KR20130131227A - 금속 나노 입자 기반 간 표적 지향 약물 전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

금속 나노 입자 기반 간 표적 지향 약물 전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금속 나노입자를 이용한 간 표적 지향 약물 전달체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 체내 안정성이 뛰어난 금 나노입자를 생체 적합성, 생분해성 및 간 조직에 특이적 전달 특성을 갖는 히알루론산으로 표면 개질하고, 남아있는 금 나노입자 표면에 다양한 간질환 치료용 단백질 의약품을 결합함으로써, 간 표적 지향 약물 전달체로 이용 가능한 히알루론산-금 나노입자/단백질 복합체의 제조 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한 히알루론산-금 나노입자/단백질 복합체를 이용하여 인체에 안전하게 적용할 수 있고 약효 시간을 증대할 수 있으며, 간에 효과적으로 전달되는 간질환 치료제로의 응용에 관한 것이다.

Description

금속 나노 입자 기반 간 표적 지향 약물 전달체 및 이의 제조방법{LIVER TARGETED DRUG DELIVERY SYSTEMS USING METAL NANOPARTICLES AND PREPARING METHOD THEREOF}
본 발명은 금속 나노입자를 이용한 간 표적 지향 약물 전달체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 체내 안정성이 뛰어난 금 나노입자의 표면을 생체 적합성, 생분해성 및 간 조직에 특이적 전달 특성을 갖는 히알루론산으로 개질하고, 히알루론산이 개질되지 않은 금 나노입자 표면에 다양한 간질환 치료용 단백질 의약품을 결합함으로써, 간 표적 지향 약물 전달체로 이용 가능한 히알루론산-금 나노입자/단백질 복합체의 제조 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한 히알루론산-금 나노입자/단백질 복합체를 이용하여 인체에 안전하게 적용할 수 있고 약효 시간을 증대할 수 있으며, 간에 효과적으로 전달되는 간질환 치료제로의 응용에 관한 것이다.
최근까지 단백질 의약품의 개발은 장기 약효 유지 및 지속 시간 증대를 위해서 생체 적합성 또는 생분해성을 갖는 고분자와 공유결합 한 컨쥬게이트 제형 개발에 초점이 맞춰져 왔다. 상기와 같은 단백질 의약품의 약효 지속 시간은 제형의 형태 및 컨쥬게이션 되는 유효 약효 성분에 따라 몇 주까지 연장되기도 한다.
그 중, 생체 적합성 및 생분해성이 뛰어난 폴리에틸렌 글리콜(poly ethylene glycol, PEG) 또는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)을 단백질 의약품에 공유결합하여 약물 전달 시스템에 응용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
하지만, 약물전달체로 활용되는 폴리에틸렌 글리콜-리포좀(PEG-Liposome) 접합체를 반복 주사하게 되면 체내에서 투여된 약물의 소실이 빨리 일어나는 'accelerated blood clearance' (가속된 혈중 청소율, ABC) 현상이 일어나는 것으로 보고된 바 있다. 또한, 간질환 치료용 단백질 의약품인 인터페론 알파의 페길화된 제형은 주 1회 주사 제형으로 상품화 되어있지만, C형 감염 치료를 위해 반복 주사 했을 시, 부작용이 심각하여 치료 도중 중단하는 환자가 많고, 유전자형 1형의 경우 50%정도의 항바이러스 효과 밖에 나타나지 않는다고 보고된 바 있다.
한편, 간 조직에 특이적으로 전달되는 히알루론산을 유효 약효 성분에 공유결합하여 간질환 치료용 약물 전달체를 제조하는 경우, 이들 컨쥬게이트 반응의 생접합 효율이 낮아 한계가 있어 왔다.
또한, 단백질 의약품을 고분자에 공유결합 한 제형의 경우, 고분자가 단백질의 많은 아미노산 서열의 다양한 반응기와 비특이적(non-specific)으로 반응하여 생체 활성도에 중요한 작용기에 반응하거나 또는 단백질의 3차 구조를 깨뜨려 생체 활성도를 낮추는 한계가 있어 왔으며, 또한 결합되는 고분자의 분자량이 커질수록 생체 활성도가 감소한다고 보고된 바 있다.
한편, 금 나노입자는 생체적합성이 뛰어난 것으로 알려져 있고, 입자의 크기 조절이 가능하며 표면 개질이 용이하여 생체분자들을 결합하는 많은 연구가 진행되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 금 나노입자 표면에 단백질 의약품이 결합하는 특성과 히알루론산의 간 조직 특이적 전달 특성을 이용하여, 단백질 의약품이 생체 활성도를 최대한으로 유지하면서 간에 표적지향적으로 전달될 수 있는, 간 표적 지향 약물 전달체 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
보다 상세하게, 본 발명의 하나의 목적은 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체로 표면 개질된 금속 나노입자, 및 상기 금속 나노입자의 표면 중 개질되지 않은 부분에 결합된 펩타이드 또는 단백질 의약품을 포함하는, 간 표적 지향 약물 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 간 표적 지향 약물 전달체 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들이 단백질 약물의 안정성을 유지하면서 간으로의 표적 지향 전달이 가능한 효과적인 약물 전달 시스템을 제공하기 위해 연구한 결과, 체내 안정성이 뛰어난 금 나노입자의 표면을 생체 적합성, 생분해성 및 간 조직에 특이적 전달 특성을 갖는 덱스트란, 헤파린 또는 히알루론산으로 개질하고, 또한 개질되지 않고 남아있는 금 나노입자의 표면에 다양한 간질환 치료용 단백질 의약품을 결합함으로써, 인체에 안전하게 적용할 수 있는 것은 물론이고, 상기 덱스트란, 헤파린 또는 히알루론산이 금속 나노입자에 결합된 단백질 의약품의 프로테아제(protease)에 의한 분해 우려를 현저히 감소시킬 수 있어 단백질 의약품의 생체 활성도를 최대한으로 유지하면서 간에 효과적으로 전달될 수 있게 됨에 따라 약물 전달 효율 및 약효 시간을 더욱 증대할 수 있는 간 표적 지향 약물 전달체를 제공할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예는, 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체로 표면 개질된 금속 나노입자, 및 상기 금속 나노입자의 표면 중 개질되지 않은 부분에 물리적으로 결합된 펩타이드 또는 단백질 의약품을 포함하는, 간 표적 지향 약물 전달체를 제공한다.
또한 본 발명의 바람직한 다른 일 구현예는,
(1) 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체에, 말단 아민기 및 내부 이황화 결합을 갖는 물질 또는 카테콜아민 계열의 물질을 도입하는 단계;
(2) 상기 도입된 물질을 금속 나노입자의 표면과 반응시켜 표면 개질된 금속 나노입자를 제조하는 단계; 및
(3) 상기 금속 나노입자의 표면 중 개질되지 않은 부분에 펩타이드 또는 단백질 의약품을 결합시키는 단계를 포함하는,
간 표적 지향 약물 전달체 제조방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 (1) 단계는 상기 히알루론산, 이의 염, 또는 유도체에 말단 아민기 및 내부 이황화 결합을 갖는 물질 또는 카테콜아민 계열의 물질을 도입하여 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 제조하는 것일 수 있다.
Figure pat00001
상기 화학식 1에서,
n은 12 내지 50의 정수이고, R은 NH(CH2)mR2이며, 상기 m은 2 내지 10의 정수이고 상기 R2는 C6H12O2 (catechol), 또는 SH(thiol)이다.
