WO2014030975A1 - 암세포의 내성을 억제한 탄소나노튜브 기반 항암제의 제조방법 - Google Patents

암세포의 내성을 억제한 탄소나노튜브 기반 항암제의 제조방법 Download PDF

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cancer
anticancer agent
carbon nanotubes
carbon nanotube
mwcnt
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강동우
강상수
최정일
남태현
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경상대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing an anticancer agent applying nanotechnology, and more specifically, to increase drug binding rate of a conventional covalent bond, carbon that can solve the side effect of the drug which has been pointed out as the biggest problem of the anticancer treatment process. It relates to a method for producing a nanotube-based anticancer agent.
  • Methods for treating cancer include treatment through surgery, radiation therapy and anticancer drug treatment, but these treatments are accompanied by side effects or the treatment is limited depending on the progress of the cancer.
  • the number of anticancer drugs has increased in quantitative terms, but there has been no significant change in quality. This is because most of the anticancer drugs act as a mechanism to stop and kill the cell cycle of the fission-prone cells, which in turn attacks the normally dividing cells in addition to the cancer cells, resulting in hair loss, loss of appetite and leukocytes. Lowering immunity occurs.
  • target anticancer drugs In order to minimize the side effects of anticancer drugs, the development of target anticancer drugs is actively taking place. To date, more than 18 target anticancer drugs have been developed and applied to clinical trials, and more than 200 are currently in clinical trials.
  • a target anticancer agent has a limitation in that it is effective even in the same type of cancer in a patient with a specific target, and the target therapeutic agent has a problem of causing resistance because it needs to be administered over a long period of time.
  • cocktail therapy that combines a targeted therapy with a powerful anticancer drug and a single drug that removes cancer in a short time by attacking multiple targets simultaneously.This also has the risk of causing serious side effects. It is implicated.
  • Carbon nanotubes have been applied in various biomedical fields, including imaging, cancer treatment, etc., due to their mechanical, visual, and chemical properties (Liu Z, et al., Nano Res. , 2:85) . , 2009; De La Zerda A, et al., Nat. Nanotechnol. , 3 (9): 557-62, 2008; Cherukuri P, et al., J. Am. Chem. Soc., 126 (48): 15638 -9, 2004; Welsher K., et al., Nano Lett. , 8 (2): 586-90, 2008; Zavaleta C, et al., Nano Lett. , 8 (9): 2800-5, 2008) .
  • Carbon nanotubes as drug carriers can be used as anticancer agents through endocytosis (Liu Z, et al., ACS Nano. , 1 (1): 50-6, 2007; Bianco A, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. , 9 (6): 674-9, 2005), plasmid DNA (Liu Y, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 44: 4782, 2005), and siRNA (small interfering RNA) (Kam NW, et al., J. Am. Chem. Soc. , 127 (36): 12492-3, 2005) to study in vitro transporters that effectively deliver a variety of biomolecules into cells It is becoming.
  • endocytosis Liu Z, et al., ACS Nano. , 1 (1): 50-6, 2007; Bianco A, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. , 9 (6): 674-9, 2005
  • anticancer drugs are bound to carbon nanotubes using pi bonds. This is because the ratio of anticancer drugs in which PI bonds are bonded to carbon nanotubes is significantly higher than that of covalent bonds, and the anticancer drugs are rapidly released from carbon nanotubes, thereby maximizing the effects of anticancer drugs in a short time.
  • the drug released from the carbon nanotubes can be rapidly pumped out of cancer cells when treating cancers resistant to anticancer drugs. It is unlikely to provide better anticancer effects.
  • anticancer agent is bonded to carbon nanotubes using a conventional covalent bond, it is difficult to expect sufficient drug efficacy due to low loading rate.
  • anticoagulants are not expected to be separated from carbon nanotubes in cancer cells due to strong covalent bonds, and the therapeutic effect is expected to be significantly lower.
  • the present invention is to solve the various problems including the above problems, while increasing the drug binding rate by covalent bonding to conventional carbon nanotubes, due to the strong binding force, rather slowly, continuously in the carbon cells carbon nanotubes It is an object of the present invention to provide a method for producing a carbon nanotube-based anticancer agent that can provide a sufficient anticancer effect even in a small amount by using the property released from the object.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • modifying the surface of the multi-walled carbon nanotubes with a carboxyl group (a) modifying the surface of the multi-walled carbon nanotubes with a carboxyl group; (b) binding the carboxylated multi-walled carbon nanotubes to an N- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) linker at a pH of 5.2 to 5.5; And (c) combining the EDC linker-coupled multi-walled carbon nanotubes with an anticancer agent at a pH of 5.9 to 6.2.
  • EDC N- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • the multi-walled carbon nanotubes may have a diameter of 5 to 50 nm, may have a length of 100 to 350 nm.
  • the surface of the multi-walled carbon nanotubes may be modified to have a 10 to 35% carboxyl group.
  • the anticancer agent may be covalently bound to the carboxylated multi-walled carbon nanotubes by EDC (N- (3-Dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride) linker.
  • EDC N- (3-Dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • the anticancer agent may be an amine compound, and the anticancer agent may be doxorubicin, epirubicin, adriamycin, adriamycin, cis-platin, mitomycin-C, or daunomycin. daunomycin).
  • the anticancer agent based on the multi-walled carbon nanotubes, 17% by weight, 18% by weight, 19% by weight, 20% by weight, 21% by weight, 22% by weight, 23% by weight, 24% by weight, 25% by weight, 26% by weight %, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, or 35% by weight, 17-35% by weight, Preferably it can be loaded at 23 to 35% by weight, more preferably 23 to 30% by weight, the loading amount depends on the degree of carboxyl group of the multi-walled carbon nanotubes and the drug binding method according to the pH control.
  • the present inventors confirmed that the anticancer agent-carbon nanotube covalent conjugate prepared through one embodiment of the present invention binds more strongly as the overall structure changes as the amount of the anticancer agent covalently bonded to the carbon nanotube increases ( 11 to 13). That is, the carbon nanotube-based anticancer agent according to the embodiment of the present invention increased the loading of the anticancer agent compared to the conventional covalent bond, and the increase of the loading causes an increase in the binding force between the carbon nanotube and the anticancer agent, When the anti-cancer agent-carbon nanotube covalent conjugate is introduced into the body, the dissociation rate between the anti-cancer agent and the carbon nanotube in the cancer cells decreases, releasing the anti-cancer agent very slowly and continuously, thereby improving the anti-cancer effect on cancer cells including anti-cancer drug-resistant cancer. It means you can maximize it.
  • EGF epidermal growth factor
  • the liver cancer, colon cancer, cervical cancer, kidney cancer, stomach cancer, prostate cancer, breast cancer, brain tumor, lung cancer, uterine cancer, colon cancer, bladder cancer, blood cancer and pancreatic cancer can be selected from the group consisting of. .
  • step (a) may incorporate the multi-walled carbon nanotubes into a strong acid solvent, and then introduce ultrasonic waves to introduce a carboxyl group to the surface.
  • the strong acid may be sulfuric acid, nitric acid, or a mixture thereof, and may be prepared using a solution in which sulfuric acid and nitric acid are mixed at a ratio of 3: 1 to 1: 3.
  • the ultrasonic treatment may be treated in an acid solution state, and the acid treatment and the ultrasonic treatment may be repeated one to three times.
  • step (b) is to disperse the carboxylated carbon nanotubes in MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) solution at room temperature, and then added NHS (N-hydroxysuccinimide) solution, and then subjected to ultrasonic treatment EDC linkers can be combined.
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the NHS solution and the EDC solution may be prepared using a MES solution (40-60 mM, pH 6.0-6.3) as a solvent, for example, based on 1 part by weight of the carboxylated carbon nanotubes, the MES solution (40 60 mM, pH 6.0-6.3) 0.1-1 part by weight, NHS solution (350-450 mM) 0.1-1 part by weight, and EDC solution (15-25 mM) may be prepared by adding 0.1-0.5 part by weight.
  • MES solution 40-60 mM, pH 6.0-6.3
  • NHS solution 350-450 mM
  • EDC solution 15-25 mM
  • step (c) may be stirred for 14-18 hours at 0 ⁇ 20 °C to bind the anticancer agent.
