KR102117394B1 - 듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 이식용 췌도 세포집단 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 이식용 췌도 세포집단 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 촉매 또는 링커를 사용하지 않고, 캡슐화된 췌도 세포에 대한 별도의 경화단계도 필요하지 않아 기존의 췌도 세포 표면개질보다 공정이 훨씬 간단하며, 하나의 나노 플랫폼 안에 두 종류의 작용기를 포함함으로써 췌도 세포집단의 코팅 효율이 향상된다. 아울러, 상기 듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 이식용 췌도 세포집단 조성물은 친수성 및 소수성 등 다양한 표적 약물의 봉입이 가능하고, 면역억제제 또는 항혈액응고제와 같은 여러 유형의 생리활성물질을 함께 전달할 수 있어, 세포의 이식률을 향상시키고, 인슐린 반응성을 안정하게 유지시키며, 비특이적 면역 반응을 효과적으로 감소시켜 새로운 세포 의약품 전달 시스템으로 활용될 수 있다.

Description

듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 이식용 췌도 세포집단 조성물{PANCREATIC CELL CLUSTER COMPOSITION FOR TRANSPLANTATION USING BIOCOMPATIBLE CELL MIMIC NANOPLATFORM COMPRISING DUAL TARGET MOIETY}
본 발명은 듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 이식용 췌도 세포집단 조성물에 관한 것이다.
당뇨(Diabetes Mellitus)는 제1형과 제2형으로 나눌 수 있는데, 제1형 당뇨(type Ⅰ diabetes)는 췌장에서 췌도(pancreatic islet of Langerhans)를 구성하는 인슐린을 생산하는 베타-세포가 주로 자가면역기전에 의해 파괴되어 인슐린이 결핍되어 나타나는 질환으로 외부로부터의 인슐린 투여를 비롯한 운동, 식이요법이 주된 치료이다. 그러나 인슐린 투여로 당뇨의 완치는 불가능하고, 합병증을 완전히 예방하지는 못한다는 한계가 있다.
이러한 점에서, 최근에는 인슐린을 분비하는 췌장 또는 췌도세포를 이식하는 당뇨병 치료가 시행되고 있는데, 췌장 이식의 경우 공여자의 절대 부족, 높은 수술 합병증, 지속적인 면역억제제의 투여를 비롯한 이식 후 관리의 어려움 등의 문제점이 있다. 이에 비해, 췌도세포 이식은 분리한 췌도세포의 체외 배양 및 면역조절 등의 실험실 내 조작이 가능하고, 이종이식의 면역반응이 극복될 경우 돼지 등을 이용한 무한한 췌도세포의 공급이 가능하며, 비교적 간편한 시술로 합병증 없이 쉽게 이식이 가능하다는 장점이 있다.
한편, 췌도세포 이식이 성공적으로 이루어지기 위해서는 효과적인 췌도세포의 분리법 개발 및 분리 과정에서 발생하는 췌도세포 손상의 최소화, 이식과정에서 발생하는 비특이적 염증과정에 의한 세포 손상과 이로 인한 생착 실패의 최소화, 이식 후 발생하는 면역반응에 의한 세포 손상의 극복 및 췌도세포 공급원의 확보 등의 문제점이 선결되어야 한다. 특히, 췌도세포 이식 후 초기 염증반응은 기능적인 부적합이나 세포 괴사(necrosis) 및 고사(apoptosis)에 의한 췌도세포의 파괴를 초래하므로, 실제 필요한 췌도세포보다 더 많은 양의 췌도세포를 이식해야만 하는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 새로운 이식용 췌도 세포집단 조성물을 개발하기 위해 노력한 결과, 췌도 세포 표면과 공유결합, 정전기적 결합 및 수소결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 화학결합을 동시에 형성할 수 있는 듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 개발하고, 상기 나노 플랫폼을 통한 마이크로캡슐(폴리머좀)화에 의해 간단하면서도 높은 효율로 췌도 세포집단을 표면 개질할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 표면개질된 췌도 세포집단의 이식 시 우수한 면역 보호 효과, 이식 부피의 최소화, 대사산물 이동의 최대화가 가능하며, 그에 따른 인슐린 분비능 향상 및 이식 세포의 괴사율 감소 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 (a) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1 생체적합성 고분자; 및 (b) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제2 생체적합성 고분자;를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 및 분리된 췌도 세포집단을 포함하는 이식용 췌도 세포집단 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이식용 췌도 세포집단 조성물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 또는 이식용 췌도 세포집단 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1 생체적합성 고분자; 및 (b) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제2 생체적합성 고분자;를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 및 분리된 췌도 세포집단을 포함하는 이식용 췌도 세포집단 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이식용 췌도 세포집단 조성물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계; (b) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제2 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계; (c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 제조한 용액을 혼합하는 단계; 및 (d) 상기 혼합된 용액을 과량의 물로 투석하는 단계;를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계; (b) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제2 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계; (c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 제조한 용액을 혼합하는 단계; (d) 상기 혼합된 용액을 과량의 물로 투석하는 단계; 및 (e) 분리된 췌도 세포에 상기 (d) 단계에서 제조한 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 처리하여 췌도 세포집단을 표면개질화 하는 단계;를 포함하는 이식용 췌도 세포집단 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 촉매 또는 링커를 사용하지 않고, 캡슐화된 췌도 세포에 대한 별도의 경화단계도 필요하지 않아 기존의 췌도 세포 표면개질보다 공정이 훨씬 간단하며, 하나의 나노 플랫폼 안에 두 종류의 작용기를 포함함으로써 췌도 세포집단의 코팅 효율이 향상된다. 아울러, 상기 듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 이식용 췌도 세포집단 조성물은 친수성 및 소수성 등 다양한 표적 약물의 봉입이 가능하고, 면역억제제 또는 항혈액응고제와 같은 여러 유형의 생리활성물질을 함께 전달할 수 있어, 세포의 이식률을 향상시키고, 인슐린 반응성을 안정하게 유지시키며, 비특이적 면역 반응을 효과적으로 감소시켜 새로운 세포 의약품 전달 시스템으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 및 이를 이용한 췌도 세포집단의 표면개질 방법을 모식도로 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 하나의 나노 플랫폼 안에 두 개의 타겟 단위를 가지며, 그에 따라 세포 표면 작용기와의 관계에서 공유결합, 정전기적 결합 또는 수소결합과 같은 화학결합을 두 종류 이상 동시에 형성하여 보다 효율적인 표면개질화(코팅화) 전략을 제시한다.
