CN112367977A - 甘草甜素-乙二醇壳聚糖共轭物包覆氧化铁纳米粒子及其用途 - Google Patents

甘草甜素-乙二醇壳聚糖共轭物包覆氧化铁纳米粒子及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包覆有甘草甜素‑乙二醇壳聚糖共轭物的纳米粒子，使用这种纳米粒子制备的移植用胰岛细胞以及包括这种纳米粒子的MRI成像组合物。如果所述胰岛细胞被移植，则包括所述纳米粒子的所述胰岛细胞可以抑制移植后的免疫应答。本发明能够提供能够通过磁力感应移植到特定区域并且能够通过MRI进行追踪的移植用胰岛细胞。

Description

甘草甜素-乙二醇壳聚糖共轭物包覆氧化铁纳米粒子及其 用途
技术领域
本发明涉及甘草甜素-乙二醇壳聚糖共轭物包覆的纳米粒子和使用了这种纳米粒子的移植用胰岛细胞组合物。
背景技术
1型糖尿病因胰脏中表现出正常功能的β细胞的数量减少，导致胰岛素分泌不足。因此，血糖没有得到正常调节，从而发生高血糖症，这引起各种并发症。
作为治疗这种1型糖尿病的方法，迄今为止，最广泛使用的是用胰岛素注射器人工注射胰岛素起到暂时调节血糖的治疗方法。为了克服胰岛素注射法的暂时血糖调节问题，异种胰岛细胞的移植方法被大量研究。尽管大多数细胞在临床上已被移植到肝脏部位，但缺点在于，细胞是通过门静脉注射的，因此会引起立即经血液介导的炎症反应(IBMIR)。此外，由于将非常少量的胰岛细胞注射到非常宽的肝脏部位，因此还存在难以追踪胰岛细胞的问题。由于这些原因，调节血糖控制所需的边缘胰岛质量要求非常高。受器官供体的限制，这也是导致胰岛细胞移植手术本身困难的因素。因此，需要一种能够在临床上成功地将胰岛细胞移植到患有糖尿病的患者的肝脏组织部位并连续观察其活力和功能性的技术。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的是提供一种用于移植胰岛细胞的组合物，其包括生物相容性聚合物-甘草甜素共轭物包覆的纳米粒子、以及用该组合物处理的胰岛细胞，以克服由于血流造成的异种胰岛细胞损失，异种胰岛细胞损失是胰岛细胞移植的最大问题，同时克服移植后发生的自身免疫应答。
本发明的另一目的是提供一种用于缓解、预防或治疗胰岛细胞缺乏症的药物组合物，该药物组合物包括移植用胰岛细胞。
本发明的又一目的是提供一种MRI成像组合物，其包括生物相容性聚合物-甘草甜素共轭物包覆的纳米粒子。
用于解决问题的方案
为了实现这些目的，本发明的一个方面提供了一种用于移植胰岛细胞的组合物，其包括包覆有生物相容性聚合物-甘草甜素共轭物的纳米粒子，其中生物相容性聚合物-甘草甜素共轭物通过共价键连接。
异种胰岛细胞移植后发生自身免疫应答的主要原因是从胰岛细胞核释放的高迁移率族蛋白B1(HMGB1)蛋白。HMGB1蛋白在细胞核中产生，并当细胞外部引发物理应激时释放到细胞外。释放的HMGB1蛋白与外部免疫细胞的受体(TLR，RAGE)结合，激活免疫细胞并促使免疫细胞分泌细胞因子。分泌的细胞因子再次向胰岛细胞施加外部刺激，这导致胰岛细胞重复内部表达并释放更多HMGB1蛋白的恶性循环，从而导致大量移植的胰岛细胞损失。
因此，为了降低异种胰岛细胞移植过程中发生的自身免疫应答水平，需要抑制细胞核产生的HMGB1蛋白释放到细胞外。为此，本发明人通过允许能够捕获HMGB1蛋白的甘草甜素通过共价键结合到生物相容性聚合物主链上，合成了生物相容性聚合物主链-甘草甜素共轭物。
如本文所用，术语“甘草甜素”是从甘草提取的成分，并且直接结合到HMGB1蛋白的A盒结构域以抑制活性和细胞外释放。然而，甘草甜素在体内的半衰期非常短，例如，当静脉内注射约5mg/kg的甘草甜素时，甘草甜素在体内的保留时间不超过约15分钟，因此在甘草甜素作为药物制剂的商业化中存在局限性。
在本发明中，通过使这种甘草甜素结合到生物相容性聚合物主链上以增加其在体内的半衰期并增加被细胞吸收的甘草甜素的量，可以增强其效果。
在本发明的示例性实施例中，本发明的甘草甜素可以在不丧失固有特性的范围内被修饰，例如为氧化形式。如图1所示，对于氧化形式的甘草甜素，末端葡糖醛酸环的第2和第3个碳之间的键通过氧化而打开，形成醛取代基。如此形成的醛基可允许甘草甜素与生物相容性聚合物主链形成键。
如本文所用，术语“生物相容性聚合物主链”是指具有组织相容性和血液相容性的聚合物，其不会通过使生物相容性聚合物主链与组织或血液接触而破坏生物组织或使血液凝结，并且是指用作能够与许多甘草甜素分子键合的主链聚合物。
在本发明的示例性实施例中，本发明的生物相容性聚合物主链包括能够与醛基形成化学键的官能团。如上所述，氧化形式的甘草甜素包括醛基，可以不受限制地使用，只要生物相容性聚合物能够与甘草甜素的醛基形成化学键的取代基即可。例如，在本发明的生物相容性聚合物主链中包括的官能团是氨基、羧基、硫醇基或羟基。优选地，可以使用包括氨基的生物相容性聚合物主链。
在本发明的示例性实施例中，本发明的生物相容性聚合物主链选自由乙二醇壳聚糖、多聚赖氨酸、聚4-乙烯基吡啶/二乙烯基苯、甲壳素、以胺基封端的聚(丁二烯/丙烯腈)、聚乙烯亚胺、聚苯胺，聚(乙二醇)双(2-氨乙基)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、乙烯胺均聚物、聚(2-乙烯基吡啶)、聚(2-乙烯基吡啶N-氧化物)、聚-ε-Cbz-L-赖氨酸、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、聚(烯丙胺)、聚(烯丙胺盐酸盐)、聚(N-甲基乙烯基胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、壳聚糖或聚(4-氨基苯乙烯)组成的组。优选地，乙二醇壳聚糖可以用作生物相容性聚合物主链。
