WO2017078277A1 - 약물 지속 방출형 나노 입자 및 상기 나노입자로 표면 개질된 췌장소도세포를 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물 - Google Patents

약물 지속 방출형 나노 입자 및 상기 나노입자로 표면 개질된 췌장소도세포를 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물 Download PDF

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pancreatic islet
nanoparticles
heparin
dopamine
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정지헌
팜탄텅
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영남대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating diabetes, comprising nanoparticles that inhibit cytokine release or a blood coagulation system during pancreatic islet cell transplantation for treating diabetes, and pancreatic islet cells surface-modified with the nanoparticles.
  • Diabetes Mellitus is a disease that presents symptoms and complications of hyperglycemia due to abnormal insulin secretion of pancreatic ⁇ -cells or abnormal receptors on insulin action organs or organs.
  • exercise therapy and diet therapy are mainly performed along with insulin injection therapy as a method of diabetic treatment, but there are limitations such as inability to cure and still exist complication risk.
  • pancreatic transplantation and pancreatic islet cell transplantation have been used to treat diabetes.
  • problems such as absolute shortage of donors, high surgical complications, and difficulty in post-transplant management including continuous administration of immunosuppressive agents There is this.
  • pancreatic islet cell transplantation can be performed in vitro, such as in vitro culture of isolated pancreatic islet cells and immunomodulation, and when pancreatic islet cells are overcome, it is also possible to supply infinite pancreatic islet cells using pigs. This is a relatively simple procedure that can be easily transplanted without complications.
  • pancreatic islet cell transplantation requires minimizing pancreatic islet cell damage during development and isolation of effective pancreatic islet cells, minimizing cell damage caused by nonspecific inflammatory processes during transplantation and engraftment failure rate.
  • the problem of overcoming cellular damage caused by immune response after transplantation and securing of pancreatic islet cell source should be selected.
  • pancreatic islet cells are destroyed by functional incompatibility or cell necrosis and apoptosis due to an initial inflammatory response following pancreatic islet cell transplantation, there is a problem in that a greater amount of pancreatic islet cells are required to be transplanted than are actually necessary pancreatic islet cells.
  • nonspecific inflammatory reactions include various tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ), interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ), and interferon- ⁇ (interferon- ⁇ , IFN- ⁇ ). It is made by proinflammatory cytokine, and large amounts of cytokines induce nitric oxide (NO) production by inducible NO synthase (iNOS) in pancreatic islet cells. Inhibition of aconitase in the Krebs cycle reduces glucose oxidation, ATP production and insulin production.
  • NO nitric oxide
  • iNOS inducible NO synthase
  • prostaglandin E2 has been reported to inhibit the secretion of glucose-induced insulin in pancreatic islet cells or ⁇ -cell lines, and is known to promote production by IL-1 ⁇ .
  • PGE2 prostaglandin E2
  • an monoclonal antibody infliximab
  • infliximab monoclonal antibody to a tumor necrosis factor-alpha receptor
  • N-monomethyl arginine Monomethyl arginine
  • 15-deoxypergualin 15-deoxypergualin
  • pancreatic islet cells when pancreatic islet cells are transplanted into the hepatic portal vein, when the transplanted pancreatic islet cells are directly exposed to blood, blood coagulation systems such as platelets and complement are activated, causing blood coagulation around the pancreatic islet cells, leading to rapid destruction of pancreatic islet cells.
  • IBMIR instant blood mediated inflammatory reaction
  • pancreatic islet cells can be expected to be stabilized at the initial stage of transplantation, so that the maximum pancreatic islet cell transplantation effect can be expected with a smaller amount of cells. What is needed is a way to control the release of caffeine or the coagulation system.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating diabetes comprising pancreatic islet cells whose surface is modified with the nanoparticles.
  • the present invention is a biodegradable polymer containing a drug; A linear polymer having one end of the linear polymer attached to a surface of the biodegradable polymer; And an adhesive material bonded to the other end of the linear polymer, wherein the linear polymer is polyethylene glycol (PEG), heparin, heparin analogue, chitosan, hyaluronic acid (Hyaluronic acid) and derivatives thereof, any one selected from the group consisting of, the adhesive substance is dopamine (Dopamine), 3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid (3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid, DOHA) and their It provides a drug sustained release nanoparticles, characterized in that any one selected from the group consisting of derivatives.
  • PEG polyethylene glycol
  • Heparin heparin analogue
  • chitosan hyaluronic acid
  • Hyaluronic acid hyaluronic acid
  • DOHA 3,4-
  • the present invention comprises a pancreatic islet cell surface modified with drug sustained release nanoparticles, the drug sustained release nanoparticles are biodegradable polymer encapsulated drug; A linear polymer having one end of the linear polymer attached to a surface of the biodegradable polymer; And it provides a pharmaceutical composition for treating diabetes, comprising an adhesive material bonded to the other end of the linear polymer.
  • the nanoparticles according to the present invention can regulate the cytokine release or blood coagulation system by releasing the encapsulated immunosuppressant or anticoagulant, the nanoparticles can improve the survival rate after transplantation of pancreatic islet cells by modifying the surface of the islet cells. It may have a therapeutic effect on diabetes.
  • Figure 1 A shows a drug sustained release nanoparticles according to the present invention
  • Figure 1 B shows the effect on the surface of the pancreatic islet cells of the nanoparticles packed with immunosuppressant
  • C in Figure 1 is an anticoagulant
  • the pancreatic islets of the enclosed nanoparticles also show the effect on the cell surface.
  • Figure 2 shows the results of thin layer chromatography (TLC) analysis of PLGA-PEG-dopamine.
  • Figure 3 shows Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR) analysis of PLGA-PEG-dopamine.
  • H-NMR H-nuclear magnetic resonance
  • Figure 6 shows the results of the H-NMR analysis of the PLGA-PEG-NHS copolymer (PLGA-PEG-NHS co-polymer).
  • Figure 7 shows the results of UV-Visible Spectrophotometer (UV-VIS) analysis of PLGA-PEG-NHS and PLGA-PEG-dopamine.
  • UV-VIS UV-Visible Spectrophotometer
  • Figure 8 shows the analysis results for the dopamine content of PLGA-PEG-dopamine.
  • Figure 9 shows the results confirmed for the effect of the organic solvent in the PLGA-PEG-dopamine nanoparticles.
  • Figure 10 shows the results confirming the effect of the weight ratio of the drug / polymer on the size and polydispersity index (PDI) of the nanoparticles.
  • Figure 11 shows the results confirming the effect of the presence of cryoprotectant added to the stability of the nanoparticles.
  • Figure 13 is the result of confirming the size of the optimized nanoparticles.
  • 16 and 17 show the results of confirming the binding of the surface of the pancreatic islet cells with PLGA-PEG-dopamine nanoparticles.
  • Figure 18 shows the results of confirming the survival rate of the cells after binding of the surface of the pancreatic islet cells and PLGA-PEG-dopamine nanoparticles.
  • Figure 21 is a graph showing the amount of TNF- ⁇ accumulated during co-culture of pancreatic islet cells and splenocytes.
  • the inventors of the present invention while studying how to control the cytokine release or blood coagulation system for successful pancreatic islet cell transplantation, biodegradable polymer encapsulated drug; A linear polymer having one end of the linear polymer attached to a surface of the biodegradable polymer; And a drug sustained release nanoparticle comprising an adhesive substance bonded to the other end of the linear polymer, and modifying the surface of pancreatic islet cells with the nanoparticles to complete the present invention.
  • the present invention is a biodegradable polymer containing a drug as shown in A in Figure 1; A linear polymer having one end of the linear polymer attached to a surface of the biodegradable polymer; And an adhesive material bonded to the other end of the linear polymer, wherein the linear polymer is polyethylene glycol (PEG), heparin, heparin analogue, chitosan, hyaluronic acid (Hyaluronic acid) and derivatives thereof, any one selected from the group consisting of, the adhesive substance is dopamine (Dopamine), 3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid (3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid, DOHA) and their It provides a drug sustained release nanoparticles, characterized in that any one selected from the group consisting of derivatives.
  • PEG polyethylene glycol
  • Heparin heparin analogue
  • chitosan hyaluronic acid
  • Hyaluronic acid hyaluronic acid
  • the biodegradable polymer is PLGA (Poly (lactide-co-glycolide)), polylactic acid (PLA), polylactide, polylactic-co-glycolic acid, polylactide-co-glycolide (PLGA), poly Phosphazine, polyiminocarbonate, polyphosphoester, polyanhydride, polyorthoester, copolymer of lactic acid and caprolactone, polycaprolactone, polyhydroxyvalate, polyhydroxybutyrate, polyamino acid, lactic acid It is any one selected from the group consisting of copolymers of amino acids, polyethylene glycol derivatives, chitosan derivatives, heparin derivatives and mixtures thereof, and more preferably PLGA, but is not limited thereto.
  • the drug is tacrolimus, cyclosporin, Cyclosporin, Sirolimus, Everolimus, Ridaforolimus, Ridaforolimus, Temsirolimus, Umirolimus, Umirolimus, Zotarolimus, Leflunomide, Methotrexate, Rituximab, Ruplizumab, Daclizumab, Avalizumab, Abatacept and Bellatacept Immunosuppression drug or argatroban, coumarin, heparin, low molecular weight heparin, hirudin, selected from the group consisting of Dabigatran (Dabigatran), Melagatran (Melagatran), Clopidogrel (Clopidogrel), Ticlopidine (Ticlopidine) and apsiximab (Abciximab) is any one of the anti-coagulant (anti-coagulant drug) selected from the group.
  • the immunosuppressant or anticoagulant may be encapsulated according to encapsulation methods well known by those of ordinary skill in the art.
  • Nanoparticles according to the invention can be attached between the collagen matrix or nanoparticles through the dopamine attached to the PEG. Therefore, as shown in B of FIG. 1, in the case of the nanoparticles containing the immunosuppressive agent, pancreatic islet cells are surrounded by PEG and dopamine, and thus the human immune system (complement, macrophage, polymorph nucleus) Leukocytes (polymorphonuclear leukocytes and K cells, etc.) can be suppressed, and the release of the immunosuppressive agent tacrolimus can inhibit the secretion of cytokines.
