ES2886627T3 - Métodos de uso de células pulmonares para trasplante e inducción de tolerancia - Google Patents

Abstract

Células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión que comprenden una cantidad eficaz de células precursoras hematopoyéticas (HPC) o suplementadas con HPC, en las que dicha cantidad eficaz es una cantidad suficiente para lograr tolerancia a dichas células de tejido pulmonar en ausencia de un régimen inmunosupresor crónico, y en las que dicha cantidad eficaz de dichas HPC comprende al menos aproximadamente 1 x 105 células por kg de peso corporal de un sujeto, para su uso en el tratamiento de un trastorno o lesión pulmonar en un sujeto que lo necesite o para inducir tolerancia específica de donante en un sujeto que necesite un trasplante de células o tejidos pulmonares.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de uso de células pulmonares para trasplante e inducción de tolerancia

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención, en algunas de sus realizaciones, se refiere a células de tejido pulmonar en suspensión que comprenden células progenitoras hematopoyéticas para su uso en aplicaciones terapéuticas.

Las enfermedades respiratorias son la segunda causa principal de muerte en el mundo. La mayoría de las terapias disponibles en la actualidad solo mejoran ligeramente la calidad de vida de los pacientes con enfermedades pulmonares y no previenen la pérdida de la superficie de intercambio de gases, que es una consecuencia importante de la progresión en una variedad de patologías pulmonares. Por lo tanto, la mejor manera de curar la enfermedad pulmonar en estadio terminal es mediante el trasplante de órganos. Sin embargo, la escasez de órganos provoca la muerte de muchos pacientes mientras se encuentran en la lista de espera.

Durante la última década, se ha investigado ampliamente el posible papel curativo de las terapias basadas en células madre. Hallazgos recientes sugieren que los progenitores tempranos derivados de tejidos adultos, como la médula ósea o de la sangre del cordón umbilical, el líquido amniótico o la placenta, incluidas las células madre mesenquimáticas, los progenitores endoteliales o los fibrocitos circulantes y una variedad de otras poblaciones, podrían injertarse estructuralmente y diferenciarse como vías respiratorias y células epiteliales alveolares o como células pulmonares intersticiales o endoteliales vasculares y podrían utilizarse en la reparación y regeneración de pulmones lesionados o enfermos [Baber S.R. etal., American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. (2007), 292(2):H1120; Weiss D.J., Pulm. Pharmacol. Ther. (2008), 21 (4):588-94; Weiss D.J. et al., Proceedings of the American Thoracic Society: Am. Thoracic Soc. (2008), p. 637; Sueblinvong V. y Weiss D.J., Traslational Research (2010), 156(3):188-205]. Sin embargo, la falta de transdiferenciación epitelial significativa, la estructura extremadamente compleja del pulmón, compuesto por más de 40 tipos de células diferentes, y una baja tasa de injerto de células trasplantadas en el pulmón, en diferentes modelos experimentales, representan un desafío importante.

Recientemente, el grupo de Reisner Y. demostró que los tejidos pulmonares embrionarios canaliculares de ratón y humanos están enriquecidos en varios progenitores pulmonares [Rosen, C. et al., Nat. Med. (2015), 21 (8): pp. 869­ 79]. Según estos estudios, con un preacondicionamiento adecuado, creando un espacio en el nicho de las células madre del pulmón del huésped, la infusión intravenosa de una suspensión de células individuales de células pulmonares canaliculares indujo un marcado quimerismo pulmonar a largo plazo que puede curar los pulmones lesionados.

Otros antecedentes de la técnica incluyen la publicación PCT n.° WO 2013/084190 y la publicación PCT n.° WO/2013/093920.

Sumario de la invención

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporcionan células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión que comprenden una cantidad eficaz de células precursoras hematopoyéticas (“hematopoietic precursor cells”, HPC) o suplementadas con HPC, en las que la cantidad eficaz es una cantidad suficiente para lograr tolerancia a las células de tejido pulmonar en ausencia de un régimen inmunosupresor crónico, y en las que dicha cantidad eficaz de dichas HPC comprende al menos aproximadamente 1 x 105 por kg de peso corporal de un sujeto, para su uso en el tratamiento de un trastorno o lesión pulmonar en un sujeto que lo necesite o para inducir tolerancia específica de donante en un sujeto que necesite un trasplante de células o tejidos pulmonares.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso comprenden además un protocolo de acondicionamiento subletal, letal o supraletal.

Según algunas realizaciones de la invención, el protocolo de acondicionamiento comprende un acondicionamiento de intensidad reducida (“reduced intensity conditioning”, RIC).

Según algunas realizaciones de la invención, el protocolo de acondicionamiento comprende la citorreducción de células T in vivo.

Según algunas realizaciones de la invención, la citorreducción de células T in vivo se efectúa mediante anticuerpos.

Según algunas realizaciones de la invención, los anticuerpos comprenden un anticuerpo anti-CD8, un anticuerpo anti-CD4 o ambos.

Según algunas realizaciones de la invención, los anticuerpos comprenden anticuerpos de globulina antitimocitos (ATG), anticuerpos anti-CD52 o anticuerpos anti-CD3 (OKT3).

Según algunas realizaciones de la invención, el protocolo de acondicionamiento comprende al menos una de entre una irradiación corporal total (“total body irradiation”, TBI), una irradiación linfoide total (“total lymphoid irradiation”, TLI), una irradiación corporal parcial, un agente quimioterapéutico y/o una inmunoterapia con anticuerpos.

Según algunas realizaciones de la invención, la TBI comprende una dosis de irradiación única o fraccionada dentro del intervalo de 1-10 Gy.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso comprenden además un agente capaz de inducir daños al tejido pulmonar, en las que los daños provocan la proliferación de células madre residentes en el tejido pulmonar.

Según algunas realizaciones de la invención, el agente capaz de inducir daños al tejido pulmonar se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente inmunosupresor, una amiodarona, un beta-bloqueante, un inhibidor de la ACE, una nitrofurantoína, una procainamida, una quinidina, una tocainida y un minoxidil.

Según algunas realizaciones de la invención, el agente capaz de inducir daños al tejido pulmonar comprende naftaleno.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso comprenden además el uso de un agente inmunosupresor durante hasta dos semanas después de las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión.

Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además tratar al sujeto con un agente inmunosupresor durante hasta dos semanas después de la administración.

Según algunas realizaciones de la invención, el agente inmunosupresor comprende ciclofosfamida.

Según algunas realizaciones de la invención, la ciclofosfamida es para una administración de dosis única.

Según algunas realizaciones de la invención, la ciclofosfamida es para una administración de dos dosis.

Según algunas realizaciones de la invención, la ciclofosfamida se administra en una sola dosis.

Según algunas realizaciones de la invención, la ciclofosfamida se administra en dos dosis.

Según algunas realizaciones de la invención, cada una de las dos dosis comprende una concentración de aproximadamente 50-150 mg por kg de peso corporal.

Según algunas realizaciones de la invención, cada una de las dos dosis se efectúa los días 3 y 4 después de las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión.

Según algunas realizaciones de la invención, cada una de las dos dosis se administra los días 3 y 4 después de la administración.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar comprenden células pulmonares de mamífero.

Según algunas realizaciones de la invención, las células pulmonares de mamífero son células humanas.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar comprenden células pulmonares fetales. Según algunas realizaciones de la invención, las células pulmonares fetales proceden de un feto en un estadio de desarrollo correspondiente al de un órgano/tejido pulmonar humano en un estadio gestacional seleccionado de un intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 22 semanas de gestación.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar comprenden células pulmonares adultas. Según algunas realizaciones de la invención, las células pulmonares adultas se obtienen de un cadáver.

Según algunas realizaciones de la invención, las células pulmonares adultas se obtienen de un donante vivo.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar comprenden células desdiferenciadas. Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar comprenden células expandidas ex vivo. Según algunas realizaciones de la invención, el tejido pulmonar no singénico es alogénico con respecto al sujeto. Según algunas realizaciones de la invención, el tejido pulmonar no singénico es xenogénico con respecto al sujeto. Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar en suspensión se encuentran en una dosis de al menos aproximadamente 10 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar en suspensión se encuentran en una dosis de al menos aproximadamente 40 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar en suspensión están en una dosis de al menos aproximadamente 100 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran a una dosis de al menos aproximadamente 10 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran a una dosis de al menos aproximadamente 40 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran a una dosis de al menos aproximadamente 100 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar en suspensión están depuradas de células T.

Según algunas realizaciones de la invención, las HPC comprenden células Lin- Sca-1+ c-kit+ (LSK) y/o células de molécula de activación linfocítica de señalización (“signaling lymphocytic activation molecule”, SLAM).

Según algunas realizaciones de la invención, las HPC comprenden al menos aproximadamente 1 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según algunas realizaciones de la invención, las HPC comprenden al menos aproximadamente 10 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según algunas realizaciones de la invención, la suplementación con las HPC comprende la adición de las HPC obtenidas del mismo donante que el tejido pulmonar.

Según algunas realizaciones de la invención, la suplementación con las HPC comprende la adición de HPC obtenidas de un donante diferente que el del tejido pulmonar.

Según algunas realizaciones de la invención, la suplementación con las HPC comprende las células de tejido pulmonar en la misma formulación que las HPC.

Según algunas realizaciones de la invención, la suplementación con las HPC comprende las células de tejido pulmonar en una formulación separada de las HPC.

Según algunas realizaciones de la invención, la suplementación con las HPC comprende administrar las células de tejido pulmonar en la misma formulación que las HPC.

Según algunas realizaciones de la invención, la suplementación con las HPC comprende administrar las células de tejido pulmonar en una formulación separada de las HPC.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar en suspensión comprenden una población heterogénea de células.

Según algunas realizaciones de la invención, la población heterogénea de células comprende cualquiera de células progenitoras hematopoyéticas, células progenitoras epiteliales, células progenitoras mesenquimáticas y/o células progenitoras endoteliales.

Según algunas realizaciones de la invención, las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso se formulan para una vía de administración intravenosa o una vía de administración intratraqueal.

Según algunas realizaciones de la invención, la administración se efectúa por vía intravenosa o vía intratraqueal. Según algunas realizaciones de la invención, el sujeto es un sujeto humano.

Según algunas realizaciones de la invención, el sujeto que necesita el trasplante de células o tejidos pulmonares tiene un trastorno o lesión pulmonar.

Según algunas realizaciones de la invención, el trastorno o lesión pulmonar comprende inflamación crónica de los pulmones.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y/o científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de las realizaciones de la invención, a continuación, se describen ejemplos de métodos y/o materiales. En caso de conflicto, prevalecerá la memoria descriptiva de la patente, incluidas las definiciones. Además, los materiales, los métodos y los ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitantes.

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en este documento, solo a modo de ejemplo, remitiéndose a los dibujos adjuntos. Remitiéndose específicamente en este punto a los dibujos en detalle, se enfatiza que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con el propósito de un análisis ilustrativo de las realizaciones de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos pone de manifiesto para los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

Las figuras 1A-F son gráficos que ilustran la población hematopoyética de células LSK y SLAM en pulmón adulto, hígado fetal y pulmón fetal. Caracterización FACS activada en células individuales vivas, CD45+, células madre hematopoyéticas KSL (linaje-, SCA-1+, C-KIT+) (figuras 1A-C) o SLAM (linaje-, CD48-, CD150+) (figuras 1D-F) en médula ósea (“bone marrow”, BM) adulta (figuras 1A, 1D), hígado embrionario (E16) (figuras 1B, 1E); y pulmón embrionario (E16) (figuras 1C, 1F).

Las figuras 2A-E ilustran que el tejido pulmonar de ratón embrionario E16 exhibe niveles marcados de células madre hematopoyéticas de repoblación a largo plazo (figura 2A) El esquema de acondicionamiento y trasplante; (figuras 2B-E) análisis FACS que muestra quimerismo hematopoyético en sangre periférica de animales tratados con NA 10 Gy (n = 5) trasplantados con células pulmonares E16. Se infundió a los ratones una mezcla de células de médula ósea CD45.1 y células pulmonares GFP+ CD45.2+ E16 en una proporción de 1:1. El quimerismo se determinó 9 meses después del trasplante en cuatro ratones diferentes.

La figura 3 es una ilustración esquemática del protocolo de acondicionamiento utilizado para el trasplante de pulmón embrionario alogénico. Acondicionamiento previo de receptores de C57BL H-2KB: citorreducción de células T (“T cell debulking”, TCD) con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 en el día -6 (300 gg cada uno), naftaleno (NA) en el día -3, 6 Gy de irradiación corporal total (“total body irradiation”, TBI) en el día -1, ciclofosfamida (CY) 100 mg/kg/día en los días 3, 4 después del trasplante alogénico de la 'mega dosis' del donante (5 x 106) depurada de células T de células pulmonares E15-16 C3H H-2Kk.

Las figuras 4A-L son gráficos que ilustran el quimerismo de sangre periférica, BM y pulmón en el trasplante de pulmón depurado de células T de 'megadosis' alogénico. Caracterización FACS del quimerismo del tipo de donante de sangre periférica (células C3H H-2Kk) y del tipo de receptor (C57BL H-2KB) en ratones control (sin trasplante), trasplante de dosis regular (1 x 106) y 'megadosis' (5 x 106) depurada de T de células pulmonares E15-16 C3H H-2Kk. Los ratones receptores se acondicionaron como se describe en la figura 3. Las células B H-2Kk derivadas del donante o H-2KB B220 derivadas del huésped, las células T CD4/8, las células mieloides CD11b en la sangre periférica y la médula ósea se muestran en las figuras 4A-G y las figuras 4H-L, respectivamente.

Las figuras 5A-F son fotografías que ilustran el quimerismo pulmonar en el trasplante de pulmón depurado de células T de 'megadosis' alogénico. Las fotografías ilustran la inmunohistología pulmonar representativa después del establecimiento del quimerismo hematopoyético (como se ilustra en las figuras 4A-L) que muestran "parches" pulmonares rojos de C3H H-2Kk-Pe derivadas del donante, en contraposición a las células C57BL/6 H-2KB del huésped alogénico (verde).

Las figuras 6A-F son fotografías que representan la inducción del quimerismo pulmonar después del trasplante de células pulmonares adultas frescas. Se recogió una suspensión unicelular que comprende 8 x 106 células pulmonares adultas de un ratón C57BL/6 positivo para GFP y se inyectaron i.v. en ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y 6 GY TBI. Después de 8 semanas, el tejido pulmonar de los ratones trasplantados se fijó en PFA al 4% y se determinaron los parches positivos para GFP mediante inmunohistología. Verde - células derivadas del donante; azul - tinción Hoechst para núcleos. Las figuras 6A-C y las figuras 6D-F muestran diferentes aumentos del mismo campo, respectivamente.

Las figuras 7A-J son gráficos que representan la inducción del quimerismo hematopoyético por células pulmonares GFP adultas frescas 8 semanas después del trasplante. Las figuras 7A-E ilustran el quimerismo en cinco ratones trasplantados con 1 x 106 células de pulmón fetal E16. Las figuras 7F-J ilustran el quimerismo en cinco ratones trasplantados con 8 x 106 células pulmonares adultas. Quimerismo sanguíneo -% de la población de 7AAD-CD45+.

Las figuras 8A-F son fotografías que representan la inducción del quimerismo pulmonar después del trasplante de células pulmonares expandidas E16: Se recolectaron células pulmonares C57BL E16 positivas para GFP y se sembraron en placas de cultivo de tejido con medio de acondicionamiento (soportes embrionarios de ratón irradiados, "irradiated mouse embryonic feeders”, iMEF)) junto con factor de crecimiento epitelial e inhibidor de Rock. El medio se cambió cada 2 días y se añadió el inhibidor de Rock fresco cada vez. Después de 4 días, las células se pasaron dividiéndolas en 3 placas. Después de 3 días más de cultivo, las células se usaron para el trasplante. Una suspensión unicelular que comprende 2 x 106 células expandidas se inyectó i.v. en ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y 6 GY TBI. Después de 8 semanas, el tejido pulmonar de los ratones trasplantados se fijó en PFA al 4% y se determinaron los parches positivos para GFP mediante inmunohistología. Verde - células derivadas del donante; azul - tinción Hoechst para núcleos. Las figuras 8A-C y las figuras 8D-F muestran diferentes aumentos del mismo campo.

Las figuras 9A-E ilustran el análisis morfométrico de la ocupación pulmonar por células derivadas del donante después del trasplante de diferentes dosis de células pulmonares. Figura 9A) Parches GFP+ (marcados con un círculo) en dos secciones histológicas de pulmón representativas de ratones receptores, 8 semanas después del trasplante de 4 x 106 células pulmonares adultas GFP+ después del acondicionamiento. La tinción de GFPbajo refleja la autofluorescencia de las células pulmonares del huésped. Figura 9B) Un parche GFP+ típico analizado más a fondo por el software Fiji para calcular el área total de GFPalto (células derivadas del donante) más GFPbajo (autofluorescencia de las células huésped) (figura 9C), en comparación con solo GFPalto (figura 9D). Figura 9E) Porcentaje del área pulmonar ocupada por tejido GFPalto del área total ocupada por ambas células del huésped GFPbajo y del donante GFPalto. Esta secuencia de comandos se utilizó automáticamente en todas las imágenes de histología recolectadas de al menos siete portaobjetos, cada uno con tres criocortes con un espacio de 36 micrómetros entre sí, lo que arroja una profundidad de más de 1000 micrómetros hacia el interior del tejido pulmonar. Resultados después del trasplante de diferentes números de células pulmonares adultas (derecha) en comparación con la ocupación pulmonar después del trasplante de células pulmonares fetales E16 (izquierda) (n = 4 ratones por cada grupo, de 45 a 60 campos por ratón).

Las figuras 10A-B ilustran la formación de parches después del trasplante de diferentes dosis de células pulmonares. Figura 10A) Secciones histológicas típicas que muestran parches GFP+ (en un círculo) después del trasplante de 1 x 106 o 8 x 106 células pulmonares adultas después del acondicionamiento del huésped. Figura 10B) Número promedio de parches GFP+ en el área pulmonar de 2 x 2 x 1 mm de los ratones receptores (n = 4 ratones por cada grupo).

Las figuras 11A-G son fotografías de análisis tridimensionales por microscopía de dos fotones que revelan parches pulmonares verdes o rojos discretos después del trasplante de una mezcla 1:1 de células pulmonares GFP y TdTomato. Se trasplantó una mezcla 1:1 de células pulmonares adultas de GFP y TdTomato en ratones receptores después del acondicionamiento. Los ratones se sacrificaron y se examinaron mediante microscopía de 2 fotones 8 semanas después de la transferencia. Se encontraron parches discretos de color verde o rojo en el pulmón del huésped. La ausencia de parches amarillos indica claramente el origen clonal de cada parche. Las figuras 11A-F) ilustran dos campos típicos a gran aumento (imagen de enfoque extendido que muestra la profundidad de exploración completa del pulmón quimérico; cada etapa z = 1 gm, fusión de 30 a 80 planos; barra de escala 50 gm). Figura 11G) Imagen de un campo más grande a bajo aumento (barra de escala 200 gm).