도 2는 분리된 신생 췌도 세포집단(neonatal pancreatic cell clusters, NPCC)을 분리 0일차, 1일차, 3일차 및 5일차에 각각 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다. 분리된 신생 췌도 세포집단 총 3개 그룹에 대하여 동일한 방법으로 관측을 수행하였다.
도 3은 (i) 공유 결합을 형성하는 블록 공중합체(PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide, NHS), (ii) 정전기적 결합을 형성하는 블록 공중합체(PLA-PEG-NH2), (iii) 수소결합을 형성하는 블록 공중합체(PLA-PEG-COOH), (iv) 작용기 없는 비교군(PLA-PEG-OCH3)을 이용하여 제조한 단일 작용기-생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼의 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM) 이미지, 입자 크기 및 표면 전하 값을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 각각의 단일 작용기-생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용하여 신생 췌도 세포집단을 표면개질화하고, 표면개질 여부를 DiD 염료를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다. 비교군으로는 (iv) 작용기 없는 PLA-PEG-CH3O(iv) 및 (v) 양친매성 고분자가 없는 음성 대조군을 사용하였다.
도 5는 각각의 단일 작용기-생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용하여 표면개질화한 신생 췌도 세포집단의 표면개질화 효율(코팅 효율)을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 각각의 단일 작용기-생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용하여 표면개질화한 신생 췌도 세포집단의 표면개질화에 대한 분자량 투과도를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 이중 작용기-생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼에 있어서, 양친매성 블록 공중합체의 혼합비율(10:0, 9:1, 5:5, 1:9, 0:10)에 따른 나노 플랫폼의 TEM 이미지를 관찰한 결과를 나타낸 도이다. 상기 양친매성 블록 공중합체로는 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-NH2를 혼합하여 사용하였다.
도 8은 본 발명에 따른 이중 작용기-생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼에 있어서, 양친매성 블록 공중합체의 혼합비율(10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 8:2, 1:9, 0:10)에 따른 나노 플랫폼의 입자 크기를 측정한 결과를 나타낸 도이다. 형성된 폴리머좀(polymersome)의 입자 크기는 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering, DLS, Malvern Panalytical)을 이용하여 측정하였다.
도 9는 이중 작용기-생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용하여 표면개질화한 신생 췌도집단에 있어서, 양친매성 블록 공중합체의 혼합비율(10:0, 9:1, 7:3, 5:5, 0:10) 에 따른 기간별 안정성을 형광 현미경을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다. 상기 양친매성 블록 공중합체로는 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-NH2를 혼합하여 사용하였다.
도 10은 이중 작용기-생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용하여 표면개질화한 신생 췌도집단의 표면을 주사형 공집점 레이져 현미경을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 이중 작용기-생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용하여 표면개질화한 신생 췌도집단에 있어서, 양친매성 블록 공중합체의 혼합비율(0:10, 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1, 10:0)에 따른 기간별 안정성을 형광 현미경을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다. 상기 양친매성 블록 공중합체로는 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-Maleimide(MAL)를 혼합하여 사용하였다.
도 12는 이중 작용기-생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용하여 표면개질화한 신생 췌도집단에 있어서, 양친매성 블록 공중합체의 혼합 비율(0:10, 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1, 10:0)에 따른 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 상기 양친매성 블록 공중합체로는 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-Maleimide(MAL)를 혼합하여 사용하였다.
도 13은 이중 작용기-생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용하여 표면개질화한 신생 췌도집단에 있어서, 양친매성 블록 공중합체의 혼합비율(5:5, 7:3, 9:1)에 따른 글루코즈 반응성을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 상기 양친매성 블록 공중합체로는 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-Maleimide(MAL)를 혼합하여 사용하였다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1 생체적합성 고분자; 및 (b) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제2 생체적합성 고분자;를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 제공한다.
본 발명에서, 용어 “췌도”는 랑게르한스섬(pancreatic islet of Langerhans)을 의미하며, 본 발명에서는 신생 돼지를 췌도 공급원(donor)으로 사용하여 신생 췌도 세포집단(neonatal pancreatic cell cluster, NPCC)을 분리하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 췌도 공급원은 인간에게 이식할 수 있는 췌도를 가지고 있는 포유동물이면 제한 없이 사용할 수 있고, 상기 포유동물은 예를 들어 돼지, 소, 원숭이, 인간일 수 있다. 이 중 돼지는 해부학적 및 생리학적으로 사람과 매우 유사하여 장기가 사람과 유사한 크기이고, 사육이 쉽고 임신기간(112일)이 짧으면서도 한꺼번에 많은 수의 새끼(6~12마리)를 낳을 수 있는 장점이 있어 췌도 공급원으로 사용될 수 있다. 또한, 돼지는 인슐린 대사능력이 사람과 유사하고, 많은 양의 췌도 세포를 가지고 있기 때문에 췌도 공급원으로 사용되기에 적합하다.