  • the anticancer agent may be bound to the carbon nanotubes even after stirring for a short time at a temperature exceeding 20 ° C., but the anticancer agent thus bound has a problem in that the binding force with the carbon nanotubes is very low.
  • the present invention has demonstrated that the above temperature and time conditions are the optimal conditions for strongly binding the drug to the carbon nanotubes.
  • the carbon nanotube-based anticancer agent according to the embodiment of the present invention has an increased binding force between the carbon nanotubes and the anticancer agent and a loading rate as compared with the conventional pi-pi bond.
  • the loading rate is increased by about 2 times.
  • the binding force between the carbon nanotubes and doxorubicin increases, which is confirmed through structural modification of the doxorubicin bound to the carbon nanotubes (see FIGS. 11 to 13).
  • carbon nanotube-based anticancer agents that increase the loading rate of anticancer agents using covalent bonds are released from carbon nanotubes continuously and continuously in cancer cells, and provide an anticancer effect against anticancer drug resistant cancers. It can provide this effect, reducing the toxic side effects of the cancer drug itself.
  • the anticancer agent may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition is preferably administered parenterally, in the case of parenteral administration, it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection and the like.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, patient's age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and reaction sensitivity. The skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis. According to a preferred embodiment of the invention, a suitable daily dosage is between 100 ⁇ g / kg and 1 mg / kg body weight. Administration may be once a day or may be divided several times over several weeks.
  • the pharmaceutical composition according to the embodiment of the present invention uses a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method that can be easily carried out by those skilled in the art to which the present invention belongs.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • composition according to an embodiment of the present invention may be administered in a dose of 100 ⁇ g / kg to 1 mg / kg which is much smaller than the general anticancer drug dosage of 5 mg / kg to 30 mg / kg, the dosage May be appropriately adjusted according to the age, sex and condition of the patient.
  • a cancer treatment method comprising the step of administering the above-described carbon nanotube-based anticancer agent to a subject with cancer.
  • the cancer may be liver cancer, colon cancer, cervical cancer, kidney cancer, gastric cancer, prostate cancer, breast cancer, brain tumor, lung cancer, uterine cancer, colon cancer, bladder cancer, blood cancer or pancreatic cancer.
  • the individual with cancer may be human or a mammal other than human.
  • the anticancer agent may be an amine-based compound, doxorubicin, epirubicin, adriamycin, adriamycin, cis-platin, mitomycin-C, or daunomycin ) And so on.
  • FIG. 1 is a schematic view (left) of an electron micrograph showing the surface of a carboxylated multi-walled carbon nanotube (right) and a covalent bond of doxorubicin to the carboxyl group of the carboxylated multi-walled carbon nanotube (left).
  • Figure 2 is a schematic diagram (bottom) showing the structural formula of the doxorubicin (top) and covalently bonded to the carbon nanotubes.
  • FIG. 3 is a transmission electron microscope photograph of doxorubicin covalently bonded to a multi-walled carbon nanotube.
  • FIG. 4 is an enlarged photograph of a doxorubicin coupled to carbon nanotubes by a high-resolution transmission electron microscope.
  • Figure 5 is a graph showing the distribution of particle size of doxorubicin, carboxylated multi-walled carbon nanotubes and doxorubicin covalently bonded multi-walled carbon nanotubes DOX-mwCNT-25.
  • 6 and 7 are graphs showing the results of confirming that the surface of the multi-walled carbon nanotubes were successfully carboxylated through FT-IR and TGA analysis, respectively.
  • FIG. 8 is a graph confirming covalent bonding of anticancer agents doxorubicin and epirubicin to carboxylated multiwalled carbon nanotubes (EDC-mwCNT-COOH) connected by EDC linker through UV-vis analysis.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of analyzing the binding of mwCNT and doxorubicin by fluorescence analysis.
  • 11 to 13 are graphs showing that the fluorescence pattern is changed according to the loading weight ratio of the drug in the carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 14 is a schematic diagram showing the tail vein injection of a carbon nanotube-based anticancer agent in a tumor model animal prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 15 shows the size of cancer cells according to elapsed time upon administration of mwCNT, pure doxorubicin (0.5 mg / kg and 5 mg / kg) and DOX-mwCNT-25 0.5 mg / kg according to an embodiment of the present invention in vivo. It is a graph showing magnification.
  • 16 shows tumor tissue collected from animals sacrificed after administration of mwCNT, pure doxorubicin (0.5 mg / kg and 5 mg / kg) and DOX-mwCNT-25 0.5 mg / kg according to an embodiment of the present invention in vivo. It is a graph showing the weight of.
  • Figure 17 shows animals sacrificed after administration of mwCNT, pure doxorubicin (0.5 mg / kg and 5 mg / kg) and 0.5 mg / kg of DOX-mwCNT-25 according to an embodiment of the present invention (top) and in vivo This is a picture of the tumor tissue (bottom) taken.
  • Figure 18 is a graph recording the body weight of animals after administration of mwCNT, pure doxorubicin (0.5 mg / kg and 5 mg / kg) and DOX-mwCNT-25 0.5 mg / kg according to an embodiment of the present invention in vivo.
  • Figure 19 shows tissues for tumor tissue collected after administration of mwCNT, pure doxorubicin (0.5 mg / kg and 5 mg / kg) and DOX-mwCNT-25 0.5 mg / kg according to an embodiment of the present invention in vivo.
  • the photograph shows the results of the analysis.
  • 20 is a graph showing the distribution of doxorubicin and DOX-mwCNT-25 in various tissues and tumor tissues 30 minutes after in vivo administration of doxorubicin and DOX-mwCNT-25 according to an embodiment of the present invention. .
  • 21 is a graph showing the distribution of doxorubicin and DOX-mwCNT-25 in various tissues and tumor tissues after 6 hours after in vivo administration of doxorubicin and DOX-mwCNT-25 according to an embodiment of the present invention. .
  • 22 is a graph showing the anticancer effect of EPI-mwCNT in lung cancer cells.
  • 23 is a graph showing the anticancer effect of DOX-mwCNT in lung cancer cells.
  • 24 is a graph showing the anticancer effect of DOX-mwCNT in breast cancer cells compared to doxorubicin single anticancer agent.
  • FIG. 25 is a graph confirming the degree of doxorubicin release from DOX-mwCNT-25 according to an embodiment of the present invention.
  • the drug was released twice ( Primary release: 6 hours, and secondary release: 50 hours).
  • 26 is a photograph and analysis graph comparing the degree of absorption of DOX-mwCNT-25 with doxorubicin drug after 2 hours of DOX-mwCNT-25 treatment according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 27 is treated with DOX-mwCNT-25 and DOX according to an embodiment of the present invention to breast cancer cells after 2 hours, drug removal of DOX-mwCNT-25 by time period (2 ⁇ 24 hours) after removing the drug (efflux) is a photograph and analysis graph comparing the degree to doxorubicin drug.
  • FIG. 28 shows prolonged delivery of DOX-mwCNT through endosomal vesicles and excretion nullification, fluorescence micrographs showing the excretion process by MDA-MB-231 cells for 2-24 hours upon pure doxorubicin treatment.
  • 29 is a graph confirming the non-efflux effect of the carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention by analyzing mRNA expression levels of Mrp-1 (drug pumping protein operating in cancer cells).
  • FIG. 30 is a photograph showing the results of analyzing the synthesis level of the MRP-1 protein by Western blot to confirm the non-efflux effect of the carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 31 shows rapid doxorubicin release upon late endosomal-lysosomal delivery under acidic lysosomal conditions
  • A is a fluorescence micrograph showing co-staining for doxorubicin (red) and late endosomes
  • C is high resolution image showing the diffusion (yellow) of doxorubicin from late endosomes (green) to nucleus (red)
  • D to F are tumor nuclei
  • G is an enlarged photograph showing the spread of doxorubicin from lysosomal vesicles
  • H is endo during late endosomal-lysosomal delivery.
  • FIG. 32 is a graph showing the results of analyzing the expression of cytokines and liver enzymes after administering DOX-mwCNT, a carbon nanotube-based anticancer agent, according to an embodiment of the present invention, to a tumor animal prepared by transplanting breast cancer cells to be.
  • Figure 34 is a photograph of the hematoxylin-eosin stained flakes of the liver tissue of Figure 33.
  • an effective amount means an amount sufficient to achieve the therapeutic efficacy of the present invention described above.
