WO2019190176A1 - 글리시리진-글리콜 키토산 컨쥬게이트가 코팅된 산화철 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents

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pancreatic
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이동윤
장수빈
이상준
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한양대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to nanoparticles coated with a glycyrrhizin-glycol chitosan conjugate, and to an implantable pancreatic islet cell composition using the same.
  • type 1 diabetes reduces the number of beta cells that function normally in the pancreas, which results in insufficient insulin secretion. As a result, hyperglycemia occurs due to poor glycemic control, which leads to various complications.
  • pancreatic islet cells are transplanted to the liver, but since the cells are injected through the portal vein, an instant blood mediated inflammatory reaction (IBMIR) is induced.
  • IBMIR instant blood mediated inflammatory reaction
  • pancreatic islet cell tracking is also difficult. For these reasons, a very high marginal pancreatic islet mass is required for blood sugar control.
  • pancreatic islets This may be a factor that makes the transplantation of pancreatic islets practically difficult due to the limitation of organ donors. Therefore, there is a need for a technique capable of successfully engrafting pancreatic islets into the liver tissue of diabetic patients and continuously monitoring their survival rate and functionality.
  • An object of the present invention is to include nanoparticles coated with a biocompatible polymer-glycisine conjugate in order to overcome heterogeneous islet cell loss caused by blood flow, which is the biggest problem of islet cell transplantation, and autoimmune reactions occurring after transplantation. It is to provide a composition for transplanting pancreatic islets and islets for transplantation treated with the composition.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating islet cell-deficiency diseases including the transplanted islet cells.
  • an aspect of the present invention is a composition for transplanting pancreatic islets comprising nanoparticles coated with a biocompatible polymer-glycisine conjugate, wherein the biocompatible polymer-glycisine conjugate is covalently linked to pancreatic islet transplantation. It provides a composition for.
  • HMGB1 high mobility group protein B1
  • TLR external immune cells
  • RAGE receptors of external immune cells
  • Secreted cytokines re-externally stimulate pancreatic islets, resulting in a repeated cycle of pancreatic islets expressing and releasing more HMGB1 proteins, resulting in the loss of large amounts of transplanted pancreatic islets.
  • the present inventors have covalently bonded a glycyrrhizin capable of capturing HMGB1 protein to the biocompatible polymer backbone to synthesize a biocompatible polymer backbone-glycirizine conjugate.
  • glycyrrhizin is a component extracted from licorice that binds directly to the A box domain of HMGB1 protein to inhibit activity and extracellular release.
  • glycyrazine has a very short half-life in the body and, for example, intravenous injection of about 5 mg / kg does not remain in the body for more than about 15 minutes and has a limit to commercialization as a pharmaceutical preparation.
  • the half-life in the body can be increased, and the amount of uptake into the cell can be increased to enhance the effect.
  • the glycyrrhizin of the present invention may be modified in a range that does not lose its inherent properties, for example, may be in an oxidized form.
  • the bond between carbons 2 and 3 of the terminal glucuronic acid ring is opened by oxidation to form an aldehyde substituent.
  • the aldehyde group thus formed can form a bond with the biocompatible polymer backbone.
  • biocompatible polymer backbone refers to a polymer having tissue compatibility and blood compatibility that does not destroy tissue or coagulate blood in contact with living tissue or blood. And, it means a polymer that serves as a backbone capable of forming a bond with a number of glycyrrhizin.
  • the biocompatible polymer backbone of the invention comprises a functional group capable of forming a chemical bond with an aldehyde group.
  • glycyrrhizin in the oxidized form may include any aldehyde group and may be used without limitation as long as it is a biocompatible polymer including a substituent capable of forming a chemical bond with an aldehyde group.
  • the functional groups included in the biocompatible polymer backbone of the present invention are amine groups, carboxyl groups, thiol groups or hydroxide groups.
  • a biocompatible polymer backbone containing an amine group may be used.
  • the biocompatible polymeric backbone of the invention is glycol chitosan, poly-L-lysine, poly (4-vinylpyridine / divinylbenzene), chitin, poly (butadiene / acrylonitrile) amine ends , Polyethyleneimine, polyaniline, poly (ethyleneglycol) bis (2-aminoethyl), poly (N-vinylpyrrolidone), poly (vinylamine) hydrochloride, poly (2-vinylpyridine), poly (2-vinyl Pyridine N-oxide), poly- ⁇ -Cbz-L-lysine, poly (2-dimethylaminoethyl methacrylate), poly (allyl amine), poly (allylamine hydrochloride), poly (N-methylvinylamine) , Poly (diallyldimethylammoniumchloride), poly (N-vinylpyrrolidone), chitosan, or poly (4-aminostyrene
  • glycol chitosan is a biocompatible and biodegradable material, and is used in various fields such as tissue engineering and drug delivery.
  • glycol chitosan it has been difficult to be used as a pharmaceutical preparation due to the problem of toxicity due to its positive charge.
  • the biocompatible polymer backbone and glycyrrhizin are connected by covalent bonds, and the covalent bonds are amide bonds, carbonyl bonds, and ester bonds. It can be selected from the group consisting of a sulfide amide bond (thioester bond) and sulfonamide bond (sulfonamide bond). More preferably, the covalent bond may be an amide bond formed by the reaction of the carbonyl group of glycidyl oxidized by treatment with sodium periodate and the amine group of the biocompatible polymer backbone.
  • glycyrazine-biocompatible polymers can be uniformly absorbed into the pancreatic islets by absorbing a large amount of glycyrizine-biocompatible polymer backbone conjugates into the target site. A method of coating the backbone conjugates on the nanoparticles was used.
  • nanoparticle refers to a structure or material having a size of nanometers (nm).
  • the nanometer size is a micron meter ( 10-6 ) scaled down to one-tenth of a millimeter.
  • the size of a material When the size of a material is reduced to nanometers, it exhibits a variety of unique physical, chemical, mechanical, and electronic properties.
  • the nanoparticles generally have an average size of about 1 nm to about 500 nm, for example, about 1 nm to about 50 nm, about 50 nm to about 100 nm, about 100 nm to about 250 nm, about And may range from 250 nm to about 500 nm.
  • the nanoparticles of the present invention may be prepared in a size of 1 to 100 nm, preferably 1 to 50 nm, more preferably 1 to 20 nm.
  • the size of the nanoparticles is 500 nm or more, the settling speed is increased, causing inconvenience in use, and dispersing agents such as glucose, sucrose, glycerolol, polyethyleneamine, and bitine should be used to prevent sedimentation.
  • the nanoparticles may be organic or inorganic nanoparticles, preferably magnetic nanoparticles (magnetic nanoparticle).
  • magnetic refers to the magnetic properties represented by a material. All materials interact with the magnetic field to produce an attractive or repulsive force. That is, when a magnetic field is applied to a substance, it is magnetized and classified into a ferromagnetic substance, a paramagnetic substance, a diamagnetic substance, and a ferrimagnetc substance according to the aspect in which the object is magnetized.
  • magnetic nanoparticles refers to nanometer-sized structures or materials that are magnetic.
  • the magnetic nanoparticles may be prepared by solution synthesis, co-precipitation, sol-gel method, high energy pulverization, hydrothermal synthesis, microemulsion synthesis, pyrolysis or sonic chemical synthesis, but is not limited thereto.
  • the magnetic nanoparticles may be selected from the group consisting of iron (Fe), cobalt (Co), nickel (Ni), manganese (Mn), gadolinium (Gd), oxides thereof, or alloys thereof. It may be, but is not limited thereto.
  • the magnetic nanoparticles are magnetic nanoparticles made of iron or iron oxide.
  • a general method for coating a glycyrazine-biocompatible polymer backbone conjugate on nanoparticles is i) a method of attaching functional groups present on the biocompatible polymer to nanoparticles, ii) pre-synthesized grafting the biocompatible polymer onto the surface of the nanoparticle, or attaching the biocompatible polymer by click chemistry, iii) a block polymer comprising a block having functional groups capable of binding to the nanoparticle (block polymer) as a biocompatible polymer, iv) a biocompatible polymer having a grafting group capable of wrapping nanoparticles, v) the biocompatible polymer and nanoparticles
  • a block polymer comprising a block having functional groups capable of binding to the nanoparticle (block polymer) as a biocompatible polymer
  • iv) a biocompatible polymer having a grafting group capable of wrapping nanoparticles v) the biocompatible polymer and nanoparticles
  • amphiphilic polymers
  • the biocompatible polymer comprises a functional group capable of binding to the nanoparticles
  • the functional group may be an amine group, a carboxyl group, a thiol group, or a hydroxide group, preferably a hydroxide It may be a rockside group.
  • the thermal decomposition technique used in the production of magnetic nanoparticles can be used for nanoparticle coating.
  • the conjugate may be wrapped on the surface of the iron oxide nanoparticles by the —OH functional group present in the polysaccharide of glycol chitosan by reacting the iron oxide nanoparticles with the glycyrazine-glycol chitosan conjugate at a high temperature.
  • This method has the advantage that the conjugate is stably coated on the surface of the nanoparticles by a large amount of -OH functional group, but may cause a disadvantage that the polysaccharide itself is decomposed when reacted at a high temperature for too long time.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating islet cell-deficiency diseases comprising the islet cell comprising the composition for transplanting the islet cells as an active ingredient.
  • Pancreatic islet cells comprising a composition for transplanting pancreatic islets containing GC-SPIO inside cells may be used for all diseases that may be caused by pancreatic islet-defective cells because cell viability increases during transplantation in vivo.
  • the on / off method described in Example 3 may be used as a method for absorbing the composition for transplanting pancreatic islets into the pancreatic islets.
  • the pancreatic islet-deficient disease of the present invention is a disease selected from the group consisting of type 1 diabetes, type 2 diabetes, and diabetic chronic kidney disease.
  • the type 1 diabetes, type 2 diabetes and diabetic chronic kidney disease are all diseases that can be treated by islet transplantation.
  • the islet cell-deficient disease of the invention is type 1 diabetes.
  • Type 1 diabetes is caused by the destruction of the beta cells of the pancreatic islets that secrete insulin and the loss of insulin secretion function, so islet transplantation may be a good treatment for type 1 diabetes.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be. On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-1000 mg / kg body weight per day.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • Another aspect of the invention provides a method for producing transplanted pancreatic islets comprising the following steps:
  • the step of contacting the pancreatic islet cell composition of (a) and the islet cells in a state separated from the donor is a method of treating the pancreatic islet cell transplant composition to the culture medium after culturing the islets Can be made.
  • (b) may be made in a manner to generate a magnetic force by contacting a magnet on one side of the islet cell culture plate, the magnet used may be used without limitation, such as neodymium magnets, electromagnets.
  • (c) is a step of mixing the pancreatic islet cell transplant composition is uniformly present in the islet cell culture medium
  • the mixing method may be made by pipetting (stirring) or (stirring) have.