본 발명에서, 용어 “생체적합성 고분자”는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 파괴하거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 갖는 고분자를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자는 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 작용기를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 화학결합은 공유결합, 정전기적 결합 및 수소결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 상기 제1 생체적합성 고분자가 형성하는 화학결합 및 제2 생체적합성 고분자가 형성하는 화학결합은 공유결합과 공유결합, 공유결합과 정전기적 결합, 공유결합과 수소결합 또는 정전기적 결합과 수소결합의 조합일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 췌도 세포 표면 특이적 작용기를 인식하여 결합함으로써 췌도 세포 표면을 표면개질할 수 있는 것이면 제한 없이 이용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 생체적합성 고분자는 N-하이드록시석신이미드기(-N-hydroxysuccinimide, NHS), 말레이미드기(-maleimide), 아민기(-NH2), 카르복시기(-COOH), 할로젠화 알킬(alkyl halide), 알코올(alchol, C-OH), 에터(ether, C-O-C), 싸이올(thiol), 설파이드(sulfide), 알데하이드(aldehyde) 및 케톤(ketone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 작용기를 가진 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 친수성 고분자 블록 및 소수성 고분자 블록을 포함하는 양친매성 블록 공중합체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 친수성 고분자 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리에틸렌옥시드, 폴리옥사졸린, 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리비닐알콜, 폴리히드록시에틸메타크릴에이트, 덱스트란, 폴리세린, 폴리트레오닌, 폴리티로신, 폴리 리신, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, 폴리아스파르트산 및 폴리글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단량체, 상기 단량체의 유도체, 또는 둘 이상의 단량체를 공중합시킨 공중합체일 수 있으며, 바람직하게는 분자량이 1000 내지 5000인 폴리알킬렌글리콜 또는 이의 유도체 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 분자량이 1000 내지 5000인 메톡시 아미노 폴리에틸렌글리콜을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 소수성 고분자 블록은 폴리락타이드, 폴리카프로락톤, 폴리(베타벤질-L-아스파테이트), 폴리프로필렌옥사이드, 루신, 이소루신, 발린, 페닐알라닌, 프롤린, 글리신, 메틴오닌 및 폴리락트산-글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단량체, 상기 단량체의 유도체, 또는 둘 이상의 단량체를 공중합시킨 공중합체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 “양친매성”은 서로 상이한 물성, 예를 들면 서로 상이한 용해도 파라미터(solubility parameter)를 가지는 영역들을 동시에 포함하고 있는 것을 의미하며, 예를 들어 친수성 영역 및 소수성 영역을 동시에 포함하고 있는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “친수성 또는 소수성”은 각 영역이 상분리 되어있는 것을 확인할 수 있을 정도의 상태에서, 예를 들면 블록(block)을 형성한 채 고분자 내에 포함되어 있는 영역을 의미하는 것으로써, 각각의 친수성 또는 소수성의 정도는 상대적인 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 양친매성 블록 공중합체는 Rx-PEG-b-PLA의 화학식을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. PEG-b-PLA는 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol), PEG)과 폴리락타이드(poly(lactic acid), PLA)의 블록 공중합체(block copolymer)를 의미하며, 이 때, 상기 Rx에서 R은 탄소 또는 수소를 포함하는 화합물 또는 작용기이면 특별히 한정되지 않으며, x는 N-하이드록시석신이미드기(-N-hydroxysuccinimide, NHS), 말레이미드기(-maleimide), 아민기(-NH2), 카르복시기(-COOH), 할로젠화 알킬(alkyl halide), 알코올(alchol, C-OH), 에터(ether, C-O-C), 싸이올(thiol), 설파이드(sulfide), 알데하이드(aldehyde) 및 케톤(ketone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 작용기일 수 있다.
본 발명에 따른 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 상기 양친매성 블록 공중합체를 이용함으로써 안정성, 생체적합성, 생분해성의 특성을 가지며, 블록 공중합체의 자기조립(self-assembly) 특성을 이용하여 췌도 세포집단을 효과적으로 캡슐화할 수 있다. 또한, 우수한 분산 특성을 가져 약학적 조성물을 비롯한 다양한 조성물에 포함될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “자기조립 특성”은 양친매성 블록 공중합체가 유중 또는 수중 상에서 자발적으로 미세한 상 분리를 일으켜 일정한 크기의 규칙성을 가지는 현상을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 공유 결합을 형성하는 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS), PLA-PEG-Maleimide(MAL), 정전기적 결합을 형성하는 PLA-PEG-NH2, 수소결합을 형성하는 PLA-PEG-COOH(PLA molecular weight: 4000, PEG molecular weight: 2000)를 사용하여 실험을 수행하였다.
본 명세서에서, 용어 “생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼”은 (a) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1 생체적합성 고분자; 및 (b) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제2 생체적합성 고분자;를 포함하는, 선택적으로 췌도 세포 표면 표적 지향능을 갖는 폴리머좀(polymersome)을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 N-하이드록시석신이미드기(-N-hydroxysuccinimide, NHS), 말레이미드기(-maleimide), 아민기(-NH2), 카르복시기(-COOH), 할로젠화 알킬(alkyl halide), 알코올(alchol, C-OH), 에터(ether, C-O-C), 싸이올(thiol), 설파이드(sulfide), 알데하이드(aldehyde) 및 케톤(ketone) 중 선택된 한가지 작용기 기반의 양친매성 블록 공중합체(제1 생체적합성 고분자); 및 다른 한가지 작용기 기반의 양친매성 블록 공중합체(제2 생체적합성 고분자)를 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 이중 작용기 기반의 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼으로서 NHS/NH2-생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 및 NHS/MAL-생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 제조하고, 상기 나노 플랫폼은 두 가지의 서로 다른 작용기(듀얼 타겟 단위)를 포함함에 따라 촉매, 링커, 스페이서 또는 캡슐화된 췌도 세포에 대한 별도의 경화단계 없이 췌도 세포집단을 효과적으로 표면개질할 수 있음을 확인하였다. 상기 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 췌도 세포에 대해 표적 지향능을 가지며, 단일 공정을 통해 제조되므로 생산 단가를 줄일 수 있는 장점이 있다.
본 명세서에서, 용어 “폴리머좀(polymersome)”은 양친매성 블록 공중합체로 만든 “친수성 영역-소수성 영역-소수성 영역-친수성 영역”을 갖는 이중층 막으로 둘러싸인 구조물로, 속이 빈 친수성 코어 내에 친수성 물질을, 소수성 쉘(shell)에 소수성 물질을 동시에 담지 할 수 있다.
본 발명에 따른 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼이 폴리머좀(polymersome)을 형성하는지 여부는 하기 식 1에 따라 계산된 질량 분율(mass fraction)로 확인할 수 있다. 식 1에 따라 계산된 질량 분율이 0.25 내지 0.40을 만족할 때 양친성 입자는 폴리머좀 형태를 나타내고, 질량 분율이 0.40 초과 0.70 이하일 때 양친성 입자는 마이셀 구조를 나타낸다.
[식 1]
질량 분율(mass fraction) = 친수성 고분자 또는 펩타이드의 분자량/(친수성 고분자 또는 펩타이드의 분자량 + 소수성 고분자의 분자량)
본 발명에 따른 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 폴리머좀 입자의 평균 지름(diameter)이 200 nm 이하일 수 있으며, 바람직하게는 50 내지 200 nm, 보다 바람직하게는 50 내지 100 nm, 보다 더 바람직하게는 80 내지 100 nm일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 블록 공중합체들의 양친매성 특성을 통해 속이 비어 있는 친수성 코어를 소수성 쉘과 친수성 쉘이 이중으로 둘러싸고 있는 폴리머좀(polymersome) 구조임을 확인하였다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 및 분리된 췌도 세포집단을 포함하는 이식용 췌도 세포집단 조성물을 제공한다.
상기 이식용 췌도 세포집단 조성물은 본 발명의 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼이 폴리머좀 구조를 가짐에 따라, 형광물질, 면역억제제 및 항혈액응고제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있고, 친수성 및/또는 소수성 약물을 담지 할 수 있는 약물전달체로 사용할 수 있으며, 따라서 이식용 췌도 세포집단 조성물의 면역 억제성을 향상시킬 수 있다.
