疫不全動物にするため、1種または複数種の遺伝子がノックアウトされている動物である。遺伝学的に修飾された非ヒト動物を作るためには、ヒトタンパク質をコードする核酸を、非ヒト宿主細胞におけるヒトタンパク質の発現のために適当な形態で、組換え発現ベクターへ組み入れることができる。様々な態様において、組換え発現ベクターは、核酸のmRNAへの転写およびmRNAのヒトタンパク質への翻訳を可能にする様式でヒトタンパク質をコードする核酸に機能的に連結された1種または複数種の制御配列を含む。「制御配列」という用語は、当技術分野において認識されており、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。そのような制御配列は、当業者に公知であり、1990,Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Califに記載されている。発現ベクターの設計は、トランスフェクトされる宿主細胞の選択および／または発現されるヒトタンパク質の量のような要因に依り得ることが理解されるべきである。

遺伝学的に修飾された動物は、例えば、（典型的には、構成性エンハンサーまたは組織特異的エンハンサーのような適切な制御要素に連結された）ヒトタンパク質をコードする核酸を、例えば、微量注入によって、卵母細胞へ導入し、卵母細胞を雌養育動物において発達させることによって作製され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも、トランスジーンの発現の効率を増加させるため、トランスジーンに含めることができる。遺伝学的に修飾された動物、具体的には、マウスのような動物を生成する方法は、当技術分野において慣習的なものになっており、例えば、米国特許第4,736,866号および第4,870,009号、ならびに1986,Hogan et al.,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.,Cold Spring Harbor Laboratoryに記載されている。遺伝学的に修飾された樹立動物は、トランスジーンを保持する付加的な動物を育種するために使用され得る。本発明のヒトタンパク質をコードするトランスジーンを保持する遺伝学的に修飾された動物は、さらに、他のトランスジーンを保持する他の遺伝学的に修飾された動物と交雑されてもよいし、またはノックアウト動物、例えば、その遺伝子のうちの1種もしくは複数種を発現しないノックアウト動物と交雑されてもよい。様々な態様において、本発明の遺伝学的に修飾された動物は、マウス、ラット、またはウサギである。

いくつかの態様において、本発明の遺伝学的に修飾された動物は、非ヒト動物のネイティブプロモーターおよびネイティブ制御要素から1種または複数種のヒト核酸を発現する。他の態様において、本発明の遺伝学的に修飾された動物は、ネイティブヒトプロモーターおよびネイティブ制御要素からヒト核酸を発現する。本発明の遺伝学的に修飾された動物には、任意のプロモーターから少なくとも1種のヒト核酸を発現する遺伝学的に修飾された動物が含まれることを、当業者は理解するであろう。本発明において有用なプロモーターの例には、DNA pol IIプロモーター、PGKプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター、グロビンプロモーター、オボアルブミンプロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、レトロウイルスLTR、およびレンチウイルスLTRが含まれるが、これらに限定されない。本発明において有用なプロモーターおよびエンハンサーの発現系には、誘導可能な発現系および／または組織特異的な発現系も含まれる。

いくつかの態様において、本発明は、プロモーターに機能的に連結されたヒトポリペプチドをコードする核酸を含むゲノムを有し、コードされたヒトポリペプチドを発現する、遺伝学的に修飾された免疫不全動物を含む。様々な態様において、本発明は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに機能的に連結されており、さらにイントロンを含有している、少なくとも1種のヒトポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットを含むゲノムを有し、かつコードされたヒトポリペプチドを発現する、遺伝学的に修飾された免疫不全非ヒト動物を含む。

様々な態様において、ヒト遺伝子を発現する遺伝学的に修飾された免疫不全動物を作製するため、ヒト核酸配列を免疫不全動物へ導入するため、様々な方法が使用される。そのような技術は、当技術分野において周知であり、前核微量注入、胚性幹細胞の形質転換、相同組換え、およびノックイン技術を含むが、これらに限定されない。使用され得る遺伝学的に修飾された動物を生成する方法には、SundbergおよびIchiki（2006,Genetically Engineered Mice Handbook,CRC Press）、Hofkerおよびvan Deursen（2002,Genetically modified Mouse Methods and Protocols,Humana Press）、Joyner（2000,Gene Targeting:A Practical Approach,Oxford University Press）、Turksen（2002,Embryonic stem cells:Methods and Protocols in Methods Mol Biol.,Humana Press）、Meyerら（2010,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 107:15022-15026）、ならびにGibson（2004,A Primer Of Genome Science 2^nd ed.Sunderland,Massachusetts:Sinauer）、米国特許第6,586,251号、Rathinamら（2011,Blood 118:3119-28）、Willingerら（2011,Proc Natl Acad Sci USA,108:2390-2395）、Rongvauxら（2011,Proc Natl Acad Sci USA,108:2378-83）、ならびにValenzuelaら（2003,Nat Biot 21:652-659）に記載されたものが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、本発明の組成物および方法は、単独で、または（例えば、IL2受容体γ鎖欠損（即ち、γ_c ^-/-）による）NK細胞の数および／もしくは機能の欠損と組み合わせて、B細胞および／またはT細胞の数および／または機能が欠損しており、プロモーターに機能的に連結されたヒト核酸を含むゲノムを有しており、かつコードされたヒトポリペプチドを発現する、遺伝学的に修飾された免疫不全動物を含む。本発明の遺伝学的に修飾された動物の生成は、発現構築物の着床前胚へのDNA注入のような方法、または胚性幹（ES）細胞もしくは誘導多能性幹（iPS）細胞のような幹細胞の使用によって達成され得る。

一つの態様において、ヒト核酸は、ヒト遺伝子のネイティブ制御要素によって発現される。他の態様において、ヒト核酸は、非ヒト動物のネイティブ制御要素によって発現される。他の態様において、ヒト核酸は、偏在性プロモーターから発現される。本発明の組成物および方法の発現構築物において有用な偏在性プロモーターの非限定的な例には、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK-1）プロモーター、βアクチンプロモーター、ROSA26プロモーター、熱ショックタンパク質70（Hsp70）プロモーター、伸長因子1α（EF1）プロモーターをコードするEF-1α遺伝子、真核生物開始因子4A（eIF-4A1）プロモーター、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）プロモーター、およびCMV（サイトメガロウイルス）プロモーターが含まれる。

他の態様において、ヒト核酸は、組織特異的プロモーターから発現される。本発明の組成物および方法の発現構築物において有用な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、M-CSFプロモーター、IL-3プロモーター、GM-CSFプロモーター、SIRPAプロモーター、TPOプロモーター、IFN-βプロモーター、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（WASP）プロモーター、CD45（リンパ球共通抗原とも呼ばれる）プロモーター、Flt-1プロモーター、エンドグリン（CD105）プロモーター、およびICAM-2（細胞内接着分子2）プロモーターのような造血系において発現される遺伝子のプロモーターが含まれる。本発明の組成物および方法において有用なこれらおよびその他のプロモーターは、Abboudら（2003,J.Histochem & Cytochem.51:941-949）、Schorppら（1996,NAR 24:1787-1788）、McBurneyら（1994,Devel.Dynamics,200:278-293）、およびMajumderら（1996,Blood 87:3203-3211）に例示されるように、当技術分野において公知である。プロモーターが含まれることに加えて、エンハンサー要素またはイントロン配列のような1種または複数種の付加的な制御要素が、本発明の様々な態様において含まれる。本発明の組成物および方法において有用なエンハンサーの例には、サイトメガロウイルス（CMV）初期エンハンサー要素およびSV40エンハンサー要素が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物および方法において有用なイントロン配列の例には、βグロビンイントロンまたはジェネリックイントロンが含まれるが、これらに限定されない。本発明のいくつかの態様において有用な他の付加的な制御要素には、転写終結配列およびmRNAポリアデニル化（pA）配列が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、ヒト核酸発現構築物の着床前胚への導入の方法は、着床前胚への注入の前に、発現構築物の直鎖化を含む。好ましい態様において、発現構築物は、受精卵母細胞へ注入される。過排卵雌から、交配の翌日に、受精卵母細胞を収集し、発現構築物を注入することができる。注入された卵母細胞を、一晩培養するか、または交尾後0.5日の偽妊娠雌の卵管へ直接移入する。過排卵、卵母細胞の採集、発現構築物注入、および胚移入のための方法は、当技術分野において公知であり、Manipulating the Mouse Embryo（2002,A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されている。DNA分析（例えば、PCR、サザンブロット、DNA配列決定等）またはタンパク質分析（例えば、ELISA、ウエスタンブロット等）によって、導入された核酸の存在について、派生動物を評価することができる。