대부분의 동물에 존재하는 히알루론산, 헤파린, 또는 덱스트란 등은 생분해성, 생적합성, 면역반응이 없는 선형적인 다당류의 고분자로서, 체내에서 분자량에 따라 여러 가지 다른 역할을 수행하기 때문에 여러 가지 용도로 사용될 수 있다. 예컨대 화학적인 방법에 의한 표면 개질이 용이하여 생체 내에서 분해 시간을 조절할 수 있으며, 이외에도 세포의 수용체와의 반응 정도를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 간 표적 지향 약물 전달체에 있어서는, 특히 단백질 의약품의 체내 전달시 프로테아제(protease)에 의한 분해를 효과적으로 줄일 수 있어 약물의 안정성 및 전달 효율을 현저히 향상시킬 수 있다.
상기 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체는 그 구성의 한정은 없으나 바람직하게는 분자량이 5,000 내지 20,000 달톤(Da)인 것을 사용할 수 있다. 상기와 같은 범위의 분자량을 갖는 히알루론산, 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 금속 나노입자의 표면 개질에 적합하다.
본 명세서에서 '히알루론산(Hyaluronic acid, HA)'은 β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 β-1,3과 β-1,4 결합으로 교대로 결합한 이당체 형태의 기본 단위체가 반복하여 연결된 직쇄상의 고분자 다당류를 지칭하며, '히알루론산의 염'은 히알루론산의 다양한 염 형태를 모두 포함한다. 예를 들어, 히알루론산 코발트, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 나트륨 등의 무기염 및 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염 형태일 수 있다. 또한 '히알루론산 유도체'란 히알루론산의 적어도 하나의 카르복실기가 다른 화합물로 치환된 고분자를 의미한다.
본 명세서에서 '덱스트란(Dextran)'은 D-글루코오스로 중합되는 다당류의 일종으로, '덱스트란의 염'은 덱스트란의 다양한 염 형태를 모두 포함한다. 예를 들어, 덱스트란 설페이트, 덱스트란 황산나트륨염 등일 수 있다. 또한 '덱스트란 유도체'란 덱스트란의 적어도 하나의 하이드록실기가 다른 화합물로 치환된 고분자를 의미한다.
본 명세서에서 '헤파린(Heparin)은 D-글루코사민과 D-글루쿠론산이 a-1,4의 결합으로 교대로 사슬 모양을 이루는 황산기를 가진 산성 다당류의 일종으로, '헤파린의 염'은 히알루론산의 다양한 염 형태를 모두 포함한다. 예를 들어, 헤파린 칼슘, 헤파린 리튬, 헤파린 칼륨 등일 수 있다. 또한 '헤파린 유도체'란 헤파린의 적어도 하나의 카르복실기가 다른 화합물로 치환된 고분자를 의미한다.
명시적인 기재가 없는 한, 본 명세서 전체에서 덱스트란, 헤파린, 히알루론산 등은 이들의 염 또는 유도체 형태를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
금속 나노입자는 바람직하게는 금 나노입자, 은 나노입자, 또는 자성 나노입자를 사용할 수 있다. 또한 바람직하게는 상기 금속 나노입자는 10nm 이상, 보다 바람직하게는 10nm 내지 30nm의 입자 크기를 갖는 것일 수 있다.
자성 나노입자는 자성을 띠는 금속 나노입자로서, 예컨대 산화철(예컨대 Fe2O3, Fe3O4 등), 페라이트(Ferrite)(예컨대 CoFe2O4, MnFe2O4 등), 및 합금(예컨대 FePt, CoPt 등과 같이 자성원자들로 인해 나타나는 산화문제, 전도성 및 안정성을 높이기 위해 귀금속과 합금시킨 것) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 금속 나노입자에 도입되는 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체는 바람직하게는 금속 나노입자 한 개당 10 내지 100 개의 분자수로 결합함으로써 상기 금속 나노입자의 표면을 개질할 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 금속 나노입자는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 히알루론산 유도체가 하기 화학식 1의 'R'로 표시되는 말단 작용기를 통해 금속 나노입자 표면에 결합되어 표면 개질된 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 화학식 1에서, n은 12 내지 50 의 정수이고, R은 NH(CH2)mR2이며, 상기 m은 2 내지 10의 정수이고 상기 R2는 C6H12O2 (catechol), 또는 SH이다.
상기 화학식 1의 구조를 갖는 히알루론산 유도체는 바람직하게는 히알루론산, 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체의 말단에, 말단 아민기 및 내부 이황화 결합을 갖는 물질 또는 카테콜아민 계열의 물질을 도입하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.
상기 도입 물질 중 말단 아민기 및 내부 이황화 결합을 갖는 물질로써, 바람직하게는 유도체에 2,2'-디설판디일디에탄아민(2,2'-disulfanediyldiethanamine, cystamine), 3,3'-디설판디일디프로판-1-아민(3,3'-disulfanediyldipropan-1-amine), 4,4'-디설판디일디부탄-1-아민(4,4'-disulfanediyldibutan-1-amine), 5,5'-디설판디일디펜탄-1-아민(5,5'-disulfanediyldipentan-1-amine) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있으며, 또한 카테콜아민 계열의 물질로써, 바람직하게는 도파민 (dopamine), 노르에피네프린 (norepinephrine) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 도입물질은 소듐 시아노보로하이드라이드 (Sodium Cyanoborohydride, NaCNBH3)를 이용하여 환원성 아민화 반응(reductive amination)을 통해 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체의 말단에 도입할 수 있다.
상기 도입단계는 바람직하게는 pH 8.5~9.5 의 소듐 보레이트 버퍼(sodium borate buffer), PBS 버퍼, 또는 Tris-HCl 버퍼와 같은 반응 용매 내에서 수행할 수 있으며, 또한 바람직하게는 37~40℃에서 3 일 내지 5일간 반응시켜 이루어질 수 있다. 이 때 상기 말단 아민기 및 내부 이황화 결합을 갖는 물질은 바람직하게는 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체의 단위체당 1 내지 2 몰(mole) 배로 사용할 수 있다. 또한 카테콜아민 계열의 물질은 바람직하게는 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체의 단위체당 0.1 내지 0.2 몰(mole) 배로 사용할 수 있다.
도입물질로서, 말단 아민기 및 내부 이황화 결합을 갖는 물질을 사용할 경우, 상기 (1) 단계는 바람직하게는, (1-1) 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체의 말단에, 말단 아민기 및 내부 이황화 결합을 갖는 물질을 도입하는 단계; 및 (1-2) 다이싸이오트레이톨(Dithiothreitol, DTT), 2-멀캅토에탄올 (2-Mercaptoethanol), 및 트리스(2-카복시에틸포스핀) (Tris(2-carboxyethyl) phosphine, TCEP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 환원제를 사용하여 상기 (1-1) 단계를 통해 형성된 이황화 결합을 절단하는 단계를 포함하여 이루어지는 것일 수 있다.
이처럼 상기 (1-2) 단계는 도입물질로서 특히 아민기 및 내부 이황화 결합을 사용시 형성되는 이황화 결합을 절단함으로써, 자유 티올기와 같이 금속 나노입자 표면에 결합 가능한 작용기를 상기 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체, 바람직하게는 상기 화학식 1의 구조를 갖는 히알루론산 유도체의 말단에 도입할 수 있다.
따라서, 상기 (1-2) 단계에 사용되는 환원제는 이황화 결합을 절단할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 사용 가능하지만, 바람직하게는 다이싸이오트레이톨(Dithiothreitol, DTT), 2-멀캅토에탄올 (2-Mercaptoethanol), 및 트리스(2-카복시에틸포스핀) (Tris(2-carboxyethyl) phosphine, TCEP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 또한 바람직하게는 상기 (1-2)단계는 20 내지 30℃보다 바람직하게는 25℃에서 12 시간 내지 24 시간 동안 이루어질 수 있다.
한편, 도입물질로서 도파민 또는 노르에피네프린 등의 카테콜아민 계열 물질을 사용할 경우에는 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체의 말단에 카테콜이 도입되므로 상기 (1-2)와 같은 후속 단계를 거치지 않고도 금 나노입자에 바로 결합시킬 수 있다.