상기 이식용 췌도 세포집단 조성물은 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼으로 표면개질됨에 따라, 면역 관련 단백질의 외부로부터의 유입을 효율적으로 막음으로써 비특이적 면역 반응을 현저히 감소시킬 수 있고, 췌도 세포 이식률을 높일 수 있다. 아울러, 폴리머좀 내에 인슐린 자극 물질 또는 면역 억제제를 포함하여 이식되는 췌도 세포집단의 인슐린 반응성을 더욱 향상시키고, 면역반응을 더욱 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 이식용 췌도 세포집단 조성물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨인 것을 특징으로 한다. 제1형 당뇨는 인슐린을 분비하는 췌도의 베타세포가 파괴됨으로 인하여 인슐린 분비기능이 소실되어 발생하므로, 본 발명에 따른 이식용 췌도 세포집단 조성물의 생체(in vivo) 이식이 좋은 치료방법이 될 수 있다.
한편, 상기 이식용 췌도 세포집단 조성물은 제1형 당뇨뿐만 아니라, 췌도 세포 결함에 의해 발생할 수 있는 모든 질환에 대하여 제한 없이 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 췌도 세포 이식으로 치료가 가능한 제2형 당뇨, 당뇨병성 만성 신질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "치료"란 조성물의 투여로 당뇨 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 용어 "예방"은 조성물의 투여로 당뇨 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 경피흡수제, 겔제, 로션제, 연고제, 크림제, 첩부제, 카타플라스마제, 페이스트제, 스프레이, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피 전달성 패치, 약물 함유 붕대 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 61 (tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내, 경막하, 뇌 내 또는 뇌실 내 주사에 의해 투여할 수 있다. 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 보다 효과적인 예방 또는 치료를 위하여, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일당 0.001 내지 1000 mg/kg(체중)으로 투여함이 바람직하고, 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 당뇨의 예방 또는 치료는 본 발명에 따른 이식용 췌도 세포집단을 생체에 이식하여 수행할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 서로 다른 종류의 화학결합을 동시에 이용하여 높은 효율로 표면개질된 이식용 췌도 세포집단을 포함하여, 세포 이식률이 높고, 글루코스에 반응하는 인슐린 분비능이 높으며, 대사물질은 투과시키지만 면역세포는 투과시키지 않을 수 있어 효과적인 당뇨 치료가 가능하다.
또한, 본 발명은 (a) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계; (b) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제2 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계; (c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 제조한 용액을 혼합하는 단계; 및 (d) 상기 혼합된 용액을 과량의 물로 투석하는 단계;를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼의 제조방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 제1 생체적합성 고분자는 N-하이드록시석신이미드기(-N-hydroxysuccinimide, NHS), 말레이미드기(-maleimide), 아민기(-NH2), 카르복시기(-COOH), 할로젠화 알킬(alkyl halide), 알코올(alchol, C-OH), 에터(ether, C-O-C), 싸이올(thiol), 설파이드(sulfide), 알데하이드(aldehyde) 및 케톤(ketone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 작용기를 포함할 수 있으며, 예를 들어, N-하이드록시석신이미드기(-N-hydroxysuccinimide, NHS)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 단계의 제2 생체적합성 고분자는 N-하이드록시석신이미드기(-N-hydroxysuccinimide, NHS), 말레이미드기(-maleimide), 아민기(-NH2), 카르복시기(-COOH), 할로젠화 알킬(alkyl halide), 알코올(alchol, C-OH), 에터(ether, C-O-C), 싸이올(thiol), 설파이드(sulfide), 알데하이드(aldehyde) 및 케톤(ketone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 작용기를 포함할 수 있고, 상기 작용기는 제1 생체적합성 고분자에 포함되는 작용기와는 다른 것이 바람직하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 제1 생체적합성 고분자와 제2 생체적합성 고분자를 용매에 분산 또는 용해시키고, 각 용액을 적절한 부피비(v/v)로 혼합한 뒤 과량의 물로 투석하는 방법을 통해서 제조할 수 있다. 상기 (c) 단계의 혼합은 (a) 단계에서 제조한 용액 및 (b) 단계에서 제조한 용액을 9:1 내지 5:5의 부피비(v/v)로 혼합하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 방법은 이에 제한되지는 않으나, 각 생체적합성 고분자를 수용액에 분산시킨 뒤 초음파를 가하는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 유기용매를 추출 또는 증발시키는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 투석하는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 균질기 또는 고압유화기를 이용하여 강하게 용매를 증발시키는 방법 및 얇은 필름 수화법(Thin film hydration)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유기용매는 DMSO(dimethyl sulfoxide, 디메틸설폭사이드), 클로로포름, 헥산, 헵탄, 메틸렌클로라이드, 벤젠, 톨루엔, 테트라하이드로퓨란, 아세톤 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 DMSO를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 각 생체적합성 고분자(양친매성 블록 공중합체)를 DMSO에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물(분획분자량 2 K의 한외여과막)로 24시간 동안 투석하는 방법을 통해서 제조하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 제1 생체적합성 고분자로 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS), 제2 생체적합성 고분자로 PLA-PEG-NH2를 사용하고 상기 각각의 양친매성 블록 공중합체를 DMSO에 용해시킨 용액을 9:1 내지 5:5 비율로 혼합하는 경우 췌도 세포집단이 높은 효율로 코팅되고, 표면개질이 안정성이 우수함을 확인하였다. 