  • the pipetting may be performed for 0.1 to 5 minutes, preferably for 0.5 to 3 minutes.
  • the method for producing transplanted pancreatic islets may further comprise the step (d) of leaving the pancreatic islets for 0.1 to 5 minutes after step (c), preferably from 0.5 minutes to It may further comprise leaving for 3 minutes.
  • the method for producing transplanted pancreatic islets may be repeated one to twenty times the steps (b) to (d), preferably steps (b) to (d) 5 Can be repeated 12 to 12 times.
  • the present inventors studied a method for efficiently introducing GC-SPIO into pancreatic islets, and after repeating the steps of applying magnetic force, pipetting and neglecting the pancreatic islets of GC-SPIO, It was confirmed that the absorption efficiency significantly increased.
  • the method of absorbing GC-SPIO into the islet cells was named "on / off system”.
  • the GC-SPIO absorbed into the islet cells captures the HMGB1 protein, which has been transported to the cytoplasm inside the cell nucleus, and the HMGB1 protein is then degraded by cellular activity.
  • the islet cells for transplantation prepared by the above method have increased survival rate, thereby enabling blood sugar regulation due to long-term insulin secretion.
  • the transplanted islet cells prepared by the method have responsiveness to magnetic force due to GC-SPIO contained in the cells. Specifically, when xenograft is transplanted, the largest amount of xenograft is transplanted into the mesenchymal 1 of the mesenchyme, so applying magnetic force by magnet (for example, neodymium magnet) to this part is applied to the islet islet. Islet cells that have absorbed multiple GC-SPIOs settle in mesenchymal 1. This can reduce heterogeneous pancreatic islet cell loss, which was unspecified at the time of transplantation due to the existing blood pressure and blood flow rate.
  • magnet for example, neodymium magnet
  • pancreatic islet cells it is possible to reduce the number of transplanted pancreatic islets according to the decrease of pancreatic islet cells, thereby reducing the fatigue of the individual to be treated, and due to the increased rate of delivery of pancreatic islets to the mesenchyme, blood glucose control function can be significantly improved.
  • Transplantation of pancreatic islet cells prepared by the above method selects appropriate graft sites known in the art (e.g., under the renal capsule and portal vein), and is used for ultrasound in a manner known to the graft site, for example, without intraperitoneal incision. Under the percutaneous portal vein can be carried out through the method of injecting the prepared islets into the liver.
  • Suitable conditions for transplantation of pancreatic islets are ABO-matched, with an islet count of at least 5,000 / kg (object weight), islet purity of at least 30%, final volume of less than 10 ml, gram staining negative, Endotoxin negative is a transplant condition (Shapiro J et al., International trial of the edmonton protocol for islet transplantation, N Engl J Med 355: 1318-1330 (2006)).
  • the method for producing transplanted pancreatic islet cells of the present invention relates to a method for using the composition for transplanting pancreatic islet cells of the present invention as described above, and the overlapping description will be omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention also provides a composition for MRI imaging comprising magnetic nanoparticles (GC-SPIO) coated with a biocompatible polymer-glycisine conjugate.
  • GC-SPIO magnetic nanoparticles
  • the magnetic nanoparticles are iron (Fe), cobalt (Co), nickel (Ni), manganese (Mn), gadolinium (Gd), oxides thereof or alloys thereof (alloy) thereof It may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • MRI contrast composition of the present invention relates to a method of using nanoparticles coated with the biocompatible polymer-glycisine conjugate contained in the composition for transplantation of pancreatic islets according to the present invention. It is omitted to avoid complexity.
  • the GC-SPIO may function as a negative contrast agent (T2 contrast agent) that darkens the corresponding site through magnetic field disturbance in MRI equipment due to the inherent properties of the iron oxide nanoparticles. .
  • T2 contrast agent negative contrast agent
  • the present invention can provide a method for transplanting pancreatic islet cells comprising GC-SPIO, the transplantation may be performed in a magnetic induction environment.
  • the transplantation may be performed in a magnetic induction environment.
  • the present invention relates to a nanoparticle (GC-SPIO) coated with a biocompatible polymer-glycisine conjugate, graft islet cells prepared using the same, and an MRI contrast composition comprising the same, wherein the GC-SPIO binds to the HMGB1 protein.
  • pancreatic islet cells comprising the magnetic nanoparticles coated with the biocompatible polymer-glycisine conjugate can be tracked in real time through MRI, and have an advantage of quantitatively confirming the amount of transplanted pancreatic islets.
  • GC glycyrrhizin-glycol chitosan conjugates
  • Figure 2 shows the results of analysis of the iron oxide nanoparticles (GC-SPIO) coated with glycol chitosan, glycyrrhizin-glycol chitosan conjugate, bare SPIO and glycyrrhizin-glycol chitosan conjugate (GC-SPIO).
  • 3 is a result of measuring the potentials of bare SPIO and GC-SPIO (A) and particle size (B) by transmission electron microscope.
  • pancreatic islet cells unlabeled islet-control group, GC-SPIO untreated pancreatic islets; pancreatic islet cells treated with random uptake-GC-SPIO; Islet cells continuously induced with magnetic force after treatment with magnet-GC-SPIO; And on / off system-GC-SPIO-treated islet cells repeated 1 minute magnetic force induction, pipetting, 1 minute culture without magnetic force.
  • FIG. 5 shows the results of quantitative analysis of the absorption of GC-SPIO after treating GC-SPIO to pancreatic islets by various methods (simple treatment, magnetic force induction, magnetic force induction + pipetting, on / off system): SPIO without magnet- Simple treatment of GC-SPIO in islet cells; SPIO with magnet (On) -Magnetic contact after GC-SPIO treatment on islet cells; SPIO with magnet (On + Pipetting)-Magnetic contact + pipetting after GC-SPIO treatment on islet cells; And SPIO with magnet (On / Off) -treated with GC-SPIO on islet cells followed by on / off cycles.
  • FIG. 6 shows the results of cell survival after treatment of GC-SPIO to pancreatic islets by various methods (magnetic induction, magnetic induction + pipetting, on / off system): intact islet-control, intact islet cells.
  • Figure 7 is a result of quantitative analysis of the absorption amount of GC-SPIO after treating the pancreatic islet cells with various concentrations of GC-SPIO in an on / off system method.
  • 11 is a result of confirming the level of HMGB1 protein released from the nucleus of the cells after the treatment of GC-SPIO in the islet cells.
  • FIG. 13 shows the results of quantifying the methylene blue solution found in each mesenchymal after injecting methylene blue solution to the mouse by portal vein transplantation: control, M1 & M2 are mesenchymal 1 & 2, and C1 & C2 are caudal lobe 1 & 2, respectively. , L is left lobe, RP is right posterior lobe and RA is right front lobe.
  • 15 is a result of quantifying insulin secretion levels according to the presence or absence of magnetic force after injecting GC-SPIO-absorbed pancreatic islets into the mouse by portal vein transplantation.
  • FIG. 16 shows the results of confirming the engraftment of pancreatic islets according to the presence or absence of magnetic force after injecting pancreatic islets with GC-SPIO into the mouse by portal vein transplantation.
  • 17 is a result of quantifying the degree of engraftment of pancreatic islets according to the presence or absence of magnetic force after injecting GC-SPIO-induced pancreatic islets into the mouse by portal vein transplantation.
  • Figure 18 is a result of injecting pancreatic islet cells absorbing GC-SPIO into the mouse by portal vein transplantation and then isolated the mesenchyme and confirmed with a microscope.
  • 21 is a schematic diagram showing the utilization method of the GC-SPIO of the present invention and pancreatic islets that have absorbed the same.
  • Example 1 Preparation of iron oxide nanoparticles coated with glycyrrhizin-glycol chitosan
  • Glycyrrhizin-glycol chitosan (GC) was prepared according to the synthesis method described in FIG. 411.47 mg of glycyrrhizic acid ammonium salt (Sigma Aldrich, USA) and 205.74 mg of glycol chitosan (WAKO PURE CHEMICAL INDUS, Japan) were added to 10 ml and 20 ml of 4 ° C. carbonate buffer, pH 9.5, respectively. It was dissolved and 214 mg of sodium periodate (Sigma Aldrich) was dissolved in 20 ml of tertiary distilled water (DW).
  • reaction solution was transferred to a semipermeable membrane (3,500 to 5,000 Da molecular weight cutoff; membrane filtration products, USA), followed by dialysis for 72 hours using 4 L of tertiary distilled water for 48 hours in 4 L of carbonate-bicarbonate buffer. Proceeded. At the end of dialysis, the solution was frozen with liquid nitrogen and lyophilized for 3 days to obtain glycyrizine-glycol chitosan in powder form (hereinafter referred to as “GC”) (FIG. 1).
  • GC glycyrizine-glycol chitosan in powder form
  • SPIO superparamagnetic iron oxide nanoparticles
  • GC glycyrrhizin-glycol chitosan
  • GC-SPIO glycosyl-glycol chitosan-coated iron oxide nanoparticles
  • the zeta potential was measured by Nano ZS (Melvern, UK) by putting 1 ml (104.5 ⁇ g / ml) of GC-SPIO into a disposable cuvette.
  • the SPIO not coated with GC (hereinafter, referred to as bare SPIO) has a charge of about -20 mA, but GC-SPIO is due to the positively charged amine group present in chitosan. Checking that the charge of about 0.5 ⁇ 0.2 mV it can be seen that the GC is normally coated on the iron oxide nanoparticles.
  • TEM transmission electron microscopy
  • Example 2 Pancreatic islet cells GC - SPIO Check uptake
  • pancreatic islets pancreatic islets
  • Collagenase P was dissolved in HBSS (Hanks' balanced salt solution) at a concentration of 1 mg / ml and injected into male SD rats by intraductal injection. Since the pancreas was separated and stored for 15 minutes in 37 °C water, the isolated pancreatic cells were washed with medium 199 (medium 199). Washed pancreatic islets were purified and further purified by centrifugation with Histopaque (Sigma, USA). Purified islets were incubated for 24 hours in RPMI-1640 (Invirogen, USA) containing 10% fetal bovine serum and 1% antibiotic.
  • RPMI-1640 Invirogen, USA
  • GC-SPIO may be absorbed into the islets by endocytosis, but has a disadvantage of low absorption efficiency and random occurrence. Therefore, we devised a new method for efficiently absorbing GC-SPIO into pancreatic islets.
  • the four experimental groups were unlabeled islets (untreated GC-SPIO), random uptake, with magnet and on / off system treatment, respectively.
  • the control group was not treated with GC-SPIO in the islets, the randomly absorbed group was simply treated with GC-SPIO in the islet cells, and the magnetic force induction group was treated with GC-SPIO in the islet cells continuously.
  • the on / off system treatment group is an experimental group that has undergone GC-SPIO treatment, magnetic force generation, pipetting and culture without magnetic force in the islets.
