ES2917884T3

ES2917884T3 - Protocolos de acondicionamiento y uso de los mismos para la regeneración de tejidos

Info

Publication number: ES2917884T3
Application number: ES16739268T
Authority: ES
Inventors: Yair Reisner; Chava Rosen; Elias Shezen; Krentsis Irit Milman
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2015-06-18
Filing date: 2016-06-16
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2036-06-16
Also published as: EP4026563A1; WO2016203477A1; US10668109B2; US20200289582A1; US20180169152A1; EP3310388B1; EP3310388A1

Abstract

Se revela un método de acondicionamiento de un sujeto que necesita trasplante de células progenitoras en suspensión de un tejido de interés. El método que comprende: (a) administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente capaz de inducir daños al tejido de interés, en el que el daño da como resultado la proliferación de células madre residentes en el tejido; y posteriormente (b) sometiendo el sujeto a un agente que ablata las células madre residentes en el tejido. También se revela un método de trasplante de células progenitoras en suspensión de un tejido de interés para un sujeto que lo necesite. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Protocolos de acondicionamiento y uso de los mismos para la regeneración de tejidos

CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA DESCRIPCIÓN

La presente descripción, en algunos aspectos de la misma, se refiere a protocolos de acondicionamiento y al uso de los mismos para la regeneración de tejidos.

Las enfermedades pancreáticas tales como la diabetes, las enfermedades pulmonares tales como la EPOC, fibrosis quística, enfisema, fibrosis pulmonar o hipertensión pulmonar, las enfermedades hepáticas tales como la cirrosis hepática o las enfermedades hepáticas virales (por ejemplo, hepatitis B o C), las enfermedades cardíacas tales como la insuficiencia cardíaca, y las enfermedades renales tales como la insuficiencia renal, son enfermedades de gran impacto médico y económico para las que no se dispone de tratamientos satisfactorios/óptimos. La mayoría de las terapias disponibles en la actualidad solo mejoran ligeramente la calidad de vida de los pacientes que lo necesitan. En la actualidad, el único tratamiento definitivo para la enfermedad pulmonar, la enfermedad hepática, la enfermedad cardíaca y la enfermedad renal en etapa terminal es el reemplazo del órgano dañado, pero muchos pacientes mueren mientras están en lista de espera debido a una grave escasez de órganos para trasplante, estableciéndose a menudo el límite de inscripción en los 60 años.

El trasplante de injertos de donantes compatibles con haplotipos totalmente diferenciados es un procedimiento médico de elección que salva vidas para reemplazar órganos lesionados o enfermos, tales como páncreas, corazón, hígado o pulmón. Sin embargo, tal modalidad de tratamiento adolece de considerables desventajas. El trasplante alogénico de órganos/tejidos es imposible de implementar en muchos casos debido a la falta de donantes de órganos (por ejemplo, generalmente cadáveres) y a la falta de disponibilidad de donantes de órganos compatibles inmunológicamente adecuados. Además, el uso de donantes humanos vivos a menudo presenta riesgos para la salud y dilemas éticos. Por tanto, un gran número de pacientes, que de otro modo se beneficiarían del trasplante terapéutico, sucumben a enfermedades asociadas con insuficiencia pancreática, hepática, pulmonar y renal mientras esperan donantes compatibles para el trasplante.

Por lo tanto, en vista de los beneficios curativos potenciales únicos de la terapia de trasplante, existe claramente una necesidad urgente y duradera de órganos/tejidos pancreáticos, hepáticos, pulmonares y renales derivados de donantes no singénicos que puedan obtenerse en cantidades suficientes, y que puedan tolerarse inmunológicamente de manera óptima, para hacer factible el trasplante terapéutico rutinario y óptimamente eficaz de tales órganos/tejidos.

Una estrategia que se ha propuesto para cumplir con este objetivo es la utilización de injertos para trasplante en etapa gestacional.

Antecedentes adicionales incluyen:

La Publicación PCT n° WO 2006/038211 se refiere a métodos para proporcionar una función de tejido y/o órgano pancreático, linfoide/hematopoyético o pulmonar a un sujeto mamífero. El método comprende trasplantar al sujeto un injerto de órgano/tejido pancreático, linfoide/hematopoyético o pulmonar de mamífero en desarrollo, respectivamente. El injerto pulmonar descrito en el documento WO 2006/038211 se encuentra en una etapa de desarrollo que corresponde esencialmente a la de un órgano/tejido pulmonar porcino en una etapa gestacional seleccionada de un intervalo de aproximadamente 42 a aproximadamente 80 días de gestación.

La Publicación PCT n° WO 2004/078022 se refiere a métodos para tratar un trastorno asociado a la fisiología o morfología patológica de órganos o tejidos. El método se efectúa trasplantando a un sujeto un injerto de tejido u órgano de mamífero (por ejemplo, injerto de órgano o tejido renal, pancreático, hepático, cardíaco o linfoide) seleccionado que no expresa o no presenta sustancialmente al menos una molécula capaz de estimular o potenciar una respuesta inmune en el sujeto.

Otra estrategia, que se ha propuesto para cumplir con este objetivo, implica el uso de poblaciones aisladas de células, tales como hepatocitos, células progenitoras hematopoyéticas y células madre (por ejemplo, sangre de cordón umbilical y médula ósea).

La Publicación PCT n° WO 2013/084190 se refiere a una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo una población aislada de células en suspensión de tejido pulmonar fetal de mamífero. El tejido pulmonar fetal se encuentra en una etapa de desarrollo correspondiente a la de un órgano/tejido pulmonar humano en una etapa gestacional seleccionada de un intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 22 semanas de gestación. También se describen métodos para usar la composición farmacéutica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de inducir daño a un tejido de interés, donde dicho daño da como resultado la proliferación de células madre residentes en dicho tejido, y donde cuando dicho tejido de interés es un tejido pulmonar, dicho agente es capaz de inducir daño al tejido no es naftaleno; y un agente que elimina dichas células madre residentes en dicho tejido, donde dicho agente que elimina dichas células madre residentes en dicho tejido se usa posteriormente a dicho agente capaz de inducir daño a dicho tejido, para su uso en el acondicionamiento de un sujeto humano que necesita un trasplante de células progenitoras en suspensión procedentes de un tejido adulto de interés.

Preferiblemente, comprende además el uso de células progenitoras en suspensión procedentes de un tejido adulto de interés para trasplante.

Preferiblemente, dicho sujeto tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad maligna, una enfermedad del sistema nervioso central, una enfermedad gastrointestinal, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad hepática, una enfermedad nefrítica, una enfermedad pancreática, una enfermedad pulmonar, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria, una inmunodeficiencia y una enfermedad autoinmune.

Preferiblemente, dichas células progenitoras: comprenden células progenitoras humanas; y/o no son singénicas con el sujeto; y/o se seleccionan del grupo que consiste en células progenitoras cardíacas, células progenitoras hepáticas, células progenitoras pancreáticas, células progenitoras del cerebro, células progenitoras nefríticas, células progenitoras de ovario, células progenitoras del bazo y células progenitoras pulmonares, y/o son capaces de regenerar un tejido estructural/funcional.

Preferiblemente, dichas células progenitoras se obtienen de un tejido pulmonar adulto.

Preferiblemente, dicho tejido de interés es un tejido parenquimatoso y/o se selecciona del grupo que consiste en un tejido cardíaco, un tejido hepático, un tejido pancreático, un tejido cerebral, un tejido nefrítico, un tejido ovárico, un tejido pulmonar y un tejido del bazo.

Preferiblemente, dicho agente es capaz de inducir daño a dicho tejido y se selecciona del grupo que consiste en un compuesto químico, un antibiótico, un fármaco terapéutico, una toxina, una intervención quirúrgica y un remedio a base de hierbas.

Preferiblemente, dicho agente es capaz de inducir daño a dicho tejido, se selecciona del grupo que consiste en un agente que causa toxicidad en células renales, un agente que causa toxicidad en células hepáticas, un agente que causa toxicidad en células cardíacas, un agente que causa toxicidad en células pancreáticas, un agente que causa toxicidad en células del cerebro, un agente que causa toxicidad en células del bazo, un agente que causa toxicidad en células ováricas y un agente que causa toxicidad en células pulmonares.

Preferiblemente, dicho agente que causa toxicidad en las células renales se selecciona del grupo que consiste en un antibiótico aminoglucósido, un inhibidor de la calcineurina, un acetaminofeno, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un antidepresivo, un antihistamínico, un agente antimicrobiano, un agente antirretroviral, una benzodiazepina, un agente cardiovascular, un agente quimioterapéutico, un remedio a base de hierbas y nefrotectomía parcial; dicho agente que causa toxicidad en las células hepáticas se selecciona del grupo que consiste en un acetaminofeno, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un glucocorticoide, una isoniazida, un fármaco derivado de la hidracina, una toxina industrial, un remedio a base de hierbas y una hepatectomía parcial; dicho agente que causa toxicidad de las células cardíacas se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente citostático, un fármaco antidepresivo, un fármaco inmunomodulador, un anestésico, un agente bloqueante de los canales de calcio, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un antagonista beta-adrenoceptor y un antiarrítmico; dicho agente que causa la toxicidad de las células pancreáticas se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de la ECA, una azatioprina, un estrógeno, una furosemida, una metildopa, una mesalazina, una pentamidina, una procainamida, un propofol, una estatina, una estreptozotocina, una sulfonamida, un diurético tiazídico, un valproato y una pancreatectomía parcial; dicho agente que causa toxicidad en las células cerebrales se selecciona del grupo que consiste en un antihistamínico, un relajante de la vejiga, un relajante muscular, un antidepresivo y un agente quimioterapéutico; dicho agente que causa la toxicidad de las células ováricas se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico y un agente inmunosupresor; dicho agente que causa toxicidad en las células pulmonares se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente inmunosupresor, una amiodarona, un bloqueador beta, un inhibidor de la ECA, una nitrofurantoína, una procainamida, una quinidina, una tocainida y un minoxidil.

Preferiblemente, dicho agente que elimina dichas células madre residentes comprende un régimen de acondicionamiento sub-letal o letal.

Preferiblemente, dicho régimen de acondicionamiento sub-letal o letal comprende una irradiación corporal parcial o un agente alquilante.

Preferiblemente, dicho agente capaz de inducir daño a dicho tejido se lleva a efecto 1-3 días antes que dicho agente que realiza la ablación de dichas células madre residentes.

Preferiblemente, dicho trasplante se realiza por vía intravenosa.

Preferiblemente, dicho trasplante se efectúa por una ruta seleccionada del grupo que consiste en intratraqueal, intrabronquial, intraalveolar, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intracardíaca, intramuscular, intraserosal, intramucosal, transmucosal, transnasal, rectal e intestinal.

Preferiblemente, comprende además el uso de un régimen inmunosupresor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS VARIAS VISTAS DE LAS FIGURAS

Algunos aspectos de la descripción se describen en el presente documento, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas. Con referencia específica ahora a las figuras en detalle, se enfatiza que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con el propósito de una discusión ilustrativa de los aspectos de la descripción. A este respecto, la descripción realizada a partir de las figuras pone de manifiesto para los especialistas en la técnica cómo se pueden llevar a la práctica los aspectos de la descripción.

En las figuras:

Figuras 1A-R: representan el crecimiento y desarrollo de tejidos precursores de embriones humanos recolectados en diferentes momentos de la gestación. Se implantaron tejidos embrionarios humanos bajo la cápsula renal de ratones NOD-SCID. Los implantes se evaluaron macroscópicamente o mediante tinción inmunohistológica después de 8 semanas. La Figura 1A es un resumen del tamaño macroscópico de implante de los implantes de diferentes periodos gestacionales: tamaño medio (± SD), basado en los ejes largo (L) y corto (W) y la altura (H) de los implantes, 6-8 semanas después del trasplante (los datos mostrados son el promedio de seis experimentos independientes); la Figura 1B es una fotografía que ilustra una apariencia macroscópica típica de los implantes recolectados a las 20 semanas de gestación; las Figuras 1C-F son fotografías de un examen microscópico con tinción de hematoxilina y eosina (H&E) del implante derivado de tejido de 20 semanas, que muestran la apariencia normal de los conductos alveolares, los alvéolos, la tráquea recubierta con epitelio ciliado, la capa muscular y el cartílago, y la monocapa alveolar/epitelial; las Figuras 1G-H son fotografías que ilustran la inmunotinción para la proteína tensioactiva C (sp-C) en rojo, y la citoqueratina-18 (CK-18) en verde, con un aumento menor (Figura 1G) y mayor (Figura 1H); la Figura 1I es una fotografía que ilustra la inmunotinción para el regulador transmembrana de fibrosis quística CFTR en rojo y CK-18 en verde; las Figuras 1J-R son fotografías que ilustran la tinción H&E típica de implantes derivados de tejidos de 15 semanas (Figuras 1J-L), 18 semanas (Figuras 1P-R) y 24 semanas (Figuras 1M-O), respectivamente. Las flechas indican quiste. En la (Figura 1M) se ilustra la imagen macroscópica de un quiste.

Figuras 2A-O: representan la identificación de progenitores tempranos y sus nichos en el pulmón embrionario humano. Las Figuras 2A-D son fotografías que ilustran la tinción H&E de tejidos pulmonares embrionarios humanos en diferentes puntos de tiempo gestacional, revelando estructuras bronquiales y bronquiolares sin ninguna estructura alveolar; las Figuras 2E-F son fotografías que ilustran la tinción inmunohistológica que muestra una alta expresión de células CK5+ en las vías respiratorias grandes y la co-expresión de CK5 y CK14 en el bronquio grande. Las flechas y puntas de flecha indican regiones con expresión de CK5 alta y baja, respectivamente. Las células CK5+ de las estructuras bronquiales y alveolares en desarrollo están asociadas con una rica inervación, ilustrada por el contacto con células nestina+ y CGRP+ (Figura 2G), así como mediante tinción de neurofilamentos (NF) (Figura 2H); la Figura 2I es una fotografía que ilustra células positivas de actina de músculo liso alfa; la Figura 2J es una fotografía que ilustra a células mesenquimales Vimentina+ que residen muy cerca de los progenitores CK5+; las Figuras 2K-N son fotografías que ilustran la tinción para CK5 (rojo) en diferentes puntos de tiempo, incluyendo 15 (Figura 2K), 17 (Figura 2L), 20 (Figura 2M) y 22 (Figura 2N) semanas de gestación humana, que demuestran diferencias en el nivel de expresión de CK5; la Figura 2O es un gráfico que ilustra el análisis morfométrico cuantitativo del área de tejido ocupada por progenitores CK5+ que muestran niveles significativamente más altos (prueba t) a las 20-22 semanas (un diamante representa un valor p que no es significativo, dos diamantes representan p <0,002).

Figuras 2P-Z: representan el análisis FACS de progenitores no hematopoyéticos tempranos en tejido pulmonar embrionario humano recolectado en diferentes puntos de tiempo gestacional. Las Figuras 2P-Q ilustran el análisis FACS representativo de células pulmonares de 20 semanas que muestran doble tinción con anti-CD45 y anti-CD34. Están representadas tres subpoblaciones dentro de las células CD45 no hematopoyéticas, que incluyen células CD4S-CD34elevado, CD45-CD34intermedio y CD45-CD34neg; las Figuras 2R-T ilustran la tinción doble con anti-CD117 (c-kit) y anti-CD271 (marcador de diferenciación mesenquimatosa) que revela el nivel de cada subpoblación; las Figuras 2U-Z ilustran el porcentaje de células CD117+ positivas individuales dentro de la población CD45-CD34neg en diferentes tejidos pulmonares embrionarios humanos.

Figuras 3A-C: representan una tinción triple con CK5, lectina ULEX y CD117 antes del trasplante de tejidos pulmonares recolectados a las 21 semanas. Vía aérea central (Figura 3A) y bronquio principal (Figura 3B) que muestran una alta expresión de CK5 en las vías respiratorias grandes, rodeadas de grandes vasos sanguíneos. Se observan algunas células CD117+ que residen en espacios perivasculares. En la región de las vías respiratorias más pequeñas (Figura 3C), se observa una menor expresión de CK5, en estrecho contacto con vasos sanguíneos más pequeños, mientras que dentro de dichos vasos sanguíneos residen numerosas células CD117+ (rosa; doble positivo para la lectina ULEX y CD117).

Figuras 4A-K: representan la tinción triple con E-cadherina, CD34 y CD117 antes del trasplante de tejidos pulmonares recolectados a las 21 semanas. La Figura 4A ilustra una tinción única para CD34; la Figura 4B ilustra una tinción única para CD117; la Figura 4C ilustra una fusión con la tinción de E-cadherina. Se representan imágenes panorámicas de dos regiones vecinas, que incluyen grandes bronquios y estructuras alveolares en desarrollo. La mayoría de las células CD34+ en la región de las estructuras alveolares en desarrollo co-expresan CD117 (Figuras 4D-G), mientras que en la región de las vías respiratorias grandes, se pueden ver algunas células CD117+ positivas sueltas muy próximas a los vasos sanguíneos (Figuras 4H-K).

Figs. 5A-D son fotografías que muestran una vista panorámica de tres campos vecinos en un pulmón humano de 20 semanas que ilustra la presencia de regiones positivas de CK5 (rojo, Figura 5a ) con diferente intensidad de expresión, que están rodeadas por vasos sanguíneos (azul, Figura 5B) y células positivas alfa-SMA (verde, Figura 5C) tanto en bronquios grandes como en alvéolos en desarrollo (azul, Figura 5B), lo que sugiere nichos distintos (la superposición de los 3 compartimentos se muestra en la Figura 5D). Barra = 50 pm.

Figuras 6A-L: representan el análisis FACS policromático de dos muestras diferentes de pulmón humano adulto. El análisis FACS policromático de tejidos pulmonares humanos adultos se realizó en paralelo con tejidos pulmonares embrionarios humanos. La suspensión de células individuales se tiñó, después de la disociación enzimática con colagenasa y dispasa de los tejidos, y se tiñó con CD34 (específico para progenitores hematopoyéticos y endoteliales), CD45 (células hematopoyéticas), CD31 (marcador de células endoteliales), CD117 (c-KIT, para identificar progenitores tempranos), anticuerpos específicos CD271 (marcador de células madre mesenquimales NGFR) y CD326 (marcador de diferenciación epitelial EPCAM) o controles de isotipo equivalentes. En ambas muestras, se identificaron poblaciones CD34+ y CD34' (Figuras 6A, 6D, 6G y 6J). Se observaron diferencias prominentes entre tejidos pulmonares adultos y embrionarios. Se identificaron niveles mucho más bajos de células CD34+ en pulmones adultos. Cuando se evaluaron en términos de presencia de población c-kit+, se identificaron poblaciones CD34+CD117+ y CD34' CD117+ muy pequeñas (Figuras 6B, 6E, 6H y 6K); la mayoría de las células CD34+CD117+ fueron positivas para el marcador CD31 y solo un pequeño porcentaje negativo para el marcador CD31 (Figuras 6C, 6F, 6I y 6^l), y la mayoría de la población Cd 34'CD117+ resultó negativa para CD31 y CD326 (Figuras 6F y 6L).

Figuras 7A-I: representan el análisis FACS de HEL de 20 semanas, demostrando subpoblaciones CD45'CD34+ y CD45-CD34- (Figura 7A). Tinción CD117+ dentro de las subpoblaciones de células CD34 positivas (Figura 7B) y negativas (Figura 7C). La mayoría de la subpoblación CD34+CD117+ es positiva para los marcadores CD31 o CD326 (Figuras 7D, 7F-G). La mayoría de las células CD34'CD117+ son negativas para los marcadores CD31 y CD326 (Figuras 7E, 7H-I). En las Figuras 7F-I, se muestran histogramas representativos, donde la línea roja marca el control del isotipo de los marcadores CD31 y CD326, la línea azul muestra la subpoblación CD34+CD31+ y la línea verde muestra la subpoblación CD34+CD326+ (Figuras 7F-G); en las Figuras 7H-I, la línea azul marca la subpoblación CD34-CD31+ y la línea verde marca la subpoblación CD34'CD326+. Estos hallazgos confirman la existencia de dos poblaciones CD117+ diferentes, tal como demuestra la inmunohistoquímica.

Figuras 8A-D: representan la tinción inmunohistológica de 15 semanas (Figuras 8A-B) y 17 semanas (Figuras 8C-D) HEL para marcador vascular ulix (azul), CK5 (verde) y CD117 (rojo), mostrando el patrón de expresión dual de CD117. Se observan varias células CD117+ individuales muy cerca de las vías respiratorias y los vasos sanguíneos grandes, mientras que la mayoría de ellas están co-localizadas dentro de los vasos sanguíneos alrededor de las estructuras alveolares en desarrollo.

Figuras 9A-D: representan el análisis de un pulmón humano de 20 semanas para determinar la presencia de progenitores endoteliales tempranos y tardíos (EPC). Esta figura identifica la presencia de dos subpoblaciones CD34+CD31+ menores distintas (Figura 9B). La primera identificada por tinción positiva para CD14 y CD45 (Figura 9C), mientras que la segunda subpoblación es CD45'CD105+ (Figura 9D).

Figuras 10A-E: representan la caracterización de tejidos embrionarios antes y después de la implantación bajo la cápsula renal de ratones singénicos. Las Figuras 10A-C son fotografías que ilustran una tinción H&E típica que demuestra el escaso crecimiento de los tejidos pulmonares E14 (Figura 10A) y E17 (Figura 10B) a las 12 semanas después del trasplante bajo la cápsula renal de ratones SCID (n = 7), en comparación con un crecimiento y una diferenciación destacados, logrados con implantes embrionarios de ratón E16 (n = 5) (Figuras 10C-E); las Figuras 10D-E son fotografías que ilustran la tinción H&E que demuestran vías respiratorias grandes (flechas grandes) y estructuras alveolares (flechas pequeñas) y tinción de citoqueratina en implantes de pulmón fetal de ratón E16.

Figura 10F: muestra una representación esquemática de etapas paralelas en el desarrollo pulmonar de ratones y humanos. La “ventana óptima” para el trasplante está dentro de la etapa de desarrollo canalicular.

Figuras 11A-Y: representan la caracterización de los progenitores pulmonares en el pulmón embrionario de ratón E16 antes del trasplante. La Figura 11A es una fotografía que ilustra la tinción H&E de pulmón embrionario E16 que demuestra estructuras inmaduras y ausencia de estructuras alveolares; la Figura 11B es una fotografía que ilustra las células CK-5 positivas (azul) en tejido de ratón E16, similar al pulmón embrionario humano, que tienen mayor expresión en las vías respiratorias grandes. Por toda la muestra se observan numerosos cuerpos neuroepiteliales, teñidos positivamente por CGRP (rojo) y tirosina hidroxilasa (TH, verde), y que están localizados en nichos; La Figura 11C es una fotografía que ilustra que las células positivas para CCSP se encuentran en las regiones de las vías respiratorias grandes, también ricas en células positivas para nestina y rodeadas por células positivas para alfa-SMA (Figura 11D, flechas blancas), lo que sugiere nichos de células madre; las Figuras 11E-G son análisis FACS policromáticos representativos de células CD45'CD31'CD326+ CD24+CD49f+CD104+ en suspensiones de células individuales derivadas de pulmón E13, E14, E15 y E16 después del tratamiento con colagenasa y dispasa (n = 10, 10, 12 y 10 respectivamente, los valores representan la media ± SD de dos experimentos diferentes). Se demuestra una abundancia significativamente mayor de esta población celular en el pulmón E15-16 (p <0,007); La Figura 11Y es un resumen de los niveles de células CD45'CD31'CD326+ CD24+CD49f+CD104+ que muestran significancia estadística calculada por la prueba t de Student (un diamante representa p <0,037, dos diamantes representan p <0,007, las estrategias de activación de células se describen en la sección de Ejemplos incluida a continuación).

Figuras 12A-F: son fotografías que muestran tinción inmunohistoquímica de pulmón C57B1 adulto, que demuestran la presencia de nestina y CGRP (Figuras 12A-B), similar a su expresión en nichos de células madre en el pulmón embrionario de ratón (Figura 12A - aumento menor - barra = 50 pm , Figura 12B - aumento mayor - barra = 20 pm). El recuadro en la (Figura 12A) indica la posición de la ampliación mostrada en la (Figura 12B); las Figuras 12C-F son fotografías que ilustran la tinción triple de pulmón C57B1 adulto para alfa-SMA (verde, Figura 12C), CGRP (rojo, Figura 12D) y E-cadherina (superposición azul con alfa-SMA y CGRP, Figura 12E), barra = 50 pm; y la Figura 12F ilustra un área ampliada del cuadrado marcado en la Figura 12E, barra = 20 pm.

Figuras 13A-D: representan la microscopía fluorescente de pulmones quiméricos con un aumento de baja potencia que demuestra diferentes números de focos de células GFP+ injertadas siguiendo diferentes regímenes de acondicionamiento. Las Figuras 13A-C son fotografías de imágenes representativas de pulmones quiméricos de animales tratados con 6 Gy TBI (Figura 13A), NA solamente (Figura 13B) y NA más 6 Gy TBI (Figura 13c ); La Figura 13D es un análisis morfométrico cuantitativo de parches de células GFP+ injertadas por mm3, después de diferentes regímenes de acondicionamiento (n=10 en cada grupo). Se presentan los resultados de 3 experimentos independientes.

Figuras 14A-L: son fotografías que muestran la tinción de células CCSP+ antes y después de la infusión de células E16. La Figura 14A ilustra los lúmenes de grandes vías respiratorias de ratones de control no tratados; La Figura 14B ilustra los pulmones de animales experimentales 1 día después del acondicionamiento con naftaleno y 6 Gy TBI, mostrando el desprendimiento de células CCSP+; la Figura 14C ilustra los pulmones de animales acondicionados con naftaleno y 6 Gy TBI 30 días después de la infusión de células E16, mostrando una marcada regeneración de la capa epitelial con células GFP+ injertadas (verde) en las luces bronquiales, que están vascularizadas, como indica la tinción para V-E cadherina; las Figuras 14D-L ilustran que las células trasplantadas (Figuras 14D-F) se incorporan a la capa epitelial, regeneran células CCSP+ (rojo), son capaces de producir tensioactivo (Figuras 14G-I) y exhiben potencial de transporte de iones, como se indica mediante tinción para CFTR (Figuras 14J-L).

Figuras 15A-C: son fotografías que muestran la microscopía de dos fotones que revelan el nivel de quimerismo en los pulmones implantados. Imágenes de pulmón representativas de microscopía de dos fotones de ratones trasplantados a las 6 semanas (Figuras 15A-B) y a las 16 semanas (Figura 15C) después del trasplante, sin (Figura 15A) y con tinción conjunta de los vasos sanguíneos con puntos cuánticos no dirigidos (rojo) (Figura 15B).

Figuras 16A-L: son fotografías que representan la caracterización inmunohistológica de pulmones quiméricos a las 16 semanas después del trasplante. Las Figuras 16A-D son imágenes representativas de pulmón quimérico teñido con anticuerpo anti-GFP (verde), anticuerpo anti-CD31 (rojo) y anticuerpo anti-pancitoqueratina (azul), que demuestran la incorporación de células GFP+ en compartimentos vasculares y epiteliales de pulmones trasplantados, sin signos de cicatrización o fibrosis; Las Figuras 16E-H son imágenes representativas de pulmones quiméricos teñidos con anticuerpo anti-GFP (verde) y anti-AQP-5 (rojo), que muestran la incorporación de tejido trasplantado en la superficie de intercambio de gases de los alveocitos de tipo I; las Figuras 16I-L son imágenes de pulmón quimérico teñido con anticuerpo anti-GFP (verde), anti-CD31 (rojo) y anti-sp-C (azul), que demuestran la participación de los alveocitos de tipo II de las células trasplantadas en la síntesis de tensioactivo.

Figuras 17A-E: son fotografías que muestran la apariencia del pulmón C57B1 de control no trasplantado analizado por microscopía de dos fotones, barra = 90 pm (pulmón de control, Figura 17A) o tinción triple del pulmón quimérico con anti-GFP (verde), anti-citoqueratina ( azul), y anticuerpos anti-CD31, demostrando quimerismo en los compartimentos epitelial y vascular del pulmón, e una incorporación completa en las estructuras, sin signos de cicatrización o fibrosis, a bajo aumento, barra = 200 pm (Figuras 17B-E). En el canal verde fluorescente, los focos quiméricos de GFP+ se indican mediante una línea de puntos (Figura 17B). En los canales rojo y azul, las mismas regiones quiméricas también se indican mediante una línea de puntos, mostrando una transición suave del tejido del receptor al donante en los compartimentos vascular (Figura 17C) y epitelial (Figura 17D), y en la (Figura 17E) se muestra la superposición de todas las capas.

Figuras 18A-I: son fotografías que representan el injerto y la incorporación de células pulmonares derivadas de humanos en el pulmón del ratón en diferentes puntos de tiempo después del trasplante. Las Figuras 18A-C ilustran el quimerismo en el pulmón de ratón a las 6 semanas después del trasplante, mostrando tinción para MHC de ratón (rojo) y tejido humano positivo para MNF-116 (verde) con bajo aumento; las Figuras 18D-F ilustran el quimerismo en el pulmón de ratón a las 6 semanas después del trasplante, mostrando tinción para MHC de ratón (rojo) y tejido humano positivo para MNF-116 (verde), con gran aumento; las Figuras 18G-I ilustran un campo adicional, teñido como en (Figuras 18D-F).

Figuras 19A-F: son fotografías que representan el quimerismo típico en el bronquio pulmonar de un ratón trasplantado a las 7 semanas después del trasplante. Las Figuras 19A y 19D ilustran células humanas que se originan a partir de células embrionarias humanas que se tiñeron selectivamente con un cóctel de anticuerpos antihumanos de ratón que incluyen anti-MNF (marcador epitelial), vimentina 9 anti-humana (típica de células estromales) y anti-CD31 humano de ratón (marcador de células endoteliales) marcado con Daylight 488 (verde); las Figuras 19B y 19E ilustran células de ratón del pulmón de ratón que se tiñeron con lectina de Banderia marcadas con Alexa-fluor 546 (rojo). Se sabe que este último se une a a-Gal expresado en células epiteliales y endoteliales de ratón. El panel superior muestra un campo quimérico con un aumento bajo (Figura 19C), el panel inferior muestra la misma región con un aumento alto (Figura 19F).

Figuras 20A-F: son fotografías que representan el quimerismo típico en los alvéolos pulmonares de un ratón trasplantado a las 7 semanas del trasplante. Las Figuras 20A y 20D ilustran células humanas que se originan a partir de células embrionarias humanas que se tiñeron selectivamente con un cóctel de anticuerpos antihumanos de ratón que incluyen anti-MNF (marcador epitelial), vimentina 9 anti-humana (típica de células estromales) y anti-CD31 humano de ratón (marcador de células endoteliales) marcado con Daylight 488 (verde); las Figuras 20B y 20E ilustran células de ratón del pulmón de ratón que se tiñeron con lectina de Banderia marcadas con Alexa-fluor 546 (rojo). Se sabe que este último se une a a-Gal expresado en células epiteliales y endoteliales de ratón, pero no en sus homólogos humanos. El panel superior muestra un campo quimérico con un aumento reducido (Figura 20C); el panel inferior muestra la misma región con aumento grande (Figura 20F).

Figuras 21A-C: son fotografías que muestran la incorporación de células humanas en el parénquima pulmonar. La Figura 21A ilustra células humanas que se tiñeron (verde) con una mezcla de anticuerpos anti-humanos que incluyen anti-MNF117, anti-V9, anti-CD31 como se describió anteriormente, y con anticuerpo anti-citoqueratina de conejo (rojo), que tiñe citoqueratina tanto de ratón como humana (Figura 21B). La fusión de ambos colores demuestra células humanas dentro del parénquima pulmonar (Figura 21C).

Figuras 22A-C: son fotografías que muestran la incorporación de células humanas en la superficie de intercambio de gases del pulmón. Las células humanas se tiñeron (verde) con una mezcla de anticuerpos anti-humanos que incluyen anti-MNF117, anti-V9 y anti-CD31, como se describió anteriormente (Figura 22A) y con anti-AQP-5 de cabra (rojo), que tiñe AQP-5 de ratón y humano (Figura 22B). La fusión de ambos colores demuestra células humanas dentro de la superficie de intercambio de gases del pulmón (Figura 22C).

Figuras 23A-F: son fotografías que muestran que las células pulmonares humanas injertadas dentro de los alvéolos de un ratón quimérico participan en la producción de tensioactivo. Las células humanas se tiñeron (verde) con una mezcla de anticuerpos anti-humanos que incluyen anti-MNF117, anti-V9 y anti-CD31 como se describió anteriormente (Figuras 23A y 23D), y con anticuerpo anti-SPC de conejo (rojo), que tiñe tanto la proteína C tensioactiva humana como la de ratón (Figura 23B). La fusión de ambos colores demuestra la participación del tejido humano trasplantado en la producción de tensioactivo (Figura 23C). El panel inferior (Figuras 23D-F) muestra tinción a gran aumento del área recuadrada indicada en la (Figura 23C).

Figuras 24A-H: son fotografías que representan el injerto de una suspensión de células individuales derivada de pulmón humano de 20 semanas teñida con CMTMR en el pulmón de un ratón NOD-SCID, barra = 500 pm (Figura 24A); parches GFP+ que denotan células pulmonares que se originan a partir de células pulmonares embrionarias de ratón trasplantadas en el modelo de trasplante singénico, barra = 1 mm (Figura 24B); las Figuras 24C-E ilustran la tinción de control con anticuerpo de anti-citoqueratina humano MNF 116 de ratón (verde, Figura 24C) y MHC anti ratón de rata (rojo, Figura 24D) de tejido pulmonar embrionario humano, que es positivo a MNF116 y negativo a MHC de ratón (la superposición de ambos se muestra en la Figura 24E); las Figuras 24F-H ilustran la tinción de control de células pulmonares de ratón con anticuerpos anti-MHC de ratón anti-MNF116 humano, demostrando tinción negativa para MNF116 y tinción positiva para MHC de ratón, barra = 50 pm.