乙二醇壳聚糖是具有生物亲和力和生物降解性的材料，并用于各种领域，诸如组织工程或给药。然而，在高分子量乙二醇壳聚糖的情况下，由于其带正电荷导致的毒性问题，难以将乙二醇壳聚糖用作药物制剂。
在本发明的示例性实施例中，生物相容性聚合物主链和甘草甜素通过共价键彼此连接，并且该共价键可以选自由酰胺键、羰基键、酯键、硫酯键和磺酰胺键组成的组。更优选地，共价键可以是通过将用高碘酸钠等处理而氧化的甘草甜素的羰基与生物相容性聚合物主链的胺基反应而形成的酰胺键。
摄取外部物质进入细胞的最常用方法之一是自然发生的内吞作用。然而，使用内吞作用的方法较为耗时，难以摄取足够量的材料，并且不能将外部材料均匀地吸收到每个细胞中，因此该方法在用作药物制剂方面仍然有局限性。因此，本发明人使用了用甘草甜素-生物相容性聚合物主链共轭物包覆纳米粒子的方法，以便将大量甘草甜素-生物相容性聚合物主链共轭物均匀地摄取到胰岛细胞中并促进向已经摄取共轭物的胰岛细胞的靶位移动。
如本文所用，术语“纳米粒子”是指具有纳米(nm)尺寸的结构或材料。纳米尺寸是将微米(10-6)的尺寸减小1/1000，并且当材料的尺寸减小到纳米尺寸时，表现出各种独特的物理、化学、机械和电子特性。
在本发明中，纳米粒子的平均尺寸通常可以在约1nm至约500nm的范围内，例如，约1nm至约50nm、约50nm至约100nm、约100nm至约250nm、以及约250nm至约500nm。
根据本发明的示例性实施例，本发明的纳米粒子可以制备为1至100mm，优选1至50mm，更优选1至20mm的尺寸。当纳米粒子的尺寸为500nm或以上时，沉降速率增加，这导致使用不便，因此需要使用分散剂，诸如葡萄糖、蔗糖、甘油、聚乙烯胺和甜菜碱来防止沉降。
在本发明中，纳米粒子可以是有机或无机纳米粒子，并且可以优选是磁性纳米粒子。
如本文所用，术语“磁性”是指材料表现出的磁性特性。所有材料都与磁场发生作用生成吸引力或排斥力。即，当对物质施加磁场时，该物质被磁化，并且根据物体被磁化的方式，物体被分为铁磁性物质、顺磁性物质、抗磁性物质、亚铁磁性物质等。
如本文所用，术语“磁性纳米粒子”是指表现出磁性特性的纳米级结构或材料。磁性纳米粒子可以通过溶液合成、共沉降、溶胶-凝胶法、高能研磨、水热合成、微乳液合成、通过热分解的合成或声化学合成来制备，但是制备方法不限于此。
在本发明中，磁性纳米粒子可以选自由铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、锰(Mn)、钆(Gd)、其氧化物或其合金组成的组，但是不限于此。
根据本发明的示例性实施例，磁性纳米粒子是由铁或氧化铁形成的磁性纳米粒子。
在本发明中，作为用甘草甜素-生物相容性聚合物主链共轭物包覆纳米粒子的通用方法，可以使用i)将生物相容性聚合物中存在的官能团附着于纳米粒子的方法、ii)将生物相容性聚合物接枝到预先合成的纳米粒子的表面上或通过点击化学将生物相容性聚合物附着到预先合成的纳米粒子的表面上的方法、iii)使用包括具有能够与纳米粒子结合的官能团的嵌段的嵌段聚合物作为生物相容性聚合物的方法、iv)使用具有能够包裹纳米粒子的官能团(接枝基团)的生物相容性聚合物的方法、v)通过生物相容性聚合物和纳米粒子之间的离子键的包覆方法、或vi)在使用具有亲水性和疏水性官能团的两亲性聚合物作为生物相容性聚合物制备胶束形式后使用与疏水性纳米粒子表面的疏水-疏水结合作用的包覆方法，但包覆方法不限于此。
根据本发明的示例性实施例，生物相容性聚合物包括能够与纳米粒子结合的官能团，并且该官能团可以是胺基、羧基或羟基，优选为羟基。因此，在磁性纳米粒子的制备中使用的热分解技术可以用于纳米粒子包覆。具体地，通过使氧化铁纳米粒子与甘草甜素-乙二醇壳聚糖共轭物在高温下反应，可以通过乙二醇壳聚糖多糖中存在的-OH官能团将共轭物包裹在氧化铁纳米粒子的表面上。该方法的优点在于，通过大量的-OH官能团稳定地用共轭物包覆了纳米粒子的表面，但是当在高温下超长时间进行反应时，可能会发生多糖本身分解的缺点。
本发明的另一方面提供了一种用于缓解、预防或治疗胰岛细胞缺乏症的药物组合物，该药物组合物包括胰岛细胞作为活性成分，该胰岛细胞包括用于将胰岛细胞移植到细胞中的组合物。
包括用于移植在细胞中包括GC-SPIO的胰岛细胞的组合物的胰岛细胞在体内移植期间具有提高的细胞活力，因此可以用于由于胰岛细胞缺乏而可能发生的所有疾病。示例3中描述的开/关方法可以用作将用于胰岛细胞移植的组合物摄取到胰岛细胞中的方法。
在本发明的示例性实施例中，本发明的胰岛细胞缺乏症是选自由1型糖尿病、2型糖尿病和糖尿病性慢性肾脏病组成的疾病。1型糖尿病、2型糖尿病和糖尿病性慢性肾脏病都是可以通过胰岛细胞移植治疗的疾病。
在本发明的示例性实施例中，本发明的胰岛细胞缺乏症是1型糖尿病。由于1型糖尿病发生在分泌胰岛素的胰岛β细胞被破坏并且胰岛素分泌功能丧失时，因此胰岛细胞移植可能是1型糖尿病的良好治疗方法。
本发明药物组合物中包含的药学上可接受的载体通常在配制过程中使用，并且包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等，但不限于此。除了上述成分以外，本发明的药物组合物还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载体和配方在《雷明顿药物科学》(第19次修订版，1995)中有详细描述。
本发明药物组合物的合适剂量可以根据多种因素而变化，诸如配制方法、给药方法、年龄、体重、患者的性别或病状、饮食、给药时间、给药途径、排泄率和反应灵敏度。同时，本发明药物组合物的剂量优选每天为0.001至1000mg/kg(体重)。