  • the human immune system complementary, macrophage, polymorph nucleus
  • Leukocytes polymorphonuclear leukocytes and K cells, etc.
  • pancreatic islets in the case of nanoparticles encapsulated with anticoagulant, as shown in FIG. 1, PEG and dopamine surround pancreatic islets (complement), macrophage, polymorphonuclear leukocytes (complement). inhibits the recognition and penetration of polymorphonuclear leukocytes and K cells) and prevents damage to pancreatic islet cells by inhibiting the instant blood mediated inflammatory reaction (IBMIR) by releasing the anticoagulant argatroban. can do.
  • IBMIR instant blood mediated inflammatory reaction
  • the nanoparticles according to the present invention may have an average diameter of 50 nm to 1000 nm, if the average diameter of the nanoparticles out of the range is too small, may cause a problem that the drug release time is reduced, Too large an average diameter of the nanoparticles may cause a problem in that the pancreatic islets are not evenly bound to the cell surface.
  • the present invention includes pancreatic islet cells whose surface is modified with drug sustained release nanoparticles, wherein the drug sustained release nanoparticles include a biodegradable polymer encapsulated with a drug; A linear polymer having one end of the linear polymer attached to a surface of the biodegradable polymer; And an adhesive substance bonded to the other end of the linear polymer.
  • the adhesive material may be any one selected from the group consisting of dopamine, 3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid (DOHA), and derivatives thereof, and more preferably. May be dopamine, but is not limited thereto.
  • DOHA 3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid
  • the linear polymer may be any one selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), heparin, heparin analogue, chitosan, hyaluronic acid, and derivatives thereof. More preferably PEG, but is not limited thereto.
  • PEG polyethylene glycol
  • the biodegradable polymer is polylactic acid (PLGA), polylactic acid (PLA), polylactide, polylactic-co-glycolic acid, polylactide-co-glycolide (PLGA), poly Phosphazine, polyiminocarbonate, polyphosphoester, polyanhydride, polyorthoester, copolymer of lactic acid and caprolactone, polycaprolactone, polyhydroxyvalate, polyhydroxybutyrate, polyamino acid, lactic acid It may be any one selected from the group consisting of copolymers of amino acids, polyethylene glycol derivatives, chitosan derivatives, heparin derivatives and mixtures thereof, and more preferably PLGA, but is not limited thereto.
  • the drug is tacrolimus, cyclosporin, Cyclosporin, Sirolimus, Everolimus, Ridaforolimus, Ridaforolimus, Temsirolimus, Umirolimus, Umirolimus, Zotarolimus, Leflunomide, Methotrexate, Rituximab, Ruplizumab, Daclizumab, Avalizumab, Abatacept and Bellatacept Immunosuppression drug or argatroban, coumarin, heparin, low molecular weight heparin, hirudin, selected from the group consisting of It may be any one of anti-coagulant drugs selected from the group consisting of dabigatran, melagatran, clopidogrel, ticlopidine and abciximab. One that does not.
  • Such immunosuppressants or anticoagulants may be encapsulated according to encapsulation methods well known by those of ordinary skill in the art.
  • the dosage of the surface-modified pancreatic islet cells with the drug sustained-release nanoparticles according to the present invention may be increased or decreased according to the route of administration, the degree of disease, sex, weight, age, etc. It does not limit the scope of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be administered to various mammals such as mice, mice, livestock, humans, and the like. All methods of transplantation can be expected, such as portal vein, eye, kidney, muscle, subcutaneous, gastrointestinal tract.
  • PLGA Poly (lactide-co-glycolide), MW: 17000 Da
  • PLGA-PEG-NHS poly (lactide-co-glycolide) -b-Poly (ethylene glycol) -N-hydroxysucciniamide, MW ⁇ 17000 Da: 3000 Da, 50:50 LA: GA
  • PLGA-FITC poly (lactide-co-glycolide) -FITC, MW to 10000 Da, 50:50 LA: GA
  • Polyscitech Indiana, USA It was.
  • RPMI 1640 culture, Hank's balanced salt solution, Histopaque-1077 and dopamine hydrochloride were purchased from Sigma-aldrich, Korea.
  • Acetone, dimethylformamide (DMF), dichloromethane (DCM) and diethylether were purchased from Junsei, Korea.
  • Fetal bovine serum (FBS) and phosphate buffer saline (PBS) were purchased from Hyclone.
  • Collagenase P was purchased from Roche diagnostic GmBH, Mainheim, Germany.
  • Live / dead cell viability / cytotoxicity assay kits were purchased from Life Technologies, Oregon, USA.
  • Cell counting kit-8 (CCK-8) was purchased from Dojindo, Japan.
  • Amicon centrifugation tube (Pore size: 100,000 Da) was purchased from Millipore Co., Billerica, Mass., USA.
  • Quant-iT TM PicoGreen® dsDNA reagent was purchased from Invitrogen, Carlsbad, California, USA.
  • Collagen coated culture dishes were purchased from MatTech Corporation (Homer Ave, Ashland, USA).
  • FT-IR Spectra is a Thermo Scientific Nicolet Nexus 670 FT-IR Spectrometer, Smart iTR and Diamond Window (Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA) was recorded using.
  • the characteristic peak for alcohol stretch (3200-3550 cm -1 , OH stretch) in the spectra of the final product is PLGA as shown in FIG.
  • amide (amide) group ( ⁇ 1600 cm-1) carbonyl peak (carbonyl peak) corresponding to the dopamine residue (moiety) and co-demonstrated coupling between the block polymer (co-block polymer).
  • PLGA and PLAG-PEG-DOPA were registered on an Agilent-NMR-VNMRS600 instrument operating at DMSO-d6 and 600 MHz and chemical shifts were reported in ppm.
  • the spectrum of PLGA-PEG-NHS was obtained from Polycitech.
  • DCM was supplied to the two phenogel 5 ⁇ m columns (DCM flow across two Phenogel 5 ⁇ m columns) and one PLgelResipore column (Agilent) using PLV-PEG-dopamine
  • M n number average molecular weight
  • M w mass average molecular weight
  • PDI polydispersity index
  • UV-VIS profiles of PLGA-PEG-NHS and PLGA-PEG-dopamine were analyzed using a U-2800 spectrophotometer (Hitachi, Japan). The reaction was confirmed through the change of the NHS peak with respect to the dopamine peak, and is shown in FIG. 7.
  • the PLGA-PEG-NHS solution of DMF is indicated by a black line
  • the PLGA-PEG-dopamine solution of DMF is indicated by a blue line.
  • the peak shift from 260 nm to 280 nm is replaced with NHS residues by dopamine. Means that.
  • Dopamine content of the binding was confirmed using a spectrophotometer. Absorbances of PLGA-PEG-dopamine solutions in different concentrations of DMF were measured at 280 nm against calibration graphs of dopamine serial solutions (1.40625 ⁇ g / ml, 2.8125 ⁇ g / ml, 5.625 ⁇ g / ml, 11.25 ⁇ g / ml, 22.5 ⁇ g / ml, 45 ⁇ g / ml). This was repeated three times.
  • the content of dopamine in the binding was measured to be 6.22 ⁇ g in 1 mg of the binding.
  • the molecular weight of the PLGA-PEG moiety is 20,000 Da, the binding efficiency of this reaction can be calculated to be about 80%.
  • PLGA-PEG-dopamine nanoparticles were prepared by a precipitation method. Specifically, 10 mg of the polymer was dissolved in 1 ml of acetone and then slowly injected into 10 ml of distilled water while stirring the oil layer. After stirring for 2 hours at room temperature, it was dialyzed in 1 L of distilled water to completely remove the organic solvent. Then, to evaluate the distribution of nanoparticles on the surface of pancreatic islet cells, PLGA-FITC and PLGA-PEG-dopamine were dissolved in acetone at a ratio of 20:80 (w / w) to prepare fluorescently labeled nanoparticles.
  • nanoparticles In order to evaluate the influence of organic solvents, two organic solvents (DMF or acetone) mixed with water were used to prepare nanoparticles.
  • DMF or acetone organic solvents
  • Tacrolimus was added to different concentrations of polymer solution (1%, 2% or 5%).
  • nanoparticles prepared without a surfactant are known to be unstable after freeze-drying, so after freeze-drying nanoparticles with or without a surfactant, they are left at room temperature and compared to the size and PDI of each nanoparticle.
  • the effect of surfactant on the stability of nanoparticles during the lyophilization process was investigated.
  • the hydrodynamic particle size, ⁇ -potential, and polydispersity index (PDI) are dynamic light scattering of the Nano-S90 zetaser (ZetaSizer, Malvern Instruments, Worcestershire, UK). Through dynamic light scattering (DLS), the measurement was performed at a fixed angle of 90 °. Hydrodynamic size was determined using the Stokes-Einstein equation. ⁇ -potential and PDI were determined following the manufacturer's instructions using the Nano DTS software (version 6.34). All measurements were carried out at 25 ° C. and calculated by performing at least three times each 10 times.
  • DLS dynamic light scattering
  • Drug content Size (nm) SD PDI SD Blank 80.48 1.316 0.174 0.009 One% 82.56 3.149 0.184 0.013 2% 81.3 0.9379 0.172 0.052 5% 172.9 4.234 0.276 0.02
  • TEM images of the nanoparticles were obtained using a JEOL 2011 instrument at 80 kV accelerated voltage. Samples were prepared by depositing 10 ⁇ L (0.1 mg / mL) of the nanoparticle suspension on a 300 mesh carbon-coated copper grid. It was incubated for 2 minutes and then smeared, dried over air and further dried in vacuo. The grid was stained with 1% uranyl formate to reinforce the difference. This process was repeated three times to obtain a representative image.
  • the optimized nanoparticles were about 80 nm in size, and were found to be distributed in a narrow size.
  • Tacrolimus and other weight ratio polymers were used to obtain optimized formulations.
  • the final suspension was dialyzed in 1 L of distilled water and collected, sucrose (5%) was added and lyophilized. After stabilization by ⁇ -radiation.
  • a suspension of FITC-labeled nanoparticles in HBSS at pH 8.0 (1 mg / ml) was placed in a collagen coated culture dish and incubated at 37 ° C. for 1, 2 or 4 hours. The suspension was then removed and washed 10 times with HBSS. Fluorescence images were obtained using a fluorescence microscope and are shown in FIG. 14. Intensity profiles were analyzed using a 3D-surface plotting graph, and the physical form of the grafted culture dish was analyzed by atomic force microscope (AFM). The analysis was performed and the results are shown in FIG. 15.