Las figuras 12A-D ilustran diferentes tipos de parches que se encuentran en el pulmón del huésped después del trasplante. Los ratones huésped se sacrificaron 8 semanas después del trasplante y sus pulmones se evaluaron mediante inmunohistología. Figuras 12A-C) Se identificaron tres tipos principales de parches según su posición anatómica, a saber, alveolar, bronquiolar y broncoalveolar. Las áreas del lumen bronquiolar (“bronchiolar lumen”, BL) y las uniones broncoalveolares (“broncho-alveolar junctions”, BAJ) están en negrita en las figuras. Es de destacar que es posible ver que las células derivadas del donante positivas para GFP están presentes en las regiones alveolar y bronquiolar del pulmón del huésped. Figura 12D) Porcentaje de tipos de parches sobre el número total de parches. Estos resultados (n = 6 ratones, se contaron 8 campos para cada ratón) se compararon con los resultados encontrados después del trasplante de 1 x 106 células de pulmón fetal E16 (n = 3 ratones, se contaron 10 campos para cada ratón).

Las figuras 13A-J ilustran diferentes linajes celulares que se encuentran en parches GFP+ derivados del donante. Se utilizó un análisis inmunohistológico para caracterizar la composición de los parches verdes GFP+ derivados del donante. Se utilizó el software Imaris para determinar la colocalización de la fluorescencia. Las áreas GFP+ se establecieron como el área de interés, y el canal de colocalización identificó píxeles que incluían fluorescencia roja (tinción de anticuerpos) y verde (marcaje de células derivadas del donante). Las células epiteliales se tiñeron con anticuerpo de citoqueratina de amplio espectro (figuras 13A-C); las células endoteliales se tiñeron con anticuerpo CD31 (figuras 13D-F); y las células mesenquimáticas se tiñeron con nestina (figuras 13G-I). En cada figura, el canal rojo representa el marcador de linaje, el canal verde marca las células GFP+ derivadas del donante, y el azul marca la tinción nuclear. Barra de escala = 20 gm. Figura 13J) Resumen del% de ROI (promedio más DE) colocalizado 8 semanas después del trasplante de 8 x 106 células pulmonares de adulto GFP+ (basado en cinco áreas diferentes obtenidas de dos ratones trasplantados).

Las figuras 14A-M ilustran la integración de células derivadas del donante en el compartimento pulmonar epitelial. Se utilizó un análisis inmunohistológico para caracterizar la composición del compartimento epitelial dentro de los parches verdes GFP+ derivados del donante. Se utilizó el software Imaris para determinar la colocalización de la fluorescencia. Las áreas GFP+ fueron designadas como áreas de interés, y el canal de colocalización identificó píxeles que incluían colores rojo y verde. Las células alveolares de tipo I (ATI) se tiñeron con acuaporina de tipo 5 (figuras 14A-C), las células alveolares de tipo II (ATII) con proteína tensioactiva C (figuras 14D-F), las células Club con CCSP (CC16) (figuras 14G-I) y las células CFTR con anti-CFTR (figuras 14J-L). En cada figura, el canal rojo representa el marcador de linaje, el canal verde marca las células GFP+ derivadas del donante, y el canal azul marca la tinción nuclear. Barra de escala = 40 gm. Figura 14M) Resumen del% de ROI (promedio más DE) colocalizado 8 semanas después del trasplante de 8 x 106 células pulmonares de adulto GFP+ (basado en cinco áreas diferentes obtenidas de dos ratones trasplantados).

La figura 15 es un gráfico que ilustra la resistencia pulmonar dinámica antes y después del trasplante de células pulmonares adultas. La resistencia pulmonar dinámica se midió después de la exposición a metacolina (64 mg/ml) usando el instrumento Scireq-FlexiVent (Emka, Francia) en ratones C57BL/6 de tipo salvaje sin tratar (columna izquierda), en ratones tratados con naftaleno y 6 Gy TBI (columna central ), y en ratones tratados con naftaleno y 6 Gy TBI y trasplantados con 4 x 106 células pulmonares adultas (columna derecha). Se establecieron diferencias significativas entre los tres grupos mediante el ensayo de Anova (n = 10 en cada grupo). Los diagramas de cajas muestran la distribución completa de los datos. Línea central, mediana; límites de la caja, 25° y 75° percentiles; bigotes, valores mínimos y máximos.

Las figuras 16A-D ilustran el análisis FACS de los progenitores pulmonares en el pulmón adulto. Se recolectaron células pulmonares adultas frescas y se tiñeron para el análisis FACS. Figura 16A) Se resumió el porcentaje promedio de células de cada grupo de la población celular total (n = 3) y se comparó con los resultados del pulmón embrionario del día 16. Figura 16B) Se tiñeron las poblaciones hematopoyéticas y endoteliales, y solo las células CD45- y CD31- se tiñeron también con Ep-Cam, un marcador epitelial para distinguir entre células madre epiteliales (Ep-Cam+CD24+) (figura 16C) y células madre mesenquimáticas (Ep-Cam-SCA-1+) (figura 16D).

Las figuras 17A-G ilustran la diferenciación 3D in vitro de progenitores pulmonares de adulto. Figura 17A) Representación esquemática del cultivo 3D. Figuras 17B-C) Imagen en fase de luz de organoides pulmonares después de 3 semanas en cultivo. Se pueden ver dos tipos principales de organoides: estructuras redondas de tipo bronquiolar rodeadas por una capa mesenquimática gruesa de células (figura 17B), o de tipo alveolar, que consisten principalmente en células epiteliales con forma de globo redondo (figura 17C). Los organoides expresan no solo marcadores epiteliales, tales como citoqueratinas de amplio espectro (figuras 17D-E) y un marcador de células alveolares de tipo I (AQP5) (figura 17F), sino que también exhiben un marcador mesenquimal (nestina) (figuras 17D-E), en el interior de la forma organoide y alrededor de ella (SCA-1) (figura 17G), probablemente desempeñando un papel como células de soporte.

Las figuras 18A-I ilustran diferentes linajes celulares que se encuentran en parches GFP+ derivados del donante. Se utilizó un análisis inmunohistológico para caracterizar la composición de los parches GFP+ derivados del donante. Se utilizó el software Imaris para determinar la colocalización de la fluorescencia. Las áreas GFP+ se establecieron como el área de interés, y el canal de colocalización identificó píxeles que incluían fluorescencia roja (tinción de anticuerpos) y verde (marcaje de células derivadas del donante). Las células epiteliales se tiñeron con anticuerpo de citoqueratina de amplio espectro (figuras 18A-C); las células endoteliales se tiñeron con anticuerpo anti-CD31 (figuras 18D-F); y las células mesenquimáticas se tiñeron con anticuerpo antinestina (figuras 18G-I). En cada figura, el canal rojo representa el marcador de linaje, el canal verde marca las células GFP+ derivadas del donante, y el canal blanco indica la colocalización. Barra de escala = 50 pm.

Las figuras 19A-L ilustran la integración de células derivadas del donante en el compartimento pulmonar epitelial. Se utilizó un análisis inmunohistológico para caracterizar la composición del compartimento epitelial dentro de los parches verdes GFP+ derivados del donante. Se utilizó el software Imaris para determinar la colocalización de la fluorescencia. Las áreas GFP+ fueron designadas como áreas de interés, y el canal de colocalización identificó píxeles que incluían colores rojo y verde. Las células ATI se tiñeron con anticuerpo antiacuaporina de tipo 5 (figuras 19A-C), las células ATII con anticuerpo antiproteína C tensioactiva (figuras 19D-F), las células Club con anticuerpo anti-cCSP (CC16) (figuras 19G-I) y las células CFTR+ con anticuerpo anti-CFTR (figuras 19J-L). En cada figura, el canal rojo representa el marcador de linaje, el canal verde marca las células GFP+ derivadas del donante, y el canal blanco indica la colocalización. Barra de escala = 50 pm.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones.

Los principios y el funcionamiento de la presente invención pueden entenderse mejor con referencia a los dibujos y descripciones adjuntas.

Antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los ejemplos. La invención puede tener otras realizaciones o ser practicada o llevada a cabo de diversas formas. Además, debe entenderse que la fraseología y la terminología empleadas en este documento tienen el propósito de describir y no deben considerarse limitantes.

Mientras estaban reduciendo la presente invención a la práctica, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que el pulmón embrionario canalicular comprende progenitores pulmonares epiteliales, así como un nivel marcado de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) que pueden inducir un quimerismo hematopoyético duradero y de múltiples linajes. Por lo tanto, se puede lograr un trasplante exitoso de células pulmonares (en suspensión) de un donante alogénico no compatible en ausencia de inmunosupresión crónica mediante el trasplante de células de tejido pulmonar que comprenden una cantidad eficaz de HPC.

Como se muestra a continuación y en la sección de ejemplos que sigue, los presentes inventores han descubierto a través de una laboriosa experimentación que el pulmón embrionario canalicular comprende no solo progenitores pulmonares epiteliales, sino también un nivel marcado de HPC que pueden inducir un quimerismo hematopoyético duradero y de múltiples linajes (figuras 1A-F). Estos progenitores hematopoyéticos pulmonares pueden competir eficazmente con las células madre de la médula ósea adultas normales (figuras 2A-D) y pueden utilizarse en escenarios de trasplantes para la inducción de tolerancia inmunitaria. Los presentes inventores han ilustrado además que las células pulmonares adultas frescas pueden inducir quimerismo tanto pulmonar como sanguíneo (figuras 6A-F y figuras 7A-J, respectivamente) similar al obtenido por las células pulmonares fetales E16. Además, se demostró que ciertas células pulmonares fetales expandidas ex vivo (E16) pueden usarse eficazmente para la inducción del quimerismo pulmonar (figuras 8A-F).

Los presentes inventores establecieron un nuevo protocolo de acondicionamiento subletal para el trasplante alogénico de pulmón que comprende el preacondicionamiento del animal receptor con citorreducción de células T in vivo, naftaleno e irradiación corporal total (TBI). A continuación, se administró a los receptores una suspensión unicelular derivada del donante de células pulmonares depuradas de células T, seguida muy de cerca de una inmunosupresión a corto plazo con ciclofosfamida. Este protocolo logró una tolerancia inmunitaria duradera y un quimerismo pulmonar para las células pulmonares embrionarias alogénicas en virtud de las HSC (figuras 4A-L y 5A-F).

Los presentes inventores han ilustrado además que las células pulmonares adultas pueden usarse como una fuente alternativa de tejidos fetales para el trasplante. Específicamente, los presentes inventores han ilustrado que las células pulmonares derivadas del donante comprenden progenitores hematopoyéticos, endoteliales, epiteliales y mesenquimáticos (figuras 16A-D) que se diferencian en tejido pulmonar funcional después del trasplante (figura 15). Tomados en conjunto, los presentes resultados ilustran que el pulmón adulto, obtenido de pulmones cadavéricos o de donantes vivos, puede representar una fuente alternativa adecuada a las células pulmonares fetales para la reparación de lesiones o enfermedades pulmonares en ausencia de inmunosupresión a largo plazo.

Por tanto, según un aspecto de la presente invención, se proporcionan células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión que comprenden una cantidad eficaz de células precursoras hematopoyéticas (HPC) o suplementadas con HPC, en las que la cantidad eficaz es una cantidad suficiente para lograr la tolerancia a las células de tejido pulmonar en ausencia de un régimen inmunosupresor crónico, y en las que dicha cantidad eficaz de dichas HPC comprende al menos aproximadamente 1 x 105 células por kg de peso corporal de un sujeto, para su uso en el tratamiento de un trastorno o lesión pulmonar en un sujeto que lo necesite o para inducir tolerancia específica de donante en un sujeto que necesite un trasplante de células o tejidos pulmonares.

Como se usa en este documento, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, frenar o revertir la progresión de una afección, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.

Como se usa en este documento, el término "sujeto" o la expresión "sujeto que lo necesita" se refiere a un mamífero, preferiblemente un ser humano, hombre o mujer de cualquier edad que sufre o está predispuesto a un daño o deficiencia del tejido pulmonar como resultado de una enfermedad, trastorno o lesión. Normalmente, el sujeto necesita un trasplante de células o tejidos pulmonares (también denominado en este documento receptor) debido a un trastorno o una condición, estado o síndrome patológico o no deseado, o una anomalía física, morfológica o fisiológica que da como resultado la pérdida de la funcionalidad del órgano y que es susceptible de tratamiento mediante trasplante de células o tejidos pulmonares.

Como se usa en el presente documento, la expresión "trastorno o lesión pulmonar" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno, afección o cualquier condición, estado o síndrome patológico o no deseado, o cualquier anomalía física, morfológica o fisiológica que implique una pérdida o deficiencia de células o tejidos pulmonares o una pérdida de función de células o tejidos pulmonares.

Los ejemplos de enfermedades pulmonares, incluyen, pero no se limitan a fibrosis quística (FQ), enfisema, asbestosis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, hipertensión pulmonar, cáncer de pulmón, sarcoidosis, lesión pulmonar aguda (síndrome de insuficiencia respiratoria de adultos), síndrome de insuficiencia respiratoria del prematuro, enfermedad pulmonar crónica del prematuro (displasia broncopulmonar), deficiencia de proteína B tensioactiva, hernia diafragmática congénita, proteinosis alveolar pulmonar, hipoplasia pulmonar, neumonía (por ejemplo, incluida la causada por bacterias, virus u hongos), asma, fibrosis pulmonar idiopática, neumonitis intersticial inespecífica (por ejemplo, la que se presenta con trastornos autoinmunitarios, como lupus, artritis reumatoide o esclerodermia), neumonitis por hipersensibilidad, neumonía organizada criptogénica (COP), neumonitis intersticial aguda, neumonitis intersticial descamativa, asbestosis y lesión pulmonar (por ejemplo, inducida por hipertensión pulmonar por isquemia/reperfusión o lesión pulmonar hiperóxica).

Según una realización, el trastorno o lesión pulmonar comprende inflamación crónica de los pulmones (por ejemplo, una inflamación que dura más de dos semanas).

Los ejemplos de afecciones de inflamación crónica de los pulmones incluyen, pero no se limitan a inflamación crónica de las vías respiratorias, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), cáncer de pulmón, fibrosis quística (FQ), enfermedades pulmonares granulomatosas, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar crónica de prematuridad, neumonitis inducida por radiación, enfermedades pulmonares asociadas con enfermedades sistémicas tales como esclerodermia, lupus, dermatomiositis, sarcoidosis y síndrome de insuficiencia respiratoria neonatal y del adulto.

Según una realización, el sujeto puede beneficiarse del trasplante de células o tejidos pulmonares.

La expresión "células de tejido pulmonar en suspensión" como se usa en este documento se refiere a células que se han aislado de su entorno natural (por ejemplo, el cuerpo humano) y se extraen del tejido pulmonar manteniendo al mismo tiempo la viabilidad, pero no mantienen una estructura de tejido (es decir, una estructura de tejido vascularizado) y no están unidas a un soporte sólido.

La expresión "tejido pulmonar", como se usa en el presente documento, se refiere a un tejido u órgano pulmonar. El tejido pulmonar de la presente invención puede ser un órgano o tejido total o parcial. Por tanto, el tejido pulmonar de la presente invención puede comprender el pulmón derecho, el pulmón izquierdo o ambos. El tejido pulmonar de la presente invención puede comprender uno, dos, tres, cuatro o cinco lóbulos (del pulmón derecho o del izquierdo). Además, el tejido pulmonar de la presente invención puede comprender uno o más segmentos pulmonares o lóbulos pulmonares. Además, el tejido pulmonar de la presente invención puede comprender cualquier número de bronquios y bronquiolos (por ejemplo, árbol bronquial) y cualquier número de alvéolos o sacos alveolares.

Dependiendo de la aplicación, el método puede realizarse usando células de tejido pulmonar que son singénicas o no singénicas con el sujeto.

Como se usa en este documento, la expresión células "singénicas" se refiere a células que fundamentalmente son genéticamente idénticas al sujeto o fundamentalmente a todos los linfocitos del sujeto. Los ejemplos de células singénicas incluyen células derivadas del sujeto (también denominadas en la técnica como "autólogas"), de un clon del sujeto o de un gemelo idéntico del sujeto.

Como se usa en este documento, la expresión células "no singénicas" se refiere a células que fundamentalmente no son genéticamente idénticas al sujeto o fundamentalmente a todos los linfocitos del sujeto, tales como células alogénicas o células xenogénicas.

Como se usa en este documento, el término "alogénico" se refiere a células que se derivan de un donante que es de la misma especie que el sujeto, pero que es sustancialmente no clonal con el sujeto. Típicamente, los mamíferos gemelos no cigóticos, exogámicos de la misma especie son alogénicos entre sí. Se apreciará que una célula alogénica puede ser HLA idéntica, parcialmente HLA idéntica o HLA no idéntica (es decir, mostrar uno o más determinantes HLA dispares) con respecto al sujeto.

Como se usa en este documento, el término "xenogénico" se refiere a una célula que expresa sustancialmente antígenos de una especie diferente en relación con la especie de una proporción sustancial de los linfocitos del sujeto. Normalmente, los mamíferos exogámicos de diferentes especies son xenogénicos entre sí.

La presente invención prevé que las células xenogénicas se deriven de una variedad de especies. Por tanto, según una realización, las células de tejido pulmonar se derivan de cualquier mamífero. La especie originaria adecuada para las células del tejido pulmonar comprende los principales animales domésticos o de ganado y los primates. Dichos animales incluyen, pero no se limitan a porcinos (por ejemplo, cerdo), bovinos (por ejemplo, vaca), equinos (por ejemplo, caballo), ovinos (por ejemplo, cabra, oveja), felinos (por ejemplo, Felis domestica), caninos (por ejemplo, Canis domestica), roedores (por ejemplo, ratón, rata, conejo, cobaya, jerbo, hámster) y primates (por ejemplo, chimpancé, mono rhesus, mono macaco, tití).

Las células de tejido pulmonar de origen xenogénico (por ejemplo, de origen porcino) se obtienen preferiblemente de una fuente que se sabe que está libre de zoonosis, tales como retrovirus endógenos porcinos. De manera similar, las células o tejidos derivados de seres humanos se obtienen preferiblemente de fuentes sustancialmente libres de patógenos.

Según una realización, las células de tejido pulmonar no son singénicas con el sujeto.

Según una realización, las células de tejido pulmonar son alogénicas con el sujeto.

Según una realización, las células de tejido pulmonar son xenogénicas con el sujeto.

Según una realización de la presente invención, el sujeto es un ser humano y las células del tejido pulmonar son de origen mamífero (por ejemplo, alogénicas o xenogénicas).

Según una realización de la presente invención, el sujeto es un ser humano y las células del tejido pulmonar son de origen humano (por ejemplo, singénicas o no singénicas).

Según una realización, el sujeto es un ser humano y las células del tejido pulmonar son de origen xenogénico (por ejemplo, de origen porcino).

Dependiendo de la aplicación y de las fuentes disponibles, las células para un uso según la presente invención pueden obtenerse de un organismo prenatal, un organismo postnatal, un adulto o un donante cadáver. Tales determinaciones están dentro de la capacidad de un experto en la técnica.

Se apreciará que las células de tejido pulmonar pueden ser preparaciones frescas o congeladas (por ejemplo, crioconservadas), como se analiza más adelante.

Según una realización, las células de tejido pulmonar son de origen embrionario (por ejemplo, correspondientes a una gestación humana de una a ocho semanas después de la fertilización).

Según una realización, las células de tejido pulmonar son de origen fetal (por ejemplo, correspondientes a la gestación humana que comienza nueve semanas después de la fertilización).

Según una realización, las células de tejido pulmonar son de origen adulto (por ejemplo, un organismo mamífero en cualquier estadio después del nacimiento).

Por consiguiente, el organismo embrionario o fetal puede ser de cualquier origen humano o xenogénico (por ejemplo, porcino) y encontrarse en cualquier estadio de la gestación. Tal determinación está dentro de la capacidad de un experto en la técnica.

Pueden emplearse varios métodos para obtener un órgano o tejido de un organismo embrionario o fetal. Así, por ejemplo, la obtención de un tejido pulmonar puede efectuarse recolectando el tejido de un feto en desarrollo, por ejemplo, mediante un procedimiento quirúrgico.