本发明的药物组合物可以以单位剂量的形式制备，或者通过根据本发明所属领域的普通技术人员能容易实现的方法使用药学上可接受的载体和/或赋形剂进行配制而被容纳在多剂量容器中。在这种情况下，剂型也可以是在油或水介质中的溶液形式、悬浮液或以乳液、提取物、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式，并且本发明的药物组合物还可以包括分散剂或稳定剂。
本发明的又一方面提供了一种制备移植用胰岛细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使项1所述的用于移植胰岛细胞的组合物与从供体分离的胰岛细胞接触；
(b)对胰岛细胞施加磁力0.1分钟至5分钟；以及
(c)将(b)的所得产物混合0.1分钟至5分钟。
在本发明的示例性实施例中，使用于移植胰岛细胞的组合物与从供体分离的胰岛细胞接触可以包括培养胰岛细胞然后使用移植胰岛细胞的组合物来处理培养基的方法。
在本发明的示例性实施例中，步骤(b)可以通过使磁铁与胰岛细胞培养板的一个表面接触生成磁力的方法来执行，并且，作为所使用的磁铁，可以使用但不限于钕磁铁、电磁铁等。
在本发明的示例性实施例中，步骤(c)是混合所得产物以使用于移植胰岛细胞的组合物均匀地存在于胰岛细胞培养基中的步骤，并且混合方法可包括移液或搅拌。移液可以进行0.1分钟至5分钟，优选进行0.5分钟至3分钟。
在本发明的示例性实施例中，制备移植用胰岛细胞的方法可以还包括：(d)：在步骤(c)之后使胰岛细胞静置0.1分钟至5分钟，并且还可以包括在步骤(c)之后优选地使胰岛细胞静置0.5分钟至3分钟。
在本发明的示例性实施例中，对于制备胰岛细胞的方法，步骤(b)至(d)可以重复1次至20次，并且优选地，步骤(b)至(d)可以重复5次至12次。
通过研究能够有效地将GC-SPIO引入胰岛细胞的方法，本发明人确认，当在使GC-SPIO与胰岛细胞接触之后重复施加磁力、移液和使胰岛细胞静置的步骤时，将GC-SPIO摄取到胰岛细胞中的效率显著提高。
在本发明中，用于将GC-SPIO摄取到胰岛细胞中的方法被称为“开-关系统”，该方法包括施加磁力、移液并使胰岛细胞静置的步骤。被吸收到胰岛细胞中的GC-SPIO捕获从细胞核移到细胞质的HMGB1蛋白，然后HMGB1蛋白通过细胞活性分解。因此，由于不发生免疫细胞活化，所以自身免疫应答降低，从而通过上述方法制备的移植用胰岛细胞具有较高活力，因此获得长期的胰岛素分泌，使得血糖得以调节。
根据本发明的示例性实施例，通过上述方法制备的移植用胰岛细胞对细胞中包括的GC-SPIO产生的磁力进行应答。具体地，在异种胰岛细胞移植时，最大数量的异种胰岛细胞被移植到肝叶的中间1中，因此当将由磁铁(例如，钕磁铁)产生的磁力施加到该部位时，因为磁力所产生的诱导被施加到胰岛细胞，所以已经摄取了多个GC-SPIO的胰岛细胞沉降在中间1中。因此，可以减少由现有的血压和血流速度而导致的在移植非特异性生成的异种胰岛细胞的损失。此外，由于减少了胰岛细胞的损失，可以减少移植的胰岛细胞的数量，从而降低待治疗个体的疲劳，并且向肝叶递送胰岛细胞速率的增加可以改善血糖调节功能，远远超过现有情况。
通过上述方法制备的胰岛细胞的移植可以通过选择本领域已知的合适移植部位(例如，在肾囊、肝门静脉等下)并在移植部位执行已知方法来执行，例如，在无任何腹部切口的情况下在超声荧光透视下通过肝门静脉将制备的胰岛经皮注射入肝脏的方法。对于适合移植的胰岛细胞状况，作为ABO匹配型，当胰岛的数量(单个胰岛)为5000kg(目标体重)或更多，胰岛纯度为30％或更高，最终体积为10ml或更少，并且细胞为革兰氏阴性和内毒素阴性时，胰岛细胞状况变为移植状况(Shapiro J等人，埃德蒙德胰岛移植方案的国际试验，NEngl J Med 355:1318-1330(2006))。
由于本发明的移植用胰岛细胞的制备方法涉及上述的用于移植胰岛细胞的组合物，为了避免在本说明书的描述中过于复杂，将省略重复的内容。
此外，本发明提供了一种MRI成像组合物，其包括生物相容性聚合物-甘草甜素共轭物包覆的磁性纳米粒子(GC-SPIO)。
根据本发明的示例性实施例，磁性纳米粒子可以选自由铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、锰(Mn)、钆(Gd)、其氧化物或其合金组成的组，但是不限于此。
由于本发明的MRI成像组合物涉及一种使用本发明的上述用于移植胰岛细胞的组合物中包括的生物相容性聚合物-甘草甜素共轭物包覆的纳米粒子的方法，因此为了避免在本说明书的描述中过于复杂，将省略重复的内容。
根据本发明的示例性实施例，GC-SPIO可以用作阴性对比剂(T2对比剂)，该阴性对比剂由于氧化铁纳米粒子的固有特性而通过MRI设备中的磁场干扰使相应部位变暗。
另外，本发明可以提供一种用于移植包括GC-SPIO的胰岛细胞的方法，并且该移植可以在磁感应环境中进行。在这种情况下，由于可以通过对移植部位施加磁力来诱导胰岛细胞，因此具有可以提高细胞移植效率的优点。
发明效果
本发明涉及甘草甜素-乙二醇壳聚糖共轭物包覆的纳米粒子(GC-SPIO)、使用这种纳米粒子制备的移植用胰岛细胞以及包括这种纳米粒子的MRI成像组合物，并且GC-SPIO可以结合到HMGB1蛋白以降低自身免疫应答水平，从而维持胰岛细胞的胰岛素分泌功能，从而实现长期血糖调节。
此外，包括生物相容性聚合物-甘草甜素共轭物包覆的磁性纳米粒子的胰岛细胞具有能够通过MRI实时追踪的优点，并且具有能够定量地确认所移植的胰岛细胞的量的优点。
附图说明
图1示意性地示出了合成甘草甜素-乙二醇壳聚糖共轭物(GC)的过程。