  • pancreatic islet cells (200 ieq) isolated in Example 3-1 were incubated in a 35 ⁇ Petri dish, treated with GC-SPIO at a concentration of 109.5 ⁇ g / ml, and generated magnetic force for 1 minute, followed by pipetting. ). After that, the pancreatic islet cells are incubated for 1 minute without generating magnetic force.
  • GC-SPIO treatment, magnetic force generation, pipetting and incubation without magnetic force correspond to one cycle, and this method is called an on / off system.
  • GC-SPIO was absorbed into the islet cells in three experimental groups except for the control group. In particular, it was confirmed that the most absorbed GC-SPIO in the on / off system treatment group.
  • the iron colorimetric assay kit (Biovision, USA) was used to quantitatively analyze the amount of GC-SPIO absorbed into the islets according to the manufacturer's protocol.
  • 10 ⁇ l of the iron standard included in the kit and 990 ⁇ l of the tertiary distilled water (DW) were mixed to make a diluted iron standard, which was prepared using assay buffer and 0: 100, 2: Standard curves were prepared by mixing 98, 4:96, 6:94, 8:92 and 10:90 ratios.
  • pancreatic islet cells 200 ieq
  • pancreatic islet cells 200 ieq
  • GC-SPIO 10 ⁇ M
  • Conditions were further treated: intact islet (untreated GC-SPIO); GC-SPIO without magnet; Magnetic force treatment group (GC-SPIO with magnet (on)); And on / off system treatment group (GC-SPIO with magnet (on / off)).
  • GC-SPIO Magnetic force treatment group
  • GC-SPIO with magnet (on / off) GC-SPIO with magnet (on / off
  • 10% CCK solution corresponding to 10% of the culture medium was added to each well, and cultured at 37 ° C. for 4 hours. After collecting the cells, the cell viability was measured by measuring the absorbance at 450 nm in a dark place.
  • Example 3 magnetic force on / off Determine optimal condition of the system
  • CCC analysis was performed by insulating GC-SPIO into pancreatic islet cells under the same conditions as in 3-1.
  • the optimum concentration of GC-SPIO is set to 20 ⁇ g / ml considering the fact that there is no difference in absorption of GC-SPIO and the filtering process of 45 ⁇ g / ml takes a long time. It was.
  • GC-SPIO 20 ⁇ g / ml
  • RPMI PBS 10%, PS 1%) medium
  • the on / off cycle was 0 (control) for each experimental group. , 4, 8 and 12 times. Since the cell strainer (cell strainer) was separated from GC-SPIO and islet cells that are not absorbed into the islet cells. Next, it was analyzed by an iron absorbance analysis kit according to the method of Example 2-2.
  • pancreatic islets In order for transplanted pancreatic islets to maintain long-term glycemic control function, the viability of pancreatic islets should be maintained for a long time. Therefore, the survival rate of the pancreatic islets which absorbed GC-SPIO in the optimal on / off system confirmed in the present invention was confirmed.
  • GC-SPIO (10 or 20 ⁇ g / ml) was treated in a 35 ⁇ Petri dish containing 3 ml of islet cells and RPMI (PBS 10%, PS 1%) medium, followed by eight on / off cycles. Incubation was for 1, 3, 5 and 7 days. After incubation, cell viability was confirmed by CCK analysis.
  • HMGB1 protein released from the nucleus of pancreatic islets was confirmed by the HMGB1 elisa kit (ELABSCIENCE, USA).
  • the experimental group was divided into streptozotoxin treated group and non-treated group, and each experimental group was divided into a control group, a control group, a SPIO group (Bare-SPIO), and a GC-SPIO group (GC-SPIO). Designed.
  • pancreatic islets are cultured in each well of a 96 well cell culture plate, and treated with 20 cycles of 20 ⁇ g / ml, an on / off system of GC-SPIO absorption optimization conditions, and the inside of the islet cells. Absorbed. Thereafter, 1.5 Mm streptozotocin (Stz) was added to induce HMGB1 protein release of pancreatic islets and incubated for 2 hours. Next, 100 ⁇ l of a color solution included in the kit was added to each well, and the reaction was performed while shaking at room temperature for 30 minutes. Finally, 100 ⁇ l of the stop solution was dispensed into each well and gently shaken, and the absorbance was measured at 450 nm in the dark within 1 hour.
  • Stz streptozotocin
  • the following experiment was performed to identify the mesenchymal cells in which pancreatic islet cells are most delivered during islet cell transplantation.
  • Zotilil and rumpun were injected into the abdominal cavity of blab / c mice in a 9: 1 ratio, followed by anesthesia followed by methylene blue solution. After waiting about 24 hours for tissue fixation of the methylene blue solution, the mice were sacrificed to separate all the mesenchyme, respectively.
  • the isolated mesenchyme was fixed with 10% formalin solution, paraffin blocks, and cut into 5 ⁇ m thick tissue sections. Then, paraffin was removed from the tissue section slide according to a method known in the art, and rehydrated, and the tissue sections were stained with Harris hematoxylin solution and Eosin solution, and observed with an optical microscope.
  • pancreatic tissue slides were reacted with the secondary antibody AlexaFluor 574 goat anti-mouse antibody (1: 1000 dilution; Invitrogen, USA) for 1 hour at room temperature with light blocking.
  • the pancreatic tissue slides were then washed with PBS, stained with DAPI and observed with a fluorescence microscope.
  • the insulin signal was significantly higher than the experimental group (magnetic induction X) in the experimental group (magnetic induction O) that gave the magnetic force inducing effect as shown in FIG.
  • the insulin signal of the experimental group that gave the magnetic force induction effect was 3362 pixels / mm2, and the experimental group that did not have the magnetic force induction effect was 1117 pixels / mm2.
  • Example 4-3 Prussian blue staining was performed to confirm whether the insulin signal identified in Example 4-3 was caused by the islets of their own islets, or by the magnetic force induced by the islet cells of the balb / c mouse. It was.
  • staining solution 4% potassium ferrocyanide + 4% hydrochloric acid
  • the mesenchymal slide was then washed twice with 3 distilled water for 3 minutes, soaked in a nuclear fast red solution and covered with parafilm. After rinsing the slides for one minute with running water, the water was removed, the polymounting solution was dropped, and the coverslip was covered and observed under an optical microscope.
  • GC-SPIO GC-SPIO concentration 20 ⁇ g / ml
  • GC-SPIO concentration 20 ⁇ g / ml was absorbed into the islets by 8 cycles of the on / off system, and injected into blab / c mice to induce magnetic force. After 24 hours, all mesenchymals were separated and fixed, placed in a petri dish and mixed with 1% agarose gel to remove noise by oxygen. Afterwards, a T2 MRI scan was performed with a T3 skyra MRI device.
  • GC-SPIO GC-SPIO concentration 20 ⁇ g / ml
  • GC-SPIO concentration 20 ⁇ g / ml was absorbed into pancreatic islets by 8 cycles of on / off system and injected into blab / c diabetic model mice (700 ieq / mouse) to induce magnetic force. Blood glucose was measured in diabetic model mice for 2 weeks after islet cell transplantation.
  • the experimental group implanted with pancreatic islet cells in the middle of the liver by magnetic force induction showed that blood glucose levels were lowered to normal levels.
  • the GC-SPIO of the present invention is effectively absorbed by pancreatic islet cells by magnetic force induction, and pancreatic islet cells absorbing GC-SPIO can be moved to a desired target site through magnetic force induction. Able to know.
  • the pancreatic islets which absorbed GC-SPIO moved to the target site secrete insulin stably and thus can be used to treat diabetes (FIG. 21).

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Abstract

본 발명은 글리시리진-글리콜 키토산 컨쥬게이트로 코팅된 나노입자, 이를 사용하여 제조된 이식용 췌도세포 및 이를 포함하는 MRI 조영용 조성물에 관한 것으로 상기 나노입자를 포함하는 췌도세포를 이식하면 이식 후 면역반응을 억제할 수 있고, 자기력 유도에 의해 특정 부위에 췌도세포 이식이 가능하며, MRI로 추적이 가능한 이식용 췌도세포를 제공할 수 있다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 29.05.2019]　글리시리진-글리콜 키토산 컨쥬게이트가 코팅된 산화철 나노입자 및 이의 용도
본 발명은 글리시리진-글리콜 키토산 컨쥬게이트(glycyrrhizin-glycol chitosan conjugate)로 코팅된 나노입자 및 이를 활용한 이식용 췌도세포 조성물에 관한 것이다.
제1형 당뇨병이 발병하면 췌장에서 정상 기능을 발휘하는 베타세포의 수가 감소하고 이로 인해 인슐린 분비가 불충분하게 된다. 이에 따라 혈당조절이 정상적으로 이루어지지 않아 고혈당증이 발생하며 이로 인하여 여러 가지 합병증이 유발된다.
이러한 제1형 당뇨병을 치료하기 위한 방법으로 인슐린 주사기로 인위적으로 인슐린을 주입하여 일시적인 혈당조절 효과를 유발하는 치료방법이 현재까지 가장 많이 이용되고 있다. 인슐린 주사법의 일시적인 혈당조절의 문제점을 극복하기 위해서는 이종 췌도세포 이식방법이 많이 연구되고 있다. 임상적으로 췌도세포를 간 부위에 대부분 이식하고 있으나, 간문맥(portal vein)을 통해 세포를 주입하므로 혈액매개성 염증반응(instant blood mediated inflammatory reaction; IBMIR)이 유도되는 단점이 있다. 또한, 매우 넓은 간 부위에 극소량의 췌도세포를 주입하므로 췌도세포 추적이 어려운 문제점도 있다. 이러한 이유들로, 혈당 조절을 하기 위해서 필요로 하는 최소한의 췌도세포 개수(marginal pancreatic islet mass)가 매우 많이 요구된다. 이는 장기 기증자의 제한에 의해서 현실적으로 췌도세포 이식 수술 자체가 어렵게 되는 요인이 되기도 한다. 따라서 임상적으로 췌도세포를 당뇨병 환자의 간 조직 부위 안에 성공적으로 생착을 하고 이들의 생존율 및 기능성을 지속적으로 관찰할 수 있는 기술이 요구된다.
본 발명의 목적은 췌도세포 이식의 가장 큰 문제점인 혈류에 의한 이종 췌도세포 손실과 이식 후 일어나는 자가면역반응을 극복하기 위하여, 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트로 코팅된 나노입자(nanoparticle)를 포함하는 췌도세포 이식용 조성물과 상기 조성물로 처리된 이식용 췌도세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 이식용 췌도세포를 포함하는 췌도세포-결함 (islet cell-deficiency) 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트로 코팅된 나노입자를 포함하는 MRI 조영용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 양상은 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트로 코팅된 나노입자를 포함하는 췌도세포 이식용 조성물로서, 상기 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트는 공유결합으로 연결된 췌도세포 이식용 조성물을 제공한다.