  • a “pharmaceutically acceptable carrier” is one commonly used in formulations, including carbohydrate compounds (eg, lactose, amylose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, cellulose, etc.), Acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, salt solutions, alcohols, gum arabic, vegetable oils (e.g. corn oil, cotton seed oil, Soymilk, olive oil, coconut oil), polyethylene glycol, methyl cellulose, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • carbohydrate compounds eg, lactose, amylose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, cellulose, etc.
  • Acacia rubber e.g. lactose, amylose, dex
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the present invention is a.
  • the production method according to an embodiment of the present invention has improved the low loading rate of the conventional covalent bonds by changing the pH at the time of EDC linker binding and anticancer agent binding, the anticancer agent is strongly bound by the conditions of the present invention is a single anticancer agent and Compared to the carbon nanotube-based anticancer agent prepared by using pi bond, it has been proved that the anticancer effect is remarkably excellent even in a small amount.
  • the pH change condition at the time of EDC linker binding and anticancer agent binding is to improve the method using only one pH selected from the conventional pH 5-7 range.
  • the pH of EDC linker can be stably bound is 4 ⁇ 6
  • the optimal pH at which the anticancer agent can bind to carbon nanotubes through EDC linker is 7 ⁇ 8.
  • the pH range weakens the binding of the EDC linker to the carbon nanotubes, and as a result, the anticancer agent cannot be stably bound to the carbon nanotubes.
  • the present inventors have optimized the two-step pH change conditions that can be both stable and strong binding of the EDC linker and the anticancer agent, and the experimental conditions of temperature, time that such binding can be maintained in practice.
  • the present inventors confirmed that the anticancer agent-carbon nanotube covalent conjugate prepared through one embodiment of the present invention binds more strongly as the overall structure changes as the amount of the anticancer agent covalently bonded to the carbon nanotube increases ( 1F-1I). That is, the carbon nanotube-based anticancer agent according to the embodiment of the present invention increased the loading of the anticancer agent compared to the conventional covalent bond, and the increase of the loading causes an increase in the binding force between the carbon nanotube and the anticancer agent, When the anti-cancer agent-carbon nanotube covalent conjugate is introduced into the body, the dissociation rate between the anti-cancer agent and the carbon nanotube in the cancer cells decreases, releasing the anti-cancer agent very slowly and continuously, thereby improving the anti-cancer effect on cancer cells including anti-cancer drug-resistant cancer. It means you can maximize it.
  • the manufacturing method according to an embodiment of the present invention by optimizing the conditions of the degree of carboxyl, pH change, compared to the conventional carbon nanotube-based anticancer drug using a covalent bond to increase the anticancer drug loading rate by about 2 times or more.
  • This increased loading rate is due to the strong binding force of the anticancer agent bound to the carbon nanotubes, consequently, as the anticancer agent is slowly discharged from the carbon nanotubes for a long time in the cancer cells, it can provide excellent anticancer effect even with the use of a small amount of anticancer agent, This may reduce the side effects of anticancer drugs. It also maximizes the therapeutic effect in anticancer drug resistant cancer cells that pump out anticancer drugs.
  • Example 1 Preparation of carbon nanotube based anticancer agent
  • Nanotubes are easily agglomerated by van der Waals attraction, which makes them difficult to disperse.
  • acids were used to oxidize the carbon atoms at the ends and defect sites of the carbon nanotubes.
  • a functional group such as a carboxylic group can be introduced.
  • a carboxyl group was introduced to the surface to prepare a carbon nanotube surface-functionalized.
  • Method for introducing a carboxyl group on the surface of the multi-walled carbon nanotubes (a) by incorporating carbon nanotubes in a strong acid solvent, chemically oxidizing the functional groups containing oxygen on the surface of the carbon nanotubes, and ( b) by ultrasonication in the acid solvent.
  • multi-wall canbon nanotubes (mwCNTs) were prepared using 20 mg of SES research products (lot NT-0140, catalog # 900-1351, Inc USA) with a diameter of 10-30 nm at 300 ° C.
  • the inventors then scraped the chemically functionalized mwCNT-COOH from the filter membrane using a medical scrap of stainless steel.
  • carboxyl residue (-COOH) was generated at the defect site of the surface of the nanotube.
  • Carboxylated modification of the defects of carbon nanotubes increases the solubility of carbon nanotubes in water or organic solvents.
  • EDC is a "zero-length cross-linker" used for protein binding.
  • the bond is completed by two successive reactions.
  • the EDC reacts with the carboxyl group to form an O-acylisourea intermediate reactant, and the intermediate reactant reacts with the amine group to generate a stable amide bond.
  • the O-acylisourea acid reactant is readily unstable and therefore hydrolyzed. Due to this instability, the coupling efficiency is very low. For this reason, NH- (N-hydroxysuccinimide) was added to convert the O-acylisourea acidic acid reactant to NHS ester to increase the stability of the acidic acid reactant, resulting in a 10 to 20-fold increase in binding efficiency.
  • MES buffer low moisture content ⁇ 99%, sigma-aldrich CAT: M3671
  • MES buffer low moisture content ⁇ 99%, sigma-aldrich CAT: M3671
  • MES buffer low moisture content ⁇ 99%, sigma-aldrich CAT: M3671
  • a tip sonicator company: Misonix sonicators, Product: sonicator 4000. Disperse for 5 minutes with a cycle of 3 seconds off.
  • the mixed solution was dispensed into a filter tube (Amicon YM-50, Millipore, USA), centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, washed at least three times with 50 mM MES buffer, and connected to carbon nanotubes (EDC- mwCNT) was prepared.
  • a filter tube Amicon YM-50, Millipore, USA
  • EDC- mwCNT carbon nanotubes
  • Carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention increased the binding rate of the anticancer agent compared to the conventional anticancer agent using a covalent bond.
  • the pH at the time of EDC linker binding and drug binding was adjusted. Among the pH 4-6 ranges where EDC linkers attach best, pH 5.5 was selected to induce binding of EDC linkers as much as possible.When binding drugs, the pH was increased to pH 6.1 to meet the conditions for maximizing drug loading, pH 7-8. Even if it was adjusted to a pH range that can inhibit the hydrolysis of EDC. This two changes in pH (pH 5.5 and 6.1) can lead to strong covalent bonds by maximizing drug loading while maintaining stable EDC linker binding.
  • Example 1-2 The EDC-mwCNT solution obtained in Example 1-2 was used as an anticancer agent, Doxorubicin (DOX) (Sigma-Aldrich, Cat # D1515) or epirubicin hydrochloride (Epirubicin hydrochloride, EPI) (Sigma-Aldrich, Cat # 9406), respectively.
  • DOX Doxorubicin
  • EPI epirubicin hydrochloride
  • the weight ratio of the drug and the carbon nanotubes were mixed at different ratios of 1: 4, 1: 2 and 1: 1, and the pH was adjusted to 6.1, followed by stirring at a platform shaker at 4 ° C. for at least 24 hours. .
  • the drug-bound EDC-mwCNT solution was centrifuged at 3,000 rpm for at least 3 hours using a filter tube (Amicon YM-50, Millipore, USA) to remove residual drug that failed to bind. Subsequently, the drug-loaded mwCNT (DOX-mwCNT, EPI-mwCNT) was dissolved in 5 ml of PBS and used for the following experiment.
  • EGF Sigma, E9644
  • DOX doxorubicin
  • EPI epirubicin hydrochloride
  • mwCNT covalently bound DOX-mwCNT, EPI-mwCNT
  • mwCNT loaded with drug and EGF Dox-EGF-mwCNT, EPI-EGF-mwCNT
  • EGF-linked doxorubicin (DOX-EGF) or epirubicin (EPI-EGF) was prepared by the same method as described in Examples 1-4, and the drug (doxorubicin or epirubicin): EGF mixed ratio of 5 It was: 1.