他の態様において、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、およびリポフェクションのような周知の方法を使用して、発現構築物を幹細胞（ES細胞またはiPS細胞）へトランスフェクトすることができる。DNA分析（例えば、PCR、サザンブロット、DNA配列決定等）またはタンパク質分析（例えば、ELISA、ウエスタンブロット等）によって、導入された核酸の存在について、細胞を評価することができる。次いで、発現構築物が組み入れられたと決定された細胞を、着床前胚へ微量注入することができる。本発明の組成物および方法のために有用な当技術分野において公知の方法の詳細な説明については、Nagyら（2002,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press）、Nagyら（1990,Development 110:815-821）、米国特許第7,576,259号、米国特許第7,659,442号、米国特許第7,294,754号、およびKrausら（2010,Genesis 48:394-399）を参照すること。

少なくとも1種のヒト核酸を発現する免疫不全動物を作るため、本発明の遺伝学的に修飾された非ヒト動物を、免疫不全動物と交雑することができる。本発明の様々な態様は、実質的に全ての細胞にヒト核酸を含む遺伝学的に修飾された動物、および全てではなく一部の細胞にヒト核酸を含む遺伝学的に修飾された動物を提供する。互いに隣接しているかまたは離れているヒト核酸の1個または複数個のコピーが、遺伝学的に修飾された動物の細胞のゲノムへ組み込まれ得る。

いくつかの態様において、本発明は、少なくとも1個のヒト造血細胞が生着した遺伝学的に修飾された非ヒトマウスである。他の態様において、本発明は、遺伝学的に修飾された非ヒト動物にヒト造血細胞を生着させる方法である。本発明の組成物および方法において有用な生着させられるヒト造血細胞には、任意のヒト造血細胞が含まれる。本発明において有用なヒト造血細胞の非限定的な例には、HSC、HSPC、LIC（leukemia initiating cells）、および任意の系統の最終分化造血細胞を含む、任意の系統の任意の分化段階にある造血細胞が含まれるが、これらに限定されない。そのような造血細胞は、骨髄、末梢血、肝臓、胎児肝臓、または臍帯血を含むが、これらに限定されない、ヒトドナーの任意の組織または位置に由来し得る。そのような造血細胞は、健康なドナー、および白血病を含む癌のような疾患を有するドナーを含む、任意のヒトドナーから単離され得る。

他の態様において、本発明は、遺伝学的に修飾された非ヒト動物にヒト造血細胞を生着させる方法である。いくつかの態様において、ヒト造血細胞を生着させられる遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、免疫不全動物である。本発明の遺伝学的に修飾された動物における造血細胞の生着は、生着動物におけるヒト造血細胞の存在によって特徴付けられる。具体的な態様において、免疫不全動物における造血細胞の生着は、適切な対照動物と比較した、造血細胞が提供された生着動物における分化ヒト造血細胞の存在によって特徴付けられる。

いくつかの態様において、本発明の動物は、ヒト造血細胞に加えて、ヒト癌細胞（例えば、ヒト固形腫瘍等）を移植される。様々な態様において、ヒト癌細胞は、（非限定的な例として、黒色腫、乳癌、肺癌等を含む）多くの異なる型の癌のいずれかに由来する、癌細胞株または患者から単離された初代ヒト癌細胞であり得る。いくつかの態様において、ヒト癌細胞およびHSPCは、同一の患者から単離され、同一の非ヒト動物へ移植される。

本発明の様々な態様において提供される遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、造血細胞の増殖および分化のモデルとして使用するため、ヒト造血系のインビボ評価のため、癌細胞のインビボ評価のため、免疫応答のインビボ研究のため、ワクチンおよび予防接種計画のインビボ評価のため、癌細胞の増殖または生存をモジュレートする薬剤の効果の試験において使用するため、癌の処置のインビボ評価のため、抗体のような免疫メディエーターのインビボの作製および収集のため、そして造血細胞および免疫細胞の機能に影響を与える薬剤の効果の試験において使用するため、のような様々な有用性を有しているが、これらに限定されない。

遺伝学的に修飾されておりかつ／または免疫不全である非ヒト動物におけるヒト造血細胞の生着は、伝統的に、造血細胞の投与前の前処理、一般にγ線もしくはX線を使用する高周波電磁放射線のレシピエント動物への致死線量未満の照射、またはブスルファンもしくはナイトロジェンマスタードのような放射線様薬物による処理のいずれかを必要とする。前処理は、宿主造血細胞の数を低下させ、ヒト造血細胞の生着のための適切な微小環境要因を作り、かつ／またはヒト造血細胞の生着のための微小環境ニッチを作ると考えられる。前処理のための標準的な方法は、本明細書およびJ.Hayakawa et al,2009,Stem Cells,27(1):175-182に記載されているように、当技術分野において公知である。免疫不全動物へヒト造血細胞を提供する工程を含み、造血細胞の投与前に動物を照射する工程を含むかまたは含まない、免疫不全動物におけるヒト造血細胞の生着のための方法が、本発明の態様によって提供される。本発明の遺伝学的に修飾された非ヒト動物へヒト造血細胞を提供する工程を含み、造血細胞の投与前にブスルファンまたはナイトロジェンマスタードのような放射線様薬物を動物へ投与する工程を含むかまたは含まない、免疫不全動物におけるヒト造血細胞の生着のための方法が、本発明の態様によって提供される。

いくつかの態様において、本発明の態様による遺伝学的に修飾された非ヒト動物における造血細胞生着の方法は、本明細書中に別記される本発明の遺伝学的に修飾された動物へヒト造血細胞を提供する工程を含む。いくつかの態様において、本発明の遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、非ヒトB細胞の数および／もしくは機能、非ヒトT細胞の数および／もしくは機能、ならびに／または非ヒトNK細胞の数および／もしくは機能が欠損している免疫不全動物である。他の態様において、免疫不全動物は、重症複合免疫不全（SCID）を有している。SCIDとは、T細胞の欠如およびB細胞機能の不足を特徴とする状態をさす。SCIDの例には、IL2RG遺伝子におけるγ鎖遺伝子変異およびリンパ球表現型T(-)B(+)NK(-)を特徴とするX連鎖SCID；ならびにJak3遺伝子変異およびリンパ球表現型T(-)B(+)NK(-)、ADA遺伝子変異およびリンパ球表現型T(-)B(-)NK(-)、IL-7Rα鎖変異およびリンパ球表現型T(-)B(+)NK(+)、CD3δまたはεの変異およびリンパ球表現型T(-)B(+)NK(+)、RAG1/RAG2変異およびリンパ球表現型T(-)B(-)NK(+)、アルテミス（Artemis）遺伝子変異およびリンパ球表現型T(-)B(-)NK(+)、CD45遺伝子変異およびリンパ球表現型T(-)B(+)NK(+)を特徴とする常染色体劣性SCIDが含まれる。いくつかの態様において、本発明の遺伝学的に修飾された非ヒト動物はRAG1^-/-である。

いくつかの態様において、本発明の態様による遺伝学的に修飾された動物における造血細胞生着の方法は、一般的にscid変異と呼ばれる重症複合免疫不全変異（Prkdc^scid）を有する遺伝学的に修飾された非ヒト動物へ、ヒト造血細胞を提供する工程を含む。scid変異は、周知であり、Bosmaら（1989,Immunogenetics 29:54-56）に記載されるようにマウス染色体16に位置している。scid変異についてホモ接合性のマウスは、機能性のT細胞およびB細胞の欠如、リンパ球減少症、低グロブリン血症、ならびに正常な造血微小環境を特徴とする。scid変異は、例えば、周知の方法を使用して、scid変異のマーカーの検出によって検出され得る。

他の態様において、本発明の態様による遺伝学的に修飾された動物における造血細胞生着の方法は、単独で、または重症複合免疫不全（scid）変異と組み合わせて、IL2受容体γ鎖欠損を有する遺伝学的に修飾された免疫不全非ヒト動物へ、ヒト造血細胞を提供する工程を含む。「IL2受容体γ鎖欠損」という用語は、IL2受容体γ鎖の減少をさす。IL2受容体γ鎖の減少は、遺伝子の欠失または変異のためであり得る。IL2受容体γ鎖の減少は、例えば、IL2受容体γ鎖遺伝子の欠失もしくは変異、および／またはIL2受容体γ鎖発現の減少の、周知の方法を使用した検出によって検出され得る。