이종 췌도세포 이식 후 일어나는 자가 면역반응의 주요 원인은 췌도세포 핵 내부로부터 방출되는 HMGB1 (high mobility group protein B1) 단백질이다. HMGB1 단백질은 세포 외부로부터 세포로 물리적 스트레스가 유발될 경우 핵 내부에서 만들어져 세포 밖으로 방출된다. 방출된 HMGB1 단백질은 외부 면역세포의 수용체(TLR, RAGE)에 결합하여 면역세포를 활성화시키고, 면역세포에서 사이토카인을 분비시킨다. 분비된 사이토카인은 췌도세포에 다시 외부 자극을 주고 이로 인해 췌도세포는 내부에서 더 많은 HMGB1 단백질을 발현하여 방출하는 악순환이 반복되어 이식된 췌도세포의 많은 양이 손실된다.
따라서 이종 췌도세포 이식시 발생되는 자가 면역반응의 수준을 줄이기 위해서는 세포핵 내부에서 만들어지는 HMGB1 단백질이 세포 밖으로 방출되는 것을 억제할 필요가 있다. 이를 위하여 본 발명자들은 생체 적합성 고분자 백본에 HMGB1 단백질을 포획할 수 있는 글리시리진(glycyrrhizin)을 공유결합으로 결합시켜 생체 적합성 고분자 백본-글리시리진 컨쥬게이트를 합성하였다.
본 명세서에 사용된 용어, "글리시리진(glycyrrhizin)"은 감초에서 추출된 성분으로 HMGB1 단백질의 A box domain에 직접적으로 결합하여 활성 및 세포외 방출을 억제한다. 그러나 글리시리진은 체내 반감기가 매우 짧은 편이며, 예를 들어 5 ㎎/㎏ 정도를 정맥 주사하였을 경우 체내에서 약 15분 이상 잔존하지 않아 의약 제제로 상용화되기에는 한계를 가진다.
본 발명에서는 이러한 글리시리진을 생체 적합성 고분자 백본과 결합시킴으로써 체내 반감기를 늘리고, 세포 내로 흡수되는 양을 증가시켜 그 효과를 높일 수 있었다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 글리시리진은 고유의 특성을 잃지 않는 범위에서 개질될 수 있으며, 예를 들어 산화된(oxidized) 형태일 수 있다. 상기 산화된 형태의 글리시리진은 도 1에 나타낸 바와 같이, 말단의 글루쿠론산 고리의 2번 탄소 및 3번 탄소 사이의 결합이 산화에 의해 열려(opened) 알데하이드 치환기를 형성하게 된다. 이렇게 형성된 알데하이드 그룹에 의해 글리시리진은 생체 적합성 고분자 백본과 결합을 형성할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "생체적합성 고분자 백본"은 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 파괴시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 갖는 고분자를 의미하고, 다수의 글리시리진과 결합을 형성할 수 있는 백본의 역할을 하는 고분자를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본은 알데하이드 그룹과 화학 결합을 형성할 수 있는 기능기를 포함한다. 상술한 바와 같이 산화된 형태의 글리시리진은 알데하이드 그룹을 포함하며, 글리시리진의 알데하이드 그룹과 화학 결합을 형성할 수 있는 치환기를 포함하는 생체 적합성 고분자라면 제한없이 이용 가능하다. 에를 들어, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본에 포함된 기능기는 아민 그룹, 카복실 그룹, 티올 그룹 또는 히드록사이드 그룹이다. 바람직하게는 아민 그룹이 포함된 생체적합성 고분자 백본을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본은 글리콜 키토산, 폴리-L-리신, 폴리(4-비닐피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/ 아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘 N-옥사이드), 폴리-ε-Cbz-L-리신, 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(알릴 아민), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(N-메틸비닐아민), 폴리(디알릴디메틸암모늄클로라이드), 폴리(N-비닐피롤리돈), 키토산, 또는 폴리(4-아미노스티렌)으로부터 선택된다. 바람직하게는 글리콜 키토산을 생체적합성 고분자 백본으로 이용할 수 있다.
상기 글리콜 키토산은 생체친화적이고 생분해성을 갖는 물질로서, 조직 공학이나 약물 전달 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 그러나 고분자량 글리콜 키토산의 경우 가지고 있는 양성 전하에 의한 독성의 문제 때문에 의약 제제로 사용되는데 어려움이 있었다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자 백본과 글리시리진은 공유결합에 의해 연결되어 있으며, 상기 공유결합은 아마이드 결합(amide bond), 카보닐 결합(carbonyl bond), 에스터 결합(ester bond), 황화 에스터 결합(thioester bond) 및 설폰아마이드 결합(sulfonamide bond)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 공유결합은 과요오드산 나트륨 등의 처리에 의해 산화된 글리시리진의 카르보닐기와 생체 적합성 고분자 백본의 아민기가 반응하여 형성된 아마이드 결합일 수 있다.
외부물질을 세포 내부로 흡수시키기 위해 많이 사용되는 방법 중 하나는 자연적으로 발생하는 엔도시토시스(endocytosis)이다. 그러나 엔도시토시스에 의한 방법은 시간이 오래 소요되고, 충분한 양의 물질 흡수가 어려우며, 외부물질이 각 세포에 균일하게 흡수되지 않으므로, 여전히 의약용 제제로 사용하는데 한계가 있다. 따라서, 본 발명자들은 많은 양의 글리시리진-생체 적합성 고분자 백본 컨쥬게이트를 췌도세포 내부로 균일하게 흡수시키고, 상기 컨쥬게이트를 흡수한 췌도세포의 표적부위로의 이동을 용이하게 하기 위해서 글리시리진-생체 적합성 고분자 백본 컨쥬게이트를 나노입자에 코팅시키는 방법을 이용하였다.
본 명세서에 사용된 용어, "나노입자(nanoparticle)"는 나노미터(㎚)의 크기를 갖는 구조 또는 물질을 의미한다. 나노미터 크기란 마이크론 미터(10-6) 크기를 1,000 분의 1로 축소한 것으로, 물질의 크기가 나노미터 수준으로 작아지면 다양하고 특이한 물리적, 화학적, 기계적 및 전자적 특성을 나타내게 된다.
본 발명에서, 상기 나노입자는 일반적으로 평균 크기가 약 1 ㎚ 내지 약 500 ㎚, 예를 들면, 약 1 ㎚ 내지 약 50 ㎚, 약 50 ㎚ 내지 약 100 ㎚, 약 100 ㎚ 내지 약 250 ㎚, 약 250 ㎚ 내지 약 500 ㎚ 범위일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 1 내지 100 ㎚, 바람직하게는 1 내지 50 ㎚, 더욱 바람직하게는 1 내지 20 ㎚ 크기로 제조될 수 있다. 나노입자의 크기가 500 nm 이상인 경우에는 침강 속도가 빨라져 사용상 불편함을 초래하여 침강 방지를 위해 글루코스, 슈크로스, 클리세롤, 폴리에틸렌아민, 비테인 등과 같은 분산제를 사용하여야 한다.
본 발명에서, 상기 나노입자는 유기 또는 무기 나노입자일 수 있으며, 바람직하게는 자성 나노입자(magnetic nanoparticle)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "자성"은 물질이 나타내는 자기적인 성질을 의미한다. 모든 물질은 자기장(magnetic field)과 상호작용하여 인력(attractive force) 또는 척력(repulsive force)이 발생한다. 즉, 물질에 자기장을 가하면 자화(magnetization)되고, 상기 물체가 자화되는 양상에 따라 강자성체 (ferromagnetic substance), 상자성체(paramagnetic substance), 반자성체 (diamagnetic substance), 페리자성체(ferrimagnetc substance) 등으로 구분된다.
본 명세서에 사용된, 용어 "자성 나노입자"는 자성을 띄는 나노미터 크기의 구조 또는 물질을 의미한다. 상기 자성 나노입자는 용액 합성, 공동 침전, 졸-겔 방법, 고 에너지 분쇄, 수열 합성, 마이크로에멀젼 합성, 열분해에 의한 합성 또는 음파화학적 합성에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 자성 나노입자는 철(Fe), 코발트(Co), 니켈(Ni), 망간(Mn), 가돌리늄(Gd), 이들의 산화물 또는 이들의 합금(alloy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 자성 나노입자는 철 또는 산화철로 이루어진 자성 나노입자이다.
본 발명에서, 나노입자에 글리시리진-생체 적합성 고분자 백본 컨쥬게이트를 코팅시키는 일반적인 방법은 i) 상기 생체 적합성 고분자에 존재하는 기능기를 나노입자에 부착시키는 방법, ii) 미리 합성된 나노입자(pre-synthesized nanoparticle)의 표면에 생체 적합성 고분자를 접붙이거나(grafting), 클릭화학반응(click chemistry)으로 생체 적합성 고분자를 부착시키는 방법, iii) 나노입자에 결합할 수 있는 기능기를 갖는 블록을 포함하는 블록 중합체(block polymer)를 생체 적합성 고분자로 사용하는 방법, iv) 나노입자를 랩핑(wrapping)할 수 있는 기능기(grafting group)를 갖는 생체 적합성 고분자를 사용하는 방법, v) 상기 생체 적합성 고분자와 나노입자 사이의 이온결합에 의한 방법, 또는 vi) 생체 적합성 고분자로 친수성 및 소수성 기능기를 모두 갖는 양친매성 고분자를 사용하여 마이셀(micell) 형태로 제조한 후 소수성 나노입자 표면과 소수성-소수성 결합 작용을 이용한 코팅 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생체적합성 고분자는 나노입자와 결합할 수 있는 기능기를 포함하며, 기능기는 아민 그룹, 카복실 그룹, 티올 그룹, 또는 히드록사이드 그룹일 수 있고, 바람직하게는 히드록사이드 그룹일 수 있다. 따라서, 자성 나노입자 제조시 사용되는 열 분해 방법(thermal decomposition technique)을 나노입자 코팅에 이용할 수 있다. 구체적으로 산화철 나노입자와 글리시리진-글리콜 키토산 컨쥬게이트를 고온에서 반응시킴으로써 글리콜 키토산의 다당체에 존재하는 -OH 작용기에 의하여 상기 컨쥬게이트를 산화철 나노입자 표면에 랩핑(wrapping)시킬 수 있다. 이 방법은 다량의 -OH 작용기에 의하여 컨쥬게이트가 안정적으로 나노입자 표면에 코팅되는 장점이 있으나, 지나치게 오랜 시간 동안 고온에서 반응시킬 경우 다당체 자체가 분해되는 단점이 생길 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 췌도세포 이식용 조성물을 세포 내부에 포함하는 췌도세포를 유효성분으로 포함하는 췌도세포-결함(islet cell-deficiency) 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
GC-SPIO를 포함하는 췌도세포 이식용 조성물을 세포 내부에 포함하는 췌도세포는 생체내 이식시 세포 생존율이 증가하므로 췌도세포-결함에 의해 발생할 수 있는 모든 질환에 대하여 이용될 수 있다. 췌도세포 이식용 조성물을 췌도세포 내부로 흡수시키는 방법은 실시예 3에 기재된 온/오프 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 췌도세포-결함 질환은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 및 당뇨병성 만성 신질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환이다. 상기 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 당뇨병성 만성 신질환은 모두 췌도세포 이식으로 치료가 가능한 질병이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 췌도세포-결함 질환은 제1형 당뇨병이다. 제1형 당뇨병은 인슐린을 분비하는 췌도의 베타세포가 파괴되고, 인슐린 분비기능이 소실되어 발생하므로 췌도세포 이식이 제1형 당뇨병에 대한 좋은 치료방법이 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 ㎎/㎏(체중)이다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기 단계를 포함하는 이식용 췌도세포 제조 방법을 제공한다:
(a) 제1항의 췌도세포 이식용 조성물과 공여자(donor)로부터 분리된 상태의 췌도세포를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 췌도세포에 0.1분 내지 5분 동안 자기력을 인가하는 단계; 및
(c) 상기 (b)의 결과물을 0.1분 내지 5분 동안 혼합하는 단계.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a)의 췌도세포 이식용 조성물과 공여자로부터 분리된 상태의 췌도세포를 접촉시키는 단계는 췌도세포를 배양한 후 배양 배지에 췌도세포 이식용 조성물을 처리하는 방식으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (b)는 췌도세포 배양 플레이트의 일 면에 자석을 접촉시켜 자기력을 발생시키는 방식으로 이루어질 수 있으며, 사용되는 자석은 네오디뮴 자석, 전자석 등 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (c)는 췌도세포 배양 배지에 췌도세포 이식용 조성물이 균일하게 존재하도록 혼합하는 단계이며, 상기 혼합 방법은 파이펫팅(pipetting) 또는 교반(stirring)으로 이루어질 수 있다. 상기 파이펫팅은 0.1분 내지 5분 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 0.5분 내지 3분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 이식용 췌도세포 제조 방법은 단계 (c) 이후 췌도세포를 0.1분 내지 5분 동안 방치하는 단계 (d)를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.5분 내지 3분 동안 방치하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 이식용 췌도세포 제조 방법은 상기 단계 (b) 내지 (d)를 1회 내지 20회 반복하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 단계 (b) 내지 (d)를 5회 내지 12회 반복할 수 있다.