Según una realización, el tejido pulmonar (es decir, tejido de pulmón) se obtiene de un feto en un estadio de gestación correspondiente a la etapa de desarrollo canalicular humano (por ejemplo, 16-25 semanas de gestación). Según una realización, el tejido pulmonar se obtiene de un feto en un estadio de gestación correspondiente a las 16-17 semanas de gestación humana, 16-18 semanas de gestación, 16-19 semanas de gestación, 16-20 semanas de gestación, 16­ 21 semanas de gestación, 16-22 semanas de gestación, 16-24 semanas de gestación, 17-18 semanas de gestación, 17-19 semanas de gestación, 17-20 semanas de gestación, 17-21 semanas de gestación, 17-22 semanas de gestación, 17-24 semanas de gestación, 18-19 semanas de gestación, 18-20 semanas de gestación, 18-21 semanas de gestación, 18-22 semanas de gestación, 18-24 semanas de gestación, 19-20 semanas de gestación, 19-21 semanas de gestación, 19-22 semanas de gestación, 19-23 semanas de gestación, 19-24 semanas de gestación, 20­ 21 semanas de gestación, 20-22 semanas de gestación, 20-23 semanas de gestación, 20-24 semanas de gestación, 21-22 semanas de gestación, 21-23 semanas de gestación, 21-24 semanas de gestación, 22-23 semanas de gestación, 22-24 semanas de gestación, 22-25 semanas de gestación, 23-24 semanas de gestación, 23-25 semanas de gestación, 24-25 semanas de gestación o 25-26 semanas de gestación.

Según una realización específica, el tejido pulmonar se obtiene de un feto en un estadio de gestación correspondiente a las 20-22 semanas de gestación humana.

Según una realización específica, el tejido pulmonar se obtiene de un feto en un estadio de gestación correspondiente a los 21-22 días de gestación humana.

Según una realización específica, el tejido pulmonar se obtiene de un feto en un estadio de gestación correspondiente a los 20-21 días de gestación humana.

Los expertos en la técnica entenderán que el estadio gestacional de un organismo es el período de tiempo transcurrido después de la fertilización del ovocito que genera el organismo. La siguiente tabla proporciona un ejemplo de los estadios gestacionales de los tejidos humanos y porcinos en los que estos pueden proporcionar tejidos fetales que se encuentran esencialmente en los correspondientes estadios de desarrollo:

Tabla 1: Estadios gestacionales correspondientes de cerdos y humanos

El estadio gestacional (en días) de un tejido perteneciente a una especie determinada que se encuentra en un estadio de desarrollo que se corresponde esencialmente con el de un tejido porcino se puede calcular de acuerdo con la siguiente fórmula: [estadio gestacional del tejido porcino en días]/[periodo gestacional del cerdo en días] x [estadio gestacional del tejido de una especie determinada en días]. De manera similar, el estadio gestacional (en días) de un tejido perteneciente a una especie determinada que se encuentra en un estadio de desarrollo que se corresponde esencialmente con el de un tejido humano puede calcularse de acuerdo con la siguiente fórmula: [estadio gestacional del tejido humano en días]/[período gestacional de los seres humanos en días] x [estadio gestacional del tejido de una especie determinada en días]. El estadio gestacional de los cerdos es de unos 115 días y el de los humanos de unos 280 días. * para el cálculo de la semana, dividir los números entre 7.

Asimismo, se pueden emplear varios métodos para obtener un órgano o tejido pulmonar de un organismo adulto (por ejemplo, vivo o cadáver). Así, por ejemplo, la obtención de un tejido pulmonar puede efectuarse recolectando el tejido de un donante de órganos mediante un procedimiento quirúrgico, por ejemplo, laparotomía o laparoscopia. Después de que el órgano/tejido se obtiene del organismo adulto, las células de tejido pulmonar, así como las células progenitoras hematopoyéticas (como se analiza en detalle a continuación), pueden aislarse del mismo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, y dichos métodos dependen de la fuente y linaje del células y pueden incluir, por ejemplo, citometría de flujo y clasificación de células como se indica, por ejemplo, en www.bio-rad.com/enuk/applications-technologies/isolation-maintenance-stem-cells.

Se apreciará que, para obtener células de tejido pulmonar, el tejido pulmonar no necesita estar intacto (es decir, mantener una estructura de tejido que sea adecuada para un trasplante de órgano completo), sin embargo, el tejido pulmonar debe comprender células viables.

Después de que se obtiene un órgano/tejido pulmonar (por ejemplo, tejido fetal o adulto), la presente invención contempla además la generación de una población aislada de células a partir del mismo.

Por tanto, las células de tejido pulmonar pueden estar comprendidas en una suspensión de células individuales o agregados de células de no más de 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000 células en un agregado.

La suspensión celular de la invención puede obtenerse por cualquier medio mecánico o químico (por ejemplo, enzimático). Existen varios métodos para disociar grupos de células para formar suspensiones de células (por ejemplo, suspensión de células individuales) a partir de tejidos primarios, células adheridas en cultivo y agregados, por ejemplo, fuerzas físicas (disociación mecánica, tal como un raspador de células, trituración a través de una pipeta de calibre estrecho, aspiración con aguja fina, disgregación en vórtice y filtración forzada a través de una malla fina de nailon o de acero inoxidable), enzimas (disociación enzimática, tal como con tripsina, colagenasa, acutasa y similares) o una combinación de ambas.

Así, por ejemplo, la digestión enzimática de un tejido/órgano en células aisladas se puede realizar sometiendo el tejido a una enzima, tal como colagenasa de tipo IV (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ, EE. UU.) y/o dispasa (productos de Invitrogen Corporation, Grand Island NY, EE. UU.). Por ejemplo, el tejido puede ser digerido con enzimas picando finamente el tejido con una hoja de afeitar en presencia, por ejemplo, de colagenasa, dispasa y CaCl2 a 37 °C durante aproximadamente 1 hora. El método puede comprender además la eliminación de desechos no específicos de la suspensión celular resultante, por ejemplo, mediante filtración secuencial a través de filtros (por ejemplo, filtros de 70 y 40 gm), esencialmente como se describe en "Materiales generales y métodos experimentales" de la sección de ejemplos que sigue.

Además, la disociación mecánica de un tejido en células aisladas se puede realizar utilizando un dispositivo diseñado para disgregar el tejido a un tamaño predeterminado. Un dispositivo de este tipo se puede obtener de CellArtis Goteborg, Suecia. Como alternativa o, además, la disociación mecánica se puede realizar manualmente usando una aguja, tal como una aguja 27g (BD Microlance, Drogheda, Irlanda) mientras se observan los tejidos/células bajo un microscopio invertido.

Después de la disociación enzimática o mecánica del tejido, las células disociadas se disgregan aún más en pequeños grupos utilizando puntas de pipeta Gilson de 200 gl (por ejemplo, pipeteando hacia arriba y hacia abajo las células).

Según una realización, las células para su uso según la presente invención pueden modificarse genéticamente antes del trasplante.

También se puede obtener un tejido pulmonar en un estadio de desarrollo deseado mediante cultivo de células, órganos/tejidos in vitro. Esta diferenciación de células, tejidos u órganos controlada in vitro se realiza de forma rutinaria, por ejemplo, usando el cultivo de líneas de células madre embrionarias para generar cultivos que contienen células/tejidos/órganos de linajes deseados. Por ejemplo, para la generación de linajes pulmonares, consúltese, por ejemplo, Otto W.R., 1997, Int. J. Exp. Pathol., 78:291-310.

Según una realización, las células se diferencian ex vivo a partir de células madre adultas o células madre pluripotentes (por ejemplo, desdiferenciadas), tales como células madre embrionarias (células ME) o iPS.

La expresión "células madre embrionarias" o "células ME" se refiere a células embrionarias que son capaces de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias. (es decir, endodermo, ectodermo y mesodermo), o permanecer en un estado indiferenciado. La expresión "células madre embrionarias" puede comprender células que se obtienen del tejido embrionario formado después de la gestación (por ejemplo, blastocisto) antes de la implantación del embrión (es decir, un blastocisto de preimplantación), células de blastocisto extendidas (“extended blastocyst cells”, EBC) que se obtienen de un blastocisto en estadio de posimplantación/pregastrulación (ver el documento WO2006/040763), células germinales embrionarias (EG) que se obtienen del tejido genital de un feto en cualquier momento durante la gestación, preferiblemente antes de las 10 semanas de gestación, y células originadas de un óvulo no fertilizado que son estimuladas por partenogénesis (partenotes).

Las células madre embrionarias (por ejemplo, ESC humanas) que se originan a partir de un óvulo no fertilizado estimulado por partenogénesis (partenotes) son conocidas en la técnica (por ejemplo, Zhenyu Lu et al., 2010, J. Assist Reprod. Genet., 27:285-291, "Derivation and long-term culture of human parthenogenetic embryonic stem cells using human foreskin feeders", que se incorpora en su totalidad a la presente como referencia). La partenogénesis se refiere al inicio de la división celular mediante la activación de óvulos en ausencia de espermatozoides, por ejemplo, mediante estimulación eléctrica o química. El óvulo activado (partenote) es capaz de convertirse en una estructura embrionaria primitiva (llamada blastocisto) pero no puede desarrollarse hasta el término ya que las células son pluripotentes, lo que significa que no pueden desarrollar los tejidos extraembrionarios necesarios (como el líquido amniótico) necesarios para un feto humano viable.

Otro método para preparar células madre embrionarias se describe en Chung et al., Cell Stem Cell, volumen 2, número 2, 113-117, 7 de febrero de 2008. Este método comprende la extracción de una sola célula de un embrión durante un proceso de fertilización in vitro. El embrión no se destruye en este proceso.

Las células madre pluripotentes inducidas (“induced pluripotent stem cells”, iPS; células madre de tipo embrionario) son células obtenidas por desdiferenciación de células somáticas adultas que están dotadas de pluripotencia (es decir, son capaces de diferenciarse en las tres capas de células germinales embrionarias, es decir, endodermo, ectodermo y mesodermo). Según algunas realizaciones de la invención, dichas células se obtienen de un tejido diferenciado (por ejemplo, un tejido somático como la piel) y se desdiferencian mediante manipulación genética, que reprograma la célula para adquirir características de células madre embrionarias. Según algunas realizaciones de la invención, las células madre pluripotentes inducidas se forman induciendo la expresión de Oct-4, Sox2, Kfl4 y/o c-Myc en una célula madre somática.

Según una realización, las células madre pluripotentes no son el resultado de la destrucción del embrión.

La expresión "células madre adultas" (también llamadas "células madre de tejido" o una célula madre procedente de un tejido somático) se refiere a cualquier célula madre derivada de un tejido somático [de un animal postnatal o prenatal (especialmente el ser humano)]. Generalmente se piensa que la célula madre adulta es una célula madre multipotente, capaz de diferenciarse en múltiples tipos de células. Las células madre adultas pueden derivarse de cualquier tejido adulto, neonatal o fetal, tal como tejido adiposo, piel, riñón, hígado, próstata, páncreas, intestino, médula ósea y placenta.

Las células madre embrionarias cultivadas se pueden diferenciar en células de linaje de desarrollo restringido (por ejemplo, células de tejido pulmonar).

La diferenciación de las células madre puede iniciarse permitiendo el crecimiento excesivo de células ME humanas indiferenciadas en cultivos en suspensión que forman cuerpos embrioides o cultivando células ME en placas en condiciones que estimulan la diferenciación de una manera particular.

Se apreciará que las condiciones de cultivo adecuadas para la diferenciación y la expansión de las células específicas de linaje aisladas incluyen varios medios de cultivo de tejidos, factores de crecimiento, antibióticos, aminoácidos y similares, y está dentro de la capacidad de un experto en la técnica determinar qué condiciones deben aplicarse para expandir y diferenciar tipos de células y/o linajes celulares concretos [analizado en Fijnvandraat A.C. etal., Cardiovasc. Res., 2003, 58:303-12; Sachinidis A. et al., Cardiovasc. Res., 2003, 58:278-91; Stavridis M.P. y Smith A.G., 2003; Biochem. Soc. Trans., 31 (Pt. 1):45-9].

También se ha inducido a las células madre pluripotentes humanas a diferenciarse en células progenitoras de pulmón y vías respiratorias [Huang et al., Nature Protocols, 10, 413-425 (2015)]. Por lo tanto, las células madre pueden cultivarse en presencia de altas concentraciones de activina A. Posteriormente, se especifica el endodermo del intestino anterior (“anterior foregut endoderm”, AFE) sesgado hacia los pulmones mediante la inhibición secuencial de la proteína morfogenética ósea (“bone morphogenetic protein”, BMP), el factor de crecimiento transformante-p (TGF-p) y la señalización de Wnt. A continuación, el AFE se ventraliza aplicando señales de Wnt, BMP, factor de crecimiento de fibroblastos (“fibroblast growth factor”, FGF) y ácido retinoico (RA) para obtener progenitores de pulmón y vías respiratorias.

La diferenciación de células madre también puede estar dirigida por modificación genética. Por ejemplo, se demostró que la expresión de cuatro factores, GATA-4 TBX5, NKX2.5 y BAF60c, induce la diferenciación de hESC en progenitores cardíacos [Dixon et al., Molecular Therapy (2011), 199, 1695-1703].

Seguimiento del estadio de diferenciación de las células madre embrionarias

Durante la etapa de cultivo, las células madre se controlan también para determinar su estadio de diferenciación. La diferenciación celular se puede determinar mediante el examen de marcadores específicos de célula o de tejido que se sabe que son indicativos de diferenciación. Por ejemplo, las células madre embrionarias de primates pueden expresar el antígeno embrionario específico de estadio (“stage-specific embryonic antigen”, SSEA) 4, el antígeno que rechaza el tumor (“tumor-rejecting antigen”, TRA)-1 -60 y TRA-1 -81.

Los marcadores específicos de tejido/célula se pueden detectar usando técnicas inmunológicas bien conocidas en la técnica [Thomson J.A. et al., (1998), Science, 282:1145-7]. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a citometría de flujo para marcadores unidos a membrana, inmunohistoquímica para marcadores extracelulares e intracelulares e inmunoensayo enzimático, para marcadores moleculares secretados.

La determinación de la diferenciación de células ME también se puede realizar mediante mediciones de la actividad fosfatasa alcalina. Las células madre embrionarias humanas indiferenciadas tienen actividad fosfatasa alcalina que puede detectarse fijando las células con paraformaldehído al 4% y revelando con el kit de sustrato Vector Red según las instrucciones del fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, California, EE. UU.).

Se puede controlar la pluripotencia de las células madre embrionarias in vitro mediante la formación de cuerpos embrioides (“embryioid bodies”, EB), así como in vivo a través de la formación de teratomas.

Teratomas

La capacidad pluripotente de la línea de células ME también puede confirmarse inyectando células en ratones SCID [Evans M.J. y Kaufman M. (1983), Pluripotental cells grown directly from normal mouse embryos, Cancer Surv., 2:185-208], que al inyectarse forman teratomas. Los teratomas se fijan con paraformaldehído al 4% y se examinan histológicamente en busca de las tres capas germinales. (es decir, endodermo, mesodermo y ectodermo).

Además de controlar un estadio de diferenciación, las células madre a menudo también se controlan para el cariotipo, con el fin de verificar la euploidía citológica, en la que todos los cromosomas están presentes y no se alteran de forma detectable durante el cultivo. Las células madre cultivadas se pueden cariotipificar usando una tinción Giemsa convencional y se pueden comparar con cariotipos publicados de las especies correspondientes.

Según la presente invención, la suspensión celular de células de tejido pulmonar comprende células viables. La viabilidad celular se puede controlar usando cualquier método conocido en la técnica, como, por ejemplo, usando un ensayo de viabilidad celular (por ejemplo, ensayo MultiTox Multiplex disponible de Promega), citometría de flujo, azul de tripano, etc.

Normalmente, las células de tejido pulmonar se utilizan inmediatamente para el trasplante. Sin embargo, en situaciones en las que las células deben mantenerse en suspensión antes del trasplante, por ejemplo, durante 1-12 horas, las células pueden cultivarse en un medio de cultivo que sea capaz de mantener su viabilidad. Dicho medio de cultivo puede ser un medio a base de agua que incluye una combinación de sustancias como sales, nutrientes, minerales, vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, proteínas, tales como citoquinas, factores de crecimiento y hormonas, todos los cuales son necesarios para mantener las células del tejido pulmonar en un estado viable. Por ejemplo, un medio de cultivo de acuerdo con este aspecto de la presente invención puede ser un medio de cultivo de tejidos sintético, tal como RPMI-1640 (Life Technologies, Israel), Ko-DMEM (productos de Gibco-Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, EE. UU.) , DMEM/F12 (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), medio Mab ADCB (HyClone, Utah, EE. UU.) O DMEM/F12 (Biological Industries, Biet Haemek, Israel) complementado con los aditivos necesarios. Preferiblemente, todos los ingredientes incluidos en el medio de cultivo de la presente invención son sustancialmente puros, con una calidad de cultivo de tejidos.

Las células de tejido pulmonar también se pueden conservar en condiciones apropiadas (típicamente mediante congelación) para mantener las células (por ejemplo, células de tejido pulmonar) vivas y funcionando para su uso en trasplantes. Según una realización, las células de tejido pulmonar se conservan como poblaciones crioconservadas. Otros métodos de conservación se describen en las patentes de EE. UU. n.os 5.656.498, 5.004.681, 5.192.553, 5.955.257, y 6.461.645. Se describen métodos para conservar en bancos células madre, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2003/0215942.

Las células de tejido pulmonar también se pueden expandir, por ejemplo, ex vivo. El término "expandido" se refiere a aumentar el número de células mediante la proliferación en al menos aproximadamente 2 veces, 4 veces, 10 veces, 20 veces, 40 veces, 80 veces, 120 veces, 140 veces o más durante un intervalo de tiempo dado (y en comparación con las células no expandidas).

Según una realización, las células de tejido pulmonar se expanden en cultivo (por ejemplo, expandido ex vivo) a partir de células adultas (por ejemplo, células pulmonares adultas).

Según una realización, las células de tejido pulmonar se expanden en cultivo (por ejemplo, expandido ex vivo) a partir de células fetales (por ejemplo, células pulmonares fetales). Las células fetales pueden tener una edad gestacional como se analizó anteriormente (por ejemplo, 14-22 semanas, por ejemplo, 15-16 semanas, de gestación humana).

Así, por ejemplo, las células de tejido pulmonar pueden obtenerse de un tejido fetal (por ejemplo, tejido de pulmón fetal) y cultivarse en placas de cultivo de tejidos en presencia de un medio celular (por ejemplo, medio de soporte, por ejemplo, iMEF) y opcionalmente con factores de crecimiento adicionales y/o citoquinas (por ejemplo, factor de crecimiento epitelial e inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK)) durante varios días (por ejemplo, 7-14 días, tal como 9 días), hasta que se obtenga un número adecuado de células. La medición del número de células (por ejemplo, células viables) se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido por un experto en la técnica, por ejemplo, mediante una cámara de recuento, mediante análisis FACS o mediante un espectrofotómetro. Se pueden encontrar más protocolos para el cultivo celular y la expansión, por ejemplo, en Liu X. et al., Am. J. Pathol. (2012), 180(2):599-607; Palechor-Ceron N. et al., Am. J. Pathol. (2013), 183(6):1862-18; Zhang L. et al., PLoS One (2011), 6(3): e18271; Terunuma A. et al., Tissue Eng. Part A. (2010), 16(4):1363-8; y Bhandary L. et al., Oncotarget. (2015), 6(8):6251-66, todos los cuales se incorporan en la presente como referencia.