Figuras 25A-D: son fotografías que muestran el seguimiento a largo plazo de ratones implantados con tejido pulmonar embrionario de ratón E16 que no muestran evidencia de teratoma. La Figura 25A ilustra un aspecto macroscópico del pulmón trasplantado un año después del trasplante, que muestra bordes lisos y ausencia de tumores; las Figuras 25B-C ilustran la tinción H&E que muestra la morfología normal del pulmón trasplantado con un aumento menor (Figura 25B) y mayor (Figura 25C) un año después del trasplante; la Figura 25D ilustra vistas coronales de imágenes TC de pulmón in vivo de un animal trasplantado típico, que muestra un aspecto radiológico normal del pulmón experimental.

Figuras 26A-J: representan una comparación histológica entre un implante de pulmón embrionario y un pulmón humano adulto, y una comparación de los protocolos de acondicionamiento. (Figura 26A) Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de tejido de pulmón embrionario humano (HEL) recogido a las 20 semanas de gestación (20 semanas HEL). Barras de escala, 200 pm (arriba) y 50 pm (abajo). (Figura 26B) Arriba, tinción H&E del implante HEL de 20 semanas debajo de la cápsula renal de ratón NOD-SCID 8 semanas después del trasplante. n = 25 implantes obtenidos a las 20-22 semanas (de cinco fetos donantes). Abajo, tinción H&E de pulmón humano adulto. Imágenes representativas con diferentes aumentos; barras de escala, 200 pm (izquierda), 50 pm (centro) y 20 pm (derecha).

(Figuras 26C-D) Nichos típicos de progenitores pulmonares CK5+. (Figura 26C) Tinción de corte HEL de 20 semanas (20 pm) para CK5 (rojo), nestina (verde) y vasos sanguíneos (BV, azul). Imágenes adquiridas reconstruidas en tres dimensiones. (Figura 26D) Imagen confocal de tejido HEL de 20 semanas para CK5 (rojo), BV (azul) y neurofilamentos (NF, verde), que revela una rica inervación (flechas). Barras de escala, 90 pm. (Figuras 26E-J) Incorporación de BrdU en pulmones de ratones C57BL/6 (n = 5 ratones por grupo) 7 días después del acondicionamiento con NA solo; 6 Gy TBI seguido de NA (6 Gy NA); ⁿA seguida de 6 Gy TBI (NA 6 Gy); 6 Gy TBI solo o sin acondicionamiento (control). (Figura 26E) Tinción inmunohistoquímica de pulmones con anticuerpo anti-BrdU (verde). Barra de escala, 100 pm. (Figura 26F) Doble tinción con anticuerpo anti-CCSP (células Club, rojo) y anticuerpo anti-BrdU (verde; flechas) evaluado por microscopía confocal de disco giratorio. Barras de escala, 34 pm. (Figura 26G) Doble tinción con anticuerpo anti-SPC (células AT2, rojo) y anticuerpo anti-BrdU (verde). Barras de escala, 50 pm. (Figura 26H) Análisis morfométrico cuantitativo de células CCSP+BrdU+ y SPC+BrdU+ siguiendo diferentes protocolos de acondicionamiento. Línea central, mediana; límites de caja, percentiles 25 y 75; pestañas, valores mínimos y máximos. Números absolutos superiores de células CCSP+BrdU+ por campo evaluado (se calcularon n = 78 campos para control, n = 40 campos para NA, n = 20 campos para 6 Gy NA, n = 54 campos para NA 6 Gy y n = 96 campos de ratones tratados, para un total de n = 3 ratones por protocolo de acondicionamiento); abajo, número de células SPC+BrdU+ por campo individual (se calcularon n = 23 campos de control, n = 22 campos para NA, n = 30 campos para 6 Gy NA, n = 23 campos para NA 6 Gy y n = 34 campos para ratones tratados con 6 Gy, para un total de n = 3 ratones por protocolo de acondicionamiento); por ratón, n = 3 ratones por grupo). Para el análisis morfométrico de células CCSP+BrdU+ y SPC+BrdU+, la comparación se realizó utilizando ANOVA anidado unidireccional (el efecto de los ratones individuales se anidó con el efecto del tratamiento). (Figura 26I) Análisis FACS de tinción anti-BrdU de células pulmonares recolectadas de ratones acondicionados usando los protocolos descritos anteriormente. Gráficos de puntos representativos (n = 5 ratones por protocolo de acondicionamiento) para calcular la abundancia de células CD45-BrdU+. (Figura 26J) Análisis cuantitativo FACS de células BrdU+ en diferentes linajes de células pulmonares (los diagramas de caja muestran el porcentaje de poblaciones de células individuales del total de células CD45-; n = 5 ratones por grupo). Línea central, mediana; límites de caja, percentiles 25 y 75; pestañas, valores mínimos y máximos. Para el análisis FACS, las diferencias entre los grupos se calcularon usando ANOVA unidireccional en las proporciones transformadas por arcoseno seguido de la prueba post hoc de Tukey; sólo se proporcionan comparaciones entre grupos de interés (NA frente a NA 6 Gy; 6 Gy NA frente a NA 6 Gy). *PAG < 0,05; **PAG < 0,01; ***p a g < 0,001; ****PAG <0,0001. Los resultados mostrados son de 1 experimento representativo de 3.

Figuras 27A-L: son fotografías que representan tejidos de pulmón embrionario humano (HEL) recolectados a las 20 semanas de gestación, antes y 8 semanas después del trasplante bajo la cápsula renal de ratones NOD-SCID. Se implantaron tejidos de vías respiratorias embrionarias humanas debajo de la cápsula renal de ratones NOD-SCID. Los implantes se evaluaron macroscópicamente y mediante tinción inmunohistológica 8 semanas después del trasplante. (Figura 27A) Aspecto de la vía aérea fetal fresca de 20 semanas, que comprende la tráquea y los pulmones. (Figuras 27B-C) Tinción H&E de la tráquea y los pulmones antes del trasplante, con un aumento menor y mayor (imagen de la izquierda en la (Figura 27B), barra de escala, 50 pm; imagen de la derecha en la (Figura 27B), barra de escala, 20 pm; izquierda imagen en (Figura 27C), barra de escala, 200 pm, imagen de la derecha en (Figura 27C), barra de escala, 50 pm. (Figura 27D) Aspecto macroscópico típico del implante de tejido pulmonar recolectado de 20 semanas. (Figura 27E) Examen microscópico de H&E de un implante derivado de la tráquea fetal de 20 semanas, que muestra una apariencia normal de la estructura traqueal cubierta con epitelio ciliado y cartílago idéntico al tejido previo al trasplante debajo de la parte inferior (en la imagen de la izquierda; barra de escala, 50 pm) y mayor aumento (en la imagen de la derecha; barra de escala, 20 pm); (Figura 27F) El parénquima pulmonar en crecimiento en el mismo implante se muestra con un aumento bajo y alto (barra de escala, 500 pm, izquierda y 200 pm, derecha) (Figuras 27G-I) Inmunotinción para marcadores de diferenciación epitelial 8 semanas después del trasplante (Figura 27G) Expresión de citoqueratina (CK18) (verde) y VE-cadherina (rojo) en estructuras similares a los alvéolos; barra de escala, 50 pm. (Figura 27H) Inmunotinción para CFTR (rojo, indicado con flechas) y CK18 (verde); barra de escala, 20 pm. (Figura 27I) Inmunotinción para la proteína tensioactiva C (SPC) (rojo y flechas) y CK18 (verde), en la parte inferior (imagen izquierda, barra de escala, 50 pm) y superior (imagen central, barra de escala, 20 pm) de aumento, y para acuaporina-5 (verde, imagen derecha; barra de escala, 20 pm). (Figuras 27J-L) Crecimiento y desarrollo de tejidos HEL recolectados a diferentes edades gestacionales 8 semanas después de la implantación bajo la cápsula renal de ratones NOD-SCID. Las diferencias en la apariencia macroscópica y microscópica (tinción H&E) de los implantes derivadas de los tejidos de 15 semanas (Figura 27J), 18 semanas (Figura 27K) y 24 semanas (Figura 27L). En las imágenes de las filas de la Figura 27J y la Figura 27L, las flechas indican estructuras quísticas. En la Figura 27K, las flechas indican estructuras de tipo alveolar. En la Figura 27J y la Figura 27K de barras de escala de izquierda a derecha, 200, 50 y 20 pm. En la Figura 27L, barra de escala, 50 y 20 pm [de izquierda a derecha]. Se analizaron al menos n = 7 muestras de implantes de 15 semanas (de 3 fetos diferentes), n = 8 de implantes de 18 semanas (de 3 fetos diferentes), y n = 5 (de 2 fetos diferentes) de implantes de 24 semanas. Se muestran imágenes representativas.

Figuras 28A-J: representan la identificación y el fenotipado de los progenitores tempranos y sus nichos en el pulmón embrionario humano. (Figura 28A) Tinción H&E de tejidos pulmonares embrionarios humanos en diferentes momentos gestacionales (n = 3, pulmones de 15 semanas; n = 3, pulmones de 17 semanas; n = 3, pulmones de 20 semanas; y n = 5, pulmones de 22 semanas analizados), que revelan estructuras bronquiales y bronquiolares sin estructuras alveolares. Barra de escala, 200 pm. (Figura 28B) Tinción de HEL de 20 semanas para mucina-1 (rojo), podoplanina (verde) y Nkx2.1 (azul) que marcan progenitores alveolares bipotentes (marcados con x en la imagen combinada). Barra de escala, 34 pm. (Figuras 28C-D) Tinción inmunohistológica de pulmones fetales de 20 semanas, que muestra una alta expresión de células CK5+ en las vías respiratorias grandes. En (Figura 28C), las flechas y las puntas de flecha indican regiones con expresión de CK5 alta y baja, respectivamente. (Figura 28D) Co-expresión de ^cK5 y CK14 en el bronquio grande. Barra de escala, 50 pm. (Figura 28E) células mesenquimales vimentina+ que residen muy cerca de los progenitores CK5+. (Figura 28F) Células positivas de alfa-actina de músculo liso, células epiteliales circundantes teñidas con anticuerpo anti-E-cadherina (rojo). Barra de escala, 50 pm. (Figura 28G) Células CK5+ de las estructuras bronquiales y alveolares en desarrollo asociadas a una rica inervación, ilustrada por la tinción de los neurofilamentos (NF), la barra de escala, 200 pm y la proximidad cercana a células nestina+ y CGRP+ (Figura 28H). Barra de escala, 50 pm. (Figura 28I) Tinción para CK5 (rojo) en diferentes momentos, incluido a las 15 (n = 3), 17 (n = 3), 20 (n = 4) y 22 (n = 5) semanas de gestación humana, que demuestran diferencias en el nivel de expresión de CK5. Barra de escala, 200 pm. (Figura 28J) Análisis morfométrico cuantitativo del área de tejido ocupada por los progenitores CK5+ que muestra niveles significativamente más altos en los tejidos de 20-22 semanas. ((prueba-t) no significativa (NS), **P=0,002).

Figuras 29A-H: son gráficos que representan el análisis FACS de progenitores no hematopoyéticos tempranos en tejido pulmonar embrionario humano y de ratón recolectado en diferentes puntos de tiempo gestacional. Panel izquierdo (Figuras 29A-B): análisis FACs representativo de células pulmonares de 20 semanas que muestra doble tinción con anti-CD45 y anti-CD34. Se representan tres subpoblaciones dentro de las células CD45' no hematopoyéticas, que incluyen células CD4S-CD34elevado, CD45- CD34+intermedio y CD45-CD34neg. Se utilizó doble tinción con anti-CD117 (c-Kit) y anti-CD271 (marcador de diferenciación mesenquimatosa, que también se muestra que se expresa en las células basales del epitelio de las vías respiratorias humanas) para definir mejor el nivel de cada subpoblación dentro de las diferentes subpoblaciones CD34neg, CD34inteim y CD34elevado (Figura 29C) Porcentaje de células CD117+ positivas únicas dentro de la población CD45' CD34neg en diferentes tejidos pulmonares embrionarios humanos. El análisis de todos los tejidos se realizó dentro del mismo experimento. (Figuras 29D-E) Análisis de HEL de 20 semanas para determinar la presencia de células progenitoras endoteliales tempranas y tardías (EPC). (Figura 29D) Análisis FACS que ilustra la presencia de dos subpoblaciones menores distintas dentro de la población celular CD34+CD31+, que previamente se demostró que representa dos tipos de EPC. La primera se identifica por tinción positiva para CD14 y CD45 y representa EPC tempranas, mientras que la segunda subpoblación es ^cD45‘ CD14' CD31+ CD144+ CD146+ y representa EPC tardías (se analizaron n = 5 muestras diferentes de tejido pulmonar de 20 semanas). (Figura 29E) Tinción del mismo tejido con un control de isotipo (IC) apropiado. (Figuras 29F-H) Poblaciones de células progenitoras en tejidos de pulmón embrionario de ratón (MEL) recolectados en diferentes puntos de tiempo gestacional. (Figura 29F) Análisis FACS representativo de células CD45' CD31 CD326+ CD24+ en suspensiones de células individuales derivadas de pulmón E13, E14, E15 y E16. Esta población celular estaba presente en una abundancia significativamente mayor en el pulmón E15-E16. (Figura 29G) Estrategias de activación basadas en tinción con anticuerpo (histograma azul) y control de isotipo apropiado (histograma rojo); se muestra el ejemplo de tinción de células E16. (Figura 29H) Diagramas de recuadros que demuestran el porcentaje de niveles celulares de CD45' CD31 CD326+ CD24+ que muestran diferencias significativas entre embriones de diversas edades gestacionales (se muestran resultados de al menos n = 6 pulmones fetales en cada grupo, ***P<0,001, ANOVA unidireccional). Las líneas centrales de los recuadros muestran las medianas; los límites de los recuadros indican los percentiles 25 y 75, las pestañas indican los valores mínimo y máximo.

Figuras 30A-H: representan el injerto de células pulmonares precursoras embrionarias GFP+ de ratón siguiendo diferentes protocolos de acondicionamiento. (Figuras 30A-C) Microscopía de fluorescencia de pulmones adultos quiméricos C57BL/6 (verde, células derivadas del donante que expresan GFP). Imágenes representativas (n = 10 para cada grupo) de pulmones quiméricos después del tratamiento con 6 Gy TBI solo (Figura 30A), NA solo (Figura 30B) o NA 6 Gy TBI (Figura 30C). Barras de escala, 1 mm. (Figura 30D) Análisis morfométrico cuantitativo de parches GFP+ de células injertadas por mm3 de tejido pulmonar después de diferentes regímenes de acondicionamiento (injerto de células del donante en animales tratados con NA 6 Gy TBI; ***P = 0,00012, ANOVA sobre valores transformados logarítmicamente); número medio de parches para cada ratón, n = 10 ratones por grupo, agrupados de tres experimentos que emplean protocolos de trasplante idénticos. El efecto de la fecha no fue significativo y, por lo tanto, se eliminó del análisis final. La línea central en el diagrama de recuadros es la mediana; límites de recuadro, percentiles 25 y 75; pestañas, valores mínimos y máximos. (Figuras 30E-F) Imágenes de bajo aumento de doble tinción de pulmón quimérico con anticuerpos anti-GFP (Figura 30E) y anti-citoqueratina (CK, izquierda), anti-CD31 (centro) o anti-nestina (derecha) (Figura 30F). Barras de escala, 200 pm. Los focos quiméricos GFP+ se indican mediante líneas de puntos. Las imágenes mostradas son representativas de tres experimentos independientes y de 10 ratones. (Figura 30G) Análisis cuantitativo de co-localización dentro de parches individuales en pulmones quiméricos 2 meses después del trasplante. Barras de escala, 50 pm. (se analizaron n = 8 parches GFP+ de 3 ratones para la co-localización de CK, se analizaron n = 8 parches GFP+ de 3 ratones para la co-localización de CD31 y se analizaron n = 7 parches GFP+ de 2 ratones para la co-localización de nestina) (Figura 30H) Resumen del % de r O i con GFP co-localizado. Los diagramas de recuadro presentan el porcentaje de GFP co-localizado con diferentes marcadores dentro del ROI indicado. Se muestra la distribución de datos completa. Línea central, mediana; límites de recuadro, percentiles 25 y 75; pestañas, valores mínimos y máximos.

Figuras 31A-J: representan el análisis morfométrico del área pulmonar ocupada por los parches injertados y su origen clonal. (Figuras 31A-B) Parches GFP+ de tipo de donante típico (verde) utilizados para el análisis morfométrico a las 8 semanas (Figura 31A) y las 16 semanas (Figura 31B) del trasplante. Pulmón quimérico con un aumento de x10 (izquierda), reconstrucción paralela en el software Fiji (centro) y mayor aumento del área marcada (derecha). Barras de escala, 200 pm. (Figura 31C) Diagramas de recuadros que muestran el porcentaje de tejido pulmonar ocupado por células GFP derivadas de donantes. Área injertada medida en n = 30 campos pulmonares aleatorios de 3 ratones en cada momento (**P<0,01, ANOVA anidado; n = 3 ratones para cada grupo, 9-10 observaciones por ratón). La línea central en el diagrama de recuadro es la mediana; límites de recuadro, percentiles 25 y 75; pestañas, valores mínimos y máximos. (Figuras 31D-E) Evaluación del quimerismo a las 6 semanas después del trasplante en el montaje completo, tejido pulmonar recién aislado; verde indica GFP derivado de donantes; el azul indica autofluorescencia del hospedante. Imágenes representativas de microscopía de dos fotones de enfoque extendido que muestran la profundidad de escaneo completa (de arriba a abajo) del pulmón quimérico en ausencia (Figura 31D, pila z 88 pm) o presencia (Figura 31E) de vasos sanguíneos (BV) alineados con puntos cuánticos (rojo). Barras de escala, 90 pm. Las imágenes son representativas de n = 7 imágenes de 2 ratones por grupo. (Figuras 31F-G) Imagen de enfoque extendido de dos fotones a las 16 semanas después del trasplante que muestra la profundidad de exploración completa del pulmón quimérico (Figura 31F, pila z 96 pm) en comparación con la imagen del pulmón de ratón C57BL/6 no trasplantado (control) (Figura 31G). Las imágenes son representativas n = 7 de n = 2 ratones por grupo; barras de escala, 90 pm). (Figuras 31H-J) Parches de tipo donante discreto después del trasplante de una mezcla 1:1 de células pulmonares embrionarias E16 que expresan GFP o tdTomato. Parches de donante verde o rojo monocromáticos típicos a las 8 semanas después del trasplante visualizados por microscopía de disco giratorio (Figura 31H; imagen de enfoque extendido; barra de escala, 70 pm) y microscopía de dos fotones (Figura 311, imagen de enfoque extendido que muestra la profundidad de exploración completa de pulmón quimérico; cada paso z = 3 pm, combinación de 60 planos; barra de escala, 100 pm). (Figura 31J) Tinción histológica del pulmón receptor con anti-GFP y anti-DsRed evaluados por microscopía confocal. Barra de escala, 70 pm. Se muestran imágenes representativas de n = 10 imágenes de n = 3 ratones.

Figuras 32A-I: son fotografías que representan tipos de clones derivados de donantes en pulmones quiméricos y quimerismo pulmonar dentro de diferentes linajes celulares. (Figuras 32A-C) Imágenes de microscopía de dos fotones, que muestran la profundidad de exploración completa de arriba a abajo de los pulmones quiméricos después de la implantación de células pulmonares E16 de donantes GFP+ a las 6 semanas después del trasplante. La imagen de la izquierda muestra una estructura bronquioalveolar regenerada (pila z 38 pm). La imagen de la derecha muestra estructuras alveolares injertadas (pila z 34 pm) a las 6 semanas después del trasplante. Barra de escala, 90 pm. (Figura 32B) Imágenes representativas de vasos sanguíneos teñidos mediante inyección i.v. de puntos cuánticos inmediatamente antes del sacrificio, que demuestran la generación de vasos sanguíneos quiméricos. Imágenes izquierda y derecha: barras de escala, 90 pm y 30 pm, respectivamente. (Figura 32C) Imágenes de pulmón quimérico de diferentes animales 4 o 6 meses después del trasplante, respectivamente (pila z en la imagen izquierda 96 pm y en la imagen derecha 86 pm). Barra de escala, 90 pm. (Figura 32D) Potencial clonogénico de progenitores pulmonares. Se acondicionaron ratones Rag1'/- con NA y se expusieron posteriormente a 6 Gy TBI antes de la administración mediante infusión i.v. de suspensión de células embrionarias que contiene una mezcla 1:1 de células E16 de donantes GFP (verde) y tdTomato (ratones Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J) (rojo). Las imágenes de tejido completo de pulmón embrionario E16, tomadas por microscopía de epifluorescencia, inmediatamente después de la recolección se muestran a la izquierda. Barra de escala, 500 pm. El marco derecho muestra pulmón quimérico de ratón Rag1-/- evaluado por microscopía de dos fotones (z = 3 pm, combinación de 20 planos, barra de escala, 100 pm) a las 8 semanas después del trasplante, que ilustra la imagen de enfoque extendido de clones monocromáticos derivados del donante que revelan su incorporación dentro del pulmón receptor. (Figuras 32E-H) Tipos de clones derivados de donantes en pulmones quiméricos. (Figura 32E) Se identificaron bronquiolos ocasionales colonizados por células GFP+ derivadas de donantes. Se muestran dos ejemplos diferentes adquiridos por microscopía confocal con un aumento menor. Barra de escala, 34 pm a la izquierda; las áreas encuadradas se muestran con mayor aumento a la derecha de cada imagen. Barra de escala, 11 pm. (Figura 32F) Tinción del bronquiolo quimérico con anticuerpos anti-GFP y anti-citoqueratina, que demuestra la naturaleza epitelial de las células injertadas. Barra de escala, 50 pm. (Figura 32G) Tinción del pulmón quimérico con anticuerpo anti-SOX-2 (rojo) y anti-GFP (verde), que demuestra parche GFP+ bronquioalveolar. Barra de escala, 50 pm. (Figura 32H) Pulmón quimérico teñido con anticuerpo anti-GFP (verde) y anti-SPC (azul), que demuestra células AT2 positivas para tensioactivo derivadas del donante. Barra de escala, 20 pm. Los primeros planos de un solo canal de la región encuadrada demuestran un patrón típico de tinción SPC. (Figura 32I) células GFP+ positivas para CFTR bronquiolares derivadas de donantes. El primer plano de la región encuadrada ilustra celdas dobles positivas (marcadas con puntas de flecha). Barra de escala, 50 pm.

Figuras 33A-G: representan la integración de células derivadas del donante en el compartimento pulmonar epitelial y la reparación funcional de los pulmones lesionados. (Figura 33A) Vista 3D representativa de clones GFP+ bronquiolares, bronquioalveolares y alveolares. La línea de puntos marca la luz bronquiolar (BL). Barra de escala, 17 pm. (Figuras 33B-C) Co-localización de células GFP+ del donante y CCSP (Figura 33B) o SPC (Figura 33C) evaluada mediante tinción de doble anticuerpo. Se muestran imágenes fluorescentes representativas de n = 7 y n = 8 imágenes, respectivamente. Barras de escala, 50 pm (Figura 33B) y 11 pm (Figura 33C). (Figura 33D) Tinción de pulmón quimérico de ratones Rag1-/- trasplantados con células pulmonares E16 de donantes C3H para H2Kk (rojo, donante) y AQP-5 (verde). Barra de escala, 17 pm. (Figura 33E) Diagramas de recuadros que muestran el porcentaje de colocalización de células donantes dentro del ROI para diferentes marcadores. El análisis de co-localización se realizó en n = 7 imágenes de 2 ratones, para la co-localización CCSP, en n = 8 imágenes de 2 ratones para la co-localización de SPC y en n = 7 imágenes de 2 ratones para la colocalización de AQP-5. Línea central, mediana; límites de recuadro, percentiles 25 y 75; pestañas, valores mínimos y máximos. (Figuras 33F-G) Análisis de la función pulmonar 6 semanas después del trasplante. (Figura 33F) Cumplimiento de la línea de base pulmonar; *P = 0,0004, ratones de control (ilesos) frente a ratones con lesión pulmonar (y sin trasplante); # P = 0,009, ratones con lesión pulmonar y sin trasplante frente a ratones que recibieron trasplante después de la lesión; ANOVA unidireccional. (Figura 33G) Amortiguación del tejido. *P = 0,015, control frente a ratones con lesión pulmonar; #P = 0,021, lesión pulmonar frente a ratones trasplantados después de la lesión; ANOVA unidireccional. n = 19 ratones de control, n = 10 ratones heridos y n = 8 ratones trasplantados en cada grupo, agrupados a partir de dos experimentos independientes (Figuras 33F-G). Los diagramas de recuadros muestran la distribución completa de los datos. Línea central, mediana; límites de recuadro, percentiles 25 y 75; pestañas, valores mínimos y máximos.

Figuras 34A-I: representan el quimerismo de tipo donante y la expresión de los marcadores AT1 y AT2 en pulmones de ratones quiméricos después del trasplante de células pulmonares E16 de donantes C3H en destinatarios Rag1-/-. (Figuras 34A-C) Control de tinción de pulmones Rag1-/- y C3H para H2Kk (rojo) y AQP-5 (azul), utilizados para definir la co-localización de la membrana de H2Kk (rojo, donante) y AQP-5 en la Figura 33D. En la (Figura 34A) se muestran las estructuras alveolares del pulmón de ratón Rag1-/-, que carecen por completo de tinción para H2Kk y se tiñen positivamente para AQP-5. (Figura 34B) Pulmón de ratón C3H que exhibe una fuerte tinción doble positiva para H2Kk y AQP-5. Barra de escala, 50 pm. (Figura 34C) Patrones de tinción distintos del pulmón C3H para H2Kk y AQP-5 o SPC para los marcadores AT1 y AT2, respectivamente. Barra de escala, 17 pm. (Figura 34D) Parches H2Kk derivados de donante distintos son claramente negativos para H2KB. Barra de escala, 200 pm. (Figura 34E) Tinción de pulmón quimérico Rag1-/- utilizada para distinguir células de donante H2Kk AQP-5+ y células de donante H2Kk SPC+ (rojo, donante), que demuestra un patrón de tinción casi idéntico de las células ^aT1 y AT2 en el pulmón C3H de control positivo. Barra de escala, 17 pm. (Figuras 34F-G) Método de segmentación celular utilizado para el análisis de células AT1 quiméricas (los detalles se describen en la sección "Materiales generales y métodos experimentales"). El mismo parche derivado del donante, que se muestra en la Figura 33D. Brevemente, se evaluaron tanto los parches de tipo donante como las regiones no quiméricas para comparar la fluorescencia roja en células H2Kk (rojo) negativas y positivas. La imagen de Hoechst para cada conjunto de datos se segmentó por núcleos. Cada núcleo se utilizó como semilla en el canal verde para extenderlo a toda la célula. Los centros celulares se marcaron con una cruz roja. La región de interés se dibujó manualmente (polígono) en cada imagen con el fin de seleccionar áreas de tejido positivas y negativas para el etiquetado del donante. Para cada segmento celular en las áreas negativa y positiva, se calculó la intensidad de fluorescencia total en los canales verde y rojo y se mostró en un diagrama de dispersión similar a FACS. (Figura 34G) El gráfico de dispersión de la izquierda muestra solo células fluorescentes verdes en la región no quimérica, calculadas a partir de cinco imágenes; el gráfico de dispersión de la derecha muestra células fluorescentes rojas y verdes dobles positivas en la región quimérica de siete imágenes de los mismos animales. Por lo tanto, los valores de intensidad total "Roja" (en unidades arbitrarias [AU]) fue de 4 ± 1 x 106 para las células AT1 en las áreas quiméricas, y de 2 ± 1 x 105 para las áreas no quiméricas. Las imágenes son representativas de n = 2 ratones, 12 semanas después del trasplante. (Figura 34H) Tinción del parche quimérico para marcador RAGE-ATI, (verde), células H2Kk del donante (rojo) y núcleos (azul), evaluados mediante microscopía de disco giratorio. Barra de escala, 17 pm. (Figura 34I) Análisis de quimerismo que define el nivel de células H2Kk positivas únicas en comparación con el de células H2KkH2KB doble positivas dentro de la población pulmonar CD45TER119', utilizando FACS. Las células pulmonares se recolectaron de ratones receptores C57BL6 Rag1-/- trasplantados con células pulmonares E16 de un donante C3H (n = 3) a las 9 semanas del trasplante. Se proporcionan porcentajes detallados de los 3 ratones.

Figuras 35A-F: son fotografías que representan el análisis de quimerismo después del trasplante de células pulmonares GFP+ E16 en un receptor 'Tomato'. Los bloques de tejido se etiquetaron triplemente para 'tdTomato' (hospedante rojo), GFP (donante) y núcleos (azul). Las imágenes confocales tridimensionales fueron adquiridas con un microscopio confocal de disco giratorio invertido Nikon Eclipse Ti, utilizando el software Andor iQ (Mag = X 40 o X 60, NA = 1,3 o 1,49 aceite, tamaño de píxel = 0,17 pm o 0,11 pm, respectivamente, delta-z = 1 pm. Barra de escala, 17 pm en las imágenes presentadas), y las pilas de imágenes 3D se analizaron de la siguiente manera: las imágenes rojas ('Tomato', en contraste con GFP, se restringe al etiquetado de la membrana) se midieron (se tomó un valor bajo aproximadamente la mitad del umbral Otsu para incluir todos los píxeles de imagen rojos) y la imagen binaria 3D se redujo para delinear las membranas celulares. La superposición de núcleos y membranas adelgazadas indica claramente que los núcleos están encerrados por un "contorno" de membrana roja. Este análisis tridimensional reveló una co-localización de 7 ± 1% (consultar la sección 'Materiales generales y métodos experimentales' para obtener una descripción detallada de los cálculos). Sin embargo, incluso este bajo nivel de co-localización se puede atribuir en gran medida a los límites de resolución del microscopio en z en los sitios de contacto celular. Por lo tanto, cuando la pila verde 3D de células del donante se superpone a la imagen roja (hospedante)/azul (núcleos), se pueden ver algunos contornos de glóbulos rojos que parecen cruzar el volumen de células verdes, mientras que los contornos rojos que rodean un área verde difícilmente se pueden detectar. Más bien, cruzan el área verde como parte del contorno de una celda "roja" que se encuentra inmediatamente encima o debajo de la celda verde, reconocible por su núcleo superior o inferior. Se muestran múltiples pilas z.

Figuras 36A-H: representan la eficiencia de formación de colonias y el quimerismo pulmonar de tipo donante después del fraccionamiento de células pulmonares de ratón E16. (Figura 36A) Análisis FACS de células pulmonares E16 de donantes C57BL/6GFP+ después (arriba) y antes del agotamiento por perlas magnéticas (abajo) de células CD45+, SCA-1+, CD31+ o CD326+. Se muestran los porcentajes de las poblaciones de células indicadas dentro de la suspensión de células individuales de pulmón fetal de ratón E16 después y antes del agotamiento. (Figura 36B) Aspecto típico de campo claro de colonias 3D generadas por células de siembra empobrecidas de diferentes fracciones. Barras de escala, 200 pm. (Figuras 36C-F) Parches GFP+ formados por poblaciones de células agotadas 8 semanas después de la infusión en receptores C57BL/6 acondicionados con NA y 6 Gy TBI. Lo mostrado es representativo de n = 41 imágenes para población trasplantada CD45-, de n = 18 imágenes para población trasplantada CD326-, de n = 30 para población trasplantada CD31- y de n = 19 para población trasplantada SCA-1-, imágenes originales de parches GFP+ (izquierda) e imágenes paralelas, reconstruidas en Fiji, de tejidos del donante (rojo) y del receptor (verde) (derecha). Barras de escala, 200 pm. (Figura 36G) Eficiencia de formación de colonias de poblaciones de células agotadas evaluadas en cultivo 3D. Eficiencia promedio de generación de colonias por 105 celdas (las barras de error representan la media y la desviación estándar de tres pocillos). La eficiencia de formación de colonias se comparó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett con la actividad de células CD45- como referencia. (Figura 36H) Diagramas de recuadros que muestran el porcentaje de tejido pulmonar ocupado por células GFP derivadas de donantes. Línea central, mediana; límites de recuadro, percentiles 25 y 75; pestañas, valores mínimos y máximos. Se puntuaron un total de 41, 18, 30 y 19 campos en 3-4 ratones (agrupados de dos procedimientos de trasplante idénticos realizados en fechas diferentes (el efecto de la fecha no fue significativo y, por lo tanto, se eliminó del análisis) para fracciones empobrecidas CD45-, CD326-, CD31- y Sca-1-, respectivamente. **P < 0,01, ***P < 0,001, ANOVA anidado unidireccional seguido de prueba de Tukey post hoc (Figuras 36G-H).

Figuras 37A-J: representan el injerto de células derivadas de HEL en ratones NOD-SCID y el impacto de la congelación y descongelación en su viabilidad y clonogenicidad. (Figura 37A) Control de tinción con anticuerpo de anti-citoqueratina humana MNF116 de ratón (verde - imagen superior izquierda) y MHC anti-ratón de ratón (rojo - imagen superior central), de tejido pulmonar embrionario humano (n = 5), que es positivo solo para MNF116, pero negativo para MHC de ratón (la superposición se muestra en la imagen de la derecha). (Figura 37B) Control de tinción de pulmón de ratón adulto (n = 5) con MNF116 antihumano, que demuestra la falta de tinción para MNF116. Barra de escala, 50 pm. (Figura 37C) Tinción de tejido HEL de 20 semanas con anticuerpos de anti-citoqueratina humana de ratón, MNF116, CD31 y V9 solos, y como cóctel de los tres anticuerpos (verde). (Figura 37D) Control negativo que muestra la falta de tinción de células pulmonares de ratón NOD-SCID con el cóctel de anticuerpos anti-MNF116, CD31 y V9 humanos. (Figura 37E) Tinción de pulmón quimérico NOD-SCID con el mismo cóctel de anticuerpos antihumanos (verde), que tiñen selectivamente células humanas injertadas en alvéolos (asteriscos), y anticuerpo de pan-citoqueratina (rojo), que tiñe positivamente tanto a tejidos de ratón como humanos (parche derivado de HEL mostrado en la Figura 38A. Barra de escala, 50 pm). (Figuras 37F-G) Quimerismo en el bronquiolo pulmonar y los alvéolos de un ratón trasplantado con NOD-SCID a las 7 semanas del trasplante. Células humanas procedentes de pulmón embrionario humano se tiñeron selectivamente con un cóctel de anticuerpos antihumanos de ratón que incluyen anti-MNF (marcador epitelial), Vimentina 9 anti-humana (típico de las células estromales) y CD31 anti-humano (marcador de células endoteliales) de ratón marcado con DyLight 488 (verde). Las células de ratón en el pulmón de ratón se tiñeron con la isolectina B4 de Bandeiraea simplicifolia, relacionada con la biotina, marcada con Alexa-fluor 546 (rojo). Este último se une a la alfa-Gal expresada en las células epiteliales y endoteliales del ratón. Las imágenes de la fila superior muestran el campo quimérico con bajo aumento, barra de escala, 50 pm; las imágenes de la fila inferior muestran la misma región con gran aumento, barra de escala, 20 pm. (Figuras 37H-J) Impacto de la congelación y descongelación en la viabilidad y clonogenicidad de una suspensión unicelular de HEL canalicular. (Figura 37H) Se preparó una suspensión de células individuales de HEL de 20 semanas tal como se describe en la sección 'Materiales generales y métodos experimentales' y se fenotipificó mediante FACS (Figura 37H - panel superior) para determinar la viabilidad (7AAD) y el contenido de células CD45\ Posteriormente, las células se congelaron durante 3 semanas, y luego se descongelaron y se volvieron a analizar por FACS (Figura 37H - panel inferior); la población descongelada mostró niveles similares de células CD45'. (Figura 37I) 105 células frescas o descongeladas se sembraron en GFR Matrigel sobre membranas Transwell y se cultivaron durante 10 días. Los clones resultantes se tiñeron para SPC (rojo, barra de escala, 200 pm) y CK (verde, barra de escala, 500 pm) para evaluar las propiedades de diferenciación epitelial. (Figura 37J) La eficiencia de formación de colonias, definida como el número de colonias formadas/número de células sembradas por pocillo como porcentaje, fue similar para las células descongeladas frente a las frescas (**P = 0,01, prueba t). Las barras representan la media ± SD de células HEL frescas y descongeladas cultivadas por triplicado.