본 발명자들은 췌도세포에 GC-SPIO를 효율적으로 도입할 수 있는 방법을 연구한 결과, 췌도세포와 GC-SPIO를 접촉시킨 후 자기력 인가, 파이펫팅 및 방치의 단계를 반복하면 GC-SPIO의 췌도세포 흡수 효율이 현저히 상승하는 것을 확인하였다.
본 발명에서, 상기 자기력 인가, 파이펫팅 및 방치의 단계를 포함하는, 췌도세포 내로 GC-SPIO를 흡수시키는 방법을 "온/오프(on/off) 시스템"으로 명명하였다. 췌도세포 내로 흡수된 상기 GC-SPIO는 세포핵 내부에서 세포질로 이동된 HMGB1 단백질을 포획하고, 이후 HMGB1 단백질은 세포 활동에 의해서 분해된다. 결과적으로 면역세포 활성화가 일어나지 않아 자가 면역반응이 감소하므로 상기 방법에 의하여 제조된 이식용 췌도세포는 생존률이 증가되어 장기적인 인슐린 분비로 인해 혈당조절이 가능하게 된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 방법에 의하여 제조된 이식용 췌도세포는 세포 내에 포함된 GC-SPIO로 인하여 자기력에 대한 반응성을 갖는다. 구체적으로 이종 췌도세포 이식시 간엽 중에서 중엽 1에 가장 많은 양의 이종 췌도세포가 이식되므로 이 부위에 자석(예를 들어 네오디뮴 자석)에 의한 자기력을 가해주면 자기력에 의한 유도성이 췌도세포에 적용되어 다수의 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포가 중엽 1에 정착된다. 이로 인해 기존의 혈압, 혈류속도에 의해 이식시 불특정적으로 발생하였던 이종 췌도세포 손실을 감소시킬 수 있다. 또한, 췌도세포의 손실 감소에 따라 이식되는 췌도세포의 수를 줄일 수 있어, 치료받는 개체의 피로도 줄일 수 있고, 간엽에 대한 췌도세포의 전달률 증가로 인해 혈당 조절기능이 기존보다 월등히 향상될 수 있다.
상기 방법에 의하여 제조된 췌도세포의 이식은 당업계에 공지된 적절한 이식부위(예를 들면, 신장 피막 하 및 간문맥 등)를 선정하고, 이식 부위에 공지된 방식, 예를 들면 복강 절개없이 초음파 투시 하에서 경피적으로 간문맥을 통해 간 내로 준비한 췌도를 주입하는 방법 등을 통해 수행될 수 있다. 이식에 적합한 췌도세포의 조건은 ABO 일치형으로서 췌도(islet) 수가 5,000/kg(객체 체중) 이상, 췌도 순도(islet purity)가 30% 이상, 최종 부피가 10 ㎖ 이하이며 그램 염색상 음성이고, 엔도톡신 음성인 경우 이식 조건이 된다(Shapiro J et al., International trial of the edmonton protocol for islet transplantation, N Engl J Med 355:1318-1330(2006)).
본 발명의 이식용 췌도세포 제조 방법은 상술한 본 발명의 췌도세포 이식용 조성물을 이용하는 방법에 관한 것인바, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
또한, 본 발명은 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트로 코팅된 자성 나노입자(GC-SPIO)를 포함하는 MRI 조영용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 자성 나노입자는 철(Fe), 코발트(Co), 니켈(Ni), 망간(Mn), 가돌리늄(Gd), 이들의 산화물 또는 이들의 합금(alloy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 MRI 조영용 조성물은 상술한 본 발명의 췌도세포 이식용 조성물에 포함된 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트로 코팅된 나노입자를 이용하는 방법에 관한 것인바, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 GC-SPIO는 산화철 나노입자의 고유 특성으로 인하여 MRI 장비 내에서 자장 교란을 통해 해당 부위를 어둡게 만드는 음성 조영제(negative contrase agent; T2 조영제)로 기능할 수 있다.
또한, 본 발명은 GC-SPIO를 포함하는 췌도세포를 이식하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 이식은 자기 유도 환경에서 수행될 수 있다. 이 경우 이식 부위에 자기력을 인가하여 췌도세포를 유도할 수 있으므로 세포 이식 효율을 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 생체 적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트로 코팅된 나노입자 (GC-SPIO), 이를 사용하여 제조된 이식용 췌도세포 및 이를 포함하는 MRI 조영용 조성물에 관한 것으로, 상기 GC-SPIO는 HMGB1 단백질과 결합하여 자가 면역반응의 수준을 낮출 수 있고, 이에 따라 췌도세포의 인슐린 분비 기능이 유지되므로 장기간 혈당조절이 가능하다.
또한, 상기 생체 적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트로 코팅된 자성 나노입자를 포함하는 췌도세포는 MRI를 통하여 실시간으로 추적이 가능하고, 이식된 췌도세포의 양을 정량적으로 확인할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 글리시리진-글리콜 키토산 컨쥬게이트(GC)를 합성하는 과정을 개략적으로 나타낸다.
도 2는 글리콜 키토산, 글리시리진-글리콜 키토산 컨쥬게이트, 산화철 나노입자(bare SPIO) 및 글리시리진-글리콜 키토산 컨쥬게이트가 코팅된 산화철 나노입자(GC-SPIO)를 푸리에 변환 적외분광법으로 분석한 결과이다.
도 3은 bare SPIO와 GC-SPIO의 전위를 측정한 결과(A) 및 투과 전자 현미경으로 입자 크기(B)를 확인한 결과이다.
도 4는 췌도세포에 다양한 방법으로 GC-SPIO를 처리한 후 흡수 여부를 투과 전자 현미경으로 확인한 결과이다: unlabeled islet-대조군, GC-SPIO 미처리한 췌도세포; random uptake-GC-SPIO를 단순 처리한 췌도세포; with magnet-GC-SPIO 처리 후 지속적으로 자기력 유도한 췌도세포; 및 on/off system-GC-SPIO 처리한 후 1분 자기력 유도, 파이펫팅, 자기력 없이 1분 배양하는 사이클을 반복한 췌도세포.
도 5는 GC-SPIO를 다양한 방법(단순처리, 자기력 유도, 자기력 유도+ 파이펫팅, 온/오프 시스템)으로 췌도세포에 처리한 후 GC-SPIO의 흡수량을 정량 분석한 결과이다: SPIO without magnet-췌도세포에 GC-SPIO를 단순 처리; SPIO with magnet(On)-췌도세포에 GC-SPIO를 처리한 후 자석 접촉; SPIO with magnet(On+Pipetting)-췌도세포에 GC-SPIO를 처리한 후 자석 접촉+파이펫팅; 및 SPIO with magnet(On/Off)-췌도세포에 GC-SPIO를 처리한 후 온/오프 사이클 처리.
도 6은 GC-SPIO를 다양한 방법(자기력 유도, 자기력 유도+ 파이펫팅, 온/오프 시스템)으로 췌도세포에 처리한 후 세포 생존율을 확인한 결과이다: intact islet-대조군, 온전한 췌도세포.
도 7은 다양한 농도의 GC-SPIO를 온/오프 시스템 방식으로 췌도세포에 처리한 후 GC-SPIO의 흡수량을 정량 분석한 결과이다.
도 8은 다양한 농도의 GC-SPIO를 온/오프 시스템 방식으로 췌도세포에 처리한 후 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 9는 온/오프 사이클 수를 변화시키면서 GC-SPIO를 췌도세포에 처리한 후 GC-SPIO의 흡수량을 정량 분석한 결과이다.
도 10은 GC-SPIO를 온/오프 시스템 방식으로 췌도세포에 처리한 후 배양 기간에 따른 세포 생존율 변화를 확인한 결과이다.
도 11은 췌도세포에 GC-SPIO를 처리한 후 세포의 핵에서 HMGB1 단백질이 방출되는 수준을 확인한 결과이다.
도 12는 마우스에 간문맥 이식으로 메틸렌 블루(methylene blue) 용액을 주입한 후 메틸렌 블루 용액이 많이 발견되는 간엽을 확인한 결과이다: 대조군(control), 우측앞엽(right anterior, RA), 우측뒤엽 (right posterior, RP), 좌엽(left), 꼬리엽 1(caudate 1, C1), 꼬리엽 2(C2), 중엽 1(mediate 1, M1) 및 중엽 2(M2).