또한, 제1 생체적합성 고분자로 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS), 제2 생체적합성 고분자로 PLA-PEG-Maleimide(MAL)를 사용하고 상기 각각의 양친매성 블록 공중합체를 DMSO에 용해시킨 용액을 9:1 내지 5:5 비율로 혼합하는 경우, 마찬가지로 췌도 세포집단이 높은 효율로 코팅되고, 표면개질이 안정성이 우수함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 서로 다른 작용기를 가진 양친매성 블록 공중합체를 동시에 포함하여, 듀얼 타겟 단위를 가짐에 따라 한 가지 종류의 작용기만을 가진 양친매성 블록 공중합체 기반의 나노 플랫폼에 비해 췌도 세포집단을 높은 효율로 코팅할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 (a) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계; (b) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제2 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계; (c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 제조한 용액을 혼합하는 단계; (d) 상기 혼합된 용액을 과량의 물로 투석하는 단계; 및 (e) 분리된 췌도 세포에 상기 (d) 단계에서 제조한 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 처리하여 췌도 세포집단을 표면개질화 하는 단계;를 포함하는 이식용 췌도 세포집단 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 이식용 췌도 세포집단 조성물은 서로 다른 작용기를 가진 양친매성 블록 공중합체를 이용하여 제조된 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 사용함에 따라, 세포 독성을 나타내지 않으면서도, 표면개질의 안정성이 오랜 기간 유지되고 인슐린 반응성에 영향을 미치지 않아 당뇨의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 시약
블록 공중합체로는 PLA-PEG 기반 블록 공중합체를 사용하였고, 구체적으로 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS), PLA-PEG-Maleimide(MAL), PLA-PEG-NH2, PLA-PEG-COOH(PLA molecular weight: 4000, PEG molecular weight: 2000)를 Nanosoft Polymers(Winston-Salem, NC, USA)에서 구입하여 사용하였다. H1 High Grade Membrane(5K MWCO)은 범한상사(Korea)에서 구입하였다. DiD(1,1′′′, 4-chlorobenzenesulfonate salt)는 Biotium, Inc.(Fremont, CA, USA)에서 구입하였으며, Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7%, K-FITC-Dextran(MW 10 kDa, 20 kDa, 70 kDa, 250 kDa)은 Sigma-Aldrich(Korea)에서 구입하였다. 케타민(Ketamine)은 유한양행(Korea)에서, 럼푼(Rompun)은 바이엘코리아(Korea)에서 구입하였다. F-10 배지는 Gibco(USA)에서 구매하였고, HBSS 버퍼는 바이오 세상(BioSesang, Korea)에서 구입하였다. 아이소부틸메틸잔틴(Isobutyl-1-methylxanthine, IBMX), 니코틴아미드(Nicotinamide), D-글루코스(D-Glucose), L-글루타민(L-glutamine), 염화칼슘 2수화물(Calcium chloride dihydrate), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 중탄산나트륨(Sodium bicarbonate), HEPES는 Sigma-Aldrich(USA)에서 구매하였으며, Antibiotic/antimycotic은 Biowest(미국), BSA는 genDEPOT(USA)에서 구입하였다.
실시예 1. 신생 췌도 세포집단의 분리 및 배양
생후 1-3일 된 신생 돼지를 췌도 공여자로 사용하였다. 이전에 확립된 Edmonton의 방법(Cell Transplant. 2016;25(3):539-47.)에 따라 신생 췌도 세포집단(neonatal pancreatic cell clusters, NPCCs)을 분리하였다.
구체적으로, 새끼 돼지에게 10 mg/kg 케타민(Ketamine) 및 1 mg/kg 자일라진 하이드로클로라이드(Rompun)를 순차적으로 근육주사로 투여하였다. 그 후, 새끼 돼지를 좌우 복부 수직 절개로 췌도를 노출시키는 복벽 절개를 시행하고, 췌도 주변의 유문, 십이지장 및 동맥으로부터 췌도를 조심스럽게 박리하였다. 이때, 특히 주의를 기울여 장 니킹(bowel nicking)에 의한 박테리아 오염을 피하도록 하였다. 박리한 췌도를 0.5% Antibiotic/antimycotic, 8.3 mM 중탄산나트륨 및 10 mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)가 첨가된 HBSS(Hank's balanced salt solution)에서 작은 조각(2 ㎣)으로 균질화하였다. 상기 조직을 우유 빛깔이 될 때까지 1.0 mg/㎖ 콜라게나제 V(Sigma-Aldrich, 미국)로 37℃증류수 수조에서 11~15분간 분해하였다. 분해된 펠릿(pellet)을 1분간 1,000 rpm에서 원심분리시킨 후, 500um 세포 스트레이너(pluriSelect, 독일)로 불필요한 조직을 여과하였다. 마지막으로, 상기 조직을 0.25% BSA 분획 V(bovine serum albumin fraction V), 50 uM 아이소부틸메틸잔틴, 10 mM 니코틴아미드, 10 mM D-글루코스, 2 mM L-글루타민, 2 mM 염화칼슘 이수화물, 100 U/㎖ 페니실린, 20 ug/㎖ 시프로플록사신 및 1% Antibiotic/antimycotic이 첨가된 Hams-F10에 재현탁시킨 후, 100ⅹmm 페트리 디쉬에 도말하였다. 배양 배지는 배양 초기 24시간 후, 그 후 48시간마다 교체하였다.
상기 분리된 신생 췌도 세포집단(총 3개 그룹)을 0, 1, 3, 5일 후에 각각 형광 현미경으로 관찰한 결과를 도 2에 나타내었다.
실시예 2. 공유, 정전기적 , 수소결합용 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 형성
공유결합, 정전기적 인력 또는 수소결합을 형성하는 블록 공중합체 기반의, 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 제조하였다. 블록 공중합체로는 하기 Rx-PEG-b-PLA 형태의 중합체를 사용하였고, 단일 타겟 단위를 가지는 나노 플랫폼이 아닌 두 개의 타겟 단위를 가지는 나노 플랫폼의 제조를 위해 공유 결합을 형성하는 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS), PLA-PEG-Maleimide(MAL), 정전기적 결합을 형성하는 PLA-PEG-NH2, 수소결합을 형성하는 PLA-PEG-COOH(PLA molecular weight: 4000, PEG molecular weight: 2000)를 사용하여 실험을 수행하였다. 비교군으로는 작용기 없는 PLA-PEG-CH3O(iv)를 사용하였다.
Figure 112019120975143-pat00001
(상기 n 또는 m은 10 내지 100의 정수이며,
R은 탄소 또는 수소를 포함하는 화합물 또는 작용기이고,
x는 N-하이드록시석신이미드기(-N-hydroxysuccinimide, NHS), 말레이미드기(-maleimide), 아민기(-NH2), 카르복시기(-COOH), 할로젠화 알킬(alkyl halide), 알코올(alchol, C-OH), 에터(ether, C-O-C), 싸이올(thiol), 설파이드(sulfide), 알데하이드(aldehyde) 또는 케톤(ketone)이다)
우선 상기 4종의 블록 공중합체 중 -NHS(i), 아민기(ii) 및 카르복시기(iii) 기반 양친매성 블록 공중합체를 DMSO에 10 mg/ml로 각각 녹인 후, 녹인 용액을 과량의 물(분획분자량 2K의 한외여과막)로 24시간 동안 투석하여 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 형성하였다. 형성된 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 4℃에서 보관하고, 이를 투과전자 현미경(TEM)으로 관찰하였다. 형성된 나노 플랫폼의 TEM 이미지, 입자 크기(지름) 및 표면 전하를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 단일 작용기를 가진 블록 공중합체로부터 폴리머좀 형태의 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼이 잘 형성되었고, 형성된 폴리머좀 입자의 평균 지름은 90.95 ± 3.10 nm 내지 95.38 ± 5.46 nm임을 확인하였다. 또한, 제타 전위를 통해 입자표면 주위의 카운터 이온을 확인하였으며, 공유결합은 약양전하, 정전기적 결합은 양전하, 수소결합은 음전하, 작용기 없음 중성을 형성하고 있다.