Figuras 38A-E: son fotografías que representan el quimerismo pulmonar en ratones NOD-SCID después del trasplante de células pulmonares embrionarias humanas (HEL). Pulmones de ratones NOD-SCID acondicionados con NA y 4 Gy TBI trasplantados con 1 x 106 Células HEL. (Figura 38A) Izquierda, tinción de células derivadas de humanos en el parénquima pulmonar de ratón con una mezcla de anticuerpos antihumanos que incluyen anti-MNF116, anti-CD31 y anti-V9. Campo seleccionado de 7 campos aleatorios de un solo ratón con alta ocupación de células pulmonares humanas. Derecha, imagen reconstruida en el software Fiji para calcular el porcentaje de ocupación pulmonar. La ocupación pulmonar promedio en este ratón fue del 4,4% ± 1,4%. Barras de escala, 50 pm. (Figura 38B) Imágenes confocales de pulmones quiméricos en la región bronquiolar teñidas con anticuerpos anti-humanos como en la Figura 38A y anticuerpo anti-citoqueratina (anti-CK) (rojo). Imagen combinada (izquierda) que muestra células epiteliales humanas dentro del bronquiolo pulmonar; barras de escala, 34 pm. Recuadro, primer plano de la región en caja que muestra tinción única e imágenes fusionadas; barras de escala, 11 pm. (Figura 38C) Células epiteliales en la región alveolar, teñidas como en la Figura 38B. Izquierda, imagen combinada que muestra células epiteliales humanas dentro del parénquima pulmonar. Barra de escala, 17 pm. Recuadro, primer plano de la región en caja que muestra tinción única e imágenes fusionadas; barras de escala, 7 pm. (Figura 38D) Células AT1. A la izquierda, células humanas teñidas con una mezcla de anticuerpos anti-humanos (verde) como en la Figura 38A y anti-AQP-5 de cabra (rojo); barra de escala, 17 pm; recuadro, primer plano de la región en caja que muestra tinción única e imágenes fusionadas (barras de escala, 7 pm). (Figura 38E) Células AT2 teñidas con una mezcla de anticuerpos anti-humanos (verde) descritos en la Figura 38A y anti-SPC de conejo (rojo), que tiñen tanto células humanas como de ratón; barra de escala, 17 pm. Recuadro, primeros planos de la región encuadrada que muestra tinción única e imágenes fusionadas; barras de escala, 7 pm.

Figuras 39A-F: son fotografías que representan la inducción del quimerismo pulmonar después del trasplante de células pulmonares adultas frescas. Se recogió una suspensión unicelular que comprende células pulmonares 8 x 106 adultas de un ratón C57BL/6 positivo para GFP y se inyectaron i.v. en ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y 6 GY TBI. Después de 8 semanas, el tejido pulmonar de los ratones trasplantados se fijó en PFA al 4% y se determinaron los parches positivos para GFP mediante inmunohistología. Células derivadas de donantes verdes; Tinción azul - Hoechst para núcleos. Las Figuras 39A-C y las Figuras 39D-F muestran diferentes aumentos del mismo campo, respectivamente.

Figuras 40A-F: son fotografías que representan la inducción del quimerismo pulmonar después del trasplante de células pulmonares expandidas E16: Se recolectaron células pulmonares C57BL E16 positivas para GFP y se sembraron en placas de cultivo de tejidos con medio de acondicionamiento (alimentadores embrionarios de ratón irradiados (iMEF)) junto con factor de crecimiento epitelial e inhibidor Rock. El medio se cambió cada 2 días y el inhibidor Rock se añadió de nuevo cada vez. Después de 4 días, las células fueron pasadas dividiéndolas en 3 placas. Después de 3 días adicionales de cultivo, las células se usaron para trasplante. Una suspensión unicelular que comprende 2 x 106 células expandidas se inyectó i.v. en ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y 6 GY TBI. Después de 8 semanas, el tejido pulmonar de los ratones trasplantados se fijó en PFA al 4% y se determinaron los parches positivos para GFP mediante inmunohistología. Células derivadas de donantes verdes; Tinción azul - Hoechst para núcleos. Las Figuras 40A-C y las Figuras 40D-F muestran diferentes aumentos del mismo campo.

DESCRIPCIÓN DE ASPECTOS ESPECÍFICOS DE LA DESCRIPCIÓN

Los principios y el funcionamiento de la presente descripción pueden entenderse mejor en referencia a las figuras y descripciones adjuntas.

Antes de explicar al menos un aspecto de la descripción en detalle, debe entenderse que la descripción no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados a través de los Ejemplos. La descripción puede tener otros aspectos o ser llevada a la práctica o llevada a cabo de diversas formas. Además, debe entenderse que el lenguaje y la terminología empleados en este documento tienen el propósito de describir y no deben considerarse limitantes.

Las enfermedades asociadas a disfunción, lesión o fallo de órganos, tal como las enfermedades pancreáticas, pulmonares, hepáticas, cardíacas y renales, independientemente de la causa de la enfermedad, son enfermedades de gran impacto médico y económico, para las que no se dispone de tratamientos satisfactorios/óptimos. Actualmente, el único tratamiento definitivo para la enfermedad en etapa terminal es el reemplazo del órgano dañado.

Al llevar a la práctica la presente descripción, los presentes inventores han identificado un protocolo de acondicionamiento para su uso en el trasplante de células progenitoras en suspensión para la regeneración de órganos y la reparación de órganos lesionados/enfermos.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que el trasplante de células progenitoras exitoso requiere la limpieza de nichos dentro del órgano a tratar (por ejemplo, pulmón). Tal paso es crítico para desocupar los nichos de tejido para la ocupación de las células trasplantadas, para lograr el quimerismo y la reparación funcional de los órganos o tejidos lesionados. El protocolo de acondicionamiento consta de dos etapas, en la primera etapa se usa un agente que induce daño tisular, el daño da como resultado la proliferación de células madre dentro del tejido. A continuación, se usa un segundo agente que elimina las células madre residentes y limpia los nichos celulares dentro del órgano. A continuación, se administran las células progenitoras (por ejemplo, de un donante de células alogénicas), mediante inyección i.v. al sujeto para producir un órgano quimérico que comprenda células tanto del donante como del receptor.

Por tanto, los presentes inventores han demostrado que el acondicionamiento de un sujeto con naftaleno (NA) dio como resultado una señal marcada de células BrdU+ en proliferación endógenas (Ejemplo 3, en la sección de Ejemplos que sigue). Esta recuperación de células endógenas, que potencialmente podrían competir con los progenitores derivados del donante y prevenir su injerto en los nichos apropiados, se inhibió mediante exposición a una irradiación corporal total (TBI) de 6 Gray (Gy) 48 horas (h) después del tratamiento con NA. Los presentes inventores también han demostrado que la administración (p. ej., administración intravenosa) de suspensiones unicelulares obtenidas de tejidos fetales humanos o de ratón en una 'ventana' canalicular de gestación (ver Ejemplo 1), obtenidas de tejidos adultos (p. ej., pulmón adulto, ver Ejemplo 8) o células expandidas ex vivo (por ejemplo, células pulmonares fetales expandidas ex vivo, véase el Ejemplo 9) se pueden usar para lograr una reparación pulmonar notable. Estos resultados se presentaron en modelos de trasplante singénico y alogénico (Ejemplos 3 y 5, respectivamente). Específicamente, las células precursoras de pulmón se alojaron, diferenciaron e integraron en pulmones lesionados de ratones, dando como resultado la formación de una unidad respiratoria completa que incluye la formación de nuevas células epiteliales y nueva vasculatura (ver Ejemplo 2). Además, el trasplante de suspensión de células individuales después del tratamiento con NA y TBI dio como resultado una mejora funcional de los pulmones lesionados (Ejemplo 5). Considerados en conjunto, estos resultados corroboran el uso del protocolo de acondicionamiento, así como las suspensiones de células individuales de células precursoras de mamíferos, p. ej. células frescas o congeladas, células fetales (por ejemplo, recolectadas en la etapa canalicular de la gestación), células tisulares adultas, células en etapa canalicular expandidas o células tisulares adultas expandidas, para la regeneración de órganos o tejidos.

Por tanto, según un aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para acondicionar a un sujeto que necesita un trasplante de células progenitoras en suspensión de un tejido de interés, comprendiendo el método:

(a) administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de inducir daño al tejido de interés, donde el daño da como resultado la proliferación de células madre residentes en el tejido; y posteriormente

(b) someter al sujeto a un agente que elimina las células madre residentes en el tejido, acondicionando así al sujeto.

Tal como se usa en este documento, el término "acondicionamiento" se refiere al tratamiento preparativo de un sujeto antes del trasplante. El acondicionamiento se realiza para desocupar los nichos celulares para el trasplante y para aumentar la tasa de éxito de un trasplante (por ejemplo, la formación de quimerismo).

Según un aspecto, el acondicionamiento del sujeto se efectúa administrando primero a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de inducir daño al tejido de interés, donde el daño da como resultado la proliferación de células madre residentes en el tejido.

La frase "daño al tejido" se refiere a una lesión localizada en un órgano diana o una parte del mismo.

El término "proliferación de células madre residentes" se refiere a la inducción de la división celular de células madre endógenas que residen dentro del tejido específico una vez sometidas al agente.

Tal como se usa en este documento, el término "tejido de interés" se refiere a cualquier tejido u órgano del cuerpo. El tejido puede comprender un tejido/órgano sólido. Según un aspecto, el tejido se ha dañado o funciona mal como resultado de una enfermedad, trastorno o lesión.

Según un aspecto, el tejido es un tejido parenquimatoso.

Los ejemplos de tejidos incluyen, aunque sin limitación, un tejido cardíaco, un tejido pulmonar, un tejido hepático, un tejido pancreático, un tejido cerebral, un tejido nefrítico, un tejido óseo, un tejido ovárico y un tejido del bazo.

Se pueden usar varios agentes acondicionadores según la presente descripción siempre que el agente induzca daño en al menos una parte del tejido que dé como resultado la proliferación de células madre residentes dentro del tejido. Así, por ejemplo, el agente puede comprender una sustancia química, un antibiótico, un fármaco terapéutico, una toxina, una intervención quirúrgica (por ejemplo, un procedimiento quirúrgico que elimina al menos una parte del tejido u órgano) o una hierba o un extracto del mismo.

El protocolo de acondicionamiento puede ajustarse para el tejido específico al que se dirigirá teniendo en cuenta la edad y la afección (por ejemplo, enfermedad, estadio de la enfermedad) del sujeto, tal determinación está dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica, especialmente en vista de la descripción proporcionada en este documento.

Sin estar ligado a la teoría, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad del agente suficiente para inducir un daño tisular localizado y la proliferación de células madre residentes, pero que no es tóxica para otros órganos del sujeto que está siendo tratado.

La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en el presente documento.

Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la descripción, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro y de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr una concentración o título deseado. Esta información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos.

Por tanto, según un aspecto, el agente capaz de inducir daño al tejido es un agente que causa toxicidad en las células renales (por ejemplo, en las nefronas), un agente que causa la toxicidad en las células hepáticas (por ejemplo, en los hepatocitos), un agente que causa la toxicidad en las células cardíacas (por ejemplo, en miocitos), un agente que causa toxicidad en las células pancreáticas (por ejemplo, en los islotes de Langerhans o acinos pancreáticos), un agente que causa toxicidad en las células cerebrales (por ejemplo, en las neuronas y células gliales), un agente que causa toxicidad en las células del bazo (por ejemplo, en la pulpa roja o blanca), un agente que causa toxicidad en las células ováricas (por ejemplo, en los folículos) o un agente que causa la toxicidad en las células pulmonares (por ejemplo, en el parénquima pulmonar).

Los ejemplos de agentes que causan toxicidad en las células renales (por ejemplo, nefrotoxicidad) incluyen, entre otros, antibióticos aminoglucósidos, inhibidores de la calcineurina, acetaminofeno, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), antidepresivos, antihistamínicos, agentes antimicrobianos, agentes antirretrovirales, benzodiazepinas, agentes cardiovasculares, agentes quimioterapéuticos y remedios a base de hierbas.

Los agentes adicionales que causan nefrotoxicidad se enumeran en la Tabla 1, a continuación [incorporado de Naughton C., Am Fam Physician (2008) 78(6): 743-750].

Tabla 1: Fármacos asociados con nefrotoxicidad

Según un aspecto, el daño al tejido nefrítico es causado por una nefrectomía parcial.

La evaluación del daño renal se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, p.ej. mediante pruebas de laboratorio comunes que miden la función renal. Tales pruebas incluyen, por ejemplo, nitrógeno ureico en sangre (BUN), análisis de creatinina en sangre, análisis de creatinina en orina y/o análisis de la eliminación de creatinina (es decir, comparar el nivel de creatinina en orina con el nivel de creatinina en sangre). La determinación del daño renal está dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento.

Los ejemplos de agentes que causan toxicidad en las células hepáticas (por ejemplo, hepatotoxicidad), incluyen, aunque sin limitación, acetaminofeno, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (por ejemplo, aspirina, fenilbutazona, ibuprofeno, sulindac, fenilbutazona, piroxicam, diclofenaco e indometacina), glucocorticoides, medicamentos derivados de la hidracina (p. ej., el antidepresivo IMAO iproniazida), productos naturales (p. ej., hongos amanita y aflatoxinas), toxinas industriales (p. ej., arsénico, tetracloruro de carbono y cloruro de vinilo) y remedios a base de hierbas (p. ej., fruta Ackee, Bajiaolian, alcanfor, Copaltra, Cycasin, Garcinia, hojas de Kava, alcaloides de pirrolizidina, hojas de castaño de Indias, valeriana, consuelda, Jin Bu Huan, Ma-huang, Shou Wu Pian y Bai Xian Pi).

Los agentes adicionales que causan hepatotoxicidad se enumeran en la Tabla 2, a continuación [incorporado de Herrine SK, www.merckmanuals.com/professional/hepatic-and-biliary-conditions/drugs-and-the-liver/liver-injuriacausada -por-drogas].

Tabla 2: Fármacos asociados con hepatotoxicidad

Según un aspecto, el daño al tejido hepático es causado por una hepatectomía parcial.

La evaluación del daño hepático se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, p.ej. mediante pruebas de función hepática como el tiempo de protrombina (PT/INR), aPTT, albúmina, bilirrubina (directa e indirecta) o midiendo las transaminasas hepáticas (AST o SGOT y ALT o SGPT). La determinación del daño hepático está dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento.

Los ejemplos de agentes que causan toxicidad en las células cardíacas (por ejemplo, cardiotoxicidad), incluyen, aunque sin limitación, agentes quimioterapéuticos [por ejemplo, Daunorubicina (Cerubidine®), Doxorrubicina, inyección de liposoma de doxorubicina (Doxil®), Epirubicina (Ellence®), Idarubicina (Idamycin® PFS) y Valrubicina (Valstar®)], agentes contra el cáncer [p.ej., Ej. trastuzumab (Herceptin®), bevacizumab (Avastin®), lapatinib (Tykerb®), sunitinib (Sutent®) y sorafenib (Nexavar®)], agentes citostáticos, fármacos antidepresivos, fármacos inmunomoduladores, anestésicos, agentes bloqueadores de los canales de calcio, fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE), antagonistas de los receptores beta-adrenérgicos y antiarrítmicos.

Los agentes adicionales que causan cardiotoxicidad se enumeran en la Tabla 3, a continuación [Feenstra y col., J Am Coll Cardiol. 1999; 33 (5): 1152-1162].

Tabla 3: Fármacos asociados con cardiotoxicidad

La evaluación del daño cardíaco se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, p.ej. mediante un examen físico, radiografía de tórax, ecocardiograma, ECG (electrocardiograma), exploración m Ug A (adquisición de múltiples puertas) y/o análisis de sangre de troponina. La determinación del daño cardíaco está dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento.

Los ejemplos de agentes que causan toxicidad en las células pancreáticas (por ejemplo, pancreatitis aguda) incluyen, entre otros, inhibidores de la ECA, alcohol, aloxano, azaserina, azatioprina, dimetilbenzo[a]antraceno, estrógenos, etionina, furosemida, metildopa, mesalazina, ácido oleico, pentamidina, procainamida, propofol, estatina, estreptozotocin sulfonamida, diurético tiazídico y valproato.

Los agentes adicionales que causan toxicidad en las células pancreáticas se enumeran en la Tabla 4, a continuación [Kaurich T, Proc (Bayl Univ Med Cent) (2008) 21(1): 77-81].

Tabla 4: Fármacos y clases de fármacos asociados con la pancreatitis aguda.

Según un aspecto, el daño al tejido pancreático es causado por una pancreatectomía parcial.

La evaluación del daño pancreático se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, p.ej. mediante análisis de sangre midiendo amilasa y/o lipasa; por prueba de elastasa fecal; por ecografía abdominal, por tomografía computarizada (TC), p. ej. con medio de contraste y/o colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE). La determinación del daño pancreático está dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento.

Los ejemplos de agentes que causan toxicidad en las células cerebrales (por ejemplo, neurotoxicidad) incluyen, entre otros, antihistamínicos (por ejemplo, difenhidramina), relajantes de la vejiga (por ejemplo, oxibutinina y tolterodina), medicamentos para el vértigo o mareos (por ejemplo, meclizina), medicamentos para los picores (por ejemplo, antihistamínicos fuertes tales como hidroxicina y difendiramina), relajantes musculares (por ejemplo, ciclobenzaprina), medicamentos para el dolor nervioso o antidepresivos (por ejemplo, tricíclicos) y agentes quimioterapéuticos.

La evaluación del daño de las células cerebrales se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, p.ej. midiendo la función cognitiva, mediante la batería de pruebas del núcleo neuroconductual (NCTB)+, por electromiografía (EMG), por potenciales evocados (EP), por electrocardiografía (ECG o EKG), por tomografía por emisión de positrones (PET) o por tomografía computarizada (TC)) [tal como se describe en detalle en Nervous System, Mergler Donna, editora, Encyclopedia of Occupational Health and Safety, Jeanne Mager Stellman, editora jefe. Organización Internacional del Trabajo, Ginebra (2011)]. La determinación del daño cerebral está dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento.

Los ejempos de agentes que causan toxicidad en las células del bazo incluyen, aunque sin limitación, fármacos contra el cáncer, hidroxiurea, nitrosobenceno y tioacetamida.

La evaluación del daño del bazo se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, p.ej. mediante imágenes de ultrasonido o por tomografía computarizada.

Los ejemplos de agentes que causan toxicidad en las células ováricas incluyen, aunque sin limitación, agentes quimioterapéuticos o agentes inmunosupresores. Los ejemplos de agentes incluyen, aunque sin limitación, agentes alquilantes, sirolimus (por ejemplo, rapamicina), 1,3-butadieno, 4-vinilciclohexeno, vinilciclohexeno deipóxido, nitrofurantoína, nitrofurazona, benceno, delta-9-tetrahidrocannabinol y tricresilfosfato. Según un aspecto, la toxicidad de las células ováricas es causada por los ovarios poliquísticos.

La evaluación del daño de las células ováricas se puede llevar a cabo utilizando cualquier método conocido en la técnica, p.ej. mediante ecografía (por ejemplo, midiendo hipoplasia, atrofia, necrosis folicular y/o hiperplasia tubular). La determinación del daño ovárico está dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento.

Los ejemplos de agentes que causan toxicidad en las células pulmonares incluyen, entre otros, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunosupresores, amiodarona, betabloqueantes, inhibidores de la ECA, nitrofurantoína, procainamida, quinidina, tocainida, minoxidil, amiodarona, metotrexato, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), gemcitabina, bleomicina, mitomicina C, busulfán, ciclofosfamida, clorambucilo, nitrosourea (p. ej., carmustina) y sirolimus.

Los agentes adicionales que causan toxicidad en las células pulmonares se enumeran en la Tabla 5, a continuación [www.merckmanuals.com/professional/pulmonary-conditions/interstitial-lung-disease/drug-induced-pulmonarydisease].

Tabla 5: Sustancias con efectos pulmonares tóxicos.

Según un aspecto, cuando el tejido de interés es un tejido pulmonar, el agente capaz de inducir daño al tejido no es naftaleno.

La evaluación del daño de las células pulmonares se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, p.ej. mediante pruebas de función pulmonar, radiografía de tórax, tomografía computarizada de tórax o tomografía por emisión de positrones (PET). La determinación del daño pulmonar está dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento.

Tal como se describió anteriormente, el daño tisular da como resultado la proliferación de células madre residentes dentro del tejido.

La evaluación de la proliferación de células madre residentes (por ejemplo, células madre endógenas dentro de un tejido) se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido por un especialista en la técnica, tal como, por ejemplo, mediante formación de imágenes in vivo de la proliferación celular, p.ej. utilizando una tomografía por emisión de positrones (PET) con un trazador de PET, p. ej. 2-fluoro-2-desoxi-D-glucosa (18FDG) marcada con 18F, o [18F] 3'-desoxi-3-fluorotimidina ((18)FLT) según se muestra en Francis y col., Gut. (2003) 52(11): 1602-6 y en Fuchs y col., J Nucl Med. (2013) 54(1): 151-8.

Por tanto, según un aspecto de la descripción, después de la administración del agente capaz de inducir daño al tejido de interés, el sujeto se somete a un segundo agente acondicionador, es decir, un agente que elimina las células madre residentes en el tejido. Como resultará evidente para los especialistas en la técnica de la biología celular, la sensibilidad a la radiación se consigue sólo en una etapa proliferativa.

Según un aspecto, el agente que elimina las células madre residentes comprende un régimen de acondicionamiento subletal o letal.

Según un aspecto, el régimen de acondicionamiento subletal o letal comprende una irradiación corporal parcial o una irradiación corporal total (TBI).

Según un aspecto, cuando se usa irradiación corporal parcial, la exposición es específica de un órgano o tejido a tratar (por ejemplo, pulmones, riñón, hígado, corazón, páncreas, cerebro, etc.). En tales casos, es aconsejable proteger los órganos corporales no irradiados para evitar daños no deseados en órganos/tejidos. Alternativamente, la irradiación puede realizarse mediante un haz enfocado.

Según un aspecto, la irradiación corporal parcial comprende una dosis de irradiación única o fraccionada dentro del rango de 0,5-1 Gy, 0,5-1,5 Gy, 0,5-2,5 Gy, 0,5-5 Gy, 0,5-7,5 Gy, 0,5-10 Gy, 0,5-15 Gy, 1-1,5 Gy, 1-2 Gy, 1-2,5 Gy, 1 3 Gy, 1-3,5 Gy, 1-4 Gy, 1-4,5 Gy, 1-1,5 Gy, 1-7,5 Gy, 1-10 Gy, 2-3 Gy, 2-4 Gy, 2-5 Gy, 2-6 Gy, 2-7 Gy, 2-8 Gy, 2-9 Gy, 2-10 Gy, 3-4 Gy, 3-5 Gy, 3-6 Gy, 3-7 Gy, 3-8 Gy, 3-9 Gy, 3-10 Gy, 4-5 Gy, 4-6 Gy, 4-7 Gy, 4-8 Gy, 4-9 Gy, 4-10 Gy, 5 6 Gy, 5-7 Gy, 5-8 Gy, 5-9 Gy, 5-10 Gy, 6-7 Gy, 6-8 Gy, 6-9 Gy, 6-10 Gy, 7-8 Gy, 7-9 Gy, 7-10 Gy, 8-9 Gy, 8-10 Gy, 10-12 Gy o 10-15 Gy.

Según un aspecto específico, la irradiación corporal parcial comprende una dosis de irradiación única o fraccionada dentro del rango de 1-7,5 Gy.

Según un aspecto, la TBI comprende una dosis de irradiación única o fraccionada dentro del rango de 0,5-1 Gy, 0,5 1,5 Gy, 0,5-2,5 Gy, 0,5-5 Gy, 0,5-7,5 Gy, 0,5-10 Gy, 0,5-15 Gy, 1-1,5 Gy, 1-2 Gy, 1-2,5 Gy, 1-3 Gy, 1-3,5 Gy, 1-4 Gy, 1-4,5 Gy, 1-1,5 Gy, 1-7,5 Gy, 1-10 Gy, 2-3 Gy, 2-4 Gy, 2-5 Gy, 2-6 Gy, 2-7 Gy, 2-8 Gy, 2-9 Gy, 2-10 Gy, 3-4 Gy, 3-5 Gy, 3-6 Gy, 3-7 Gy, 3-8 Gy, 3-9 Gy, 3-10 Gy, 4-5 Gy, 4-6 Gy, 4-7 Gy, 4-8 Gy, 4-9 Gy, 4-10 Gy, 5-6 Gy, 5-7 Gy, 5-8 Gy, 5-9 Gy, 5-10 Gy, 6-7 Gy, 6-8 Gy, 6-9 Gy, 6-10 Gy, 7-8 Gy, 7-9 Gy, 7-10 Gy, 8-9 Gy, 8-10 Gy, 10-12 Gy o 10-15 Gy.

Según un aspecto específico, la TBI comprende una dosis de irradiación única o fraccionada dentro del rango de 1 7,5 Gy.

Según un aspecto, el agente que elimina las células madre residentes comprende un agente quimioterapéutico (por ejemplo, un agente antineoplásico). Según un aspecto específico, el agente comprende un agente alquilante. Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen, aunque sin limitación, ciclofosfamida, busulfán, mecloretamina o mustina (HN2), uramustina o mostaza de uracilo, melfalán, clorambucilo, ifosfamida, bendamustina, nitrosoureas, carmustina, lomustina, estreptozocina, tiotepa, platino, cisplatino, carboplatino, nedaplatino, oxaliplatino, satraplatino, triplatin tetranitrato, procarbazina, altretamina, triazenos (dacarbazina, mitozolomida, temozolomida), dacarbazina, temozolomida, myleran, busulfex, fludarabina y dimetil mileran.

El agente quimioterapéutico se puede administrar al sujeto en una sola dosis o en varias dosis, p.ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dosis (por ejemplo, dosis diarias) para eliminar las células madre residentes en el tejido.

Según un aspecto, el agente capaz de inducir daño al tejido se administra al sujeto de 1 a 10 días (por ejemplo, de 1 a 3 días, por ejemplo, 3 días) antes del agente que elimina las células madre residentes.

Según un aspecto, el agente que elimina las células madre residentes se administra al sujeto de 1 a 10 días (por ejemplo, de 1 a 3 días, por ejemplo, 2 días) antes de la administración de las células progenitoras (discutido más adelante).

Según un aspecto, el agente capaz de inducir daño al tejido se administra al sujeto 2-10 días (por ejemplo, 2-3 días) antes del trasplante y el agente que elimina las células madre residentes se administra al sujeto 40-48 horas después (por ejemplo, 1-3 días antes del trasplante, por ejemplo, 1 día antes del trasplante).

Según un aspecto, el agente capaz de inducir daño al tejido y el agente que elimina las células madre residentes es el mismo agente (por ejemplo, agente alquilante).

Los presentes inventores han ilustrado que el acondicionamiento de ratones receptores usando un tratamiento con naftaleno, seguido de irradiación corporal total (TBI), conduce a un quimerismo sustancial y duradero en diferentes linajes celulares de los pulmones lesionados (ver los Ejemplos 2 y 4, de la sección de Ejemplos incluida a continuación).

Por tanto, el método de la presente descripción se puede aplicar para el acondicionamiento de cualquier sujeto que necesite un trasplante de células progenitoras.

Por tanto, según un aspecto de la presente descripción, se proporciona un método de trasplante de células progenitoras en suspensión de un tejido de interés a un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método: (a) acondicionar al sujeto según el método de la descripción; y (b) trasplantar las células progenitoras en suspensión al sujeto.

Tal como se usa en este documento, el término "sujeto" o "sujeto que necesita" se refiere a un mamífero, preferiblemente un ser humano, hombre o mujer de cualquier edad que necesita un trasplante de células (es decir, trasplante de células progenitoras) o que sufre de una enfermedad que puede tratarse con un trasplante de células (es decir, un trasplante de células progenitoras). Normalmente, el sujeto necesita un trasplante (también denominado en este documento receptor) debido a un trastorno o una afección, estado o síndrome patológico o no deseado, o una anomalía física, morfológica o fisiológica susceptible de tratamiento mediante trasplante celular. Según un aspecto específico, el sujeto padece o está predispuesto a daño o deficiencia de tejido como resultado de una enfermedad, trastorno o lesión. Más adelante se proporcionan ejemplos de tales trastornos.

Tal como se usa en el presente documento, la frase "trasplantar" se refiere a la administración de células corporales, p. ej. células individuales o un grupo de células, en un sujeto.

Tal como se usa en este documento, el término "células progenitoras" o "células precursoras" se refiere a células que se encuentran en tejidos fetales o adultos, y que están comprometidas con un linaje celular específico. Estas células dan lugar a células diferenciadas (es decir, células diferenciadas terminalmente).

Según un aspecto, las células progenitoras comprenden células progenitoras cardíacas, células progenitoras hepáticas, células progenitoras pancreáticas, células progenitoras del cerebro, células progenitoras nefríticas, células progenitoras de ovario, células progenitoras del bazo o células progenitoras pulmonares.

La frase "células en suspensión", tal como se usa en este documento, se refiere a células progenitoras que se han aislado de su entorno natural (por ejemplo, el cuerpo humano) y se extraen de la sangre o tejido/órgano, y aunque mantienen la viabilidad no mantienen la estructura del tejido (es decir, no tienen estructura de tejido vascularizado) de modo que puedan ser inyectables, por ejemplo, mediante administración intravenosa. Según un aspecto específico, las células en suspensión no están unidas a un soporte sólido.

Dependiendo de la aplicación, el método puede realizarse usando células progenitoras que son singénicas o no singénicas con el sujeto.

Tal como se usa en este documento, el término células "singénicas" se refiere a células que son esencialmente genéticamente idénticas al sujeto o esencialmente a todos los linfocitos del sujeto. Los ejemplos de células singénicas incluyen células derivadas del sujeto (también denominadas en la técnica como "autólogas"), de un clon del sujeto o de un gemelo idéntico del sujeto.

Tal como se usa en este documento, el término células "no singénicas" se refiere a células que no son esencialmente genéticamente idénticas al sujeto o esencialmente a todos los linfocitos del sujeto, tales como células alogénicas o células xenogénicas.

Tal como se usa en este documento, el término "alogénico" se refiere a células que se derivan de un donante que es de la misma especie que el sujeto, pero que es sustancialmente no clonal con el sujeto. Típicamente, los mamíferos gemelos no cigóticos, consanguíneos de la misma especie son alogénicos entre sí. Se apreciará que una célula alogénica puede ser HLA idéntica, parcialmente HLA idéntica o HLA no idéntica (es decir, mostrar uno o más determinantes HLA dispares) con respecto al sujeto.

Tal como se usa en este documento, el término "xenogénico" se refiere a una célula que expresa sustancialmente antígenos de una especie diferente en relación con la especie de una proporción sustancial de los linfocitos del sujeto. Normalmente, los mamíferos consanguíneos de diferentes especies son xenogénicos entre sí.

La presente descripción prevé que las células xenogénicas se deriven de una variedad de especies. Por tanto, según un aspecto, las células progenitoras pueden derivar de cualquier mamífero. Los orígenes de especies adecuados para las células progenitoras comprenden los principales primates y animales domésticos o de ganado. Dichos animales incluyen, aunque sin limitación, porcinos (por ejemplo, cerdo), bovinos (por ejemplo, vaca), equinos (por ejemplo, caballo), ovinos (por ejemplo, cabra, oveja), felinos (por ejemplo, Felis domestica), caninos (p. ej., Canis domestica), roedores (por ejemplo, ratón, rata, conejo, conejillo de indias, jerbo, hámster) y primates (por ejemplo, chimpancé, mono rhesus, mono macaco, tití).

Las células progenitoras de origen xenogénico (por ejemplo, origen porcino) se obtienen preferiblemente de una fuente que se sabe que está libre de zoonosis, tal como retrovirus endógenos porcinos. De manera similar, las células o tejidos derivados de seres humanos se obtienen preferiblemente de fuentes sustancialmente libres de patógenos.

Según un aspecto, las células progenitoras no son singénicas con el sujeto.

Según un aspecto, las células progenitoras son alogénicas con el sujeto.

Según un aspecto, las células progenitoras son xenogénicas con el sujeto.

Según un aspecto, las células progenitoras son singénicas con el sujeto (por ejemplo, autólogas).

Según un aspecto de la presente descripción, el sujeto es un ser humano y las células progenitoras son de origen humano (por ejemplo, singénicas o no singénicas).