도 13은 마우스에 간문맥 이식으로 메틸렌 블루(methylene blue) 용액을 주입한 후 각 간엽에서 발견되는 메틸렌 블루 용액을 정량화한 결과이다: 대조군 (control), M1&M2는 각각 중엽 1&2, C1&C2는 각각 꼬리엽 1&2, L은 좌엽, RP는 우측뒤엽 및 RA는 우측앞엽.
도 14는 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포를 마우스에 간문맥 이식으로 주입한 후 자기력 유도 유무에 따라 인슐린의 분비 정도를 확인한 결과이다.
도 15는 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포를 마우스에 간문맥 이식으로 주입한 후 자기력 유도 유무에 따른 인슐린의 분비 수준을 정량화한 결과이다.
도 16은 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포를 마우스에 간문맥 이식으로 주입한 후 자기력 유도 유무에 따라 췌도세포의 생착 정도를 확인한 결과이다.
도 17은 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포를 마우스에 간문맥 이식으로 주입한 후 자기력 유도 유무에 따른 췌도세포의 생착 정도를 정량화한 결과이다.
도 18은 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포를 마우스에 간문맥 이식으로 주입한 후 간엽을 분리하여 현미경으로 확인한 결과이다.
도 19는 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포를 마우스에 간문맥 이식으로 주입한 후 간엽을 분리하여 MRI로 분석한 결과이다.
도 20은 당뇨 동물모델에 췌도세포만 주입하거나 또는 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포를 주입한 후 자기력 유도 유무에 따른 혈당량 변화를 확인한 결과이다.
도 21은 본 발명의 GC-SPIO 및 이를 흡수한 췌도세포의 활용 방법을 개략적으로 보여주는 모식도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 글리시리진-글리콜 키토산이 코팅된 산화철 나노입자 제조
1-1. 글리시리진-글리콜 키토산 합성
글리시리진(glycyrrhizin)-글리콜 키토산(glycol chitosan, GC)은 도 1에 개시된 합성방법에 따라 제조하였다. 글리시리진산 암모늄염(Glycyrrhizic acid ammonium salt; Sigma Aldrich, 미국) 411.47 ㎎과 글리콜 키토산(WAKO PURE CHEMICAL INDUS, 일본) 205.74 ㎎을 각각 pH 9.5의 4℃ 탄산염 완충액(carbonate buffer) 10 ㎖, 20 ㎖에 첨가하여 용해 시키고, 과요오드산나트륨(sodium periodate; Sigma Aldrich) 214 ㎎을 3차 증류수(DW) 20 ㎖에 용해시켰다. 과요오드산나트륨이 완전히 용해되면 이를 글리시리진 용액 10 ㎖에 첨가하여 4℃, 빛이 차단된 조건에서 90분 동안 반응시켰다. 글리콜 키토산이 완전히 용해되면 이를 글리시리진과 과요오드산나트륨이 함께 용해되어 있는 용액에 첨가하여 4℃, 빛이 차단된 조건에서 약 24시간 동안 반응시켰다. 이후 시아노 보노하이드라이드 (cyano borohydride) 15 ㎕를 첨가하고, 4℃, 빛을 차단한 조건에서 24시간 동안 반응시켜 2차 아미드 결합(amide bond)을 1차 아미드 결합으로 변경하여 안정화시켰다. 반응 종료 후 반응액을 반투과성막 (3,500 내지 5,000 Da 분자량 컷오프; membrane filtration products, 미국)에 옮긴 뒤 4 L의 탄산염-중탄산염 완충액에서 48시간, 이후 4 L의 3차 증류수를 이용해 72시간 동안 투석을 진행하였다. 투석이 끝나면 용액을 액체질소로 동결시키고, 3일 동안 동결건조를 진행하여 파우더 형태의 글리시리진-글리콜 키토산(이후 "GC"로 기재함)을 수득하였다(도 1).
1-2. GC가 코팅된 산화철 나노입자 제조
3목 플라스크를 3차 증류수(distilled water, DW)로 세척한 후 3차 증류수 30 ㎖을 넣고 고무마개로 덮었다. 3목 플라스크 내부로 질소가스를 30분 동안 주입하여 3차 증류수 내부에 있는 산소를 제거하고, 염화철(II) 4수화물(Iron(II) chloride tetrahydrate) 0.28 g, 염화철(III) 6 수화물(Iron(III) chloride hexahydrate) 0.56 g을 3차 증류수에 첨가하였다. 여기에 수산화 암모늄(ammonium hydroxide) 8 ㎖을 한방울씩 첨가(dropwise)한 후 30분 동안 교반하여 산화철을 침전시키고, 수산화 암모늄을 제거하기 위해 침전된 산화철 나노입자 (superparamagnetic iron oxide nanoparticle; 이하, SPIO로 기재함)는 3차 증류수로 3회 세척하였다. 3차 증류수 10 ㎖에 글리시리진-글리콜 키토산(GC) 100 ㎎을 첨가하여 교반한 후 이 용액을 상기 SPIO와 혼합하였다. SPIO와 GC의 혼합 용액을 80℃에서 2시간 동안 교반하고, 3차 증류수로 3회 세척하였다. 이후 상기 혼합 용액을 특정 조건에서 초음파처리(sonication)하였다: 39% 증폭 (amplification), 온(On) 시간: 2초, 오프(Off) 시간: 2초, 총 시간: 1시간). GC로 코팅되지 않은 SPIO는 초원심분리(4,000 rmp, 1000초, 4℃)로 제거하고, 최종적으로 800 ㎚ 및 400 ㎚ 공극 크기의 필터로 여과하여 글리시리진-글리콜 키토산이 코팅된 산화철 나노입자(glycyrrhizin-glycol chitosan conjugation coated superparamagnetic iron oxide nano particle; 이하, GC-SPIO로 기재함)를 수득하였다.
1-3. GC - SPIO 분석: 푸리에 변환 적외분광법
GC와 SPIO의 결합 여부는 푸리에 변환 적외분광법(Fourier transform infrared spectroscopy)(ATR-FTIR) 장비인 NicoletTM iSTM50 FR-IR Spectrometer(Thermo scientific, 미국)로 확인하였다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 기존 글리콜 키토산에 존재하는 C-H 스트레칭(stretching), 사카린 구조 피크(saccharine structure peak) (2922 cm-1, 1057 cm-1)와 글리시리진에 존재하는 COO-peak (1398 cm- 1)가 합성된 GC-SPIO에 모두 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 글리시리진과 글리콜 키토산이 제대로 컨쥬게이션된 것을 의미한다.
또한, SPIO 및 GC-SPIO의 ATR-FTIR 분광을 측정한 결과 Fe-O 스트레칭 피크(568 cm- 1)를 확인할 수 있었다. 최종 합성 물질인 GC-SPIO에서는 GC에 존재하는 C-H 스트레칭, 사카린 구조 피크(Saccharine structure peak) (2922 cm-1, 1057 cm-1) 또한 관찰되었다. 이 결과를 통해 최종 합성물질인 GC-SPIO의 합성이 제대로 이루어진 것을 알 수 있었다.
1-4. GC - SPIO 분석: 제타 전하 및 크기
일회용 큐벳(cuvette)에 GC-SPIO 1 ㎖ (104.5 ㎍/㎖)을 넣어 Nano ZS(Melvern, UK)로 제타 전위(zeta potential)를 측정하였다.
측정 결과, 도 3의 A에 나타낸 바와 같이 GC로 코팅되지 않은 SPIO(이하, bare SPIO로 기재함)의 경우 약 -20 ㎷의 전하를 띄나, GC-SPIO는 키토산에 존재하는 양전하의 아민기로 인해 약 0.5±0.2 ㎷의 전하를 나타내는 것을 확인하여 산화철 나노입자에 GC가 정상적으로 코팅된 것을 알 수 있었다.
또한, SPIO 및 GC-SPIO의 크기를 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM)으로 확인하였다. 그 결과, 도 3의 B에 나타낸 바와 같이 bare SPIO는 크기가 약 14.9±0.4 ㎚이고, GC-SPIO는 크기가 약 8.4±0.3 ㎚임을 확인하여 GC 코팅에 의해 입자 크기가 감소한 것을 알 수 있었다. 입자 크기 감소로 인하여 GC-SPIO는 췌도세포 내부로 더 잘 흡수될 수 있다.
실시예 2: 췌도세포의 GC - SPIO 흡수(uptake) 확인
2-1. 췌도세포 (pancreatic islets) 분리
콜라게네이스 P를 HBSS(Hanks' balanced salt solution)에 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시키고, 이를 수컷 SD 랫트(rat)에 관내 주입(intraductal injection)하였다. 이후 췌장을 분리하여 37℃ 물에서 15분 동안 보관하고, 분리된 췌도세포는 미디움 199(medium 199)로 세척하였다. 세척한 췌도세포를 정제하고, 히스토파크 (Histopaque; Sigma, 미국)로 원심분리하여 추가로 정제하였다. 정제한 췌도세포는 10% 소태아혈청과 1% 항생제를 포함하는 RPMI-1640(Invirogen, 미국)에서 24시간 동안 배양하였다.
2-2. 췌도세포의 GC - SPIO 흡수 확인
GC-SPIO는 엔도시토시스에 의해서 췌도세포 내부로 흡수될 수 있으나, 흡수 효율이 낮고 무작위로 일어나는 단점이 있다. 따라서, 췌도세포에 GC-SPIO를 효율적으로 흡수시키기 위한 새로운 방법을 고안하였다. 4개의 실험군은 각각 대조군(unlabeled islets)(GC-SPIO 미처리), 무작위 흡수군(random uptake), 자기력 유도군(with magnet) 및 온/오프 시스템 처리군(on/off system)이다. 대조군은 췌도세포에 GC-SPIO를 처리하지 않은 것이고, 무작위 흡수군은 췌도세포에 GC-SPIO를 단순 처리한 것이며, 자기력 유도군은 췌도세포에 GC-SPIO를 처리한 후 지속적으로 자기력을 발생시킨 것이고, 온/오프 시스템 처리군은 췌도세포에 GC-SPIO 처리, 자기력 발생, 파이펫팅 및 자기력없이 배양하는 과정까지 수행한 실험군이다.
구체적으로 실시예 3-1에서 분리한 췌도세포(200 ieq)를 35π 페트리 접시에서 배양하고, GC-SPIO를 109.5 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후 1분 동안 자기력을 발생시킨 후, 파이펫팅(pipetting)하였다. 이후 자기력을 발생시키지 않은 상태로 1분 동안 췌도세포를 배양한다. GC-SPIO 처리, 자기력 발생, 파이펫팅 및 자기력없이 배양하는 과정이 1 사이클에 해당하며, 이러한 방법을 온/오프(on/off) 시스템으로 명명한다.