실시예 3. 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 신생 췌도 세포집단 표면개질화 확인
DiD 염료를 이용하여, 상기 실시예 2에서 제조한 나노 플랫폼을 이용한 신생 췌도 세포집단의 표면개질화를 수행하였다. 비교군으로는 작용기 없는 PLA-PEG-CH3O(iv) 및 양친매성 고분자가 없는 음성 대조군(v)을 사용하였다.
우선 상기 4종의 블록 공중합체 중 -NHS(i), 아민기(ii) 및 카르복시기(iii) 기반 양친매성 블록 공중합체를 DMSO에 10 mg/ml로 각각 녹인 후, 녹인 용액에 DiD 염료를 2.5 mM 농도로 첨가한 뒤, 과량의 물(분획분자량 2 K의 외여과막)로 24시간 동안 투석하여 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 형성하였다. 다음으로, 실시예 1에서 분리한 신생 췌도 세포집단 2000 IEQ/ml 2.7mL에 상기 염료가 담지된 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 0.3mL를 첨가하였다(9:1(v/v) 비율). 상기 혼합물을 37℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후, HBSS 버퍼로 2번 세척하고, 주사형 공집점 레이져 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM)을 이용하여 여기(excitation) 파장 633 nm, 방출(emission) 파장 665 nm에서 세포 이미지를 관측하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 양친매성 블록공중합체를 사용하여 표면개질한 신생 췌도 세포집단 표면에 빨간색 형광이 관찰되어, 공유결합, 정전기적 결합 또는 수소 결합을 형성하는 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 모두에서 신생 췌도 세포집단의 표면개질이 잘 이루어짐을 확인하였다.
실시예 4. 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 신생 췌도 세포집단 표면개질화 효율
상기 실시예 3에서 제조한 표면개질된 신생 췌도 세포집단의 표면개질화(코팅) 효율을 측정하였다. 구체적으로, 마이크로플레이트 리더기(SpectraMax i3x, Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 여기 파장 633 nm, 방출 파장 665 nm에서 신생 췌도 세포집단의 형광 강도(a.u.)를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 각 실험군의 형광 광도는 각각 29.80 ± 2.44%(i, -NHS, 공유결합), 13.23 ± 2.58%(ii, -NH2, 정전기적 결합), 14.05 ± 1.22%(iii, -COOH, 수소결합), 2.57 ± 0.17%(iv, -CH3O, 작용기 없는 비교군) 및 0.20 ± 0.12%(v, 양친매성 고분자 없음, 음성 대조군)로 나타남을 확인하였다. 작용기 없는 나노 플랫폼과 비교하여, 공유결합은 11.6배, 정전기적 결합은 5.15배, 수소결합은 5.47배 높은 표면개질 효율을 나타내었다.
상기 결과를 통해 표면개질화 효율은 블록 공중합체에 포함된 작용기의 결합 종류가 공유결합 >> 수소결합 > 정전기적 결합 >> 작용기 없음 순으로 우수함을 확인하였다.
실시예 5. 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 신생 췌도 세포 집단 표면 개질화의 분자량 투과도 확인
상기 실시예 2에서 제조한 공유결합, 정전기적 인력 또는 수소결합을 형성하는 작용기를 포함하는 나노 플랫폼을 이용한 신생 췌도 세포집단에 K-FITC-Dextran(MW 10 kDa, 20 kDa, 70 kDa, 250 kDa) 10 mg/ml를 첨가하고, 4시간 후 주사형 공집점 레이져 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM)을 이용하여 여기 파장 485 nm, 방출 파장 528 nm에서 세포 이미지를 관측하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 공유, 정전기적, 수소결합을 형성하는 작용기를 포함하는 나노 플랫폼으로 표면개질된 경우에는 10 kDa, 20 kDa 분자량까지 세포 내 유입이 이루어졌으며, 작용기 없는 PLA-PEG-CH3O의 경우에는 10 kDa, 20 kDa, 70 kDa 및 250 kDa 분자량 모두 세포 내 유입이 이루어진 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 나노 플랫폼은 대사물질은 투과시키지만 면역세포는 투과시키지 않기 때문에 면역 반응 없이 췌도 세포집단을 생체 내로 이식할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 작용기 혼합 비율 별 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 형성
상기 신생 췌도 세포집단에 대한 표면개질 효과를 확인한 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS), PLA-PEG- Maleimide(MAL), PLA-PEG-NH2 및 PLA-PEG-COOH(PLA molecular weight: 4000, PEG molecular weight: 2000)에 있어서, 상기 4개 작용기 중 2개 작용기를 서로 다른 비율로 혼합하여 투석 방법을 통해 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 형성하였다. 나노 플랫폼 형성 방법은 상기 실시예 2에 개시한 것과 동일한 방법을 사용하였다. 우선 상기 양친매성 블록 공중합체 중 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-NH2를 각각 DMSO에 10 mg/ml로 녹인 후, 녹인 용액을 10:0, 9:1, 5:5, 1:9 또는 0:10 비율로 혼합하고, 과량의 물(분획분자량 2 K의 한외여과막)로 24시간 동안 투석하여 본 발명에 따른 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 형성하였다. 형성된 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼(“NHS/NH2-생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼”)은 4℃에서 보관하였고, 상기 나노 플랫폼을 투과전자 현미경(TEM)으로 관찰한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 형성된 NHS/NH2-생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼의 형태를 TEM 이미지로 확인한 결과 모든 혼합 비율에서 폴리머좀(polymersome) 형태를 이룬 것을 확인하였다.