  • AFM atomic force microscope
  • (1-A) is an optical image of the culture plate coated with untreated collagen
  • (1-B) is a fluorescence image of the culture plate coated with untreated collagen
  • ( 1-C) is a 3D-surface plot of fluorescence intensity on the culture plate surface coated with untreated collagen
  • (2-A) was incubated with FITC-labeled PLGA-PEG-dopamine nanoparticles for 2 hours before collagen.
  • Optical image of this coated dish, (2-B) was incubated with FITC-labeled PLGA-PEG-dopamine nanoparticles for 2 hours, followed by fluorescence image of collagen coated dish, and (2-C) was FITC.
  • FIG. 15 (A) is a culture plate coated with untreated collagen, (B) is a culture dish coated with collagen after 2 hours of incubation of PLGA-PEG-dopamine nanoparticles labeled with FITC, (C) is distilled water PLGA-PEG-dopamine nanoparticles suspension labeled with FITC. 14 and 15 showed that PLGA-PEG-dopamine nanoparticles showed a high covering percentage and were bound to the surface of the collagen-coated culture dish.
  • pancreatic islet cells Two days after pancreatic islet cells were isolated, the cells were washed twice with HBSS at pH 8.0 and collected by centrifugation at 1800 rpm.
  • a suspension of PLGA-PEG-dopamine nanoparticles (1 mg / ml) was added to the cell pellet and allowed to react at 37 ° C. for 1 hour with slight shaking every 10 minutes.
  • the surface-modified pancreatic islet cells were washed twice with HBSS at pH 8.0 and resuspended in the culture medium.
  • FITC-labeled nanoparticles were used for conjugation and observed over time with a fluorescence microscope and a confocal laser scanning microscope.
  • pancreatic islet cells The viability of nanoparticle-conjugated pancreatic islet cells was quantitatively assessed by CCK-8 analysis using a cell counting kit-8 (Dojindo molecular technologies Inc., Rock-ville, MD). Unmodified pancreatic islet cells or modified pancreatic islet cells in 100 ⁇ l of RPMI-1640 were aliquoted into 96 well plates and incubated for 24 hours. After incubation, WST-8 (2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazoium, monosodium salt) solution (10ml) was added. Each well was incubated for 4 hours after the addition.
  • pancreatic islet cells The amount of formazan produced was measured by reading the absorbance at 450 nm and the final data normalized to the DNA content of each chamber. In addition, the viability of pancreatic islet cells was quantitatively analyzed using a live / dead assay viability / toxicity kit.
  • Viable pancreatic islet cells have a strong, uniform green color because the activity of esterase in the cell causes non-fluorescent cell-permeant calcein AM to fluoresce intensely.
  • Ethidium homodimer-1 (EthD-1) enters the damaged membrane of the pancreatic islet and binds to the nucleic acid, so dead cells become red fluorescent.
  • mice were anesthetized, and then spleens were extracted and splenic lymphocytes were extracted. That is, cut the spleen of the mouse, cut it into small pieces, and put it on a cell strainer (40 ⁇ m, Corning Incorporated-Life Sciences, Durham, NC27712 USA), and put the spleen into the end of the plunger of the 1 ml syringe (Korea Vaccine Association). Grinded. The cells thus obtained were washed with excess Hank's buffer salt solution (HBSS) and then centrifuged at 1400 rpm for 3 minutes.
  • HBSS Hank's buffer salt solution
  • the cell pellet was mixed again with 10 ml of HBSS to obtain resuspended cells which were again filtered on a filter to remove small clusters of cells. Then, the cells were collected again and incubated briefly at 4 ° C. for 3 minutes in a medium containing 1 ml of RBC hemolysis buffer. It was then washed three times with HBSS and dispensed into cell culture dishes (Corning Incorporated, Corning, NY, USA). After incubation overnight, only cells that were not attached to the dish were collected and washed with medium. In this way, splenic lymphocytes were purified from adherent cells such as macrophage and neutrophils. The splenocytes isolated were stained by trypan blue (Sigma) exclusion method, and the cell viability was about 95% or more.
  • Dissociated splenocytes were dispensed in 96-well flat-bottom plates (Corning, USA) by 1x10 5 cells / well with 50 ⁇ l RPMI-1640 unmodified 50 pancreatic islet cells (control) and drug-free nanoparticles.
  • the coated pancreatic islet cells (empty nanoparticle group) and tacrolimus (coated with tacrolimus) were coated with pancreatic islet cells (tacromus nanoparticle group), respectively, for 7 days.
  • Half of the medium was replaced with fresh culture medium after 1, 3, 5 and 7 days of incubation to determine TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ concentrations.
  • pancreatic islets and splenocytes were confirmed by cell membrane preservation staining using acridine orange (AO, Sigma) and propiodium iodine (PI, Sigma). Cells were stained for 3 min in the dark with AO 0.67 ⁇ M and PI 75 ⁇ M. Because AO can penetrate cells, all stained nucleated cells show green fluorescence and PI can only enter cells that do not function properly, so only dead, dead, or necrotic nucleated cells can stain red. Indicated.
  • AO acridine orange
  • PI propiodium iodine
  • mouse IL-1 ⁇ and tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ) were obtained using a commercial kit (IL-1 ⁇ , R & D systems Inc, Minneapolis, MN; TNF- ⁇ , Bender Medsystems Diagnosis GmbH Vienna, Austria). It was measured by the disclosed ELISA method.
  • pancreatic islet cells morphological changes of control pancreatic islet cells, pancreatic islet cells coated with empty nanoparticles, and pancreatic islet cells coated with tacrolimus-encapsulated nanoparticles in the presence of spleen cells are shown. Specifically, it can be seen that unmodified pancreatic islet cells (control) started to collapse after 3 days and completely lost their cell membrane integrity after 7 days of coculture. In addition, a large number of pancreatic islet cell fragments could be found in the culture medium, indicating severe destruction of pancreatic islet cells. At the same time, the surface-modified pancreatic islet cells had few fragments in the medium and preserved their cell membranes for up to seven days.
  • the viability of surface-modified pancreatic islet cells was effectively maintained while the number of dead cells increased rapidly after 7 days after unmodified pancreatic islet cells were exposed to splenocytes.
  • TNF- ⁇ when control pancreatic islet cells were exposed to splenocytes, the concentration of TNF- ⁇ was 28.729 ⁇ 10.113 pg / ml, whereas secreted during co-culture of fertilized pancreatic islet cells and splenocytes on the surface. Almost no accumulated concentration of TNF- ⁇ was observed. That is, during co-culture of pancreatic islets and splenocytes, the interaction between antigens on the surface of pancreatic islet cells and T-cells activated lymphocytes and caused secretion of cytokines such as TNF- ⁇ and IL-2. In addition, mutual interference of cytokines and lymphocytes amplified the activation of these cells.
  • pancreatic islet cells The final step in this process was the destruction of pancreatic islet cells following morphological changes and decreased cell viability.
  • pancreatic islet cells When the surface of pancreatic islet cells was coated with nanoparticles, the invasion of recipient antigen-presenting cells (APCs) as well as the migration of donor antigen-pressenting cells was also inhibited.
  • the presence of PEG treated polymer nanoparticles located on the surface of pancreatic islet cells also reduced the cell-cell communication required for xenotransplant rejection.
  • the sustained release of tacrolimus from the nanoparticles into the microenvironment around the pancreatic islet cells inhibited the secretion of IL-2, reducing the activity of splenic cells. Therefore, pancreatic islet cells coated with nanoparticles could effectively suppress the immune response during co-culture of hepatic pancreatic islet cells and splenocytes.
  • Type 1 diabetes was induced by C57BL / 6 mice with a single intraperitoneal injection of 200 mg / kg of streptozocin (STZ). After 3 days, rats with blood glucose of 350 mg / dL or more for 2 consecutive days were selected for diabetic award. The mice thus selected were anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine 80 mg / kg and xylazine 16 mg / kg, and the left kidneys of the recipient mice were exposed by lumbar incision. A small scratch was made at the bottom of the kidney with a 31 gauge needle. The bent capillaries were then encapsulated and moved in a direction to create a pouch in the capsule that continued transplantation.
  • STZ streptozocin
  • Modified or unmodified pancreatic islet cells 400 IEQ in cutdown tubing (JMS Co., Ltd, Korea) were slowly injected into the pouch using a Hamilton syringe (Hamilton company, Nevada, USA). . The nicks were then built with low heat and finally the kidneys were returned to the ritoneum prior to suturing the surgical site with sutures. The mice were free to eat water and food during the experiment.
  • pancreatic islet cell transplantation After pancreatic islet cell transplantation, a fasting glucose level was observed in the tail vein of the mouse using a portable glucose meter (Contour TS, Bayer Healthcare LLC, IN, USA). Pancreatic islet cell transplantation was considered a failure if blood glucose levels were below 200 mg / dl for two consecutive days, and transplanted pancreatic islet cells were restricted if blood glucose levels were higher than 200 mg / dl.
  • FIGS. 22 and 23 The results are shown in FIGS. 22 and 23.
  • FIG. 22 (a) when the general pancreatic islet cells were transplanted into the c57BL / 6 mouse, the blood glucose level was maintained until about 5 days after the transplantation, but the blood glucose level rapidly increased thereafter.
  • Figure 22 (b) when the tacrolimus-binding pancreatic islet cells were transplanted, the blood glucose was low until about 10 days, after which the blood glucose increased again as the cell lifespan decreased.
  • pancreatic islet cells according to the present invention to increase the survival rate of pancreatic cells transplanted into diabetic animals, including humans, it is possible to significantly alleviate the symptoms of diabetes diseases.