이와 같이 제조된 각 다당류의 유도체, 바람직하게는 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체는 말단(하기 화학식 1의 'R')을 금속 나노입자와, 바람직하게는 상기 금속 나노입자 한 개당 10 내지 100 개의 분자수로 반응시켜 표면 개질된 금속 나노입자를 제조할 수 있다((2) 단계).
상기 화학식 1의 히알루론산 유도체는 금속 나노입자 한 개당 10 내지 100 개의 분자수로 결합함으로써 상기 금속 나노입자의 표면을 개질할 수 있다.
이처럼 간 조직 특이적 전달 특성을 갖는 덱스트란, 헤파린 또는 히알루론산 등으로 표면이 개질된 금속 나노입자를 사용함으로써, 인체에 안전하게 적용할 수 있고 약효 시간을 증대할 수 있으며, 단백질 의약품의 생체 활성도를 최대한으로 유지하면서 간에 효과적으로 전달될 수 있는 간 표적 지향 약물 전달체를 제공할 수 있으며, 이는 또한 다양한 간질환 치료제의 개발에 다양하게 응용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 간 표적 지향 약물 전달체를 통해 전달되는 펩타이드 또는 단백질 의약품은, 상기 제조된 표면 개질된 금속 나노입자의 표면 중 개질되지 않은 부분과 상기 의약품을 구성하는 아미노산간의 상호작용을 통해 결합된 형태로 제공될 수 있다.
바람직하게는 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 금속 나노입자 한 개당 10 내지 200개의 분자수로 결합할 수 있으며, 상기 결합은 바람직하게는 공유결합 또는 비공유 결합일 수 있으며, 상기 비공유 결합은 바람직하게는 정전기적 결합 및/또는 소수성 결합 등의 물리적 결합일 수 있다.
따라서, 상기 금속 나노입자의 표면에 공유결합 또는 비공유결합을 할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 다양한 펩타이드 또는 단백질 의약품을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 금속 나노입자의 표면에 공유 결합된 것으로서, 상기 의약품을 구성하는 아미노산 중에 시스테인(Cystein), 특히 이황화 결합을 이루지 않은 자유 티올(thiol)기를 갖는 시스테인을 포함하고 있는 것일 수 있다.
한편, 펩타이드 또는 단백질 의약품이 상술한 바와 같은 시스테인을 포함하고 있지 않을 경우, 또는 상기 의약품을 구성하는 아미노산 중에 시스테인을 포함하고 있더라도 자유 티올기가 없이 이황화 결합(disulfide bond)을 하고 있는 펩타이드 또는 단백질 의약품일 경우, 바람직하게는 금속 나노입자의 표면과 비공유 결합, 바람직하게는 정전기적 결합 및/또는 소수성 결합 등의 물리적으로 결합된 형태로서 제공될 수 있다. 이 경우, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 바람직하게는 상기 의약품을 구성하는 아미노산 중에 티로신 (tyrosine), 라이신 (lysine), 아스파틱산 (aspartic acid), 알지닌 (arginine) 히스티딘 (hystidine) 및 트립토판 (tryptophan)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하고 있는 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 급성간염, 만성간염, 간경변증, 간경화, 지방간, 또는 간암 등의 간질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 간질환(C형 간염) 치료용 단백질인 인터페론 알파, TNF 관련 세포자가소멸 유도 단백질(TNF-related apoptosis-inducing ligand), 혈관 점착 단백질 1(vascular adhesion protein 1), 간세포생장인자(Hepatocyte growth factor) 등을 공유결합 또는 비공유결합, 바람직하게는 정전기적 결합 및/또는 소수성 결합 등의 물리적 결합으로 상기 금속 나노입자의 표면과 결합시켜 제공할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 전달체는 이처럼 공유결합이 아닌 물리적 결합을 통하여 단백질 의약품을 결합시킨 경우에도 매우 효율적인 간 표적 지향 전달이 이루어질 수 있으므로(<실험예 9> 참조), 다양한 종류의 단백질 의약품에 대해 폭넓게 적용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 간 표적 지향 전달체 제조방법 중 제 (3) 단계는, 상기 금속 나노입자의 표면 중 개질되지 않은 부분에 펩타이드 또는 단백질 의약품을 공유 결합시키는 단계로서, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 이를 구성하는 아미노산 중에 이황화 결합을 이루지 않은 시스테인을 포함하고 있는 것일 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 제 (3) 단계는, 상기 금속 나노입자의 표면 중 개질되지 않은 부분에 펩타이드 또는 단백질 의약품을 비공유 결합, 바람직하게는 정전기적 및/또는 소수성 결합시키는 단계로서, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 이를 구성하는 아미노산 중에 티로신 (tyrosine), 라이신 (lysine), 아스파틱산 (aspartic acid), 알지닌 (arginine) 히스티딘 (hystidine) 및 트립토판 (tryptophan)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하고 있는 것일 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 간 표적 지향 전달체는 체내 안정성이 뛰어난 금 나노입자를 생체 적합성, 생분해성 및 간 조직에 특이적 전달 특성을 갖는 히알루론산으로 표면 개질하고, 또한 개질되지 않고 남아있는 금 나노입자의 표면에 다양한 간질환 치료용 단백질 의약품을 결합함으로써, 인체에 안전하게 적용할 수 있고 약효 시간을 증대할 수 있으며, 단백질 의약품의 생체 활성도를 최대한으로 유지하면서 간에 효과적으로 전달될 수 있으므로, 본 발명의 바람직한 또 다른 일 구현예는 간 표적 지향 전달체를 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 상기 간 표적 지향 전달체 외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 더욱 포함할 수 있으며, 그 외 첨가제, 부형제, 안정화제 등은 당 분야에서 널리 알려진 것을 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 상기 간 질환은 특별히 제한되지 않으나 바람직하게는 급성간염, 만성간염, 간경변증, 간경화, 지방간, 또는 간암 등의 간질환 일 수 있다.
본 발명의 간 표적 지향 약물 전달체 및 이의 제조방법은 금속 나노입자에 결합 가능한 다양한 단백질 의약품에 적용 가능하고, 생체 적합성이 뛰어난 금 나노입자 등의 금속 나노입자와 생체적합성, 생분해성 고분자인 히알루론산의 간 조직 특이적 전달 특성을 이용하여 보다 효과적이고 안전한 간질환 치료제로의 다양한 응용이 가능하다. 또한 본 발명의 일 구현예에 따른 간 표적 지향 약물 전달체에 결합된 단백질 의약품의 활성도는 본래의 단백질 의약품 자체의 활성도에 비해 감소하는 정도가 낮고, 또한 생체 내에서 시간이 지나면서 금속 나노입자로부터 단백질 의약품이 떨어져 나올 수 있어 단백질의 활성도가 더욱 높아질 수 있다. 이러한 본 발명의 간 표적 지향 약물 전달체는 간염 및 간암 등 간질환 치료제로의 응용이 기대된다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 HA-AuNP/IFNa 복합체의 제조 방법에 관한 화학적 스킴을 간략히 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명의 실험예 1에 따라 AuNP/IFNa 복합체를 UV-Vis absorbance spectra를 이용하여 분석한 결과다.
도 2b는 본 발명의 실험예 1에 따라 HA-AuNP/IFNa 복합체를 UV-Vis absorbance spectra를 이용하여 분석한 결과다.
도 3a은 본 발명의 실험예 1에 따라 AuNP, AuNP/IFNa, HA-AuNP 및 HA-AuNP/IFNa 복합체를 DLS를 이용하여 분석한 결과다.
도 3b는 본 발명의 실험예 1에 따라 AuNP/IFNa 및 HA-AuNP/IFNa 복합체를 TEM image를 통해서 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실험예 2에 따라 HA-AuNP에 대한 IFNa의 비율을 증가시켜나감에 따라 복합체를 형성한 IFNa의 양을 형광분석 및 ELISA 분석을 이용하여 정량한 결과다.