Las células de tejido pulmonar pueden comprender células obtenidas de más de un donante de células.

Según una realización, las células de tejido pulmonar están depuradas de células T.

Como se usa en el presente documento, la expresión "depuradas de células T" se refiere a una población de células de tejido pulmonar que están depuradas de linfocitos T. Las células del tejido pulmonar depuradas de células T pueden estar depuradas de células CD3+, células CD2+, células CD8+, células CD4+, células T a/p y/o células T y/5.

Según una realización, las células del tejido pulmonar están depuradas de células T CD3+.

Según una realización, las células de tejido pulmonar depuradas de células T comprenden menos de 50 x 105 células T CD3+, 40 x 105 células T CD3+, 30 x 105 células T CD3+, 20 x 105 células T CD3+, 15 x 105 células T CD3+, 10 x 105 células T CD3+, 9 x 105 células T CD3+, 8 x 105 células T CD3+, 7 x 105 células T CD3+, 6 x 105 células T CD3+, 5 x 105 células T CD3+, 4 x 105 células T CD3+, 3 x 105 células T c D3+, 2 x 105 células T c D3+, 1 x 105 células T CD3+ o 5 x 104 células T CD3+por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, las células del tejido pulmonar depuradas de células T comprenden menos de 1 x 105 células T CD3+ por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según una realización, las células del tejido pulmonar están depuradas de células CD8+.

Según una realización, las células de tejido pulmonar depuradas de células T comprenden menos de 50 x 105 células CD8+, 25 x 105 células CD8+, 15 x 105 células CD8+, 10 x 105 células CD8+, 9 x 105 células CD8+, 8 x 105 células CD8+, 7 x 105 células CD8+, 6 x 105 células CD8+, 5 x 105 células CD8+, 4 x 105 células CD8+, 3 x 105 células CD8+, 2 x 105 células CD8+, 1 x 105 células CD8+, 9 x 104 células CD8+, 8 x 104 células CD8+, 7 x 104 células CD8+, 6 x 104 células CD8+, 5 x 104 células CD8+, 4 x 104 células CD8+, 3 x 104 células CD8+, 2 x 104 células CD8+ o 1 x 104 células CD8+ por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según una realización, las células de tejido pulmonar están depuradas de células B.

Según una realización, las células del tejido pulmonar están depuradas de células B (células B CD19+ y/o CD20+).

Según una realización, las células de tejido pulmonar comprenden menos de 50 x 105 células B, 40 x 105 células B, 30 x 105 células B, 20 x 105 células B, 10 x 105 células B, 9 x 105 células B, 8 x 105 células B, 7 x 105 células B, 6 x 105 células B, 5 x 105 células B, 4 x 105 células B, 3 x 105 células B, 2 x 105 células B o 1 x 105 células B por kilogramo de peso corporal del sujeto.

La depuración de las células T, por ejemplo, células CD3+, CD2+, TCRa/p+, CD4+ y/o CD8+, o células B, por ejemplo células CD19 y/o CD20+, puede llevarse células a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, tal como por erradicación (por ejemplo, muerte) con anticuerpos específicos o por purificación basada en afinidad, por ejemplo, mediante el uso de técnicas de separación de células magnéticas, clasificador FACS y/o marcaje con ELISA de captura.

Tales métodos se describen en la presente y en The Handbook of Experimental Immunology, volúmenes 1 a 4 (D.N. Weir, editor) y Flow cytometry and cell sorting (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 1992). Por ejemplo, las células se pueden clasificar, por ejemplo, mediante citometría de flujo o FACS. Por tanto, puede usarse la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y esta puede tener grados variables de canales de color, canales de detección de dispersión de luz obtusos y de ángulo bajo, y canales de impedancia. Se puede usar cualquier técnica de separación dependiente de ligando conocida en la técnica junto con técnicas de separación tanto positivas como negativas que se basan en las propiedades físicas de las células en lugar de la afinidad del anticuerpo, que incluyen, pero no se limitan a elutriación y centrifugación en gradiente de densidad.

Otros métodos para la clasificación de células incluyen, por ejemplo, inmunoadsorción y separación usando técnicas de afinidad, incluidas aquellas técnicas que usan soportes sólidos, tales como placas, esferas y columnas. Por tanto, las muestras biológicas pueden separarse mediante "inmunoadsorción" con un anticuerpo unido a una matriz sólida, por ejemplo, a una placa.

Como alternativa, las células pueden clasificarse/separarse mediante técnicas de separación magnética, y algunos de estos métodos utilizan esferas magnéticas. Hay diferentes esferas magnéticas disponibles de varias fuentes, que incluyen, por ejemplo, Dynal (Noruega), Advanced Magnetics (Cambridge, MA, EE. UU.), Immuncon (Filadelfia, Ee . UU.), Immunotec (Marsella, Francia), Invitrogen, Stem Cell Technologies (EE. UU.) y Cellpro (EE. UU.). Como alternativa, los anticuerpos pueden biotinilarse o conjugarse con digoxigenina y usarse junto con columnas de afinidad revestidas con avidina o antidigoxigenina.

Según una realización, se pueden combinar diferentes métodos de depuración/separación, por ejemplo, la clasificación de células magnética se puede combinar con FACS, para aumentar la calidad de la separación o para permitir la clasificación por múltiples parámetros.

Según una realización, las células de tejido pulmonar depuradas de células T se obtienen mediante citorreducción de células T (TCD).

La citorreducción de células T se puede efectuar usando anticuerpos, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-CD8, anticuerpos anti-CD4, anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD2, anticuerpos anti-TCRa/p y/o anticuerpos anti-TCRy/5.

Según una realización, la depuración de las células B se efectúa mediante la citorreducción de células B.

La citorreducción de células B puede efectuarse usando anticuerpos, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-CD 19 o anti-CD20. Como alternativa, se puede lograr la depuración in vivo de células B mediante la infusión de anticuerpos anti-CD20.

Se puede efectuar la citorreducción de células T o B in vitro o in vivo (por ejemplo, en un donante antes de adquirir las células de tejido pulmonar del mismo).

Las células de tejido pulmonar para su uso según la invención comprenden típicamente una población heterogénea de células.

Por tanto, las células de tejido pulmonar pueden comprender cualquiera de células progenitoras hematopoyéticas, células progenitoras epiteliales, células progenitoras mesenquimáticas y/o células progenitoras endoteliales.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de citoqueratina 5+ (CK5+).

Según una realización, las células comprenden la expresión de los marcadores de citoqueratina 5+ (CK5+) y citoqueratina 14+ (CK14+).

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de c-Kit+ CD45- CD34-.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de c-Kit+ CD45- CD34- CD31- CD326-CD271-.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de c-Kit+ CD34+.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de c-Kit+ CD34+ CD31+.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de c-Kit+ CD34+ CD326+.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de CD34+ CD31 CD14+ CD45+. Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de CD34+ CD31+ CD45- CD105+. Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de CD31+ (por ejemplo, las células son células progenitoras endoteliales).

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de CD31+ CD144+.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de CD31+ CD146+.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de CK+ (por ejemplo, las células son células progenitoras epiteliales).

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de SOX9+.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de SOX2+.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de NKX2.1.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de mucina+ podoplanina+.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de Epcam+ CD24+ SCA1 .

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de Epcam+ CD24+ SCAl-.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de Epcam+ CD24+ podoplanina+ Scal+. Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de nestina+ (por ejemplo, las células son células progenitoras mesenquimales).

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de proteína relacionada con el gen de la calcitonina+ (CGRP+).

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de alfa actina de músculo liso+ (alfa-SMA+).

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de vimentina+.

Según una realización específica, las células son células progenitoras hematopoyéticas.

Según una realización, las células comprenden la expresión de un marcador de CD45+ (por ejemplo, células progenitoras hematopoyéticas).

Según una realización específica, las células progenitoras hematopoyéticas son células LSK que comprenden la expresión de un marcador de Lin- Sca-1+ c-kit+.

Según una realización específica, las células progenitoras hematopoyéticas son células de molécula de activación linfocítica de señalización (SLAM) que comprenden la expresión de un marcador de CD41- CD48- CD150+ de linaje negativo.

Según una realización, cada una de las poblaciones de células mencionadas anteriormente puede purificarse a partir del tejido pulmonar. Según una realización específica, cada una de las poblaciones de células mencionadas anteriormente puede tener una purificación de aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%.

La purificación de tipos de células específicos puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, como por ejemplo, mediante purificación basada en afinidad (por ejemplo, mediante el uso de esferas MACS, clasificador FACS y/o marcaje con ELISA de captura) usando anticuerpos específicos que reconocen cualquiera de los marcadores celulares descritos anteriormente (por ejemplo, CK5, CK14, c-Kit, Lin, Sca-1, CD31, CD34, CD41, CD45, CD48, CD105, CD150, CD271, CD326, etc.).

Según una realización de la presente invención, la suspensión celular comprende una mezcla no purificada de células de tejido pulmonar.

Según otra realización, las células de tejido pulmonar en suspensión comprenden una población de células pulmonares específica de tipo celular (por ejemplo, células de tejido pulmonar depuradas de células T y/o HPC). El aislamiento de dichas células puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, como, por ejemplo, mediante purificación basada en afinidad (por ejemplo, mediante el uso de esferas MACS, clasificador FACS y/o marcaje con ELISA de captura, como se mencionó anteriormente) o por erradicación (por ejemplo, muerte) de células no deseadas con anticuerpos específicos dirigidos a las mismas.

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar en suspensión comprenden una cantidad eficaz de células precursoras hematopoyéticas (HPC).

Como se usa en este documento, la expresión "células precursoras hematopoyéticas" o "HPC" se refiere a una preparación celular que comprende células hematopoyéticas inmaduras. Tal preparación de células incluye o se deriva de una muestra biológica, por ejemplo, tejido pulmonar (por ejemplo, tejido fetal o adulto), médula ósea (por ejemplo, médula ósea depurada de células T), sangre periférica movilizada (por ejemplo, movilización de células CD34+ para mejorar su concentración), sangre de cordón (por ejemplo, cordón umbilical), hígado fetal, saco vitelino y/o placenta.

Como alternativa o además, pueden usarse células CD34+ purificadas u otras células madre hematopoyéticas, tales como células CD131+, de acuerdo con algunas realizaciones de las presentes indicaciones, con o sin la expansión ex vivo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "una cantidad eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para lograr la tolerancia a las células del tejido pulmonar en ausencia de un régimen inmunosupresor crónico.

Como se usa en este documento, el término "tolerancia" se refiere a una condición en la que hay una menor capacidad de respuesta de las células del receptor (por ejemplo, células T del receptor) cuando entran en contacto con las células del donante (por ejemplo, HPC del donante), en comparación con la capacidad de respuesta de las células del receptor en ausencia de dicho método de tratamiento.

La inducción de tolerancia permite el trasplante de un injerto celular o de tejido (por ejemplo, células de tejido pulmonar) con un riesgo reducido de rechazo del injerto o enfermedad del injerto contra el huésped (EICH).

Sin ceñirse a la teoría, la tolerancia hacia las HPC del donante, en el receptor, conduce a una tolerancia central (por ejemplo, por selección negativa en el timo), lo que resulta en tolerancia hacia las células del tejido pulmonar y la obtención de un tejido quimérico (es decir, un tejido que comprende células tanto del donante como del receptor).

Como se mencionó, las HPC inducen tolerancia específica de donante y superan la necesidad de utilizar un régimen inmunosupresor crónico.

Como se usa en este documento, la expresión "régimen inmunosupresor crónico" se refiere a la administración de una terapia inmunosupresora durante un período prolongado de tiempo después del trasplante (es decir, postrasplante), por ejemplo, durante más de 2 semanas, un mes, dos meses, 6 meses, 12 meses, 2 años, 5 años o más.

Una cantidad eficaz de HPC normalmente comprende al menos aproximadamente 1 x 105-10 x 107 células por kg de peso corporal del sujeto.

Según una realización, las HPC comprenden un intervalo de dosis de aproximadamente 1-5 x 105, 1-10 x 105, 1 -50 x

105, 1-100 x 105, 5-10 x 105, 5-20 x 105, 5-30 x 105, 5-40 x 105, 5-50 x 105, 5-60 x 105, 5-70 x 105, 5-80 x 105, 5-90 x

105, 5-100 x 105, 10-20 x 105, 10-30 x 105, 10-40 x 105, 10-50 x 105, 10-60 x 105, 10-70 x 105, 10-80 x 105, 10-90 x 105,

10-100 x 105, 50-60 x 105, 50-70 x 105, 50-80 x 105, 50-90 x 105, 50-100 x 105, 1-5 x 106, 1-10 x 106, 5-10 x 106, 5-20 x 106, 5-30 x 106, 5-40 x 106, 5-50 x 106, 5-60 x 106, 5-70 x 106, 5-80 x 106, 5-90 x 106, 5-100 x

106, 10-20 x 106, 10-30 x 106, 10-40 x 106, 10-50 x 106, 10-60 x 106, 10-70 x 106, 10-80 x 106, 10-90 x 106, 10-100 x

106, 50-60 x 106, 50-70 x 106, 50-80 x 106, 50-90 x 106, 50-100 x 106, 1-5 x 107, 1-10 x 107, 1-50 x 107, 1-100 x 1075­

10 x 107, 5-20 x 107, 5-30 x 107, 5-40 x 107, 5-50 x 107, 5-60 x 107, 5-70 x 107, 5-80 x 107, 5-90 x 107, 5-100 x 107, 10­

20 x 107, 10-30 x 107, 10-40 x 107, 10-50 x 107, 10-60 x 107, 10-70 x 107, 10-80 x 107, 10-90 x 107, 10-100 x 10750-60 x 107, 50-70 x 107, 50-80 x 107, 50-90 x 107 o 50-100 x 107 células por kg de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, las HPC comprenden un intervalo de dosis de aproximadamente 1-10 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, las HPC comprenden un intervalo de dosis de aproximadamente 5-30 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto.

Según una realización, las HPC comprenden al menos aproximadamente 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 10 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 10 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 10 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108 o 10 x 108 células por kg de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, las HPC comprenden al menos aproximadamente 0,1 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, las HPC comprenden al menos aproximadamente 1 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, las HPC comprenden al menos aproximadamente 5 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, las HPC comprenden al menos aproximadamente 10 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto.

Según una realización, las HPC comprenden al menos aproximadamente 0,01 -0,5% de las células de tejido pulmonar en suspensión.

Según una realización, las HPC comprenden al menos aproximadamente 0,01-1% de las células de tejido pulmonar en suspensión.

Según una realización, las HPC comprenden al menos aproximadamente 0,01-10% de células de tejido pulmonar en suspensión.

Para aumentar la tolerancia, las células de tejido pulmonar en suspensión se pueden complementar con HPC. Según una realización, las HPC y las células de tejido pulmonar se obtienen del mismo tejido (es decir, de un tejido pulmonar de un feto o de un donante adulto).

Según una realización, las HPC y las células de tejido pulmonar se obtienen del mismo donante (por ejemplo, donante no singénico).

Según una realización, las HPC y las células de tejido pulmonar se obtienen de diferentes donantes (por ejemplo, de dos donantes no singénicos que comparten la identidad de HLA).

Según una realización, las células de tejido pulmonar y las HPC se administran en la misma formulación.

Según otra realización, las células de tejido pulmonar y las HPC se administran en formulaciones separadas.

En los casos en los que se administran formulaciones separadas, las HPC se pueden administrar antes, concomitantemente o después de la administración de las células de tejido pulmonar.

En consecuencia, las HPC y las células de tejido pulmonar se pueden administrar juntas, el mismo día, en días posteriores o incluso separadas por unos pocos días (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 14 días de diferencia). La administración de las células de tejido pulmonar en suspensión y/o HPC al sujeto puede efectuarse de numerosas formas, dependiendo de varios parámetros, tales como, por ejemplo, el tipo, estadio o gravedad de la enfermedad a tratar, los parámetros físicos o fisiológicos específicos del sujeto individual y/o el resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, dependiendo de la aplicación y el propósito, la administración de las células de tejido pulmonar en suspensión y/o las HPC se puede realizar mediante una vía seleccionada del grupo que consiste en intratraqueal, intrabronquial, intraalveolar, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intracardíaca, intramuscular, intraserósica, intramucósica, transmucósica, transnasal, rectal e intestinal.

Según una realización, la administración se efectúa por vía intravenosa.

Según una realización, la administración se efectúa por vía intratraqueal.

Como alternativa, la administración de las células de tejido pulmonar al sujeto puede efectuarse mediante la administración de las mismas en diversas localizaciones anatómicas adecuadas para que tengan un efecto terapéutico. Por lo tanto, dependiendo de la aplicación y el propósito, las células de tejido pulmonar pueden administrarse en una ubicación anatómica homotópica (una ubicación anatómica normal para el tipo de órgano o tejido de las células), o en una ubicación anatómica ectópica (una ubicación anatómica anómala para el tipo de órgano o tejido de las células).

En consecuencia, dependiendo de la aplicación y el propósito, las células de tejido pulmonar pueden implantarse ventajosamente (por ejemplo, trasplantarse) debajo de la cápsula renal, o en el riñón, la grasa testicular, el subcutis, el epiplón, la vena porta, el hígado, el bazo, la cavidad cardíaca, el corazón, la cavidad torácica, el pulmón, el páncreas, la piel y/o el espacio intraabdominal.

Según una realización de la presente invención, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto en un intervalo de dosis de aproximadamente 1-10 x 106, 5-10 x 106, 1-50 x 106, 10-50 x 106, 10-60 x 106, 10-70 x 106, 10-80 x 106, 10-90 x 106, 1-100 x 106, 5-100 x 106, 10-100 x 106, 50-100 x 106, 1 -200 x 106, 5-200 x 106, 10-200 x 106, 50-200 x 106, 100-200 x 106, 1-500 x 106, 5-500 x 106, 10-500 x 106, 100-500 x 106, 1-1000 x 106, 5-1000 x 106, 10­ 1000 x 106, 50-1000 x 106, 100-1000 x 106, 500-1000 x 106, 1 -2000 x 106, 5-2000 x 106, 10-2000 x 106, 20-2000 x 106, 30-2000 x 106, 40-2000 x 106, 50-2000 x 106, 60-2000 x 106, 70-2000 x 106, 80-2000 x 106, 90-2000 x 106, 100-2000 x 106, 200-2000 x 106, 300-2000 x 106, 400-2000 x 106, 500-2000 x 106, 600-2000 x 106, 700-2000 x 106, 800-2000 x 106, 900-2000 x 106, 1000-2000 x 106, 1500-2000 x 106, 100-3000 x 106, 200-3000 x 106, 300-3000 x 106, 400-3000 x 106, 500-3000 x 106, 600-3000 x 106, 700-3000 x 106, 800-3000 x 106, 900-3000 x 106, 1000-3000 x 106, 2000-3000 x 106, 500-4000 x 106, 1000-4000 x 106, 2000-4000 x 106, 3000-4000 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto en un intervalo de dosis de aproximadamente 40-2000 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar obtenidas de un pulmón adulto).

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto en un intervalo de dosis de aproximadamente 40-1000 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar obtenidas de un pulmón adulto).

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto en un intervalo de dosis de aproximadamente 1000-2000 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células pulmonares derivadas de un pulmón adulto).

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto en un intervalo de dosis de aproximadamente 10-100 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón fetal).

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto en un intervalo de dosis de aproximadamente 40-100 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón fetal).