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Abstract

본 발명은 약물을 봉입시킨 생분해성 고분자; 상기 생분해성 고분자의 표면에 선형 고분자의 일 말단이 부착된 선형 고분자; 및 상기 선형 고분자의 다른 말단에 결합된 접착성 물질;을 포함하고, 상기 선형 고분자는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG), 헤파린(heparin), 헤파린 유사체(heparin analogue), 키토산(chitosan), 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 상기 접착성 물질은 도파민(Dopamine), 3,4-디하이드록시하이드로신남산(3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid, DOHA) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약물 지속 방출형 나노입자 및 본 발명에 따른 약물 지속 방출형 나노입자로 표면이 개질된 췌장소도세포를 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물에 대한 것이다. 본 발명에 따른 나노입자는 봉입된 면역억제제 또는 항응고제를 방출시켜 사이토카인 방출 또는 혈액응고 시스템을 조절할 수 있기 때문에 상기 나노입자로 췌장소도세포 표면을 개질하면 췌장소도세포의 이식 후 생존율을 향상시킬 수 있다.

Description

약물 지속 방출형 나노 입자 및 상기 나노입자로 표면 개질된 췌장소도세포를 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물
본 발명은 당뇨병을 치료하기 위한 췌장소도세포 이식 시에, 사이토카인 방출 또는 혈액응고 시스템을 억제하는 나노입자 및 상기 나노입자로 표면 개질된 췌장소도세포를 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물에 대한 것이다.
당뇨병(Diabetes Mellitus)은 췌장 β-세포의 인슐린 분비 이상이나 인슐린 작용기관 또는 장기의 수용체 이상 등으로 인한 고혈당 증상과 이에 따른 합병증을 나타내는 질병이다. 현재 당뇨병 치료 방법으로 주로 인슐린 주사 요법과 함께 운동요법, 식이요법이 시행되고 있으나, 완치가 불가능하고 합병증 위험이 여전히 존재하는 등의 한계가 있다.
이에, 최근에는 췌장 이식 및 췌장소도세포 이식을 이용한 당뇨병 치료방법이 시행되고 있는데, 췌장 이식의 경우, 공여자의 절대 부족, 높은 수술 합병증, 지속적인 면역억제제의 투여를 비롯한 이식 후 관리의 어려움 등의 문제점이 있다. 이에 비해, 췌장소도세포 이식은 분리한 췌장소도세포의 체외 배양 및 면역조절 등의 시험관 내 조작이 가능하고, 이종이식의 면역반응이 극복될 경우 돼지 등을 이용한 무한한 췌장소도세포의 공급도 가능하며, 비교적 간편한 시술로 합병증 없이 쉽게 이식할 수 있다는 장점이 있다.
그러나 췌장소도세포 이식이 성공적으로 이루어지기 위해서는 효과적인 췌장소도세포의 분리법 개발 및 분리 과정에서 발생하는 췌장소도세포 손상의 최소화, 이식 과정에서 발생하는 비특이적 염증과정에 의한 세포 손상과 이로 인한 생착 실패율의 최소화, 이식 후 발생하는 면역반응에 의한 세포 손상의 극복 및 췌장소도세포 공급원의 확보 등의 문제점이 선결돼야 한다. 특히, 췌장소도세포 이식 후 나타나는 초기 염증반응 때문에 기능적인 부적합이나 세포 괴사 및 고사에 의해 췌장소도세포가 파괴되므로, 실제 필요한 췌장소도세포보다 더 많은 양의 췌장소도세포를 이식해야만 하는 문제점이 있다.
이러한 비특이적 염증반응은 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터류킨-1β(interleukin-1β, IL-1β), 인터페론-γ(interferon-γ, IFN-γ)와 같은 다양한 전 염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)에 의해 이루어지며, 다량의 사이토카인은 췌장소도세포에서 유도형 NO 생성효소(inducible NO synthase, iNOS)에 의한 산화질소(nitric oxide, NO) 생성을 유도하고, 이는 크렙스 회로(Krebs cycle)에서 아코니타아제(aconitase)를 억제하여, 글루코스의 산화와 ATP 생성 및 인슐린의 생성을 감소시킨다.
또한, 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2, PGE2)는 췌장소도세포 또는 β-세포주에서 글루코스에 의해 유도되는 인슐린의 분비를 억제하는 것으로 보고되었으며, IL-1β에 의해서 생성이 촉진된다고 알려져있다. 더욱이 상기 이식과정에서 발생하는 비특이적 염증과정에 의한 세포 손상을 막기 위하여 종양괴사인자-알파의 수용체에 대한 단클론 항체(infliximab)가 개발되어 실제 췌장소도세포 이식에 사용되고 있으며, 산화질소를 조절하는 N-모노메틸 아르기닌(N-monomethyl arginine), 대식세포의 기능을 조절하는 15-데옥시스페르구알린(15-deoxypergualin)의 사용도 시도되고 있으나 임상에 본격적으로 적용하지는 못하고 있는 실정이다.
더불어 간문맥으로 췌장소도세포를 이식하면서 이식된 췌장소도세포가 혈액에 직접 노출되면 혈소판, 보체 등 혈액응고 시스템이 활성화되어 췌장소도세포 주위로 혈액응고가 일어나 췌장소도세포가 급격히 파괴되는 초급성 혈액 매개성 염증반응(Instant blood mediated inflammatory reaction, IBMIR)이 발생한다는 점도 문제이다.
따라서 염증성 사이토카인을 제어할 수 있다면 이식 초기 췌장소도세포의 안정을 유도하여 보다 소량의 세포로 최대한의 췌장소도세포 이식 효과를 기대할 수 있을 것인 바, 성공적인 췌장소도세포 이식을 위해서 상기와 같은 사이토카인 방출 또는 혈액응고 시스템을 조절할 수 있는 방법이 필요하다.
본 발명의 목적은 췌장소도세포 이식 시 사이토카인 방출 또는 혈액응고 시스템을 조절할 수 있는 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명은 다른 목적은 상기 나노입자로 표면이 개질된 췌장소도세포를 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 약물을 봉입시킨 생분해성 고분자; 상기 생분해성 고분자의 표면에 선형 고분자의 일 말단이 부착된 선형 고분자; 및 상기 선형 고분자의 다른 말단에 결합된 접착성 물질;을 포함하고, 상기 선형 고분자는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG), 헤파린(heparin), 헤파린 유사체(heparin analogue), 키토산(chitosan), 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 상기 접착성 물질은 도파민(Dopamine), 3,4-디하이드록시하이드로신남산(3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid, DOHA) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약물 지속 방출형 나노입자를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 약물 지속 방출형 나노입자로 표면이 개질된 췌장소도세포를 포함하고, 상기 약물 지속 방출형 나노입자는 약물을 봉입시킨 생분해성 고분자; 상기 생분해성 고분자의 표면에 선형 고분자의 일 말단이 부착된 선형 고분자; 및 상기 선형 고분자의 다른 말단에 결합된 접착성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 나노입자는 봉입된 면역억제제 또는 항응고제를 방출시켜 사이토카인 방출 또는 혈액응고 시스템을 조절할 수 있으므로, 상기 나노입자로 췌장소도세포 표면을 개질함으로써 췌장소도세포의 이식 후 생존율을 향상시켜 높은 당뇨병 치료 효과를 나타낼 수 있다.
도 1 중 A는 본 발명에 따른 약물 지속 방출형 나노입자를 나타낸 것이고, 도 1 중 B는 면역억제제가 봉입된 나노입자의 췌장소도세포 표면에서의 효과를 나타낸 것이며, 도 1 중 C는 항응고제가 봉입된 나노입자의 췌장소도세포 표면에서의 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 PLGA-PEG-도파민의 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 PLGA-PEG-도파민의 푸리에 변환 적외분광법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4 및 도 5는 PLGA-PEG-도파민의 H-핵자기공명(H-nuclear magnetic resonance, H-NMR) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 PLGA-PEG-NHS 공중합체(PLGA-PEG-NHS co-polymer)의 H-NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 PLGA-PEG-NHS와 PLGA-PEG-도파민의 자외선-가시광선 분광분석법(UV-Visible Spectrophotometer, UV-VIS) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 PLGA-PEG-도파민의 도파민 함량에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 PLGA-PEG-도파민 나노입자에 있어서 유기 용제의 영향에 대해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 나노입자의 크기 및 다분산지수(polydispersity index, PDI)에 대한 약물/중합체의 중량비의 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 나노입자의 안정성에 대한 동결방지제 첨가 유무의 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 최적화된 나노입자의 크기 분포를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 최적화된 나노입자의 크기를 확인한 결과이다.
도 14는 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 PLGA-PEG-도파민 나노입자의 결합을 확인한 결과이다.
도 15는 콜라겐이 코팅된 배양접시와 PLGA-PEG-도파민 나노입자의 결합에서 강도 분포(Intensity distribution)을 확인한 결과이다.
도 16 및 도 17은 췌장소도세포의 표면과 PLGA-PEG-도파민 나노입자의 결합을 확인한 결과이다.
도 18은 췌장소도세포의 표면과 PLGA-PEG-도파민 나노입자의 결합 후 세포의 생존율을 확인한 결과이다.
도 19는 췌장소도세포와 지라세포와의 공배양 시 세포의 모습을 나타낸 결과이다.
도 20은 췌장소도세포와 지라세포와의 공배양 시 세포들을 염색하여 세포들의 생존능을 확인한 결과이다.
도 21은 췌장소도세포와 지라세포와의 공배양 시 축적된 TNF-α의 양을 나타낸 그래프이다.
도 22 및 도 23은 당뇨병 마우스에 췌장소도세포를 이식한 후 혈당 및 몸무게의 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자는 성공적인 췌장소도세포 이식을 위해서 사이토카인 방출 또는 혈액응고 시스템을 조절할 수 있는 방법에 대해 연구하던 중, 약물을 봉입시킨 생분해성 고분자; 상기 생분해성 고분자의 표면에 선형 고분자의 일 말단이 부착된 선형 고분자; 및 상기 선형 고분자의 다른 말단에 결합된 접착성 물질을 포함하는 약물 지속 방출형 나노입자를 제조하고, 상기 나노입자로 췌장소도세포의 표면을 개질하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 도 1 중 A와 같이, 약물을 봉입시킨 생분해성 고분자; 상기 생분해성 고분자의 표면에 선형 고분자의 일 말단이 부착된 선형 고분자; 및 상기 선형 고분자의 다른 말단에 결합된 접착성 물질;을 포함하고, 상기 선형 고분자는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG), 헤파린(heparin), 헤파린 유사체(heparin analogue), 키토산(chitosan), 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 상기 접착성 물질은 도파민(Dopamine), 3,4-디하이드록시하이드로신남산(3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid, DOHA) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약물 지속 방출형 나노입자를 제공한다.