  • Carbon nanotube based anticancer agent of an embodiment of the present invention designation Abbreviation Multi-walled Carbon Nanotubes multi walled canbon nantobue mwCNT Doxorubicin doxorubicin DOX Epirubicin epirubicin EPI Carboxylated Carbon Nanotubes mwCNT-COOH mwCNT-COOH Carboxylated Carbon Nanotubes + EDC Linker EDC-mwCNT-COOH EDC-mwCNT Carboxylated Carbon Nanotubes + Anticancer Agent DOX-mwCNT-COOH DOX-mwCNT EPI-mwCNT-COOH EPI-mwCNT Carboxylated Carbon Nanotubes + EGF + Anticancer Agent DOX-EGF-mwCNT DOX-EGF-mwCNT EPI-EGF-mwCNT EPI-EGF-mwCNT EGF + Anticancer Drug DOX-EGF EPI-EGF EPI-EGF E
  • BALB / c nude mice (20 g, Laboratory Animal Lab., Gyeongsang National University) were temperature-controlled, and were bred under free-range conditions (6: 00-18: 00).
  • the present inventors photographed with a high-resolution transmission electron microscope (FE-TEM, JEM 2100F, Japan) operating at 200 kV to visualize the carboxyl group of the mwCNT-COOH prepared in Example 1-1 (Fig. 1). As a result, as shown in FIG. 1, it can be seen that the outer surface of mwCNT is not smooth and is rugged due to carboxylation. In addition, as a result of measuring the size based on the transmission electron microscope image, the diameter of the CWCNT-COOH was measured to about 30-50 nm. All mwCNT samples were diluted in ethanol and sonicated for 2 minutes and subjected to TEM imaging.
  • FIG. 3 schematically shows the appearance of doxorubicin linked to the mwCNT.
  • Chro-TEM freeze-transmission electron microscopy
  • F20 freeze-transmission electron microscopy
  • Tecnai freeze-transmission electron microscopy
  • the particle sizes of DOX, mwCNT-COOH and DOX-mwCNT measured using transmission electron microscopy were 0-40, 350-350 and 500-830 nm, respectively ( Figure 5), depending on the density prepared in PBS. It exhibited poly-dispersity between 0.1 and 0.5.
  • FT-IR Fourier Transform Infrared Spectroscopy
  • TGA Thermal Gravimetric Analysis
  • the anticancer agent was normally bound to the carboxylated carbon nanotubes of the manufacturing method of Example 1 through UV-vis (UV-Visible) absorption spectra, wherein the spectrometer (X-ma 3000 series, Human corporation, South Korea) ) was used.
  • the nano anticancer agent stored in PBS was diluted 10 to 30 times, and the UV-vis (UV-Visible) absorption spectrum in the solution state was measured by a spectrometer (X-ma 3000 series, Human corporation, South Korea).
  • a control for the mwCNT-COOH was used COOH-mwCNT that does not bind an anticancer agent.
  • the mass ratio of doxorubicin or epirubicin covalently bound on mwCNT was determined by the difference in absorption signal intensity between DOX-mwCNT or EPI-mwCNT and the mass density in solution was measured by the linear standard curve of DOX and mwCNT oxide.
  • a physically or non-specifically conjugated anticancer agent is carbon. Fluorescence of doxorubicin bound to the nanotubes was analyzed.
  • the anticancer agent that physically combines the carbon nanotubes and the anticancer agent means an anticancer drug that is mixed by combining the carbon nanotubes and the anticancer agent by simple pipetting, and the anticancer agent covalently coupled the carbon nanotubes and the anticancer agent in the same amount. Comparative analysis. In addition, doxorubicin single drug was used as a control for the entire experiment.
  • Fluorescence spectrophotometer (Luminescence spectrometer, Perkin Elmer) was used to analyze the degree of fluorescence emitted from doxorubicin by comparing the degree of structural change of the anticancer agent attached to the carbon nanomaterials with the binding method and binding degree. Since doxorubicin is a compound that fluoresces itself, the decrease in the intensity of fluorescence of doxorubicin means that the structural change occurred as the doxorubicin was strongly bound to carbon nanotubes.
  • doxorubicin single anticancer drug has a very high fluorescence
  • anti-cancer agent DOX-mwCNT, covalently conjugated
  • DOX physically coupled anticancer agent
  • doxorubicin it was observed that the intensity of fluorescence observed from covalently bonded carbon nanotubes was reduced by about 88% compared to the physically bound carbon nanotube based anticancer agents.
  • the fluorescence intensity of doxorubicin is 100%
  • the physically bound DOX-mwCNT shows about 6.3% fluorescence
  • the covalently bound DOX-mwCNT shows about 0.8% fluorescence and the fluorescence is greatly reduced. I could confirm that. Comparing the intensity of the fluorescence according to the binding method, when the physically bound DOX-mwCNT is viewed as 100%, the covalently bound DOX-mwCNT showed about 12% fluorescence.
  • This reduction in fluorescence intensity is due to the structural change of doxorubicin due to interference and strong covalent bonds by carbon nanotubes, and is strongly used for carbon nanotube-based anticancer agents prepared using covalent bonds according to an embodiment of the present invention. The results demonstrate that the anticancer agent is bound.
  • the tumor animal model prepared by transplanting MDA-MB-231 cells in Example 2 was randomly divided into 7 groups of 10 animals each, and then 0.5 mg / kg of DOX, mwCNT and DOX-mwCNT dissolved in PBS. 200 ⁇ l of -25 or pure PBS (negative control), respectively, were injected into the tail vein, weighed on days 2, 9 and 16, and weighed and tumor size was measured twice a week for 21 days. The volume of the tumor was then calculated by the formula:
  • V (volume) X (length ) x D (width) 2/2.
  • Figure 2a is a schematic diagram showing an experimental procedure of injecting the DOX-mwCNT prepared according to an embodiment of the present invention into the tail vein of a tumor model animal.
  • tumor size and volume after DOX-mwCNT-25 0.5 mg / kg treatment after three tail vein injections corresponded to those when treated with pure doxorubicin at 5 mg / kg.
  • 0.5 mg / kg of pure doxorubicin showed no significant tumor suppression.
  • tumor tissue was collected from the sacrificed mice and weighed. At this time, in order to compare the significance of each group, using the Prism (GraphPad Software, Inc.) was statistically treated with one-way ANOVA (analysis of variance) (** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001).
  • the size of the tumor tissue was reduced in the group administered doxorubicin and DOX-mwCNT-25, low dose (0.5 mg / kg) in the group administered the DOX-mwCNT-25
  • tumor tissue size was significantly reduced compared to the non-administered control group.
  • doxorubicin only a high dose (5 mg / kg) of the tumor tissue was significantly reduced in size compared to the control group.
  • FIGS. 16 and 17 comparing the size and shape of the tumor after separating the tumor from each experimental group. Similar to the graph of FIG. 16, the tumor size was decreased in the group administered with doxorubicin and a carbon nanotube-based anticancer agent, and a high dose of doxorubicin (5 mg / kg) and a low dose of anticancer drug based on carbon nanotubes (0.5) mg / kg) was similar in size and shape of tumors in the group administered (FIGS. 16 and 17).
  • the cancer cell killing effect caused by the administration of high dose of doxorubicin also appeared when a low dose of about 1/10 times of the carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention. Therefore, the toxic side effects of doxorubicin drug itself can be avoided, and an excellent anticancer effect can be expected.
  • the administration was performed for 24 days after administration of a carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention. Thereafter, the mixture was anesthetized with ethyl ether, sacrificed, and tumor tissue was collected. After weighing the collected tumor tissue, the collected tumor is fixed in 10% formalin for 24 hours, washed with running water, and then dehydrated in 70, 80, 90, 95, and 100% ethanol in order. It is then transparent with xylene, embedded with paraffin, made into slices of 5 ⁇ m thickness, placed on a glass slide glass, and hematoxylin and Eosin (H & E) stained. It carried out and observed with the optical microscope.
  • H & E hematoxylin and Eosin
  • DOX-mwCNT-25 according to an embodiment of the present invention was significantly superior to the cancer cell necrosis effect compared to the doxorubicin single drug in the low-dose group.
  • no damage to tumor tissue was observed in individuals treated with PBS or mwCNT only (FIG. 19).
  • the carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention is excellent in the anticancer effect on tumor cells, the toxicity of the drug itself compared to doxorubicin single drug Prove that you can lower the side effects.
  • tissue sample 100 mg was pulverized using a grinder with 0.5 ml of a buffer containing 0.25 M sucrose, 40 mM Tris Acetate, 10 mM EDTA, and then 0.2 ml of 0.1 ml of 10% Triton X- After adding 100, the mixture was vigorously mixed with a stirrer, 0.75 M hydrochloric acid was added to isopropanol, and left at ⁇ 20 ° C. for 15 hours, followed by extraction of doxorubicin. The extracted doxorubicin was measured with a plate reader to determine the content of each sample.