도 5는 본 발명의 실험예 3에 따라 HA-AuNP/IFNa에 Tween 20 및 MgCl2를 처리하였을 때, 떨어져나오는 IFNa의 양을 ELISA assay로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명의 실험예 4에 따라 IFNa와 HA-AuNP/IFNa의 원편광 이색성 분광 분석(Circular Dichroism) 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 6b는 Tween 20과 MgCl2를 처리한 뒤 떨어져 나온 IFNa의 CD 분석결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실험예 5에 따라 NaCl 150mM에서의 AuNP/IFNa와 HA-AuNP/IFNa의 안정성을 비교하여 나타낸 것으로, "1"은 AuNP, "2"는 AuNP/IFNα 17, "3"은 AuNP/IFNα 120, "4"는 HA-AuNP, "5"는 HA-AuNP/IFNα 17, 및 "6"은 HA-AuNP/IFNα 110를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실험예 5에 따라 HA-AuNP/IFNa 복합체를 BSA에서 3일 동안 반응시킨 후, 떨어져 나온 IFNa의 양을 ELISA assay로 정량한 것이다.
도 9은 본 발명의 실험예 6에 따라 HA-AuNP/IFNa 및 AuNP/IFNa 복합체와 PEG-Intron, IFNa의 활성도 분석 결과를 daudi(버킷 림프종, burkitt lymphoma) 세포을 이용한 항증식 어세이(antiproliferation assay)를 통하여 나타낸 것이다.
도 10는 본 발명의 실험예 7에 따라 HA-AuNP/IFNa 및 AuNP/IFNa 복합체와 IFNa의 인간 혈청(human serum) 내에서 안정성을 daudi 세포를 이용한 항증식 어세이(antiproliferation assay)를 통하여 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실험예 8에 따라 HA-AuNP의 세포독성을 daudi 세포를 이용한 MTS assay를 통하여 나타낸 것이다.
도 12은 본 발명의 실험예 9에 따라 HA-AuNP/IFNa 및 AuNP/IFNa 복합체와 PEG-Intron, IFNa에 의해 쥐의 간으로 전달되는 IFNa를 ELISA assay로 정량분석하여 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실험예 10에 따라 HA-AuNP/IFNa의 간세포별 분포를 ICP-MS와 TEM image로 분석하여 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실험예 11에 따라 HA-AuNP/IFNa의 주요 조직별 부포를 ELISA와 ICP-MS로 분석하여 나타낸 것이다.
도 15a은 본 발명의 실험예 12에 따라 HA-AuNP/IFNa 및 AuNP/IFNa 복합체와 PEG-Intron, IFNa의 쥐의 간에서의 항바이러스 효과를 보기 위해 western blot으로 OAS 1을 분석한 결과를 나타낸 것이다. (1:control, 2:IFNa, 3: PEG-intron, 4:HA-AuNP, 5:HA-AuNP/IFNa 120, 6:HA-AuNP/IFNa 75, 7:AuNP/IFNa 110, * P <0.05 and ** P < 0.01)
도 15b는 본 발명의 실험예 12에 따라 HA-AuNP/IFNa 및 AuNP/IFNa 복합체와 PEG-Intron, IFNa의 쥐의 간에서의 항바이러스 효과를 보기 위해 western blot으로 Mx 1을 분석한 결과를 나타낸 것이다. (1:control, 2:IFNa, 3: PEG-intron, 4:HA-AuNP, 5:HA-AuNP/IFNa 120, 6:HA-AuNP/IFNa 75, 7:AuNP/IFNa 110, * P <0.05 and ** P < 0.01)
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> HA - AuNP / IFNa 복합체의 제조
<1-1> 말단에 티올기가 도입된 히알루론산 ( HS - HA ) 유도체의 제조
히알루론산 (HA) (MW 12KDa) 200mg와 소듐 클로라이드 (Sodium Chloride, NaCl) 230mg을 pH 8.5의 0.1 M 보레이트 버퍼 (Borate buffer) 20 mL 에 녹이고, 시스타민 하이드로클로라이드 (Cystamine Hydrochloride) 를 HA의 단위체당 1 몰(mole)배로 첨가하였다. 2시간 뒤에, 소듐 시아노보로하이드라이드 (Sodium Cyanoborohydride)를 200mM로 첨가하고 40℃ 에서 5일 동안 반응시켰다. 그 뒤, 다이싸이오트레이톨(Dithiothreitol, DTT)을 100mM로 첨가하고 25℃에서 12시간 동안 반응시킨 후, 150mM NaCl에 대하여 2일, 25%(v/v) 에탄올(ethanol)에 대하여 1일, 증류수에 대하여 1일 동안 투석하여 정제한 후 동결건조 시켜 말단에 티올 (thiol) 그룹이 도입된 HS-HA 유도체를 얻었다.
HS-HA 유도체는 사용하기 전에 TCEP를 HA 1분자당 1 몰(mole)배로 첨가하여 12시간 동안 반응하여, 정제 과정 중 생겼을지 모를 이황화결합을 환원시켜주고 PD-10 탈염 컬럼(desalting column) 을 이용하여 TCEP를 제거해주었다. TCEP가 남아있을 경우, 그 다음 첨가될 IFNa의 구조에 영향을 미칠 수 있다. Ellman assay 를 통해서 HA 말단에 대해 티올 그룹이 약 95몰% 이상으로 도입된 것을 확인할 수 있었다(Anal Biochem., 1973, 56(1), 310-1. 참조).
<1-2> HA - AuNP 제조
테트라클로로금산 (Chloroauric acid) 10mg을 90mL 증류수에 녹이고 끓을 때까지 가열하였다. 용액이 끓기 시작하였을 때 5mL의 25 mM 소듐 사이트레이트 (sodium citrate)를 첨가한 뒤, 진한 빨간색이 될 때까지 약 30분간 반응시켜 금 나노입자 용액을 얻었다.
제조된 금 나노입자 용액 (5.4nM) 50 mL에 상기 <1-1>에서 얻어진 HS-HA 820?을 첨가한 뒤, 1일 동안 반응시켜 HA로 개질된 금 나노입자 (HA-AuNP) 를 얻었다.
<1-3> HA - AuNP / IFNa 복합체 제조
다음으로 인터페론 알파 (IFNa)(신풍제약)를 PBS (pH 7.4) 에 0.7mg/mL로 녹이고 상기 <1-2>에서 얻어진 5 내지 6 nM 의 HA-AuNP solution 10 mL 에 금 나노입자 당 인터페론이 10 내지 200 개가 되도록 넣어준 뒤, 12시간 동안 반응시켰다. 그 뒤, 원심분리기 (20,000×g, 20분) 를 이용하여 금 나노입자를 침전 시키고 상층액을 걸러주는 과정을 2번 하여 반응하지 않은 인터페론을 제거하고, 마지막으로 PBS (pH 7.4) 에 재분산 시켜 HA-AuNP/IFNa 복합체를 얻었다 (도 1).
< 비교예 1> AuNP / IFNa 복합체의 제조
테트라클로로금산 (Chloroauric acid) 10mg을 90mL 증류수에 녹이고 끓을 때까지 가열하였다. 용액이 끓기 시작하였을 때 5mL의 25 mM 소듐 사이트레이트 (sodium citrate)를 첨가한 뒤, 진한 빨간색이 될 때까지 약 30분간 반응시켜 금 나노입자(AuNP) 용액을 얻었다.