Según un aspecto, el sujeto es un ser humano y las células progenitoras son de origen xenogénico (por ejemplo, origen porcino).

Dependiendo de la aplicación y las fuentes disponibles, las células de la presente descripción pueden obtenerse de un organismo prenatal, organismo postnatal, un adulto o un donante cadáver. Tales determinaciones están dentro de la capacidad de un especialista en la técnica.

En la medida en que las células progenitoras se obtienen mediante la destrucción de un embrión humano, las células progenitoras humanas no forman parte de la invención reivindicada y se mencionan únicamente con fines de referencia. Esto se aplica independientemente de si la destrucción es directa o indirecta, por ejemplo, en los casos en que las células progenitoras se obtienen de una línea celular que se ha establecido mediante la destrucción de un embrión humano.

Según un aspecto, las células progenitoras son de origen embrionario (por ejemplo, correspondientes a una gestación humana de una a ocho semanas después de la fertilización).

Según un aspecto, las células progenitoras son de origen fetal (por ejemplo, correspondientes a la gestación humana que comienza nueve semanas después de la fertilización).

Según un aspecto, las células progenitoras son de origen adulto (por ejemplo, un organismo mamífero en cualquier etapa después del nacimiento).

Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para obtener células para trasplante. Así, por ejemplo, las células progenitoras pueden obtenerse de un órgano o tejido. Se apreciará que las células progenitoras de la descripción pueden ser preparaciones frescas o congeladas (por ejemplo, crioconservadas), tal como se describe a continuación.

Según un aspecto, el órgano o tejido es de un organismo fetal. El organismo fetal puede ser de cualquier origen humano o xenogénico (por ejemplo, porcino) y en cualquier etapa de la gestación. Tal determinación está en la capacidad de un especialista en la técnica.

Según un aspecto, el órgano o tejido fetal comprende un tejido pulmonar fetal, un tejido pancreático fetal, un tejido nefrítico fetal, un tejido hepático fetal, un tejido cardíaco fetal, un tejido cerebral fetal, un tejido del bazo fetal y un tejido ovárico fetal.

Pueden emplearse varios métodos para obtener un órgano o tejido de un organismo fetal. Así, por ejemplo, la obtención de un tejido (por ejemplo, tejido de hígado, páncreas, corazón, riñón o pulmón) puede efectuarse recolectando el tejido de un feto en desarrollo, por ejemplo, por un procedimiento quirúrgico.

Según un aspecto, el tejido pulmonar (es decir, tejido de pulmón) se obtiene de un feto en una etapa de gestación correspondiente a la etapa de desarrollo canalicular humana (por ejemplo, 16-25 semanas de gestación). Según un aspecto, el tejido pulmonar se obtiene de un feto en una etapa de gestación que corresponde a las 16-17 semanas de gestación humana, 16-18 semanas de gestación, 16-19 semanas de gestación, 16-20 semanas de gestación, 16-21 semanas de gestación, 16-22 semanas de gestación, 16-24 semanas de gestación, 17-18 semanas de gestación, 17 19 semanas de gestación, 17-20 semanas de gestación, 17-21 semanas de gestación, 17-22 semanas de gestación, 17-24 semanas de gestación, 18-19 semanas de gestación, 18-20 semanas de gestación, 18-21 semanas de gestación, 18-22 semanas de gestación, 18-24 semanas de gestación, 19-20 semanas de gestación, 19-21 semanas de gestación, 19-22 semanas de gestación, 19-23 semanas de gestación, 19-24 semanas de gestación, 20-21 semanas de gestación, 20-22 semanas de gestación, 20-23 semanas de gestación, 20-24 semanas de gestación, 21 22 semanas de gestación, 21-23 semanas de gestación, 21-24 semanas de gestación, 22-23 semanas de gestación, 22-24 semanas de gestación, 22-25 semanas de gestación gestación, 23-24 semanas de gestación , 23-25 semanas de gestación, 24-25 semanas de gestación o 25-26 semanas de gestación. Según un aspecto específico, el tejido pulmonar se obtiene de un feto en una etapa de gestación correspondiente a las 20-22 semanas de gestación humana.

Según un aspecto, el tejido hepático (es decir, tejido de hígado) se obtiene de un feto en una etapa de gestación correspondiente a las 5-16 semanas de gestación humana. Según un aspecto, el tejido hepático se obtiene de un feto en una etapa de gestación que corresponde a las 5-7 semanas de gestación humana, 5-8 semanas de gestación, 5-9 semanas de gestación, 5-10 semanas de gestación, 5-11 semanas de gestación, 5-12 semanas de gestación, 6-7 semanas de gestación, 6-8 semanas de gestación, 6-9 semanas de gestación, 6-10 semanas de gestación, 6-11 semanas de gestación, 6-12 semanas de gestación, 6-14 semanas de gestación, 7-8 semanas de gestación, 7-9 semanas de gestación, 7-10 semanas de gestación, 7-11 semanas de gestación, 7-12 semanas de gestación, 7-14 semanas de gestación, 7-16 semanas de gestación, 8-9 semanas de gestación, 8-10 semanas de gestación, 8-12 semanas de gestación, 8-14 semanas de gestación, 8-16 semanas de gestación, 9-10 semanas de gestación, 9-11 semanas de gestación, 9-12 semanas de gestación, 10-12 semanas de gestación, 10-14 semanas de gestación, 10 16 semanas de gestación, 6 semanas de gestación, 7 semanas de gestación, 8 semanas de gestación, 9 semanas de gestación o 10 semanas de gestación. Según un aspecto específico, el tejido hepático se obtiene de un feto en una etapa de gestación correspondiente a las 7-9 semanas de gestación humana, p. ej. 7 semanas de gestación.

Según un aspecto, el tejido pancreático (es decir, tejido del páncreas) se obtiene de un feto en una etapa de gestación que corresponde a las 5-20 semanas de gestación humana. Según un aspecto, el tejido pancreático se obtiene de un feto en una etapa de gestación que corresponde a las 5-7 semanas de gestación humana, 5-8 semanas de gestación, 5-9 semanas de gestación, 5-10 semanas de gestación, 5-11 semanas de gestación, 5-12 semanas de gestación, 5 14 semanas de gestación, 5-16 semanas de gestación, 6-7 semanas de gestación, 6-8 semanas de gestación, 6-9 semanas de gestación, 6-10 semanas de gestación, 6-11 semanas de gestación, 6-12 semanas de gestación, 6-14 semanas de gestación, 7-8 semanas de gestación, 7-9 semanas de gestación, 7-10 semanas de gestación, 7-11 semanas de gestación, 8-9 semanas de gestación, 8-10 semanas de gestación, 8-12 semanas de gestación, 8-14 semanas de gestación, 8-16 semanas de gestación, 8-18 semanas de gestación, 8-20 semanas de gestación, 9-10 semanas de gestación, 9-11 semanas de gestación, 9-12 semanas de gestación, 10-12 semanas de gestación, 10-14 semanas de gestación, 10-16 semanas de gestación, 10-18 semanas de gestación gestación, 10-20 semanas de gestación, 12-14 semanas de gestación, 12-16 semanas de gestación ks de gestación, 12-20 semanas de gestación, 14-18 semanas de gestación, 14-20 semanas de gestación, 16-18 semanas de gestación, 16-20 semanas de gestación, 6 semanas de gestación, 7 semanas de gestación, 8 semanas de gestación, 9 semanas de gestación o 10 semanas de gestación. Según un aspecto específico, el tejido pancreático se obtiene de un feto en una etapa de gestación que corresponde a las 8-20 semanas de gestación humana, p. ej. 8 semanas de gestación.

Según un aspecto, el tejido cardíaco (es decir, tejido del corazón) se obtiene de un feto en una etapa de gestación correspondiente a las 5-16 semanas de gestación humana. Según un aspecto, el tejido cardíaco se obtiene de un feto en una etapa de gestación que corresponde a las 5-7 semanas de gestación humana, 5-8 semanas de gestación, 5-9 semanas de gestación, 5-10 semanas de gestación, 5-11 semanas de gestación, 5-12 semanas de gestación, 6-7 semanas de gestación, 6-8 semanas de gestación, 6-9 semanas de gestación, 6-10 semanas de gestación, 6-11 semanas de gestación, 6-12 semanas de gestación, 6-14 semanas de gestación, 7-8 semanas de gestación, 7-9 semanas de gestación, 7-10 semanas de gestación, 7-11 semanas de gestación, 8-9 semanas de gestación, 8-10 semanas de gestación, 8-12 semanas de gestación, 8-14 semanas de gestación, 8-16 semanas de gestación, 9-10 semanas de gestación, 9-11 semanas de gestación, 9-12 semanas de gestación, 9-14 semanas de gestación, 9-16 semanas de gestación, 10-12 semanas de gestación, 10-14 semanas de gestación, 10-16 semanas de gestación, 6 semanas de gestación, 7 semanas de gestación, 8 semanas de gestación, 9 semanas de gestación o 10 semanas de gestación. Según un aspecto específico, el tejido cardíaco se obtiene de un feto en una etapa de gestación correspondiente a las 7-9 semanas de gestación humana, p.ej. 9 semanas de gestación.

Según un aspecto, el tejido nefrítico (es decir, tejido renal) se obtiene de un feto en una etapa de gestación que corresponde a las 5-16 semanas de gestación humana. Según un aspecto, el tejido nefrítico se obtiene de un feto en una etapa de gestación que corresponde a las 5-7 semanas de gestación humana, 5-8 semanas de gestación, 5-9 semanas de gestación, 5-10 semanas de gestación, 5-11 semanas de gestación, 5-12 semanas de gestación, 6-7 semanas de gestación, 6-8 semanas de gestación, 6-9 semanas de gestación, 6-10 semanas de gestación, 6-11 semanas de gestación, 6-12 semanas de gestación, 6-14 semanas de gestación, 7-8 semanas de gestación, 7-9 semanas de gestación, 7-10 semanas de gestación, 7-11 semanas de gestación, 7-12 semanas de gestación, 7-14 semanas de gestación, 7-16 semanas de gestación, 8-9 semanas de gestación, 8-10 semanas de gestación, 8-12 semanas de gestación, 8-14 semanas de gestación, 8-16 semanas de gestación, 10-12 semanas de gestación, 10-14 semanas de gestación, 10-16 semanas de gestación, 6 semanas de gestación, 7 semanas de gestación, 8 semanas de gestación, 9 semanas de gestación o 10 semanas de gestación. Según un aspecto específico, el tejido nefrítico se obtiene de un feto en una etapa de gestación correspondiente a las 7-9 semanas de gestación humana, p. ej. 7-8 semanas de gestación.

Los especialistas en la técnica entenderán que la etapa gestacional de un organismo es el período de tiempo transcurrido después de la fertilización del ovocito que genera el organismo.

La siguiente tabla proporciona un ejemplo de las etapas gestacionales de los tejidos humanos y porcinos en las que éstos pueden proporcionar tejidos fetales que se encuentran esencialmente en las etapas de desarrollo correspondientes:

Tabla 6: Etapas gestacionales correspondientes de cerdos y humanos.

Asimismo, se pueden emplear varios métodos para obtener un órgano o tejido de un organismo adulto (por ejemplo, vivo o cadáver). Por tanto, por ejemplo, la obtención de un tejido (por ejemplo, tejido de hígado, páncreas, corazón, riñón o pulmón) puede efectuarse recolectando el tejido de un donante de órganos mediante un procedimiento quirúrgico, por ejemplo, laparotomía o laparoscopia. Después de obtener el órgano/tejido del organismo adulto, las células madre (por ejemplo, células madre adultas) pueden aislarse del mismo según métodos conocidos en la técnica, dichos métodos dependen de la fuente y del linaje de las células y pueden incluir, por ejemplo, citometría de flujo y clasificación de células, tal como se muestra, por ejemplo, en www.bio-rad.com/en-uk/applicationstechnologies/isolation-maintenance-stem-cells.

Una vez obtenido el órgano/tejido (por ejemplo, tejido fetal), la presente descripción contempla además la generación de una población aislada de células a partir del mismo.

Las células progenitoras pueden estar comprendidas en una suspensión de células individuales o de agregados de células, de no más de 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000 células por agregado.

La suspensión celular de la descripción se puede obtener por cualquier medio mecánico o químico (por ejemplo, enzimático). Existen varios métodos para disociar grupos de células para formar suspensiones de células (por ejemplo, suspensión de células individuales) a partir de tejidos primarios, células adheridas en cultivo y agregados, por ejemplo, fuerzas físicas (disociación mecánica, tal como raspador de células, trituración a través de una pipeta de calibre estrecho, aspiración con aguja fina, disgregación en vórtice y filtración forzada a través de una malla fina de nailon o acero inoxidable), enzimas (disociación enzimática tal como con tripsina, colagenasa, acutasa y similares) o una combinación de ambas.

Así, por ejemplo, la digestión enzimática de tejido/órgano en células aisladas se puede realizar sometiendo el tejido a una enzima como la colagenasa tipo IV (Worthington biochemical corporation, Lakewood, NJ, EE.UU.) y/o lo dispasa (productos de Invitrogen Corporation, Grand Island NY, EE.UU.). Por ejemplo, el tejido puede ser digerido con enzimas picando finamente el tejido con una hoja de afeitar en presencia de p.ej. colagenasa, dispasa y CaCb a 37 °C durante aproximadamente 1 hora. El método puede comprender además la eliminación de desechos no específicos de la suspensión celular resultante mediante, por ejemplo, filtración secuencial a través de filtros (por ejemplo, filtros de 70 y 40 pm), esencialmente como se describe en "Materiales generales y métodos experimentales" de la sección de Ejemplos incluida a continuación.

Además, la disociación mecánica de tejido en células aisladas se puede realizar utilizando un dispositivo diseñado para romper el tejido a un tamaño predeterminado. Se puede obtener un dispositivo de este tipo de CellArtis Goteborg, Suecia. Adicional o alternativamente, la disociación mecánica se puede realizar manualmente usando una aguja, tal como una aguja de 27g (BD Microlance, Drogheda, Irlanda) mientras se observan los tejidos/células bajo un microscopio invertido.

Después de la disociación enzimática o mecánica del tejido, las células disociadas se rompen en pequeños grupos utilizando puntas de pipeta Gilson de 200 pL (por ejemplo, pipeteando hacia arriba y hacia abajo las células).

Alternativamente, se puede obtener un tejido mediante cultivo in vitro o ex vivo de células, órganos/tejidos. Dicha diferenciación controlada in vitro de células, tejidos u órganos se realiza de forma rutinaria, por ejemplo, usando cultivo de líneas de células madre embrionarias para generar cultivos que contienen células de linajes deseados.

Según un aspecto, las células de la presente descripción son diferenciadas ex vivo de las células madre adultas o células madre pluripotentes, tal como las células madre embrionarias (células ES) o iPS.

La frase "células madre embrionarias" o "células ES" se refiere a células embrionarias que son capaces de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias (es decir, endodermo, ectodermo y mesodermo), o de permanecer en un estado indiferenciado. La frase "células madre embrionarias" puede comprender células que se obtienen del tejido embrionario formado después de la gestación (por ejemplo, blastocisto) antes de la implantación del embrión (es decir, blastocisto de preimplantación), células de blastocisto extendidas (EBC) que se obtienen de un blastocisto en etapa de post-implantación/pre-gastrulación (ver el documento WO2006/040763), células germinales embrionarias (EG) que se obtienen del tejido genital de un feto en cualquier momento durante la gestación, preferiblemente antes de las 10 semanas de gestación, y células originadas de un óvulo no fertilizado que son estimuladas por partenogénesis (partenotes).

Las células madre embrionarias (por ejemplo, ESC humanas) que se originan a partir de un óvulo no fertilizado estimulado por partenogénesis (partenotes) son conocidas en la técnica (por ejemplo, Zhenyu Lu y col., 2010. J. Assist Reprod. Genet. 27: 285-291; "Derivation and long-term culture of human parthenogenetic embryonic stem cells using human foreskin feeders"). La partenogénesis se refiere al inicio de la división celular mediante la activación de óvulos en ausencia de espermatozoides, por ejemplo, mediante estimulación eléctrica o química. El óvulo activado (partenote) es capaz de convertirse en una estructura embrionaria primitiva (llamada blastocisto) pero no puede desarrollarse a término ya que las células son pluripotentes, lo que significa que no pueden desarrollar los tejidos extraembrionarios necesarios (tal como el líquido amniótico) necesarios para un feto humano viable.

Otro método para preparar células madre embrionarias se describe en Chung et al., Cell Stem Cell, volumen 2, número 2, 113-117, 7 de febrero de 2008. Este método comprende extraer una sola célula de un embrión durante un proceso de fertilización in vitro. El embrión no se destruye en este proceso.

Las células madre pluripotentes inducidas (iPS; células madre de tipo embrionario) son células obtenidas por des diferenciación de células somáticas adultas que están dotadas de pluripotencia (es decir, ser capaz de diferenciarse en las tres capas de células germinales embrionarias, esto es, endodermo, ectodermo y mesodermo). Según algunos aspectos de la descripción, dichas células se obtienen de un tejido diferenciado (por ejemplo, un tejido somático como la piel) y se des-diferencian mediante manipulación genética, que reprograma la célula para adquirir características de células madre embrionarias. Según algunos aspectos de la descripción, las células madre pluripotentes inducidas se forman induciendo la expresión de Oct-4, Sox2, Kfl4 y/o c-Myc en una célula madre somática. En la medida en que son de origen humano, las células madre pluripotentes no son el resultado de la destrucción del embrión.

La frase "células madre adultas" (también llamadas "células madre de tejido" o una célula madre de un tejido somático) se refiere a cualquier célula madre derivada de un tejido somático [de un animal postnatal o prenatal (especialmente el ser humano)]. Generalmente se piensa que la célula madre adulta es una célula madre multipotente, capaz de diferenciarse en múltiples tipos de células. Las células madre adultas pueden derivarse de cualquier tejido adulto, neonatal o fetal, como tejido adiposo, de piel, riñón, hígado, próstata, páncreas, intestino, médula ósea y placenta.

Las células madre embrionarias cultivadas de la presente descripción se pueden diferenciar en células de linaje de desarrollo restringido (por ejemplo, células progenitoras).

La diferenciación de las células madre puede iniciarse permitiendo el crecimiento excesivo de células ES humanas indiferenciadas en cultivos en suspensión que forman cuerpos embrioides o colocando células ES en placas en condiciones que promuevan la diferenciación de una manera particular.

Se apreciará que las condiciones de cultivo adecuadas para la diferenciación y expansión de las células específicas de linaje aislado incluyen varios medios de cultivo de tejidos, factores de crecimiento, antibióticos, aminoácidos y similares y está dentro de la capacidad de un especialista en la técnica determinar qué condiciones deben aplicarse para expandir y diferenciar tipos de células particulares y/o linajes celulares [revisado en Fijnvandraat AC y col., Cardiovasc Res. 2003; 58: 303-12; Sachinidis A y col., Cardiovasc Res. 2003; 58: 278-91; Stavridis MP y Smith AG, 2003; Biochem Soc T rans. 31 (Pt 1): 45-9].

Por ejemplo, las células madre embrionarias pueden inducirse a diferenciarse in vitro en células progenitoras cardíacas [Engels et al., Stem Cells (2014) 00: 000-000]. Se ha demostrado que varios factores enriquecen la diferenciación cardíaca, como la insulina y los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF1/2).

También se ha inducido a las células madre embrionarias a diferenciarse en células progenitoras neurales [Kim y col., Dev Biol. (2009) 15; 328 (2): 456-471; Patente de EE.UU. n° 5.851.832]. Para su generación, el medio normalmente incluye cualquiera de los siguientes factores o constituyentes de medio en una combinación eficaz: ácido retinoico (RA), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), una proteína inflamatoria de macrófagos (MIP), factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) y factor de crecimiento epidérmico (EGF).

También se ha inducido a las células madre pluripotentes humanas a diferenciarse en células progenitoras de pulmón y vías respiratorias [Huang et al., Nature Protocols 10, 413-425 (2015)]. Por lo tanto, las células madre pueden cultivarse en presencia de altas concentraciones de activina A. Posteriormente, el endodermo del intestino anterior (AFE) sesgado por los pulmones se especifica mediante la inhibición secuencial de la proteína morfogenética ósea (BMP), factor de crecimiento transformante-p (TGF-p) y señalización Wnt. A continuación, el AFE se ventraliza aplicando señales de Wnt, BMP, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y ácido retinoico (RA) para obtener progenitores de pulmón y vías respiratorias.

También se ha inducido a las células madre embrionarias a diferenciarse en células progenitoras pancreáticas [Chen y col., Cell Biol Int. (2008) 32(4): 456-61]. El método utiliza un sistema de diferenciación in vitro con una concentración sérica reducida más nicotinamida para generar células progenitoras pancreáticas tempranas a partir de células madre embrionarias. Los métodos adicionales se describen, por ejemplo, en Kahan et al., Diabetes (2003) 52(8): 2016-2024.

También se ha inducido a las células madre embrionarias a diferenciarse en células progenitoras néfricas [Takasato y col., Nature Cell Biology 16, 118-126 (2014)] dirigiendo la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hESC) a través de la línea primitiva posterior y el mesodermo intermedio (IM) en condiciones de cultivo en monocapa completamente definidas químicamente utilizando factores de crecimiento utilizados durante la embriogénesis normal.

También se ha inducido a las células madre embrionarias a diferenciarse en células progenitoras hepáticas [Pei y col., Tissue Eng Part C Methods. (2009) 15(1): 95-104]. La generación de células de linaje hepatocítico temprano a partir de células hES se llevó a cabo usando cuatro etapas de inducción secuenciales como sigue: primero, se generaron cuerpos embrioides (EB) cultivando células hES en suspensión; en segundo lugar, los EB fueron restringidos en linaje al endodermo definitivo con activina A humana; tercero, las células se diferenciaron adicionalmente mediante el co cultivo con células estromales de hígado fetal humano (hFLSC) convertidas en transgénicas para liberar de manera estable el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF); cuarto, el tratamiento de las células con señales solubles consistió en bFGF derivado de hFLSC, factor de crecimiento de hepatocitos, oncostatina M y dexametasona.

La diferenciación de células madre también puede estar dirigida por modificación genética. Por ejemplo, se demostró que la expresión de cuatro factores GATA-4, TBX5, NKX2.5 y BAF60c induce la diferenciación de hESC en progenitores cardíacos [Dixon et al., Molecular Therapy (2011) 199, 1695-1703].

Seguimiento de la etapa de diferenciación de las células madre embrionarias

Durante la etapa de cultivo, las células madre se controlan adicionalmente para determinar su estado de diferenciación. La diferenciación celular se puede determinar mediante el examen de marcadores específicos de células o tejidos que se sabe que son indicativos de diferenciación. Por ejemplo, las células madre embrionarias de primates pueden expresar el antígeno embrionario específico de la etapa (SSEA) 4, el antígeno que rechaza el tumor (TRA)-1-60 y TRA-1-81.

Los marcadores específicos de tejido/célula se pueden detectar usando técnicas inmunológicas bien conocidas en la técnica [Thomson JA y col., (1998). Science 282: 1145-7]. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, citometría de flujo para marcadores unidos a membrana, inmunohistoquímica para marcadores extracelulares e intracelulares e inmunoensayo enzimático, para marcadores moleculares secretados.

La determinación de la diferenciación de células ES también se puede realizar mediante mediciones de la actividad de la fosfatasa alcalina. Las células madre embrionarias humanas indiferenciadas tienen actividad de fosfatasa alcalina que puede detectarse fijando las células con paraformaldehído al 4% y revelando con el kit de sustrato Vector Red según las instrucciones del fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, California, EE.UU.).

Se puede controlar la pluripotencia de las células madre embrionarias in vitro a través de la formación de cuerpos embrioides (EB), así como in vivo a través de la formación de teratomas.

Teratomas

La capacidad pluripotente de la línea de células ES también puede confirmarse inyectando células en ratones SCID [Evans MJ y Kaufman M (1983). Pluripotential cells grown directly from normal mouse embryos. Cancer Surv. 2: 185 208], que al inyectarse forman teratomas. Los teratomas se fijan con paraformaldehído al 4% y se examinan histológicamente en busca de las tres capas germinales (es decir, endodermo, mesodermo y ectodermo).

Además de controlar para un estado de diferenciación, las células madre a menudo también se controlan para el cariotipo, con el fin de verificar la euploidez citológica, en la que todos los cromosomas están presentes y no se alteran de forma detectable durante el cultivo. Las células madre cultivadas se pueden cariotipar usando una tinción de Giemsa estándar y se pueden comparar con cariotipos publicados de las especies correspondientes.

Según la presente descripción, la suspensión celular de células progenitoras comprende células viables. La viabilidad celular se puede controlar usando cualquier método conocido en la técnica, como, por ejemplo, usando un ensayo de viabilidad celular (por ejemplo, Ensayo MultiTox Multiplex disponible de Promega), citometría de flujo, azul tripán, etc.

Normalmente, las células progenitoras se utilizan inmediatamente para el trasplante. Sin embargo, en situaciones en las que las células deben mantenerse en suspensión antes del trasplante, p.ej. durante 1-12 horas, las células pueden cultivarse en un medio de cultivo que sea capaz de mantener su viabilidad. Dicho medio de cultivo puede ser un medio a base de agua que incluye una combinación de sustancias tales como sales, nutrientes, minerales, vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, proteínas tales como citoquinas, factores de crecimiento y hormonas, todos los cuales son necesarios para mantener las células progenitoras en un estado viable. Por ejemplo, un medio de cultivo según este aspecto de la presente descripción puede ser un medio de cultivo de tejidos sintético tal como RPMI-1640 (Life Technologies, Israel), Ko-DMEM (productos de Gibco-Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, EE.UU.), DMEM/F12 (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), medio Mab ADCB (HyClone, Utah, EE.UU.) o DMEM/F12 (Biological Industries, Biet Haemek, Israel) complementado con los aditivos necesarios. Preferiblemente, todos los ingredientes incluidos en el medio de cultivo de la presente descripción son sustancialmente puros, con un grado de cultivo de tejidos.

Las células progenitoras también se pueden almacenar en condiciones apropiadas (típicamente mediante congelación) para mantener las células (por ejemplo, células progenitoras) vivas y funcionando para su uso en trasplantes. Según un aspecto, las células progenitoras se almacenan como poblaciones criopreservadas. Otros métodos de conservación se describen en las Patentes de EE.UU. n° 5.656.498, 5.004.681, 5.192.553, 5.955.257 y 6.461.645. Los métodos para almacenar células madre se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2003/0215942.

Las células progenitoras también se pueden expandir, p.ej. ex vivo. El término "expandido" se refiere a aumentar el número de células en al menos aproximadamente 2 veces, 4 veces, 10 veces, 20 veces, 40 veces, 80 veces, 120 veces, 140 veces o más.

Según un aspecto, las células progenitoras se expanden en cultivo (p. ej. expandidas ex vivo) a partir de células fetales (por ejemplo, células pulmonares fetales). Las células fetales pueden tener una edad gestacional tal como se ha discutido anteriormente (por ejemplo, 16-25 semanas, por ejemplo, 20-22 semanas, de gestación humana).

Según un aspecto, las células progenitoras se expanden en cultivo (p. ej. expandidas ex vivo) a partir de células adultas (por ejemplo, células pulmonares adultas).

Así, por ejemplo, las células progenitoras pueden obtenerse de un tejido fetal (por ejemplo, tejido pulmonar fetal) y cultivarse en placas de cultivo de tejidos en presencia de un medio celular (por ejemplo, medio de alimentación, por ejemplo, iMEF) y opcionalmente con factores de crecimiento adicionales y/o citocinas (por ejemplo, factor de crecimiento epitelial e inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK)) durante varios días (por ejemplo, 7-14 días, tal como 9 días), hasta que se obtenga un número adecuado de células. La medición del número de células (por ejemplo, células viables) se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido por un especialista en la técnica, por ejemplo, mediante una cámara de recuento, mediante análisis FAC o mediante un espectrofotómetro.

Las células progenitoras pueden comprender células obtenidas de más de un donante de células.

Según un aspecto, las células progenitoras comprenden una población heterogénea de células (por ejemplo, población de células no separada).

Según otro aspecto de la presente descripción, las células progenitoras comprenden una población purificada de células. Por consiguiente, las células progenitoras pueden tratarse para eliminar una población específica de células de las mismas (por ejemplo, la eliminación de una subpoblación). Esta subpoblación puede administrarse luego a un sujeto (como se describe a continuación) o descartarse (y usarse el resto de la población celular, como se describe a continuación).

Según un aspecto de la presente descripción, las células progenitoras comprenden una población purificada de células epiteliales, endoteliales y/o mesenquimales.

La purificación de tipos de células específicos puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido por un especialista en la técnica, como por ejemplo, mediante purificación basada en afinidad (por ejemplo, mediante el uso de perlas MACS, clasificador FACS y/o marcaje ELISA de captura) usando anticuerpos específicos que reconocen cualquier marcador celular específico (por ejemplo, CD31, CD34, CD41, CD45, CD48, CD105, CD150, CD271, CD326, MUCIN-1, PODOPLANIN).

La administración de las células progenitoras en suspensión al sujeto puede efectuarse de numerosas formas, dependiendo de varios parámetros, tales como, por ejemplo, el tipo, estadio o gravedad de la enfermedad a tratar, los parámetros físicos o fisiológicos específicos del individuo sujeto y/o el resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, dependiendo de la aplicación y el propósito, la administración de las células progenitoras en suspensión puede efectuarse mediante una ruta seleccionada del grupo que consiste en intratraqueal, intrabronquial, intraalveolar, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intracardíaca, intramuscular, intraserosa, intramucosal, transmucosal, transnasal, rectal e intestinal.

Según un aspecto, la administración se efectúa por vía intravenosa.

Según un aspecto, la administración se efectúa por vía intratraqueal.

Alternativamente, la administración de las células progenitoras al sujeto puede efectuarse mediante la administración de las mismas en diversas localizaciones anatómicas adecuadas para que tengan un efecto terapéutico. Por lo tanto, dependiendo de la aplicación y el propósito, las células progenitoras pueden administrarse en una ubicación anatómica homotópica (una ubicación anatómica normal para el tipo de órgano o tejido de las células), o en una ubicación anatómica ectópica (una ubicación anatómica anormal del órgano o tipo de tejido de las células).

En consecuencia, dependiendo de la aplicación y el propósito, las células progenitoras se pueden implantar (por ejemplo, trasplantar) ventajosamente debajo de la cápsula renal, o en el riñón, la grasa testicular, la subcutis, el epiplón, la vena porta, el hígado, el bazo, la cavidad cardíaca, el corazón, la cavidad torácica, el pulmón, el páncreas, la piel y/o el espacio intraabdominal.

Por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad o afección hepática (por ejemplo, disfunción o insuficiencia hepática), las células progenitoras pueden trasplantarse al hígado, la vena porta, la cápsula renal, la subcutis, el epiplón, el bazo y el espacio intraabdominal. De manera similar, para el tratamiento de una enfermedad o afección pancreática (por ejemplo, diabetes), el trasplante de células progenitoras según la presente descripción puede realizarse ventajosamente trasplantando las células en la vena porta, el hígado, el páncreas, la grasa testicular, la subcutis, el epiplón, un asa intestinal (la subserosa de un asa en U del intestino delgado) y/o el espacio intraabdominal. Para el tratamiento de una enfermedad o afección pulmonar, las células progenitoras en suspensión se pueden administrar en el pulmón, debajo de la cápsula renal, el hígado, la vena porta, la subcutis, el epiplón, el bazo, el espacio intraabdominal, el páncreas y/o la grasa testicular. Para el tratamiento de una enfermedad o afección gastrointestinal, las células progenitoras de la presente descripción pueden administrarse en el hígado, la vena porta, la cápsula renal, la subcutis, el epiplón, el bazo, el espacio intraabdominal, el páncreas, la grasa testicular y/o un asa intestinal (la subserosa de un asa en U del intestino delgado). Asimismo, el trasplante de células progenitoras puede llevarse a cabo con el fin de tratar a receptores que padecen, por ejemplo, insuficiencia renal, insuficiencia cardíaca o daño cerebral.

Según un aspecto, el trasplante de las células progenitoras da como resultado la regeneración de tejido estructural/funcional.

Según un aspecto, el trasplante de las células progenitoras da como resultado la generación de un tejido quimérico (es decir, un tejido que comprende células de orígenes genéticamente distintos).

Después del trasplante de las células progenitoras en el sujeto según las presentes enseñanzas, es aconsejable, según la práctica médica estándar, controlar la funcionalidad de crecimiento y la inmunocompatibilidad de las células trasplantadas según cualquiera de las diversas técnicas de la técnica estándar. Por ejemplo, la funcionalidad de los tejidos pulmonares regenerados se puede controlar después del trasplante mediante pruebas de función pulmonar estándares (tal como se ha discutido en detalle anteriormente, por ejemplo, mediante análisis de las propiedades funcionales de los implantes en desarrollo, según lo indicado por la capacidad de sintetizar tensioactivo, detectable mediante tinción para proteína tensioactiva C (sp-C) y la capacidad de transportar iones, como lo indica la tinción del regulador transmembrana de fibrosis quística CFTR). Asimismo, la funcionalidad de tejidos regenerados hepáticos, cardíacos, nefríticos, cerebrales, ováricos y pancreáticos se puede controlar después del trasplante mediante pruebas de función estándar, tal como se ha descrito en detalle anteriormente.

El método de la presente descripción se puede aplicar para tratar cualquier enfermedad o afección en la que el trasplante de células progenitoras pueda ser ventajoso.

Según un aspecto, la enfermedad es una enfermedad maligna, una enfermedad del sistema nervioso central, una enfermedad gastrointestinal, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad hepática, una enfermedad nefrítica, una enfermedad pancreática, una enfermedad pulmonar, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria, una inmunodeficiencia y una enfermedad autoinmune.

Enfermedades cancerosas

Las enfermedades malignas (también denominadas cánceres) que pueden tratarse mediante el método de la descripción pueden ser cualquier tumor sólido o no sólido y/o metástasis tumoral.

Los ejemplos de cáncer incluyen, aunque sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma de Kaposi, melanoma, cáncer de pulmón (incluido el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el adenocarcinoma de pulmón y el carcinoma escamoso de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico (incluido el cáncer gastrointestinal), cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma carcinoide, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, mesotelioma, mieloma múltiple, trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD) y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, tumor cerebral). Las condiciones cancerosas susceptibles de tratamiento de la descripción incluyen cánceres metastásicos.