天然に存在するヒトの核酸配列およびアミノ酸配列に加えて、その用語は、ヒトの核酸配列およびアミノ酸配列のバリアントを包含する。本明細書において使用されるように、「バリアント」という用語は、対応する野生型ヒトと比較して各々1個または複数個の変異を含有している、ヒトの単離された天然に存在する遺伝子変異体またはヒトの組換えによって調製された変動のいずれかを定義する。例えば、そのような変異は、1個または複数個のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失であり得る。「バリアント」という用語には、非ヒトオルソログも含まれる。いくつかの態様において、本発明のバリアントポリペプチドは、野生型ヒトポリペプチドとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有する。

2種の配列の間の同一性パーセントは、本明細書中に別記される技術を使用して決定される。部位特異的変異誘発およびPCRによって媒介される変異誘発のような標準的な分子生物学技術を使用して、変異を導入することができる。当業者は、ヒトタンパク質の機能的特性を改変することなく、1個または複数個のアミノ酸変異を導入し得ることを認識するであろう。

ヒトタンパク質バリアントを作製するため、ヒトタンパク質において保存的アミノ酸置換を作製することができる。保存的アミノ酸置換は、当技術分野において認識されている、あるアミノ酸の類似した特徴を有する別のアミノ酸への置換である。例えば、各アミノ酸は、以下の特徴のうちの一つまたは複数を有していると記載され得る：正の電荷を有する、負の電荷を有する、脂肪族、芳香族、極性、疎水性、および親水性。保存的置換は、指定された構造的または機能的な特徴を有するあるアミノ酸の、同一の特徴を有する別のアミノ酸への置換である。酸性アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸が含まれ；塩基性アミノ酸には、ヒスチジン、リジン、アルギニンが含まれ；脂肪族アミノ酸には、イソロイシン、ロイシン、およびバリンが含まれ；芳香族アミノ酸には、フェニルアラニン、グリシン、チロシン、およびトリプトファンが含まれ；極性アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、およびチロシンが含まれ；疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、およびトリプトファンが含まれ；保存的置換には、各群内のアミノ酸同士の置換が含まれる。アミノ酸は、相対的なサイズに関しても記載され得、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、プロリン、トレオニン、セリン、バリンは、全て、典型的には、小さいと見なされる。

ヒトバリアントには、合成のアミノ酸類似体、アミノ酸誘導体、および／または非標準アミノ酸が含まれ得、例示的には、αアミノ酪酸、シトルリン、カナバニン、シアノアラニン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジヒドロキシ-フェニルアラニン、ジエンコル酸、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、ノルバリン、3-ホスホセリン、ホモセリン、5-ヒドロキシトリプトファン、1-メチルヒスチジン、メチルヒスチジン、およびオルニチンが含まれるが、これらに限定されない。

ヒトバリアントは、野生型ヒトをコードする核酸との高度の同一性を有する核酸によってコードされる。ヒトバリアントをコードする核酸の相補鎖は、高ストリンジェンシー条件下で、野生型ヒトをコードする核酸と特異的にハイブリダイズする。

「核酸」という用語は、一本鎖、二本鎖、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む任意の形態の、複数個のヌクレオチドを有するRNA分子またはDNA分子をさす。「ヌクレオチド配列」という用語は、核酸の一本鎖型のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序をさす。

ヒトバリアントをコードする核酸は、周知の方法論を使用して、単離されてもよいし、または組換えもしくは合成によって生成されてもよい。

ヒト造血細胞の単離、宿主動物へのヒト造血細胞の投与、およびその生着を査定する方法は、当技術分野において周知である。宿主動物への投与のための造血細胞は、以下に限定はされないが、臍帯血、骨髄、末梢血、サイトカインまたは化学療法によって動員された末梢血、および胎児肝臓のような、造血細胞を含有している任意の組織から入手され得る。造血細胞は、以下に限定はされないが、静脈内、肝臓内、腹腔内、大腿骨内、および／または脛骨内のような、様々な経路を介した投与によって、新生仔または成体動物へ投与され得る。

本発明の遺伝学的に修飾された動物におけるヒト造血細胞の生着は、以下に限定はされないが、造血細胞の投与後の1回または複数回の時点での、ヒト造血細胞が投与された動物における細胞のフローサイトメトリー分析のような、様々な方法のいずれかによって査定され得る。

ヒト造血細胞を単離し、ヒト造血細胞を宿主動物へ投与し、宿主動物におけるヒト造血細胞の生着を査定する例示的な方法は、本明細書、ならびにPearsonら（2008,Curr.Protoc.Immunol.81:1-15）、Itoら（2002,Blood 100:3175-3182）、Traggiaiら（2004,Science 304:104-107）、Ishikawaら（2005,Blood 106:1565-1573）、Shultzら（2005,J.Immunol.174:6477-6489）、およびHolyoakeら（1999,Exp Hematol.27:1418-27）に記載されている。

本発明のいくつかの態様において、特定の造血細胞集団（例えば、HSC、HSPC、LIC、CD34+、CD34-、系統特異的マーカー等）が濃縮された細胞の集団を入手するため、ヒト造血細胞を最初の起源材料から単離する。単離された造血細胞は、純粋な集団であってもよいし、またはそうでなくてもよい。一つの態様において、本発明の組成物および方法において有用な造血細胞においては、CD34のような特定のマーカーを有する細胞が枯渇している。別の態様において、本発明の組成物および方法において有用な造血細胞は、CD34のようなマーカーについての選択によって濃縮されている。いくつかの態様において、本発明の組成物および方法において有用な造血細胞は、CD34+細胞が細胞の約1〜100％を構成する細胞集団であるが、ある種の態様においては、CD34+細胞が全細胞の1％未満を構成する細胞集団も使用することができる。ある種の態様において、本発明の組成物および方法において有用な造血細胞は、CD34+細胞が全細胞の約1〜3％を占めるT細胞が枯渇した細胞集団、CD34+細胞が全細胞の約50％を占める系統枯渇細胞集団、またはCD34+細胞が全細胞の約90％を占めるCD34+陽性の選択された細胞集団である。

少なくとも1種のヒト遺伝子を発現する遺伝学的に修飾された非ヒト動物におけるヒトの造血系および／または免疫系の生成に関連して、投与される造血細胞の数は、限定的に考慮されない。従って、非限定的な例として、投与される造血細胞の数は、約1×10³〜約1×10⁷の範囲であり得るが、様々な態様において、より多数またはより少数が使用されてもよい。別の非限定的な例として、レシピエントがマウスである時、投与されるHSPCの数は、約3×10³〜約1×10⁶ CD34+細胞の範囲であり得るが、様々な態様において、より多数またはより少数が使用されてもよい。レシピエントの他の種について、投与される必要のある細胞の数は、ルーチンの実験法のみを使用して決定され得る。

一般に、遺伝学的に修飾された非ヒト動物に存在するヒト造血細胞の数（または百分率）が、投与されたヒト造血細胞の寿命を超えた時点で、非ヒト動物へ投与されたヒト細胞の数（または百分率）より大きい時、生着が成功したと見なすことができる。投与された造血細胞の子孫の検出は、例えば、レシピエント動物におけるヒトDNAの検出、または、例えば、CD45のようなヒト細胞表面マーカーの検出によるような、完全ヒト造血細胞の検出によって達成され得る。最初のレシピエントから第二のレシピエントへのヒト造血細胞の連続移入、および第二のレシピエントにおけるヒト造血細胞の生着は、第一のレシピエントにおける生着のさらなるオプションの試験である。生着は、ヒト造血細胞の投与後1〜4ヶ月目の血液、脾臓、または骨髄におけるヒトCD45+細胞が0.05％以上として、フローサイトメトリーによって検出され得る。例えば、Watanabe（1997,Bone Marrow Transplantation 19:1175-1181）に記載されたように、幹細胞を動員するため、サイトカイン（例えば、GM-CSF）を使用することができる。

以下の実験例を参照することによって、さらに詳細に、本発明を説明する。これらの例は、例示を目的として提供されるに過ぎず、特記しない限り、限定的なものではない。従って、本発明は、決して、以下の例に限定されると解釈されるべきではなく、本明細書中に提供された教示の結果として明白になる全ての任意の変動を包含するものと解釈されるべきである。