또한, 상기 양친매성 블록 공중합체 중 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-NH2를 각각 DMSO에 10 mg/ml로 녹인 후, 녹인 용액을 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 8:2, 1:9 또는 0:10 비율로 혼합하고, 과량의 물(분획분자량 2 K의 한외여과막)로 24시간 동안 투석하여 본 발명에 따른 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 형성하였다. 상기 나노 플랫폼의 평균 입자 크기를 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering, DLS; Malvern Panalytical)법에 의해 측정한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, DLS를 통해 입자 형성을 확인하였으며, 100-200 nm 사이의 균일한 입자가 형성됨을 확인하였다.
실시예 7. 작용기 혼합 비율 별 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼의 표면개질화 확인
상기 실시예 6에서 제조한 나노 플랫폼 및 DiD 염료를 이용하여, 신생 췌도 세포집단의 표면개질화 여부를 확인하였다.
7-1. PLA -PEG-N- Hydroxysuccinimide ( NHS ) 및 PLA -PEG-NH2 기반 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 표면 개질화
실시예 6과 동일한 방법으로, 양친매성 블록 공중합체 중 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-NH2를 각각 DMSO에 10 mg/ml로 녹인 후, 녹인 용액을 10:0, 9:1, 7:3, 5:5 또는 0:10 비율로 혼합하고, 각 용액에 DiD 염료를 2.5 mM 농도로 첨가하였다. 그 다음, 과량의 물(분획분자량 2 K의 외여과막)로 24시간 동안 투석하여 본 발명에 따른 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 형성하였다. 그 후, 실시예 1에서 분리한 신생 췌도 세포집단 2000 IEQ/ml 2.7mL에 염료가 담지된 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 0.3mL를 첨가하였다(9:1(v/v) 비율). 상기 혼합물을 37℃에서 한시간 동안 반응시킨 후, HBSS 버퍼로 2 번 세척하고, 형광 현미경에서 형광 세기를 확인하여 표면개질의 기간별 안정성을 평가하고, 주사형 공집점 레이져 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM)을 이용하여 여기(excitation) 파장 633 nm, 방출(emission) 파장 665 nm에서 세포 이미지를 관측하였다.
보다 구체적으로, 표면 개질화는 PEG 기반 나노 입자 및 NPCC를 혼합함으로써 수행되었다. 표면 개질화에 사용된 완충제는 0.25 % BSA를 갖는 F-10 배지이다. PEG 기반 나노 입자를 PEG화 완충액에서 1/10로 희석시켰다. 4,000-10,000 섬 당량 (IEQ) NPCC를 6- 웰 배양 플레이트에 시딩한 다음, 희석된 PEG 기반 나노 입자를 NPCC에 첨가하였다. 이들 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 한 다음, 수확하고 HBSS 완충액으로 세척하였다. 표면 개질화 된 NPCC를 6-웰 배양 플레이트에서 배양한 후 관찰하였다. 그 결과를 각각 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 형광 현미경을 통해 관찰한 결과 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-NH2는 9:1 비율로 혼합되는 경우 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity, MFI)가 가장 높아 표면개질의 안정성이 가장 높음을 확인하였다.
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 신생 췌도 세포집단 표면에 빨간색 형광이 관찰되어, 본 발명에 따른 상기 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼에 의해 신생 췌도 세포집단의 표면개질이 잘 이루어졌음을 확인하였다.
7-2. PLA -PEG-N- Hydroxysuccinimide ( NHS ) 및 PLA -PEG- Maleimide ( MAL ) 기반 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 표면 개질화
실시예 6과 동일한 방법으로, 양친매성 블록 공중합체 중 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-Maleimide(MAL)를 각각 DMSO에 10 mg/ml로 녹인 후, 녹인 용액을 0:10, 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1 및 10:0 비율로 혼합하고, 각 용액에 DiD 염료를 2.5 mM 농도로 첨가하였다. 그 다음, 과량의 물(분획분자량 2 K의 외여과막)로 24시간 동안 투석하여 본 발명에 따른 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼(“NHS/MAL-생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼”)을 형성하였다. 그 후, 상기 실시예 7-1과 동일한 방법으로 상기 나노 플랫폼을 이용하여 신생 췌도 세포집단의 표면개질을 수행하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 형광 현미경을 통해 관찰한 결과 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-Maleimide(MAL)는 9:1 비율로 혼합되는 경우 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity, MFI)가 가장 높아 표면개질의 안정성이 가장 높음을 확인하였다. 또한, 6일차 기준으로, NHS 및 MAL이 9:1, 7:3, 5:5 비율로 혼합된 이중 작용기-나노 플랫폼은 NHS 단일 작용기로 이루어진 나노 플랫폼보다 코팅 효율이 각각 1.78배, 1.47배, 1.49배 높음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 단일 작용기로 제조된 나노 플랫폼에 비해 두 종류 이상의 작용기를 포함하는 나노 플랫폼이 췌도 세포 코팅에 보다 효율적임을 확인하였다.
실시예 8. 표면개질된 신생 췌도 세포집단의 생존율 분석
WST(water-soluble tetrazolium salt) 분석을 통해, 작용기 혼합 비율에 따른 생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼으로 표면개질된 신생 췌도 세포집단의 생존율을 확인하였다. 상기 나노 플랫폼은 양친매성 블록 공중합체 중 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-Maleimide(MAL)를 각각 DMSO에 10 mg/ml로 녹인 후, 녹인 용액을 0:10, 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1 및 10:0 비율로 혼합하여 제조한 것을 사용하였다. F-10 배지에 현탁한 표면개질된 신생 췌도 세포집단 100 μl을 96-웰 플레이트에 넣은 후, EZ-CYTOX 10 μl씩을 첨가하여 2시간 동안 배양하였다. 그 다음, 흡광도 측정 전 1분 정도 부드럽게 쉐이킹한 뒤, 마이크로플레이트 리더기(SpectraMax i3x, Molecular Devices, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 모든 혼합 비율에서 NHS/MAL-생체 적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 두 종류 이상의 작용기를 포함하는 나노 플랫폼은 세포 독성 없이 효율적인 췌도 세포집단 표면개질화를 달성할 수 있음을 확인하였다.
실시예 9. 표면개질된 신생 췌도 세포집단의 인슐린 분비량 분석
저-글루코스(Low-Glucose) 및 고-글루코스(High-Glucose) Krebs-Ringer 중탄산염 완충액(KRBB, pH 7.4) 용액을 이용하여, 본 발명에 따른 나노 플랫폼으로 표면개질된 신생 췌도 세포집단으로부터 분비되는 인슐린의 양을 평가하였다. 상기 나노 플랫폼은 양친매성 블록 공중합체 중 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-Maleimide(MAL)를 각각 DMSO에 10 mg/ml로 녹인 후, 녹인 용액을 5:5, 7:3 및 9:1 비율로 혼합하여 제조한 것을 사용하였다.