Según un aspecto, la enfermedad maligna es una neoplasia maligna hematológica. Los ejemplos de neoplasias hematológicas incluyen, aunque sin limitación, leucemia [por ejemplo, linfática aguda, linfoblástica aguda, linfoblástica aguda pre-linfocito B, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T, leucemia aguda - megacarioblástica, monocítica, mieloide aguda, mieloide aguda con eosinofilia, de células B, basófila, mieloide crónica, crónica, de células B, eosinofílica, de Friend, granulocítica o mielocítica, de célula pilosa, linfocítica, megacarioblástica, monocítica, monocítica-macrófaga, mieloblástica, mieloide, mielomonocítica, de célula plasmática, de pre-célula B, promielocítica, subaguda, de células T, neoplasia linfoide, predisposición a padecer malignidad mieloide, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica aguda de células T (T-ALL) y leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL)] y linfoma [p. ej., enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, de Burkitt, de linfocitos T cutáneos, histiocítico, linfoblástico, de linfocitos T, tímico, de linfocitos B, incluidos los de bajo grado/foliculares; NHL de linfocitos pequeños (SL); NHL folicular/de grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; n Hl linfoblástico de alto grado; NHL de células pequeñas no escindidas de alto grado; NHL enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom].

Según un aspecto específico, la enfermedad maligna es una leucemia, un linfoma, un mieloma, un melanoma, un sarcoma, un neuroblastoma, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un cáncer de mama, un cáncer de ovario, un cáncer de esófago, un cáncer de células sinoviales, un cáncer de hígado o un cáncer de páncreas.

Enfermedades inflamatorias - Incluyen, aunque sin limitación, enfermedades inflamatorias crónicas y enfermedades inflamatorias agudas.

Enfermedades inflamatorias asociadas con hipersensibilidad.

Los ejemplos de hipersensibilidad incluyen, aunque sin limitación, hipersensibilidad de tipo I, hipersensibilidad de tipo II, hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, hipersensibilidad inmediata, hipersensibilidad mediada por anticuerpos, hipersensibilidad mediada por inmunocomplejos, hipersensibilidad mediada por linfocitos T y DTH.

Hipersensibilidad de tipo I o inmediata, tal como el asma.

La hipersensibilidad de tipo II incluye, aunque sin limitación, enfermedades reumatoides, enfermedades autoinmunes reumatoides, artritis reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul; 15(3): 791), espondilitis, espondilitis anquilosante (Jan Voswinkel y col., Arthritis Res 2001; 3(3): 189), enfermedades sistémicas, enfermedades autoinmunes sistémicas, lupus eritematoso sistémico (Erikson J. y col., Immunol Res 1998; 17(1-2): 49), esclerosis, esclerosis sistémica (Renaudineau Y. y col., Clin Diagn Lab Immunol. Marzo de 1999; 6(2): 156); Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 Jun; 169: 107), enfermedades glandulares, enfermedades autoinmunes glandulares, enfermedades autoinmunes pancreáticas, diabetes, diabetes tipo I (Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct; 34 Suppl: S125), enfermedades tiroideas, enfermedades tiroideas autoinmunes, enfermedad de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun; 29(2): 339), tiroiditis, tiroiditis autoinmune espontánea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol 200015 de diciembre; 165(12): 7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho, agosto de 1999; 57(8): 1810), mixedema, mixedema idiopático (Mitsuma T. Nippon Rinsho. Agosto de 1999; 57(8): 1759); enfermedades reproductivas autoinmunes, enfermedades ováricas, autoinmunidad ovárica (Garza KM. et al., J Reprod Immunol, febrero de 1998; 37(2): 87), esterilidad autoinmune anti-esperma (Diekman AB. Et al., Am J Reprod Immunol.

^{2 0 0 0}Mar; 43(3): 134), pérdida fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl ²: S107-9), enfermedades neurodegenerativas, enfermedades neurológicas, enfermedades autoinmunes neurológicas, esclerosis múltiple (Cruz AH. et al., J Neuroimmunol 2001, 1 de enero; 112(1-2): 1), enfermedad de Alzheimer (Oron L. y col., J Neural Transm Suppl. 1997; 49: 77), miastenia gravis (Infante AJ. Y Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18(1-2): 83), neuropatías motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. Mayo de 2000; 7(3): 191), síndrome de Guillain-Barré, neuropatías y neuropatías autoinmunes (Kusunoki S. Am J Med Sci. Abril de 2000; 319(4): 234), enfermedades miasténicas, síndrome miasténico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci. Abril de 2000; 319(4): 204), enfermedades neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelosa, atrofia cerebelosa paraneoplásica, síndrome del hombre rígido no paraneoplásico, atrofias cerebelosas, atrofias cerebelosas progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Sydenham, síndrome de Gilles de la Tourette, poliendocrinopatías, poliendocrinopatías autoinmunes (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (París), enero de 2000; 156(1): 23); neuropatías, neuropatías disinmunes (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999; 50: 419); neuromiotonía, neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple congénita (Vincent A. y col., Ann N Y Acad Sci.

13 de mayo de 1998; 841: 482), enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunes cardiovasculares, aterosclerosis (Matsuura E. y col., Lupus. 1998; 7 Suppl 2: S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus. 1998; 7 Suppl 2: S132), trombosis (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2: S107-9), granulomatosis, granulomatosis de Wegener, arteritis, arteritis de Takayasu y síndrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 200025 de agosto; 112 (15-16): 660); enfermedad autoinmune anti-factor VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost 2000; 26(2): 157); vasculitis, vasculitis necrotizante de vasos pequeños, poliangeítis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis, glomerulonefritis necrotizante focal pauciinmune, glomerulonefritis en media luna (Noel LH. Ann Med Interne (París). Mayo de 2000; 151(3): 178); síndrome antifosfolípido (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14(4): 171); insuficiencia cardíaca, anticuerpos de los receptores adrenérgicos p de tipo agonista en la insuficiencia cardíaca (Wallukat G. y col., Am J Cardiol. 17 de junio de 1999; 83(12A): 75H), púrpura trombocitopénica (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 abril-junio; 14(2): 114); anemia hemolítica, anemia hemolítica autoinmune (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan; 28(3-4): 285), enfermedades gastrointestinales, enfermedades autoinmunes del tracto gastrointestinal, enfermedades intestinales, enfermedad intestinal inflamatoria crónica (García Herola A. y col., Gastroenterol Hepatol. Enero de 2000; 23(1): 16), enfermedad celíaca (Landau YE. y Shoenfeld Y. Harefuah 16 de enero de 2000; 138(2): 122), enfermedades autoinmunes de la musculatura, miositis, miositis autoinmune, síndrome de Sjogren (Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep; 123(1): 92); enfermedad autoinmune del músculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother junio de 1999; 53(5-6): 234), enfermedades hepáticas, enfermedades autoinmunes hepáticas, hepatitis autoinmune (Manns MP. J Hepatol, agosto de 2000; 33(2): 326) y cirrosis biliar primaria (Strassburg CP. y col., Eur J Gastroenterol Hepatol. Junio de 1999; 11(6): 595).

La hipersensibilidad mediada por células T o de tipo IV incluye, aunque sin limitación, enfermedades reumatoides, artritis reumatoide (Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci USA 18 de enero de 1994; 91(2): 437), enfermedades sistémicas, enfermedades autoinmunes sistémicas, lupus eritematoso sistémico (Datta SK., Lupus 1998; 7(9): 591), enfermedades glandulares, enfermedades glandulares autoinmunes, enfermedades pancreáticas, enfermedades pancreáticas autoinmunes, diabetes tipo 1 (Castano L. y Eisenbarth GS. Ana. Rev. Immunol. ⁸: 647); enfermedades tiroideas, enfermedades tiroideas autoinmunes, enfermedad de Graves (Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar; 92 (1): 77); enfermedades de los ovarios (Garza KM. et al., J Reprod Immunol, febrero de 1998; 37(2): 87), prostatitis, prostatitis autoinmune (Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec; 50(6): 893), síndrome poliglandular, síndrome poliglandular autoinmune, síndrome poliglandular autoinmune tipo I (Hara T. y col., Blood. 1 de marzo de 1991; 77(5): 1127), enfermedades neurológicas, enfermedades neurológicas autoinmunes, esclerosis múltiple, neuritis, neuritis óptica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 mayo; 57(5): 544), Miastenia gravis (Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 Dec; 20(12): 2563), síndrome del hombre rígido (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci USA 27 de marzo de 2001; 98(7): 3988), enfermedades cardiovasculares, autoinmunidad cardíaca en la enfermedad de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 199615 de octubre; 98(8): 1709), púrpura trombocitopénica autoinmune (Semple JW. et al., Blood 1996 15 de mayo; 87(10): 4245), autoinmunidad anti-linfocitos T colaboradores (Caporossi AP. y col., Viral Immunol 1998; 11(1): 9), anemia hemolítica (Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar; 74(3): 139), enfermedades hepáticas, enfermedades hepáticas autoinmunes, hepatitis, hepatitis crónica activa (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54(3): 382), cirrosis biliar, cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 noviembre; 91(5): 551), enfermedades nefríticas, enfermedades autoinmunes nefríticas, nefritis, nefritis intersticial (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol, agosto de 1990; 1(2): 140), enfermedades del tejido conectivo, enfermedades del oído, enfermedades autoinmunes del tejido conectivo, enfermedad autoinmune del oído (Yoo TJ. et al., Cell Immunol, agosto de 1994; 157(1): 249), enfermedad del oído interno (Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sci 199729 de diciembre; 830: 266), enfermedades de la piel, enfermedades cutáneas, enfermedades dérmicas, enfermedades cutáneas ampollosas, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso y pénfigo foliáceo.

Los ejemplos de hipersensibilidad de tipo retardado incluyen, aunque sin limitación, dermatitis de contacto y erupción farmacológica.

Los ejemplos de tipos de hipersensibilidad mediadora de linfocitos T incluyen, aunque sin limitación, linfocitos T auxiliares y linfocitos T citotóxicos.

Los ejemplos de hipersensibilidad mediada por linfocitos T colaboradores incluyen, aunque sin limitación, hipersensibilidad mediada por linfocitos Th1 e hipersensibilidad mediada por linfocitos Th2.

Enfermedades autoinmunes

Incluyen, aunque sin limitación, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatoides, enfermedades glandulares, enfermedades gastrointestinales, enfermedades cutáneas, enfermedades hepáticas, enfermedades neurológicas, enfermedades musculares, enfermedades nefríticas, enfermedades relacionadas con la reproducción, enfermedades del tejido conectivo y enfermedades sistémicas.

Los ejemplos de enfermedades cardiovasculares autoinmunes incluyen, aunque sin limitación, aterosclerosis (Matsuura E. y col., Lupus. 1998; 7 Suppl 2: S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus. 1998; 7 Suppl 2: S132), trombosis (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2: S107-9), Granulomatosis de Wegener, arteritis de Takayasu, síndrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 200025 de agosto; 112(15-16): 660), enfermedad autoinmune anti-factor VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost 2000; 26(2): 157), vasculitis necrotizante de vasos pequeños, poliangeítis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis necrotizante focal pauciinmune y glomerulonefritis en media luna (Noel LH. Ann Med Interne (París). Mayo de 2000; 151(3): 178), síndrome antifosfolípido (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14(4): 171), insuficiencia cardíaca inducida por anticuerpos (Wallukat G. y col., Am J Cardiol. 17 de junio de 1999; 83(12A): 75H), púrpura trombocitopénica (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 abril-junio; 14(2): 114; Semple JW. et al., Blood 1996 15 de mayo; 87(10): 4245), anemia hemolítica autoinmune (Efremov Dg . et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan; 28(3-4): 285; Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar; 74(3): 139), autoinmunidad cardíaca en la enfermedad de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 15 de octubre; 98(8): 1709) y autoinmunidad anti-linfocitos T colaboradores (Caporossi AP. y col., Viral Immunol 1998; 11(1): 9).

Los ejemplos de enfermedades reumatoides autoinmunes incluyen, aunque sin limitación, artritis reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul; 15(3): 791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci USA 18 de enero de 1994; 91(2): 437) y espondilitis anquilosante (Jan Voswinkel y col., Arthritis Res ^{2 0 0 1}; 3(3): 189).

Los ejemplos de enfermedades glandulares autoinmunes incluyen, aunque sin limitación, enfermedad pancreática, diabetes tipo I, enfermedad de la tiroides, enfermedad de Graves, tiroiditis, tiroiditis autoinmune espontánea, tiroiditis de Hashimoto, mixedema idiopático, autoinmunidad ovárica, infertilidad autoinmune anti-esperma, prostatitis autoinmune y síndrome poliglandular autoinmune de tipo I. Las enfermedades incluyen, aunque sin limitación, enfermedades autoinmunes del páncreas, diabetes tipo 1 (Castano L. y Eisenbarth GS. Ann Rev. Immunol. ⁸: 647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct; 34 Suppl: S125), enfermedades tiroideas autoinmunes, enfermedad de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun; 29(2): 339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar; 92(1): 77), tiroiditis autoinmune espontánea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol 2000 15 de diciembre; 165(12): 7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho, agosto de 1999; 57(8): 1810), mixedema idiopático (Mitsuma T. Nippon Rinsho. Agosto de 1999; 57(8): 1759), autoinmunidad ovárica (Garza KM. et al., J Reprod Immunol, febrero de 1998; 37(2): 87), infertilidad autoinmune anti-esperma (Diekman AB. y col., Am J Reprod Immunol. Marzo de 2000; 43(3): 134), prostatitis autoinmune (Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec; 50(6): 893) y síndrome poliglandular autoinmune tipo I (Hara T. y col., Blood. 1 de marzo de 1991; 77(5): 1127).

Los ejemplos de enfermedades gastrointestinales autoinmunes incluyen, aunque sin limitación, enfermedades intestinales inflamatorias crónicas (García Herola A. y col., Gastroenterol Hepatol. Enero de 2000; 23(1): 16), enfermedad celíaca (Landau YE. y Shoenfeld Y. Harefuah 16 de enero de 2000; 138(2): 122), colitis, ileítis y enfermedad de Crohn.

Los ejemplos de enfermedades cutáneas autoinmunes incluyen, aunque sin limitación, enfermedades cutáneas ampollosas autoinmunes, tales como, aunque sin limitación, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso y pénfigo foliáceo.

Los ejemplos de enfermedades hepáticas autoinmunes incluyen, aunque sin limitación, hepatitis, hepatitis activa crónica autoinmune (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54(3): 382), cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 noviembre; 91(5): 551; Strassburg CP. y col., Eur J Gastroenterol Hepatol. Junio de 1999; 11 (⁶): 595) y hepatitis autoinmune (Manns MP. J Hepatol, agosto de 2000; 33(2): 326).

Los ejemplos de enfermedades neurológicas autoinmunes incluyen, aunque sin limitación, esclerosis múltiple (Cruz AH. et al., J Neuroimmunol 2001, 1 de enero; 112(1-2): 1), enfermedad de Alzheimer (Oron L. y col., J Neural Transm Suppl. 1997; 49: 77), miastenia gravis (Infante AJ. Y Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18(1-2): 83; Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 Dec; 20(12): 2563), neuropatías, neuropatías motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. Mayo de 2000; 7(3): 191); síndrome de Guillain-Barré y neuropatías autoinmunes (Kusunoki S. Am J Med Sci. Abril de 2000; 319(4): 234), miastenia, síndrome miasténico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci. Abril de 2000; 319(4): 204); enfermedades neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelosa, atrofia cerebelosa paraneoplásica y síndrome del hombre rígido (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci USA 27 de marzo de 2001; 98(7): 3988); síndrome del hombre rígido no paraneoplásico, atrofias cerebelosas progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Sydenham, síndrome de Gilles de la Tourette y poliendocrinopatías autoinmunes (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (París), enero de 2000; 156(1): 23); neuropatías disinmunes (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999; 50: 419); neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple congénita (Vincent A. y col., Ann N Y Acad Sci. 13 de mayo de 1998; 841: 482), neuritis, neuritis óptica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 mayo; 57(5): 544) y enfermedades neurodegenerativas.

Los ejemplos de enfermedades musculares autoinmunes incluyen, aunque sin limitación, miositis, miositis autoinmune y síndrome de Sjogren primario (Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep; 123(1): 92) y enfermedad autoinmune del músculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother junio de 1999; 53(5-6): 234).

Los ejemplos de enfermedades nefríticas autoinmunes incluyen, aunque sin limitación, nefritis y nefritis intersticial autoinmune (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol, agosto de 1990; 1(2): 140).

Los ejemplos de enfermedades autoinmunes relacionadas con la reproducción incluyen, aunque sin limitación, pérdida fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2: S107-9).

Los ejemplos de enfermedades autoinmunes del tejido conjuntivo incluyen, aunque sin limitación, enfermedades del oído, enfermedades autoinmunes del oído (Yoo TJ. et al., Cell Immunol, agosto de 1994; 157(1): 249) y enfermedades autoinmunes del oído interno (Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sci 199729 de diciembre; 830: 266).

Los ejemplos de enfermedades autoinmunes sistémicas incluyen, aunque sin limitación, lupus eritematoso sistémico (Erikson J. y col., Immunol Res 1998; 17(1-2): 49) y esclerosis sistémica (Renaudineau Y. y col., Clin Diagn Lab Immunol. Marzo de 1999; 6(2): 156); Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 Jun; 169: 107).

Enfermedades infecciosas

Los ejemplos de enfermedades infecciosas incluyen, aunque sin limitación, enfermedades infecciosas crónicas, enfermedades infecciosas subagudas, enfermedades infecciosas agudas, enfermedades virales, enfermedades bacterianas, enfermedades por protozoos, enfermedades parasitarias, enfermedades fúngicas, enfermedades micoplasmáticas y enfermedades por priones.

Los tipos específicos de patógenos virales que causan enfermedades infecciosas que se pueden tratar según las enseñanzas de la presente descripción incluyen, aunque sin limitación, retrovirus, circovirus, parvovirus, papovavirus, adenovirus, herpesvirus, iridovirus, poxvirus, hepadnavirus, picornavirus, calicivirus, togavirus, flavivirus, reovirus, ortomixovirus, paramixovirus, rabdovirus, bunyavirus, coronavirus, arenavirus y filovirus.

Los ejemplos específicos de infecciones virales que pueden tratarse según las enseñanzas de la presente descripción incluyen, aunque sin limitación, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) inducido por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), gripe, infección por rinovirus, meningitis viral, Infección por virus de Epstein-Barr (VEB), infección por virus de hepatitis A, B o C, sarampión, infección/verrugas por virus del papiloma, infección por citomegalovirus (CMV), infección por virus Herpes simplex, fiebre amarilla, infección por el virus del Ébola y rabia.

Enfermedades de inmunodeficiencia

Los ejemplos de enfermedades de inmunodeficiencia que pueden tratarse mediante el trasplante de células progenitoras de la presente descripción incluyen, aunque sin limitación, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) causado por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), inmunodeficiencias combinadas graves (SCID), tales como deficiencia de adenosina desaminasa (ADA), e inmunodeficiencias resultantes de la mielorreducción/mieloablación terapéutica, tal como en el contexto de terapias para cánceres, tales como las neoplasias malignas hematológicas.

Enfermedades pulmonares

Los ejemplos de enfermedades pulmonares incluyen, aunque sin limitación, fibrosis quística, enfisema, asbestosis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, hipertensión pulmonar, cáncer de pulmón, sarcoidosis, lesión pulmonar aguda (síndrome de dificultad respiratoria del adulto), síndrome de dificultad respiratoria del prematuro, enfermedad pulmonar crónica del prematuro (displasia broncopulmonar), deficiencia de proteína B tensioactiva, hernia diafragmática congénita, proteinosis alveolar pulmonar, hipoplasia pulmonar y lesión pulmonar (por ejemplo, inducida por isquemia/reperfusión, hipertensión pulmonar o lesión pulmonar hiperóxica).

Enfermedades del sistema nervioso central (SNC)

Las enfermedades del SNC incluyen enfermedades neurodegenerativas. Los ejemplos no limitantes de trastornos neurodegenerativos incluyen: (i) enfermedades neurodegenerativas crónicas tales como esclerosis lateral amiotrófica familiar y esporádica (FAL^sy ELA, respectivamente), enfermedad de Parkinson familiar y esporádica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer familiar y esporádica, esclerosis múltiple, atrofia olivopontocerebelosa, atrofia multisistémica, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de cuerpos de Lewy difusa, degeneración corticodentatonigral, epilepsia mioclónica familiar progresiva, degeneración estrionigral, distonía de torsión, temblor familiar, síndrome de Down, síndrome de Gilles de la Tourette, enfermedad periférica de Hallervorden-Spatz, neuropatía periférica diabética, demencia pugilística, demencia por SIDA, demencia relacionada con la edad, deterioro de la memoria asociado a la edad y enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la amiloidosis, tales como las causadas por la proteína priónica (PrP), que se asocia con la encefalopatía espongiforme transmisible (enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, tembladera y kuru) y los causados por una acumulación excesiva de cistatina C (angiopatía hereditaria por cistatina C); y (ii) trastornos neurodegenerativos agudos tales como lesión cerebral traumática (p. ej., lesión cerebral relacionada con cirugía), edema cerebral, daño de nervios periféricos, lesión de la médula espinal, enfermedad de Leigh, síndrome de Guillain-Barré, trastornos de almacenamiento lisosómico como lipofuscinosis, enfermedad de Alper, vértigo como resultado de la degeneración del SNC; patologías que surgen con el abuso crónico de alcohol o drogas que incluyen, por ejemplo, la degeneración de neuronas en el locus coeruleus y el cerebelo; patologías que surgen con el envejecimiento, incluida la degeneración de neuronas cerebelosas y neuronas corticales que conduce a alteraciones cognitivas y motoras; y patologías que surgen con el abuso crónico de anfetaminas, incluida la degeneración de las neuronas de los ganglios basales que conducen a alteraciones motoras; cambios patológicos resultantes de traumatismos focales tales como apoplejía, isquemia focal, insuficiencia vascular, encefalopatía hipóxico-isquémica, hiperglucemia, hipoglucemia o traumatismo directo; patologías que surgen como un efecto secundario negativo de fármacos y tratamientos terapéuticos (por ejemplo, degeneración de las neuronas de la corteza cingulada y entorrinal en respuesta a dosis anticonvulsivas de antagonistas de la clase NMDA del receptor de glutamato) y la demencia relacionada con Wernicke-Korsakoffs. Las enfermedades neurodegenerativas que afectan a las neuronas sensoriales incluyen ataxia de Friedreich, diabetes, neuropatía periférica y degeneración neuronal retiniana.

Las enfermedades del SNC también incluyen enfermedades neurodegenerativas de los sistemas límbico y cortical que incluyen amiloidosis cerebral, atrofia de Picks y síndrome de Retts.

Enfermedades gastrointestinales

Las enfermedades gastrointestinales ejemplares incluyen, aunque sin limitación, enfermedades intestinales inflamatorias crónicas, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, celiaquía, colitis, ileítis, cáncer gastrointestinal y lesión gastrointestinal (por ejemplo, enteritis viral, bacteriana, por radiación y proctitis).

Enfermedades cardiovasculares

Los ejemplos de enfermedades cardiovasculares incluyen, aunque sin limitación, insuficiencia cardíaca, lesión del tejido cardíaco, enfermedad de las arterias coronarias, accidente cerebrovascular (p. ej., trastorno cerebrovascular), enfermedad vascular periférica, enfermedad de las arterias coronarias. Las enfermedades de las arterias coronarias incluyen, por ejemplo, infarto de miocardio y angina. Accidente cerebrovascular, incluye, por ejemplo, infarto cerebral y hemorragia cerebral.

Los ejemplos de enfermedades cardiovasculares adicionales incluyen, aunque sin limitación, insuficiencia cardíaca crónica o congestiva (CHF), enfermedad cardíaca isquémica (ⁱH^d), enfermedad cardíaca reumática, accidente cerebrovascular, enfermedad cardíaca hipertensiva, enfermedad cardíaca reumática (RHD), aneurismas aórticos, cardiomiopatía, fibrilación auricular, enfermedad cardíaca congénita, enfermedad cardíaca pulmonar, enfermedad cardíaca valvular, endocarditis, toxicidad cardíaca inducida por fármacos (por ejemplo, cardiomiopatía inducida por clorhidrato de doxorrubicina (adriamicina)) y enfermedad arterial periférica (PAD).

Enfermedades hepáticas

Los ejemplos de enfermedades hepáticas incluyen, aunque sin limitación, infección por hepatitis C, neoplasias hepatobiliares malignas tales como carcinoma hepatocelular (Molmenti EP, Klintmalm GB., 2001. J Hepatobiliary Pancreat Surg. ⁸: 427-34), cirrosis, colangitis esclerosante primaria (Crippin JS., 2002. Can J Gastroenterol. 16: 700), enfermedad hepática alcohólica (Podevin P. y col., 2001. J Chir (París). 138: 147), hepatitis B (Samuel D., 2000. Acta Gastroenterol Belg. 63: 197-9), hepatotoxicidad inducida por fármacos/toxinas, daño vascular hepático, cáncer hepático, hepatitis autoinmune, traumatismo hepático cerrado, daño hepático asociado con errores congénitos del metabolismo, defectos del ciclo de la urea, hipercolesterolemia, enfermedad por almacenamiento de glucógeno, hiperoxaluria primaria tipo I, cirrosis criptogénica, síndrome de Crigler-Najjar tipo I, fibrosis hepática congénita, enfermedad de Neimann-Pick, cirrosis biliar primaria, amiloidosis, atresia biliar, hepatoblastoma, síndrome de Alagille, hemangioendotelioma, colestasis, insuficiencia hepática aguda/fulminante, síndrome de Budd-Chiari, deficiencia de alfa-1-antitripsina, enfermedad de Wilson, hemocromatosis, tirosinemia, trastornos del metabolismo de las porfirinas como protoporfiria, fibrosis quística, neoplasia maligna de los conductos biliares intrahepáticos, lipidosis, trastornos del metabolismo del cobre, trastornos del metabolismo de las purinas y pirimidinas, trastornos de la excreción de bilirrubina, mucopolisacaridosis, trastorno congénito de factor VIII, trastorno congénito de factor IX, necrosis del hígado, hígado graso alcohólico, secuelas de enfermedad hepática crónica, trastornos de la vesícula biliar, obstrucción del conducto biliar, atresia biliar, ictericia perinatal debida a daño hepatocelular, trombosis de la vena porta (PVT), hemofilia (Liu y col., 1994. Transpl Int. 7: 201), y enfermedades de almacenamiento lisosómico/deficiencias enzimáticas como la enfermedad de Gaucher (Groth CG. et al., Birth Defects Orig Artic Ser. 9: 102-5).

Enfermedades néfricas

Los ejemplos de enfermedades renales incluyen, aunque sin limitación, insuficiencia renal aguda, síndrome nefrítico agudo, nefropatía por analgésicos, enfermedad renal ateroembólica, insuficiencia renal crónica, nefritis crónica, síndrome nefrótico congénito, enfermedad renal en etapa terminal, síndrome de Goodpasture, glomerulonefritis proliferativa mesangial de IgM, nefritis intersticial, cáncer de riñón, daño renal, infección renal, daño renal, cálculos renales, nefritis lúpica, glomerulonefritis membranoproliferativa I, glomerulonefritis membranoproliferativa II, nefropatía membranosa, glomerulonefritis necrotizante, nefroblastoma, nefrocalcinosis mediada, síndrome nefrótico, poliquistosis renal, glomerulonefritis posestreptocócica, nefropatía por reflujo, embolia de la arteria renal, estenosis de la arteria renal, necrosis papilar renal, acidosis tubular renal tipo I, acidosis tubular renal tipo II, infusión renal y trombosis de la vena renal.

Enfermedades pancreáticas

Los ejemplos de enfermedades pancreáticas incluyen, aunque sin limitación, cáncer de páncreas, neoplasia mucinosa papilar intraductal (IPMN), neoplasia quística mucinosa (MCN), neoplasia quística serosa (SCN), tumor neuroendocrino (NET), pancreatitis crónica (PC), pancreatitis (por ejemplo, pancreatitis crónica, pancreatitis aguda, pancreatitis hereditaria), fibrosis quística, daño pancreático inducido por fármacos, toxicidad pancreática por alcohol y enfermedades o síndromes asociados con una deficiencia de insulina que incluyen, entre otros, diabetes mellitus tipo ¹y tipo ², síndrome metabólico, subtipos de diabetes mellitus tipo ¹y tipo ², síndrome de deficiencia de insulina, diabetes joven de inicio en la madurez (MODY 1-11) y diabetes mellitus neonatal permanente.

Según un aspecto, la enfermedad es una disfunción o insuficiencia de órganos, un cáncer, una enfermedad de Alzheimer, una enfermedad de Parkinson, una enfermedad de Huntington, una esclerosis múltiple, una enfermedad de Crohn, una lesión del páncreas, una diabetes mellitus, una cirrosis hepática, una hepatitis B, hepatitis C, enfermedad renal, daño cardíaco isquémico, toxicidad cardíaca inducida por fármacos, isquemia, lesión, lesión intestinal, herida e infección viral.

Dado que es probable que las células no singénicas (por ejemplo, alogénicas) induzcan una reacción inmunitaria cuando se administran al sujeto, se han desarrollado varios enfoques para reducir la probabilidad de rechazo de células no singénicas. Estos incluyen suprimir el sistema inmunológico del receptor o encapsular las células no autólogas en membranas semipermeables inmunoaisladoras antes del trasplante. Alternativamente, se pueden usar células pueden que no expresan antígenos de superficie xenogénicos, tales como los desarrollados en animales transgénicos (por ejemplo, en cerdos).

Por tanto, según un aspecto, para evitar el rechazo del injerto de las células progenitoras, se puede administrar al sujeto un régimen inmunosupresor.

Los ejemplos de tipos adecuados de regímenes inmunosupresores incluyen la administración de fármacos inmunosupresores y/o una irradiación inmunosupresora.

En la bibliografía de la técnica se proporciona una amplia guía para seleccionar y administrar regímenes inmunosupresores adecuados para trasplantes (por ejemplo, consúltese: Kirkpatrick CH. y Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. et al., 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. y Strom TB., 1996. New Engl. J. Med.

331, 365; Midthun DE. et al., 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. et al., 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. et al., 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. y col., 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. y col. 1998. Lancet 351, 623).

Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, aunque sin limitación, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sales de oro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, infliximab (REMICADE), etanercept, bloqueadores de TNF alfa, un agente biológico que se dirige a una citoquina inflamatoria y un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). Los ejemplos de AINE incluyen, aunque sin limitación, ácido acetil salicílico, salicilato de colina y magnesio, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolaco, meclofenamato, nabuzumeprotona piroxicam, sulindac, tolmetina, acetaminofeno, ibuprofeno, inhibidores de Cox-2, tramadol, rapamicina (sirolimus) y análogos de rapamicina (como CCI-779, RAD001, AP23573). Estos agentes pueden administrarse individualmente o en combinación.

Tal como se usa en este documento, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10%.

Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye aunque sin limitación".

El término "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".

El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicados.

Tal como se usa en este documento, la forma singular "un", "una" y "el/la” incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluidas sus mezclas.

A lo largo de esta solicitud, varios aspectos de esta descripción se pueden presentar en formato de rango. Debe entenderse que la descripción en formato de rango es simplemente por conveniencia y brevedad, y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la descripción. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un rango revela específicamente todos los subrangos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un rango tal como de 1 a ⁶tiene subrangos específicamente descritos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a ⁶, de 3 a ⁶, etc., así como los números individuales dentro de ese rango, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y ⁶. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango.

Siempre que se indique en la presente memoria un rango numérico, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccionario o integral) dentro del rango indicado. Las frases "que oscila entre" un primer número de indicación y un segundo número de indicación y "oscila desde" un primer número de indicación "a" un segundo número de indicación se usan aquí indistintamente y están destinadas a incluir el primer y segundo número indicado y todos los numerales fraccionarios e integrales entre ellos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada, incluidos, entre otros, aquellos modos, medios, técnicas y procedimientos que se conocen o se desarrollan fácilmente a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos realizados por profesionales de la disciplina química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.

Se aprecia que ciertas características de la descripción, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de aspectos separados, también se pueden proporcionar en combinación en un solo aspecto. A la inversa, varias características de la descripción, que se describen, por brevedad, en el contexto de un solo aspecto, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otro aspecto descrito de la descripción. Ciertas características descritas en el contexto de varios aspectos no deben considerarse características esenciales de esos aspectos, a menos que el aspecto sea inoperativo sin esos elementos.

Varios aspectos de la presente descripción tal como se han esbozado anteriormente, y tal como se reivindican en la sección de reivindicaciones incluida a continuación, encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Se hace ahora referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la descripción de una manera no limitativa.

De forma general, la nomenclatura usada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente descripción incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practica! Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como las establecidas en las Patentes de EE.UU. n° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (⁸a Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía científica y de patentes, ver, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. n° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. l., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Se proporcionan otras referencias generales a lo largo de este documento. Se cree que los procedimientos de incluidos en las mismas son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para mayor comodidad del lector.

MATERIALES GENERALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Tejidos pulmonares fetales humanos

Se obtuvo tejido pulmonar fetal humano a las 15-24 semanas de gestación a partir de abortos legales. El consentimiento informado por escrito para el uso de tejido pulmonar se obtuvo según un protocolo aprobado por el Comité de Ética de la Declaración de Helsinki del Centro Médico Assaf Harofe o del Centro Médico Wolfson. La edad fetal se determinó en base a la información clínica y se confirmó mediante mediciones de la longitud del pie fetal. Todas las muestras de pulmón fetal obtenidas se procesaron para análisis histológico o de citometría de flujo y posteriormente se usaron para estudios in vitro e in vivo tal como se describe a continuación y en las secciones de Ejemplos incluidas a continuación.