Según una realización de la presente invención, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto a una dosis de al menos aproximadamente 1 x 106, 1,5 x 106, 2 x 106, 2,5 x 106, 3 x 106, 3,5 x 106, 4 x 106, 4,5 x 106, 5 x 106, 5,5 x 106, 6 x 106, 6,5 x 106, 7 x 106, 7,5 x 106, 8 x 106, 8,5 x 106, 9 x 106, 9,5 x 106, 10 x 106, 12,5 x 106, 15 x 106, 20 x 106, 25 x 106, 30 x 106, 35 x 106, 40 x 106, 45 x 106, 50 x 106, 60 x 106, 70 x 106, 80 x 106, 90 x 106, 100 x 106, 110 x 106, 120 x 106, 130 x 106, 140 x 106, 150 x 106, 160 x 106, 170 x 106, 180 x 106190 x 106, 200 x 106, 250 x 106, 300 x 106, 320 x 106, 350 x 106, 400 x 106, 450 x 106, 500 x 106, 600 x 106, 700 x 106, 800 x 106, 900 x 106, 1000 x 106, 1100 x 106, 1200 x 106, 1300 x 106, 1400 x 106, 1500 x 106 o 2000 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto a una dosis de al menos aproximadamente 40 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón adulto).

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto a una dosis de al menos aproximadamente 200 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón adulto).

Según una realización, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto a una dosis de al menos aproximadamente 320 x 106 por kilogramo de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón adulto).

Según una realización, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto a una dosis de al menos aproximadamente 500 x 106 por kilogramo de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón adulto).

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto a una dosis de al menos aproximadamente 1000 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón adulto).

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto a una dosis de al menos aproximadamente 2000 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón adulto).

Según una realización, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto a una dosis de al menos aproximadamente 10 x 106 por kilogramo de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón fetal).

Según una realización, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto a una dosis de al menos aproximadamente 40 x 106 por kilogramo de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón fetal).

Según una realización, las células de tejido pulmonar en suspensión se administran al sujeto a una dosis de al menos aproximadamente 100 x 106 por kilogramo de peso corporal del sujeto (por ejemplo, para la administración de células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón fetal).

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar derivadas de un pulmón fetal (en suspensión) se administran al sujeto a una dosis de aproximadamente 10-100 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto (por ejemplo, aproximadamente 40 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto).

Según una realización específica, las células de tejido pulmonar obtenidas de un pulmón adulto (en suspensión) se administran al sujeto a una dosis de aproximadamente 40-2000 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto (por ejemplo, aproximadamente 320 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto).

Las células de tejido pulmonar en suspensión que comprenden HPC o complementadas con HPC de algunas realizaciones de la invención se pueden administrar a un organismo per se, o en una composición farmacéutica en la que se mezclan con vehículos o excipientes adecuados.

Como se usa en el presente documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en el presente documento con otros componentes químicos, tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

En este documento, la expresión "ingrediente activo" se refiere a las células de tejido pulmonar que comprenden HPC o complementadas con HPC responsables del efecto biológico.

En adelante, las expresiones "vehículo fisiológicamente aceptable" y "vehículo farmacéuticamente aceptable", que pueden usarse indistintamente, se refieren a un vehículo o diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y que no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Se incluye un adyuvante bajo estas expresiones.

En este documento, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de un ingrediente activo. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición, que se incorpora en la presente como referencia.

Las vías de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, administración oral, rectal, transmucósica, especialmente transnasal, intestinal o parenteral, incluidas inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intracardiacas, por ejemplo, en la cavidad ventricular derecha o izquierda, en la arteria coronaria común, inyecciones intravenosas, intratraqueales, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.

Las estrategias convencionales para la administración de fármacos al sistema nervioso central (SNC) incluyen: estrategias neuroquirúrgicas (por ejemplo, inyección intracerebral o infusión intracerebroventricular); manipulación molecular del agente (por ejemplo, producción de una proteína de fusión quimérica que comprende un péptido de transporte que tiene afinidad por una molécula de la superficie celular endotelial en combinación con un agente que por sí mismo es incapaz de cruzar la BHE) en un intento de aprovechar una de las vías de transporte endógenas de la BHE; estrategias farmacológicas diseñadas para aumentar la solubilidad en lípidos de un agente (por ejemplo, conjugación de agentes solubles en agua con portadores de lípidos o colesterol); y la alteración transitoria de la integridad de la BHE por alteración hiperosmótica (resultante de la infusión de una disolución de manitol hacia la arteria carótida o del uso de un agente biológicamente activo, tal como un péptido de angiotensina). Sin embargo, cada una de estas estrategias tiene limitaciones, como los riesgos inherentes asociados con un procedimiento quirúrgico invasivo, una limitación de tamaño impuesta por una limitación inherente a los sistemas de transporte endógenos, efectos secundarios biológicos potencialmente indeseables asociados con la administración sistémica de una molécula quimérica compuesta por de un motivo portador que podría ser activo fuera del SNC, y el posible riesgo de daño cerebral dentro de las regiones del cerebro donde se interrumpe la BHE, lo que lo convierte en un método de administración subóptimo.

Como alternativa, se puede administrar la composición farmacéutica de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante la inyección de la composición farmacéutica directamente en una región de tejido de un paciente (por ejemplo, tejido pulmonar).

Las composiciones farmacéuticas se pueden fabricar mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Por tanto, los productos farmacéuticos pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos para producir preparaciones que pueden usarse de modo farmacéutico. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.

Para la inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica se pueden formular en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como disolución de Hank, disolución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para la administración transmucósica, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.

Para la administración oral, la composición farmacéutica se puede formular fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten formular la composición farmacéutica como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por parte de un paciente. Se pueden fabricar preparaciones farmacológicas para un uso oral usando un excipiente sólido, opcionalmente triturando la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas, tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables, tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.

Los núcleos de grageas se proporcionan con revestimientos adecuados. Para este propósito, se pueden usar disoluciones de azúcar concentradas que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.

Las composiciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras fabricadas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas fabricadas de gelatina y un plastificante, como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos mezclados con una carga, tal como lactosa, aglutinantes, tales como almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los ingredientes activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden agregar estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para la vía de administración elegida.

Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o grageas formuladas de manera convencional.

Para la administración por inhalación nasal, los ingredientes activos para su uso de acuerdo con algunas realizaciones de la invención se administran convenientemente en forma de una presentación de pulverización en aerosol desde un envase presurizado o un nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina para usar en un dispensador que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

La composición farmacéutica descrita en el presente documento puede formularse para la administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para la inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis con, opcionalmente, un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los ingredientes activos se pueden preparar como suspensiones para inyección apropiadas a base de agua o aceite. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los ingredientes activos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.

Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, una disolución a base de agua, estéril, libre de pirógenos, antes de su uso.

La composición farmacéutica de algunas realizaciones de la invención también se puede formular en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, usando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de algunas realizaciones de la invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de ingredientes activos (es decir, células de tejido pulmonar en suspensión que comprenden HPC o complementadas con HPC) eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de un trastorno (por ejemplo, una enfermedad o afección pulmonar) o prolongar la supervivencia. del sujeto que se está tratando.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento.

Para cualquier preparación, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz se puede calcular inicialmente a partir de ensayos in vitro y de cultivo celular. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr una concentración o título deseado. Esta información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.

Un ejemplo de modelo animal que puede usarse para evaluar la cantidad terapéuticamente eficaz de células de tejido pulmonar en suspensión que comprenden una cantidad eficaz de HPC o suplementadas con HPC comprende el modelo animal murino (por ejemplo, ratones), en el que la lesión pulmonar se induce, por ejemplo, mediante una inyección intraperitoneal de naftaleno (por ejemplo, más del 99% de pureza) con o sin irradiación adicional (por ejemplo, 40-48 horas después de la administración de naftaleno), como se describe en detalle en la sección de ejemplos que sigue.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en este documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales in vitro, en cultivos celulares o en animales de experimentación. Los datos obtenidos de estos ensayos in vitro y de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. El médico individual puede elegir la formulación, la vía de administración y la dosificación exactas en vista del estado del paciente (véase, por ejemplo, Fingl, et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", cap. 1, p.1).

La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles amplios del ingrediente activo que sean suficientes para inducir o suprimir el efecto biológico (concentración mínima eficaz, “minimal effective concentration”, MEC). La MEC variará según cada preparación, pero puede calcularse a partir de datos in vitro. Las dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependerán de las características individuales y la vía de administración. Se pueden utilizar ensayos de detección para determinar las concentraciones plasmáticas.

Dependiendo de la gravedad y la capacidad de respuesta de la afección a tratar, la dosificación puede ser de una o varias administraciones, con un curso de tratamiento que dura desde varios días hasta varias semanas o hasta que se logra la curación o se logra la disminución del estado patológico.

La cantidad de una composición a administrar dependerá, por supuesto, del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la aflicción, la forma de administración, el criterio del médico que prescribe, etc.

Las composiciones pueden presentarse, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina de metal o plástico, tal como un envase de blíster. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones de administración. El paquete o dispensador también puede estar alojado en una nota asociada con el recipiente en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, y dicha nota refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones o la administración humana o veterinaria. Dicha nota, por ejemplo, puede ser un etiquetado aprobado por U.S. Food and Drug Administration para medicamentos recetados o un prospecto de producto aprobado. Las composiciones que comprenden una preparación formulada en un vehículo farmacéutico compatible también pueden prepararse, colocarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una afección indicada, como se indicó con más detalle anteriormente.

Para evitar aún más una reacción inmunitaria residual que todavía puede estar presente cuando se administran las células de tejido pulmonar, se han desarrollado varias estrategias para reducir la probabilidad de rechazo. Estas incluyen encapsular las células no singénicas en membranas semipermeables inmunoaislantes antes del trasplante. Como alternativa, pueden emplearse células que no expresan antígenos de superficie xenogénicos, tales como las desarrolladas en animales transgénicos (por ejemplo, cerdos).

Las técnicas de encapsulación generalmente se clasifican como microencapsulación, que implica vehículos esféricos pequeños, y macroencapsulación, que implica membranas de fibra hueca y de lámina plana más grandes (Uludag, H. et al. (2000), Technology of mammalian cell encapsulation, Adv. Drug Deliv. Rev., 42, 29-64).

Los métodos para preparar microcápsulas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos en: Lu, M. Z. et al. (2000), Cell encapsulation with alginate and a-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine), Biotechnol. Bioeng., 70, 479-483; Chang, T. M. y Prakash, S. (2001), Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms, Mol. Biotechnol., 17, 249-260; y Lu, M. Z. et al. (2000), A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate), J. Microencapsul., 17, 245-521.

Por ejemplo, las microcápsulas se preparan utilizando colágeno modificado en un complejo con una cubierta de terpolímero de metilacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), ácido metacrílico (MAA) y metacrilato de metilo (MMA), lo que da como resultado un grosor de la cápsula de 2-5 pm. Dichas microcápsulas se pueden encapsular adicionalmente con 2-5 pm adicionales de cubiertas de terpolímero para impartir una superficie lisa con carga negativa y minimizar la absorción de proteínas plasmáticas (Chia, S. M. et al. (2002), Multi-layered microcapsules for cell encapsulation, Biomaterials, 23, 849-856).

Otras microcápsulas se basan en alginato, un polisacárido marino (Sambanis, A. (2003), Encapsulated islets in diabetes treatment, Diabetes Thechnol. Ther., 5, 665-668), o sus derivados. Por ejemplo, se pueden preparar microcápsulas mediante la complejación de polielectrolitos entre los polianiones alginato de sodio y sulfato de celulosa de sodio y el clorhidrato del policatión poli(metilen-co-guanidina) en presencia de cloruro de calcio.

Se apreciará que la encapsulación celular mejora cuando se utilizan cápsulas más pequeñas. Así, por ejemplo, el control de calidad, la estabilidad mecánica, las propiedades de difusión y las actividades in vitro de las células encapsuladas mejoraron cuando el tamaño de la cápsula se reduce de 1 mm a 400 pm (Canaple, L. et al. (2002), Improving cell encapsulation through size control, J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 13, 783-96). Además, se descubrió que las biocápsulas nanoporosas con un tamaño de poro bien controlado de tan solo 7 nm, con unas químicas de superficie adaptadas y con unas microarquitecturas precisas inmunoaislan con éxito microambientes para las células (véase, Williams, D. (1999), Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices, Med. Device Technol., 10, 6-9; y Desai, T. A. (2002), Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation, Expert Opin. Biol. Ther., 2, 633-646).

Según una realización, el trasplante de células de tejido pulmonar da como resultado la regeneración de tejido pulmonar estructural/funcional.

Según una realización, el trasplante de células de tejido pulmonar da como resultado la generación de un pulmón quimérico (es decir, un pulmón que comprende células de orígenes genéticamente diferenciados).

Se apreciará que las células dentro de las células del tejido pulmonar en suspensión son capaces de regenerar un tejido pulmonar estructural/funcional, incluida la generación de un pulmón quimérico. El pulmón quimérico comprende estructuras alveolares, bronquiales y/o bronquiolares y/o estructuras vasculares. Además, el tejido pulmonar estructural/funcional comprende la capacidad de sintetizar tensioactivo [por ejemplo, proteína secretora de células de Clara (“Clara cell secretory protein”, CCSP), acuaporina-5 (AQP-5) y proteína tensioactiva C (sp-C)], detectables mediante tinción celular específica y/o la capacidad para transportar iones (por ejemplo, según lo indicado por tinción para el regulador transmembrana de fibrosis quística-CFTR). Las células dentro de las células del tejido pulmonar en suspensión son además capaces de regenerar un tejido epitelial, mesenquimático y/o endotelial (por ejemplo, tejido epitelial, mesenquimático y/o endotelial, según lo indicado por la formación de un tejido pulmonar quimérico completo que comprende todos estos componentes).

Después del trasplante de las células de tejido pulmonar al sujeto de acuerdo con las presentes indicaciones, es aconsejable, de acuerdo con la práctica médica convencional, controlar la funcionalidad de crecimiento y la inmunocompatibilidad de las células trasplantadas de acuerdo con cualquiera de las diversas técnicas convencionales de la técnica. Por ejemplo, la funcionalidad de los tejidos pulmonares regenerados puede controlarse después del trasplante mediante ensayos de función pulmonar convencionales, por ejemplo, mediante el análisis de las propiedades funcionales de los implantes en desarrollo, como lo indica la capacidad de sintetizar tensioactivo, detectable mediante tinción para la proteína tensioactiva C (sp-C) y la capacidad de transportar iones, como lo indica la tinción para el regulador transmembrana de fibrosis quística-CFTR.

Para facilitar el injerto de las células del tejido pulmonar, y para reducir, al menos aproximadamente en un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%, o preferiblemente evitar el rechazo del injerto y/o la enfermedad del injerto contra el huésped (EICH), el método puede comprender además, de forma ventajosa, acondicionar al sujeto antes de la administración de las células de tejido pulmonar.

Como se usa en este documento, el término "acondicionamiento" se refiere al tratamiento preparativo de un sujeto antes del trasplante.

De acuerdo con una realización, para aumentar la tasa de éxito de un trasplante (por ejemplo, la formación de quimerismo), el sujeto se trata mediante un acondicionamiento capaz de desocupar nichos celulares en el tejido u órgano pulmonar.

Por tanto, el acondicionamiento del sujeto se efectúa administrando a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de inducir daños al tejido pulmonar en el que el daño da como resultado la proliferación de células madre residentes en el tejido pulmonar.

La expresión "daños al tejido pulmonar" se refiere a una lesión localizada en un órgano/tejido pulmonar o una parte del mismo.

La expresión "proliferación de células madre residentes" se refiere a la inducción de la división celular de células madre endógenas que residen dentro del tejido pulmonar una vez sometidas al agente.

Se pueden usar varios agentes acondicionadores de acuerdo con la presente invención siempre que el agente induzca daños en al menos una parte del tejido pulmonar que den como resultado la proliferación de células madre residentes dentro del tejido pulmonar. Así, por ejemplo, el agente puede comprender una sustancia química, un antibiótico, un fármaco terapéutico, una toxina o una hierba o un extracto de la misma.

El protocolo de acondicionamiento puede ajustarse teniendo en cuenta la edad y el estado (por ejemplo, enfermedad, estadio de la enfermedad) del sujeto, y dicha determinación está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente en vista de la descripción proporcionada en este documento.

Sin ceñirse a la teoría, una cantidad terapéuticamente eficaz de acondicionamiento es una cantidad del agente acondicionador suficiente para inducir un daño localizado en el tejido pulmonar y la proliferación de células madre residentes, pero que no es tóxica para otros órganos del sujeto que está siendo tratado (por ejemplo, hígado, riñones, corazón, etc.).

La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en el presente documento.

Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz se puede calcular inicialmente a partir de ensayos in vitro y de cultivo celular. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr una concentración o título deseado. Esta información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos.

Los ejemplos de agentes que causan toxicidad en las células pulmonares incluyen, pero no se limitan a agentes quimioterapéuticos, agentes inmunosupresores, amiodarona, beta-bloqueantes, inhibidores de la ACE, nitrofurantoína, procainamida, quinidina, tocainida, minoxidil, amiodarona, metotrexato, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), gemcitabina, bleomicina, mitomicina C, busulfán, ciclofosfamida, clorambucilo, nitrosourea (por ejemplo, carmustina) y sirolimus.

Otros agentes que causan toxicidad de las células pulmonares se enumeran en la tabla 2, a continuación [incorporado de Collard, www.merckmanuals.com/professional/pulmonary-disorders/interstitial-lung-disease/drug-inducedpulmonary-disease].

Tabla 2: Sustancias con efectos pulmonares tóxicos

Como se ilustra en la sección de ejemplos que sigue, el acondicionamiento de un sujeto usando naftaleno induce una ablación específica de sitio (por ejemplo, de células Clara en los bronquiolos respiratorios y en las uniones broncoalveolares) y así facilita el injerto de las células del tejido pulmonar en suspensión. Para eliminar más eficazmente las células madre pulmonares residenciales (que pueden proliferar rápidamente después del tratamiento con naftaleno), el sujeto se sometió además a TBI subletal (por ejemplo, 6 Gy) antes de la administración de las células del tejido pulmonar en suspensión (véase el ejemplo 1 y la figura 3 de la sección de ejemplo que sigue).

Por tanto, según una realización de la presente invención, el protocolo de acondicionamiento comprende un tratamiento con naftaleno.

Según una realización, el tratamiento con naftaleno se administra al sujeto 1 -10 días (por ejemplo, 7, 6, 5, 4, 3, 2 días, por ejemplo, 3 días) antes de la administración de las células de tejido pulmonar en suspensión.

La evaluación de los daños al tejido pulmonar se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante ensayos de función pulmonar, radiografía de tórax, tomografía computarizada de tórax o tomografía por emisión de positrones (PET). La determinación de los daños pulmonares está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento.

Como se describió anteriormente, los daños al tejido pulmonar dan como resultado la proliferación de células madre residentes dentro del tejido.

La evaluación de la proliferación de células madre residentes (por ejemplo, células madre endógenas dentro de un tejido pulmonar) se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido por un experto en la técnica, como por ejemplo, mediante formación de imágenes in vivo de la proliferación celular, por ejemplo ,utilizando una tomografía por emisión de positrones (PET) con un trazador de PET, por ejemplo 2-fluoro-2-desoxi-D-glucosa (18FDG) marcada con 18F o [18F] 3'-desoxi-3-fluorotimidina ((18) FLT) según lo indicado por Francis et al., Gut (2003), 52(11 ):1602-1606 y por Fuchs et al., J. Nucl. Med. (2013), 54(1):151-158.