图2是通过傅立叶变换红外光谱法分析乙二醇壳聚糖、甘草甜素-乙二醇壳聚糖共轭物、氧化铁纳米粒子(裸SPIO)及甘草甜素-乙二醇壳聚糖共轭物包覆的氧化铁纳米粒子(GC-SPIO)的结果。
图3是测量裸SPIO和GC-SPIO的电位的结果(A)及通过透射电子显微镜法确认上述裸SPIO和GC-SPIO的粒径的结果(B)。
图4是通过各种方法用GC-SPIO处理后，通过透射电子显微镜法确认胰岛细胞是否摄取了GC-SPIO的结果：未标记的胰岛对照组，未经GC-SPIO处理的胰岛细胞；简单地用GC-SPIO处理的随机摄取胰岛细胞；磁铁-胰岛细胞，其中在经过GC-SPIO处理后会产生磁力；以及开/关系统-胰岛细胞，其中在进行GC-SPIO处理后，重复进行1分钟的磁力感应、移液和没有任何磁力的1分钟的培养的循环。
图5是通过各种方法(简单处理、磁力感应、磁力感应+移液、开/关系统)用GC-SPIO处理胰岛细胞后定量分析对GC-SPIO的摄取的结果：无经GC-SPIO简单处理过的磁铁-胰岛细胞的SPIO；带有经GC-SPIO处理过然后与磁铁接触的磁铁(开)-胰岛细胞；带有经GC-SPIO处理然后与磁铁接触+移液的磁铁(开+移液)-胰岛细胞的SPIO；以及带有经GC-SPIO处理并用开/关循环处理的磁铁(开/关)-胰岛细胞的SPIO。
图6是通过各种方法(磁力感应、磁力感应+移液、开/关系统)用GC-SPIO处理胰岛细胞后确认细胞存活力的结果：完整的胰岛对照组、完整的胰岛细胞。
图7是通过开/关系统方法用各种浓度的GC-SPIO处理胰岛细胞后定量分析对GC-SPIO的摄取的结果。
图8是通过开/关系统方法用各种浓度的GC-SPIO处理胰岛细胞后确认细胞活力的结果。
图9是在改变开/关循环次数的同时在用GC-SPIO处理胰岛细胞后定量分析对GC-SPIO的摄取的一组结果。
图10是通过开/关系统方法用GC-SPIO处理胰岛细胞后确认细胞活力随培养时间而变化的一组结果。
图11是用GC-SPIO处理胰岛细胞后确认从细胞核释放的HMGB1蛋白水平的结果。
图12是通过肝门静脉移植将亚甲基蓝溶液注射到小鼠中后确认发现有大量亚甲基蓝溶液的肝叶的结果：对照组、右前(RA)、右后(RP)、左、尾1(C1)、尾2(C2)、中间1(M1)和中间2(M2)。
图13是通过肝门静脉移植将亚甲基蓝溶液注射到小鼠中后对在每个肝叶中发现的亚甲基蓝溶液进行定量的结果：对照组；M1和M2分别是中间M1和M2；C1和C2分别为尾1和尾2；L是左；RP是右后；RA是右前。
图14是通过肝门静脉移植将已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞注入到小鼠中后在没有磁力感应或有磁力感应的情况下确认胰岛素分泌程度的结果。
图15是通过肝门静脉移植将已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞注入到小鼠中后根据磁力感应的有无对胰岛素分泌程度进行定量的结果。
图16是通过肝门静脉移植将已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞注入到小鼠中后在没有磁力感应或有磁力感应的情况下确认胰岛细胞的移植程度的结果。
图17是通过肝门静脉移植将已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞注入到小鼠中后根据磁力感应的有无对胰岛细胞的移植进行定量的结果。
图18是通过肝门静脉移植将已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞注入到小鼠中后分离肝叶并通过显微镜确认肝叶的一组结果。
图19是通过肝门静脉移植将已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞注入到小鼠中后分离肝叶并通过MRI确认肝叶的一组结果。
图20是在仅将胰岛细胞注射到糖尿病动物模型中或将已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞注射到糖尿病动物模型中之后，根据磁力感应的有无，确认血糖变化的结果。
图21是示意性地示出了使用本发明的GC-SPIO和已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞的方法的示意图。
具体实施方式
在下文中，将通过示例更详细地描述本发明。提供这些示例仅是为了更具体地描述本发明，对于本发明所属领域的普通技术人员显而易见的是，本发明的范围不受根据这些要旨的这些示例的限制。
示例1：制备甘草甜素-乙二醇壳聚糖包覆的氧化铁纳米粒子
1-1.合成甘草甜素-乙二醇壳聚糖
通过图1中公开的合成方法制备甘草甜素-乙二醇壳聚糖(GC)。将411.47mg甘草甜素铵盐(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)，美国)和205.74mg乙二醇壳聚糖(和光纯药工业株式会社(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES)，日本)在4℃下分别加入到10ml和20ml pH值为9.5的碳酸盐缓冲液中并溶解，并且将214mg高碘酸钠(西格玛奥德里奇(SigmaAldrich))溶解于20ml三次蒸馏水(DW)中。当高碘酸钠完全溶解时，将所得溶液加入到10ml甘草甜素溶液中，并使所得混合物在遮光的条件下在4℃下反应90分钟。当乙二醇壳聚糖完全溶解时，将所得溶液加入到溶解有甘草甜素和高碘酸钠的溶液中，并使所得混合物在遮光的条件下在4℃下反应约24小时。之后，向其中加入15μl氰基硼氢化物，并使所得混合物在遮光的条件下在4℃下反应24小时，以通过将仲酰胺键变为伯酰胺键来稳定所得产物。反应完成后，将反应溶液转移至半透膜(截留分子量为3500至5000Da；膜过滤产品(MembraneFiltration Products)，美国)，然后在4L碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中透析48小时，然后使用4L三级蒸馏水透析72小时。当透析完成后，将溶液用液氮冷冻，冷冻干燥3天，从而得到粉末状的甘草甜素-乙二醇壳聚糖(下文称为“GC”)(图1)。