다음으로 인터페론 알파 (IFNa)(신풍제약)를 PBS (pH 7.4) 에 0.7mg/mL로 녹이고 상기 금 나노입자 용액에 금 나노입자 당 인터페론의 개수가 10 내지 200개가 되도록 넣어준 뒤, 12시간 동안 반응시켰다. 그 뒤, 원심분리기 (20,000×g, 20분) 를 이용하여 금 나노입자를 침전 시키고 상층액을 걸러주는 과정을 2번 하여 반응하지 않은 인터페론을 제거하고, 마지막으로 PBS (pH 7.4) 에 재분산 시켜 표면개질이 되지 않은 AuNP에 IFNa를 결합시킨 AuNP/IFNa 복합체를 얻었다.
< 실험예 1>
HA - AuNP / IFNa 복합체의 형성 확인 및 분석
상기 <비교예 1>에 따라 제조된 표면개질이 되지 않은 AuNP에 IFNa를 결합시킨 것 (AuNP/IFNa 복합체) 과 <실시예 1>에 따라 제조된 HA로 표면개질을 한 AuNP에 IFNa를 결합시킨 것 (HA-AuNP/IFNa 복합체)(각각 금 나노입자 당 인터페론 200개를 넣어 제조함) 을 함께 DLS(dynamic light scattering) (Zetasizer Nano, Malvern Instrument Co., UK) 및 UV-Vis spectra(S-3100, Scinco Co., Seoul, Korea)를 이용하여 비교 분석하였다. 분석 결과, HA-AuNP/IFNa의 경우 IFNa 약 110개가 결합되었고, AuNP/IFNa의 경우 약 120개가 결합되었음을 확인하였다.
이 때의 모든 용액은 비교를 위해서 모두 DIW 에 분산한 뒤, 분석하였다. 도 2a에서 볼 수 있듯이 AuNP에 IFNa를 첨가하였을 때 표면 플라즈몬 공명의 피크(peak) 적색편이(red shift)를 확인하였다. 또한 도 2b에 나타난 바와 같이, AuNP에 HA를 도입하고, IFNa를 첨가하였을 때도 각각 표면 플라즈몬 공명 피크(peak) 적색편이를 확인하였다.
DLS를 이용하여 유체역학적 지름을 측정한 결과, AuNP의 지름은 22.16nm 였고, IFNa를 첨가한 뒤에는 지름이 29.25nm로 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 AuNP에 IFNa가 단층(single layer)으로 결합하였다는 것을 알 수 있었다(도 3a). 한편 AuNP에 HA를 도입한 후의 지름은 52.23nm였고, IFNa를 첨가한 후의 지름은 57.83nm로 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3a). 또한, TEM image를 통해서 복합체가 단순 분산(mono disperse)된 것을 확인할 수 있었다(도 3b).
이처럼 DLS, UV-Vis spectra를 통해 측정된 결과 모두 AuNP에 HA를 도입한 후에도, IFNa가 AuNP에 결합하는 것을 보여주었다.
< 실험예 2>
HA - AuNP / IFNa 복합체의 정량분석
HA-AuNP에 결합하는 IFNa의 분자수를 ELISA assay를 통해 정량 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에 따라 HA-AuNP (5.4 nM) 에 AuNP 당 IFNa의 분자수가 10 내지 200개가 되도록 하여 복합체를 형성한 뒤, 원심분리(20,000×g, 20분)하여 침전시키고, 상층액 부분과 AuNP에 결합한 부분을 각각 별도로 PBS로 희석한 뒤, IFNa를 표준곡선(standard curve)(IFNa를 PBS로 각각 0, 0.015625 0.3125, .625, 1.25, 2.5, 5, 10ng/mL 가 되게 희석하여, sample과 동시에 ELISA assay를 하여 얻음)으로 이용하여 ELISA assay kit(VeriKineTM Human Interferon-Alpha ELISA Kit, PBL InterferonSource, Piscataway, NJ)로 제조사의 방법에 따라 정량 분석하였다. 실험 결과, AuNP에 결합한 IFNa는 결합한 분자수에 따라서 ELISA assay에 의한 검출 정도가 다르게 나타났다. 이는 입체 장해(steric hindrance)로 인한 것이거나, 또는 IFNa가 항체(antibody)에 결합하는 부분이 금 나노입자에 결합했을 시 그 활성도가 떨어질 수 있기 때문이라고 사료된다. 따라서 금 나노입자에 결합하지 않은 상층액에 있는 IFNa로 정량하였다.
위에 상기한 바와 같이, AuNP과의 상호작용으로 인하여 IFNa의 구조가 바뀌거나 활성도가 떨어진다면, 상층액에 있는 IFNa도 ELISA assay로 검출되지 않을 수 있으므로 좀 더 정확한 판단을 위해서 HA-AuNP에 결합하는 IFNa의 분자수를 형광분석기 (fluorescence spectrofluorophotometer (Fluoroskan Ascent FL, Lab systems, Germany) 로 분석하였다. 이 때, IFNa 한 분자 당 FITC를 한 개 씩만 결합시켜 AuNP 표면에 결합 시 방해될 수 있는 여지를 최소화 하였다. 구체적으로, IFNa 1mg을 0.1M 소듐 카보네이트 (sodium carbonate) 버퍼 1mL에 첨가한 뒤, 플루오레세인 아이소싸이오시아나이트 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 를 IFNa의 3 내지 5 몰(mole)배로 넣어 상온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, PBS (pH 7.4)에서 24 시간 동안 투석(dialysis)하여 결합하지 않은 IFNa를 제거하였다. 앞서 언급한 바와 같이 AuNP 당 IFNa-FITC의 분자수가 10 내지 200개가 되도록 하여 복합체를 형성한 뒤, 원심분리기를 이용하여 침전시키고(20,000×g, 20분), 상층액을 형광분석기를 통해 분석하고, IFNa-FITC를 표준곡선(standard curve)으로 하여 (IFNa-FITC를 IFNa 기준 1, 2, 4, 8, 16, 32 ?/mL 으로 만들어 동시에 형광분석기를 통해 분석함) HA-AuNP에 결합한 IFNa를 정량 분석하였다. HA가 없는 AuNP에 대해서도 같은 방법으로 실험하였다.
실험 결과, HA-AuNP에 AuNP 당 IFNa를 20, 50, 100, 및 200개를 넣어주었을 때, IFNa의 첨가량에 따라 결합된 IFNa 수가 증가함을 알 수 있으며, IFNa를 20 및 200개로 넣어주었을 때 각각 약 17, 110개가 결합하였고, 이는 ELISA assay 결과와 형광분석 결과가 거의 동일하였다 (도 4). 반면 HA가 도입되지 않은 AuNP에 결합하는 IFNa의 최고 분자수는 AuNP당 200개의 IFNa를 첨가 하였을 때, 약 120개 정도가 결합하여 HA가 도입된 경우에 비해 좀 더 많은 수의 IFNa가 결합함을 알 수 있었다.
이를 통해 표면 개질이 되지 않은 AuNP의 표면에 IFNa가 결합할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 따라서 HA의 도입 여부 및 사용량에 따라 금속 나노입자에 결합하는 단백질의 최대량을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실험예 3>
AuNP 에 대한 IFNa 의 결합 메커니즘 분석
상기 <실시예 1>에서 제조된 HA-AuNP/IFNa(AuNP 당 IFNa 200개를 첨가하여 120개가 결합된 것과 HA-AuNP 당 IFNa 200개를 첨가하여 110개 결합된 것) 에서의 AuNP에 대한 IFNa의 결합 메커니즘을 분석하기 위해서 특정한 상호작용을 방해하는 화학작용제를 첨가하여 결합을 떼어내는 실험을 하였다. 구체적으로, HA-AuNP/IFNa 복합체 (IFNa 기준 20 ?/mL, 1mL) 에 트윈 20(Tween 20)(소수성 상호작용을 확인하기 위함)을 1 %(v/v) 농도가 되도록 처리하거나 또는 MgCl2(정전기적 인력을 확인하기 위함)를 1 M가 되도록 처리하였다. 또한 트윈 20과 MgCl2를 각각 1 %(v/v), 1 M가 되도록 함께 처리하였다. 6시간 뒤, 원심분리기 (20,000 X g, 20 분)를 이용하여 AuNP을 침천시키고, 상층액을 ELISA assay를 통해 분석하여 AuNP로부터 떨어져나온 IFNa를 정량 분석하여 하기 표 1에 나타냈다.