  • the inventors then carried out cell viability experiments using the drug in the concentration of the in vitro conditions corresponding to the concentration used in the above in vivo conditions. This is because the effective drug concentration in tumor tissue is dependent on the allocation rate from the bio-distribution in vivo. Only 1-2% of the dose reaches tumor tissue based on live-distribution after tail vein injection (FIGS. 20 and 21).
  • A549 cells (1 ⁇ 0 4 cells / well CAT: CRL-1658, company: ATCC) were cultured in 96 well plates, planted at a rate of 1 ⁇ 10 4 cells per well, and 10% fetal bovine serum (fetal). cultured in DMEM medium containing bovine serum (FBS). At this time, the incubator was kept in a humid state at a temperature of 37 °C under 5% CO 2 condition. The cells were incubated for 24 hours, respectively, and treated with mwCNT-COOH, EPI, EPI-EGF, EPI-mwCNT, and EPI-EGF-mwCNT at a rate of 0.086, 0.172, 0.345, 0.69, 1.38 ⁇ mol / L per well.
  • doxorubicin-containing drugs DOX-EGF, DOX-mwCNT-25, DOX-EGF-mwCNT
  • All conditions except the treatment drug were the same.
  • doxorubicin similar to the cancer cell killing effect of epirubicin, doxorubicin also showed the best lung cancer cell killing effect when bound to the carboxylated multi-walled carbon nanotubes according to an embodiment of the present invention (Fig. 23).
  • the present inventors confirmed the cancer cell killing effect of the carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention using a breast cancer cell line.
  • MDA-MB-231 cells (CAT: HTB-26; company: ATCC) were cultured in 96-well plates, planted at a rate of 3 ⁇ 10 5 cells per well, and 10% fetal bovine serum (FBS) Cultured in the included DMEM medium. At this time, the incubator was kept in a humid state at a temperature of 37 °C at 5% CO 2 condition, and the cells were incubated for 24 hours, respectively. Thereafter, mwCNT-COOH, DOX, and DOX-mwCNT-25 were treated at a rate of 100, 200, 400, 900, 1800, 3200) ng / ml per well, and further incubated for 48 hours.
  • FBS fetal bovine serum
  • MTT reagent 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • 100 ⁇ l of DMSO solution was added per well, and then the absorbance was measured at 560 nm using a microplate reader (Model 680, Bio-Rad).
  • the anticancer agent prepared using the carboxylated multiwall carbon nanotubes according to one embodiment of the present invention may provide an effect of treating doxorubicin single drug at a high dose even at a low dose. It also proved that it can be applied to various cancer cells.
  • epirubicin it means that it can be applied to various drugs having an amine group.
  • Drug release rate of the carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention is DOX-mwCNT concentration of 1 ⁇ g / ml in PBS (phosphate buffered saline; pH 7.0) and ABS (Acetate buffered saline; pH 5.0), respectively After thawing, shaking with a rocker in a 37 ° C. incubator and left for 1, 2, 5, 10, 24, 48, 72, 120, and 240 hours. Each time sample was filtered using Amicon ® Ultra Centrifugal Filters-50K Membrane (Millipore, Ireland) for 15 minutes at 15,000 rpm, followed by excitation at 470 nm using a plate reader and at 590 nm wavelength. Measured.
  • the result of comparing the release rate of the DOX-mwCNT in ABS and PBS after the DOX-mwCNT is administered in vivo it is delivered to the cell in a stable state from the carbon nanotubes in the cell Suggests that it can be released.
  • the degree of uptake and efflux into the cells of the carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention was observed according to treatment concentration and treatment time. At this time, a group treated with doxorubicin single drug was used as a control.
  • DOX-mwCNT-25 and doxorubicin After treating DOX-mwCNT-25 and doxorubicin according to an embodiment of the present invention to MDA-MB-231 breast cancer cells cultured in 24-well plates at a ratio of 1 ⁇ 10 4 cells per well at 12.5, 50, and 200 ng / ml, respectively. After 2 hours, the cells were fixed and observed with a 594 nm wavelength under a fluorescence microscope (FIG. 26). Since doxorubicin itself is a fluorescent substance, the amount of doxorubicin or DOX-mwCNT-25 absorbed into cells was determined by the intensity of fluorescence observed. In FIG. 26, the degree of intake into breast cancer cells according to the concentration of doxorubicin and the degree of efflux from breast cancer cells were compared. In the doxorubicin and DOX-mwCNT treatment group, the fluorescence intensity of doxorubicin increased in proportion to the treatment concentration, and no significant difference was observed between the groups (FIG.
  • DOX-mwCNT-25 and doxorubicin according to an embodiment of the present invention were treated at 100 ng / ml in MDA-MB-231 breast cancer cells cultured in 24-well plates at a ratio of 1 ⁇ 10 4 cells per well. After 2 hours of treatment with DOX-mwCNT-25 and doxorubicin, the culture medium was removed, washed three times with PBS, and the efflux of MDA-MB-231 breast cancer cells was removed for 24 hours by adding a medium without anticancer agent. Observation was carried out with FIG. 27. After removing doxorubicin from the culture medium in FIG.
  • carbon nanotube-based anticancer agent (DOX-mwCNT) according to an embodiment of the present invention is strongly bound to carbon nanotubes by covalent bonds, thereby nullifying efflux for anticancer drug resistance. And longer residence time in cells compared to a single anticancer agent, and demonstrates continuous release of the drug during the proliferation of cancer cells. That is, the anticancer agent to which carbon nanotubes are applied according to an embodiment of the present invention may increase the therapeutic effect of the anticancer agent even with a small amount, and may increase the maximized therapeutic effect even against cancers resistant to the anticancer agent. It means that there is.
  • the inventors performed a high magnification image analysis showing the degradation of the absorbed doxorubicin signal for 24 hours by simultaneously staining doxorubicin and late endosomal markers.
  • doxorubicin a high magnification image analysis showing the degradation of the absorbed doxorubicin signal for 24 hours by simultaneously staining doxorubicin and late endosomal markers.
  • FIG. 28A a result of fluorescence microscopy observation, late endosomes were hardly observed after complete removal of doxorubicin from the nucleus. Therefore, it can be seen that the late endosomes play the role of an external transporter of doxorubicin released from the nucleus.
  • late endosomal signaling was not reduced in the nuclei of cells treated with DOX-mwCNT-25 for 24 hours (FIG. 28B).
  • Mrp-1 multiple drug resistance protein 1
  • DOX-mwCNT or doxorubicin according to an embodiment of the present invention after planting MDA-MB-231 breast cancer cells known to express MRP1 in 6 well plates at a rate of 4x10 5 cells / well, and then doxorubicin and DOX-mwCNT 100 Treated with ng / ml for 2 hours.
  • carbon nanotubes were treated at the same time at 348 ng / ml.
  • Mrp-1 expression was continuously maintained in cells treated with a carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention, whereas in the case of doxorubicin, Mrp-1 after 6 hours of treatment. Expression decreased.
  • the present inventors have thus demonstrated that the endosomes play an important role in drug release of DOX-mwCNT-25 according to one embodiment of the present invention by simultaneously observing the endosomal marker and doxorubicin using a high resolution microscope ( A to G of FIG. 31.
  • 31A-G provide evidence for drug release during the endosomal-lysosomal phase, because doxorubicin is abundant in late endosomes, while lacking in lysosomes.
  • An enlarged photograph of the late endosomes can be seen in the nucleus of the doxorubicin from the late endosomes (Fig. 31C). This is the first evidence of doxorubicin release from nanoparticles surrounded by late endosomes.
  • Photographs of doxorubicin and lysosomes show that the approaching endosome (red: doxorubicin in early or late endosomes) and the lysosome (green) inward and outward with reduced doxorubicin in the vesicles are present at the same time. G to F) of FIG. 31.
  • the enlarged photograph can confirm the diffusion of doxorubicin from the lysosomal vesicles (G of FIG. 31).
  • the rich acid hydrolase that surrounds the nucleus and is surrounded by late endosomes and lysosomes is sufficient to cleave the amide bond between doxorubicin and mwCNT.