Animales

Los animales se mantuvieron en condiciones aprobadas por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Instituto Weizmann. Todos los procedimientos fueron monitoreados por la Unidad de Recursos Veterinarios del Instituto Weizmann y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Las cepas de ratón utilizadas incluyeron: N^oD-SCID (NOD.CB17-Prkdcsc/d/J), R a l-/- (B6.129S7-Rag1tm1Mom/J sobre fondo C57BL/6J), C57BL/6J (CD45.2) y C57BL/6-Tg (CAG-EGFP)1Osb/J, ratones C3H/HeJ (Centro de cría de animales del Instituto Weizmann, Rehovot, Israel), ratones tdTomato (Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Jackson Labs, Bar Harbor, EE.UU.). Todos los ratones tenían entre ⁶y 12 semanas de edad. Los ratones se mantuvieron en jaulas pequeñas (hasta cinco animales en cada jaula) y alimentados con alimentos estériles y agua ácida. Aleatorización: animales de la misma edad, sexo y antecedentes genéticos fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento. Los criterios de exclusión preestablecidos se basaron en las pautas de IACUC e incluyeron enfermedades sistémicas, toxicidad, dificultad respiratoria, interferencia con la comida y la bebida y una pérdida de peso sustancial (más del 15%). Durante el período de estudio, la mayoría de los animales parecían gozar de buena salud y se incluyeron en el análisis correspondiente. En todos los experimentos, los animales se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento.

Para los experimentos de trasplante de cápsulas de riñón (Figuras 26A-J), se utilizaron ratones NOD-SCID (machos y hembras distribuidos uniformemente entre los grupos) de ⁸a 12 semanas de edad. n = 25 ratones para trasplante HEL de 20-22 semanas; n = 30 ratones para tejido recolectado a las 15-19 semanas de gestación, y n = 10 ratones para tejido HEL de 23-24 semanas. Para los experimentos de incorporación de BrdU, se utilizaron ratones hembra C57BL/6 de ⁸a 12 semanas de edad; n = 75 ratones para tres experimentos. Para las Figuras 30A-H, los hospedantes fueron ratones C57BL/6, 24 hembras y ⁶machos (distribuidos uniformemente entre los grupos), de ⁸a 12 semanas de edad; n = 30 para 3 experimentos. Los donantes fueron embriones E16 GFP+ (C57BL/6-Tg (CAG-EGFP)1Osb/J). Para las Figuras 31A-J, se utilizaron ratones hembra C57BL/6 de 6-7 semanas de edad. En experimentos que utilizan el etiquetado de GFP y tdTomato, se trasplantaron ratones hembra C57BL/6 Rag1~'~ acondicionadas (de ⁸a 12 semanas, n = 4) con una mezcla 1:1 de 1 * 10⁶células pulmonares embrionarias E15-E16 positivas para GFP y tdTomato. En experimentos con hospedantes 'rojos' y donantes 'verdes', se trasplantaron ratones hembra acondicionados tdTomato (Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (de 8-12 semanas de edad, n = 3) con 1 * 10⁶células pulmonares embrionarias E15-E16 positivas para GFP. Para las Figuras 33A-G, los hospedantes fueron ratones hembra C57BL/6, de ⁸a 12 semanas de edad. Los donantes fueron embriones E16 GFP+. Para las mediciones de la función pulmonar, se trasplantaron n = 40 ratones C57BL/6 en dos experimentos. En experimentos alogénicos, se trasplantaron ratones hembra acondicionadas C57BL/6 R a g 1 (H2KB) (8-12 semanas de edad) con 1 * 10⁶células pulmonares E15-E16 de donantes C3H (H2Kk); n = 10 ratones en dos experimentos. Para las Figuras 36A-H, los hospedantes fueron ratones hembra C57BL/6, de ⁶a 7 semanas de edad, n = ⁶para cada grupo en dos experimentos. Total n = 30 ratones. Los donantes fueron embriones E16 GFP+. Para las Figuras 38A-E, los hospedantes fueron ratones hembra NOD-SCID, de ⁸a 10 semanas de edad, n = 13 en dos experimentos. Los donantes fueron embriones HEL de 20 semanas de gestación.

Procedimientos con animales

Procedim iento de trasplante

Los trasplantes de los tejidos precursores embrionarios se realizaron bajo anestesia general (2,5% de 2,2,2-tribromoetanol, 97% en PBS, 10 mL/kg administrados por vía intraperitoneal) tal como se ha descrito anteriormente [Katchman H. y col., Stem Cells. (2008) 26(5): 1347-55].

Implantación debajo de la cápsula renal.

El riñón del hospedante se expuso a través de una incisión lateral izquierda. Se hizo una incisión de 1,5 mm en el extremo caudal de la cápsula renal y se injertaron los tejidos precursores del donante debajo de la cápsula renal en fragmentos de ¹a ²mm de diámetro.

Los tejidos pulmonares fetales humanos, que van desde las 15 a las 24 semanas de gestación, se obtuvieron de abortos legales en los que se obtuvo el consentimiento informado por escrito para el uso de tejido pulmonar según un protocolo aprobado por el Comité de Ética de Helsinki. La edad fetal se determinó en función de la información clínica y se confirmó mediante mediciones de la longitud del pie fetal. Para garantizar que el tejido del injerto se derivara del pulmón fetal, solo se utilizaron lóbulos pulmonares completos para la preparación del tejido del xenoinjerto. Las vías respiratorias inferiores frescas se cortaron en condiciones estériles en piezas de 1-3 mm3. La cirugía se realizó en ratones inmunodeficientes anestesiados y se colocó tejido pulmonar fetal humano debajo de la cápsula renal de cada ratón (una pieza). Los xenoinjertos se recolectaron a diferentes tiempos después del injerto.

Para el trasplante singénico de pulmón embrionario de ratón bajo la cápsula renal de ratones C57BL, se recolectaron pulmones de embriones de diferentes edades gestacionales (14-17 días de gestación) y se injertaron bajo la cápsula renal en fragmentos de 1-2 mm de diámetro. Para garantizar que el tejido del injerto se derivara del pulmón fetal, solo se utilizaron lóbulos pulmonares completos para la preparación del tejido del injerto.

Los animales que recibieron implantes se sacrificaron entre 2 y 20 semanas después del trasplante. A continuación, se extrajeron los riñones que llevaban los injertos trasplantados y se fijaron en paraformaldehído al 4% o se criopreservaron.

Las secciones de tejido se tiñeron de forma rutinaria con hematoxilina y eosina (H&E). La evaluación de la función y la diferenciación del injerto se realizó mediante marcaje histoquímico e inmunohistoquímico.

En algunos experimentos de control, se utilizaron tejidos pulmonares humanos adultos. Con ese fin, se obtuvo tejido pulmonar normal del Banco de Tejidos de Cirugía Torácica del Hospital Médico Sheba, con la aprobación de la junta de revisión institucional. El consentimiento informado por escrito para el uso de tejido pulmonar se obtuvo según un protocolo aprobado por el Comité de Ética de la Declaración de Helsinki del Centro Médico Sheba. Se generaron suspensiones unicelulares con el uso de digestión enzimática por colagenasa y dispasa.

Análisis morfométrico

Se congelaron pulmones embrionarios humanos de diferentes edades gestacionales en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (Sakura Finetek USA, Inc. Tissue-Tek OCT) y se seccionaron con Leica Cryocut 1800. Se tiñeron secciones consecutivas de ¹²pm con diferentes anticuerpos tal como se describe en la siguiente sección de Ejemplos. En algunos experimentos, las áreas de interés se cuantificaron utilizando el software Image Pro (Media Cybernetics, Crofton, MD, www.mediacy.com). Se analizaron al menos 3-5 muestras diferentes de pulmones de la misma edad gestacional de diferentes donantes fetales.

Lesión pulm onar p o r naftaleno

Para los estudios de lesión pulmonar, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de naftaleno (NA) (más del 99% de pureza; Sigma-Aldrich), disuelto en aceite de maíz, 200 mg por kg de peso corporal, 40-48 horas antes del trasplante de tejido pulmonar embrionario.

Para la lesión pulmonar "doble", los animales tratados con naftaleno se irradiaron adicionalmente en un irradiador de cesio (Gammacell 40), (40-48 horas después de la administración de naftaleno). Se irradiaron los ratones C57BL/6, tdTomato (Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J, y Rag1-/- con ⁶Gy TBI, y se irradiaron los ratones NOD-SCID con 3-4 Gy TBI.

Suspensión unicelular de pulmón fetal humano y de ratón, preparación y trasplante de células

Preparación e inyección de células

Las suspensiones de células se obtuvieron de pulmones fetales de ratón o humano digeridos con enzima. Brevemente, la digestión pulmonar se realizó picando finamente tejido con una hoja de afeitar en presencia de 1 mg/mL de colagenasa, 2,4 U/mL de dispasa (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) en PBS Ca+Mg+. La eliminación de desechos no específicos se logró mediante filtración secuencial a través de filtros de 70 y 40 pm. A continuación, las células se lavaron con 1 x PBS (libre de Ca y Mg) con FCS al 2% y antibióticos. Para evitar la acumulación de células antes de la inyección, se añadieron 50 unidades/1 mL de heparina a la suspensión de células individuales.

Después del acondicionamiento con NA, TBI o ambos, los ratones C57BL/6 se trasplantaron con 1 x 10⁶células pulmonares embrionarias E15-E16 positivas para GFP inyectadas en la vena de la cola 4-8 horas después de la irradiación.

En experimentos que utilizan el marcaje de GFP y tdTomato, se trasplantaron ratones donantes C57BL/6 Rag1-/- con una mezcla 1:1 de 1 x 10⁶células pulmonares embrionarias E15-E16 positivas para GFP y tdTomato inyectadas en la vena de la cola 4-8 horas después de la irradiación.

En experimentos con hospedantes mixtos 'rojos' y donantes 'verdes', se trasplantaron ratones acondicionados tdTomato (Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J con 1 x 10⁶células pulmonares embrionarias E15-E16 positivas para GFP inyectadas en la vena de la cola 4-8 horas después de la irradiación.

En los trasplantes alogénicos, se trasplantaron ratones Rag1~'~ C57BL/6 (H2KB) acondicionados con 1 x 10⁶células pulmonares E15-E16 de donantes C3H (H2Kk), tal como se ha descrito anteriormente para trasplantes singénicos. Para el trasplante de HEL, se trasplantaron ratones NOD-SCID acondicionados con NA y 3-4 Gy TBI con 1 x 10⁶células derivadas de HEL de 20-22 semanas, inyectadas en la vena de la cola 4-8 horas después de la irradiación.

Preparación e inyección de células pulmonares adultas frescas

Se recogieron células pulmonares adultas de ratones C57BL/6 positivos para GFP (Jackson Labs, Bar Harbor, EE.UU.). Todos los ratones tenían entre ⁶y 12 semanas de edad. Se inyectó una suspensión unicelular que comprendía ⁸x 10⁶células pulmonares adultas por vía intravenosa en ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y ⁶GY TBI.

Preparación e inyección de células expandidas de pulmón E16

Se recolectaron células pulmonares C57BL E16 positivas para GFP y se sembraron en placas de cultivo tisular con medio de acondicionamiento [alimentadores embrionarios de ratón irradiados (iMEF)] junto con factor de crecimiento epitelial (1 pM) e inhibidor Rock (Y-27632, 5 pM). El medio se cambió cada 2 días y el inhibidor Rock se añadió de nuevo cada vez. Después de 4 días, las células se sometieron a pasaje dividiéndolas en 3 placas. Después de 3 días adicionales de cultivo, las células se usaron para trasplante. Se inyectó i.v. una suspensión unicelular que comprende 2 x 10⁶células expandidas en ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y ⁶GY TBI.

Evaluación de focos GFP+ en pulmones quiméricos p o r morfometría

Los pulmones se fijaron con una solución de PFA al 4% introducida a través de la tráquea a una presión constante de 20 cm de H²O. Luego, los pulmones se sumergieron en fijador durante la noche a 4 °C. Los pulmones se procesaron después del tratamiento con PFA y se fijaron en sacarosa al 30% y se congelaron en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (Sakura Finetek USA, Inc. Tissue-Tek). Se tomaron secciones escalonadas en serie, de 12 pm de espesor, a lo largo del eje longitudinal del lóbulo. La distancia fija entre las secciones se calculó para permitir el muestreo sistemático de al menos 20 secciones en todo el pulmón. Los cortes de pulmón se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Se contó el número real de focos GFP+ (se definió un parche individual como un grupo de más de 5 células GFP+ distintas) por lámina utilizando el software Image Pro. El área de cada corte se estimó mediante el software Image Pro, y se evaluó el área promedio de cortes y la frecuencia promedio de parches GFP+ en todos los cortes (parche(P)/Área(A) (mm2)), asumiendo que la frecuencia por área en un gran número de cortes refleja la distribución por volumen.

Citometría de flu jo

Se analizaron suspensiones de células individuales derivadas de pulmón embrionario humano (15-24 semanas) y de ratón (14-17 semanas), y suspensiones de células individuales de ratón adulto y humano adulto mediante citometría de flujo policromática. Todas las muestras se tiñeron con anticuerpos conjugados o controles de isotipo coincidentes según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos eran de e-Bioscience, BD y Biolegend. La lista completa de anticuerpos usados en el estudio se resume en la Tabla 7, a continuación. Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences) o BD FACSCanto II y se analizaron con el software BD FACSDiva ⁶o FlowJo (versión 7.6.5 o versión vX.0.7 Tree Star Inc).

En experimentos de quimerismo tras el trasplante de E16 de donantes C3H en receptores Rag1■/_, se preparó una suspensión unicelular de pulmón quimérico mediante tratamiento enzimático del tejido, tal como se ha descrito anteriormente, y las células se tiñeron con anti-CD45, anti-TER119, 7AAD, anti-H2Kk y anti-H2KB, así como los controles de isotipo relevantes. La discriminación de doblete se realizó utilizando FCS-Area y FCS-Height. Los datos se adquirieron con un citómetro de flujo FACSCanto II y se analizaron con el software FlowJo (versión vX.0.7 Tree Star Inc).

Inmunohistoquím ica

Los animales se sacrificaron a diferentes tiempos después del trasplante; los pulmones se inflaron con una solución de PFA al 4% y se mantuvieron durante 24 horas, luego se crioconservaron en sacarosa al 30% y se congelaron rápidamente en isopentano preenfriado con aire líquido, o se procesaron para su inclusión en parafina. Las muestras de las secciones congeladas se recolectaron y se inflaron hasta su capacidad total con una mezcla 1:1 de OCT y PBS y se congelaron instantáneamente en isopentano preenfriado con aire líquido. Las muestras congeladas se cortaron en secciones de ⁶o 12 pm y se tiñeron. Los bloques de parafina se cortaron en secciones de 4 pm y se tiñeron después de la desparafinización de xileno y la rehidratación tal como se ha descrito anteriormente [Hecht G y col., Proc Nat Acad de Sci. (2009) 106(21): 8659]. El resumen de los anticuerpos usados en el estudio se muestra en la Tabla 7, a continuación. Todos los anticuerpos secundarios eran de Jackson Immunoresearch Laboratories o Abcam. Las muestras teñidas se analizaron utilizando un microscopio fluorescente vertical Olympus BX51 con objetivos de * ^{1 0}, * 40 de aire y * ^{1 00}de aceite, y una cámara digital Olympus (DP70), o con un microscopio confocal de disco giratorio invertido Nikon Eclipse Ti con objetivos * 10, * 20 de aire y objetivos de aceite * 40, * 60 y * 100 para alta resolución. Las imágenes en el microscopio de fluorescencia se adquirieron mediante el software ^dP Controller y DP Manager (Olympus). Las imágenes en microscopio confocal se adquirieron utilizando el software Andor iQ y se analizaron y reconstruyeron en tres dimensiones (como se indica) con el software Volocity (Perkin-Elmer, Coventry, Reino Unido). En algunos casos, las imágenes se procesaron (se ajustaron la intensidad y el contraste, se superpusieron) en Adobe Photoshop.

Se fijaron tejidos pulmonares fetales humanos y de ratón con solución de PFA al 4% sin inflado previo y se mantuvieron durante 24 horas, luego se criopreservaron en sacarosa al 30% y se congelaron instantáneamente en isopentano preenfriado con aire líquido, o se procesaron para su inclusión en parafina. Las muestras de las secciones congeladas se congelaron rápidamente en OCT en isopentano preenfriado con aire líquido.

Tabla 7: Una lista de los anticuerpos utilizados en el estudio.

Ensayo de incorporación de BrdU

Se midió la proliferación de células pulmonares in vivo mediante captación de BrdU. Brevemente, el control y cuatro grupos de ratones experimentales (7 días después de la administración de naftaleno y 5 días después de TBI) recibieron una dosis única de BrdU (Sigma) por vía intraperitoneal 120 minutos antes del sacrificio (a una dosis de 50 mg por kg de peso corporal). Se extirparon los pulmones, se digirieron enzimáticamente los pulmones izquierdos (utilizando el mismo protocolo que para la disociación del tejido embrionario) para análisis FACS policromático, y se fijaron los pulmones derechos con PFA al 4% y se procesaron para tinción de inmunofluorescencia adicional. Se obtuvieron múltiples cortes en serie con anticuerpos anti-BrdU-FITC y anti-CCSP o anti-SPC. Todos los estudios FACS e inmunohistoquímicos se realizaron utilizando el kit de flujo BrdU (BD Biosciences), según las instrucciones del fabricante. Para el análisis morfométrico de células CCSP+BrdU+ y SPC+BrdU+, las imágenes se tiñeron con anticuerpos anti-CCSP y anti-BrdU o anti-SPC y anti-BrdU y los núcleos se contratiñeron con colorante Hoechst. Las imágenes fueron adquiridas por un observador ciego respecto a los grupos de tratamiento, utilizando un microscopio fluorescente Olympus y una cámara digital Olympus (DP70) con un objetivo * 40. Se contaron al menos 20 campos aleatorios teñidos diferentes para cada marcador.

Separación de subpoblaciones de células pulmonares embrionarias p o r MACS

Se prepararon suspensiones de células individuales de pulmón fetal (E15-E16) mediante digestión enzimática y se agotaron diferentes subpoblaciones de células mediante MACS utilizando columnas LS (Miltenyi Biotec) en tampón MACS (BSA al 0,5%, e Dt A 2 mM en 1 * PBS estéril, filtrado y desgasificado) según el protocolo proporcionado por el proveedor. La suspensión unicelular se pasó a través de un filtro de células de 100, 70 y 40 pm (BD Biosciences). Las células CD45+, SCA-1+, CD31+ o CD326+ se agotaron tratando la suspensión de células individuales con anticuerpos apropiados contra cada uno de los antígenos de superficie conjugados con biotina (Biolegend) seguido de unión con perlas magnéticas anti-biotina (Miltenyi Biotec). Las poblaciones de células agotadas se analizaron mediante FACS, se sembraron en Matrigel GFR (BD) para el ensayo de formación de colonias o se trasplantaron (1 x 106 células) en ratones C57BL/6 preacondicionados con NA y ⁶Gy TBI.

Ensayo de formación de colonias de células epiteliales

Brevemente, se obtuvieron células pulmonares de ratón fetal de fetos de ratón C57BL/6 con embarazo programado (Harlan Laboratories), según un protocolo aprobado (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales). Después del aislamiento inicial, la digestión pulmonar se realizó picando finamente el tejido con una hoja de afeitar en presencia de colagenasa al 0,1%, 2,4 U/mL de dispasa (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) en PBS Ca+Mg+ e incubando las células a 37 °C durante 30 min. Los residuos inespecíficos se eliminaron mediante filtración secuencial a través de filtros de 70 y 40 pm. Las suspensiones de pulmón completo se lavaron en FCS al 2% en 1 x PBS. La suspensión de células individuales resultante se resuspendió en 100 pL de Matrigel (BD Biosciences) con factor de crecimiento reducido (GFR) prediluido 1:1 (vol/vol) con medio Epi-CFU y se cultivaron en una placa Transwell de 12 pocillos (1 1,5 * 105 células por pocillo; Transwell Permeable Supports de 0,4 pm, Corning), tal como se ha descrito anteriormente [McQualter JL et al., Proceedings of the National Academy of Sciences. (2010) 107(4): 1414-9]. El número absoluto de clones epiteliales se determinó después de 7-10 días en cultivo; en algunos experimentos, la eficiencia de formación de colonias se calculó como el número de clones en crecimiento por número de células sembradas * ^{1 0 0}, como porcentaje (número de células sembradas que dieron lugar a clones en crecimiento dividido por el número total de células sembradas en el pocillo). Los clones en crecimiento se caracterizaron adicionalmente como se describe a continuación. Todos los cultivos celulares se llevaron a cabo a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de CO²al 5%. El medio se reemplazó cada 48-72 horas.

La caracterización morfológica y fenotípica de los organoides epiteliales desarrollados en cultivo tal como se ha descrito anteriormente se llevó a cabo usando inmunohistoquímica de fluorescencia o campo brillante de montaje completo. En resumen, las estructuras 3D cultivadas en las condiciones de cultivo se fijaron en paraformaldehído al 4% (Electron Microscopic Sciences) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4°C. Luego, los cultivos de la montura completa se lavaron brevemente en 1 x PBS y se permeabilizaron y bloquearon usando Triton X-100 al 0,5% y suero de caballo al 10% en PBS durante 2 horas. Después de la permeabilización y el bloqueo, los cultivos se lavaron tres veces con PBS durante 20 minutos, seguido de incubación con anticuerpos primarios durante 48-72 horas a 4°C. Después de la tinción con anticuerpos primarios, los cultivos de montaje completo se lavaron con PBS y una disolución de Triton-X100 al 0,5% y se tiñeron con los anticuerpos secundarios relevantes durante la noche a 4°C, seguido de contratinción con colorante Hoechst. Los cultivos de montaje completo se evaluaron mediante un microscopio de disco giratorio invertido Nikon Eclipse Ti. Las imágenes se adquirieron con el software Andor iQ y se reconstruyeron en tres dimensiones con el software Volocity (Perkin-Elmer, Coventry, Reino Unido).

Cálculo de área injertada con GFP+

Se prepararon cortes en serie de pulmones quiméricos de diferentes puntos de tiempo después del trasplante y se tiñeron con anticuerpo anti-GFP en combinación con otros marcadores tal como se indica en la sección de Ejemplos a continuación. Se obtuvieron múltiples imágenes aleatorias de los cortes en serie teñidos utilizando un microscopio fluorescente Olympus y una cámara digital Olympus (DP70) con objetivo * 10. Cada imagen analizada se evaluó individualmente para la validación del patrón de tinción antes del procesamiento. Según se identificaban parches grandes positivos para GFP que contenían cientos de células en pulmones quiméricos, se realizaba un cálculo computerizado del área injertada mediante el software Fiji. El canal verde se extrajo de la imagen RGB. El porcentaje del área injertada se calculó a partir de todo el tejido pulmonar. Las áreas injertadas tienen valores altos de intensidad verde, mientras que todo el tejido pulmonar tiene una intensidad verde baja (autofluorescencia) y las áreas del espacio aéreo son oscuras. El tejido pulmonar completo, excluyendo los espacios de aire que llenan la estructura pulmonar, se detectó aplicando desenfoque de Gauss al canal verde (sigma = 3), estableciendo un umbral fijo bajo en la imagen borrosa y suavizando aún más los bordes para eliminar pequeños artefactos mediante las operaciones de dilatación y erosión. Se creó una máscara de todo el tejido pulmonar cuyos bordes se ilustran en rojo (Figuras 31A-B, 36C-F y 38A) y se midió su área. Se utilizó el método de umbral global RenyiEntropy [Kapur y col. Comput. Vis. Graph. Image Process. (1985) 29, 273-285] para calcular el umbral de intensidad del área de alta GFP (injertada) y para crear una máscara cuyos bordes se ilustran en verde en las Figuras 31A-B, 36C-F y 38A. El porcentaje de área injertada con GFP+ se calculó a partir de dos mediciones como el área alta en GFP+/tejido pulmonar total * 100 como porcentaje (suma de las áreas de parche verde injertado dividida por el área total del tejido). En la mayoría de los experimentos se utilizó software automatizado, pero en algunos casos se requirió el examen manual de los portaobjetos. No obstante, en todos los casos, el lector no conocía la identidad de la muestra.

Análisis de co-localización

El análisis de co-localización se realizó en secciones fluorescentes utilizando el software Imaris 7.7.1 (Bitplane AG, Suiza, www.bitplane.com). Se combinaron múltiples cortes en serie de pulmones quiméricos con anticuerpo anti-GFP (verde) y uno de los varios marcadores utilizados para el análisis de co-localización (siempre rojo). Las imágenes para el análisis se obtuvieron utilizando un microscopio fluorescente Olympus y una cámara digital Olympus (DP70) con objetivo * 40. Cada imagen analizada se evaluó individualmente para la validación del patrón de tinción utilizado antes del procesamiento. Las imágenes se abrieron en el módulo de co-localización de Imaris y la región de interés (ROI) para la co-localización se definió mediante un umbral fijo en el canal verde para concentrarse en las partes relevantes de la imagen. Los umbrales para la co-localización de los canales rojo (material A, marcador de interés) y verde (material B, GFP) se calcularon automáticamente para cada imagen utilizando el método de Costes [Costes y col., Biophys. J. (2004) ^{8 6}: 3993-4003]. Se creó un canal co-localizado; se calcularon las estadísticas del canal y se exportaron a archivos de Excel. El grado de co-localización se evaluó a través del porcentaje (%) de material B del ROI co-localizado: (intensidad verde total en la región co-localizada/intensidad verde total en el ROI) * 100. Los datos se presentan como media ± s.d. de todas las imágenes analizadas para cada marcador.

En el experimento que evaluó la fusión potencial de las células del donante de GFP después del trasplante en receptores 'tdTomato', la co-localización se calculó a partir del número de píxeles etiquetados tanto por verde como por rojo, dividido por los píxeles verdes (umbral tomado como la mitad del valor Otsu). El valor se promedió en cinco campos, cada uno de los cuales comprende 10 secciones ópticas. Las imágenes confocales tridimensionales se adquirieron con el microscopio confocal de disco giratorio invertido Nikon Eclipse Ti, utilizando el software Andor iQ (Mag = *40 o *60, NA = aceite 1,3 o 1,49, tamaño de píxel = 0,17 pm o 0,11 pm, respectivamente, delta-z = 1 pm).

En experimentos con donantes alogénicos (H2Kk), el análisis de co-localización se realizó tal como se ha descrito anteriormente, excepto que las secciones congeladas ^{( 12}pm) de pulmones quiméricos se tiñeron con anticuerpo anti-H2Kk-PE anti-ratón conjugado y AQP-5 marcado con DyLight 488. Los umbrales de co-localización de canales rojos (material A, H2Kk) y verdes (material B, AQP-5) se calcularon automáticamente para cada imagen utilizando el método de Costes (Costes, ver anterior). Se creó un canal co-localizado; se calcularon las estadísticas del canal y se exportaron a archivos de Excel.

El análisis de segmentación celular de las células AT1 co-localizadas se realizó de la siguiente manera: las imágenes se adquirieron con microscopía confocal de disco giratorio, con tinción del MHC del donante (H2Kk) en el canal rojo, AQP-5 en el canal verde y núcleos (tinte Hoechst) en el canal azul. Se evaluaron tanto los parches de tipo donante como las regiones no quiméricas para comparar la fluorescencia roja en células H2Kk (rojo) negativas y positivas. La imagen de Hoechst para cada conjunto de datos se segmentó por núcleos. Cada núcleo se utilizó como semilla en el canal verde para extenderlo a toda la célula. Los centros celulares se marcaron con una cruz roja. Las celdas superpuestas podrían definir un área de celda más grande o más pequeña, compensada por el área más pequeña o más grande de la celda vecina. Para cada segmento celular, se calcularon las intensidades de fluorescencia totales en los canales verde y rojo y se mostraron en un diagrama de dispersión similar a FACS.

La región de interés se dibujó manualmente (polígono) en cada imagen con el fin de seleccionar áreas de tejido positivas y negativas para el etiquetado del donante.

Evaluación de la función pulm onar del ratón

Los ratones fueron anestesiados con quetamina-xilazina intraperitoneal, traqueotomizados, paralizados y ventilados con la unidad de función pulmonar de ratón FlexiVent (SCIREQ, Montreal, Quebec, Canadá). La resistencia y el cumplimiento al inicio del estudio se recopilaron con el software FlexiVent (SCIREQ). Los investigadores desconocían la identidad de los grupos de ratones experimentales.

Microscopía de dos fotones

Antes de la obtención de imágenes, los ratones fueron sacrificados o inyectados i.v. con el trazador sanguíneo de nanopartículas Quantum dot 655 para marcaje vascular (Invitrogen-Molecular Probes (n° de catálogo Q2102IMP)) y a continuación fueron sacrificados. Los pulmones se extirparon y se colocaron debajo de una cámara de imágenes cubierta de vidrio. La obtención de imágenes se realizó utilizando un microscopio multifotón Ultima (Prairie Technologies Middleton, WI) que incorpora un láser Mai Tai Ti-Sapphire pulsado (Newport Corp, CA). El láser se sintonizó a 850-900 nm para excitar EGFP o para excitar simultáneamente EGFP y el trazador sanguíneo, o para excitar simultáneamente EGFP y tdTomato. Se utilizó un objetivo sumergido en agua de 20 * (NA 0,95) o 40 * (NA 0,8) o de aire 10 * (NA 0,3) de Olympus. Para crear una pila Z típica, se escanearon secciones del pulmón que contenían células marcadas con GFP (los embriones del donante expresan GFP bajo el promotor de p-actina; por lo tanto, todas las células injertadas fueron positivas para GFP) se escanearon a una profundidad de aproximadamente 30-150 pm con pasos z de 2 o 3 pm. Los datos se analizaron utilizando el software Volocity (Perkin-Elmer, Coventry, Reino Unido). Toda la representación 3D de las imágenes se realizó en el software Volocity.

Imágenes de m icro-CT

Las imágenes de micro-CT se realizaron bajo anestesia general (2,5% de 2,2,2-tribromoetanol, al 97% en PBS, 10 mL/kg administrados por vía intraperitoneal).

Se realizaron experimentos de micro-CT in vivo en el escáner TomoScope® 30S Duo (CT Imaging, Alemania) equipado con dos sistemas de detección de fuente. El voltaje de operación de ambos tubos fue de 40 kV. El tiempo de integración del primer y segundo protocolo fue de 90 ms (rotación 360) y 5 min (rotación 3600) y se obtuvieron imágenes axiales con una resolución isotrópica de 80 pm. El procesamiento de los datos de CT se analizó utilizando el software ImageJ.

Congelación y descongelación de suspensión unicelu lar derivada de HEL

Para la criopreservación y descongelación de células derivadas de HEL, se utilizó un protocolo estándar para la criopreservación de células mononucleares de sangre periférica. Brevemente, las células HEL derivadas enzimáticamente se diluyeron a una concentración de 100 x 10⁶células por mL. Se añadió suavemente el mismo volumen de tampón de congelación (DMSO al 20% diluido en FCS al 80%) y luego se dividieron las células en criotubos (50 x 10⁶células por mL en cada uno). Para el proceso de congelación, se utilizó una cámara que contenía propanol frío para lograr una velocidad de enfriamiento de -1 °C por minuto. Los criotubos se mantuvieron en la cámara durante 24 horas a -70 °C y luego se transfirieron a un recipiente de nitrógeno líquido para una conservación prolongada.

Antes de su uso, las células se descongelaron rápidamente y luego se diluyeron lentamente para eliminar el DMSO. La dilución gradual de DMSO ayudó a evitar el estrés osmótico. Brevemente, los criotubos se retiraron del nitrógeno líquido y se transfirieron a un baño de agua a 37 °C. Las células se diluyeron gradualmente en medio Epi-CFU modificado que contenía FCS al 10%. Después de descongelar, las células se fenotiparon mediante FACS, se evaluó su viabilidad y se sembraron en placas en condiciones de cultivo 3D para el ensayo de formación de colonias por triplicado. Después de 10 días de cultivo, se contabilizaron las colonias para determinar la eficacia de formación de colonias.

Análisis estadístico

Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional con contrastes a priori entre los grupos, o mediante ANOVA unidireccional en las proporciones transformadas por arcoseno seguido de un análisis de Tukey post hoc o seguido de una prueba de Dunnett, ANOVA anidado o de una prueba t de dos colas, tal como se indica en las leyendas de las figuras relevantes. Para cada ANOVA, se probó la normalidad de los residuos mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Además, se probó la homogeneidad de las varianzas mediante la prueba de Levene. Para los casos en los que la prueba de Levene mostró diferencias significativas en las varianzas entre los grupos, se realizó una transformación específica para abordar las violaciones de la homogeneidad de los supuestos de varianza (tal como se indica en las leyendas de las figuras relevantes). En situaciones donde se utilizó el análisis de Tukey post hoc, se realizaron todas las comparaciones por pares, pero en las figuras solo se muestran los valores P de la diferencia entre los grupos de interés. En situaciones en las que se utilizó la prueba de Dunnett, las comparaciones por pares se realizaron con el grupo de control apropiado, tal como se indica en las leyendas de las figuras relevantes. En situaciones en las que se realizó un ANOVA anidado, se analizaron al menos siete observaciones para cada ratón (en algunos casos más, tal como se indica en las leyendas de las figuras relevantes).

Para cada conjunto de datos, se calculó la media ± s.d. y se presenta en la sección de Ejemplos que sigue. Para la presentación gráfica de los mismos conjuntos de datos, se generaron diagramas de recuadro, utilizando el software GraphPad Prism (Versión 6.01), que presenta la distribución completa del conjunto de datos. La línea central en los cuadros muestra las medianas; los límites de las casillas indican los percentiles 25 y 75, las pestañas indican los valores mínimo y máximo. Las diferencias entre los grupos se consideraron estadísticamente significativas para P < 0,05. El tamaño de la muestra se determinó sobre la base de las limitaciones de IACUC y la experiencia previa con experimentos de trasplante en el laboratorio. Por lo tanto, el tamaño de la muestra no se calculó para asegurar un poder estadístico adecuado para detectar tamaños de efecto hipotéticos.

EJEMPLO 1

'Ventana' canalicular para progenitores pulmonares humanos y de ratón

Potencial de crecimiento de tejidos pulmonares embrionarios humanos recolectados en diferentes momentos gestacionales

Para evaluar una ventana adecuada para los progenitores pulmonares fetales humanos, los presentes inventores caracterizaron inicialmente el potencial de crecimiento y la diferenciación de los tejidos precursores pulmonares recolectados a diferentes tiempos gestacionales (tejidos procedentes de fetos humanos de 15 a 24 semanas). Usando la implantación de fragmentos de pulmón fetal humano completo (Figuras 1A-I, Figuras 26A-B y Figuras 27A-L) o de ratón (datos no mostrados) debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes (NOD-SCID) o singénicos, respectivamente, se observó que el uso de tejido fetal de pulmón humano o de ratón recolectado en la etapa canalicular de desarrollo permitió un crecimiento y diferenciación óptimos.