이때, 상기 생분해성 고분자는 PLGA(Poly(lactide-co-glycolide)), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 유도체, 키토산 유도체, 헤파린 유도체 및 이들의 혼합물 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 보다 바람직하게는 PLGA이나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약물은 타크로리무스(tacrolimus), 시클로스포린(Cyclosporin), 시롤리무스(Sirolimus), 에베롤리무스(Everolimus), 리다포롤리무스(Ridaforolimus), 템시롤리무스(Temsirolimus), 유미롤리무스(Umirolimus), 조타롤리무스(Zotarolimus), 레프루노미드(Leflunomide), 메토트렉세이트(Methotrexate), 리툭시맙(Rituximab), 루플리주맙(Ruplizumab), 다클리주맙(Daclizumab), 아바타셉트(Abatacept) 및 벨라타셉트(Belatacept)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 면역억제제(immunosuppression drug) 또는 아르가트로반(argatroban), 쿠마린(Cumarin), 헤파린(Heparin), 저분자량헤파린(Low molecular weight heparin), 히루딘(Hirudin), 다비가트란(Dabigatran), 멜라가트란(Melagatran), 클로피도그렐(Clopidogrel), 티클로피딘(Ticlopidine) 및 압시시맙(Abciximab)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항응고제(anti-coagulant drug)이다.
상기 면역억제제 또는 항응고제는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 널리 알려진 봉입 방법에 따라 봉입될 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자는 PEG에 부착된 도파민을 통해 콜라겐 매트릭스나 나노입자간에 부착할 수 있다. 따라서, 도 1 중 B와 같이, 면역억제제가 봉입된 나노입자의 경우 췌장소도세포(Pancreatic islets)를 PEG 및 도파민이 둘러싸서 인체 내 면역시스템(보체(complement), 대식세포(macrophage), 다형핵백혈구(polymorphonuclear leukocyte) 및 K 세포 등)의 인식 및 침투를 억제하고, 면역억제제인 타크로리무스의 방출로 싸이토카인(cytokines)의 분비를 억제할 수 있다.
더불어 도 1 중 C와 같이, 항응고제가 봉입된 나노입자의 경우 PEG 및 도파민이 췌장소도세포(Pancreatic islets)를 둘러싸서 인체 내 면역시스템(보체(complement), 대식세포(macrophage), 다형핵백혈구(polymorphonuclear leukocyte) 및 K 세포 등)의 인식 및 침투를 억제하고, 항응고제인 아르가트로반의 방출로 초급성 혈액 매개성 염증반응(Instant blood mediated inflammatory reaction, IBMIR)을 억제하여 췌장소도세포의 손상을 방지할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 나노 입자는 50 nm 내지 1000 nm의 평균직경을 가질 수 있는 바, 상기 범위를 벗어나 나노입자의 평균직경이 너무 작으면, 약물 방출 시간이 감소되는 문제가 야기될 수 있고, 나노입자의 평균직경이 너무 크면 췌장소도세포 표면에 균일하게 결합하기 어려운 문제가 야기될 수 있다.
더불어 본 발명은 약물 지속 방출형 나노입자로 표면이 개질된 췌장소도세포를 포함하고, 상기 약물 지속 방출형 나노입자는 약물을 봉입시킨 생분해성 고분자; 상기 생분해성 고분자의 표면에 선형 고분자의 일 말단이 부착된 선형 고분자; 및 상기 선형 고분자의 다른 말단에 결합된 접착성 물질;을 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 상기 접착성 물질은 도파민(Dopamine), 3,4-디하이드록시하이드로신남산(3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid, DOHA) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 보다 바람직하게는 도파민일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 선형 고분자는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG), 헤파린(heparin), 헤파린 유사체(heparin analogue), 키토산(chitosan), 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 보다 바람직하게는 PEG일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 생분해성 고분자는 PLGA(Poly(lactide-co-glycolide)), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 유도체, 키토산 유도체, 헤파린 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 보다 바람직하게는 PLGA이나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약물은 타크로리무스(tacrolimus), 시클로스포린(Cyclosporin), 시롤리무스(Sirolimus), 에베롤리무스(Everolimus), 리다포롤리무스(Ridaforolimus), 템시롤리무스(Temsirolimus), 유미롤리무스(Umirolimus), 조타롤리무스(Zotarolimus), 레프루노미드(Leflunomide), 메토트렉세이트(Methotrexate), 리툭시맙(Rituximab), 루플리주맙(Ruplizumab), 다클리주맙(Daclizumab), 아바타셉트(Abatacept) 및 벨라타셉트(Belatacept)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 면역억제제(immunosuppression drug) 또는 아르가트로반(argatroban), 쿠마린(Cumarin), 헤파린(Heparin), 저분자량헤파린(Low molecular weight heparin), 히루딘(Hirudin), 다비가트란(Dabigatran), 멜라가트란(Melagatran), 클로피도그렐(Clopidogrel), 티클로피딘(Ticlopidine) 및 압시시맙(Abciximab)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항응고제(anti-coagulant drug)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 면역 억제제 또는 항응고제는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 널리 알려진 봉입 방법에 따라 봉입될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약물 지속 방출형 나노입자로 표면이 개질된 췌장소도세포의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있는 바, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 이식의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 간문맥, 안구, 신장, 근육, 피하, 위장 등에 할 수 있다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<참고예> 실험 재료의 준비
PLGA(Poly(lactide-co-glycolide), MW: 17000 Da), PLGA-PEG-NHS(poly(lactide-co-glycolide)-b-Poly(ethylene glycol)-N-hydroxysucciniamide, MW~17000 Da:3000 Da, 50:50 LA:GA) 및 PLGA-FITC(poly(lactide-co-glycolide)-FITC, MW~10000 Da, 50:50 LA:GA)는 폴리사이테크(Polyscitech, Indiana, USA)에서 구매하였다. RPMI 1640 배양액, HBSS(Hank's balanced salt solution), 히스토페이크-1077(Histopaque-1077) 및 도파민 히드로클로라이드(dopamine hydrochloride)는 시그마-알드리치(Sigma-aldrich, Korea)에서 구매하였다. 아세톤(Acetone), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디클로로메테인(dichloromethane, DCM) 및 디에틸에테르(diethylether)는 준세이(Junsei, Korea)에서 구매하였다. 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)는 하이클론(Hyclone)에서 구매하였다. 콜라게나아제 P(Collagenase P)는 로슈 진단 GmBH(Roche diagnostic GmBH, Mainheim, Germany)에서 구매하였다. 라이브/데드 세포 생존/세포독성 분석 키트(Live/dead cell viability/cytotoxicity assay kit)는 라이프 테크놀러지(Life Technologies, Oregon, USA)에서 구매하였다. 세포 카운팅 키트-8(Cell counting kit-8, CCK-8)은 두진두 실험실(Dojindo, Japan)에서 구매하였다. 아미콘 원심분리 튜브(Amicon centrifugation tube, Pore size: 100,000 Da)는 밀리포어(Millipore Co., Billerica, MA, USA)에서 구매하였다. 콴트-iT™피코그린　dsDNA 시약(Quant-iT™PicoGreen　dsDNA reagent)는 인비트로겐(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)에서 구매하였다. 콜라겐이 코팅된 배양접시는 매트테크 회사(MatTech Corporation, Homer Ave, Ashland, USA)에서 구매하였다.
<실시예 1> PLGA-PEG-도파민 결합체의 합성
100 mg의 PLGA-PEG-NHS와 2.83 mg의 도파민 하이드로클로라이드를 1 ml의 디메틸폼아마이드(dimethylformamide, DMF)에 용해한 후 4℃에서 밤새 교반하였다. 그런 후, 20 ml의 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)를 첨가하고 반응물을 격렬하게 섞어주었다. 도파민이 메틸렌 클로라이드와 혼합되지 않는 원리를 이용하여, 미반응 도파민은 원심분리하여 침전물로 제거하였다. 생성물인 PLGA-PEG-도파민을 포함하는 상등액을 수거하고, 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 이용하여 순도를 검사하였다. 미반응 도파민이 발견되지 않은 경우, 40℃에서 낮은 압력을 가하여 용액을 증발시켜 점성의 생성물을 수거하고, 차가운 에테르에서 침전시켜 정제하였다. 최종적으로, 생성물을 -20℃에서 4시간 동결시킨 후 분말 형태를 얻기 위하여 -70℃에서 12시간 동결 건조하였다.
<실시예 2> PLGA-PEG-도파민 결합체의 특성 평가
1) 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)
도파민 히드로클로라이드의 용액, DMF 내의 PLGA-PEG-NHS 및 반응물질을 유리 도파민(free dopamin)을 제거한 후, TLC 플레이트(4cm×15cm)에 떨어뜨렸다. TLC 플레이트를 30분간 실온에서 보관한 후, 이동상(mobile phase, DMF:methanol=1:1)을 포함하는 유리 탱크(glass tank)에 30분간 도입하고 60℃에서 1시간 동안 건조하였다. 그 결과, 도 2와 같이, 반응물에서 도파민에 대한 화학적 흔적(chemical trace)이 발견되지 않았고, 최종생성물로부터 유리 도파민이 거의 다 제거된 것을 확인하였다.
2) 푸리에 변환 적외분광법 (Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR)
FT-IR 스펙트라는 써모 사이언티픽 니콜렛 넥서스 670 FT-IR 분광계(Thermo Scientific Nicolet Nexus 670 FT-IR Spectrometer), 스마트 iTR(Smart iTR) 및 다이아몬드 윈도우(diamond window, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA)를 이용하여 기록하였다. 이렇게 PLGA-PEG-도파민 결합체의 화학적 구조를 FT-IR로 확인한 결과 도 3과 같이, 최종 생성물의 스펙트라에서 알코올 스트레치(stretch)(3200-3550 cm-1, O-H stretch)에 대한 특징적인 피크가 PLGA의 스펙트라 피크와 비교했을 때 상당히 증가된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 결합체 내 PEG의 존재를 확인시켜 주었다. 더불어, 아미드(amide) 그룹(~1600 cm- 1)에 해당하는 카보닐 피크(carbonyl peak)는 도파민 잔기(moiety)와 코-블럭 중합체(co-block polymer)간의 결합을 증명하였다.