  • FIG. 31K schematically shows a delivery route of a drug covalently bound from carbon nanotubes through an endo-lysosomal pathway.
  • the group administered with the carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention was confirmed that the cytokine is secreted at a similar or lower level than the control group.
  • the stability of the carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention through the liver enzymes GOT and GPT levels.
  • mice BALB / c nude mice were intravenously injected with mwCNTs at 10 mg / kg once according to an embodiment of the present invention, and after 1, 4, and 12 weeks, mice were sacrificed. The sacrificed mice were opened and the organs were observed. As a result, the distribution of carbon nanotubes was concentrated in the lung and liver tissues. However, after 1, 4, and 12 weeks of intravenous injection, the mwCNT remaining amount of liver was observed to decrease (see FIG. 33).
  • liver tissue was fixed in 10% formalin for 24 hours, washed with running water, and then dehydrated in 70, 80, 90, 95, and 100% ethanol in turn. Thereafter, the mixture was transparent with xylene, paraffin embedded, sections were cut to a thickness of 5 ⁇ m, placed on a glass slide glass, and subjected to hematoxylin and eosin (H & E). Observation was carried out with an optical microscope.
  • the present invention is effective in administering a very small amount compared to a single anticancer agent while the anticancer agent covalently bound to the carbon nanotubes in cancer cells is gradually released from the carbon nanotubes, and does not cause toxicity by the carbon nanotubes or the anticancer agent.
  • a therapeutic effect can be expected for anticancer drug resistant cancer cells.
  • Carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention can provide a superior anticancer effect even with a trace amount of about 1/10 times that of a single doxorubicin single anticancer agent, which is a carbon nano enough to cause structural changes of doxorubicin This is because it is strongly bonded through the covalent bond with the tube and is released slowly for a long time.
  • the sustained release in cancer cells may solve the resistance problem of effluxing cancer cells' anticancer agents, and furthermore, the anticancer agents may be continuously released from the carbon nanotubes of the present invention at the time of proliferation and division of cancer cells. Released, can maximize anticancer effect.

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Abstract

본 발명은 암 내성을 극복할 수 있는 항암제를 제공하기 위하여, (a) 다중벽 탄소나노튜브의 표면을 카복실기로 개질시키는 단계; (b) 상기 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브를 pH 5.2~5.5의 조건에서 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride) 링커를 결합하는 단계; 및 (c) 상기 EDC 링커가 결합된 다중벽 탄소나노튜브를 pH 5.9~6.2의 조건에서 항암제와 결합시키는 단계를 포함하는, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 항암제를 제공한다.

Description

암세포의 내성을 억제한 탄소나노튜브 기반 항암제의 제조방법
본 발명은 나노기술을 적용한 항암제의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 종래의 공유결합의 약물 결합율을 증가시키면서, 항암치료 과정의 가장 큰 문제점으로 지적되어오던 약물 부작용을 해소할 수 있는 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법에 관한 것이다.
암을 치료하기 위한 방법으로는 수술을 통한 치료, 방사선 치료 그리고 항암제 투여를 통한 치료 등이 있으나 이러한 치료방법들은 부작용이 수반되거나, 암의 진행 정도에 따라 시술이 제한적으로 적용된다. 특히, 항암제는 거듭된 연구결과 양적인 측면에서는 그 종류가 늘었지만, 질적인 측면에서는 큰 변화가 없었다. 그 이유는 항암제 대부분이 분열이 왕성한 세포의 세포주기를 멈추게 하고 사멸케 하는 메커니즘으로 작동하기 때문이며, 이로 인해 암세포 이외에도 정상적으로 분열하는 세포를 공격해서 항암제의 대표적 부작용인 탈모, 식욕부진 그리고 백혈구 감소로 인한 면역력 저하 등이 일어난다.
항암제의 부작용을 최소화하기 위해 표적항암제의 개발이 활발히 일어나고 있으며, 현재까지 18종 이상의 표적항암제가 개발되어 임상에 적용되고 있으며, 200여종 이상이 임상실험 중이다. 하지만 이러한 표적항암제는 같은 종류의 암이라도 특정 표적인자가 나타난 환자에게 효과가 있다는 한계가 있으며, 표적치료제는 장기간에 걸쳐서 투여해야하기 때문에 내성을 유발하는 문제가 있다. 이를 보완하기 위해서 표적치료제를 기존의 강력한 항암제와 병합하는 칵테일 요법과 여러 표적인자를 동시에 공격함으로써, 단 시간에 암을 제거하는 단일약물을 사용하는 방법 등이 있는데, 이것 또한 심각한 부작용을 유발할 위험성을 내포하고 있다.
탄소나노튜브(carbon nanotubes)는 기계적, 시각적, 화학적 특성으로 인하여, 이미징(imaging), 암 치료 등을 포함한 다양한 생물의학 분야에서 적용되고 있다(Liu Z, et al., Nano Res., 2:85, 2009; De La Zerda A, et al., Nat. Nanotechnol., 3(9):557-62, 2008; Cherukuri P, et al., J. Am. Chem. Soc., 126(48):15638-9, 2004; Welsher K., et al., Nano Lett., 8(2):586-90, 2008; Zavaleta C, et al., Nano Lett., 8(9):2800-5, 2008). 약물전달체로서 탄소나노튜브는 세포내이입(endocytosis)을 통하여 항암제(Liu Z, et al., ACS Nano., 1(1):50-6, 2007; Bianco A, et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 9(6):674-9, 2005), 플라스미드 DNA(Liu Y, et al., .Angew. Chem. Int. Ed., 44:4782, 2005), 및 siRNA(small interfering RNA)(Kam NW, et al., J. Am. Chem. Soc., 127(36):12492-3, 2005)을 포함한 다양한 생체분자를 세포내로 효과적으로 전달하는, 시험관내(in vitro)전달체로 연구되고 있다. 종래의 탄소나노튜브를 이용한 약물전달체에 관한 기술 분야는 단일벽 탄소나노튜브(single wall carbon nanotube)을 이용하여 항암제를 전달하는 방법에 관한 연구가 대다수 이루어져왔다. 단일벽 탄소나노튜브의 표면을 PEG(polyethylene glycol)을 이용하여 코팅한 후, π-π 스태킹(stacking)을 이용하여 항암제를 로딩하는 방법이 주로 연구되어 있다(Liu et al, Angew. Chem. Int. Ed., 48:7668-7672, 2009; Liu et al, ACS. NANO., 1(1):50-56, 2007; Liu et al, J. Am. Chem. Soc., 129, 8438-8439, 2007).
종래의 탄소나노튜브를 이용한 항암제 분야는 대부분 파이 결합을 이용하여 항암제를 탄소나노튜브에 결합시켰다. 이는 공유결합에 비하여 파이 결합이 탄소나노튜브로 결합되는 항암제의 비율이 현저히 높고, 탄소나노튜브로부터 항암제가 빠르게 방출(release)되는 특성으로 단시간 내에 항암제의 효과를 극대화할 수 있기 때문이다. 그러나 상술한 특성으로 인하여 항암제에 대하여 내성이 있는 암을 치료하는 경우 탄소나노튜브로부터 방출되는 약물이 빠른 속도로 암 세포로부터 배출(pumping out)되는 결과를 초래하기 때문에, 나노기술이 적용되지 않은 항암제 보다 더 우수한 항암 효과를 제공한다고 보기 어렵다. 또한, 종래의 공유결합을 이용한 탄소나노튜브에 항암제를 결합하는 경우, 적재율이 낮아 충분한 약효를 기대하기 어려웠다. 또한 강력한 공유결합으로 인하여 암 세포 내에서 탄소나노튜브로부터 항암제가 분리되지 않을 것으로 예상되어 그 치료효과가 현저히 낮을 것으로 예상되어 왔다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 종래의 탄소나노튜브에 공유결합에 의한 약물 결합률을 증가시키면서, 강력한 결합력으로 인하여 오히려 암 세포내에서 서서히, 지속적으로 탄소나노튜브로부터 방출되는 특성을 이용하여 소량으로도 충분한 항암 효과를 제공할 수 있는 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조된 항암제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, (a) 다중벽 탄소나노튜브의 표면을 카복실기로 개질시키는 단계; (b) 상기 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브를 pH 5.2~5.5의 조건에서 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride) 링커를 결합하는 단계; 및 (c) 상기 EDC 링커가 결합된 다중벽 탄소나노튜브를 pH 5.9~6.2의 조건에서 항암제와 결합시키는 단계를 포함하는, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법이 제공된다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 다중벽 탄소나노튜브는 5 내지 50 nm의 직경을 가질 수 있으며, 100 내지 350 nm의 길이를 가질 수 있다.