시약 MgCl2 Tween 20 MgCl2 + Tween 20
HA-AuNP/IFNa에서 유리된 IFNa 비율(%) 10.07 % 40.62% 95.03 %
상기 표 1에 나타난 바와 같이, Tween 20에 의해 약 10.07 %의 IFNa가 떨어져 나왔고, MgCl2에 의해서 약 40.62 %의 IFNa가 떨어져 나왔다. 이를 통해, IFNa가 주로 소수성 상호작용으로 AuNP에 결합되어 있는 것을 확인하였다. 또한, Tween 20과 MgCl2를 함께 처리 했을 시에는 대부분 떨어져 약 95.03 %가 떨어져 나오는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, IFNa가 AuNP 표면에 소수성 상호작용과 정전기적 인력 두 가지 모두를 통해서 결합하고 있다는 것을 알 수 있었다(표 1). AuNP/IFNa 복합체에서도 위와 같은 양상을 보였다(도 5).
< 실험예 4>
HA - AuNP / IFNa 복합체 형성시 IFNa 의 구조 변성 여부 확인
1) 분석 방법
IFNa의 농도를 기준으로 하여 (0.1 mg/ml) 상기 <실시예 1>에 따라 제조된 HA-AuNP/IFNa 복합체 및 이에 대해 상기 실험예 3에 따른 화학작용제(트윈 20 및 MgCl2)를 첨가한 경우 각각의 IFNa 의 원편광 이색성 분광 분석(Circular Dichroism) 분석을 하여 도 6a 및 도 6b에 나타냈다. 분석 조건은 하기와 갔다.
<CD 분석 조건>
UV spectrophotometer : JASCO J-715
측정 조건 : 25 ℃, 200~250 nm, N2 atmosphere
석영 큐빗(A quartz cuvette) : 2 mm 경로 길이(path length)
미가공 데이터(Raw data): 반응시간 1초에 따라 0.2 mm 간격
2) 분석 결과
도 6a에서 볼 수 있듯이 HA-AuNP/IFNa의 경우, 금 나노 입자로 인한 산란(scattering) 효과와, 단백질로부터 금 나노입자로의 에너지 이동(energy transfer) 으로 인해 CD값을 제대로 얻을 수 없었다.
따라서 HA-AuNP/IFNa (IFNa 기준 0.1 mg/mL, 500 ?) 에 tween 20과 MgCl2를 각각 1 %(v/v)와 1 M 가 되도록 처리한 뒤, 6시간 뒤에 원심분리기(20,000 X g, 20 분)로 금 나노입자를 침전 시킨 뒤, 상층액에 있는 IFNa를 ELISA로 정량 한 뒤, CD로 분석하였다. 도 6b에서 볼 수 있듯이 IFNa에 tween 1%와 MgCl2 1M 를 처리하여도 CD 피크(peak)는 변하지 않았고, 금 나노입자로부터 떼어낸 IFNa의 CD 피크(peak)와도 일치하는 것을 확인하였다. 따라서 IFNa가 금 나노입자에 결합할 때 단백질(IFNa)의 3D 구조가 변하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 5>
HA - AuNP / IFNa 복합체의 혈장에서의 안정성 평가
1) NaCl 150 mM 에서의 안정성 평가
표면 개질된 금속 나노 입자 표면에 단백질이 결합된 약물 전달체의 혈장에서의 안정성을 평가하기 위해서, AuNP, <비교예 1>에 따라 제조된 표면개질이 되지 않은 AuNP에 IFNa를 결합시킨 것 (AuNP/IFNa 복합체), HA-AuNP, 및 <실시예 1>에 따라 제조된 HA로 표면개질을 한 AuNP에 IFNa를 결합시킨 것 (HA-AuNP/IFNa 복합체) 각각에 대해 우선 NaCl 150mM에서의 안정성을 평가하였다.
도 7에서 볼 수 있듯이, AuNP, 및 HA가 없는 <비교예 1>의 AuNP/IFNa 복합체의 경우, IFNa가 완벽하게 결합하지 않은 복합체(예: AuNP/IFNa 17)는 NaCl 150mM에서 빠른 시간 내에 침전현상을 보였지만, IFNa가 최대한으로 결합한 AuNP/IFNa 120 복합체는 NaCl 150mM에서 비교적 안정하였다. 하지만 HA-AuNP 자체가 NaCl 150mM에서 매우 안정하기 때문에 HA-AuNP/IFNa 복합체는 결합한 IFNa 개수에 상관없이 NaCl 150mM에서 모두 매우 안정하였다.
2) 혈장 단백질에서의 안정성 평가
다음으로는 혈장 단백질에서의 안정성을 평가하였다. HA-AuNP/IFNa 복합체에 결합된 IFNa가 생체 내에서 혈장 단백질들과 AuNP의 경쟁적인 상호작용으로 인해 떨어져 나올 수 있다. 특히, 혈장 알부민(albumin)은 AuNP에 잘 결합한다고 알려져 있다. 따라서 혈장에서의 HA-AuNP/IFNa 복합체의 안정성을 실험하기 위해서 bovine serum albumin (BSA)에 의해 떨어져 나오는 IFNa의 양을 정량분석 하는 실험을 하였다.
구체적으로, <실시 예1>에 따라 AuNP당 IFNa 분자수가 각각 17, 43, 75, 및 110개가 되도록 HA-AuNP/IFNa 복합체를 형성하였다(AuNP당 각각 IFNa 20, 50, 100, 200개 첨가하여 제조함). 이 복합체들에 각각 BSA 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.) 을 2mg/mL가 되도록 첨가한 뒤, 가볍게 흔들어 주면서 3일 동안 반응시켰다. 3일 뒤에 원심분리기(20,000 X g, 20 분)를 이용하여 침전시키고, 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 상층액을 ELISA assay 를 통해 분석하고, IFNa를 표준곡선(standard curve)으로 하여 HA-AuNP에서 떨어져나온 IFNa를 정량 분석하였다.
실험 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, HA-AuNP/IFNa 17 복합체의 경우, BSA에 3일 동안 반응시켰을 시, IFNa가 빠르게 떨어져 나오는 것을 확인하였다. 하지만 AuNP 당 IFNa의 분자수가 증가할수록 BSA에 의해 떨어져 나오는 IFNa가 줄어들었으며 HA-AuNP/IFNa 75, HA-AuNP/IFNa 110, AuNP/IFNa 120 복합체의 경우에는 IFNa가 거의 떨어져 나오지 않았다. 이는 AuNP 당 IFNa의 분자수가 증가할수록 AuNP와 BSA가 상호작용 할 수 있는 기회가 적어지기 때문이라고 사료된다.
< 실험예 6>
HA - AuNP / IFNa 복합체의 활성도 분석 ( In Vitro )
인간 B 림포블라스토이드 세포인 (Human B-lymphoblastoid cell) 다우디 세포(Daudi cell) 는 인터페론이 존재할 경우 증식을 잘 하지 못하는 세포로 알려져 있어 인터페론의 활성도를 테스트 하는데 많이 쓰이는 세포이다.