이후 투사 전자 현미경으로 세포를 관찰한 결과 , 도 4에 나타난 바와 같이 대조군을 제외한 3개 실험군에서 GC-SPIO가 췌도세포 내로 흡수된 것을 알 수 있었다. 특히 온/오프 시스템 처리군에서 가장 많은 GC-SPIO가 흡수된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 철 흡광 분석 키트(iron colorimetric assay kit; Biovision, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 췌도세포 내로 흡수된 GC-SPIO의 양을 정량적으로 분석하였다. 먼저 키트에 포함된 표준 철(iron standard) 10 ㎕와 3차 증류수(DW) 990 ㎕를 섞어 희석된 철 표준(diluted iron standard)을 만들고, 이를 분석 완충액(assay buffer)과 0:100, 2:98, 4:96, 6:94, 8:92 및 10:90 비율로 섞어 표준 곡선(standard curve)을 작성하였다.
다음으로 96 웰 플레이트에서 췌도세포(200 ieq)를 배양한 후 GC-SPIO(10 μM)를 첨가하고, 각각의 실험군에 해당하는 조건을 처리하였다: 자기력 비처리군(GC-SPIO without magnet); 자기력 처리군(GC-SPIO with magnet(on)); 자기력 및 파이펫팅 처리군(GC-SPIO with magnet (on+pipetting)); 및 온/오프 시스템 처리군(GC-SPIO with magnet(on/off)). 이후 각 웰에 철 환원제 5 ㎕를 첨가하여 30분 동안 섞어주고, 형광을 발현시키기 위해 각 웰에 철 프로브 100 ㎕를 추가로 분주하였다. 빛을 차단하기 위해 호일로 감싼 뒤 실온에서 1시간 동안 흔들어 주었다. 췌도세포가 흡수한 GC-SPIO의 양은 어두운 장소에서 593 ㎚ 파장으로 흡광도를 측정하여 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 온/오프 시스템 처리군에서 가장 많은 양의 GC-SPIO가 췌도세포 내부로 들어간 것을 확인할 수 있었다.
2-3. 온/ 오프 시스템에 의한 췌도세포의 생존율 변화 확인
췌도세포의 GC-SPIO 흡수가 세포 독성을 유도하는지 확인하기 위하여 24 웰 플레이트에서 췌도세포(200 ieq)를 배양한 후 GC-SPIO(10 μM)를 30분 동안 처리하고, 각각의 실험군에 해당하는 조건을 추가로 처리하였다: 대조군(intact islet)(GC-SPIO 미처리); 자기력 비처리군(GC-SPIO without magnet); 자기력 처리군(GC-SPIO with magnet(on)); 및 온/오프 시스템 처리군(GC-SPIO with magnet(on/off)). 이후 각 웰에 배양 배지의 10%에 해당하는 CCK 용액을 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양하고, 세포를 회수한 후 어두운 장소에서 450 ㎚ 파장으로 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.
측정 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 각 실험군에서 세포 생존율의 유의미한 차이를 확인할 수 없었다. 따라서, GC-SPIO를 췌도세포 내부로 흡수시킬 때 가장 효과적인 방법인 온/오프 시스템이 세포 독성이 없는 것을 알 수 있었다.
실시예 3: 자기력 온/ 오프 시스템의 최적 조건 확인
3-1. GC - SPIO 처리농도 최적화
96 웰 플레이트에서 췌도세포(200 ieq)를 배양한 후 다양한 농도의 GC-SPIO (0, 2.5, 5, 10, 20 및 45 ㎍/㎖)를 온/오프 시스템 방법으로 처리하였다. 구체적으로, 췌도세포 및 RPMI(PBS 10%, PS 1%) 배지 3 ㎖이 포함된 35π 페트리 접시에 해당 농도의 GC-SPIO를 처리하고, 1분 동안 자기력을 주고, 1분 동안 파이펫팅한 후, 1분 동안 자기력을 처리하지 않고 배양하는 과정을 총 12회(1 사이클x12) 실시하였다. 이후 세포 스트레이너(cell strainer)로 췌도세포 내부로 흡수되지 않은 GC-SPIO와 췌도세포를 분리하였다. 다음으로 상기 실시예 2-2의 방법에 따라 철 흡광 분석 키트로 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 GC-SPIO의 처리 농도에 따라 췌도세포에 흡수된 양이 증가하는 것을 알 수 있었다. 대조군(C)을 기준으로 GC-SPIO의 처리 농도가 2.5 ㎍/㎖인 경우 142, 5 ㎍/㎖는 166, 10 ㎍/㎖는 197, 20 ㎍/㎖는 252, 45 ㎍/㎖는 268로 나타나 대조군과 각 실험군 사이에 유의미한 차이가 나타나는 것을 확인하였다. 그러나 GC-SPIO 처리 농도 20 ㎍/㎖ 그룹(252)과 GC-SPIO 처리 농도 45 ㎍/㎖그룹(268) 결과 사이에는 통계적 유의성이 나타나지 않았다. 이를 통해 GC-SPIO 처리 농도 20 ㎍/㎖까지는 처리 농도와 GC-SPIO 흡수량 사이에 양의 상관관계가 존재하나, 그 이상의 처리농도에서는 흡수량과 상관관계가 약한 것을 알 수 있었다.
3-2. 췌도세포 생존율 확인
상기 3-1과 동일한 조건으로 췌도세포에 GC-SPIO를 흡수시킨 후 세포를 분리하여 CCK 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 대조군과 각 실험군 사이에서 세포 생존율의 유의미한 차이를 확인할 수 없었으며, GC-SPIO 처리 농도와 췌도세포의 독성은 무관하다는 결론을 낼 수 있었다.
실시예 3-1의 결과와 종합하여 GC-SPIO의 흡수량 차이도 존재하지 않고, 처리 농도 45 ㎍/㎖의 필터링 과정이 오래 걸리는 점을 고려하여 GC-SPIO의 최적 농도는 20 ㎍/㎖로 설정하였다.
3-3. 자기력 온/ 오프 시스템 사이클 횟수 최적화
자기력 온/오프 시스템을 사용하여 췌도세포 내로 GC-SPIO를 흡수시킬 때, 온/오프 사이클 수에 따른 GC-SPIO의 흡수량을 확인하였다.
구체적으로 췌도세포 및 RPMI(PBS 10%, PS 1%) 배지 3 ㎖이 포함된 35π 페트리 접시에 GC-SPIO(20 ㎍/㎖)를 처리하고, 온/오프 사이클을 실험군마다 각각 0(대조군), 4, 8 및 12회 수행하였다. 이후 세포 스트레이너(cell strainer)로 췌도세포 내부로 흡수되지 않은 GC-SPIO와 췌도세포를 분리하였다. 다음으로 실시예 2-2의 방법에 따라 철 흡광 분석 키트로 분석하였다.
분석 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 대조군을 기준으로 온/오프 사이클을 4회 수행한 경우에는 GC-SPIO의 흡수량에 유의미한 차이가 없었고, 온/오프 사이클을 8회 수행한 경우 GC-SPIO의 흡수량이 약 2.9배 증가한 것을 알 수 있었다. 반면, 온/오프 사이클을 12회 수행한 경우 GC-SPIO의 흡수량이 약 3배 증가하여 8회 수행한 경우와 비교하여 GC-SPIO의 흡수량이 유사한 것을 확인할 수 있었다.
따라서 실험의 효율성을 고려하였을 때 온/오프 사이클을 8회 수행하는 것이 가장 최적인 사이클 회수라는 결론을 낼 수 있다.
3-4. 최적 온/ 오프 시스템에서 췌도세포 생존율 변화 확인
이식한 췌도세포가 장기간 혈당 조절 기능을 유지하기 위해서는 췌도세포의 생존력이 장기간 유지되어야 한다. 따라서, 본 발명에서 확인한 최적 온/오프 시스템에서 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포의 생존율을 확인하였다.
구체적으로 췌도세포 및 RPMI(PBS 10%, PS 1%) 배지 3 ㎖이 포함된 35π 페트리 접시에 GC-SPIO(10 또는 20 ㎍/㎖)를 처리하고, 온/오프 사이클을 8회 수행한 후 1, 3, 5 및 7일 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 CCK 분석으로 세포 생존율을 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 대조군(온전한 췌도세포)과 각 실험군 사이에서 세포 생존율의 유의미한 차이를 확인할 수 없었다. 이 결과는 본 발명의 최적 온/오프 시스템이 세포 독성을 유발하지 않으므로 이식 후 췌도세포가 간 조직에 정착하여 인슐린 분비기능을 하기까지 충분히 생존할 수 있음을 의미한다.
실시예 4: GC - SPIO를 흡수한 췌도세포의 효과 확인
4-1. GC - SPIO의 HMGB1 단백질 방출 억제 효과
췌도세포의 핵에서 방출되는 HMGB1 단백질의 양은 HMGB1 elisa kit (ELABSCIENCE, 미국)로 확인하였다. 실험군은 스트렙토조톡신 처리군과 비처리군으로 나누고, 다시 각 실험군을 대조군(Control), SPIO 처리군(Bare-SPIO) 및 GC-SPIO 처리군(GC-SPIO)으로 구분하여 총 6개 실험군을 디자인하였다.
먼저, 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 200 ieq(islet equivalent)의 췌도세포를 분주하여 배양하고, GC-SPIO의 흡수 최적화 조건인 20 ㎍/㎖, 온/오프 시스템 8 사이클로 처리하여 췌도세포 내부로 흡수시켰다. 이후 췌도세포의 HMGB1 단백질 방출을 유도하기 위해 1.5 Mm 스트렙토조톡신 (streptozotocin, Stz)을 첨가하여 2시간 동안 배양하였다. 다음으로 각 웰에 키트에 포함된 발색 용액(colour solution) 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 쉐이킹하면서 반응시켰다. 마지막으로 정지 용액 100 ㎕를 각 웰에 분주하여 가볍게 흔들어 주고, 1시간 이내에 암소에서 450 ㎚ 파장으로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 대조군(C)과 SPIO 처리군(B)은 방출되는 HMGB1 단백질의 양에 유의미한 차이가 없으나, GC-SPIO 처리군(GC)은 대조군과 비교하여 방출되는 HMGB1 단백질이 현저히 감소하고, 이러한 경향은 스트렙토조톡신으로 세포 스트레스를 유도한 경우에도 나타나는 것을 확인하였다. 이 결과는 GC-SPIO가 HMGB1 단백질의 방출을 효과적으로 억제할 수 있음을 의미한다.