준비된 췌도 세포집단을 2회 세척한 다음, 2.8 mM의 저-글루코오스 KRBB 용액 1 ml과 1시간 동안 전처리한 후, 새로운 2.8 mM 농도의 저-글루코오스 KRBB 용액 1 ml과 1시간 동안 배양하고, 28 mM 농도의 고-글루코오스 KRBB 용액 1 ml과 37℃에서 1시간 더 배양하였다. 각 조건에서 상등액을 취하고, Rat/Mouse Insulin ELISA 키트(Millipore, MA)를 사용하여 췌도 세포집단으로부터 분비된 인슐린의 양을 측정하였다. 자극 지수(stimulation index, SI)는 자극 대 기본 인슐린의 비로 계산되며, 인슐린 분비의 능력을 나타내며, 고-글루코스 조건의 인슐린 분비량을 저-글루코스 조건의 인슐린 분비량으로 나누어 계산하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 표면개질된 신생 췌도 세포집단의 SI값은 PLA-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 및 PLA-PEG-Maleimide(MAL)가 9:1 비율로 혼합되는 경우 가장 높아(2.5), 상기 비율에서 신생 췌도 세포집단의 인슐린 분비능력이 가장 우수함을 확인하였다. 또한, 5:5 또는 7:3 비율로 혼합되는 경우에도 SI값이 1 이상으로 나타남을 통해, 본 발명의 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼으로 표면개질된 췌도 세포집단은 인슐린 반응성이 안정하게 유지됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 촉매 또는 링커를 사용하지 않고, 캡슐화된 췌도 세포에 대한 별도의 경화단계도 필요하지 않아 기존의 췌도 세포 표면개질보다 공정이 훨씬 간단하며, 하나의 나노 플랫폼 안에 두 종류의 작용기를 포함함으로써 췌도 세포집단의 코팅 효율이 향상됨을 확인하였다.
상기 듀얼 타겟 단위를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 이용한 이식용 췌도 세포집단 조성물은 친수성 및 소수성 등 다양한 표적 약물의 봉입이 가능하고, 면역억제제 또는 항혈액응고제와 같은 여러 유형의 생리활성물질을 함께 전달할 수 있어, 세포의 이식률을 향상시키고, 인슐린 반응성을 안정하게 유지시키며, 비특이적 면역 반응을 효과적으로 감소시켜 새로운 세포 의약품 전달 시스템으로 활용될 수 있다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (19)

  1. (a) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1 생체적합성 고분자; 및
    (b) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제2 생체적합성 고분자; 를 포함하는 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼으로서,
    상기 제1 및 제2 생체적합성 고분자는 Rx-PEG-b-PLA의 화학식을 갖는 양친매성 블록공중합체이고,
    상기 x는 N-하이드록시석신이미드기(-N-hydroxysuccinimide, NHS), 말레이미드기(-maleimide), 아민기(-NH2), 카르복시기(-COOH), 할로젠화 알킬(alkyl halide), 알코올(alchol, C-OH), 에터(ether, C-O-C), 싸이올(thiol), 설파이드(sulfide), 알데하이드(aldehyde) 및 케톤(ketone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 작용기이며,
    상기 제1 및 제2 생체적합성 고분자의 x는 상이한 것인, 나노 플랫폼.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 상기 작용기를 통해 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는, 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼.
  3. 제2항에 있어서, 상기 화학결합은 공유결합, 정전기적 결합 및 수소결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 폴리머좀(polymersome) 형태인 것을 특징으로 하는, 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼.
  10. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼은 폴리머좀 입자의 평균 지름이 50 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는, 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼.
  11. 제1항 내지 제3항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼 및 분리된 췌도 세포집단을 포함하는 이식용 췌도 세포집단 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 형광물질, 면역억제제 및 항혈액응고제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  13. 제11항의 췌도 세포집단 조성물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  15. (a) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계;
    (b) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제2 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계;
    (c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 제조한 용액을 혼합하는 단계; 및
    (d) 상기 혼합된 용액을 과량의 물로 투석하는 단계;를 포함하고,
    상기 제1 및 제2 생체적합성 고분자는 Rx-PEG-b-PLA의 화학식을 갖는 양친매성 블록공중합체이고,
    상기 x는 N-하이드록시석신이미드기(-N-hydroxysuccinimide, NHS), 말레이미드기(-maleimide), 아민기(-NH2), 카르복시기(-COOH), 할로젠화 알킬(alkyl halide), 알코올(alchol, C-OH), 에터(ether, C-O-C), 싸이올(thiol), 설파이드(sulfide), 알데하이드(aldehyde) 및 케톤(ketone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 작용기이며,
    상기 제1 및 제2 생체적합성 고분자의 x는 상이한 것인,
    생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼의 제조방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제15항에 있어서, 상기 (c) 단계의 혼합은 (a) 단계에서 제조한 용액 및 (b) 단계에서 제조한 용액을 9:1 내지 5:5의 부피비(v/v)로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  19. (a) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제1 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계;
    (b) 췌도 세포 표면과 화학결합을 형성할 수 있는 제2 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계;
    (c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 제조한 용액을 혼합하는 단계;
    (d) 상기 혼합된 용액을 과량의 물로 투석하는 단계; 및
    (e) 분리된 췌도 세포에 상기 (d) 단계에서 제조한 생체적합성 세포 모방형 나노 플랫폼을 처리하여 췌도 세포집단을 표면개질화 하는 단계;를 포함하고,
    상기 제1 및 제2 생체적합성 고분자는 Rx-PEG-b-PLA의 화학식을 갖는 양친매성 블록공중합체이고,
    상기 x는 N-하이드록시석신이미드기(-N-hydroxysuccinimide, NHS), 말레이미드기(-maleimide), 아민기(-NH2), 카르복시기(-COOH), 할로젠화 알킬(alkyl halide), 알코올(alchol, C-OH), 에터(ether, C-O-C), 싸이올(thiol), 설파이드(sulfide), 알데하이드(aldehyde) 및 케톤(ketone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 작용기이며,
    상기 제1 및 제2 생체적합성 고분자의 x는 상이한 것인,
    이식용 췌도 세포집단 조성물의 제조방법.
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KR20020031893A (ko) * 2000-10-24 2002-05-03 윤동진 고분자 결합을 이용한 췌장소도 막의 표면개질 방법
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