이에 상기 다우디 세포(Daudi cell)(Korean Cell Line Bank) 를 세포배양액 (RPMI 1640 media supplemented with 10 vol% fetal bovine serum (FBS) and 10 IU/mL of antibiotics (penicillin), GIBCO ) 에 4×105 cells/mL로 분산시킨 후, 96 웰 플레이트(well plate)에 50?씩 넣어주었다. 또한 IFNa, PEG-Intron(신풍제약), HA-AuNP/IFNa 75, HA-AuNP/IFNa 110 및 AuNP/IFNa 120 복합체를 각각 세포배양액을 사용하여 여러 농도로 희석해 준 뒤, 다우디 세포에 각각 50?씩 넣어주었다. 이를 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 4일 동안 배양한 후, MTS assay (Cell Titer 96 AQueous One Solution Reagent, Promega (Madison, WI))를 통하여 다우디 세포의 증식속도를 확인하였다.
도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, IFNa에 비하여 HA-AuNP/IFNa 및 AuNP/IFNa 복합체의 활성도가 떨어지지만 시중에 판매되는 PEG-Intron의 경우와 동등한 정도의 효율을 보이는 것을 알 수 있었다. 그러나 이처럼 in vitro 상에서는 세포에 대한 IFNa의 활성도가 비슷하더라도, in vivo 상에서는 10 nm ~ 200 nm 의 크기를 갖는 입자가 신장 청소율(renal clearance)을 줄일 수 있다는 보고(Annu. Rev. Biomed. Eng. 2011, 13, 507-530.)가 있을 뿐만 아니라, 또한 본 발명의 실시예에 따른 복합체는 HA로 인한 간 표적지향 효과가 있어 in vivo 상에서 시중에 판매되는 PEG-Intron보다 더 높은 효율과 장기 지속성을 기대할 수 있다.
< 실험예 7>
HA - AuNP / IFNa 복합체의 인간 혈청( human serum )에서의 활성도 분석 ( In vitro )
IFNα, PEG-Intron, AuNP/IFNα 120, HA-AuNP/IFNα 75, HA-AuNP/IFNα 110 복합체를 IFNa 농도가 20?/mL로 동일하도록 각각 인간 혈청 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.) 에 용해시켜 37℃에서 3일 동안 반응시켰다. 3 일 뒤에, 상기 실험예 6과 동일한 방법으로 각 샘플의 생물학적 활성도를 다우디 세포(Daudi cell)를 이용한 MTS assay를 사용해 측정하였다.
도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, IFNa는 인간 혈청에서 빠르게 분해되어 그 활성도가 1/10로 감소하는 것을 확인 하였다. 반면, 두 종류의 HA-AuNP/IFNa 75, HA-AuNP/IFNa 110 및 AuNP/IFNa 120 복합체는 그 활성도가 감소하지 않아, 본 발명의 실시예에 따른 약물 전달체는 혈청 안정성이 매우 높음을 확인할 수 있었으며, 금속 나노입자당 결합된 단백질의 분자수가 증가할수록 안정성이 더욱 증가함을 알 수 있었다.
< 실험예 8>
HA - AuNP 세포 독성 확인
인터페론 알파의 전달체인 HA-AuNP만의 세포 독성을 확인하기 위해서 다우디 세포(Daudi cell)에서 상기 <실험예 6>에서와 같은 방법으로 실험하여 도 10에 나타냈다.
도 11에 나타난 바와 같이, 상기 <실험예 8>에서 사용한 HA-AuNP의 최고 농도보다 10배 높은 농도에서도 뚜렷한 세포 독성이 없음을 확인할 수 있었다.
< 실험예 9>
HA - AuNP / IFNa 복합체의 간 표적 지향 전달 능력 평가 ( In Vivo )
Balb/c mouse(포항공대 생명공학센터, 암컷 Balb/c mice, 5 주령, 약 20 g) 의 꼬리 정맥을 통해 PBS, IFNa, PEG-Intron, HA-AuNP, HA-AuNP/IFNa 75, HA-AuNP/IFNa 110, AuNP/IFNa 120 복합체를 각각 투여한 후 (주사량 : 인터페론 기준 0.2mg/kg), 4시간, 1일, 3일과 7일 뒤에 각각 쥐의 간을 채취하여 간에서 추출된 전체 단백질(mg)에 대한 IFNa(pg)의 농도를 ELISA assay로 정량하여 도 12 에 나타냈다.
도 12에서 알 수 있듯이, HA-AuNP 자체는 간에서의 IFNa 농도에 영향을 주지 않았다. IFNa는 1일, 3일, 및 7일째 측정되지 않았고, PEG-Intron은 3일째 약 100pg/mg의 농도로 측정되었지만, 7일째에는 측정되지 않았다. 이는 IFNa와 PEG-Intron이 몸에서 빠르게 제거되기 때문이라고 생각된다. 반면, 본 발명의 실시예에 따른 AuNP-기반 IFNa 복합체들은 3일째에 모두 PEG-Intron보다 높은 IFNa level을 나타냈고, IFNa가 AuNP에 공유결합이 아닌 물리적 결합을 하고 있는데도 불구하고, 7일째에도 여전히 간 조직에 남아있는 것을 확인하였다. 특히 HA-AuNP/IFNa 110 복합체가 간 조직에 더욱 많이 존재하는 것을 확인하였다.
이는 10 nm 이상의 크기를 가지는 나노입자가 신장의 여과(renal filtration)나 배뇨(urinary excretion)에 의해서 몸에서 빠르게 제거 되는 것을 막아주는 역할을 할 수 있고 (nnu Rev Biomed Eng. 2011;13:507-30), 또한 HA의 부착 방지(antifouling) 성질이, 나노 입자가 세망내피계(reticuloendothelial system (RES)) 나 순환하는 대식세포(macrophages)에 의해서 흡입되는 것을 줄여주는 역할을 할 수 있고, IFNa이 효소 분해 되는 것을 막아줄 수 있고, 또한 HA가 간에 표적 전달되는 역할을 하기 때문이라고 생각된다 (Nano Lett 2011;11:2096-103 and Adv Mater 2008;20(21):4154-7).
< 실험예 10>
HA - AuNP / IFNa 복합체의 간세포 분포( In Vitro )
Balb/c mouse의 꼬리 정맥을 통해 PBS, AuNP/IFNα 120, HA-AuNP/IFNα 110 복합체를 각각 투여한 후 (주사량 : 인터페론 기준 0.2mg/kg), 1일 뒤에 쥐의 간을 채취하여 간세포 별 AuNP의 분포를 ICP-MS와 TEM image로 분석하였다.
도 13 에서 볼 수 있는 바와 같이, HA-AuNP/IFNα 120 복합체는 liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) 에 주로 분포하는 것을 확인하였다.
< 실험예 11>
HA - AuNP / IFN α 복합체의 주요 조직별 분포 ( In Vivo )
Balb/c mouse의 꼬리 정맥을 통해 PBS, AuNP/IFNα 120, HA-AuNP/IFNα 110 복합체를 각각 투여한 후 (주사량 : 인터페론 기준 0.2mg/kg), 1일 뒤에 쥐의 간, 비장, 신장, 폐를 채취하여 간에서의 IFNα 양과 AuNP의 양을 각각 ELISA와 ICP-MS를 통하여 정량하였다.
도 14 에서 볼 수 있는 바와 같이, HA-AuNP/IFNα 120은 AuNP/IFNα 110 복합체보다 간에서의 IFNα의 양과 AuNP의 양이 높았고, 반면 폐에서의 IFNα의 양과 AuNP의 양은 낮았다. 이는 HA가 복합체의 간 표적 지향 전달을 도와주는 역할을 했음을 보여준다.