4-2. 이식물질이 가장 많이 전달되는 간엽 확인
췌도세포 이식시 췌도세포가 가장 많이 전달되는 간엽을 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다. 조레틸(Zoletil)과 룸푼(rumpun)을 9:1 비율로 blab/c 마우스 복강에 주입하여 마취시킨 후 간문맥 이식으로 메틸렌 블루(methylene blue) 용액을 주입하였다. 메틸렌 블루 용액의 조직 정착을 위해 약 24시간을 기다린 후 마우스를 희생시켜 모든 간엽을 각각 분리하였다. 분리한 간엽은 10% 포르말린 용액으로 고정한 뒤 파라핀 블럭으로 만들고, 5 ㎛ 두께로 절단하여 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 이후 당업계에 알려진 방법에 따라 조직 절편 슬라이드에서 파라핀을 제거하고, 재수화 시킨 후 해리스 헤마토실린 용액(Harris hematoxylin solution)과 에오신 용액(Eosin solution)으로 조직 절편을 염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 다른 간엽과 비교하여 메틸렌블루 용액이 중엽에 많이 분포하는 것을 확인할 수 있었다: 중엽(mediate), 꼬리엽(caudate), 우측앞엽(right anterior), 우측뒤엽 (right posterior). 또한, 이미지 J(image J)로 정량적으로 분석한 결과 도 13에 나타낸 바와 같이 중엽에 가장 많은 양의 메틸렌블루 용액이 분포하고, 중엽 중에서도 중엽 1(M1)에 가장 많은 것을 알 수 있었다. 이 결과를 통해 췌도세포의 이식 성공률을 올리기 위해서는 중엽을 중심으로 자기력을 발생시키는 것이 효과적임을 알 수 있었다.
4-3. 인슐린 신호 확인
췌도세포(700 ieq)에 최적 조건(8 사이클, GC-SPIO 농도 20 ㎍/㎖)으로 GC-SPIO를 흡수시키고, 이를 blab/c 마우스(n=4/실험군)에 간문맥으로 주입한 뒤 외부에서 마우스 간의 중엽 부위에 자석을 접촉시켜 자기력을 발생시켰다. 24시간 후 마우스를 희생시켜 모든 간엽을 분리하고, 상기 실시예 4-2에 따라 간엽 절편 슬라이드를 제작한 후 파라핀을 제거하였다. 이후 상기 간엽 절편 슬라이드 중에서 췌장 조직 슬라이드를 인슐린 항체(1:200 희석, 마우스 단일클론항체; Abcam, 미국) 및 20% 염소 혈청(goat serum)과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날 췌장 조직 슬라이드를 2차 항체인 AlexaFluor 574 염소 항-마우스 항체(1:1000 희석; Invitrogen, 미국)와 빛이 차단된 상태로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 췌장 조직 슬라이드를 PBS로 세척하고, DAPI로 염색하여 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 췌도세포 이식 후 중엽 1에 네오디뮴 자석을 부착하여 자기력 유도 효과를 준 실험군(n=5)에서 그렇지 않은 실험군(n=5)에 비해 훨씬 많은 양의 인슐린 신호(insulin signal)가 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로 자기력 유도 효과를 통해 더 많은 양의 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포가 중엽으로 유도되는 것을 알 수 있었다.
또한 이미지 J로 정량적으로 분석한 결과 도 15에 나타낸 바와 같이 자기력 유도 효과를 준 실험군(자기력 유도 O)에서 그렇지 않은 실험군(자기력 유도 X)에 비해 인슐린 신호가 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 각 실험군의 평균을 낸 결과, 자기력 유도 효과를 준 실험군의 인슐린 신호는 3362 pixels/㎟이고, 자기력 유도 효과를 주지 않은 실험군은 1117 pixels/㎟로 나타났다.
4-4. 프러시안 블루 (Prussian blue) 염색
실시예 4-3에서 확인한 인슐린 신호가 balb/c 마우스가 본래 가지고 있던 자체적 췌도세포에 의한 것인지 또는 자기력에 의해 유도되어 중엽 1에 정착한 췌도세포에 의한 신호인지 확인하기 위해 프러시안 블루 염색을 수행하였다.
췌도세포(700 ieq)에 최적 조건(8 사이클, GC-SPIO 농도 20 ㎍/㎖)으로 GC-SPIO를 흡수시키고, 이를 blab/c 마우스(n=3/실험군)에 간문맥으로 주입한 뒤 외부에서 마우스 간의 중엽 부위에 자석을 접촉시켜 자기력을 발생시켰다. 24시간 후 마우스를 희생시켜 모든 간엽을 분리하고, 상기 실시예 4-2에 따라 간엽 절편 슬라이드를 제작한 후 파라핀을 제거하였다. 이후 간엽 슬라이드를 염색 용액(4% 페로시안화 칼륨(potassium ferrocyanide)+4% 염산 (hydrochloric acid))으로 10분씩 2회 염색하였다. 이후 간엽 슬라이드를 3차 증류수로 3분 동안 2회 세척하고, 뉴클리어 패스트 레드(nuclear fast red) 용액에 담근 후 파라필름을 덮었다. 흐르는 물로 슬라이드를 1분 동안 헹군 후 물기를 제거하고, 폴리마운팅 용액(polymounting solution)을 떨어뜨린 후 커버슬립을 덮어 광학 현미경으로 관찰하였다.
관찰 결과, 도 16 및 도 17에 나타낸 바와 같이 대조군(자기력 유도 X)과 비교하여 실험군(자기력 유도 O)에서 염색이 많이 되는 것을 확인하여 GC-SPIO를 포함하는 췌도세포가 마우스 간의 중엽에 효과적으로 정착한 것을 알 수 있었다.
4-5. MRI(Magnetic resonance imaging) 촬영
온/오프 시스템 8 사이클로 GC-SPIO(GC-SPIO 농도 20 ㎍/㎖)를 췌도세포에 흡수시키고, 이를 blab/c 마우스에 주입한 뒤 자기력을 유도하였다. 24시간 후 모든 간엽을 분리 및 고정하여 페트리 디쉬에 놓고, 1% 아가로스 젤과 혼합하여 산소에 의한 노이즈를 제거하였다. 이후 T3 skyra MRI 장비로 T2 MRI 간 스캔을 시행하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 대조군(GC-SPIO 미주입)에 비해 자기력을 유도한 실험군(GC-SPIO&자기력 유도 O)에서 중엽(M1 및 M2)이 어둡게 보이는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이미지 J로 정량 분석한 결과 도 19에 나타낸 바와 같이 자기력을 유도한 실험군(GC-SPIO&자기력 유도 O)의 중엽(M1 및 M2)에서 T2 (음조영, negative contrast) 신호가 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 이는 간의 중엽에 GC-SPIO가 많이 유도된 것을 나타내며, GC-SPIO를 흡수한 췌도세포가 간의 중엽에 존재함을 의미한다. 한편, 본 결과를 통하여 GC-SPIO가 T2 MRI 조영제로도 활용될 수 있음을 알 수 있다.
4-6. GC - SPIO를 흡수한 췌도세포의 당뇨 치료 효과
온/오프 시스템 8 사이클로 GC-SPIO(GC-SPIO 농도 20 ㎍/㎖)를 췌도세포에 흡수시키고, 이를 blab/c 당뇨 모델 마우스에 주입(700 ieq/mouse)한 뒤 자기력을 유도하였다. 췌도세포 이식 후 2주일 동안 당뇨 모델 마우스에서 혈당을 측정하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이 대조군인 췌도세포를 이식하지 않은 실험군(diabetic)과 비교하여 췌도세포만을 이식한 실험군(intract islet transplantation), GC-SPIO를 흡수한 췌도세포 이식 실험군(GC-SPIO-labled islet transplantation) 및 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포 이식+자기력 유도 실험군(GC-SPIO-labeled islet transplantation with magnet guide)에서 당뇨 모델 마우스의 혈당이 정상 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 자기력 유도로 간의 중엽에 췌도세포를 이식한 실험군도 혈당 수치가 정상 수준까지 내려가는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포를 자기력으로 표적부위에 이식하여도 당뇨 치료 효과는 유지되고, 이에 더하여 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포를 표적부위(간의 중엽)로부터 간부분절제술(partial resection of liver)로 쉽게 제거할 수 있음을 의미한다.
상기 실시예 1 내지 4의 결과를 통하여 본 발명의 GC-SPIO는 자기력 유도에 의하여 췌도세포에 효과적으로 흡수되고, GC-SPIO를 흡수한 췌도세포는 자기력 유도를 통하여 원하는 표적부위로 이동시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한, 표적부위로 이동된 GC-SPIO를 흡수한 췌도세포는 인슐린을 안정적으로 분비하므로 당뇨병 치료에 활용될 수 있음을 알 수 있다(도 21).

Claims (14)

  1. 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트로 코팅된 나노입자를 포함하는 췌도세포 이식용 조성물로서,
    상기 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트는 공유결합으로 연결된 것인, 췌도세포 이식용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 글리시리진은 산화된(oxidized) 형태인 것인, 췌도세포 이식용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 공유결합은 아마이드 결합(amide bond), 카보닐 결합(carbonyl bond), 에스터 결합(ester bond), 황화 에스터 결합(thioester bond) 및 설폰아마이드 결합(sulfonamide bond)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 췌도세포 이식용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 글리콜 키토산, 폴리-L-리신, 폴리(4-비닐피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘 N-옥사이드), 폴리-ε-Cbz-L-리신, 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(알릴 아민), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(N-메틸비닐아민), 폴리(디알릴디메틸암모늄클로라이드), 폴리(N-비닐피롤리돈), 키토산, 또는 폴리(4-아미노스티렌)으로부터 선택되는 것인, 췌도세포 이식용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 무기 나노입자인 것인, 췌도세포 이식용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 무기 나노입자는 철(Fe), 코발트(Co), 니켈(Ni), 망간(Mn), 가돌리늄(Gd), 이들의 산화물 또는 이들의 합금(alloy)으로 이루어진 군에서 선택되는 자성 나노입자(magnetic nanoparticle)인 것인, 췌도세포 이식용 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 나노입자와 결합할 수 있는 기능기를 포함하는 것인, 췌도세포 이식용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 기능기는 아민 그룹, 카복실 그룹, 티올 그룹, 또는 히드록사이드 그룹인 것인, 췌도세포 이식용 조성물.
  9. 제1항의 췌도세포 이식용 조성물을 세포 내부에 포함하는 췌도세포를 유효성분으로 포함하는, 췌도세포-결함(islet cell-deficiency) 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 췌도세포-결함 질환은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 및 당뇨병성 만성 신질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것인, 췌도세포-결함 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. (a) 제1항의 췌도세포 이식용 조성물과 공여자(donor)로부터 분리된 상태의 췌도세포를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 췌도세포에 0.1분 내지 5분 동안 자기력을 인가하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)의 결과물을 0.1분 내지 5분 동안 혼합하는 단계를 포함하는, 이식용 췌도세포 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 이식용 췌도세포 제조 방법은 단계 (c) 이후 췌도세포를 0.1분 내지 5분 동안 방치하는 단계 (d)를 추가로 포함하는 것인, 이식용 췌도세포 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 이식용 췌도세포 제조 방법은 상기 단계 (b) 내지 (d)를 1회 내지 20회 반복하는 것인, 이식용 췌도세포 제조 방법.
  14. 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트로 코팅된 나노입자를 포함하는 MRI 조영용 조성물로서,
    상기 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트는 공유결합으로 연결된 것인, MRI 조영용 조성물.
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