En general, tras el examen a las ⁸semanas después del trasplante, más del 98% de los injertos de tejido de donantes de todas las edades sobrevivieron y todos los injertos recuperados mostraron un tamaño aumentado, sin evidencia de neoplasia en ninguno de los injertos recuperados. Sin embargo, los resultados fueron claramente diferentes cuando se intentó un trasplante similar utilizando como tejidos de donante pulmones de gestación temprana o tardía.

Como puede verse en la Figura 1A, el tejido cosechado a las 20-22 semanas (n = 25, 1-3 mm de tamaño) mostró un mayor crecimiento a las ⁸semanas del trasplante (alcanzando un tamaño de 300,7 /- 15,2 mm), en comparación al tejido recolectado a las 15-19 o 23-24 semanas de gestación (61,6 /- 3,5 mm y 10,6 /- 2,0 mm, respectivamente).

Para obtener una evaluación cuantitativa de los diferentes atributos estructurales en el implante de pulmón en crecimiento, mostrado macroscópicamente en la Figura 1B, se empleó el análisis morfométrico. Tal como se muestra en las Figuras 1C-F, todos los elementos del árbol respiratorio, similares en apariencia al tejido pulmonar humano adulto, se detectaron en implantes que crecen desde el tejido de la semana 20-22. Así, la formación de conductos alveolares con alvéolos (Figuras 1C-F), tráquea cubierta con epitelio ciliado (Figura IE), capas musculares y cartílago (Figura IE) y monocapas de epitelio alveolar (Figura IF), fueron todas exhibidas por los implantes en crecimiento. Asimismo, se expresaron claramente parámetros que definen las propiedades funcionales de los implantes en desarrollo, como lo indica la capacidad de sintetizar tensioactivo, detectable mediante tinción para la proteína tensioactiva C (sp-C) (Figuras 1G-H), y la capacidad de transportar iones, como lo indica la tinción para el regulador transmembrana de fibrosis quística CFTR (Figura 11). Normalmente, estos marcadores funcionales que aparecen relativamente tarde durante el proceso de maduración coinciden con los elementos más diferenciados que expresan citoqueratina 18 (CK18), y no se expresan en el tejido de 20 semanas antes del trasplante (datos no mostrados).

Sorprendentemente, y en contraste con los resultados anteriores, los implantes que se originaron a partir de tejido recolectado a las 15 semanas (Figuras 1J-L) o a las 24 semanas (Figuras 1M-O) desarrollaron quistes y fueron negativos para la tinción de sp-C y CFTR (datos no mostrados), mientras que los implantes que se originaron a partir de tejido de 18 semanas, aunque exhibían todos los patrones de diferenciación y maduración, incluida la tinción para sp-C y CFTR (datos no mostrados), todavía eran defectuosos, ya que los conductos alveolares formados eran más estrechos y las paredes alveolares eran más gruesas (Figuras 1P-R). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la "ventana" óptima para recolectar tejido pulmonar embrionario humano para trasplante es entre las ^{2 0}y ²²semanas de gestación.

Identificación de progenitores de células madre y sus nichos en el tejido pulmonar embrionario humano en diferentes momentos gestacionales.

Tras la identificación del tejido pulmonar embrionario humano de "ventana" óptima para el trasplante, se evaluó la presencia de células madre putativas en este tejido de "ventana" en comparación con los tejidos recolectados en puntos de tiempo gestacional anteriores o posteriores. En consecuencia, se llevó a cabo una caracterización fenotípica extensa de supuestos progenitores epiteliales, endoteliales y mesenquimales en pulmones fetales humanos y de ratón, lo que indicó un marcado enriquecimiento de estos supuestos progenitores en el tejido pulmonar canalicular en comparación con tejidos recolectados en diferentes momentos gestacionales (Figuras 28A-J y Figuras 29A-H).

Tal como se muestra en las Figuras 2A-D, la tinción H&E reveló que se encuentran más estructuras bronquiales y bronquiolares en los tejidos recolectados a las ^{2 0 - 2 2}semanas, en comparación con los tejidos recolectados en puntos de tiempo anteriores. Para definir las posibles diferencias en los niveles de progenitores en estos tejidos, se examinó la presencia de la supuesta subpoblación progenitora de células pulmonares epiteliales basales, que se ha demostrado que expresan las citoqueratinas 5 (CK5) y 14 (CK14). Estos marcadores distintos se regulan negativamente tras la diferenciación, en paralelo a la expresión del fenotipo positivo CK8/CK18 más maduro.

Como puede verse en la Figura 2E, se observó una frecuencia marcada de células positivas para CK5 en las vías respiratorias grandes junto con la expresión de CK14 (Figura 2F), mientras que se observó una abundancia algo menor en los alvéolos en desarrollo. Además, esta tinción inmunohistológica reveló que las células CK5+ estaban rodeadas de células nestina+ (Figura 2G), y algunas de ellas exhibían propiedades de cuerpos neuroepiteliales marcados por la proteína relacionada con el gen de la calcitonina (CGRP). Como se puede ver en la Figura 2H, esta inervación se reveló aún más mediante la tinción de neurofilamentos (NF), lo que sugiere una arquitectura de nichos de células madre similares a la definida para las células madre hematopoyéticas en la médula ósea y en las vías respiratorias de los ratones adultos. Además, en línea con un informe muy reciente sobre el nicho de BM, el nicho epitelial CK5+ también contenía células positivas de actina de músculo liso alfa (Figura 2I y Figuras 5A-D) y células mesenquimales vimentina+ (Figura 2J).

Es importante destacar que el análisis morfométrico demostró una abundancia relativa de progenitores CK5+ en el tejido de 'ventana' de ^{2 0}a ^{2 2}semanas de gestación, lo que sugiere que la ventana óptima probablemente está asociada a un mayor número de estos progenitores. Así, en el tejido recolectado a las 20-22 semanas de gestación, se observó que el área CK5+ representaba un promedio de 14,1% ± 5,6 del tejido pulmonar total, en comparación con 5,26% ± ^{1 , 06}(P = 0,0006) o 6,05% ± 0,18 (P = 0,002), en tejidos de 15 y 17 semanas, respectivamente (Figuras 2K-O).

Además, tanto las células pulmonares canaliculares humanas como las de ratón mostraron una marcada actividad clonogénica en cultivos tridimensionales (3D) en ausencia de factores de crecimiento exógenos (datos no mostrados). En particular, la las células pulmonares embrionarias humanas citoqueratina-5+ (CK5+), consideradas como representantes de progenitores epiteliales comprometidos, estaban comúnmente rodeadas por células mesenquimales en estrecha proximidad a los vasos sanguíneos (Figura 26C y Figuras 28A-J). Además, se obtuvo una clara evidencia de inervaciones de nicho, como lo indica la presencia de neurofilamentos (Figura 26D y Figura 28G) y cuerpos neuroepiteliales marcados por la expresión del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) (Figura 28H). Esta estructura única de células progenitoras rodeadas por mesénquima y células endoteliales e inervantes, nuevamente sugiere una arquitectura de nicho de células madre similar a la definida para las células madre hematopoyéticas en BM.

En conjunto, esta "ventana de oportunidad" para recolectar pulmón embrionario como fuente de trasplante puede explicarse en parte por la frecuencia de células progenitoras epiteliales positivas para CK5 y sus respectivos nichos. Para investigar más a fondo otros supuestos progenitores en diferentes tejidos embrionarios, se utilizó un análisis FACS para determinar la presencia de varios fenotipos atribuidos recientemente a células madre pulmonares humanas pluripotenciales. En particular, la atención se centró en dos fenotipos. La primera, una subpoblación rara, teñida positiva para c-kit (CD117) y negativa para muchos marcadores de diferenciación, incluido CD34, fue descrita recientemente por Kajstura et al., principalmente en tejido pulmonar adulto, pero también en tejido embrionario, los autores sugirieron que estas células representan una célula madre pulmonar multipotente, con capacidad de autorrenovación [Kajstura J. y col., N Engl J Med. (2011) 364(19): 1795-806; Anversa P. y col., Nat Med. (2011) 17(9): 1038-9] y con potencial regenerativo para todos los linajes pulmonares. Sin embargo, Suzuki et al. mantienen que en el pulmón embrionario, las células C-Kit+ también expresan CD34 y probablemente son progenitores endoteliales [Moodley Y. y col., N Engl J Med. (2011) 365(5): 464-6; Suzuki T. et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine (2010) 181 (Resúmenes de congreso 1): A4898], por lo tanto, también se evaluó la presencia de células C-Kit+CD34+ (Figuras 2P-Z).

Con ese fin, se analizaron suspensiones unicelulares obtenidas de tejidos pulmonares embrionarios humanos tratados enzimáticamente, recolectados a las 16, 18 y ^{2 0}semanas de gestación, para determinar la expresión de varios marcadores de diferenciación, que incluyen CD34 (específico para progenitores hematopoyéticos y endoteliales), CD45 (células hematopoyéticas), CD31 (marcador de células endoteliales), CD117 (c-KIT, para identificar progenitores tempranos), CD271 (NGFR, marcador de células madre mesenquimales) y CD326 (EPCAM, marcador de diferenciación epitelial).

Sorprendentemente, se observó que la población no hematopoyética negativa para CD45 comprendía tres poblaciones de progenitores C-Kit+ distintas, incluidas células CD34elevado, CD34intermedi° y CD34negativo (Figuras ²P-T). Mientras que la última población es compatible con las células madre pulmonares adultas pluripotenciales tempranas, las otras células CD34+ podrían diferenciarse más fuertemente hacia el linaje endotelial que también expresa niveles altos de CD31 (Figuras 5A-D).

Curiosamente, la subpoblación C-Kit+ CD34neg fue claramente más abundante en los tejidos recolectados a las 20 semanas (aproximadamente hasta un 2-3% de población CD34neg) en comparación con edades gestacionales más tempranas (menos del 0,15%) o con tejido pulmonar adulto utilizado como control (menos del 0,45%, Figuras ⁶A-L).

Estas células C-Kit+CD45'CD34'CD271‘ únicas, que también son negativas para CD31 y CD326 (Figuras 7A-I), según Kajstura et al. también podría identificarse mediante inmunohistología. Por tanto, tal como se muestra en las Figuras 3A-C, estos supuestos progenitores estaban presentes en niveles bajos en las proximidades de las grandes vías respiratorias, principalmente en los espacios perivasculares.

Es importante destacar que cuando los tejidos pulmonares se analizaron mediante tinción inmunohistológica para CD117 y CD34, se encontraron varias subpoblaciones de células distintas similares a las encontradas por el análisis FACS. El análisis de un pulmón humano de 20 semanas se muestra en las Figuras 4A-K; la mayoría de las células CD117+ coexpresaron c D34 y residían en los vasos sanguíneos (Figuras 4A-C) que rodean los alvéolos en desarrollo (Figuras 4D-G), mientras que la subpoblación de células únicas positivas CD117+ menor se encontró en las proximidades de grandes vasos sanguíneos y grandes vías respiratorias (Figuras 4H-K). Se observó un patrón similar de distribución de células CD117+ en tejidos pulmonares de edad gestacional más temprana (Figuras ⁸A-D), aunque el porcentaje total revelado por FACS fue significativamente mayor en el tejido de 20 semanas (Figuras 2A-Z). Además, tal como se muestra en las Figuras 9A-D, los tejidos embrionarios de ^{2 0}semanas también exhiben células progenitoras endoteliales (EPC) tempranas y tardías que pueden tener un papel único en la reparación microvascular pulmonar. Por lo tanto, también se observó que este tejido exhibe la presencia de dos subpoblaciones CD34+CD31+ distintas. La primera identificada por tinción positiva para CD14 y CD45, mientras que la segunda subpoblación fue CD45'CD105+. Las primeras, denominadas "^eP^ctempranas", se caracterizan por un crecimiento temprano in vitro, positividad para CD34/CD31/CD14, la incapacidad para formar tubos en un ensayo de formación de tubos Matrigel, y por altos niveles de secreción de citocinas. El otro tipo de EPC, denominadas “EPC de crecimiento tardío”, “células endoteliales de crecimiento (OEC)” o “células formadoras de colonias endoteliales (ECFC)”, se caracteriza por la positividad de CD31 y CD105, la falta de CD45 y CD14 y la capacidad única de formar espontáneamente vasos sanguíneos humanos cuando se implantan en un gel en ratones inmunodeficientes, integrándose con los vasos de la circulación sistémica del ratón.

EJEMPLO 2

Prueba de concepto en modelos de ratón para el potencia l regenerativo de los trasplantes de pulmón embrionario de 'ventana'

'Ventana' óptima para recolectar tejido precursor de pulmón embrionario de ratón para trasplante

Con el fin de evaluar el potencial curativo del tejido derivado de pulmón embrionario en modelos de ratón apropiados, se definió inicialmente la “ventana” óptima para recolectar pulmón embrionario de ratón para trasplante, al igual que para su homólogo humano. Así, se extrajo tejido embrionario de pulmón de ratón en diferentes momentos de gestación (E14-E17), se implantó debajo de la cápsula renal de ratones singénicos y, ⁸semanas después del trasplante, se evaluó la presencia de parénquima pulmonar, estructuras bronquiales y alveolares en los implantes, así como la presencia no deseada de fibrosis y quistes.

Como se puede ver en las Figuras 10A-E, doce semanas después del trasplante renal subcapsular, el tejido pulmonar E14 y E17 dio como resultado la formación de tejido quístico y fibrótico (Figuras 10A-B), mientras que el pulmón embrionario de ratón E15-E16 exhibió un marcado potencial para diferenciarse aún más y alcanzar la etapa alveolar (Figuras 10C-E). Por tanto, de forma similar al tejido pulmonar humano, la etapa canalicular del desarrollo pulmonar ofrece la ventana óptima para la recolección de tejido para trasplante (Figura 10F). Además, de manera similar al tejido de "ventana" humano, el tejido pulmonar E16 no exhibió alvéolos (Figura 11A); las células positivas para CK-5 eran abundantes en las vías respiratorias grandes, y se encontraron numerosos cuerpos neuroepiteliales dentro de toda la muestra, que se tiñeron positivamente para CGRP y se localizaron en nichos (Figura 11B) de manera similar a la médula ósea y el pulmón de ratón adulto (Figuras 12A-F). Del mismo modo, se encontraron células positivas para CCSP en las regiones de las vías respiratorias grandes, que eran ricas en células positivas para nestina (Figura 11C), que sugerían nichos de células madre y estaban rodeadas por células positivas para alfa-SMA (Figura 11D).

Además, de manera similar a sus contrapartidas humanas, el tejido E15-E16 se enriqueció con supuestos progenitores en comparación con los tejidos gestacionales tempranos o tardíos, como demuestra el análisis FACS de células CD45' CD31'EpCAM+CD24+CD49f+CD104+, establecidas recientemente como progenitores pulmonares putativos en pulmón de ratón adulto [McQualter JL et al., Proceedings of the National Academy of Sciences (2010) 107(4): 1414-9]. Por lo tanto, tal como se puede ver en las Figuras 11E-Y, que muestran el análisis FACS representativo de las suspensiones de células individuales E13, E14, E15 y E16, se observaron niveles marcadamente más altos de células c D45'CD31‘ EpCAM+CD24+CD49f+CD104+ en tejido pulmonar E15 y E16 (0,062% ± 0,007 y 0,073% ± 0,005, respectivamente) en comparación con el nivel en tejido E13 y E14 (0,002 ± 0,00057% y 0,012 ± 0,0057%, respectivamente).

Trasplante de células pulmonares embrionarias de ratón E16 para el tratamiento de lesiones pulmonares

Teniendo en cuenta que los tejidos E15-16 exhiben un marcado potencial de crecimiento y una marcada diferenciación tras el trasplante, este tejido de "ventana" se evaluó adicionalmente en un modelo de ratón para determinar la lesión pulmonar.

Para ello, estas células se evaluaron inicialmente en un modelo basado en la inducción de lesiones con naftaleno, tal como se ha descrito anteriormente [Stripp B et al, American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology (1995) 269(6): 791]. Este modelo de lesión pulmonar imita las enfermedades pulmonares causadas por una lesión epitelial leve, detectable por cambios en la expresión de células pulmonares Clara.

La localización anatómica particular de las células Clara en los bronquiolos respiratorios y en las uniones broncoalveolares permitió localizar con precisión el sitio de la lesión después de la exposición al naftaleno, y probar la capacidad de una suspensión de células individuales de células embrionarias de "ventana" para colonizar y restaurar la capa epitelial lesionada en receptores singénicos.

Dos días después de la administración de naftaleno, los ratones receptores C57BL se infundieron con 1 x 10⁶células de pulmón E16, derivadas de ratones preñadas positivas para GFP. Posteriormente, los pulmones de los animales tratados se evaluaron histológicamente en diferentes puntos de tiempo para detectar la presencia de células positivas para GFP. Estos experimentos iniciales (no mostrados) revelaron que la ablación de las células Clara por naftaleno era transitoria y no podía permitir un injerto significativo y el desarrollo de células Clara derivadas de donantes. Por tanto, los presentes inventores contemplaron que podría ser necesario un régimen de acondicionamiento más agresivo, eliminando de manera más eficaz la proliferación de células madre residentes, para la evaluación de la capacidad regenerativa de las células del donante, tal como se incluye comúnmente en estudios que miden la inducción de quimerismo después del trasplante de médula ósea.

Para probar esta teoría, 40 horas después de la lesión por naftaleno, los animales se trataron adicionalmente con TBI subletal ^{( 6}Gy) para eliminar las células madre pulmonares residentes, que son potencialmente inducidas a proliferar por el tratamiento previo con naftaleno.

Después de 1 día, los ratones recibieron células pulmonares E16 y se les siguió el injerto y el desarrollo de células derivadas del donante en sus pulmones mediante tinción inmunohistológica junto con análisis morfométrico, así como mediante microscopía de dos fotones.

Tal como se muestra en las Figuras 13A-C, los 'parches' positivos para GFP, que indican el injerto de células derivadas del donante en los pulmones del recepto, mejoraron notablemente a los 30 días después del trasplante, en ratones acondicionados con naftaleno y ⁶Gy TBI (Figura 13C) en comparación con TBI solo (Figura 13A), o naftaleno solo (Figura 13B). Este marcado impacto del acondicionamiento sobre el nivel de quimerismo pulmonar se demuestra cuantitativamente en la Figura 13D, que representa el análisis morfométrico de los parches de GFP encontrados en tres experimentos independientes que comprenden un total de nueve ratones en cada grupo. Así, mientras que en ratones acondicionados con naftaleno y ⁶Gy TBI se observaron 55 focos/mm³de focos derivados de donantes, en ratones acondicionados con naftaleno o TBI solo solo se observaron 10-12 focos/mm3y 2-3 focos/mm3, respectivamente.

El examen inmunohistológico de ratones que exhibían pulmones quiméricos reveló además el nivel de integración en elementos funcionales en los pulmones de los receptores. Como se muestra en la Figura 14A, los lúmenes de las vías respiratorias grandes de los ratones de control no tratados exhibieron claramente la presencia de células Clara CCSP+, y estas células se sometieron a ablación y descamación inmediatamente después del acondicionamiento (Figura 14B). Sin embargo, los ratones trasplantados después del acondicionamiento elegido, exhibieron el día 30 después del trasplante la formación de una nueva capa epitelial, y se observaron células GFP+ injertadas en los lúmenes bronquiales. Estas células GFP+ derivadas de donantes se incorporaron a las vías respiratorias bronquiales y alveolares del hospedante, y fueron vascularizadas, tal como se muestra mediante tinción para V-cadherina (Figura 14C); También expresaron CCSP (Figuras 14D-F) y fueron positivas para la expresión de Sp-c (Figuras 14G-I) y CFTR (Figuras 14J-L), lo que sugiere su capacidad para producir tensioactivo y participar en el transporte de iones. Como era de esperar, estos marcadores funcionales específicos se exhibieron de manera diferencial por las células GFP+ injertadas según su ubicación. Por lo tanto, en las vías respiratorias grandes, las células fueron positivas para CCSP, y en los alvéolos, las células injertadas fueron positivas para sp-C, pero se observó que todas las células expresan CFTR, lo cual es de particular importancia para la posible corrección de la fibrosis quística (CF).

Curiosamente, cuando se probaron en puntos de tiempo posteriores al trasplante, los focos iniciales claramente estaban creciendo en tamaño y ocupando así una mayor proporción de los pulmones injertados. Esto se demostró además mediante microscopía de dos fotones, que permite la visión directa de los pulmones inmediatamente después del sacrificio, con o sin co-tinción intravital de los vasos sanguíneos con Quantum dots rojos para el marcaje vascular fluorescente (datos no mostrados). Como se puede ver en las Figuras 15A-C, aunque se observó un injerto moderado del pulmón por células de tipo donante a las ⁶semanas del trasplante, con una integración predominante de células GFP+ trasplantadasa en las estructuras bronco-alveolares y vasculares (Figuras 15A-B), a los 4 meses del trasplante se observó una mayor progresión de las células de tipo donante que ocupan casi un tercio del tejido pulmonar (Figura 15C).

Además, la evaluación inmunohistológica de estos pulmones quiméricos a las 16 semanas después del trasplante, reveló la integración completa de las células derivadas del donante, en la superficie de intercambio de gases en la interfaz de los vasos sanguíneos y en las estructuras epiteliales alveolares (Figuras 16A-L). Por lo tanto, se observaron células GFP+ mediante tinción triple con CD31 y anticuerpos anti-pan-citoqueratina para ser incorporadas en los compartimentos vasculares y epiteliales de los pulmones trasplantados, sin signos de cicatrización o fibrosis (Figuras 16A-D y Figuras 17A-E). Asimismo, las tinciones AQP (Figuras 16E-H) y SP-C (Figuras 16I-L) revelaron la incorporación de células derivadas del donante en la superficie de intercambio de gases de los alveocitos de tipo I y de tipo II, respectivamente.

En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que las células pulmonares embrionarias recolectadas de tejido de "ventana" podrían ofrecer una nueva fuente de células para la reparación del tejido pulmonar. Además, se prevé que la terapia con tales células podría ser más eficaz si se combina con un acondicionamiento subletal, aunque esto podría ser menos crítico en situaciones clínicas en las que los progenitores pulmonares del hospedante sufren una ablación notable por la lesión en curso.

Trasplante de una suspensión unicelular derivada de pulmón embrionario humano de 20 a 22 semanas en ratones NOD-SCID, después de la inducción de lesión pulmonar con naftaleno y TBI

Para investigar la capacidad de las células pulmonares embrionarias humanas "ventana" para integrarse en los pulmones lesionados, se estableció un modelo de lesión pulmonar en ratones SCID inmunodeficientes. Teniendo en cuenta que los ratones NOD-SCID son más sensibles a TBI, se utilizaron 3,0 GY TBI en lugar de los 6,0 Gy TBI utilizados en los estudios con tejido de donante de ratón, descritos anteriormente. Además, como reemplazo del marcaje genético de GFP, se utilizó inmunohistología con anticuerpos específicos de ratón y humanos para distinguir entre células epiteliales, endoteliales y mesenquimales del hospedante y del donante.

Así, mientras que la infusión de 1 x 10⁶células recolectadas después de la digestión enzimática de células pulmonares embrionarias humanas de 20 semanas en ratones NOD-SCID, acondicionadas con NA solo, no dio como resultado ningún nivel apreciable de injerto (datos no mostrados), se logró un quimerismo marcado después de la infusión del mismo número de células en ratones NOD-SCID acondicionados con naftaleno y tratamiento posterior con 3,0 Gy TBI (Figuras 18A-I y 19A-F).

En un experimento inicial a corto plazo, se tiñó una suspensión unicelular derivada de pulmón embrionario humano (20 w) con el colorante fluorescente de seguimiento, 5-(y 6-)(((4clorometil)benzoil)amino)tetrametilrodamina) (CMTMR), y las células se infundieron en ratones NOD-SCID acondicionados. Cuando se examinaron 2 semanas después, las células humanas injertadas pudieron visualizarse dentro de distintos parches en el pulmón de los ratones receptores (Figura 24A), similar a los parches GFP+ encontrados en el modelo de trasplante singénico (Figura 24B). Como la tinción de CMTMR es transitoria, se llevó a cabo un segundo conjunto de experimentos para distinguir las células humanas y de ratón en momentos posteriores al trasplante, mediante tinción inmunohistológica utilizando un anticuerpo anti-MHC de ratón que no presente reacción cruzada con tejido humano de control (Figuras 24C-E), y el anticuerpo anti-citoqueratina humana MNF 116 (tinción de células epiteliales humanas), no reactivo de forma cruzada con tejido de ratón de control, como se verifica mediante tinción doble en las Figuras 24F-H.

Es importante destacar que a las ⁶semanas después del trasplante, la doble tinción con estos anticuerpos reveló claramente un nivel significativo de quimerismo. Como se puede ver en las Figuras 18A-C, que muestran un bajo aumento de los bronquios de ratón, la doble tinción con el ratón y los marcadores humanos demuestra claramente la incorporación de células derivadas de humanos en la estructura pulmonar, y esto se puede apreciar aún más con un gran aumento de dos campos diferentes (Figuras 18D-F y 18G-I, respectivamente).

En un tercer conjunto de experimentos, se trasplantaron células pulmonares embrionarias humanas recolectadas a las 20 semanas en NOD-SCID tratados con NA y TBI ligeramente superior (4 Gy).

Los pulmones de los ratones se tiñeron 7 semanas después del trasplante con marcadores anti-humanos y anti-ratón distintivos adicionales. Así, el anticuerpo anti-citoqueratina humana MNF 116 de ratón (tinción de células epiteliales humanas), anti-V9 humano de ratón (tinción de vimentina 9, típico de células estromales) y anti-CD31 humano de ratón (tinción de células endoteliales) se mezclaron y se colocaron en la sección de tejido; a continuación, las secciones se incubaron con un segundo anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con Daylight 488 (verde). Las Figuras 19A y 19D muestran la tinción selectiva por este cóctel de anticuerpos de tejidos humanos en la estructura bronquial del pulmón de ratón. Las células de ratón en el pulmón de ratón se tiñeron con lectina de Banderia. Se sabe que ésta última se une al resto a-Gal expresado en células epiteliales y endoteliales de ratón y, como puede verse, no presenta reactividad cruzada con el tejido humano cuando se controla solo (Figuras 19B y 19E) o junto con tinción de MNF (Figuras 19C y 19F). Además, utilizando marcadores similares, también se pudo detectar un quimerismo marcado en los alvéolos de los ratones trasplantados (Figuras 20A-F). Es importante destacar que también se encontró que las células pulmonares humanas derivadas del trasplante de células embrionarias humanas exhiben varios marcadores funcionales importantes.

Como se puede ver en las Figuras 21A-C, la doble tinción de las células humanas marcadas en verde por el cóctel descrito anteriormente (Figura 21A) junto con un marcador general de citoqueratina, dio como resultado la tinción de todas las células epiteliales tanto de ratón como de origen humano (Figura 21B), lo que ilustra distintas células epiteliales dentro de la población de células humanas en el pulmón injertado (Figura 21C). Asimismo, las células humanas positivas para acuaporina-5 (AQP-5), típicas de los alveocitos de tipo I (Figuras 22A-C) y las células humanas positivas para la proteína tensioactiva C (SP-C) característica de los alveocitos de tipo II (Figuras 23A-F) se distinguieron claramente dentro de los pulmones quiméricos de los animales trasplantados a las 7 semanas del trasplante.

Por tanto, las células pulmonares derivadas de seres humanos no solo se incorporan al pulmón de ratón lesionado, sino que también expresan AQP-5, necesaria para realizar el intercambio de gases, o SP-C, lo que indica la producción de tensioactivo por los alvéolos.

El tratamiento con células madre derivadas de pulmón embrionario no está asociado con el desarrollo de teratoma

Uno de los temas más controvertidos en el trasplante de células madre embrionarias, que limita su aplicación clínica, es la potencial tumorigenicidad de los tejidos trasplantados. En estudios previos en los que los presentes inventores intentaron definir la "ventana" óptima para diferentes tejidos precursores de embriones de cerdo, los resultados mostraron que más allá de E28, ninguno de los tejidos probados presenta ningún riesgo de formación de teratoma [Eventov-Friedman S et al., Proceedings of the National Academy of Science (2005) 102(8): 2928]. Por lo tanto, considerando que los pulmones embrionarios se desarrollan tarde en la embriogénesis y que, en consecuencia, la “ventana” de elección para el tejido pulmonar embrionario de ratón, cerdo o humano representa una etapa relativamente tardía de la gestación, el riesgo de inducción de teratoma asociado con dichos tejidos precursores es probablemente muy bajo. Sin embargo, para verificar aún más esta importante cuestión, se realizó un análisis histológico detallado de los ratones trasplantados (n = 30) hasta 12 meses después del trasplante; no se encontró evidencia de ningún tumor en el tejido pulmonar trasplantado. Además, el seguimiento a largo plazo de los ratones trasplantados mediante micro-CT de pulmón (resolución de 80 pm) no reveló ninguna lesión sospechosa de ocupación de espacio en estos ratones. En las Figuras 25A-D se muestra un resumen de estos resultados con imágenes representativas.

Discusión

Los presentes resultados ilustran que el tejido embrionario de pulmón humano o de ratón, obtenido en la etapa canalicular, puede ofrecer una fuente óptima para el reemplazo de tejido mediante trasplante. Además, se propuso que el pulmón embrionario humano, rico en progenitores tempranos, se asemeja en sus atributos a los tejidos de la médula ósea y la sangre del cordón umbilical, cuyo uso para trasplantes en enfermedades hematopoyéticas se ha incrementado drásticamente durante la última década. Los tejidos embrionarios de 'ventana', que exhibieron un crecimiento y diferenciación óptimos tras la implantación en ratones singénicos o SCID, están significativamente enriquecidos para varios progenitores epiteliales, mesenquimales y endoteliales, en comparación con el tejido de puntos de tiempo gestacional anteriores o posteriores. Además, el análisis detallado de estos progenitores tempranos en sus respectivos tejidos embrionarios reveló que los progenitores epiteliales residen en nichos específicos, similares a los descritos ampliamente para los nichos de células madre hematopoyéticas en la médula ósea. Por tanto, los presentes resultados documentaron, en las proximidades de las supuestas células progenitoras de pulmón, el ensamblaje de células endoteliales, células positivas para nestina y células mesenquimales, que también están típicamente inervadas, como se encuentra mediante tinción positiva para CGRP y neurofilamentos. Estos resultados son consistentes con estudios que indican la posible existencia de nichos de células madre en el pulmón de un ratón adulto [Engelhardt JF. American Journal of respiratory cell and molecular biology (2001) 24(6): 649-52].

Además de definir la ventana óptima para el uso de tejido fetal en el trasplante, correlacionada con la aparición de nichos de progenitores pulmonares embrionarios humanos, el presente estudio también arroja luz sobre un debate en curso sobre el fenotipo de los progenitores pulmonares humanos. Así, mientras Kajstura et al. [Kajstura y col. 2011, ver anterior] describió una pequeña población de células c-kit+ que son negativas para todos los demás marcadores y que residen en áreas perivasculares discretas cercanas a grandes estructuras de las vías respiratorias, los presentes inventores encontraron en los alvéolos en desarrollo otra población celular c-kit+, que reside en los vasos sanguíneos, muy cerca de los progenitores CK5+, que expresan antígenos CD34 y CD31, como sugirieron Suzuki et al. (Suzuki et al 2010, ver anterior). Por tanto, el tejido embrionario de pulmón de "ventana", caracterizado aquí, contiene ambas poblaciones progenitoras positivas de c-kit putativas. La estrecha proximidad y la posible interacción de las células positivas para c-kit con progenitores epiteliales CK5+ es consistente con la sugerencia reciente de que la activación de c-kit es crucial para el desarrollo normal y el mantenimiento de las estructuras alveolares [Lindsey JY et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine (2011) 183 (1 Resúmenes de Conferencia): A2445].

Es importante destacar que los tejidos de la "ventana canalicular óptima" exhiben el nivel más alto de todos los tipos de progenitores en relación con los tejidos pulmonares de etapas de desarrollo anteriores; por tanto, los presentes inventores contemplaron que el trasplante intravenoso de la mezcla de células no fraccionadas, de forma similar a la metodología utilizada en el trasplante de médula ósea, podría ser el enfoque preferido. De hecho, el trasplante de una suspensión unicelular de pulmón de ratón E15-E16 o de tejido pulmonar humano de 20-22 semanas demostró la notable capacidad regenerativa de estas células después de la lesión pulmonar inducida por la combinación de naftaleno y TBI subletal de 6,0 Gy. Críticamente, este nivel de acondicionamiento antes del trasplante era necesario para establecer el quimerismo cuando los progenitores pulmonares del hospedante estaban presentes en niveles significativos, como se observó después de la inducción de lesiones con naftaleno. Recientemente, Duchesneau et al.

[Duchesneau P y col., Molecular Therapy (2010) 18(10): 1830-6] demostraron que el injerto de células derivadas de la médula ósea en las estructuras pulmonares puede mejorarse notablemente mediante la intensificación del acondicionamiento utilizando el agente mieloablativo busulfán además de naftaleno. Claramente, este requisito de acondicionamiento puede variar en su intensidad en diferentes situaciones clínicas, dependiendo del nivel de lesión pulmonar de los progenitores del hospedador afectados por el proceso patológico.

Tomados en conjunto, los presentes resultados revelaron un injerto robusto en diferentes compartimentos del pulmón del hospedante y la formación de toda la unidad respiratoria, incluidos los siguientes elementos: a) Células epiteliales recién formadas en pequeños bronquiolos, como se manifiesta a través de las células GFP+ CCSP+. b) Células de neumocitos tipo 1 (GFP+AQP-5+), importantes para la superficie de intercambio de gases dentro de los alvéolos. c) Células de neumocitos tipo 2 (GFP+ Sp-C+), importantes para la producción de tensioactivo en los alvéolos. d) Fuerte presencia de células ^gF^p+ CD31+ en la vasculatura. Además, el tejido injertado exhibe, junto con los elementos respiratorios, la expresión de CFTR requerida para el transporte de iones, especialmente crítico para los pacientes con CF (fibrosis quística).