1-2.制备GC包覆的氧化铁纳米粒子
用三级蒸馏水(DW)洗涤三颈烧瓶后，向其中加入30ml三级蒸馏水，并用橡胶塞盖住烧瓶。通过向三颈烧瓶中注入氮气30分钟除去三次蒸馏水中的氧气，然后向三次蒸馏水中加入0.28g氯化亚铁四水合物和0.56g三氯化铁六水合物。在向其中滴加8ml氢氧化铵之后，通过搅拌所得混合物30分钟使氧化铁沉淀，并且将沉淀的氧化铁纳米粒子(超顺磁性氧化铁纳米粒子：下文称为SPIO)用三次蒸馏水洗涤3次以除去氢氧化铵。在将100mg甘草甜素-乙二醇壳聚糖(GC)添加到10ml三次蒸馏水中并且搅拌所得混合物之后，将该溶液与SPIO混合。将SPIO和GC的混合溶液在80℃下搅拌2小时，并用三次蒸馏水洗涤3次。之后，将混合溶液在特定条件下超声处理：扩增39％，开启时间：2秒，关闭时间：2秒，总时间：1小时。通过超速离心(4000rpm，1000秒，4℃)除去未包覆GC的SPIO，最后用孔径为800nm和400nm的过滤器进行过滤，以获得甘草甜素-乙二醇壳聚糖共轭物包覆的超顺磁性氧化铁纳米粒子(下文称为GC-SPIO)。
1-3.GC-SPIO分析：傅立叶变换红外光谱
通过使用NicoletTM iSTM 50FTIR光谱仪(赛默飞科技(Thermo Scientific)，美国)作为傅立叶变换红外光谱(ATR-FTIR)设备来确认GC和SPIO是否结合。
因此，如图2所示，可以确认的是，在现有乙二醇壳聚糖中存在的C-H伸拉伸、糖精结构峰(2922cm-1、1057cm-1)和COO-峰(1398cm-1)均存在于合成的GC-SPIO中。这意味着甘草甜素和乙二醇壳聚糖正确缀合。
此外，作为SPIO和GC-SPIO的ATR-FTIR光谱的测量结果，确认了Fe-O拉伸峰(568cm-1)。在最终合成材料GC-SPIO中也观察到了GC中存在的C-H拉伸和糖精结构峰(2922cm-1、1057cm-1)。通过该结果可以看出，最终的合成材料GC-SPIO已被正确合成。
1-4.GC-SPIO分析：ζ-电荷和尺寸
将1ml(104.5μg/ml)GC-SPIO放入一次性比色皿中，并通过Nano ZS(Malvern，英国)测量ζ-电位。通过测量，如图3的A所示，尽管未包覆GC的SPIO(下文称为裸SPIO)表现出约-20mV的电荷，但由于壳聚糖中带正电荷的胺基，通过确认GC-SPIO表现出约0.5±0.2mV的电荷，可以看出氧化铁纳米粒子通常包覆有GC。
另外，通过透射电子显微镜法(TEM)确认SPIO和GC-SPIO的尺寸。因此，如图3的B所示，通过确认裸SPIO的尺寸为约14.9±0.4nm，并且GC-SPIO的尺寸为约8.4±0.3nm，可以看出由于GC包覆而使粒径得到减小。由于粒径减小，GC-SPIO可能会被更好地吸收到胰岛细胞中。
示例2：确认胰岛细胞的GC-SPIO摄取
2-1.分离胰岛细胞(胰岛)
将胶原酶P以1mg/kg的浓度溶解在汉克斯氏平衡盐溶液(HBSS)中，并将所得溶液经导管内注射至雄性SD大鼠中。之后，分离胰腺并将其储存在37℃的水中15分钟，并用培养基199洗涤分离出来的胰岛细胞。对洗涤后的胰岛细胞进行纯化，并通过用Histopaque(Sigma，美国)离心进一步纯化。将纯化的胰岛细胞在含有10％牛胎血清和1％抗生素的RPMI-1640(Invitrogen，美国)中培养24小时。
2-2.确认胰岛细胞的GC-SPIO摄取
尽管GC-SPIO可通过内吞作用被吸收到胰岛细胞中，但是GC-SPIO存在的缺点是摄取效率低并且随机发生摄取。因此，设计了一种在胰岛细胞中有效摄取GC-SPIO的新方法。四个实验组是对照组(未标记的胰岛)(未经处理的GC-SPIO)、随机摄取组(随机摄取)、磁力感应组(带有磁铁)和开/关系统处理组(开/关系统)。对照组是未用GC-SPIO处理胰岛细胞的实验组，随机摄取组是用GC-SPIO简单处理过胰岛细胞的实验组，磁力感应组是胰岛细胞经GC-SPIO处理后连续生成磁力的实验组，而开/关系统处理组是在胰岛细胞上进行GC-SPIO处理、磁力生成、移液和无磁力培养过程的实验组。
具体地，在将示例2-1中分离的胰岛细胞(200IEQ)在35π皮氏培养皿中培养并用GC-SPIO以109.5μg/ml的浓度处理后，生成磁力1分钟，然后移液。之后，将胰岛细胞培养1分钟而不生成任何磁力。GC-SPIO处理、磁力生成、移液和无磁力培养的过程相当于一个循环，这种方法称为开/关系统。
之后，通过透射电子显微镜法观察细胞，如图4所示，可见除了对照组外，在三个实验组的胰岛细胞中摄取了GC-SPIO。特别地，可以确认在开/关系统处理组中摄取了最大量的GC-SPIO。
此外，使用铁比色测定试剂盒(Biovision，美国)根据制造商的方案对胰岛细胞中摄取的GC-SPIO的量进行了定量分析。首先，通过将试剂盒中包含的10μl铁标与990μl三级蒸馏水(DW)混合来制备稀释铁标，并通过将稀释铁标与测定缓冲液按0:100、2:98、4:96、6:94、8:92和10:90的比例混合来绘制标准曲线。