さらなる説明なしに、当業者は、上記の説明および以下の例示的な例を使用して、本発明の化合物を作製し、利用し、特許請求の範囲に記載された方法を実施することができると考えられる。従って、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指摘するものであって、決して、開示の残りを限定するものと解釈されてはならない。

実施例1：ヒト血液リンパ系マウスにおける機能性の自然免疫応答および固形腫瘍支持
本明細書に記載されるように、ヒト血液リンパ系（HHLS）を定植されたマウスは、予測的なヒト前臨床インビボ研究のための強力なツールを表す。現在のHHLSマウスの主要な限界は、自然免疫のために重要なヒト細胞の発達が不完全であることである。本明細書において、サイトカインをコードする複数の遺伝子が遺伝学的にヒト化されている新規のマウス系統を報告する。これらのヒト化サイトカインは、ヒト造血ならびにヒト単球／マクロファージおよびNK細胞の発達および機能を効率的に支持するために共同作用する。腫瘍微小環境において、ヒトマクロファージは、免疫抑制性の表現型を獲得し、ヒト癌の増殖を支持する。より完全な機能性のヒト自然免疫系を有するHHLSマウスのこの新規モデルは、ヒト自然免疫の生理学および病理学のインビボ研究を容易にする極めて大きい可能性を有している。

単球およびマクロファージは、自然免疫応答の主要な細胞成分である（Auffray et al.,2009,Annual review of immunology 27,669）。一方では、これらの細胞は、感染を感知し、食作用または炎症誘発因子の分泌のような多様な機序によって、直接抗微生物機能を媒介することができる。他方では、単球／マクロファージは、炎症の消散および組織修復にとって重要な免疫抑制機能を獲得することができる。さらに、これらの抗炎症特性は、腫瘍浸潤マクロファージによって取り込まれ、多様な機序を通して、進化中の腫瘍に生存上の優越を提供する（Allavena and Mantovani,2012,Clinical and experimental immunology 167,195；Qian and Pollard,2010,Cell 141,39）。

マウスのような小動物モデルは、インビボの哺乳動物免疫応答を研究するために頻繁に使用されている。しかしながら、異種間には、免疫機能の基本的な違いが存在する（Mestas and Hughes,2004,Journal of Immunology 172,2731；Rongvaux et al.,2013,Annual review of immunology 31,635）。特に、単球／マクロファージ集団には、主要な表現型上および機能上の種特異的な違いが存在し、一般に、マウス研究から取得された知識は、部分的にしかヒトに適用可能でない（Auffray et al.,2009,Annual review of immunology 27,669；Rongvaux et al.,2013,Annual review of immunology 31,635；Chow et al.,2011,Nature reviews Immunology 11,788）。インビボのヒト造血・免疫機能の特異性を研究するための一つの有望なアプローチは、ヒト血液リンパ系（HHLS）を保持しているマウスの使用にある（Rongvaux et al.,2013,Annual review of immunology 31,635；Shultz et al.,2012,Nature reviews Immunology 12,786）。しかしながら、現在のHHLSマウスにおいては、単球／マクロファージおよびNK細胞のような数種のヒト免疫細胞型の発達および機能に大きい欠陥がある（Rongvaux et al.,2013,Annual review of immunology 31,635）。これらの欠陥は、対応するヒト受容体に対するマウスサイトカインの交差反応性の低下による可能性が最も高い（Manz,2007,Immunity 26,537）。この限界を超えるため、サイトカインをコードするマウス遺伝子をヒトカウンターパートに交換する戦略が開発され（Willinger et al.,2011,Trends in immunology 32,321）、このアプローチは、個々のヒト細胞型の発達および機能の有意な改善をもたらした（図16）（Rathinam et al.,2011,Blood 118,3119；Willinger et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,2390；Rongvaux et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,2378）。

造血は、多能性造血幹細胞が、より拘束された前駆細胞へ分化し、次いで、成熟血球へ分化する厳密に制御された発達過程である（Kondo et al.,2003,Annual review of immunology 21,759；Doulatov et al.,2012,Cell stem cell 10,120）。この過程は、連続的な発達段階を支持する特異的なサイトカインを必要とする（図5）。マウスにおいてヒト骨髄造血を完全に再現するためには、おそらく、複数のヒト化サイトカインの間の相乗作用が必要とされるであろう。従って、hSIRPAtg RAG2-/-IL-2Rγ-/-バックグラウンド（Traggiai et al.,2004,Science 304,104；Strowig et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,13218）において、M-CSF（Rathinam et al.,2011,Blood 118,3119）、IL-3/GM-CSF（Willinger et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,2390）、およびTPO（Rongvaux et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,2378）をコードする遺伝子がヒトカウンターパート（Willinger et al.,2011,Trends in immunology 32,321）に交換された、MISTRGと命名された新規マウス系統を生成した。

新生仔MISTRGマウスおよび（hSIRPAトランスジーンを欠く）同腹仔MITRGに、致死線量未満を照射し、標準的なプロトコルに従って、ヒト胎児肝臓由来CD34+細胞を移植した（Traggiai et al.,2004,Science 304,104）。同一の遺伝的背景を共有するが、全てのヒト化対立遺伝子を欠くRAG2-/-IL2-Rγ-/-（RG）マウス、および市販のNOD-Scid IL2-Rγ-/-（NSG）マウスを、対照として用いた。血中生着レベル（hCD45+細胞百分率）（図1Aおよび1B；および図6A）は、以前に報告されたように（Strowig et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,13218；Brehm et al.,2010,Clinical immunology 135,84）、RGマウスにおいてより低く、NSGレシピエントにおいてより高かった。MISTRGおよびNSGにおいて、血中hCD45+細胞の百分率は類似していた。血中生着は、RGと比較して、MITRGにおいても有意に増加しており、このことから、組み合わせられた遺伝子のヒト化が、おそらく、マウス自然応答を弱めることによって、SIRPα/CD47交差反応性（Strowig et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,13218；Takenaka et al.,2007,Nature immunology 8,1313；Legrand et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,13224）を通して食作用寛容を誘導する必要性を克服することが示唆された。血中に少なくとも10％のヒトCD45+細胞を有するマウスを、さらなる実験法のために選択した（図6B）。両方のMISTRGレシピエントの大多数において、骨髄（BM）におけるhCD45+細胞の百分率は、90％を超え、99％にまで達し（図1Aおよび1C；ならびに図6C〜6E）、BMにおける生着の高い効率は、SIRPα/CD47相互作用とは無関係であった。より競合的な条件においてヒト造血を支持するヒト化サイトカインの能力を試験するため、ヒトCD34+細胞を、未照射MISTRGへ移植した。このプロトコルは、全てのレシピエントの血液およびBMにヒトCD45+細胞をもたらし（図1Dおよび1E）、注目すべきことに、マウスの半分が、X線前処理の後に生着させらせたレシピエントにおいて測定された最高レベルと同等に高いキメラ化を示した（図1Eを図1Bおよび1Cと比較すること）。本明細書に記載されたデータは、MISTRGにおける複数のサイトカインの遺伝子交換によって、骨髄におけるマウス造血がほぼ完全にヒト造血に置き換わり、病理を誘導する放射線の必要性が省略され得る微小環境が作られることを示している。

次に、ヒト骨髄造血を支持するMISTRGマウスの能力を査定した。ヒト骨髄系細胞（hCD33+）は、RGおよびNSGと比較して有意に高い割合で、MISTRGの血液および骨髄に存在した（図2A；および図7A〜7C）。MISTRGにおける骨髄系細胞の割合の増加は、リンパ系に富むマウス血液とは根本的に異なっている、骨髄系細胞に富むヒト血液の生理学的組成に類似している血液組成をもたらした（Mestas and Hughes,2004,Journal of Immunology 172,2731；Rongvaux et al.,2013,Annual review of immunology 31,6354）（図2B；および図7D）。単球（CD33hiSSCloCD66-）および顆粒球（CD33+SSChiCD66+）の両方が、BMに存在し（図7E）、末梢血中のヒト骨髄系細胞集団が、単球からほぼ構成されており（図7F）、このことから、このマウス環境においては、ヒト顆粒球の最終分化およびBMからの脱出または末梢生存がまだ最適でないことが示唆された。しかしながら、重要なことに、免疫組織化学（hCD68+細胞）（図2C）またはフローサイトメトリー（hCD33+）（図7Gおよび7H）によって示されたように、ヒト骨髄系細胞が、MISTRGの肺、肝臓、および結腸のような非リンパ組織に多数存在し、NSGマウスにおいて見出されたヒト骨髄系細胞の数を、有意に、およそ10倍、超えていた。