3) H-핵자기공명(H-nuclear magnetic resonance, H-NMR)
PLGA 및 PLAG-PEG-DOPA의 스펙트라는 DMSO-d6과 600MHz에서 작동하는 에질런트-NMR-VNMRS600 계측기(Agilent-NMR-VNMRS600 instrument)에 등록하였고 화학 이동은 ppm으로 기록하였다. PLGA-PEG-NHS의 스펙트럼은 폴리사이테크에서 얻었다.
그 결과 도 4와 같이, PLGA-AL 결합의 H-NMR 스펙트럼에서, 중합체 신호의 유병률(prevalence)이 관찰되었다. 그러나 도파민의 존재는 도파민의 수소에 속하는 2.57 ppm 및 3.28 ppm(peak area: 0.16)의 두 가지 작은 피크에서 확인되었다. 젖산 유닛에 해당하는 수소 원자는 피크 면적 7.72인 4.829 ppm에서부터 4.945 ppm까지의 피크를 제공하였다.
더불어 도 5와 같이, PLGA-PEG-도파민 스펙트라의 NHS(4.46 ppm)에 해당하는 피크의 흡광도는 PLGA-PEG-NHS와 도파민의 상호작용을 확인시켜 주었고, 이때 NHS 잔기는 도파민에 의해 재배치되었음을 나타냈다.
한편, 도 6을 참조하면, 폴리사이테크로부터 제공받은 PLGA-PEG-NHS 공중합체(PLGA-PEG-NHS co-polymer)의 H-NHR 결과에서 PLGA와 도파민의 피크 면적 간의 상대 비율(relative ratio)을 바탕으로 결합 효율성을 계산한 결과, 결합 효율성은 대략 60% 정도였다.
4) 겔 투과 크로마토그래피(Gel permeation chromatography)
두 개의 페노겔 5μm 컬럼(DCM flow across two Phenogel 5 μm columns) 및 하나의 PLgelResipore 컬럼(Agilent)에 1 ml/분으로 DCM을 공급하면서 배리언 시스템(Varian system)을 사용하여 PLGA-PEG-도파민의 분자량을 측정하였다. 이 결과를 폴리스티렌(polystyrene) 기준을 바탕으로 교정하였고 수평균분자량(Mn), 질량평균분자량(Mw) 및 다분산 지수(polydispersity index, PDI)를 산출하여 하기 표 1에 나타내었다(하기 PLGA-PEG-NHS 및 HO-PEG-COOH의 결과는 폴리사이테크(USA)로부터 얻었다).
Polymer Mn(from GPC) Mw(from GPC) PDI
PLGA-PEG-NHS 16,048 24,882 1.55
HO-PEG-COOH Average Mn by GPC ~ 3300
5) 자외선-가시광선 분광분석법(UV-Visible Spectrophotometer, UV- VIS )
중합체의 화학적 구조를 확인하기 위하여, PLGA-PEG-NHS 및 PLGA-PEG-도파민의 UV-VIS 프로필(profiles)을 U-2800 분광광도계(spectrophotometer, Hitachi, Japan)을 이용하여 분석하였다. 반응은 도파민 피크에 대한 NHS 피크의 변화를 통해 확인하여, 도 7에 나타내었다. 도 7을 참조하면, DMF의 PLGA-PEG-NHS 용액은 검은 선, DMF의 PLGA-PEG-도파민 용액은 파란 선으로 표시되어 있는데, 260nm에서 280nm로 피크의 이동은 도파민에 의해 NHS 잔기가 대체되는 것을 의미한다.
6) 결합물의 도파민 함량 확인
결합물의 도파민 함량을 분광광도계를 이용하여 확인하였다. 서로 다른 농도의 DMF 내 PLGA-PEG-도파민 용액의 흡광도를 도파민 연속적 용액(serial solution)의 교정 그래프에 대하여 280nm에서 측정하였다(1.40625 μg/ml, 2.8125 μg/ml, 5.625 μg/ml, 11.25 μg/ml, 22.5 μg/ml, 45 μg/ml). 이를 세 번 반복해서 수행하였다.
그 결과 도 8과 같이, 결합물에서 도파민의 함량은 1 mg의 결합물 중 6.22 μg인 것으로 측정되었다. PLGA-PEG 부분의 분자량이 20,000 Da이라고 가정함으로써 이 반응의 결합 효율이 약 80%임을 계산할 수 있었다.
<실시예 3> PLGA-PEG-도파민 나노입자(Nanoparticles, NPs)의 제조
침전 방법(precipitation method)을 통해 PLGA-PEG-도파민 나노입자를 준비하였다. 구체적으로, 10 mg 중합체를 1 ml 아세톤에 용해한 후 오일층을 교반하면서 10 ml의 증류수에 천천히 주입하였다. 다시 실온에서 2시간 교반한 후, 유기 용매를 완전히 제거하기 위하여 1ℓ의 증류수에 투석하였다. 이후 췌장소도세포 표면의 나노입자들의 분포를 평가하기 위해, PLGA-FITC 및 PLGA-PEG-도파민을 20:80(w/w)의 비율로 아세톤에 녹여 형광 표지된 나노입자를 준비하였다.
<실시예 4> PLGA-PEG-도파민 NPs의 특성 평가
1) 유기용제(organic solvent)의 영향을 평가
유기용제(organic solvent)의 영향을 평가하기 위해, 물과 혼합되는 두 가지 유기 용제(DMF 또는 아세톤)를 나노입자 제조에 사용하였다. 나노 입자의 PDI 및 크기에서 약물 함량의 영향을 확인하기 위해, 타크로리무스(Tacrolimus)를 다른 농도의 폴리머 용액(1%, 2% 또는 5%)에 첨가하였다. 특히, 계면활성제(동결방지제) 없이 제조한 나노입자는 동결 건조 후 불안정한 것으로 알려져 있으므로 계면활성제를 첨가 또는 미첨가한 나노입자를 동결 건조한 후, 이를 실온에 두었다가 각 나노입자의 크기와 PDI를 비교하여 동결건조 과정 동안 계면활성제가 나노입자의 안정성에 미치는 영향을 조사하였다.
구체적으로, 유체역학적 입자 사이즈(Hydrodynamic particle size), ζ-포텐셜(ζ-potential) 및 다분산지수(polydispersity index, PDI)는 Nano-S90 제타시저(ZetaSizer, Malvern Instruments, Worcestershire, UK)의 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS)을 통해, 90°의 고정 각도(fixed angle)에서 측정하였다. 유체역학적 크기는 스토크스-아인슈타인 방정식(Stokes-Einstein equation)를 이용하여 결정하였다. ζ-포텐셜 및 PDI는 나노 DTS 소프트웨어(버전 6.34)를 이용하여 제조사의 지침을 따라 결정하였다. 모든 측정은 25℃에서 수행했고, 적어도 각 10회로 3번 이상 수행하여 계산하였다.
그 결과 도 9와 같이, 나노입자를 제조하기 위해 DMF를 사용할 때, 더 좋은 PDI와 작은 사이즈의 나노입자가 관찰되었다. 그러나 나노입자의 사이즈가 너무 작으면, 약물 방출 시간이 감소되는 문제가 야기될 수도 있기 때문에 낮은 비점(boiling point)를 갖고 있어 현탁액으로부터 제거가 쉬운 아세톤을 선택하여, 나노 입자의 PDI 및 크기에서 약물의 함량 및 약물과 중합체의 중량비의 영향을 확인하고 그 결과를 하기 표 2 및 도 10에 나타내었다.
약물 함량 (Drug content) 크기(nm) SD PDI SD
블랭크(blank) 80.48 1.316 0.174 0.009
1% 82.56 3.149 0.184 0.013
2% 81.3 0.9379 0.172 0.052
5% 172.9 4.234 0.276 0.02
상기 결과를 통하여, 타크로리무스는 2% 이상의 함량으로 충진되면 그 효과가 저하되는 것을 확인하였다.
또한, 동결건조 과정 동안 계면활성제(동결방지제, cryoprotectant)가 나노입자의 안정성에 미치는 영향을 확인하여 그 결과를 하기 표 3 및 도 11에 나타내었다. 상기 실시예 1과 같이 PLGA-PEG-도파민 결합체를 제조할 때, 증류수에 투석한 후 투석액에 동결방지제로써 10%의 수크로오스(sucrose)를 첨가하고 동결건조 하였다.
Size(nm) SD PDI SD
대조군 71.94 0.4179 0.125 0.011
수크로오스 첨가한 후 동결건조함. 79.83 0.4409 0.181 0.03
수크로오스 미첨가 후 동결건조 함. 1334 33.71 0.637 0.072
상기 결과를 통하여, 10%의 수크로오스가 존재해도, 동결건조 후 나노입자의 PDI 및 사이즈에는 큰 변화가 없다는 것을 확인하였다.
그러므로 상기 표 2 및 표 3와 도 9 및 도 10을 통해 확인한 결과를 통해, 최적화된 제제를 제조하기 위한 프로토콜(protocol)을 수립하였다. 간략하게, 0.1 mg의 타크로리무스와 9.9 mg의 PLGA-PEG-도파민을 1 ml의 아세톤에 용해시키고 이 용액을 10 ml의 물에 천천히 주입시켰다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 이 현탁액을 1ℓ의 증류수에 4시간 동안 투석하여 유기 용제와 유리 약물을 완벽하게 제거하였다. 그런 후 투석액을 수집하고, 동결방지제인 10%의 수크로오스의 존재하에 감압하며 동결건조시켰다. 마지막으로, 생성물을 ν-방사선 조사(ν-irradiation)를 통해 멸균하였다.
2) TEM 및 DLS를 이용한 NPs 크기 및 분포도 측정
나노입자의 TEM 이미지는 80 kV 가속 전압(accelerated voltage)에서 JEOL 2011 기기를 사용하여 얻었다. 샘플은 300 메쉬의 탄소-코팅된 구리 그리드(300-mesh carbon-coated copper grid) 상에 나노입자 현탁액 10 μL (0.1 ㎎ / ㎖)을 증착시켜 제조하였다. 이를 2분간 배양한 후 도말하여, 공기 상에서 건조하고 진공에서 더 건조시켰다. 그리드는 차이를 강화하기 위해 1% 우라닐 포름산염(uranyl formate)과 함께 착색하였다(counter stained). 이 과정을 세 번 반복하여 대표적인 이미지를 얻었다.