Por tanto, de acuerdo con una realización de la invención, tras la administración del agente capaz de inducir daños al tejido de interés, el sujeto se somete a un segundo agente acondicionador, es decir, un agente que elimina las células madre residentes en el tejido. Como resultará evidente para los expertos en la técnica de la biología celular, la sensibilidad a la radiación se consigue solo en una etapa proliferativa.

Según otra realización, un agente que elimina las células madre residentes en el tejido (como se analiza escribe a continuación) puede administrarse al sujeto sin acondicionamiento previo con un agente que induzca daños al tejido (por ejemplo, naftaleno).

Según una realización, el agente que elimina las células madre residentes comprende un protocolo de acondicionamiento subletal, letal o supraletal.

Según una realización, el protocolo de acondicionamiento comprende un acondicionamiento de intensidad reducida (“reduced intensity conditioning”, RIC).

Según una realización, el acondicionamiento de intensidad reducida se efectúa durante hasta 2 semanas (por ejemplo, 1- 14, 1-10 o 1-7 días) antes del trasplante de las células de tejido pulmonar.

Según una realización, el protocolo de acondicionamiento comprende una irradiación corporal total (TBI), una irradiación linfoide total (TLI, es decir, exposición de todos los ganglios linfáticos, el timo y el bazo), una irradiación corporal parcial, una citorreducción de células T (TCD), un agente quimioterapéutico y/o inmunoterapia con anticuerpos.

Por tanto, de acuerdo con una realización, la TBI comprende una dosis de irradiación única o fraccionada dentro del intervalo de 0,5-1 Gy, 0,5-1,5 Gy, 0,5-2,5 Gy, 0,5-5 Gy, 0,5-7,5 Gy, 0,5-10 Gy, 0,5-15 Gy, 0,5-20 Gy, 1 -1,5 Gy, 1 -2 Gy, 1 -2,5 Gy, 1 -3 Gy, 1 -3,5 Gy, 1 -4 Gy, 1 -4,5 Gy, 1 -1,5 Gy, 1 -7,5 Gy, 1 -10, Gy, 1 -15, Gy, 1 -12 Gy, 2-3 Gy, 2-4 Gy, 2-5 Gy, 2- 6 Gy, 2-7 Gy, 2-8 Gy, 2-9 Gy, 2-10 Gy, 2-15 Gy, 2-20 Gy, 3-4 Gy, 3-5 Gy, 3-6 Gy, 3-7 Gy, 3-8 Gy, 3-9 Gy, 3-10 Gy, 3- 15 Gy, 3-20 Gy, 4-5 Gy, 4-6 Gy, 4-7 Gy, 4-8 Gy, 4-9 Gy, 4-10 Gy, 4-15 Gy, 4-20 Gy, 5-6 Gy, 5-7 Gy, 5-8 Gy, 5-9 Gy, 5-10 Gy, 5-15 Gy, 5-20 Gy, 6-7 Gy, 6-8 Gy, 6-9 Gy, 6-10 Gy, 6-20 Gy, 7-8 Gy, 7-9 Gy, 7-10 Gy, 7-20 Gy, 8-9, Gy, 8­ 10 Gy, 10-12 Gy, 10-15 Gy o 10-20 Gy.

Según una realización específica, la TBI comprende una dosis de irradiación única o fraccionada dentro del intervalo de 1-20 Gy.

Según una realización específica, la TBI comprende una dosis de irradiación única o fraccionada dentro del intervalo de 1-10 Gy.

Según una realización, el tratamiento de TBI se administra al sujeto 1-10 días (por ejemplo, 1-3 días) antes del trasplante. Según una realización, el sujeto se acondiciona una vez con TBI 1 o 2 días antes del trasplante.

Según una realización específica, la TLI comprende una dosis de irradiación dentro del intervalo de 0,5-1 Gy, 0,5-1,5 Gy, 0,5-2,5 Gy, 0,5-5 Gy, 0,5-7,5 Gy, 0,5-10 Gy, 0,5-15 Gy , 0,5-20 Gy, 1-1,5 Gy, 1-2 Gy, 1-2,5 Gy, 1-3 Gy, 1-3,5 Gy, 1 -4 Gy, 1 -4,5 Gy, 1 -1,5 Gy, 1 -7,5 Gy , 1-10 Gy, 2-3 Gy, 2-4 Gy, 2-5 Gy, 2-6 Gy, 2-7 Gy, 2-8 Gy, 2-9 Gy, 2-10 Gy, 3-4 Gy , 3-5 Gy, 3-6 Gy, 3-7 Gy, 3-8 Gy, 3-9 Gy, 3-10 Gy, 4-5 Gy, 4-6 Gy, 4-7 Gy, 4-8 Gy , 4-9 Gy, 4-10 Gy, 5-6 Gy, 5-7 Gy, 5-8 Gy, 5-9 Gy, 5-10 Gy, 6-7 Gy, 6-8 Gy, 6-9 Gy , 6-10 Gy, 7-8 Gy, 7-9 Gy, 7-10 Gy, 8-9 Gy, 8-10 Gy, 10-12 Gy, 10-15 Gy, 10-20 Gy, 10-30 Gy, 10-40 Gy, 10-50 Gy, 0,5-20 Gy, 0,5-30 Gy, 0,5-40 Gy o 0,5-50 Gy.

Según una realización específica, la TLI comprende una dosis de irradiación única o fraccionada dentro del intervalo de 1-20 Gy.

Según una realización específica, la TLI comprende una dosis de irradiación única o fraccionada dentro del intervalo de 1-10 Gy.

Según una realización, el tratamiento con TLI se administra al sujeto 1-10 días (por ejemplo, 1-3 días) antes del trasplante. Según una realización, el sujeto se acondiciona una vez con TLI 1 o 2 días antes del trasplante.

Como se describe en detalle en la sección de ejemplos que sigue, el sujeto puede ser tratado mediante citorreducción de células T in vivo, por ejemplo con un anticuerpo anti-CD4, un anticuerpo anti-CD8, un anticuerpo anti-CD3 (OKT3), un anticuerpo anti-CD52 (por ejemplo, CAMPATH) y/o un anticuerpo de globulina antitimocitos (ATG) (por ejemplo, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 días antes del trasplante a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 100-500 gg, por ejemplo, 300 gg cada una).

Según una realización, el acondicionamiento comprende un agente quimioterapéutico. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a busulfán, milerán, busulfex, fludarabina, melfalano, dimetil milerán y tiotepa y ciclofosfamida. El agente o agentes quimioterapéuticos se pueden administrar al sujeto en una sola dosis o en varias dosis, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dosis (por ejemplo, dosis diarias) antes del trasplante. Según una realización, al sujeto se le administra un agente quimioterapéutico (por ejemplo, fludarabina, por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 30 mg/m2/día) durante 3-7 días consecutivos, por ejemplo, 5 días consecutivos, antes del trasplante (por ejemplo, los días -7 a -3).

Según una realización, el acondicionamiento comprende una inmunoterapia con anticuerpos. Los ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a un anticuerpo anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab comercializado con los nombres comerciales, por ejemplo, de Campath, MabCampath, Campath-1H y Lemtrada) y un agente de globulina antitimocitos (ATG) [por ejemplo, timoglobulina (ATG de conejo, rATG, disponible en Genzyme) y Atgam (ATG equino, eATG, disponible en Pfizer)]. La inmunoterapia con anticuerpos adicional puede comprender agentes anti-CD3 (OKT3), anti-CD4 o anti-CD8. Según una realización, el anticuerpo se administra al sujeto en una sola dosis o en varias dosis, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dosis (por ejemplo, dosis diarias) antes del trasplante (por ejemplo, 4-8 días, por ejemplo, 6 días, antes del trasplante).

Según una realización, el acondicionamiento comprende un bloqueo coestimulador. Así, por ejemplo, el acondicionamiento puede comprender administrar transitoriamente al sujeto al menos un inhibidor de la coestimulación de células T y al menos un inhibidor del ligando CD40, y más preferiblemente puede comprender además administrar al sujeto un inhibidor de la proliferación de células T.

Según una realización, el inhibidor de la coestimulación de células T es CTLA4-Ig, el inhibidor del ligando CD40 es un anticuerpo antiligando CD40, y el inhibidor de la proliferación de células T es la rapamicina. Como alternativa, el inhibidor de la coestimulación de células T puede ser un anticuerpo anti-CD40. Como alternativa, el inhibidor de la coestimulación de células T puede ser un anticuerpo específico para B7-1, B7-2, CD28, anti-LFA-1 y/o anti-LFA3.

Según una realización específica, el acondicionamiento comprende un tratamiento con naftaleno (por ejemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días, por ejemplo, 3 días, antes del trasplante) y un tratamiento de TBI (por ejemplo, 9, 8, 7 , 6, 5, 4, 3, 2 o 1 día, por ejemplo, 1 día, antes del trasplante, a una dosis, por ejemplo, de 1 -20 Gy, por ejemplo, 6 Gy).

Según otra realización específica, el acondicionamiento comprende un tratamiento de citorreducción de células T (por ejemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días, por ejemplo 6 días, antes del trasplante, por ejemplo, con anticuerpos anti-CD8 y/o anti-CD4), un tratamiento con naftaleno (por ejemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días, por ejemplo, 3 días, antes del trasplante) y un tratamiento de TBI (por ejemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 días, por ejemplo, 1 día, antes del trasplante, a una dosis, por ejemplo, de 1-20 Gy, por ejemplo, 6 Gy).

Según otra realización específica, el acondicionamiento comprende solo el tratamiento de TBI (por ejemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 días, por ejemplo, 1 día, antes del trasplante, a una dosis, por ejemplo, de 1 -20 Gy , por ejemplo, 6 Gy).

Para evitar el rechazo del injerto de las células del tejido pulmonar, se puede administrar al sujeto un régimen inmunosupresor postrasplante.

Según una realización, el sujeto se trata con un régimen inmunosupresor durante hasta dos semanas después de la administración de las células de tejido pulmonar.

Según una realización, el sujeto se trata con un régimen inmunosupresor durante hasta 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días después de la administración de las células de tejido pulmonar.

Los ejemplos de tipos adecuados de regímenes inmunosupresores incluyen la administración de fármacos inmunosupresores (también denominados agentes inmunosupresores) y/o irradiación inmunosupresora.

En la bibliografía de la técnica se proporciona una amplia guía para seleccionar y administrar regímenes inmunosupresores adecuados para trasplantes (por ejemplo, consúltese: Kirkpatrick C.H. y Rowlands D.T. Jr., 1992, JAMA, 268, 2952; Higgins R.M. et al., 1996, Lancet, 348, 1208; Suthanthiran M. y Strom T.B., 1996, New Engl. J. Med., 331,365; Midthun D.E. et al., 1997, Mayo Clin. Proc., 72, 175; Morrison V.A. et al., 1994, Am. J. Med., 97, 14; Hanto D.W., 1995, Annu. Rev. Med., 46, 381; Senderowicz A.M. et al., 1997, Ann. Intern. Med., 126, 882; Vincenti F. et al., 1998, New Engl. J. Med., 338, 161; Dantal J. et al., 1998, Lancet, 351, 623).

Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, pero no se limitan a metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sales de oro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE), bloqueantes de TNF-alfa, un agente biológico que se dirige a una citoquina inflamatoria y un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). Los ejemplos de AINE incluyen, pero no se limitan a ácido acetilsalicílico, salicilato de colina y magnesio, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolaco, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicamo, sulindaco, tolmetina, acetaminofeno, ibuprofeno, inhibidores de Cox-2, tramadol, rapamicina (sirolimus) y análogos de rapamicina (como CCI-779, RAD001, AP23573). Estos agentes pueden administrarse individualmente o en combinación.

Según una realización, el agente inmunosupresor es ciclofosfamida.

Como se usa en este documento, el término "ciclofosfamida" se refiere al agente alquilante de mostaza nitrogenada que específicamente agrega un grupo alquilo (CnH2n+1) al ADN (también conocido como citofosfano). En una realización específica, la ciclofosfamida se refiere a la fórmula molecular CzH15C12N2O2P^H2O y el nombre químico 2-[bis(2-cloroetil)amino]tetrahidro-2H-1,3,2-oxazafosforina 2-óxido monohidrato. La ciclofosfamida está disponible en el mercado, por ejemplo, en Zydus (German Remedies), Roxane Laboratories Inc-Boehringer Ingelheim, Bristol-Myers Squibb Co - Mead Johnson and Co, y Pfizer - Pharmacia & Upjohn, bajo las marcas de Endoxan, Cytoxan, Neosar, Procytox y Revimmune.

Típicamente, se administra al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de ciclofosfamida después del trasplante de células de tejido pulmonar.

Según una realización, la presente invención contempla además la administración de ciclofosfamida antes del trasplante (por ejemplo, los días 4, 3 o 2 antes del trasplante, es decir, T-4, -3 o -2) además de la administración después del trasplante como se describe en el presente documento. .

Es de destacar que la fecha del trasplante (de las células del tejido pulmonar) se considera T = cero.

Sin ceñirse a la teoría, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de ciclofosfamida eficaz para matar las células T alorreactivas del huésped o del donante activadas, sin ser tóxica para el sujeto.

Por ejemplo, en caso de un trasplante de células de tejido pulmonar, la cantidad terapéuticamente eficaz de ciclofosfamida comprende aproximadamente 1 -25 mg, 1 -50 mg, 1 -75 mg, 1 -100 mg, 1 -250 mg, 1 -500 mg, 1 -750 mg, 1-1000 mg, 5-50 mg, 5-75 mg, 5-100 mg, 5-250 mg, 5-500 mg, 5-750 mg, 5-1000 mg, 10-50 mg, 10-75 mg, 10-100 mg, 10-250 mg, 10-500 mg, 10-750 mg, 10-1000 mg, 25-50 mg, 25-75 mg, 25-100 mg, 25-125 mg, 25-200 mg, 25­ 300 mg, 25-400 mg, 25-500 mg, 25-750 mg, 25-1000 mg, 50-75 mg, 50-100 mg, 50-125 mg, 50-150 mg, 50-175 mg, 50-200 mg, 50-250 mg, 50-500 mg, 50-1000 mg, 75-100 mg, 75-125 mg, 75-150 mg, 75-250 mg, 75-500 mg, 75-1000 mg, 100-125 mg, 100-150 mg, 100-200 mg, 100-300 mg, 100-400 mg, 100-500 mg, 100-1000 mg, 125-150 mg, 125­ 250 mg, 125-500 mg, 125-1000 mg, 150-200 mg, 150-300 mg, 150-500 mg, 150-1000 mg, 200-300 mg, 200-400 mg, 200-500 mg, 200-750 mg, 200-1000 mg, 250-500 mg, 250-750 mg, 250-1000 mg por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, la cantidad terapéuticamente eficaz de ciclofosfamida es de aproximadamente 25­ 200 mg por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, la cantidad terapéuticamente eficaz de ciclofosfamida es de aproximadamente 50­ 150 mg por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, la cantidad terapéuticamente eficaz de ciclofosfamida es de aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Como se ilustra en la sección de ejemplos que sigue, los presentes inventores han demostrado que la administración de dos dosis de ciclofosfamida después del trasplante (en los días 3 y 4 después del trasplante) permite un injerto duradero y tolerancia a la “megadosis”' de células de tejido pulmonar depuradas de células T.

Según una realización, la ciclofosfamida se administra en una sola dosis.

Según una realización, la ciclofosfamida se administra en múltiples dosis, por ejemplo, en 2, 3, 4, 5 dosis o más. Según una realización específica, la ciclofosfamida se administra en dos dosis.

Según una realización, la ciclofosfamida se administra a diario, tal como una vez al día o dos veces al día.

La dosis de cada administración de ciclofosfamida puede comprender aproximadamente 5 mg, 7,5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 210 mg, 220 mg, 230 mg, 240 mg, 250 mg, 260 mg, 270 mg, 280 mg, 290 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg o 500 mg por kilogramo de peso corporal del sujeto.

Según una realización específica, la dosis de ciclofosfamida es de 50 mg por kilogramo de peso corporal del sujeto. Según una realización, la ciclofosfamida se administra después del trasplante. Así, por ejemplo, se puede administrar ciclofosfamida al sujeto 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 días o más después del trasplante (es decir, T+1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Según una realización específica, la ciclofosfamida se administra al sujeto en dos dosis, por ejemplo, los días 3 y 4 después del trasplante.

Según una realización, la ciclofosfamida se administra antes del trasplante y después del trasplante. Así, por ejemplo, se puede administrar ciclofosfamida al sujeto 3 días antes del trasplante (T-3) y luego después del trasplante (por ejemplo, en los días T+3, 4, etc.).

El número de administraciones y la cantidad terapéuticamente eficaz de ciclofosfamida pueden ajustarse según sea necesario teniendo en cuenta el tipo de trasplante y la respuesta del sujeto al régimen. La determinación del número de administraciones y la cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10%.

El término y las expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye, pero no se limita a".

El término "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".

El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura pueden incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicado.

Como se usa en este documento, la forma en singular "un", "una", “la” y "el" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluidas sus mezclas.

A lo largo de esta solicitud, se pueden presentar varias realizaciones de esta invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo describe específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo como de 1 a 6 incluye subintervalos específicamente descritos como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como los números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Siempre que se indique en la presente un intervalo numérico, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccionario o integral) dentro del intervalo indicado. Las expresiones "varía/varía entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que varía/que varía de" un primer número indicado "a" un segundo número indicado se usan en la presente indistintamente y están destinadas a incluir el primer y segundo número indicado y todos los numerales fraccionarios e integrales entre ellos.

Como se usa en el presente documento, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada, incluidos, entre otros, aquellos modos, medios, técnicas y procedimientos que se conocidos por los expertos en la técnica química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica, o que pueden ser desarrollados por estos a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos.

Se aprecia que ciertas características de la invención, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una única realización. A la inversa, varias características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una única realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.

Varias realizaciones y aspectos de la presente invención, como se delineó anteriormente y como se reivindica en la sección de reivindicaciones a continuación, encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

En este punto se hace referencia a los siguientes ejemplos, que, junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de forma no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook et al. (1989); "Protocolos actuales en biología molecular "Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al. , " Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, " A Practical Guide to Molecular Cloning ", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds), "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se establece en las patentes de EE. UU. n.os 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", volúmenes I-III, Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology", volúmenes I-III, Coligan J. E., ed. (1994)); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (octava edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la biblografía científica y de patentes, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis", Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridation", Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation", Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture", Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes", IRL Press (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning", Perbal, B. (1984) y "Methods in Enzymology", vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide to Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., " Strategies for Protein Purification and Characterization A Laboratory Course Manual", CSHL Press (1996). Se proporcionan otras referencias generales a lo largo de este documento. Se cree que los procedimientos contenidos en estas son bien conocidos en la técnica y se proporcionan por comodidad para el lector.

Materiales generales y procedimientos experimentales

Animales

Los animales se mantuvieron en condiciones aprobadas por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Instituto Weizmann. Todos los procedimientos fueron controlados por el veterinario de la Unidad de Recursos Veterinarios del Instituto Weizmann y aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC). Las razas de ratones utilizadas incluyeron: C57BL/6J (CD45.2 y CD45.1), beta-actina GFP sobre un trasfondo de C57BL/6J, C3H/HeJ (Centro de cría de animales del Instituto Weizmann, Rehovot, Israel), ratones Rag1-/- ratones sobre un trasfondo de C57BL/6J (centro de reproducción Weizmann) y ratones tdTomato (Gt(ROSA)26Sortm4) (ACTB-tdTomato, -EGFP) Luo/J (Jackson Labs, Bar Harbor, EE. UU.).