ヒトにおいては、CD14マーカーおよびCD16マーカーの発現に基づき、表現型的および機能的に、単球の三つのサブセットが記載されている（Auffray et al.,2009,Annual review of immunology 27,669；Cros et al.,2010,Immunity 33,375）。ヒト単球の三つの亜集団（CD14+CD16-、CD14+CD16+、およびCD14dimCD16+）の全てが、MISTRGのリンパ組織ならびに肺および肝臓のような非リンパ組織に存在していた（図2Dおよび2E；ならびに図8Aおよび8B）。対照的に、NSGにおいては、骨髄系細胞の頻度がより低いことに加えて、CD14+CD16-単球およびある程度のCD14+CD16+単球のみが一貫して検出され得、CD14dimCD16+細胞はほとんど示されなかった。MISTRGにおいて見出された単球亜集団の拡張的な免疫表現型（CD33、CD11b、CD115、CD62L、およびCX3CR1）は、ヒト末梢血における等価なサブセットに緊密に匹敵した（図9）。MITRGのBMから単離されたヒトCD14+CD16-単球およびCD14+CD16+単球は、TLR4およびTLR7/8のリガンド（それぞれLPSおよびR848）に応答して高レベルの炎症性サイトカインを産生した（図2Fおよび2G）。MITRGのWBCに対して実施されたインビトロアッセイにおいて、CD14+CD16-細胞およびCD14+CD16+細胞の両方が、GFPを発現する大腸菌を貪食する高い能力を有していたが、CD14dimCD16+単球は限定された食作用能力を有しており（図2H）、これは、再び、ヒト血中の対応する亜集団の生理学的特性を反映した（Cros et al.,2010,Immunity 33,375）。LPSを用いてインビボ投与されるか、または細菌性およびウイルス性のヒト病原体、それぞれ、リステリア菌およびA型インフルエンザに感染した時、MISTRGマウスは、ヒト炎症性サイトカイン（それぞれ、TNFα、IL-6、およびIFNγ）を大量に産生して応答したが、NSGマウスは、有意に低い、約1log低い応答を示した（図2I〜2K）。これらの結果は、MISTRGにおいて発達するヒト単球サブセットが、インビトロおよびインビボで、機能性であることを証明している。しかしながら、マウスにおける機能性のヒト食細胞の存在の欠点は、ヒト-マウス食作用寛容の突破であり、マウスRBCはそれに対して特に感受性である（図10Aおよび10B）。このマウスRBCの破壊は、貧血をもたらし（図10C〜10I）、生着マウスの寿命を10〜12週（MISTRG）または12〜16週（MITRG）に限定した。

骨髄系細胞は、サイトカインの産生を通して、他の免疫細胞の発達および分化を支持することができる。MISTRGマウスの骨髄コンパートメントが、IL-15のようなヒトサイトカインの起源であるか否かを、査定した。この概念と一致して、ヒトIL-15およびヒトIL-15RαのmRNA発現が、NSGと比較した時、MISTRGにおいて10倍以上増加していることが見出された（図3A；および図11A）。MISTRGにおけるヒトIL-15/IL-15Rαの細胞起源をより詳細に明確にするため、精製されたヒト細胞集団におけるヒトIL-15およびヒトIL-15Rαの転写物の存在量を測定した。ヒトIL-15RαmRNAの発現は、非骨髄系細胞（hCD33-）よりヒト骨髄系細胞（hCD33+）において高かった（図3B）。特に、CD14+CD16+単球は、IL-15およびIL-15Rαの両方の転写物の濃縮を示した（図3B）。MISTRGからのヒト骨髄系細胞の表面上のヒトIL-15Rαタンパク質の発現は、フローサイトメトリーによって確認された（図11B）。

これらの所見に基づき、MISTRGマウスが、NK細胞のようなIL-15トランスプレゼンテーションに依存性のヒト免疫細胞の発達を支持するか否かを査定した（Ma et al.,2006,Annual review of immunology 24,657；Soderquest et al.,2011,Blood 117,4511）。マウスIL-15はインビボでヒトNK細胞を支持するのに十分でないため、現在のHHLSマウスモデルにおけるヒトNK細胞の効率的な発達は、ヒトIL-15/IL-15Rαの外来性の薬理学的送達を必要とする（Huntington et al.,2009,Journal of experimental medicine 206,25；Chen et al.,2009,Proceedings of the National Academy of Sciences 106,21783；Pek et al.,2011,Immunobiology 216,218）23-25）。以前に報告されたように（Huntington et al.,2009,Journal of experimental medicine 206,25；Chen et al.,2009,Proceedings of the National Academy of Sciences 106,21783；Pek et al.,2011,Immunobiology 216,218）、生着NSGにおいては極めて少数のヒトNK細胞（hNKp46+hCD3-）が観察された（図3Cおよび3D；ならびに図12Aおよび12B）。対照的に、ヒトNK細胞は、生着MISTRGの複数の組織に容易に検出され、NSGと比較しておよそ10倍増加していた（図3Cおよび3D；ならびに図12Aおよび12B）。骨髄とは別に、MITRGはMISTRGより少ないヒトNK細胞を有していたが、それは、以前に報告された、末梢におけるヒトNK細胞の生存のためのヒトSIRPαの必要性のためである可能性が最も高い（Legrand et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,13224）。MISTRGマウスにおけるhNKp46+hCD3-細胞は、ヒト対照に緊密に類似した典型的なNK細胞表面マーカーCD94、CD161、およびキラー細胞抑制受容体（KIR）を発現していたため、真のNK細胞を表していた（図12Aおよび12B）。発達に対する効果に加えて、IL-15は、NK細胞の成熟も促進する。それと一致して、成熟マーカーCD16の表面発現および溶解性顆粒タンパク質パーフォリンの量が、NSGと比較して、MISTRGに由来するNK細胞において、より高いことが見出された（図13C〜13F）。

ヒトにおけるインビボのIL-15トランスプレゼンテーションの細胞起源は、現在未知であるが、ヒト骨髄系細胞はインビトロでヒトNK細胞増殖を支持することができる（Huntington et al.,2009,Journal of experimental medicine 206,25）。ヒト単球／マクロファージによるヒトIL-15のトランスプレゼンテーションが、MISTRGにおける改善されたヒトNK細胞発達の基礎であるか否かを試験するために、食細胞を枯渇させるため、リポソームに封入されたクロドロン酸によってマウスを処理した（図14）。食細胞の枯渇は、ヒトNK細胞の有意な低下も誘導し（図3E）、このことから、ヒト単球／マクロファージが、実際に、インビボのヒトNK細胞ホメオスタシスを支持するため、IL-15をトランスプレゼントする重要な細胞型であることが示唆された。

NK細胞は、MHCクラスIの発現を欠く（自己喪失）細胞を死滅させることによって（Raulet,2006,Seminars in immunology 18,145）、そしてキーサイトカインIFNγを産生することによって（Vivier et al.,2008,Nature immunology 9,503）、病原体に対する自然防御に参加する。より高度のパーフォリン発現（図13Eおよび13F）と一致して、MHCクラスIを欠くヒト細胞に対する有意に増強されたNK細胞の細胞傷害活性が、NSGと比較して、MISTRGにおいてインビボで観察された（図3F）。NK細胞はリステリア感染後のIFNγの初期の起源である。従って、感染後2日目に、肝臓におけるヒトIFNγmRNAの発現は、NSGよりMISTRGにおいて10倍以上高度であることが見出された（図3G）。1細胞解像度で、リステリア感染MISTRGに由来するNK細胞は、NSGより有意に高い頻度で（図3I）、エクスビボ再刺激なしにヒトIFNγの産生を示した（図3H）。MISTRGにおけるNK細胞は、CD107aの細胞膜露出によって示されるように、リステリア感染後に溶解活性（脱顆粒）も有していた（図3H）。全体として、MISTRGは、ヒト骨髄系細胞の効率的な産生を介して、ヒトNK細胞の発達、分化、および機能を支持し、それによって、現在のHHLSマウスモデルの一つの主要な限界を克服する。