또한, 상기 다중벽 탄소나노튜브의 표면은 10~35% 카복실기를 갖도록 개질될 수 있다.
또한, 상기 항암제는 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride) 링커에 의하여 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브에 공유적으로 결합될 수 있다. 상기 항암제는 상기 항암제는 아민 계열 화합물일 수 있으며, 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 시스-플라틴(cis-platin), 미토마이신-C 또는 다우노마이신(daunomycin)일 수 있다.
상기 항암제는 상기 다중벽 탄소나노튜브에 대하여, 17중량%, 18중량%, 19중량%, 20중량%, 21중량%, 22중량%, 23중량%, 24중량%, 25중량%, 26중량%, 27중량%, 28중량%, 29중량%, 30중량%, 31중량%, 32중량%, 33중량%, 34중량%, 또는 35중량%로 적재될 수 있고, 17~35 중량%, 바람직하게는 23~35중량%, 더욱 바람직하게는 23~30 중량%로 적재될 수 있고, 적재량은 다중벽 카본 나노튜브의 카복실기의 정도 및 pH 조절에 따른 약물 결합 방식에 의존한다. 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예를 통하여 제조된 항암제-탄소나노튜브 공유결합체는 탄소나노튜브에 공유결합된 항암제의 양이 증가함에 따라 전체적인 구조가 변화할 정도로 더욱 강력하게 결합함을 확인하였다(도 11 내지 도 13 참조). 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제는 종래의 공유결합에 비하여 항암제의 적재량을 증가시켰으며, 이러한 적재량의 증가는 탄소나노튜브와 항암제 사이의 결합력의 증가를 야기하고, 실제 항암제-탄소나노튜브 공유결합체가 체내에 도입되었을 때, 암세포 내에서 항암제와 탄소나노튜브 사이의 해리속도가 감소하여 항암제를 아주 서서히 지속적으로 방출시킴으로써, 항암제 내성 암을 포함한 암세포에 대한 항암효과를 극대화시킬 수 있음을 의미한다.
또한, 상기 제조방법에 있어서, 추가로 상피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF)를 포함할 수 있다. EGF 수용체는 폐암세포에서 과발현된다는 것이 알려져 있어, 이러한 특성을 이용하여 EGF를 포함하는 항암제를 암 조직으로 타겟팅될 수 있게 한다.
또한, 상기 제조방법에 있어서, 상기 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 단계 (a)는 다중벽 탄소나노튜브를 강산 용매에 혼입한 후, 초음파 처리하여 카복실기를 표면에 도입시킬 수 있다. 상기 강산은 황산, 질산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 황산과 질산이 3:1~1:3의 비율로 혼합된 용액을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 초음파 처리는 산 용액 상태에서 처리할 수 있으며, 이러한 산 처리와 초음파 처리 단계는 1회 내지 3회 반복할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 상온에서 MES(2-morpholinoethanesulfonic acid) 용액에 카복실화된 탄소나노튜브를 분산시킨 후, NHS(N-hydroxysuccinimide) 용액을 첨가하고, 초음파 처리를 수행하여 EDC링커를 결합시킬 수 있다. 상기 NHS 용액과 EDC 용액은 MES 용액(40~60 mM, pH 6.0~6.3)를 용매로 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어 상기 카복실화된 탄소나노튜브 1 중량부를 기준으로, MES 용액(40~60 mM, pH 6.0~6.3) 0.1~1 중량부, NHS 용액(350~450 mM) 0.1~1 중량부, 및 EDC 용액(15~25 mM) 0.1~0.5 중량부를 첨가하여 제조될 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 단계 (c)는 0~20℃에서 14~18시간 동안 교반하여 항암제를 결합시킬 수 있다. 20℃를 초과하는 온도에서 짧은 시간 동안 교반하여도 항암제는 탄소나노튜브에 결합될 수 있으나, 이렇게 결합된 항암제는 탄소나노튜브와의 결합력이 매우 낮다는 문제가 있다. 본 발명은 상술한 온도 및 시간 조건은 탄소나노튜브에 약물을 강력하게 결합시킬 수 있는 최적의 조건임을 증명하였다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 상술한 제조방법에 의하여 제조된, 탄소나노튜브 기반의 항암제가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제는 종래의 파이-파이 결합에 비하여 탄소나노튜브와 항암제 사이의 결합력이 증가되고, 적재율이 감소되었다. 그러나 종래의 공유결합을 이용한 탄소나노튜브 기반의 항암제에 비하여 적재율이 약 2배 정도 증가한 것을 특징으로 한다. 이러한 적재율의 증가에 따라, 탄소나노튜브와 독소루비신 사이의 결합력이 증가하며, 이는 탄소나노튜브에 결합된 독소루비신이 구조적으로 변형을 통해서 확인되었다(도 11 내지 도 13 참조). 즉, 공유결합을 이용하여 항암제의 적재율을 상승시킨 탄소나노튜브 기반의 항암제는 암 세포 내에서 서서히 지속적으로 탄소나노튜브로부터 방출되어 항암제 내성 암에 대한 항암효과를 제공하는 효과를 제공하며, 더불어 미량으로 이러한 효과를 제공할 수 있어 항암제 자체의 독성 부작용을 감소시킨다.
상기 항암제는 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 비경구로 투여되는 것이 바람직하고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 적합한 1일 투여량은, 100 μg/kg 내지 1 mg/kg(체중)이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 몇 주간 수회 나누어 투여할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 일 실시예에 따른 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 일반적인 항암제 투여량인 5 mg/kg ~ 30 mg/kg 보다 매우 미량인 100 μg/kg 내지 1 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 상술한 탄소나노튜브 기반의 항암제를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법이 제공된다.
상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 또는 췌장암일 수 있다.
상기 암에 걸린 개체는 인간 또는 인간을 제외한 포유동물일 수 있다.
또한, 상기 항암제는 아민 계열 화합물일 수 있으며, 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 시스-플라틴(cis-platin), 미토마이신-C 또는 다우노마이신(daunomycin) 등 일 수 있다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 암 세포 사멸효과 항암제의 독성 부작용을 감소시킨 탄소나노튜브 기반의 항암제를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1는 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브의 표면을 나타내는 전자현미경 사진(우측) 및 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브의 카복실기에 독소루비신이 공유결합되는 모습을 개략적으로 나타낸 개요도(좌측)이다.
도 2는 독소루비신의 구조식(상단) 및 탄소나노튜브에 공유결합된 모습을 도식적으로 나타낸 개요도(하단)이다.
도 3은 다중벽 탄소나노튜브에 공유결합된 독소루비신을 촬영한 투과 전자현미경 사진이다.
도 4는 고해상도 투과 전자현미경으로 탄소나노튜브에 결합된 독소루비신의 모습을 확대촬영한 사진이다.
도 5는 독소루비신, 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브 및 독소루비신이 공유결합된 다중벽 탄소나노튜브인 DOX-mwCNT-25의 입자 크기의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 6 및 도 7은 각각 FT-IR 및 TGA 분석을 통하여 다중벽 탄소나노튜브의 표면이 성공적으로 카복실화된 것을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 UV-vis 분석을 통하여 EDC 링커가 연결된 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브(EDC-mwCNT-COOH)에 항암제인 독소루비신과 에피루비신이 공유결합된 것을 확인한 그래프이다.
도 9는 에피루비신(EPI)이 mwCNT-COOH에 결합된 경우와 에피루비신과 EGF가 mwCNT에 결합된 경우의 UV-vis 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 mwCNT와 독소루비신의 결합여부를 형광분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11 내지 도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제에서 약물의 적재 중량비에 따라 형광 양상이 변화하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 종양 모델 동물에 탄소나노튜브 기반 항암제의 꼬리정맥 주사를 나타내는 개요도이다.