그 결과 도 12 및 도 13과 같이, 최적화된 나노입자의 크기는 약 80 nm이고, 좁은 크기(narrow size)로 분포하는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 5> NPs의 캡슐화
최적화된 제형을 얻기 위하여 타크로리무스와 다른 중량비(weight ratio)의 중합체를 사용하였다. 완전하게 유기 용매 및 유리 약물을 제거하기 위해 최종 현탁액을 1ℓ의 증류수에 투석하였고 이를 수집하여, 수크로오스(sucrose, 5%)를 첨가하고 동결 건조하였다. 이후 ν-방사선조사를 통해 안정화시켰다.
1) 췌장소도세포(pancreas islets)의 분리
스프라그-다울리(sprague-Dawley, SD) 랫트(8주령, 수컷, 한국)의 췌장소도세포는 콜라게나아제 타입 IV (Sigma) 소화(digestion) 방법을 통해 분리하였다. 이를 10% FBS, 2 mN 탄산소수나트륨(sodium bicarbonate), 11 mM 글루코스(glucose), 6 mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 포함하는 RPMI-1640 배지로 배양하였다. 모든 마우스 실험은 영남대학교(Yeungnam University, South Korea)의 윤리 위원회를 통해 승인받았고, 국가적 지침(national guidelines)에 따라 수행하였다.
2) 콜라겐 결합 분석
pH 8.0(1mg/ml)의 HBSS 내의 FITC로 표지된 나노입자들의 현탁액을 콜라겐으로 코팅된 배양접시에 넣고 37℃에서 1, 2 또는 4시간 동안 배양하였다. 그런 후, 현탁액을 제거하고 HBSS로 10회 세척하였다. 형광이미지는 형광 현미경(fluorescence microscope)을 이용하여 수득하여 도 14에 나타내었다. 강도 프로필(intensity profile)은 3D-표면 플롯팅 그래프(3D-surface plotting graph)를 이용하여 분석하였고, 결합된(grafted) 배양접시의 물리적인 형태는 원자간력현미경(atomic force microscope, AFM)을 통해 분석하였고 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 14 중 (1-A)는 처리하지 않은 콜라겐으로 코팅한 배양접시의 광학 이미지(Optical images), (1-B)는 처리하지 않은 콜라겐으로 코팅한 배양접시의 형광 이미지(Fluorescence image), (1-C)는 처리하지 않은 콜라겐으로 코팅한 배양접시 표면의 형광 강도의 3D-표면 플롯팅, (2-A)는 FITC로 표지된 PLGA-PEG-도파민 나노입자와 함께 2시간 배양한 후 콜라겐이 코팅된 배양접시의 광학 이미지, (2-B)는 FITC로 표지된 PLGA-PEG-도파민 나노입자와 함께 2시간 배양한 후 콜라겐이 코팅된 배양접시의 형광 이미지, (2-C)는 FITC로 표지된 PLGA-PEG-도파민 나노입자와 함께 2시간 배양한 후 코팅한 배양접시 표면의 형광 강도의 3D-표면 플롯팅이다.
더불어 표면 100 ㎛ 범위의 강도 분포(intensity distribution)를 확인하여 도 15에 나타내었다. 도 15 중 (A)는 처리하지 않은 콜라겐으로 코팅한 배양접시, (B)는 FITC로 표지된 PLGA-PEG-도파민 나노입자를 2시간 배양한 후의 콜라겐으로 코팅한 배양 접시, (C)는 증류수의 FITC로 표지된 PLGA-PEG-도파민 나노입자 현탁액이다. 상기 도 14 및 도 15를 통해 PLGA-PEG-도파민 나노입자는 높은 피복 비율(covering percentage)를 보이며, 콜라겐이 코팅된 배양접시의 표면에 결합되었음을 알 수 있었다.
3) 췌장소도세포의 표면으로의 PLGA-PEG-도파민 NPs의 접합
췌장소도세포를 분리하고 2일 후, 세포를 pH 8.0의 HBSS로 두 번 세척하고 1800 rpm으로 원심분리하여 수집하였다. 췌장소도세포 표면으로의 나노입자의 접합을 위해, PLGA-PEG-도파민 나노입자(1 mg/ml)의 현탁액을 세포 펠렛에 더해주고, 10분마다 약간씩 흔들어주며 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 표면이 개질된 췌장소도세포는 pH 8.0의 HBSS로 두 번 세척해주고 배양 배지에 재현탁시켰다. 나노입자의 분포를 평가하기 위해, FITC-표지된 나노입자를 접합에 이용하였고, 형광 현미경과 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscope)으로 시간에 걸쳐 관찰하였다.
그 결과 도 16 및 도 17과 같이, 췌장소도세포(islets) 표면 전부를 PLGA-PEG-도파민 나노입자가 덮고 있는 것을 확인할 수 있었다.
4) 췌장소도세포의 생존능력 평가
나노입자가 접합된 췌장소도세포의 생존능력은 세포 카운팅 키트-8(cell counting kit-8, Dojindo molecular technologies Inc., Rock-ville, MD)를 이용하여 CCK-8 분석으로 정량적으로 평가하였다. 100 μl의 RPMI-1640 내의 개질되지 않은 췌장소도세포 또는 개질된 췌장소도세포를 96 웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 WST-8(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoium, monosodium salt) 용액(10ml)을 각 웰에 더해준 후 4시간 더 배양하였다. 생성된 포르마잔의 양은 450 nm에서의 흡광도를 판독함으로써 측정하였고, 최종 데이터는 각 챔버(chamber)의 DNA 함량으로 표준화하였다. 추가적으로 췌장소도세포의 생존 능력은 생존/사멸 분석 생존능력/세포독성 키트(Live/dead assay viability/toxicity kit)를 이용하여 정량적으로 분석하였다.
세포 내의 에스테라아제(esterase)의 활성이 비-형광 세포 투과-칼세인(non-fluorescent cell-permeant calcein) AM이 강렬한 형광을 띠도록 하기 때문에, 생존 가능한 췌장소도세포는 강하고 균일한 녹색을 띠게 된다. EthD-1(Ethidium homodimer-1)은 손상된 췌장소도세포 멤브레인으로 들어가 핵산과 결합하게 되므로 죽은 세포는 붉은 형광을 띠게 된다.
그 결과 도 18과 같이, 표면이 개질된 췌장소도세포의 90% 영역 및 개질되지 않은 췌장소도세포는 녹색 형광을 나타내었고 그 형태(morphology) 또한 췌장소도세포와 헤파린-도파(heparin-DOPA)의 배양 후에 보존되었다. 따라서 이러한 결과를 통해 PLGA-PEG-도파민 나노입자가 췌장소도세포 표면에 접합하는 것은 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
< 실시예 6> 지라 림프구와의 상호작용
1) 지라 T-세포의 준비
지라 림프구와의 상호작용을 알아보기 위해, C57BL/6 수컷 마우스를 마취한 후 개복하여 지라를 적출한 후 지라 림프구들을 추출하였다. 즉, 마우스의 지라를 잘라내어 작은 조각으로 썬 다음 세포 여과기(40 μm, Corning Incorporated-Life Sciences, Durham, NC27712 USA)에 올려놓고, 여과기에서 1 ml의 주사기(한국백신협회)의 플런저 말단으로 지라 조각들을 갈았다. 이렇게 얻은 세포들은 Hank's buffer salt solution(HBSS)를 초과 첨가하여 세척한 후, 3분간 1400 rpm에서 원심분리하였다. 세포 펠렛은 10 ml의 HBSS로 다시 섞어주어 재부유된 세포를 획득하였고 이것을 다시 여과기에서 여과하여 작은 세포 송이(cluster)들을 제거하였다. 이후, 다시 세포들을 모아 1 ml의 RBC 용혈 버퍼가 있는 배지에서 3분간, 4℃ 조건으로 잠시 배양하였다. 그 후, HBSS로 3번 세척하고 셀 배양 디시(Corning Incorporated, Corning, NY, USA)에 분주하였다. 밤새도록 배양한 후 디시에 붙어 있지 않은 세포들만을 모아 배지로 세척하였다. 이러한 방법으로 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophils)와 같은 접착 세포들에서 지라 림프구를 정제하였다. 분리된 지라세포(splenocyte)들을 트리판 블루(trypan blue, Sigma) 배제법으로 염색하여 확인한 세포 생존능력은 약 95% 이상이었다.
2) 췌장소도세포(islets) 및 지라세포의 공배양
분리된 지라세포를 96 웰 편평바닥 플레이트(Corning, USA)에 1x105 cells/well만큼 분주하여 200 μl RPMI-1640과 함께 개질되지 않은 50 췌장소도세포(대조군), 약물이 봉입되지 않은 나노입자로 코팅된 췌장소도세포(빈 나노입자군) 및 타크로리무스(tacrolimus)가 봉입된 나노입자로 코팅된 췌장소도세포(타크로무스 나노입자군)과 함께 각각 7일간 공배양하였다. TNF-α 및 IL-1β 농도를 측정하기 위해 배지의 반을 배양 시작 1일, 3일, 5일 및 7일 경과 후마다 신선한 배양 배지로 교체하였다.
7일 배양 후, 췌장소도세포 및 지라세포의 생존능력을 아크리딘 오렌지(AO, Sigma) 및 프로포디움 아이오딘(PI, Sigma)를 사용하여 세포막 보전 염색으로 확인하였다. 세포들은 AO 0.67 μM와 PI 75 μM로 어둠 속에서 3분간 염색되었다. AO는 세포 침투가 가능하므로, 모든 염색된 유핵 세포는 녹색 형광을 나타내었고, PI는 면역 반응이 제대로 기능하지 못하는 세포에만 들어갈 수 있으므로, 죽고 있거나, 죽었거나, 괴저성의 유핵 세포들만이 붉은 염색을 나타내었다.