接下来，在96孔板中培养胰岛细胞(200IEQ)后，向其中加入GC-SPIO(10μm)，并以对应的条件对每个实验组进行处理：磁力非处理组(无磁铁的GC-SPIO)；磁力处理组(带有磁铁(开)的GC-SPIO)；磁力和移液处理组(带磁铁(开+移液)的GC-SPIO)；以及开/关系统处理组(带磁铁(开/关)的GC-SPIO)。之后，将5ml的铁还原剂添加到每个孔中并混合30分钟，并且另外将100ml的铁探针等分到每个孔中以表达荧光。将孔用箔包裹以阻挡光，然后在室温下摇动1小时。胰岛细胞摄取的GC-SPIO量是通过在黑暗处测量593nm波长处的吸光度来确认的。
结果，如图5所示，可以确认在开/关系统处理组中将最大量的GC-SPIO引入了胰岛细胞中。
2-3.通过开/关系统确认胰岛细胞活力的变化
为了确认胰岛细胞对GC-SPIO的摄取是否会引起细胞毒性，将胰岛细胞(200IEQ)在24孔板中进行培养，然后用GC-SPIO(10μm)处理30分钟，并且另外用对应的条件对每个实验组进行处理：对照组(完整的胰岛)(未经过处理的GC-SPIO)；磁力非处理组(不带磁铁的GC-SPIO)；带磁铁(开)的磁力处理组GC-SPIO；以及开/关系统处理组(带磁铁(开/关)的GC-SPIO)。之后，通过向每个孔中加入相当于培养基的10％的CCK溶液，将细胞在37℃下培养4小时，回收细胞，然后通过在黑暗处测量在450nm波长处的吸光度来测量细胞活力。
通过测量，如图6所示，可以确认实验组之间的细胞活力没有显著差异。因此，可以看出，当将GC-SPIO摄取到胰岛细胞中时，作为最有效的方法的开/关系统没有细胞毒性。
示例3：确认磁力开/关系统的最佳条件
3-1.优化GC-SPIO处理浓度
在96孔板中培养胰岛细胞(200IEQ)后，通过开/关系统方法用各种浓度的GC-SPIO(0、2.5、5、10、20和45μg/ml)处理胰岛细胞。具体而言，总共进行12次(1个循环×12)用GC-SPIO以对应浓度处理包括胰岛细胞的35π皮氏培养皿和3ml RPMI(PBS 10％，PS 1％)培养基，对其施加磁力1分钟，进行移液1分钟，然后不进行任何磁力处理地将胰岛细胞培养1分钟的过程。之后，通过细胞筛将胰岛细胞中未摄取的GC-SPIO与胰岛细胞分离。接下来，根据示例2-2的方法，使用铁吸光度分析试剂盒进行分析。
因此，如图7所示，可以看到，根据GC-SPIO的处理浓度，被摄取到胰岛细胞中的量增加。基于对照组(C)，在处理浓度为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和45μg/ml的情况下，分别表现出诸如为142、166、197、252和268的值，从而确认在对照组和每个实验组之间表现出了显著差异。然而，在GC-SPIO处理浓度20μg/ml组(252)结果和GC-SPIO处理浓度45μg/ml组(268)结果之间，没有表现出统计学意义。由此可以看出，直到GC-SPIO处理浓度为20μg/ml为止时，处理浓度与GC-SPIO摄取量之间存在正相关，但当处理浓度超过20μg/ml时，与摄取量的相关性较弱。
3-2.确认胰岛细胞活力
在与3-1相同的条件下将GC-SPIO摄取到胰岛细胞中后，通过分离细胞进行CCK分析。
因此，如图8所示，在对照组和每个实验组之间不能确认细胞活力的显著差异，并且可以得出GC-SPIO处理浓度与胰岛细胞的毒性无关的结论。
考虑到通过总结示例3-1得到20μg/ml和45μg/ml浓度下GC-SPIO的摄取量没有差异这一事实，结合到处理浓度为45μg/ml时的过滤过程需要很长时间，将GC-SPIO的最佳浓度设置为20μg/ml。
3-3.优化磁力开/关系统循环次数
当使用磁力开/关系统将GC-SPIO摄取到胰岛细胞中时，确认了根据开/关循环次数的GC-SPIO摄取量。
具体地，用GC-SPIO(20μg/ml)处理包括胰岛细胞和3ml RPMI(PBS 10％，PS 1％)培养基的35π皮氏培养皿，并且针对每个实验组，分别进行开/关循环0次(对照组)、4次、8次和12次。之后，通过细胞筛将胰岛细胞中未被摄取的GC-SPIO与胰岛细胞分离。接下来，根据示例2-2的方法，使用铁吸光度分析试剂盒进行分析。
通过分析，如图9所示，基于对照组，可以看出，当进行4次开/关循环时，GC-SPIO的摄取量没有显著差异，而当进行8次开/关循环时，GC-SPIO的摄取量增加了约2.9倍。相反，可以确认的是，当进行12次开/关循环时，GC-SPIO的摄取量增加了约3倍，这类似于当进行8次开/关循环时的情况。
因此，考虑到实验的效率，可以得出结论的是进行8次开/关循环是最佳的循环次数。
3-4.确认最佳开/关系统中胰岛细胞活力的变化
为了使移植的胰岛细胞长期维持血糖调节功能，需要长期维持胰岛细胞的活力。因此，确认了在本发明中确认的最佳开/关系统中已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞的活力。
具体地，用GC-SPIO(10或20μg/ml)处理包括胰岛细胞和3ml RPMI(PBS10％，PS1％)培养基的35π皮氏培养皿，进行8次开/关循环，然后将胰岛细胞培养1、3、5和7天。当培养完成后，通过CCK分析确认细胞活力。
结果，如图10所示，不能确认对照组(完整的胰岛细胞)和每个实验组之间的细胞存活率的显著差异。该结果意味着本发明的最佳开/关系统不会产生细胞毒性，因此，胰岛细胞可以在移植后沉降在肝组织中，并且可以充分存活直到实现胰岛素分泌功能。
示例4：SPIO确认已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞的作用
4-1.GC-SPIO对HMGB1蛋白释放的抑制作用