次に、腫瘍微小環境の情況におけるヒト骨髄系細胞の役割を査定した。従って、ヒト黒色腫細胞株Me290を、腫瘍モデルとして使用した（Valmori et al.,1998,Journal of immunology 160,1750）。臨床的観察は、骨髄系細胞が、数種の固形腫瘍において腫瘍に浸潤すること、浸潤マクロファージの高い密度が、大部分の型の癌において患者予後不良と相関することを示している（Qian and Pollard,2010,Cell 141,39；Coussens et al.,Science 339,286；Egeblad et al.,2010,Developmental cell 18,884；Nelson and Bissell,2006,Annual review of cell and developmental biology 22,287；Bingle et al.,2002,T Journal of pathology 196,254）。従って、（CD45およびCD11bをそれぞれコードする）ヒトPTPRCおよびITGAMのmRNAの発現によって示されるように、MISTRGにおいて、NSGより高度の腫瘍へのヒト骨髄系細胞浸潤が検出された（図4A）。患者におけるヒト腫瘍に緊密に類似して、マクロファージマーカーCD163およびCD14を発現する細胞が、MISTRGの腫瘍に多く存在したが、NSGの同一の腫瘍ではほとんど検出不可能であった（図4Bおよび4C；ならびに図15）。CD163+細胞の大部分が、低レベルのHLA-DRおよび高レベルのCD206も発現していた（図4Bおよび4D）。この免疫表現型は、「M2様」マクロファージに一般に関連している（Hao et al.,2012,Clinical & developmental immunology 2012,948098；Tang,2013,Cancer Lett 332,3）。

マクロファージのM2サブタイプは、癌細胞への増殖シグナル、抗アポトーシスシグナル、血管新生促進活性、原発腫瘍からの癌細胞の脱出および転移の形成の許容を含む、多様なエフェクター機序を介して、腫瘍進行を促進する（Qian and Pollard,2010,Cell 141,39；Coussens et al.,Science 339,286；Egeblad et al.,2010,Developmental cell 18,884）。MISTRGにおいて腫瘍へのマクロファージ浸潤が腫瘍増殖を促進し得るか否かを査定した。注目すべきことに、ヒトCD163+HLA-DRlowCD206+マクロファージが多量に浸潤しているCD34+生着MISTRGにおける腫瘍のサイズは、ヒトマクロファージが浸潤していないNSGマウスにおける腫瘍より有意に大きく、非生着NSGマウスまたは非生着MISTRGマウスにおいて見られたのと同一の小さいサイズであることが観察された（図4Eおよび4F）。マクロファージが腫瘍増殖を支持する機序のうちの一つは、血管新生および免疫抑制を促進するサイトカインまたは酵素の産生を通したものである。VEGFは、重要な多機能性の腫瘍支持分子であり（Kandalaft et al.,Current topics in microbiology and immunology 344,129；Motz and Coukos,Immunity 39,61）、この因子がMISTRGにおける腫瘍増殖に関与しているか否かを試験するため、マウスをヒトVEGF阻害剤Avastin（商標）によって処理した。この処理は、腫瘍増殖表現型を完全に逆転させ（図4F）、そのことから、MISTRGにおける骨髄系細胞がVEGF依存性の機序を通して黒色腫増殖を支持することが証明された。全体として、これらの結果は、MISTRGマウスが、腫瘍発達におけるヒトマクロファージの役割を再現し、特に、腫瘍発達の開始時の、インビボのヒト腫瘍とヒトマクロファージとの間の相互作用の研究を可能にするモデルの重要な必要性を満たすことを示す。

本明細書に記載されたデータは、MISTRGマウスへの複数のヒトサイトカインの提供が、ヒト造血、およびヒト免疫細胞機能のための直接または間接の支持に対して、相乗効果をもたらすことを証明した（図16）。HHLSマウスのMISTRGモデルは、インビボでヒト自然免疫応答を研究する独特の機会を提示する。

材料および方法を以下に記載する。

マウス系統
RAG2-/-γc-/-Balb/c×129遺伝的背景における、TPO、IL-3/GM-CSF、およびM-CSFをコードする遺伝子のノックイン交換、またはヒトSIRPαのBACトランスジェニック発現によるマウスの生成が報告された（Rathinam et al.,2011,Blood 118,3119；Willinger et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,2390；Rongvaux et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,2378；Strowig et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,13218）。これらの系統を、MITRG（M-CSFh/hIL-3/GM-CSFh/hTPOh/hRAG2-/-γc-/-）マウスおよびMISTRG（M-CSFh/hIL-3/GM-CSFh/hhSIRPAtgTPOh/hRAG2-/-γc-/-）マウスを入手するため、交雑した。それらのマウスは、生存可能で、健康で、繁殖性である。マウスは、エンロフロキサシン含有飲料水（Baytril、0.27mg/ml）で継続的に処理しながら、特定病原体除去条件下で維持された。NOD Scidγc-/-（NSG）マウスは、Jackson Laboratoryから入手された。

ヒトHSPCの調製およびレシピエントマウスへの生着
記載されたように（Rathinam et al.,2011,Blood 118,3119；Willinger et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,2390；Rongvaux et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,2378；Traggiai et al.,2004,Science 304,104；Strowig et al.,2011,Proceedings of the National Academy of Sciences 108,13218）、レシピエントマウスにヒト造血幹細胞・前駆細胞を生着させた。胎児肝臓試料を、小片へ切断し、コラゲナーゼD（Roche、100ng/mL）によって37℃で45分間処理し、細胞懸濁物を調製した。密度勾配遠心（Lymphocyte Separation Medium,MP Biomedicals）後の抗ヒトCD34ミクロビーズ（Miltenyi Biotec）によるポジティブ免疫磁気選択によって、ヒトCD34+細胞を精製した。細胞を、10％DMSOを含有しているFBSにおいて凍結させ、液体窒素中に維持した。

生着のため、新生仔マウス（生後2日以内）に致死線量未満を照射し（X線照射；RG、2×180cGy、4時間間隔；NSG、1×100cGy；MISTRG、1×150cGy）、100,000個のFL-CD34+細胞を含む20μLのPBSを、22ゲージ針（Hamilton Company）を用いて肝臓へ注射した。特定の実験（図1Dおよび1E）においては、200,000〜300,000個の細胞を、未照射MISTRG新生仔レシピエントへ注射した。7〜9週後にマウスから採血し、ヒトCD45+細胞の百分率をフローサイトメトリーによって測定した。ヒトCD45+細胞が、総（マウスおよびヒトの合計）CD45+集団の少なくとも5％（RG）または10％（NSG、MITRG、およびMISTRG）を占めるマウスを、さらなる実験法のために選択した。移植の9〜12週後にマウスを屠殺するかまたは実験のために使用した。

全ての実験が、Yale University Human Investigation Committee and Yale Institutional Animal Care and Use Committeeのプロトコルに準拠して実施された。

ヒト細胞集団の免疫表現型分析
WBCを調製するため、ヘパリン処置血液を、RBCを排除するため、ACK溶解緩衝液によって2回処理した。（大腿骨および脛骨から洗い流された）脾臓および骨髄の単細胞懸濁物を、ACK溶解緩衝液によって処理した。組織を機械的に解離させ、100U/mlコラゲナーゼIVおよび0.02mg/ml DNase I（Sigma）によって37℃で1時間消化した後の密度勾配遠心によって、肝臓および肺の白血球を単離した。

FACS分析のため、以下の抗原に対する抗体を使用した。

マウス抗原：CD45（クローン30-F11）、CD71（RI7217）、Ter119。

ヒト抗原：CD1c（BDCA1、クローンL161）、CD3（UCHT1）、CD11b（ICRF44）、CD11c（3.9）、CD14（M5E2）、CD16（3G8）、CD19（HIB19）、CD33（WM53）、CD45（HI30）、CD62L（DREG-56）、CD66（ASL-32）、CD94（DX22）、CD107a（H4A3）、CD115（9-4D2-1E4）、CD123（6H6）、CD141（BDCA3、M80）、CD161（HP-3G10）、CD235a（HI264）、CD303（BDCA2、201A）、NKp46（9E2）、IL-15Rα（JM7A4）、CX3CR1（2A9-1）、HLA-A、B、C（W6/32）、HLA-DR（L243）、IFNγ（B27）、KIR2DL1/S1（HP-MA4）、KIR2DL2/L3（DX27）、KIR3DL1（DX9）、パーフォリン（dG9）。

ヒト系統カクテル：CD3、CD15、CD19、CD56、NKp46。

全ての抗体を、Biolegend、BD Biosciences、またはMiltenyi Biotecから入手した。データは、LSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences）においてFACSDivaによって獲得され、FlowJoソフトウェアによって分析された。