Todos los ratones se utilizaron a las 6-18 semanas de edad. Los ratones se mantuvieron en jaulas pequeñas (hasta cinco animales en cada jaula) y se alimentaron con alimentos estériles y agua ácida. Aleatorización: los animales de la misma edad, sexo y trasfondo genético se asignaron al azar a grupos de tratamiento. Los criterios de exclusión preestablecidos se basaron en las directrices de la IACUC e incluyeron enfermedades sistémicas, toxicidad, insuficiencia respiratoria, negativa a comer y beber y una pérdida de peso sustancial (más del 15%). Durante el período de estudio, más del 90% de los ratones parecían gozar de buena salud y se incluyeron en el análisis correspondiente. En todos los experimentos, los animales se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento.

Para el experimento mostrado en las figuras 16A-D, se utilizaron ratones hembra C57BL/6J y C57BL/6J E16. Para las figuras 17A-G, se utilizó cada grupo de cinco ratones hembra C57BL/6J para el cultivo en placas de 12 pocillos. Para las figuras 9A-E y 10A-B, en experimentos que estudian la respuesta a la dosis, se utilizaron hembras acondicionadas C57BL/6J, de 8 semanas de edad, como huéspedes, con cuatro a cinco ratones en cada grupo, para dos experimentos. Como donantes de pulmón se utilizaron ratones hembra C57BL/6J-GFP, de 8 a 18 semanas de edad, y ratones hembra positivos para E15-16-GFP. Para las figuras 9A-E y 10A-B, se utilizaron siete hembras C57BL/6J acondicionadas como huéspedes, y C57BL/6J-GFP+ ratones hembras como donantes de pulmón. Para el experimento que se muestra en las figuras 11A-G, se trasplantaron ratones hembra acondicionadas Ragl-/--C57BL/6J (de 8 a 12 semanas de edad) con una mezcla 1:1 de 6 x 106 células pulmonares de adulto GFP+ y positivas para tdTomato. Para la figura 15 (mediciones de la función pulmonar), se trasplantaron ratones C57BL/6J en dos experimentos con 4 x 106 o 6 x 106 células pulmonares de adulto procedentes de ratones donantes C57BL/6J -GFP+. Se utilizaron C57BL/6J con y sin daño pulmonar como controles en ambos experimentos.

Ensayo de quimerismo mixto

Los ratones irradiados con 10 Gy se trasplantaron mediante CD45.1 de médula ósea singénica junto con pulmón embrionario derivado de la suspensión de células individuales de beta-actina GFP (CD45.2) a una proporción 1:1 -total de 106 células.

Inducción de lesión pulmonar

Para los estudios de lesión pulmonar, se disolvió naftaleno (más del 99% de pureza; Sigma-Aldrich) en aceite de maíz y se administró a una dosis de 200 mg por kg de peso corporal a ratones C57BL/6, mediante inyección intraperitoneal (IP), 3 días antes del trasplante de células pulmonares embrionarias, como se ha descrito previamente [Stripp, B.R., et al., American Journal of Physiology - Pulmon Cellular and Molecular Physiology (1995), 269(6): p. 791].

Para la lesión de "pulmón doble", los animales tratados con naftaleno después se irradiaron en un irradiador de rayos X (Xrad-320), 40-48 horas después de la administración de naftaleno, para una dosis total de 6 Gy TBI, y se trasplantaron de 4 a 24 horas después.

Tratamiento de citorreducción de células T (TCD)

Los ratones receptores se inyectaron IP con TCD 300 pg/ratón de anticuerpos anti-CD4 (clon GK1.5) y anti-CD8 (clon YTS169.4) 6 días antes del trasplante de células pulmonares embrionarias.

Tratamiento con ciclofosfamida (Endoxan)

Los ratones receptores se inyectaron IP con CY 100 mg/kg los días 3-4 después del trasplante de células pulmonares embrionarias (días 3 y 4).

Suspensión de células individuales pulmonares fetales de ratón: procedimientos de preparación y trasplante de células Las suspensiones de células se obtuvieron de pulmones de embriones y adultos de ratón digeridos con enzimas, como se ha descrito previamente [Liang S.X. et al., Physiological genomics (2005), 23(2):172]. Brevemente, la digestión pulmonar se realizó picando finamente el tejido con una hoja de afeitar en presencia de colagenasa 1 mg/ml (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) en PBS Ca+Mg+. Después de la incubación durante 30 minutos a 37 °C, se utilizó una aguja de 18 G para triturar los trozos de tejido. Después de otra incubación durante 30 minutos a 37 °C, se realizó una trituración adicional con una aguja 21-G. Los residuos no específicos se eliminaron mediante filtración secuencial a través de filtros de 100 gm. A continuación, las células se lavaron con 1 x PBS (libre de Ca y Mg) con FCS al 2%. Para evitar la acumulación de células antes de la inyección, se añadieron 50 unidades de heparina/ml a la suspensión de células individuales antes de la inyección i.v., y la suspensión se filtró de nuevo a través de filtros de 40 gm.

La suspensión de células aisladas se depuró de células T usando esferas magnéticas para CD4 y CD8.

Después del acondicionamiento con naftaleno (en el día -3) y TBI (día -1), se trasplantaron ratones C57BL/6J con 1 x 106 hasta 8 x 106 células pulmonares embrionarias E15-16 o adultas positivas para GFP inyectadas en la vena de la cola 4-24 horas después de la irradiación. En experimentos que utilizan marcaje con GFP y tdTomato, los ratones donantes Rag1'A-C57BL/6J se trasplantaron con una mezcla 1:1 de 6 x 106 células pulmonares positivas para GFP y para tdTomato inyectadas en la vena de la cola, 4-24 horas después de la irradiación.

Preparación e inyección de células expandidas de pulmón E16

Se recolectaron células pulmonares C57BL E16 positivas para GFP y se sembraron en placas de cultivo de tejidos con medio de acondicionamiento [soportes embrionarios de ratón irradiados (iMEF)] junto con factor de crecimiento epitelial (1 gM) e inhibidor de Rock (Y-27632, 5 gM). El medio se cambió cada 2 días y el inhibidor de Rock se añadió fresco cada vez. Después de 4 días, las células se pasaron dividiéndolas en 3 placas. Después de 3 días adicionales de cultivo, las células se usaron para el trasplante. Una suspensión unicelular que comprende 2 x 106 células expandidas se inyectó i.v. a ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y 6 GY TBI.

Preparación e inyección de células pulmonares adultas frescas

Se recogieron células pulmonares adultas de ratones C57BL/6 positivos para GFP (Jackson Labs, Bar Harbor, EE. UU.). Todos los ratones tenían entre 6 y 12 semanas de edad. Una suspensión unicelular que comprende 8 x 106 células pulmonares adultas se inyectó por vía intravenosa a ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y 6 GY TBI.

Evaluación de los focos GFP+ en pulmones quiméricos por morfometría

Los pulmones se fijaron con una disolución de PFA al 4% introducida a través de la tráquea a una presión constante de 20 cm H2O. Luego, los pulmones se sumergieron en fijador durante la noche a 4 °C. Los pulmones se procesaron después del tratamiento con PFA y se fijaron en sacarosa al 30% y se congelaron en un compuesto de temperatura de corte óptima (“Optimal Cutting Temperature”, OCT) (Sakura Finetek USA, Inc. Tissue-Tek). Se cortaron secciones escalonadas en serie, de 12 gm de espesor, a lo largo del eje longitudinal del lóbulo. La distancia fija entre las secciones se calculó para permitir el muestreo sistemático de al menos 20 secciones en todo el pulmón. Los cortes de pulmón se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Se contó el número real de focos GFP+ (se definió un grupo de más de 5 células GFP+ diferenciadas como un solo parche) por corte utilizando el software Image Pro. El área de cada corte se calculó mediante el software Image Pro, y el área promedio de los cortes y la frecuencia promedio de los parches GFP+ se evaluaron en todos los cortes (parche (P)/área (A) (mm2)), suponiendo que la frecuencia por área en un gran número de cortes refleja la distribución por volumen.

Citometría de flujo (FACS)

Se analizaron células de sangre periférica, médula ósea (BM), hígado fetal y pulmón fetal de ratones mediante citometría de flujo.

Se prepararon suspensiones de células individuales a partir de pulmones de ratón adulto y fetal mediante digestión enzimática y se analizaron mediante citometría de flujo policromática. Las muestras se tiñeron con anticuerpos conjugados o controles de isotipo coincidente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos se adquirieron en e-Bioscience, BD y Biolegend. Se proporciona la lista completa de los anticuerpos utilizados en el estudio (SI 4). Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences) o BD FACSCanto II y se analizaron con el software BD FACSDiva 6 o FlowJo (versión 7.6.5 o versión vX.0.7 Tree Star Inc).

Inmunohistoquímica (IHC)

Los animales se sacrificaron en diferentes momentos después del trasplante; los pulmones se inflaron a su máxima capacidad con una disolución de PFA al 4% y se mantuvieron durante 24 horas, luego se crioconservaron en sacarosa al 30% y se congelaron instantáneamente en isopentano preenfriado con aire líquido. Las muestras congeladas se cortaron en secciones de 12 gm y se tiñeron. La lista de anticuerpos y diluciones usados en este estudio se proporciona en la tabla 3, a continuación. Todos los anticuerpos secundarios se adquirieron en Jackson Immunoresearch Laboratories o Abcam.

Las muestras teñidas se evaluaron utilizando un microscopio fluorescente vertical Olympus BX51 con objetivos aéreos x10, x40 y de aceite x100, y una cámara digital Olympus (DP70), o con un microscopio confocal de disco giratorio invertido Nikon Eclipse Ti con objetivos aéreos de x10, x20 y objetivos de aceite x40, x60 y x100 para alta resolución. Las imágenes de microscopía de fluorescencia se adquirieron mediante el software DP Controller y DP Manager (Olympus). Las imágenes de microscopía confocal se adquirieron utilizando el software Andor iQ, y se analizaron y reconstruyeron en tres dimensiones (como se indica) con el software Imaris (Bitplane AG, Suiza, www.bitplane.com). En algunos casos, las imágenes se procesaron (se ajustaron la intensidad y el contraste, se superpusieron) en Adobe Photoshop.

Tabla 3: Una lista de los anticuerpos utilizados en el estudio.

Eliminación de células pulmonares embrionarias CD45+ por MACS

Se prepararon suspensiones unicelulares de pulmón adulto mediante digestión enzimática y, en algunos experimentos, células CD45+ depuradas por MACS usando columnas LS (Miltenyi Biotec) en tampón m Ac S (BSA al 0,5%, EDTA 2 mM en 1 x PBS estéril, filtrado y desgasificado) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el proveedor. Las células CD45+ se depuraron tratando las células mediante la unión con esferas magnéticas anti-CD45 (Miltenyi Biotec). Las poblaciones de células depuradas se analizaron mediante FACS, se sembraron en GFR Matrigel (BD) para el ensayo de formación de colonias como se indica en la sección “Resultados”.

Ensayo de formación de colonias de células in vitro

El ensayo de formación de colonias de células epiteliales se realizó de acuerdo con un protocolo previamente publicado [Bartoncello y McQualter, Stem cell biology (2011), 2G.1.1-2G.1.12] con algunas modificaciones. Brevemente, después del aislamiento inicial, la digestión pulmonar se realizó picando finamente el tejido con una hoja de afeitar en presencia de colagenasa al 0,1% y dispasa 2,4 U/ml (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) en PBS Ca+Mg+, seguido de una incubación a 37 °C durante 30 minutos. Los residuos no específicos se eliminaron mediante filtración secuencial a través de filtros de 100 pm. Las suspensiones de pulmón completo se lavaron en FCS al 2% en 1 x PBS. La suspensión de células individuales resultante se resuspendió en 100 pl de Matrigel (BD Biosciences) con factor de crecimiento reducido (GFR) prediluido 1:1 (vol/vol) con medio Epi-CFU y se cultivaron en una placa Transwell de 12 pocillos (1-1,5 x 105 células por pocillo; soportes permeables Transwell 0,4 pm, Corning), como se ha descrito [Bartoncello y McQualter (2011), supra]. El número absoluto de clones epiteliales se determinó después de 7-20 días en cultivo. Los clones en crecimiento se caracterizaron adicionalmente como se describe a continuación. Todos los cultivos celulares se llevaron a cabo a 37 °C en una incubadora humidificada con 7% de CO2. El medio se reemplazó cada 48-72 horas.

La caracterización morfológica y fenotípica de los organoides epiteliales desarrollados en cultivo como se describió anteriormente se llevó a cabo usando inmunohistoquímica de fluorescencia o de campo brillante de montaje completo. En resumen, las estructuras 3D cultivadas en condiciones de cultivo se fijaron y se permeabilizaron en una mezcla 1:1 de metanol y acetona durante 20 minutos a 4 °C. Luego, los cultivos de montaje completo se lavaron brevemente en 1 x PBS y se permeabilizaron y bloquearon usando Triton X-100 al 0,5% y suero de caballo al 10% en PBS durante 2 horas. Después de la permeabilización y el bloqueo, los cultivos se lavaron tres veces con PBS con Tween al 0,05% durante 20 minutos, seguido de una incubación con anticuerpos primarios durante 48-72 horas a 4 °C. Después de la tinción con anticuerpos primarios, los cultivos de montaje completo se lavaron con PBS y una disolución de Triton-X100 al 0,5% y se tiñeron con los anticuerpos secundarios pertinentes durante la noche a 4 °C, seguido de una contratinción con tinte Hoechst. Los cultivos de montaje completo se evaluaron mediante un microscopio de disco giratorio invertido Nikon Eclipse Ti. Las imágenes se adquirieron con el software Andor iQ y se reconstruyeron en tres dimensiones con el software Imaris (Bitplane AG, Suiza, www.bitplane.com).

Evaluación de los focos GFP+ en pulmones quiméricos por morfometría

Los pulmones se fijaron con una disolución de PFA al 4% introducida a través de la tráquea a una presión constante de 20 cm H2O. Luego, los pulmones se sumergieron en fijador durante la noche a 4 °C. Los pulmones se procesaron después del tratamiento con PFA y se fijaron en sacarosa al 30% y se congelaron en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (Sakura Finetek USA, Inc. Tissue-Tek.). Se cortaron secciones escalonadas en serie, de 12 pm de espesor, a lo largo del eje longitudinal del lóbulo. La distancia fija entre las secciones se calculó para permitir el muestreo sistemático de al menos 20 secciones en todo el pulmón. Los cortes de pulmón se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Se contó el número real de focos GFP+ (se definió un grupo de más de 5 células GFP+ diferenciadas se definió como un solo parche) por corte utilizando el software Image Pro (Media Cybernetics, Crofton, MD, www.mediacy.com). El área de cada cortó rebanada se estimó y calculó mediante el software Fiji (ImageJ, https://fiji.sc). El tamaño promedio de cada parche GFP+ se calculó, utilizando cortes aleatorios de ratones huésped trasplantados con 1 x 106 hasta 3 x 106 células pulmonares de adulto GFP+, en las que los parches GFP+ podían diferenciarse entre sí (figuras 9A-E). Después de determinar el tamaño promedio de los parches GFP+, se calculó el número de parches GFP+ para diferentes dosis de células (área de alto GFP+ total/área promedio de los parches GFP+ (mm2)), suponiendo que la frecuencia por área en un gran número de cortes refleja la distribución por volumen.

Cálculo del área injertada GFP+

Se prepararon cortes en serie de pulmones quiméricos procedentes de diferentes momentos después del trasplante y se tiñeron con anticuerpo anti-GFP en combinación con otros marcadores como se indica en la sección de ejemplos a continuación. Se cortaron secciones escalonadas en serie, de 12 pm de espesor, a lo largo del eje longitudinal del lóbulo. La distancia fija entre las secciones se calculó para permitir el muestreo sistemático de al menos 20 secciones en todo el pulmón. Los cortes se obtuvieron utilizando un microscopio fluorescente Olympus y una cámara digital Olympus (DP70) con objetivo x10. Cada imagen analizada se evaluó individualmente para la validación del patrón de tinción antes del procesamiento. Como se identificaron grandes parches positivos para GFP que contenían cientos de células en pulmones quiméricos, el software Fiji calculó el área injertada. El canal verde se extrajo de la imagen RGB. A continuación, se calculó el porcentaje del área injertada a partir de todo el tejido pulmonar. Las áreas injertadas tenían valores altos de intensidad verde, mientras que todo el tejido pulmonar tenía una intensidad verde baja (autofluorescencia), y las áreas del espacio aéreo aparecían oscuras. El tejido pulmonar completo excluyendo los espacios de aire que llenan la estructura pulmonar se detectó aplicando desenfoque de Gauss al canal verde (sigma = 3), estableciendo un umbral fijo bajo en la imagen borrosa y suavizando aún más los bordes para eliminar pequeños artefactos mediante las operaciones de dilatación y erosión. Se creó una máscara del tejido pulmonar completo (figuras 9A-E) y se midió su área. Se utilizó el método de umbral global RenyiEntropy [Kapur et al. Comput. Vis. Graph. Image Process. (1985), 29: 273-285] para calcular el umbral de intensidad del área de alta GFP (injertada) y para crear una máscara (figuras 11A-G y 12A-D). El porcentaje de área GFP+ injertada se calculó a partir de dos mediciones como área de alto GFP+ (injertada)/área de bajo GFP+ (tejido total) X 100. En la mayoría de los experimentos, se utilizó un software automático, pero, en algunos casos, se requirió el examen manual de los portaobjetos. Sin embargo, en todos los casos, el lector no conocía la identidad de la muestra.

Análisis de colocalización

El análisis de colocalización se realizó en secciones fluorescentes utilizando el software Imaris 7.7.2 (Bitplane AG, Suiza, www.bitplane.com). Se tiñeron conjuntamente múltiples cortes en serie procedentes de pulmones quiméricos con anticuerpo anti-GFP (verde) y uno de varios marcadores utilizados para el análisis de colocalización (siempre rojo). Las imágenes para el análisis se obtuvieron utilizando un microscopio fluorescente Olympus y una cámara digital Olympus (DP70) con objetivo x40. Cada imagen analizada se evaluó individualmente para la validación del patrón de tinción utilizado antes del procesamiento. Las imágenes se abrieron en el módulo de colocalización de Imaris, y el canal verde definió la región de interés (“region of interest”, ROI) para la colocalización, para concentrarse en las partes pertinentes de la imagen, definiendo el área GFP+ completa como 100%. Se creó un canal colocalizado; las estadísticas del canal se calcularon y exportaron a archivos de Excel. El grado de colocalización se evaluó como el porcentaje (%) de material de ROI colocalizado: (intensidad de rojo total en la región colocalizada/intensidad verde total en la ROI) x 100. Los datos se presentan como promedio ± d.e. de todas las imágenes analizadas para cada marcador.

Microscopía de dos fotones

Los ratones fueron sacrificados antes de la obtención de imágenes. Los pulmones se extirparon y se colocaron debajo de una cámara de formación de imágenes cubierta de vidrio. La formación de imágenes se realizó utilizando un microscopio multifotón Ultima (Prairie Technologies Middleton, WI) que incorpora un láser Mai Tai Ti-Sapphire pulsado (Newport Corp, CA). El láser se sintonizó a 850-900 nm para excitar EGFP o para excitar simultáneamente EGFP y tdTomato. Se utilizó un objetivo x20 sumergido en agua (NA 0,95) o x40 (NA 0,8) o un objetivo aéreo x10 (NA 0,3) de Olympus. Para crear un apilamiento Z típico, se escanearon secciones del pulmón que contenían células marcadas con GFP (los embriones del donante expresan GFP bajo el promotor de p-actina; por lo tanto, todas las células injertadas fueron positivas para GFP) a una profundidad de aproximadamente 30-150 pm con etapas z de 1 pm. Los datos se analizaron utilizando el software Imaris (Bitplane AG, Suiza, www.bitplane.com). Toda la renderización 3D de las imágenes se realizó con el software Imaris.