通过HMGB1 Elisa试剂盒(ELABSCIENCE，美国)确认从胰岛细胞释放的HMGB1蛋白的量。通过将实验组分为链脲佐菌素处理组和非处理组，然后将每个实验组再次分为对照组(Control)、SPIO处理组(Bare-SPIO)和GC-SPIO处理组(GC-SPIO)，来设计总共6个实验组。
首先，将200个胰岛当量(IEQ)胰岛细胞等分到96孔细胞培养板的每个孔中并进行培养，并在20μg/ml的最佳摄取条件下用开关系统的8个循环进行处理来将CC-SPIO摄取到胰岛细胞中。之后，加入1.5mM链脲佐菌素(Stz)以使HMGB1蛋白从胰岛细胞释放，并将细胞培养2小时。接下来，将试剂盒中包括的100μl有色溶液添加至每个孔，并且使混合物在摇动的同时在室温下反应30分钟。最后，将100ml终止溶液等分到每个孔中并轻轻摇动，并在1小时内在黑暗处测量450mm波长处的吸光度。
结果，如图11所示，确认的是，在对照组(C)和SPIO处理组(B)之间，HMGB1蛋白的释放量没有显著差异，但与对照组相比，GC-SPIO处理组中所释放的HMGB1蛋白显著降低，甚至当链脲佐菌素产生细胞应激时也表现出这种趋势。该结果意味着GC-SPIO能够有效抑制HMGB1蛋白的释放。
4-2.确认已递送了最大量的移植材料的肝叶
进行如下实验以确认在胰岛细胞移植过程中递送了最大量的胰岛细胞的肝叶。在以9:1的比例将舒泰和隆本注入balb/c小鼠的腹腔以麻醉它们之后，通过肝门静脉移植术注射亚甲基蓝溶液。等待约24小时进行亚甲基蓝溶液的组织固定后，处死小鼠分离所有肝叶。分离的肝叶用10％福尔马林溶液固定，制成石蜡块，切成5μm的厚度以制备组织切片载玻片。之后，从组织切片载玻片上除去石蜡，将载玻片再水化，然后用哈里斯苏木精溶液和曙红溶液对组织切片进行染色，并在光学显微镜下观察。
结果，如图12所示，可以确认，亚甲基蓝溶液在中间肝叶中的分布比在其他肝叶中的分布更多：尾、右前、右后。另外，通过基于图像J进行的定量分析，如图13所示，可以看出，在中间肝叶中亚甲基蓝溶液的分布最多，而在中间的叶中，亚甲基蓝溶液在中间1中的存在量最大。通过该结果可以看出，以中间肝叶为中心生成磁力对于提高胰岛细胞移植的成功率是有效的。
4-3.确认胰岛素信号
在最佳条件(8次循环，GC-SPIO浓度为20μg/ml)下将GC-SPIO摄取到胰岛细胞(700IEQ)中，将胰岛细胞注入balb/c小鼠(n＝4/实验组)，然后通过使磁铁从外部与小鼠肝脏的中间肝叶部位接触来生成磁力。24小时后，处死小鼠除去所有肝叶，并根据示例4-2制备肝叶切片载玻片，然后从其中除去石蜡。之后，将上述肝叶切片载玻片中的胰腺组织载玻片与胰岛素抗体(1:200稀释度，小鼠单克隆抗体；Abcam，美国)和20％山羊血清在4℃下反应过夜。第二天，将胰腺组织载玻片与二级抗体AlexaFluor 574山羊抗鼠抗体(1:1000稀释；Invitrogen，美国)在室温下以遮光状态反应1小时。之后，用PBS洗涤胰腺组织载玻片，用DAPI染色，并在荧光显微镜下观察。
结果，如图14所示，可以确认的是，在胰岛细胞移植后，在中间1上附着有钕磁铁以产生磁力感应作用的实验组(M(O),n＝5)中，观察到的胰岛素信号量比在中间1上未附着有钕磁铁以产生磁力感应作用的实验组(M(X),n＝5)中高得多。从该结果可以看出，通过磁力感应作用，在中间肝叶中诱导了大量已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞。
此外，通过基于图像J进行定量分析，如图15所示，可以确认的是，给予了磁感应作用的实验组(磁感应O)中的胰岛素信号比没有给予磁感应作用的实验组(磁感应X)中的胰岛素信号明显更高。通过取每个实验组的平均值，发现给予了磁感应作用的实验组的胰岛素信号被显示为每平方毫米3362个像素，而没有给予磁感应作用的实验组的胰岛素信号被显示为每平方毫米1117个像素。
4-4.用普鲁士蓝染色
为了确认示例4-3中确认的胰岛素信号是归因于balb/c小鼠原本拥有的自身胰岛细胞，还是归因于中间1中沉降的胰岛细胞所产生的且由磁力产生的信号，用普鲁士蓝染色。
在最佳条件(8次循环，GC-SPIO浓度为20μg/ml)下将GC-SPIO摄取到胰岛细胞(700IEQ)中，通过肝门静脉将胰岛细胞注射到balb/c小鼠(n＝3/实验组)中，然后通过使磁铁从外部与小鼠肝脏的中间肝叶部位接触来生成磁力。24小时后，处死小鼠除去所有肝叶，并根据示例4-2制备肝叶切片载玻片，然后从其中除去石蜡。之后，用染色溶液(4％亚铁氰化钾+4％盐酸)将肝叶载玻片染色两次，每次10分钟。之后，用三级蒸馏水洗涤肝叶载玻片两次，持续3分钟，浸入核速溶红溶液中，然后用石蜡膜覆盖。在用流水冲洗载玻片1分钟后，除去水分，并向其上滴加聚乙烯封片溶液，然后用盖玻片覆盖载玻片，并在光学显微镜下观察。
通过观察，如图16和图17所示，通过确认实验组(磁力感应O)与对照组(磁力感应X)相比染色明显，可以看出包括GC-SPIO的胰岛细胞有效地沉降在小鼠肝脏的中间肝叶中。
4-5.磁共振成像(MRI)成像
通过开关系统的8次循环将GC-SPIO(GC-SPIO的浓度为20μg/ml)摄取到胰岛细胞中，并将胰岛细胞注射到balb/c小鼠中，然后产生磁力。24小时后，分离并固定所有肝叶，将其置于皮氏培养皿中，并与1％琼脂糖凝胶混合以除去氧气引起的噪音。之后，通过3TSkyra MRI设备进行T2 MRI肝脏扫描。