組織学的分析のため、脾臓、肺、肝臓、および結腸の組織を、IHC亜鉛固定液（BD Biosciences）または4％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンで包埋した。切片を、ヘマトキシロンおよびエオシン、または抗ヒトCD68抗体（クローンPGM1）後のHRPコンジュゲート二次抗体によって染色し、ペルオキシダーゼ基質3,3'-ジアミノベンジジンによって発色させた。

インビトロ食作用アッセイ
GFPを発現する大腸菌を、OD600が1.5〜1.8になるまで、37℃で一晩、LB培地において増殖させ、その時点で、細菌を希釈しOD600がおよそ1.0になるまで1〜2時間増殖させた。大腸菌をPBSで3回洗浄し、1×10⁷ WBC当たり約2×10⁸の大腸菌で、200μlの容量で、37℃で4時間、MITRGマウスに由来するWBCと共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞をPBSによって洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。

インビトロTLR刺激およびインビボ感染
ヒト単球サブセットをマウスのBMから単離した。簡単に説明すると、BM細胞を、6匹のマウスの後肢および脊椎から回収しプールした。ヒトCD33+細胞を、磁気単離（EasySep CD33選択キット、StemCell Technologies）によって濃縮した。CD14+CD16-サブセットおよびCD14+CD16+サブセットを、FACSAriaセルソーター（BD Biosciences）で精製した。200μl培地中の100,000個の細胞を、TLR4リガンドLPS（E.Coli 0111:B4、Sigma-Aldrich、100ng/ml）またはTLR7/8リガンドR848（Invivogen、10μg/ml）の存在下で一晩培養した。

インビボ刺激のため、35μgのLPS（E.Coli 0111:B4、Sigma-Aldrich）を含む100μl PBSを腹腔内注射し、90分後に血清を収集した。

3×10³コロニー形成単位（CFU）のリステリア菌（10403S株）を、静脈注射によって、マウスに感染させた。感染の48時間後に、血清および組織を、それぞれELISAおよびqPCRのために採集した。未感染マウスまたは感染マウスからの肝臓リンパ球を、モネンシン（GolgiStop、BD Biosciences）および抗ヒトCD107a抗体を含有している培地において、37℃／5％CO₂で4時間インキュベートした。次いで、細胞を、表面抗原について染色し、Cytofix/Cytopermキット（BD Biosciences）を使用して透過性化し、細胞内ヒトIFNγについて染色した。

2×10⁴PFUのインフルエンザA/PR8（H1N1）ウイルスをマウスに鼻腔内感染させ、感染後3日目に、qPCR分析のため、肺を採集した。

マウス血清中および培養上清中のサイトカイン濃度（ヒトTNFα、IL-6、およびIL-1β）は、製造業者の指示に従って、ELISA MAX標準キット（Biolegend）を使用して測定された。

RBC分析
RBC数はHemavet 950（Drew Scientific）で測定した。血液塗抹標本はライト-ギムザによって染色した。マウスRBC移入実験については、血液をRGマウスから入手し、CFSE（20μM、37℃で15分）によって標識し、PBSによって3回洗浄し、200μlの標識されたRBCを後眼窩静脈注射によって注射した。5分後に、フローサイトメトリーによってTer119+細胞中のCFSE陽性細胞の初期頻度（0日目、100％）を決定するため、マウスから採血した。次いで、示された時点で採血し、CFSEによって標識されたTer119+細胞の維持を、0日目の値に対する百分率として計算した。

インビボ食細胞の枯渇
100μlのクロドロン酸負荷リポソーム（Van Rooijen and Sanders,1994,Journal of immunological methods 174,83）の静脈内後眼窩注射によって、食細胞を枯渇させた。クロドロン酸リポソームを1日3回注射し、最後の注射の24時間後に、マウス肝臓内のヒトNK細胞を分析した。RBC食作用アッセイについては、クロドロン酸リポソームを、CFSEによって標識されたRBCの移入の3日前および1日前に注射した。

定量的RT-PCR
製造業者の指示に従って、TRIzol試薬（Invitrogen）によって、組織または精製された細胞から全RNAを抽出し、SuperScript First-Strand Synthesis System（Invitrogen）によるcDNA合成のために使用した。ABIから購入されたプライマー-プローブセットを用いて、7500 Fast Real-Time PCR系で、定量的RT-PCRを実施した。比較CT法（comparative threshold cycle method）を使用して発現値を計算し、示されたように、マウスHprtまたはヒトHPRTに対して標準化した。

インビボNK細胞細胞傷害アッセイ
インビボのヒトNK細胞による細胞傷害を、以前に報告されたプロトコル（Strowig et al.,2010,Blood 116,4158）に従って決定した。LCL721.221（HLAクラスI陰性）細胞およびLCL721.45（クラスI陽性）細胞を1:1比で混合し、CellTrace Violet（Invitrogen）によって標識し、生着NSGマウスまたは生着MISTRGマウスへ静脈内注射した（1×10⁷細胞/マウス）。マウスを12時間後に屠殺し、脾臓の単細胞懸濁物を調製し、フローサイトメトリーによって分析した。青紫色細胞の中のHLAクラスI陽性および陰性の割合を測定し、（MHCクラスI陽性−MHCクラスI陰性）×100／MHCクラスI陽性として、特異的溶解を計算した。

腫瘍形成
ヒト黒色腫細胞株Me290（Valmori et al.,1998,Journal of immunology 160,1750）を、およそ90％コンフルエンシーにまで増殖させ、細胞（マウス1匹当たりおよそ700万個の細胞）を、マウスの側腹部に麻酔下で皮下注射した。いくつかの実験については、腫瘍植え込みの日から開始して、抗ヒトVEGF抗体Avastin（商標）（Roche；100μg静脈内）によってマウスを一日おきに処理した。腫瘍のサイズを11日後に測定し、以下の式を使用して体積を計算した：体積＝0.5×長さ2×幅。

患者およびマウスの組織を、OCT（Optimum Cutting Temperature、Sakura Finetek）で凍結させた。凍結切片（7μm）を、トリトン100X 0.1％によって15分間、ヒアルロニダーゼ0.03％によって15分間、Background Buster（Innovex bioscience）によって15分間、Fc Receptor Block（Innovex bioscience）によって15分間、さらにBackground Busterによって15分間、連続的に処理した。次いで、切片を、5％BSAおよび0.01％サポニンが補足されたPBSで希釈された一次抗体によって室温で1時間染色し、洗浄し、二次抗体によって室温で40分間染色した。核を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（1μg/mL）によって2分間染色した。

一次抗体：ヒトCD14（1:200、UCHM1、AbD Serotec）；ヒトCD163（1:200、EDHu-1、AbD Serotec）；ヒトCD206（1:100、15-2、AbD Serotec）；ヒトHLA-DR（1:100、LN3、Biolegend）。CD163/CD206組み合わせ染色のため、両方の抗体を、組織染色前に、Alexa Fluor 488または568 Antibody Labeling Kit（Molecular Probes）によって標識した。

二次抗体：ヤギ抗ラットAlexa Fluor 568；ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488；ヤギ抗マウスAlexa Fluor 588、またはヤギ抗マウスAlexa Fluor 647（1:700、Molecular Probes）。

免疫蛍光イメージングを、NIS-Element Arソフトウェア（Nikon Instruments Inc）を介して操作されたEclipse Ti倒立顕微鏡系（Nikon Instruments Inc.）で実施した。

CD163+細胞浸潤の密度の定量化のため、3人の異なる黒色腫患者、3匹のNSG、および3匹のMISTRGに由来する腫瘍を選択した。各腫瘍から、3個の凍結切片をヒトCD163について染色した。染色された各切片から、3枚の代表的な画像を獲得し、各群（患者、MISTRG、およびNSG）から全部で27枚の代表的な画像を獲得した。各画像について、CD163+細胞をNIS-Element Arソフトウェア（Nikon Instruments Inc.）を使用して計数した。「チャンネルを分割（split channels）＋オーバーレイ（overlay）」ディスプレイを使用して、別々の各チャンネルおよびオーバーレイでの同時ズームによって、各画像を分析した。

統計分析
統計分析は、一元配置のANOVA後のチューキーの事後検定、両側独立スチューデントt検定、または反復測定ANOVAを使用して、GraphPad Prism 5ソフトウェアによって実施された。