Evaluación de la hipersensibilidad de las vías respiratorias ("airway hyper-responsiveness", AHR)

Los ratones se anestesiaron con quetamina/xilazina, se traqueostomizaron y se ventilaron con un aparato FlexiVent (SCIREQ, Montreal, Quebec, Canadá). Después de la determinación de la línea de base de la resistencia de las vías respiratorias, los ratones fueron expuestos a metacolina 0 a 64 mg/ml nebulizada directamente en el circuito ventilatorio usando un nebulizador AeroNebLab (SCIREQ). Se utilizaron dos modelos de mecánica respiratoria para evaluar la resistencia pulmonar (R): el modelo lineal de primer orden de un solo compartimento y el modelo de fase constante. Todos los puntos de datos se recopilaron con el software FlexiVent (SCIREQ). Los resultados se expresaron como un aumento relativo de R sobre los valores de la línea de base.

Análisis estadístico

Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante un ensayo de la t. Para cada conjunto de datos, se calculó el promedio ± d.e. y este se presenta en la sección de “Resultados” del texto principal. Las diferencias entre los grupos se consideraron estadísticamente significativas para P < 0,05.

Ejemplo 1

El pulmón fetal como fuente de células madre hematopoyéticas para la inducción de la tolerancia al trasplante y el quimerismo

Los inventores de la presente invención demostraron previamente en un modelo de ratón singénico que tras el preacondicionamiento con naftaleno e irradiación corporal total (TBI), la infusión intravenosa de una suspensión de células individuales de células pulmonares canaliculares indujo un marcado quimerismo pulmonar a largo plazo [Rosen, C. et al., Nat. Med. (2015), 21 (8): p. 869-79]. Basándose en esta prueba de concepto, los presentes inventores han intentado alcanzar un nivel similar de quimerismo pulmonar tras el trasplante de células pulmonares embrionarias canaliculares de donantes alogénicos totalmente incompatibles. En general, la aceptación de tales trasplantes se puede lograr usando una inmunosupresión continua. Sin embargo, considerando los efectos secundarios problemáticos asociados con la supresión inmunitaria crónica, es más deseable una estrategia alternativa como la basada en la inducción de tolerancia inmunitaria. Está bien establecido que se puede inducir tolerancia inmunitaria después del trasplante de células madre hematopoyéticas que, si se injertan, pueden colonizar el timo y conducir a tolerancia central por selección negativa.

Los presentes inventores han descubierto ahora que el pulmón embrionario canalicular, que comprende no solo progenitores pulmonares epiteliales, sino también un nivel marcado de células madre hematopoyéticas, puede inducir un quimerismo hematopoyético duradero y de múltiples linajes. Específicamente, una población de progenitores hematopoyéticos pulmonares similar a la que se encuentra en la médula ósea de adulto (BM) y el hígado en estadio gestacional (E16) se puede distinguir mediante el análisis FACS de marcadores bien establecidos de progenitores hematopoyéticos (conocidos como células LSK - linaje negativo, SCA1+, c-KIT+, así como las células SLAM - linaje negativo CD41- CD48- CD150+) (figuras 1A-1F). Utilizando un ensayo de autorrenovación competitivo, se ilustró que los progenitores hematopoyéticos pulmonares pueden competir eficazmente con las células madre de la médula ósea de adulto normales (figuras 2A-E).

En consecuencia, como se ilustra en la figura 3, se estableció un nuevo protocolo de acondicionamiento subletal que comprende el preacondicionamiento del animal receptor con citorreducción de células T in vivo (6 días antes del trasplante), naftaleno (3 días antes del trasplante) e irradiación corporal total (TBI, 1 día antes del trasplante). A continuación, a los animales receptores se les administra una suspensión unicelular derivada del donante de células pulmonares depuradas de células T, seguido de una inmunosupresión a corto plazo con ciclofosfamida 3 y 4 días después del trasplante. Este protocolo logra una tolerancia inmunitaria duradera y un quimerismo pulmonar para las células pulmonares embrionarias alogénicas (figuras 4A-C, 4J y 5A-F) en virtud de las HSC que están presentes en el pulmón canalicular. En particular, los progenitores hematopoyéticos pulmonares fueron capaces de inducir quimerismo en la sangre periférica del receptor (figuras 4A-G), así como en la médula ósea del receptor (figuras 4H-L). Tomados en conjunto, los progenitores hematopoyéticos pulmonares son capaces de inducir tolerancia central a las células pulmonares trasplantadas que permiten un injerto de larga duración en ausencia de inmunosupresión crónica.

Ejemplo 2

Inducción de quimerismo hematopoyético después del trasplante de células pulmonares adultas frescas

Se recolectaron células pulmonares adultas de un ratón C57BL/6 positivo para GFP y se inyectó una suspensión de una sola célula que comprendía 8 x 106 i.v. en ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y 6 GY TBI.

Ocho semanas después del trasplante, se obtuvo tejido pulmonar de ratones trasplantados, se fijó y se analizó en busca de parches positivos para GFP. Como es evidente a partir de los resultados (figuras 6A-F), se encontró un número notable de parches positivos para GFP derivados del donante en los pulmones del receptor. Además, el análisis de sangre reveló la inducción de quimerismo sanguíneo por infusión de células pulmonares adultas similar a la obtenida por células pulmonares fetales E16 (figuras 7A-J).

Ejemplo 3

Inducción de quimerismo pulmonar después del trasplante de células pulmonares expandidas ex vivo

Las células pulmonares se expandieron ex vivo obteniendo en primer lugar células pulmonares C57BL E16 positivas para GFP y sembrando las células en placas de cultivo de tejidos con un medio de acondicionamiento adecuado (iMEF) junto con el factor de crecimiento epitelial y el inhibidor de Rock. Una suspensión unicelular que comprende 2 x 106 células expandidas se inyectó i.v. en ratones receptores C57BL/6 después del acondicionamiento con NA y 6 GY TBI.

Ocho semanas después del trasplante, se obtuvo tejido pulmonar de ratones trasplantados, se fijó y se analizó en busca de parches positivos para GFP. Como es evidente a partir de los resultados (figuras 8A-F) se encontró un número notable de parches positivos para GFP derivados del donante en los pulmones del receptor.

Ejemplo 4

Caracterización FACS de progenitores en el pulmón de ratón adulto

Los presentes inventores caracterizaron la composición celular de pulmón de ratón fetal frente a adulto. Como se puede esperar, la composición celular del pulmón de ratón adulto es diferente de las células de pulmón fetal E16 (figura 16A). El pulmón adulto exhibió niveles más altos de células CD31+ endoteliales y CD45+ hematopoyéticas, así como de progenitores mesenquimáticos CD45- CD31- Ep- Leva- SCA-1+ PDGR- alfa+ (1,9 ± 0,29% frente a 0,1 ± 0,05%) (figuras 16B, 16D), mientras que la concentración de progenitores epiteliales de ratón CD45- CD31- Ep- Leva+ CD24+ (figuras 16 B-C) fue menor en el pulmón adulto (1,13 ± 0,05% frente a 8,1 ± 1).

Ejemplo 5

Diferenciación in vitro de células pulmonares adultas

Para evaluar la actividad regenerativa potencial de los progenitores pulmonares epiteliales dentro de la preparación pulmonar de adulto, los presentes inventores ensayaron inicialmente su capacidad para formar organoides pulmonares. ex vivo (figura 17A). Después de la eliminación de las células hematopoyéticas CD45+, las células pulmonares adultas restantes se sembraron en placas de cámara cubiertas con Matrigel, y 2-3 semanas después, se observó en los cultivos la presencia de organoides pulmonares. Las placas que contienen los organoides se fijaron y tiñeron para diferentes marcadores de diferenciación pulmonar. Aunque se obtuvo un número menor de organoides en comparación con las células pulmonares fetales, pudieron detectarse claramente organoides tanto alveolares como bronquiolares (figuras 17B-C).

Además, no solo pudieron encontrarse células epiteliales (CK+ o ATI+) dentro de los organoides en crecimiento, sino que también se observaron células mesenquimáticas nestina+ y Sca1+ (figuras 17D-G).

Ejemplo 6

Capacidad de formación de parches de las células pulmonares adultas

Los resultados preliminares descritos anteriormente sugirieron poderosamente que los progenitores pulmonares adultos podrían ofrecer una fuente adicional para el trasplante. Sin embargo, considerando las limitaciones de los ensayos ex vivo, era fundamental verificar esta posibilidad mediante el uso del ensayo actual recientemente desarrollado para los progenitores formadores de 'parches' in vivo.

Como describieron previamente Rosen et al. [Rosen, C. et al., Nat. Med. (2015), supra], este ensayo, basado en el trasplante de progenitores de pulmón fetal E16 GFP+ hacia receptores acondicionados con naftaleno y TBI 6 GY, conduce a la formación de parches clonogénicos discretos probablemente derivados de un solo progenitor. Considerando que los pulmones fetales exhiben niveles más altos de progenitores epiteliales CD45-CD31-EPCAM+CD24+, los presentes inventores inicialmente eligieron usar un número de células 4 veces mayor para el trasplante de pulmón adulto. Por tanto, los presentes inventores utilizaron 4 x 106 células pulmonares adultas procedentes de donantes C57BL-GFP y evaluaron el quimerismo en los pulmones de los receptores 8 semanas después del trasplante. Como se muestra en la figura 9A, la tinción histológica reveló parches GFP+ en el pulmón del huésped, lo que indica que el pulmón adulto contiene de hecho progenitores formadores de parches.

Con el fin de comparar cuantitativamente la frecuencia de estos progenitores en pulmones adultos frente a pulmones fetales, los presentes inventores llevaron a cabo un experimento de respuesta a la dosis, en el que de 1 a 8 x 106 células adultas positivas para GFP se trasplantaron desde ratones donantes C57BL después de acondicionar a los receptores con naftaleno y 6 GY TBI 48 horas después. Como control positivo, se administraron 1 x 106 células pulmonares fetales GFP. Los ratones se sacrificaron 8 semanas después del trasplante y sus pulmones se evaluaron mediante inmunohistología. Utilizando el software FIJI, capaz de distinguir entre diferentes intensidades de fluorescencia, se registró y analizó el nivel de intensidad de GFP en todo el pulmón (figuras 9B-E). El área negra en el pulmón del huésped indica el fondo del campo escaneado que representa un área vacía sin células. El verde débil indica células huésped negativas para GFP (autofluorescencia), mientras que la tinción verde intensa marca las células positivas para GFP derivadas del donante. El cálculo del software no toma en cuenta el área negra del fondo y puede calcular el porcentaje del área de alto nivel de GFP de la región celular total.

Una advertencia con respecto a este cálculo está relacionada con el tamaño del parche, que aumenta proporcionalmente con el aumento de la dosis celular. Por tanto, a dosis altas de células, resulta cada vez más difícil definir los bordes del parche, y los parches observados pueden incluir dos o tres parches vecinos. Para abordar este problema, los presentes inventores intentaron definir el tamaño promedio de un solo parche GFP observado a una dosis baja de células, en la cual los parches individuales se pueden delinear claramente, y esta área promedio se usó para calcular el número de parches formados después del trasplante a alta dosis celular. Por lo tanto, el número de parches en un área total de 2 x 2 x 1 mm3 se calcula para cada pulmón. De nuevo, como puede verse en las figuras 10A-B, esta forma de análisis mostró una dependencia lineal de la dosis celular.

En conjunto, este análisis sugirió que el trasplante de aproximadamente 3 x 106 células pulmonares de un donante adulto dan como resultado cuantitativamente el mismo nivel de quimerismo encontrado después del trasplante de 1 x 106 células pulmonares fetales E16, lo que indica que la frecuencia de células formadoras de parches es aproximadamente 3 veces menor que la encontrada en el pulmón fetal E16.

Ejemplo 7

Análisis tridimensional mediante microscopía de dos fotones de parches derivados de donantes

Para visualizar la integración de células derivadas del donante GFP+ en la estructura tridimensional del pulmón, se utilizó una microscopía de dos fotones, inmediatamente después del sacrificio de los ratones trasplantados (SI 3).

De modo notable, como se demostró anteriormente para las células pulmonares E16, solo se encontraron parches verdes o rojos discretos sin parches amarillos después del trasplante de una mezcla 1:1 de células pulmonares adultas positivas para GFP verde y TdTomato rojo (figuras 11A-G), lo que indica claramente que cada parche se deriva de un único progenitor pulmonar.

Ejemplo 8

Localización pulmonar de parches derivados de donantes

En general, los parches derivados de donantes se pueden clasificar por su ubicación anatómica dentro del pulmón, a saber, parches bronquiolares, bronquioalveolares y alveolares. Como puede verse en las figuras 12A-D, el trasplante de células pulmonares adultas conduce predominantemente a parches alveolares de forma similar a los resultados con células pulmonares fetales. Sin embargo, también se detectaron parches bronquiolares y bronquioalveolares, aunque hubo una tendencia a un nivel más pronunciado de tales parches después del trasplante de pulmón fetal.

Ejemplo 9

Análisis inmunohistológico de parches pulmonares derivados de donantes

Los presentes inventores caracterizaron a continuación los tipos de células formados dentro de los parches derivados del pulmón de adulto. Como puede verse en las figuras 13A-J, el análisis inmunohistológico reveló la presencia de células epiteliales (CK+) (figuras 13A-C y 13J), endoteliales (CD31+) (figuras 13D-F y 13J) y mesenquimáticas (nestina+) (figuras 13G-J) dentro de cada parche.

Dentro del linaje epitelial, este análisis reveló ambos tipos de células alveolares diferenciadas, a saber, células alveolares de tipo I (ATI), responsables del intercambio de gases entre los alvéolos y la sangre, y células alveolares de tipo II (ATII), responsables de la secreción de tensioactivo. Se usó un anticuerpo contra acuaporina 5, un canal de agua principal expresado en células ATI, para identificar células ATI (figuras 14A-C), mientras que se usó la proteína C tensioactiva para teñir células ATII (figuras 14D-F). Otro tipo de célula importante es la célula Club, que se encuentra en los bronquiolos; estas células protegen el epitelio bronquiolar, secretando proteínas como la uteroglobina y otros componentes similares al tensioactivo. Las células Club, identificadas por tinción para la proteína CCSP (CC16, figuras 14G-I) también son responsables de desintoxicar las sustancias nocivas inhaladas en los pulmones. Finalmente, como se muestra en las figuras 14J-L, los presentes inventores también encontraron colocalización del regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (“cystic fibrosis transmembrane conductance regulator”, CFTR) dentro de las células derivadas del donante GFP+, lo que indica que, como en los trasplantes de células E16, las células trasplantadas pueden potencialmente proporcionar funciones que faltan en el pulmón enfermo de los pacientes con fibrosis quística.

Ejemplo 10

Evaluación funcional de la reparación de lesiones pulmonares

La marcada colonización pulmonar con células derivadas del donante dentro de diferentes linajes de células pulmonares (figuras 18A-I y 19A-L) indicó claramente que el procedimiento de trasplante actual podría ofrecer una nueva modalidad para la regeneración pulmonar. Para ensayar la capacidad funcional de las células trasplantadas, se midió la resistencia dinámica (R) del pulmón después de la exposición a metacolina (64 mg/ml). Como se puede ver en la figura 15, este parámetro, que evalúa cuantitativamente el nivel de constricción en los pulmones, se reduce significativamente después de la exposición a naftaleno más 6 GY TBI (P = 0,0004) y se restauró por completo 8 semanas después del trasplante de 4 x 106 células pulmonares adultas (P = 0,0275).

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión que comprenden una cantidad eficaz de células precursoras hematopoyéticas (HPC) o suplementadas con HPC, en las que dicha cantidad eficaz es una cantidad suficiente para lograr tolerancia a dichas células de tejido pulmonar en ausencia de un régimen inmunosupresor crónico, y en las que dicha cantidad eficaz de dichas HPC comprende al menos aproximadamente 1 x 105 células por kg de peso corporal de un sujeto, para su uso en el tratamiento de un trastorno o lesión pulmonar en un sujeto que lo necesite o para inducir tolerancia específica de donante en un sujeto que necesite un trasplante de células o tejidos pulmonares.

2. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según la reivindicación 1, que comprenden además un protocolo de acondicionamiento subletal, letal o supraletal.

3. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según la reivindicación 2, en las que dicho protocolo de acondicionamiento comprende un acondicionamiento de intensidad reducida (RIC) y, opcionalmente, en las que dicho protocolo de acondicionamiento comprende al menos uno de los siguientes: citorreducción de células T in vivo, irradiación corporal total (TBI), irradiación linfoide total (TLI), irradiación corporal parcial, un agente quimioterapéutico y/o una inmunoterapia con anticuerpos.

4. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, que comprenden además un agente capaz de inducir daños al tejido pulmonar, en las que dichos daños dan como resultado la proliferación de células madre residentes en dicho tejido pulmonar.

5. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según la reivindicación 4, en las que dicho agente capaz de inducir daños al tejido pulmonar comprende naftaleno o ciclofosfamida.

6. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que además comprenden el uso de un agente inmunosupresor hasta dos semanas después de dichas células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión, y opcionalmente en las que dicho agente inmunosupresor comprende ciclofosfamida y, opcionalmente, en las que dicha ciclofosfamida:

(i) es para una administración de dosis única; o

(ii) es para una administración de dos dosis.

7. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según la reivindicación 6, en las que cada una de dichas dos dosis:

(i) comprende una concentración de aproximadamente 50-150 mg por kg de peso corporal; y/o

(ii) se lleva a cabo los días 3 y 4 después de dichas células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión.

8. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en las que dichas células de tejido pulmonar comprenden:

(i) células pulmonares de mamífero y, opcionalmente, en las que dichas células pulmonares de mamífero son células humanas; y/o

(ii) células pulmonares fetales y, opcionalmente, en las que dichas células pulmonares fetales proceden de un feto en un estadio de desarrollo correspondiente a la de un órgano/tejido pulmonar humano en un estadio gestacional seleccionado de un intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 22 semanas de gestación; y/o

(iii) células pulmonares adultas; y/o

(iv) células desdiferenciadas; y/o

(v) células expandidas ex vivo.

9. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en las que dichas células de tejido pulmonar en suspensión están:

(i) a una dosis de al menos aproximadamente 10 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto; o (ii) a una dosis de al menos aproximadamente 40 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto; o (iii) a una dosis de al menos aproximadamente 100 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto; o

(iv) depuradas de células T.

10. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en las que dichas HPC comprenden:

(i) células CD34+ y/o células de molécula de activación linfocítica de señalización (SLAM); y/o

(ii) al menos aproximadamente 1 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto; y/o

(iii) al menos alrededor de 10 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

11. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en las que dichas células suplementadas con dichas HPC comprenden:

(i) la adición de HPC obtenidas del mismo donante que dicho tejido pulmonar; y/o

(ii) dichas células de tejido pulmonar en la misma formulación que dichas HPC; o

(iii) dichas células de tejido pulmonar en una formulación distinta de dichas HPC.

12. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en las que dichas células de tejido pulmonar en suspensión comprenden una población heterogénea de células.

13. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, formuladas para una vía intravenosa o una vía de administración intratraqueal.

14. Las células de tejido pulmonar no singénicas en suspensión para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en las que dicho sujeto que necesita dicho trasplante de células o tejidos pulmonares tiene un trastorno o lesión pulmonar, y opcionalmente en las que dicho trastorno o lesión pulmonar comprende inflamación crónica de los pulmones.