结果，如图18所示，可以确认的是，与对照组(未注射GC-SPIO)相比，在产生了磁力的实验组(GC-SPIO和磁感应O)中，中间肝叶(M1和M2)显得更暗。另外，通过基于图像J进行定量分析，如图19所示，可以看出，在产生了磁力的实验组(GC-SPIO和磁力感应O)的中间肝叶(M1和M2)中，T2(阴性对比)信号显得很强。这意味着在肝脏的中间肝叶中诱导了大量的GC-SPIO，并且在肝脏的中间肝叶中存在已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞。同时，通过目前的结果，可以看出GC-SPIO也可以用作T2 MRI对比剂。
4-6.已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞对糖尿病的治疗作用
通过开关系统的8次循环将GC-SPIO(GC-SPIO的浓度为20μg/ml)摄取到胰岛细胞中，并将胰岛细胞注射到balb/c糖尿病模型小鼠中(700IEQ/小鼠)，然后产生磁力。胰岛细胞移植后2周，在糖尿病模型小鼠中测量血糖。
结果，如图20所示，可以确认的是，与作为对照组的未移植胰岛细胞的实验组(糖尿病)相比，糖尿病模型小鼠的血糖水平恢复到仅移植了胰岛细胞的实验组(完整的胰岛移植)、移植了已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞的实验组(GC-SPIO标记的胰岛移植)、以及移植了已经摄取了GC-SPIO+磁力感应的胰岛细胞的实验组(磁引导下GC-SPIO标记的胰岛移植)中的正常水平。具体地，可以看出，由于磁力感应，将胰岛细胞移植到肝脏的中间肝叶中的实验组的血糖水平也降低到正常水平。该结果意味着，即使当通过磁力将已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞移植到靶位时，也可以维持糖尿病治疗效果，并且除了糖尿病治疗效果以外，也可以通过部分切除肝脏轻松地将已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞从靶位(肝脏的中间肝叶)中除去。
从示例1至4的结果可以看出，本发明的GC-SPIO可以通过磁力感应被有效地摄取到胰岛细胞中，并且已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞可以通过磁力感应移动至期望的靶位。此外，可以看出，移动至靶位的已经摄取了GC-SPIO的胰岛细胞稳定地分泌胰岛素，因此可以用于糖尿病的治疗(图21)。

Claims (14)

1.一种用于移植胰岛细胞的组合物，包括包覆有生物相容性聚合物-甘草甜素共轭物的纳米粒子，其中所述生物相容性聚合物-甘草甜素共轭物通过共价键连接。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述甘草甜素是氧化形式。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述共价键选自由酰胺键、羰基键、酯键、硫酯键和磺酰胺键组成的组。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物相容性聚合物选自由乙二醇壳聚糖、多聚赖氨酸、聚(4-乙烯基吡啶/二乙烯基苯)、甲壳素、以胺基封端的聚(丁二烯/丙烯腈)、聚乙烯亚胺、聚苯胺，聚(乙二醇)双(2-氨乙基)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、乙烯胺均聚物、聚(2-乙烯基吡啶)、聚(2-乙烯基吡啶N-氧化物)、聚-ε-Cbz-L-赖氨酸、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、聚(烯丙胺)、聚(烯丙胺盐酸盐)、聚(N-甲基乙烯基胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、壳聚糖或聚(4-氨基苯乙烯)组成的组。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述纳米粒子是无机纳米粒子。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述无机纳米粒子是选自由铁、钴、镍、锰、钆、其氧化物或其合金组成的组的磁性纳米粒子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述生物相容性聚合物包括能够结合至纳米粒子的官能团。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述官能团为胺基、羧基、硫醇基或羟基。
9.一种用于缓解、预防或治疗胰岛细胞缺乏症的药物组合物，其包括胰岛细胞作为活性成分，所述胰岛细胞在细胞中包括权利要求1所述的组合物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述胰岛细胞缺乏症是选自由1型糖尿病、2型糖尿病和糖尿病性慢性肾脏病组成的组的疾病。
11.一种移植用胰岛细胞的制备方法，所述方法包括：(a)使权利要求1所述的用于移植胰岛细胞的组合物与从供体分离的胰岛细胞接触；(b)对所述胰岛细胞施加磁力0.1分钟至5分钟；以及(c)将(b)的所得产物混合0.1分钟至5分钟。
12.根据权利要求11所述的方法，还包括(d)：在步骤(c)之后，使所述胰岛细胞静置0.1分钟至5分钟。
13.根据权利要求12所述的方法，其中将步骤(b)至(d)重复1次至20次。
14.一种MRI成像组合物，其包括包覆有生物相容性聚合物-甘草甜素共轭物的纳米粒子，其中所述生物相容性聚合物-甘草甜素共轭物通过共价键连接。
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