実施例2：ヒト骨髄性新生物をMISTRGに生着させることが可能である
骨髄性白血病は、骨髄系統の細胞に影響を与える癌の型である。骨髄性白血病は、急性骨髄性白血病（AML）、骨髄増殖性障害（MPD）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、および骨髄異形成症候群（MDS）を含む種々の型に分類される。骨髄性白血病を発症するリスクは、年齢と共に増加し、これらの疾患の罹患率は、集団の高齢化と共に増加する可能性が高い。治療アプローチおよび支持療法アプローチが、クリニックにおいて利用可能であるが、この疾患群についてのよりよい理解および新規治療が必要とされている。

ヒト白血病を研究するために使用される方法のうちの一つは、患者試料の免疫不全マウスへの異種移植に頼る。しかしながら、現在入手可能なレシピエントマウスは、この目的のために最適ではない：AML試料の一部のみが、成功裡に生着することができ；MPD、CMML、またはMDS（RCUD、RAEB I、およびRAEB IIを含む）の頑強な生着は、従来報告されていない。従って、レシピエントマウスの最適化された系統が、ヒト骨髄性白血病のよりよい生着のために必要とされている。

MISTRGがヒト造血細胞のよりよい生着を支持し、骨髄におけるマウス型造血からヒト型造血へのほぼ完全な交換をもたらすことが、本明細書において証明される。AML、CMML、およびMDSを有する患者から単離された試料を、MISTRGに生着させることが可能であることも、本明細書中に示される（図17）。

従って、本明細書に記載された遺伝学的に修飾された非ヒト動物は、（i）疾患の細胞的および分子的な病原を研究し；（ii）予測的または予後的に有益なバイオマーカーを同定し；（iii）治療のための新規標的を同定し；（iv）前臨床状況および患者特異的な状況において治療を試験するために有用であろう、ヒト骨髄性白血病の新規インビボ動物モデルを表す。

本明細書中に引用された全ての特許、特許出願、および出版物の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。具体的な態様に関して本発明が開示されたが、本発明の他の態様および変動が、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることは、明白である。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような態様および等価な変動を含むと解釈されるものとする。

Claims (16)

1. ゲノムを有する、遺伝学的に修飾された免疫不全げっ歯類動物を作製するための方法であって、該方法は、該ゲノムが：
   ヒトM-CSFポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトIL-3ポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトGM-CSFポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトSIRPAポリペプチドをコードする核酸、および
   ヒトTPOポリペプチドをコードする核酸
   を含むように該ゲノムを遺伝学的に修飾する工程
   を含み、
   ヒトM-CSFポリペプチドをコードする核酸、ヒトIL-3ポリペプチドをコードする核酸、ヒトGM-CSFポリペプチドをコードする核酸、ヒトSIRPAポリペプチドをコードする核酸、およびヒトTPOポリペプチドをコードする核酸が、各々プロモーターに機能的に連結され、
   かつ該げっ歯類動物が、ヒトM-CSFポリペプチド、ヒトIL-3ポリペプチド、ヒトGM-CSFポリペプチド、ヒトSIRPAポリペプチド、およびヒトTPOポリペプチドを発現する、方法。
2. ヒト造血細胞を、遺伝学的に修飾された免疫不全げっ歯類動物に移植する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. ヒト造血細胞がCD34+細胞を含む、請求項２に記載の方法。
4. ヒトワクチンを試験するための方法であって、該方法は、該ワクチンの効果を試験するために、遺伝学的に修飾された免疫不全げっ歯類動物を該ワクチンで処置する工程を含み；遺伝学的に修飾された免疫不全げっ歯類動物が、
   ヒトM-CSFポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトIL-3ポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトGM-CSFポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトSIRPAポリペプチドをコードする核酸、および
   ヒトTPOポリペプチドをコードする核酸
   を含むゲノムを有し；
   ヒトM-CSFポリペプチドをコードする核酸、ヒトIL-3ポリペプチドをコードする核酸、ヒトGM-CSFポリペプチドをコードする核酸、ヒトSIRPAポリペプチドをコードする核酸、およびヒトTPOポリペプチドをコードする核酸が、各々プロモーターに機能的に連結され；
   該げっ歯類動物が、ヒトM-CSFポリペプチド、ヒトIL-3ポリペプチド、ヒトGM-CSFポリペプチド、ヒトSIRPAポリペプチド、およびヒトTPOポリペプチドを発現し；かつ
   該げっ歯類動物にヒト造血細胞が生着している、方法。
5. ヒト造血細胞がCD34+細胞を含む、請求項４に記載の方法。
6. 造血細胞または免疫細胞の機能をモジュレートする薬剤の効果を試験するための方法であって、該方法は、該薬剤の効果を試験するために、遺伝学的に修飾された免疫不全げっ歯類動物を該薬剤で処置する工程を含み；遺伝学的に修飾された免疫不全げっ歯類動物が、
   ヒトM-CSFポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトIL-3ポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトGM-CSFポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトSIRPAポリペプチドをコードする核酸、および
   ヒトTPOポリペプチドをコードする核酸
   を含むゲノムを有し；
   ヒトM-CSFポリペプチドをコードする核酸、ヒトIL-3ポリペプチドをコードする核酸、ヒトGM-CSFポリペプチドをコードする核酸、ヒトSIRPAポリペプチドをコードする核酸、およびヒトTPOポリペプチドをコードする核酸が、各々プロモーターに機能的に連結され；
   該げっ歯類動物が、ヒトM-CSFポリペプチド、ヒトIL-3ポリペプチド、ヒトGM-CSFポリペプチド、ヒトSIRPAポリペプチド、およびヒトTPOポリペプチドを発現し；かつ
   該げっ歯類動物にヒト造血細胞が生着している、方法。
7. ヒト造血細胞がCD34+細胞を含む、請求項６に記載の方法。
8. 癌細胞の増殖もしくは生存をモジュレートする薬剤の効果を試験するための、または癌の該薬剤に関する処置のインビボ評価のための方法であって、該方法は：
   遺伝学的に修飾された免疫不全げっ歯類動物に、ヒト癌細胞を移植する工程；および
   該薬剤の効果を試験するために、該遺伝学的に修飾された免疫不全げっ歯類動物を該薬剤で処置する工程
   を含み；
   該遺伝学的に修飾された免疫不全げっ歯類動物が、
   ヒトM-CSFポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトIL-3ポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトGM-CSFポリペプチドをコードする核酸、
   ヒトSIRPAポリペプチドをコードする核酸、および
   ヒトTPOポリペプチドをコードする核酸
   を含むゲノムを有し；
   ヒトM-CSFポリペプチドをコードする核酸、ヒトIL-3ポリペプチドをコードする核酸、ヒトGM-CSFポリペプチドをコードする核酸、ヒトSIRPAポリペプチドをコードする核酸、およびヒトTPOポリペプチドをコードする核酸が、各々プロモーターに機能的に連結され；
   該げっ歯類動物が、ヒトM-CSFポリペプチド、ヒトIL-3ポリペプチド、ヒトGM-CSFポリペプチド、ヒトSIRPAポリペプチド、およびヒトTPOポリペプチドを発現し；かつ
   該げっ歯類動物にヒト造血細胞が生着している、方法。
9. ヒト造血細胞がCD34+細胞を含む、請求項８に記載の方法。
10. ゲノムが、組換え活性化遺伝子2(Rag-2)の遺伝子ノックアウトをさらに含有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. ゲノムが、IL2受容体γ鎖(IL2rg)の遺伝子ノックアウトをさらに含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 遺伝学的に修飾された免疫不全げっ歯類動物がマウスである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ヒトSIRPAポリペプチドが、全長ヒトSIRPAポリペプチドの、生物学的活性を有する断片である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. ヒトSIRPAポリペプチドが融合タンパク質である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
15. ヒトSIRPAポリペプチドが、全長ヒトSIRPAポリペプチドの、生物学的活性を有する断片を含む融合タンパク質である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
16. ヒトM-CSFポリペプチドをコードする核酸、ヒトIL-3ポリペプチドをコードする核酸、ヒトGM-CSFポリペプチドをコードする核酸、ヒトSIRPAポリペプチドをコードする核酸、およびヒトTPOポリペプチドをコードする核酸が、それぞれ、ネイティブげっ歯類M-CSFプロモーター、IL-3プロモーター、GM-CSFプロモーター、SIRPAプロモーター、およびTPOプロモーターに機能的に連結される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。

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