< 실험예 12>
HA - AuNP / IFNa 복합체의 간 표적 지향 전달 효율 분석 ( In Vivo )
Balb/c mouse(포항공대 생명공학센터, 암컷 Balb/c mice, 5 주령, 체중 약 20 g) 의 꼬리 정맥을 통해 PBS, IFNa, PEG-Intron, HA-AuNP, HA-AuNP/IFNa 75, HA-AuNP/IFNa 110, AuNP/IFNa 120 복합체를 각각 투여한 후 (주사량: 인터페론 기준 0.2mg/kg), 7일 뒤에 쥐의 간을 채취하여 간에서의 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 1 (2'-5'-oligoadenylate synthetase 1, OAS 1) 및 믹소바이러스 저항 1 (myxovirus resistance, Mx) 레벨(level)을 웨스턴 블롯(western blot)를 통하여 정량하여 도 15a(OAS 1) 및 도 15b(Mx)에 나타냈다 (Biomaterials, 2011, 32, 8722-8729).
OAS 1과 Mx는 인터페론에 의해 발현되는 단백질로 항바이러스 특성을 갖는다. 도 15a 에서 볼 수 있는 바와 같이, HA-AuNP/IFNa 75, HA-AuNP/IFNa 110 및 AuNP/IFNa 120 복합체의 경우, 7일 뒤에도 간에서의 항바이러스 역할을 하는 OAS 1 레벨이 IFNa와 PEG-intron에 비해 현저히 높아지는 것을 확인할 수 있었으며 특히 HA-AuNP/IFNa 110 복합체가 HA-AuNP/IFNa 75 및 AuNP/IFNa 120 복합체보다 더욱 높은 레벨의 OAS 1을 발현시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 15b에서 볼 수 있는 바와 같이, HA-AuNP/IFNa 110 복합체는 IFNa, PEG-intron, HA-AuNP/IFNa 75, 및 AuNP/IFNa 120 복합체에 비해 더욱 높은 레벨의 Mx를 발현시키는 것을 확인할 수 있었다. 이는 <실험예 9> 에서 확인한 간 조직 내에서의 IFNa의 농도 결과와도 잘 부합된다.

Claims (23)

  1. 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체로 표면 개질된 금속 나노입자, 및 상기 금속 나노입자의 표면 중 개질되지 않은 부분에 결합된 펩타이드 또는 단백질 의약품을 포함하는, 간 표적 지향 약물 전달체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체는 분자량이 5,000 내지 20,000 달톤(Da)인, 간 표적 지향 약물 전달체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 또는 자성 나노입자인, 간 표적 지향 약물 전달체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체가 금속 나노입자 한 개당 10 내지 100개의 분자수로 결합되어 표면 개질된 것인, 간 표적 지향 약물 전달체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 히알루론산 유도체가 말단 작용기(하기 화학식 1의 'R')을 통해 금속 나노입자 표면에 결합되어 표면 개질된 것인, 간 표적 지향 약물 전달체:
    [화학식 1]
    Figure pat00003

    상기 화학식 1에서,
    n은 12 내지 15의 정수이고, R은 NH(CH2)mR2이며, 상기 m은 2 내지 10의 정수이고 상기 R2는 C6H12O2, 또는 SH이다.
  6. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 금속 나노입자 한 개당 10 내지 200개의 분자수로 결합된 것인, 간 표적 지향 약물 전달체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 금속 나노입자의 표면에 공유 결합 또는 비공유 결합된 것인 간 표적 지향 약물 전달체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 금속 나노입자의 표면에 공유 결합된 것으로서, 상기 의약품을 구성하는 아미노산 중에 이황화 결합을 이루지 않은 시스테인을 포함하고 있는 것인, 간 표적 지향 약물 전달체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 금속 나노입자의 표면에 비공유 결합된 것으로서, 상기 의약품을 구성하는 아미노산 중에 티로신 (tyrosine), 라이신 (lysine), 아스파틱산 (aspartic acid), 알지닌 (arginine) 히스티딘 (hystidine) 및 트립토판 (tryptophan)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하고 있는 것인, 간 표적 지향 약물 전달체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 TNF 관련 세포자가소멸 유도 단백질(TNF-related apoptosis-inducing ligand), 혈관 점착 단백질 1(vascular adhesion protein 1), 간세포생장인자(Hepatocyte growth factor) 및 인터페론 알파(IFNa)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 간 표적 지향 약물 전달체.
  11. (1) 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체에, 말단 아민기 및 내부 이황화 결합을 갖는 물질 또는 카테콜아민 계열의 물질을 도입하는 단계;
    (2) 상기 도입된 물질을 금속 나노입자 표면과 반응시켜 표면 개질된 금속 나노입자를 제조하는 단계; 및
    (3) 상기 금속 나노입자의 표면 중 개질되지 않은 부분에 펩타이드 또는 단백질 의약품을 결합시키는 단계를 포함하는,
    간 표적 지향 전달체 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 (1) 단계는
    (1-1) 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체에, 말단 아민기 및 내부 이황화 결합을 갖는 물질을 도입하는 단계; 및
    (1-2) 다이싸이오트레이톨(Dithiothreitol, DTT), 2-멀캅토에탄올 (2-Mercaptoethanol), 및 트리스(2-카복시에틸포스핀) (Tris(2-carboxyethyl) phosphine, TCEP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 환원제를 사용하여 상기 1-1) 단계를 통해 형성된 이황화 결합을 절단하는 단계를 포함하여 이루어지는 것인, 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 (1) 단계는
    상기 히알루론산, 이의 염, 또는 유도체에 말단 아민기 및 내부 이황화 결합을 갖는 물질 또는 카테콜아민 계열의 물질을 도입하여 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 제조하는 것인, 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00004

    상기 화학식 1에서,
    n은 12 내지 50의 정수이고, R은 NH(CH2)mR2이며, 상기 m은 2 내지 10의 정수이고 상기 R2는 C6H12O2, 또는 SH이다.
  14. 제11항에 있어서, 상기 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체는 분자량이 5,000 내지 20,000 달톤(Da)인, 제조방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 제 (2) 단계는 상기 덱스트란, 헤파린, 히알루론산, 이들의 염, 또는 유도체를 금속 나노입자 한 개당 10 내지 100개의 분자수로 반응시키는 것인, 제조방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 말단 아민기 및 내부 이황화 결합을 갖는 물질은 2,2'-디설판디일디에탄아민(2,2'-disulfanediyldiethanamine), 3,3'-디설판디일디프로판-1-아민(3,3'-disulfanediyldipropan-1-amine), 4,4'-디설판디일디부탄-1-아민(4,4'-disulfanediyldibutan-1-amine), 5,5'-디설판디일디펜탄-1-아민(5,5'-disulfanediyldipentan-1-amine), 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 제조방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 카테콜아민 계열의 물질은 도파민 (dopamine), 노르에피네프린 (norepinephrine) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 것인 제조방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 (2) 단계의 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 또는 자성 나노입자인, 제조방법.
  19. 제11항에 있어서, 상기 제 (3) 단계는
    상기 금속 나노입자의 표면 중 개질되지 않은 부분에 펩타이드 또는 단백질 의약품을 공유 결합시키는 단계로서, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 이를 구성하는 아미노산 중에 이황화 결합을 이루지 않은 시스테인을 포함하고 있는 것인, 제조방법.
  20. 제11항에 있어서, 상기 제 (3) 단계는
    상기 금속 나노입자의 표면 중 개질되지 않은 부분에 펩타이드 또는 단백질 의약품을 비공유 결합시키는 단계로서, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 이를 구성하는 아미노산 중에 티로신 (tyrosine), 라이신 (lysine), 아스파틱산 (aspartic acid), 알지닌 (arginine) 히스티딘 (hystidine) 및 트립토판 (tryptophan)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하고 있는 것인, 제조방법.
  21. 제11항에 있어서, 상기 제 (3) 단계는
    상기 금속 나노입자의 표면 중 개질되지 않은 부분에 인터페론 알파(IFNa)를 정전기적 결합 및 소수성 결합시키는 것인, 제조방법.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 간 표적 지향 전달체를 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 간 질환은 급성간염, 만성간염, 간경변증, 간경화, 지방간, 또는 간암인, 약학 조성물.
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