또한 마우스 IL-1β와 종양 괴사 인자(tumer necrosis factor, TNF-α)가 상업적인 kit(IL-1β, R&D systems Inc, Minneapolis, MN; TNF-α, Bender Medsystems Diagnosis GmbH Vienna, Austria)를 이용하여 이에 개시된 ELISA 방법으로 측정되었다.
3) 실험 결과
상기 실험의 결과가 도 19 내지 도 21에 도시되어 있다.
도 19를 참조하면, 지라세포 존재 하에서 대조군 췌장소도세포, 빈 나노입자로 코팅된 췌장소도세포 및 타크로리무스가 봉입된 나노입자로 코팅된 췌장소도세포의 형태학적 변화가 나타나있다. 구체적으로, 개질되지 않은 췌장소도세포(대조군)는 3일 후에 붕괴되기 시작해서 공배양 7일 후면 그 세포막 보전을 완전히 잃어버린 것을 볼 수 있다. 게다가, 매우 많은 췌장소도세포 조각들을 배양 배지에서 찾을 수 있었는데, 이는 췌장소도세포의 심각한 파괴를 의미한다. 동시에, 표면이 수정된 췌장소도세포는 배지에 그 조각이 거의 없었으며, 7일까지 그들의 세포막을 보전했다.
또한, 도 20을 참조하면, 표면이 개질된 췌장소도세포의 생존능력은 효과적으로 유지된 반면 죽은 세포의 수는 수정되지 않은 췌장소도세포가 비장세포에 노출되고 7일 후부터 급격하게 증가했다.
도 21을 참조하면, 대조군 췌장소도세포가 지라세포에 노출되었을 때, TNF-α의 농도가 28.729 ± 10.113 pg/ml 였던 반면에, 표면에 수정된 췌장소도세포 및 지라세포의 공배양 시에 분비된 TNF-α의 축적 농도는 거의 관찰되지 않았다. 즉, 췌장소도세포와 지라세포의 공배양 동안 췌장소도세포 표면의 항원과 T-세포 간의 상호작용이 림프구들을 활성화했고, TNF-α와 IL-2 같은 사이토카인의 분비를 야기했다. 또한, 사이토카인과 림프구의 상호 간섭이 이 세포의 활성화를 증폭했다. 이 과정의 최종 과정은 형태학적 변화와 세포 생존 능력의 감소에 따른 췌장소도세포의 파괴였다. 췌장소도세포의 표면이 나노입자로 코팅될 때, 수여자의 항원전달세포(Antigen-presenting cells, APCs)의 침입뿐만 아니라 공여자의 항원전달세포(antigen-pressenting cells)의 이동 또한 억제되었다. 췌장소도세포의 표면에 위치하는 PEG 처리된 중합체 나노입자의 존재 또한 이종 간의 이식 거부 반응에 필요한 세포-세포 커뮤니케이션을 감소시켰다. 게다가, 나노입자로부터 췌장소도세포 주변의 미세환경으로의 타크로리무스의 지속적인 방출이 IL-2의 분비를 억제하여, 지라세포의 활성을 감소시켰다. 그러므로 이종 간의 췌장소도세포 및 지라세포의 공배양 동안 나노입자로 코팅된 췌장소도세포가 효과적으로 면역 반응을 억제할 수 있었다.
<실시예 7> 췌장소도세포의 이식
1) 랫트 췌장소도세포를 당뇨성 마우스로 이종 간 기관 이식
C57BL/6 마우스에 200 mg/kg의 스트렙토조신(streptozocin, STZ)을 단일 복강 내 주사하여 제1형 당뇨병을 유도하였다. 3일 후에, 연이은 2일 동안 혈당이 350 mg/dL 이상인 쥐들을 당뇨성 수여용으로 선별하였다. 이렇게 선별된 쥐들을 케타민 80 mg/kg 및 자일라진 16 mg/kg을 복강 내 주사하여 마취시키고 수여용 쥐들의 왼쪽 신장을 요추 절개하여 노출시켰다. 31 게이지 바늘로 신장 바닥에 작은 스크래치를 만들었다. 그리고 나서, 구부러진 모세혈관을 캡슐에 넣어 이식이 지속되는 캡슐에 파우치를 만들 수 있는 방향으로 움직였다. 컷다운 튜빙(Cutdown tubing; JMS Co., Ltd, 한국)에 담긴 표면이 수정되거나 수정되지 않은 췌장소도세포(400 IEQ)가 Hamilton 주사기(Hamilton company, Nevada, USA)를 이용하여 파우치 안으로 천천히 주입되었다. 이후, 간격(nick)을 낮은 열로 지졌고, 마지막으로 봉합선으로 수술 부위를 봉합하기에 앞서 신장을 배막(ritoneum)으로 되돌려 놓았다. 실험용 마우스들은 실험 기간 동안 물과 음식을 자유롭게 섭취할 수 있었다.
췌장소도세포 이식 후, 포터블 글루코스 미터(portable glucose meter; Contour TS, Bayer Healthcare LLC, IN, USA)를 이용하여 비 공복 시 혈당 농도를 마우스의 꼬리 정맥에서 관찰하였다. 췌장소도세포 이식은 혈당 레벨이 연이은 2일 동안 200 mg/dl 이하가 되면 성공으로, 200 mg/dl보다 혈당이 높아지면 이식된 췌장소도세포가 제한되었으므로 실패로 간주되었다.
2) 실험결과
그 결과가 도 22 및 도 23에 나타나있다. 도 22 (a)를 참조하면, c57BL/6 마우스에 일반 췌장소도세포를 이식한 경우, 이식 후 약 5일까지는 낮은 혈당을 유지하지만, 그 이후부터 다시 혈당이 급격하게 증가하였다. 반면에, 도 22 (b)를 참조하면, 타크로리무스 결합 췌장소도세포를 이식한 경우, 약 10일까지 낮은 혈당을 나타내었으며 그 이후 세포의 수명이 감소함에 따라 다시 혈당이 증가하는 모습을 나타냈다.
또한, 도 23 (a)를 참조하면, 일반 췌장소도세포를 이식한 경우, 당뇨에 걸린 후 계속해서 감소하던 체중이 이식후 잠시 증가하다가 약 5일 내지 10일이 지난 후에는 다시 감소하기 시작했으나, 도 23 (b)를 참조하면, 타크리로무스 결합 췌장소도세포를 이식한 경우 대부분 꾸준히 체중이 증가하는 모습을 나타냈다.
즉, 이러한 결과들로부터 본 발명에 따른 표면이 개질된 췌장소도세포를 이용하여 인간을 포함한 당뇨 동물에 이식된 췌장세포의 생존율을 증가시킴으로써 당뇨 질환의 병증을 현저히 완화시킬 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 약물을 봉입시킨 생분해성 고분자; 상기 생분해성 고분자의 표면에 선형 고분자의 일 말단이 부착된 선형 고분자; 및 상기 선형 고분자의 다른 말단에 결합된 접착성 물질;을 포함하고, 상기 선형 고분자는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG), 헤파린(heparin), 헤파린 유사체(heparin analogue), 키토산(chitosan), 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 상기 접착성 물질은 도파민(Dopamine), 3,4-디하이드록시하이드로신남산(3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid, DOHA) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약물 지속 방출형 나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 PLGA(Poly(lactide-co-glycolide)), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 유도체, 키토산 유도체, 헤파린 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약물 지속 방출형 나노입자.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 약물은 타크로리무스(tacrolimus), 시클로스포린(Cyclosporin), 시롤리무스(Sirolimus), 에베롤리무스(Everolimus), 리다포롤리무스(Ridaforolimus), 템시롤리무스(Temsirolimus), 유미롤리무스(Umirolimus), 조타롤리무스(Zotarolimus), 레프루노미드(Leflunomide), 메토트렉세이트(Methotrexate), 리툭시맙(Rituximab), 루플리주맙(Ruplizumab), 다클리주맙(Daclizumab), 아바타셉트(Abatacept) 및 벨라타셉트(Belatacept)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 면역억제제(immunosuppression drug) 또는 아르가트로반(argatroban), 쿠마린(Cumarin), 헤파린(Heparin), 저분자량헤파린(Low molecular weight heparin), 히루딘(Hirudin), 다비가트란(Dabigatran), 멜라가트란(Melagatran), 클로피도그렐(Clopidogrel), 티클로피딘(Ticlopidine) 및 압시시맙(Abciximab)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항응고제(anti-coagulant drug)인 것을 특징으로 하는 약물 지속 방출형 나노입자.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 나노 입자는 50 nm 내지 1000 nm의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 약물 지속 방출형 나노입자.
  5. 약물 지속 방출형 나노입자로 표면이 개질된 췌장소도세포를 포함하고, 상기 약물 지속 방출형 나노입자는 약물을 봉입시킨 생분해성 고분자; 상기 생분해성 고분자의 표면에 선형 고분자의 일 말단이 부착된 선형 고분자; 및 상기 선형 고분자의 다른 말단에 결합된 접착성 물질;을 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 접착성 물질은 도파민(Dopamine), 3,4-디하이드록시하이드로신남산(3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid, DOHA) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 선형 고분자는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG), 헤파린(heparin), 헤파린 유사체(heparin analogue), 키토산(chitosan), 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 PLGA(Poly(lactide-co-glycolide)), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 유도체, 키토산 유도체, 헤파린 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 약물은 타크로리무스(tacrolimus), 시클로스포린(Cyclosporin), 시롤리무스(Sirolimus), 에베롤리무스(Everolimus), 리다포롤리무스(Ridaforolimus), 템시롤리무스(Temsirolimus), 유미롤리무스(Umirolimus), 조타롤리무스(Zotarolimus), 레프루노미드(Leflunomide), 메토트렉세이트(Methotrexate), 리툭시맙(Rituximab), 루플리주맙(Ruplizumab), 다클리주맙(Daclizumab), 아바타셉트(Abatacept) 및 벨라타셉트(Belatacept)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 면역억제제(immunosuppression drug) 또는 아르가트로반(argatroban), 쿠마린(Cumarin), 헤파린(Heparin), 저분자량헤파린(Low molecular weight heparin), 히루딘(Hirudin), 다비가트란(Dabigatran), 멜라가트란(Melagatran), 클로피도그렐(Clopidogrel), 티클로피딘(Ticlopidine) 및 압시시맙(Abciximab)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항응고제(anti-coagulant drug)인 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.
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