Este injerto bastante drástico después de una "doble lesión", en contraposición al acondicionamiento con cada agente solo, podría explicarse por la competencia entre los progenitores del hospedante y del donante por sus respectivos nichos. Reynolds y col. [Reynolds SD et al., American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology (2004) 287(6): L1256-65] demostró que la eliminación de la población de células que expresan CCSP por el naftaleno da como resultado inflamación alveolar secundaria, edema y agotamiento de la población de células alveolares de tipo II. Por tanto, la lesión selectiva de las vías respiratorias puede servir como lesión incitante en enfermedades caracterizadas por una función alveolar gravemente comprometida. Además, Volscaert et al. [Volckaert T y col., J Clin Invest. (2011) 121(11): 4409] demostraron que la cascada de señalización embrionaria Wnt/Fgf10 se reactiva en células de músculo liso parabronquial maduras (PSMC) después de una lesión inducida por naftaleno, de una manera que activa la señalización de Notch y la posterior transición epitelial a mesenquimal; este hallazgo indica que la activación de esta vía embrionaria probablemente podría servir como desencadenante para la incorporación efectiva del tejido derivado de pulmón embrionario en los diferentes compartimentos pulmonares. Asimismo, se demostró que la lesión pulmonar inducida por radiación induce la ruptura de la barrera hemato-alveolar y la disfunción de la microcirculación y, por lo tanto, podría permitir el predominio de las células endoteliales derivadas del donante (45 47).

Independientemente del mecanismo involucrado, es sorprendente el marcado injerto en el modelo de ratón de células derivadas del donante obtenido en estructuras tanto bronquiolares como alveolares. Este quimerismo, que aumenta con el tiempo, probablemente se puede atribuir a los múltiples progenitores de donantes en el tejido pulmonar embrionario implantado, lo que permite que la progenie de células madre pluripotenciales auto-renovantes tempranas reemplace gradualmente a las células del hospedante o del donante derivadas de precursores posteriores.

También se observó una integración y un desarrollo pulmonar similares cuando se probaron progenitores pulmonares humanos en ratones NOD-SCID, aunque en este sistema la posible pérdida de diafonía con las citocinas de ratón podría reducir el injerto. Así, en tres conjuntos de experimentos, los presentes resultados ilustraron que las células humanas derivadas del donante se incorporan en estructuras tanto bronquiolares como alveolares, exhibiendo características similares a las descritas anteriormente para las células pulmonares embrionarias de ratón singénicas.

Se requieren más estudios para definir protocolos de inmunosupresión óptimos que permitan un trasplante exitoso en receptores alogénicos. En general, la etapa embrionaria temprana puede hacer que el tejido del donante implantado sea menos inmunogénico; sin embargo, los trasplantes de tejido embrionario no pueden evadir la vía indirecta del rechazo. No obstante, este desafío puede abordarse mediante protocolos que incluyan agentes que induzcan el bloqueo coestimulador. Alternativamente, el marcado nivel de progenitores hematopoyéticos (resultados no publicados) en el tejido pulmonar embrionario podría resultar en un quimerismo hematopoyético que podría inducir tolerancia central hacia las células pulmonares derivadas del donante después del trasplante. Además, la posibilidad de criopreservar suspensiones unicelulares de tejido pulmonar de ²⁰a ^{2 2}semanas, lo que podría mejorar notablemente la disponibilidad de trasplantes, también podría permitir establecer bancos de donantes con HLA tipado, como se hace con la sangre del cordón umbilical, y, por lo tanto, se podrían reducir potencialmente los requisitos de inmunosupresión.

Por último, el presente tejido embrionario de ratón de 'ventana' no mostró riesgo de teratoma cuando se siguió durante períodos prolongados después del trasplante, mediante micro-TC de alta resolución (80 pm), así como mediante examen patológico al final del período de seguimiento.

En resumen, los presentes resultados demuestran por primera vez que la etapa canalicular de la gestación ofrece una "ventana" óptima para recolectar tejido precursor de pulmón embrionario humano y de ratón para el trasplante regenerativo. Este tejido, que está libre de riesgo de teratoma, está altamente enriquecido para varios tipos de progenitores que fueron identificados por inmunohistología en sus respectivos nichos, de manera similar a las HSC en la médula ósea. El injerto marcado, la diferenciación y la incorporación robusta de estos progenitores en los pulmones lesionados pueden proporcionarse mediante la infusión de una suspensión unicelular preparada mediante digestión enzimática del tejido pulmonar embrionario. Como en el trasplante de médula ósea, la inducción del quimerismo pulmonar depende de alguna forma de acondicionamiento, para reducir la competencia con precursores endógenos de tipo hospedante. Si bien se han defendido varios intentos de aislar células madre pluripotenciales de pulmones adultos y expandir estas células en cultivo con el propósito de un trasplante regenerativo, los presentes resultados demuestran que el tejido pulmonar embrionario recolectado a las ^{2 0 - 2 2}semanas de gestación podría ofrecer potencialmente una modalidad alternativa más simple para la reparación pulmonar.

EJEMPLO 3

Ablación de progenitores pulmonares endógenos que ocupan nichos

Basándose en los resultados preliminares descritos anteriormente, los presentes inventores probaron el potencial curativo de suspensiones unicelulares no fraccionadas de células pulmonares de ratón en estadio canalicular, en el modelo bien establecido de lesión pulmonar inducida por NA. Este modelo imita las enfermedades pulmonares causadas por una lesión epitelial, que se refleja en los cambios en la presencia de células pulmonares club (antes denominadas células Clara, que se marcan mediante tinción para la proteína secretora de células Clara (CCSP; formalmente conocida como Scgb1a1). Considerando la observación de una marcada analogía entre los nichos de las células progenitoras en el pulmón y en BM, era tentador probar la vía iv para la transferencia celular, comúnmente utilizada en HSCT. Por lo tanto, 2 días después de la administración de NA, los ratones receptores C57BL/6 fueron infundidos por vía intravenosa con 1 x 10⁶células pulmonares singénicas E16, derivadas de embriones positivos para GFP. Posteriormente, los pulmones de los animales tratados se evaluaron en diferentes puntos de tiempo para detectar la presencia de células positivas para GFP. Estos experimentos iniciales (datos no mostrados) no lograron alcanzar un nivel detectable de quimerismo pulmonar, lo que indica que los progenitores no se dirigían al pulmón o que la ablación inducida por NA de las células del club fue transitoria, y no permitió un injerto o propagación adecuados de células CCSP derivadas de donante.

Para abordar la última posibilidad, los presentes inventores exploraron adicionalmente el estado del nicho usando análisis de incorporación de BrdU de ratones acondicionados con NA solo, en ausencia de trasplante. Se pudo detectar una señal marcada de células en proliferación BrdU+ endógenas (Figura 26E), lo que sugiere que una ola de progenitores endógenos probablemente puede expandirse dentro de la primera semana después de la exposición a NA. Esta recuperación de células endógenas, que potencialmente podría competir con los progenitores derivados de donantes y prevenir su injerto en los nichos apropiados, se inhibió después de la exposición a la irradiación corporal total (TBI) de ⁶Gray (Gy) 48 horas después del tratamiento con NA. La exposición a ⁶Gy TBI antes del tratamiento con NA no eliminó eficazmente el grupo endógeno de progenitores, tal como indica la incorporación marcada de BrdU si se administró NA después, en lugar de antes, de la exposición a ⁶Gy TBI (Figura 26E). Un análisis inmunohistológico adicional reveló que tanto las células CCSP+BrdU+ (Figura 26F) como las BrdU+ dentro del compartimento de los alveocitos tipo 2 (AT2) marcadas por tinción para la proteína tensioactiva C (SPC) (Figura 26G) se expandieron después de la lesión pulmonar inducida por NA. El análisis morfométrico cuantitativo, utilizando el software Fiji, de los números de células CCSP+BrdU+ y SPC+ BrdU+ por campo evaluado después de diferentes protocolos de acondicionamiento, mostró que, de hecho, estas células podrían ser eliminadas de manera efectiva tras la exposición posterior a ⁶Gy TBI (los valores de P para la comparación de NA solo frente a NA ⁶Gy TBI, fueron de 0,00017 y 0,0001 para las células CCSP+BrdU+ y SPC+ BrdU+, respectivamente). La evaluación de la distribución del número de células en proliferación por campo evaluado individual, recogidas en más de ^{2 0}campos de tres ratones diferentes, demostró la eficacia mejorada de eliminación de células proliferantes inducida por la administración de TBI después de NA (Figura 26H). En particular, la ablación tanto de células CCSP+BrdU+ como de células SPC+BrdU+ por NA seguido de ⁶Gy TBI fue significativamente más eficaz en comparación con ⁶Gy TBI antes de NA (P = 0,000017 y 0,0001 para células CCSP+BrdU+ y SPC+BrdU+, respectivamente).

Este análisis inmunohistológico de elementos del compartimento epitelial se extendió adicionalmente a otros linajes celulares utilizando un análisis FACS más cuantitativo para determinar el nivel de células CD45-BrdU+ siguiendo diferentes modalidades de acondicionamiento (Figura 26I). Se observó una señal detectable, que representa poblaciones de células endógenas endoteliares (CD45-CD31+), epiteliares (CD45-CD326+) y mesenquimales (CD45-SCA-1⁺⁾²⁸capaces de proliferar en respuesta a la exposición a NA (Figura 26J). Una vez más, el nivel de células BrdU+ dentro de estos linajes se redujo significativamente después de la exposición a ⁶Gy TBI administrada 48 horas después del NA (los valores de P fueron 0,015, 0,0009 y 0,0004 para células CD45-CD31+BrdU+, CD45-CD326+BrdU+ y CD45-SCA-1+BrdU+, respectivamente), mientras que el tratamiento con ⁶Gy TBI antes de la exposición a NA fue menos efectivo (los valores de P para la comparación de NA ⁶Gy TBI frente a ⁶Gy TBI NA, fueron 0,004, 0,0009 y 0,006 para células CD45-CD31+BrdU+, CD45-CD326+BrdU+ y CD⁴⁵SCA-1+BrdU+, respectivamente). Tomados en conjunto, estos resultados indicaron claramente que, como en HSCT, la inducción del quimerismo pulmonar podría requerir una "eliminación de nicho" de progenitores endógenos, y que este requisito previo podría cumplirse mediante un preacondicionamiento adecuado.

EJEMPLO 4

Quimerismo pulm onar en diferentes linajes después de la ablación del progenitor

Para evaluar el impacto del preacondicionamiento sobre el quimerismo pulmonar, los presentes inventores expusieron ratones a ⁶Gy t B i 48 horas después de NA, y les infundieron 1 x 10⁶células pulmonares de ratones E16 positivos para GFP, varias horas después de la irradiación. A continuación, se controló el injerto y el desarrollo de células derivadas del donante en los ratones receptores mediante tinción inmunohistológica, análisis morfométrico y microscopía de dos fotones. Los 'parches' GFP+, que indican el injerto de células derivadas del donante en los pulmones del receptor, mejoraron notablemente a los 30 días después del trasplante en ratones acondicionados con NA y ⁶Gy TBI (Figuras 30A-H), en comparación con TBI solo o nA solo (Figuras 30A-D). Un análisis adicional a las ⁸semanas después del trasplante utilizando el software Fiji reveló que en ratones acondicionados con NA más ⁶Gy TBI, dichas células GFP+ derivadas de donante ocuparon en promedio 11 ± 3% (media ± s.d.) del pulmón receptor. El análisis de co-localización utilizando el software Imaris mostró que las células de tipo donante co-localizadas comprendían más del 20% de subpoblaciones celulares citoqueratina+ (CK+) o CD31 o nestina+ dentro de las regiones de interés (ROI) definidas. La ^rO ⁱpara la co-localización (% ROI co-localizada) se definió por un umbral fijo en el canal verde (% ROI co-localizada, media ± SD para CK = 9,1 ± 4,2, para CD31 = 18,06 ± 6,1, para nestina = 8,5 ± 2,5%, respectivamente), lo que indica quimerismo en los compartimentos epitelial, vascular y mesenquimatoso del pulmón (Figuras 30E-H). Este quimerismo pulmonar progresó notablemente en ausencia de una lesión posterior, ocupando las células del donante el 28 ± ⁶% del pulmón cuando se ensayó a las 16 semanas después del trasplante (P < 0,01) (Figuras 31A-J).

La estructura tridimensional de los parches injertados se visualizó mediante microscopía de dos fotones, lo que permitió una visión directa de los pulmones inmediatamente después del sacrificio (Figuras 31D-G y Figuras 32A-I). Si bien el injerto obvio de células de tipo donante ya era evidente a las ⁶semanas después del trasplante, con integración predominante de células GFP+ trasplantadas en las estructuras bronquio-alveolares y vasculares (Figuras 31D-E y Figura 32B), continuó la proliferación adicional de células de tipo donante, ocupando las células del donante casi un tercio del tejido pulmonar después de 4 meses (Figuras 31F-G y Figura 32C) .

En particular, estos parches GFP+ probablemente se derivan de la expansión clonal y de la diferenciación de progenitores únicos, como lo indica el trasplante de una mezcla 1:1 de células pulmonares fetales E16 de ratones marcados con GFP (verde) y 'tdTomato' (rojo) (Figura 32D), lo que lleva a a parches monocromáticos distintos, como revela la imagen de enfoque extendido de microscopía confocal de disco giratorio (Figura 31H), o la microscopía de dos fotones (Figura 311 y Figura 32D). Asimismo, la tinción histológica del pulmón receptor con anticuerpo anti-GFP y anti-DsRed (reactivo cruzado con td-Tomato) y el examen detallado mediante microscopía confocal de disco giratorio (Figura 31J) demostraron la ausencia de superposición entre parches derivados de donante completamente verdes y completamente rojos, apoyando su origen clonal.

EJEMPLO 5

Mejora funcional después del trasplante.

Habiendo demostrado que los parches derivados del donante que se observaron se originaron a partir de un único progenitor, y considerando la función esencial del compartimento epitelial en el pulmón, los inventores caracterizaron a continuación la diferenciación de células epiteliales y los tipos de células que componen los distintos parches. Se identificaron tres tipos de parches, bronquiolar, bronquioalveolar y alveolar (Figura 33A), sobre la base de la morfología y la orientación con respecto al lumen bronquiolar. Aunque estos diferentes tipos de parches se pueden visualizar bien en base a la morfología, se llevó a cabo una verificación adicional de los límites bronquioalveolares mediante inmunotinción para SOX2, un factor de transcripción expresado por las células en las vías respiratorias conductoras (Figuras 32E-G). El análisis cuantitativo de la frecuencia de diferentes tipos de parches sugirió que la mayoría de los parches comprenden predominantemente estructuras alveolares (Figura 32H) (159 de 262 parches, ⁸⁸campos, n = 3 ratones), pero también se identificaron algunos parches bronquiolares (15 de 262) y bronquioalveolares ^{( 88}de 262). En particular, algunas células GFP+ injertadas se tiñeron positivamente para el regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) (Figura 32I) y potencialmente expresan CFTR de tipo salvaje, crítico para la reparación de la fibrosis quística, aunque la tinción per se no confirma la actividad funcional apropiada.

Para evaluar más a fondo el nivel de quimerismo de tipo donante en diferentes subpoblaciones funcionales de células pulmonares, se utilizó tinción CCSP para detectar células club, acuaporina-5 (AQP-5) o el receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE) para detectar alveocitos de tipo I (células AT1) y SPC para detectar células AT2 (Figuras 33B-C). La AQP-5 es un marcador de superficie, y su colocalización con GFP es difícil de determinar (ya que las células AT1 tienen extensiones citoplasmáticas largas que están distantes del núcleo), por lo que se generaron ratones quiméricos mediante el trasplante del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) - células pulmonares E16 de ratones donantes C3H/HeJ dispares, que expresan haplotipo H2k (H2Kk) en ratones inmunodeficientes R agl-1- de fondo C57BL/6, que expresan haplotipo H2B (H2KB) (Figuras 34A-C). Aunque el MHC de clase I no se expresa en todas las células pulmonares, se expresa en gran medida en la superficie celular de las células alveolares y endoteliales, y los parches pulmonares de tipo donante en ratones trasplantados se pueden distinguir claramente por la tinción del MHC de la superficie celular (Figura 34D). Por tanto, este sistema es más adecuado para estudiar la colocalización en la superficie celular con AQP-5 (Figuras 33D-E y Figuras 34E-F). El porcentaje de co-localización de GFP con CCSP o SPC y de H2Kk con AQP-5 se cuantificó utilizando el 'módulo de co-localización' de Imaris. Se observó aproximadamente un 20% - 50% de co-localización dentro de las ROI definidas en las estructuras quiméricas relevantes dentro de cada una de estas subpoblaciones pulmonares epiteliales después de la infusión de células pulmonares E16 GFP+ o H2Kk (Figura 33E). El porcentaje de ROI co-localizada se definió mediante un umbral fijo en el canal verde (GFP) para CCSP y SPC (% ROI co-localizada = 18,8 ± 10,3 para CCSP, 6,5 ± 3,6 para SPC; media ± s.d.) o el canal rojo (H2Kk) para AQP-5 (% de ROI co-localizada = 28,5 ± 12,1 para AQP-5). También se observó una marcada co-localización en las células AT1 con tinción de tipo donante cuando se utilizó un análisis de segmentación celular alternativo (Figuras 34F-G). Además, las características de AT1 de estas células de tipo donante positivas para AQP-5 se verificaron mediante tinción con RAGE (Figura 34H).

La clara distinción de los parches de tipo donante de las células de tipo hospedante en este modelo alogénico (Figura 34D) indicó claramente que para la mayoría de las células que expresan el MHC del donante, es poco probable la fusión con las células de hospedante. De hecho, el análisis FACS de una suspensión unicelular de pulmón quimérico ⁸semanas después del trasplante confirmó este hallazgo, revelando que aunque las células del donante positivas únicamente para H2Kk representan aproximadamente el 5,2% ± 2,1%, media ± s.d. de la población de células pulmonares CD45 (los porcentajes en tres ratones fueron del 7,3%, 5,1% y 3,1%), solo el 0,27% ± 0,16% de las células eran doble positivas para H²KkH²KB (los porcentajes de doble positivo en estos tres ratones fueron 0,17, 0,46 y 0,19, respectivamente), lo que indica que más del 90% de las células de tipo donante no se fusionaron con las células de hospedante (Figura 34I).

Además, los presentes inventores documentaron el predominio de células donantes positivas únicas no fusionadas con células de hospedante en el modelo singénico, en el que se infunden células de pulmón E16 GFP+ en receptores que expresan tdTomato (el análisis de co-localización detallado y la tinción confocal 3D se presentan en las Figuras 35A-F). En particular, en este modelo de ratón, en contraste con el modelo alogénico (en el que las células del donante se identifican por su expresión de MHC de clase I), los marcadores de GFP y tdTomato se expresan en todas las células pulmonares.

Tomados en conjunto, estos datos de quimerismo indican claramente que el daño a diferentes linajes de células pulmonares puede revertirse mediante la infusión de células pulmonares de ratones E16 fetales después del acondicionamiento con NA y TBI. Para verificar aún más que la función pulmonar de hecho se restauró después del trasplante, se realizó un análisis de la función pulmonar que se usa comúnmente en la evaluación de modelos de enfermedades respiratorias en ratones y su reparación. En comparación con los ratones lesionados no tratados, los ratones receptores de trasplantes mostraron una conformidad basal significativamente mejorada (P = 0,009) de los pulmones lesionados, medida por la técnica de oscilación a las ⁶semanas después del trasplante (Figura 33F), lo que da como resultado un rendimiento similar al de los ratones sanos no lesionados. Los ratones tratados también mostraron una amortiguación tisular significativamente mejorada en comparación con los ratones lesionados no tratados (P = 0,021) (Figura 33G). En particular, el análisis histológico detallado y la microtomografía computerizada de pulmón (micro-CT; resolución de 80 pm) de los ratones tratados (n = 30) hasta 12 meses después del trasplante no detectó ningún tumor en el tejido pulmonar trasplantado (Figuras 25A-D).

EJEMPLO 6

Tipos de células necesarios para la regeneración p o r parte de los progenitores epiteliales

Aunque varios progenitores epiteliales, incluidas las células putativas CD45'CD31'EpCAM+CD24+ y el precursor común descrito recientemente de las células AT1 y AT2, marcado por doble tinción para mucina-1 y podoplanina, podrían dar lugar a los parches de tipo donante observados, los presentes inventores encontraron que cuando se purificaron mediante clasificación FACs , estas subpoblaciones tenían muy poca actividad 'formadora de parches' in vivo en comparación con lo observado con células no clasificadas, incluso cuando las fracciones de células clasificadas se recombinaron (datos no mostrados). Por tanto, los presentes inventores intentaron en experimentos posteriores utilizar el fraccionamiento celular con perlas magnéticas, que consume menos tiempo y, por lo tanto, es menos tóxico cuando se procesa un gran número de células. En estos experimentos, se evaluó el papel de las principales subpoblaciones de células pulmonares E16 definiendo el impacto de su agotamiento en la regeneración pulmonar.

Usando perlas magnéticas, se agotaron células CD45+, SCA-1+, CD31+ o EpCAM+ (también conocidas como CD326) de las células pulmonares E16 GFP+ de ratones donantes C57BL/6. Las células restantes se fenotiparon luego mediante análisis FACS (Figura 36A) y se analizaron para la generación de colonias en un sistema de cultivo 3D (Figura 36B) y para determinar su capacidad para formar parches ⁸semanas después de la infusión de 1 * 10⁶células en receptores C57BL/6 acondicionados con NA y ⁶Gy TBI (Figuras 36C-F). Como se esperaba, después de la eliminación de células hematopoyéticas CD45+, la preparación celular restante (la fracción CD45') retuvo una marcada actividad formadora de colonias en cultivo 3D y formación de parches in vivo (Figura 36C), mientras que después de la eliminación de progenitores epiteliales EpCAM+ estas actividades se vieron afectadas negativamente (Figura 36D) (83% y 98% de reducción, en comparación con la fracción CD45', P = 0,00015 y P = 0,00013, respectivamente). Curiosamente, el ensayo del parche pulmonar también indicó un papel crítico para células CD31+ (Figura 36E) (93% de reducción en el número de parches en comparación con la fracción CD45', P = 0,00013); y se observó una reducción significativa, pero menos pronunciada, de parches después de la eliminación de células SCA-1+ (Figura 36F) (reducción del 62%, en comparación con la eliminación de la población CD45-, P = 0,005). En el ensayo de cultivo 3D, el papel de las células CD31+, aunque considerable, fue menos influyente (Figura 36G), y se observó una reducción similar en la actividad (en comparación con la que se produce después de la eliminación de las células CD45) después de la eliminación de células SCA-1+ o de células CD31+ (63% y 53%, respectivamente). Considerados en conjunto, los presentes resultados in vivo (Figura 36H) confirman que las células endoteliales CD31+ y las células mesenquimales SCA-1+ podrían tener un papel importante en la facilitación del crecimiento y desarrollo de progenitores epiteliales EpCAM+. Por tanto, los presentes resultados indican que el trasplante de una suspensión unicelular sin fraccionamiento, tal como se hace en el trasplante de sangre de cordón umbilical, podría ser ventajoso para la regeneración pulmonar.

EJEMPLO 7

Trasplante de células pulmonares fetales humanas en ratones NOD-SCID

Para investigar la capacidad de las células pulmonares embrionarias humanas en etapa canalicular para integrarse en pulmones de ratones lesionados, se estableció el modelo de lesión pulmonar NA en ratones NOD-SCID. Debido a que los ratones NOD-SCID son más sensibles a la TBI que los ratones de tipo salvaje, estos ratones se acondicionaron con 3-4 Gy TBI (en lugar de ⁶Gy TBI). La infusión de 1 * 10⁶células pulmonares embrionarias humanas de 20 semanas de gestación en ratones NOD-SCID acondicionadas con NA solo dio como resultado un injerto insignificante (datos no mostrados), pero se observó un mayor quimerismo después de la infusión de células en ratones NOD-SCID acondicionados con NA seguido de 3-4 Gy TBI. Los inventores confirmaron este patrón, que se encontró primero después de la infusión de una suspensión unicelular teñida con el tinte de seguimiento fluorescente CMTMR (datos no mostrados), en un segundo experimento para verificar el quimerismo de tipo donante mediante doble tinción del pulmón receptor con un anticuerpo de MHC de ratón (sin reactividad cruzada con tejido humano) (Figura 37A) y un anticuerpo (MNF116) contra citoqueratina humana (que tiñe las células epiteliales humanas y no reacciona de forma cruzada con tejido de ratón de control) (Figura 37B). A las ⁶semanas después del trasplante, la doble tinción con estos anticuerpos mostró la incorporación de células derivadas de humanos en las estructuras pulmonares (datos no mostrados).

En dos experimentos posteriores, se infundieron células pulmonares de embriones humanos recolectados a las 20 semanas de gestación en ratones NOD-SCID tratados con NA y 4 Gy TBI. Siete semanas después de la infusión, los pulmones se tiñeron con isolectina B4 de Bandeiraea simplicifolia (tinción de ratón y otras especies, pero sin reacción cruzada con tejido humano) sola o junto con un anticuerpo contra un amplio espectro de citoqueratinas humanas (clon MNF116, véase la Tabla 7 anterior), vimentina V9 y CD31 (no cruzada reactivo con tejido de ratón) (Figuras 37C-E). El último cóctel tiñó selectivamente células de origen humano en estructuras tanto alveolares como bronquiales de ratones quiméricos (Figuras 37F-G). Los ratones receptores mostraron diversos grados de quimerismo. Por lo tanto, el análisis morfométrico reveló más del 0,5% de ocupación pulmonar en ⁶de 13 ratones [en un experimento, tres de estos seis ratones positivos (con más del 0,5% de ocupación pulmonar) exhibieron una ocupación pulmonar de 0,8% ± 0,4%, 0,6% ± 0,05% y 1,0% ± 0,9%, media ± sd; en el segundo experimento, tres de los siete ratones mostraron una mayor ocupación pulmonar, de 4,2% ± 1,5%, 4,4% ± 1,4% y 5,15% ± 2,8%, respectivamente]. La ocupación promedio de pulmón de células humanas en estos seis ratones, identificada usando una mezcla de anticuerpos anti-humanos a las 7 semanas después del trasplante, fue del 3% ± 2,3% del parénquima pulmonar del ratón (Figura 38A), en comparación con el 11% encontrado para las células E16 de ratón singénico a las ⁸semanas después del trasplante (Figura 30C). Sin embargo, los patrones identificados fueron similares a los encontrados en el modelo de trasplante singénico, y los parches bronquioalveolares y alveolares de origen humano (Figuras 38B-C) que comprenden células AT1 (Figura 38D) y AT2 (Figura 38E) se detectaron mediante doble tinción de células humanas con anticuerpos anti-AQP-5 y anti-SPC, respectivamente.

Tomados en conjunto, los presentes resultados (en ratones individuales que muestran una ocupación pulmonar relativamente alta) establecen además la prueba de concepto obtenida en los estudios descritos anteriormente utilizando el sistema singénico. Además, la viabilidad de células pulmonares humanas CD45' en estadio canalicular después de la congelación y descongelación (Figura 37H) y su capacidad para formar estructuras pulmonares tridimensionales en cultivo ex vivo (Figura 37I), respaldan la viabilidad de "almacenar" células pulmonares embrionarias humanas para la tipificación de tejidos y los ensayos de control de calidad antes del trasplante.

EJEMPLO 8

Inducción de quimerism o pulm onar después del trasplante de células pulmonares adultas frescas

Se recolectaron células pulmonares adultas de un ratón C57BL/6 positivo para GFP y se inyectó i.v. una suspensión unicelular que comprendía ⁸x 10⁶en ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y ⁶GY TBI.

Ocho semanas después del trasplante, se obtuvo tejido pulmonar de ratones trasplantados, se fijó y se analizó en busca de parches positivos para GFP. Como es evidente a partir de los resultados (Figuras 39A-F) se encontró un número marcado de parches positivos de GFP derivados del donante en los pulmones del receptor.

EJEMPLO 9

Inducción de quimerism o pulm onar después del trasplante de células pulmonares expandidas ex vivo

Las células pulmonares se expandieron ex vivo obteniendo primero células pulmonares C57BL E16 positivas para GFP y sembrando las células en placas de cultivo de tejidos con un medio de condición adecuado (iMEF) junto con el factor de crecimiento epitelial y el inhibidor Rock. Se inyectó i.v. una suspensión unicelular que comprende 2 x 10⁶células expandidas en ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y ⁶GY TBI.

Ocho semanas después del trasplante, se obtuvo tejido pulmonar de ratones trasplantados, se fijó y se analizó en busca de parches positivos para GFP. Como es evidente a partir de los resultados (Figuras 40A-F) se encontró un número marcado de parches positivos para GFP derivados del donante en los pulmones del receptor.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de inducir daño a un tejido de interés, donde dicho daño da como resultado la proliferación de células madre residentes en dicho tejido, y donde cuando dicho tejido de interés es un tejido pulmonar dicho agente es capaz de inducir daño al tejido no es naftaleno; y un agente que elimina dichas células madre residentes en dicho tejido, en el que dicho agente que elimina dichas células madre residentes en dicho tejido se usa posteriormente para dicho agente capaz de inducir daño a dicho tejido, para su uso en el acondicionamiento de un sujeto humano que necesita un trasplante de células progenitoras en suspensión procedente de un tejido adulto de interés.

2. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso según la reivindicación 1, que comprende además el uso de células progenitoras en suspensión de un tejido adulto de interés para trasplante.

3. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para uso de las reivindicaciones 1 o 2, donde dicho sujeto tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad maligna, una enfermedad del sistema nervioso central, una enfermedad gastrointestinal, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad hepática, una enfermedad nefrítica, una enfermedad pancreática, una enfermedad pulmonar, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria, una inmunodeficiencia y una enfermedad autoinmune.

4. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso de la reivindicación 1 o 2, donde dichas células progenitoras:

comprenden células progenitoras humanas; y/o

no son singénicas con el sujeto; y/o

se seleccionan del grupo que consiste en células progenitoras cardíacas, células progenitoras hepáticas, células progenitoras pancreáticas, células progenitoras del cerebro, células progenitoras néfricas, células progenitoras de ovario, células progenitoras del bazo y células progenitoras pulmonares, y/o

son capaces de regenerar un tejido estructural/funcional.

5. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso según la reivindicación 1,2 o 4, donde dichas células progenitoras se obtienen de un tejido pulmonar adulto.

⁶. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso de la reivindicación 1 o 2, donde dicho tejido de interés es un tejido parenquimatoso y/o se selecciona del grupo que consiste en un tejido cardíaco, un tejido hepático, un tejido pancreático, un tejido cerebral, un tejido nefrítico, un tejido ovárico, un tejido pulmonar y un tejido del bazo.

7. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso de la reivindicación 1 o 2, donde dicho agente capaz de inducir daño a dicho tejido se selecciona del grupo que consiste en un compuesto químico, un antibiótico, un fármaco terapéutico, una toxina, una intervención quirúrgica y un remedio a base de hierbas.

⁸. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para uso de la reivindicación 1 o 2, donde dicho agente capaz de inducir daño a dicho tejido se selecciona del grupo que consiste en un agente que causa toxicidad en las células renales, un agente que causa toxicidad en las células hepáticas, un agente que causa toxicidad en las células cardíacas, un agente que causa toxicidad en las células pancreáticas, un agente que causa toxicidad en las células del cerebro, un agente que causa toxicidad en las células del bazo, un agente que causa toxicidad en las células ováricas y un agente que causa toxicidad en las células pulmonares.

9. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso según la reivindicación ⁸, donde

dicho agente que causa toxicidad en las células renales se selecciona del grupo que consiste en un antibiótico aminoglucósido, un inhibidor de la calcineurina, un acetaminofeno, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un antidepresivo, un antihistamínico, un agente antimicrobiano, un agente antirretroviral, una benzodiazepina, un agente cardiovascular, un agente quimioterapéutico, un remedio a base de hierbas y nefrotectomía parcial;

dicho agente que causa toxicidad en las células hepáticas se selecciona del grupo que consiste en un acetaminofeno, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un glucocorticoide, una isoniazida, un fármaco derivado de la hidracina, una toxina industrial, un remedio a base de hierbas y una hepatectomía parcial;

dicho agente que causa toxicidad en las células cardíacas se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente citostático, un fármaco antidepresivo, un fármaco inmunomodulador, un anestésico, un agente bloqueante de los canales de calcio, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un fármaco betaantagonista de los receptores adrenérgicos y un antiarrítmico;

dicho agente que causa toxicidad en las células pancreáticas se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de la ECA, una azatioprina, un estrógeno, una furosemida, una metildopa, una mesalazina, una pentamidina, una procainamida, un propofol, una estatina, una estreptozotocina, una sulfonamida, un diurético tiazídico, un valproato y una pancreatectomía parcial;

dicho agente que causa toxicidad en las células cerebrales se selecciona del grupo que consiste en un antihistamínico, un relajante de la vejiga, un relajante muscular, un antidepresivo y un agente quimioterapéutico; dicho agente que causa toxicidad en las células ováricas se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico y un agente inmunosupresor;

dicho agente que causa toxicidad en las células pulmonares se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente inmunosupresor, una amiodarona, un bloqueador beta, un inhibidor de la ECA, una nitrofurantoína, una procainamida, una quinidina, una tocainida y un minoxidil.

10. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde dicho agente que elimina las células madre residentes comprende un régimen de acondicionamiento subletal o letal.

11. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso según la reivindicación 10, donde dicho régimen de acondicionamiento subletal o letal comprende una irradiación corporal parcial o un agente alquilante.

12. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde dicho agente capaz de inducir daño a dicho tejido se efectúa 1-3 días antes de que dicho agente extirpe dichas células madre residentes.

13. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso según la reivindicación 2, donde dicho trasplante se efectúa por vía intravenosa.

14. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso de la reivindicación 2, donde dicho trasplante se efectúa mediante una ruta seleccionada del grupo que consiste en intratraqueal, intrabronquial, intraalveolar, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intracardíaca, intramuscular, intraserosa, intramucosal, transmucosal, transnasal, rectal e intestinal.

15. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente para su uso de la reivindicación 1 o 2, que comprende además el uso de un régimen inmunosupresor.