도 15는 생체 내 조건에서 mwCNT, 순수 독소루비신(0.5 mg/kg 및 5 mg/kg) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25 0.5 mg/kg 투여시 경과 시간에 따른 암세포의 크기의 배율을 나타내는 그래프이다.
도 16은 생체 내 조건에서 mwCNT, 순수 독소루비신(0.5 mg/kg 및 5 mg/kg) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25 0.5 mg/kg 투여후 희생된 동물에서 채취된 종양조직의 중량을 나타내는 그래프이다.
도 17은 생체 내 조건에서 mwCNT, 순수 독소루비신(0.5 mg/kg 및 5 mg/kg) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25 0.5 mg/kg 투여 후 희생된 동물(상단) 및 그로부터 채취된 종양조직(하단)을 촬영한 사진이다.
도 18은 생체 내 조건에서 mwCNT, 순수 독소루비신(0.5 mg/kg 및 5 mg/kg) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25 0.5 mg/kg 투여 후 동물들의 체중을 기록한 그래프이다.
도 19는 생체 내 조건에서 mwCNT, 순수 독소루비신(0.5 mg/kg 및 5 mg/kg) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25 0.5 mg/kg 투여 후, 채취된 종양조직에 대한 조직학적 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 20은 독소루비신과 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25의 생체 내 투여 후 30분 경과 후 상기 독소루비신 및 DOX-mwCNT-25의 다양한 조직 내 및 종양조직에서의 분포 정도를 확인한 그래프이다.
도 21은 독소루비신과 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25의 생체 내 투여 후 6시간 경과 후 상기 독소루비신 및 DOX-mwCNT-25의 다양한 조직 내 및 종양조직에서의 분포 정도를 확인한 그래프이다.
도 22는 EPI-mwCNT의 폐암 세포에서의 항암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 23은 DOX-mwCNT의 폐암 세포에서의 항암 효과를 나타내는 그래프이다.
도 24는 DOX-mwCNT의 유방암 세포에서의 항암 효과를 독소루비신 단일 항암제와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25로부터 독소루비신 방출 정도를 확인한 그래프로서 혈액(FBS, pH=7.2)및 세포 내부(ABS, pH=5)에서 2차례에 걸친 약물 방출(1차 방출: 6 시간, 및 2차 방출: 50시간)을 나타낸다.
도 26은 유방암 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25 처리 2시간 경과 후, DOX-mwCNT-25의 흡수정도를 독소루비신 약물과 비교한 사진과 분석 그래프이다.
도 27은 유방암 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25 및 DOX를 각각 처리하고 2시간 경과 후, 약물을 제거한 후 시간대 별로(2~24시간) DOX-mwCNT-25의 약물 배출(efflux) 정도를 독소루비신 약물과 비교한 사진과 분석 그래프이다.
도 28은 엔도좀 소포 및 배출 무력화(nullification)을 통해 DOX-mwCNT의 연장된 전달을 나타내는 것으로서, 순수한 독소루비신 처리시 2-24시간 동안 MDA-MB-231 세포에 의한 배출 과정을 보여주는 형광현미경 사진(A) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT 처리시 2-24시간 동안 MDA-MB-231 세포에 의한 배출이 억제되는 것을 나타내는 사진(B), 그리고 해당 기전의 차이를 설명하기 위한 개요도이다.
도 29는 Mrp-1(암세포에서 작동하는 약물 pumping 단백질) mRNA 발현 수준 분석을 통한 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제의 non-efflux 효과를 확인한 그래프이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제의 non-efflux 효과를 확인하기 위해 MRP-1 단백질의 합성 수준을 웨스턴블랏 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 31은 산성 리소좀 조건에서의 후기 엔도좀-리소좀 전달시 급격한 독소루비신 방출을 나타내며, A는 독소루비신(적색) 및 후기 엔도좀에 대한 공-염색을 나타내는 형광현미경 사진이고, B는 종양 핵으로 접근하는 후기 엔도좀과 핵으로부터 병합된 후기 엔도좀 소포를 보여주는 확대사진이며, C는 후기 엔도좀(녹색)으로부터 핵(적색)로의 독소루비신의 확산(황색)을 나타내는 고해상도 사진이고, D 내지 F는 종양 핵을 둘러싸서 직접적으로 중첩이 되는 독소루비신(적색) 및 리소좀(녹색)을 보여주는 공-염색 사진이며, G는 리소좀 소포로부터 독소루비신의 확산을 보여주는 확대된 사진이고, H는 후기 엔도좀-리소좀 전달시 엔도리조좀 단계에서의 급격한 약물 방출을 설명하기 위한 개요도이며, I는 다른 pH(pH 5 및 7.2), FBS, 및 리소좀(1 mg/ml 농도)의 다른 pH에서의 약물 방출을 나타내는 그래프이다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제인 DOX-mwCNT를 유방암 세포를 이식하여 제조한 종양동물에 투여한 후, 사이토카인 및 간 효소의 발현을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 33은 탄소나노튜브를 정상 마우스에 투여한 후, 간 클리어런스(clearance)를 확인하기 위한 간 조직 사진이다.
도 34는 상기 도 33의 간 조직의 박편을 헤마톡살린-에오신 염색한 사진이다.
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 “유효량”은 상술한 본 발명의 치료 효능을 발휘하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 “약제학적으로 허용되는 담체”는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
(a) 다중벽 탄소나노튜브의 표면을 카복실기로 개질시키는 단계;
(b) 상기 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브를 pH 5.2~5.5의 조건에서 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride) 링커를 결합하는 단계; 및
(c) 상기 EDC 링커가 결합된 다중벽 탄소나노튜브를 pH 5.9~6.2의 조건에서 항암제와 결합시키는 단계를 포함하는, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법은 종래의 공유결합의 낮은 적재율을 EDC 링커 결합과 항암제 결합시의 pH를 변화시킴으로써 개선하였으며, 이러한 본 발명의 조건에 의하여 항암제가 강력하게 결합되어 단일 항암제 및 파이 결합을 이용하여 제조된 탄소나노튜브 기반의 항암제에 비하여 소량으로도 현저히 우수한 항암 효과가 있음을 입증하였다.
우선, 본 발명의 일 실시예에 따른 EDC 링커 결합 및 항암제 결합시의 pH 변화 조건은 종래의 pH 5~7 범위 내에서 선택되는 하나의 pH 만을 이용하는 방법을 개량한 것이다. 일반적으로 탄소나노튜브에 EDC 링커를 결합시키는 pH 조건과 항암제를 결합시키는 pH 조건을 동일하게 적용하여 나노기술이 적용된 항암제를 제조하였다. 그러나 EDC 링커가 안정적으로 결합할 수 있는 pH는 4~6인 반면, 항암제가 EDC 링커를 통하여 탄소나노튜브에 결합할 수 있는 최적의 pH는 7~8이기 때문에, 항암제가 탄소나노튜브에 결합되는 pH 범위는 EDC 링커와 탄소나노튜브의 결합을 약화시켜, 결과적으로 항암제가 탄소나노튜브에 안정적으로 적정량이 결합될 수 없도록 한다. 이에, 본 발명자는 EDC 링커와 항암제가 모두 안정적이면서 강력하게 결합될 수 있는 2 단계의 pH 변화 조건 및 이러한 결합이 실제로 강력하게 유지될 수 있는 온도, 시간의 실험조건을 최적화하였다.
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예를 통하여 제조된 항암제-탄소나노튜브 공유결합체는 탄소나노튜브에 공유결합된 항암제의 양이 증가함에 따라 전체적인 구조가 변화할 정도로 더욱 강력하게 결합함을 확인하였다(도 1f 내지 도 1i 참조). 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제는 종래의 공유결합에 비하여 항암제의 적재량을 증가시켰으며, 이러한 적재량의 증가는 탄소나노튜브와 항암제 사이의 결합력의 증가를 야기하고, 실제 항암제-탄소나노튜브 공유결합체가 체내에 도입되었을 때, 암세포 내에서 항암제와 탄소나노튜브 사이의 해리속도가 감소하여 항암제를 아주 서서히 지속적으로 방출시킴으로써, 항암제 내성 암을 포함한 암세포에 대한 항암효과를 극대화시킬 수 있음을 의미한다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법은 카복실 정도, pH 변화의 조건을 최적화함으로써, 종래의 공유결합을 이용한 탄소나노튜브 기반의 항암제에 비하여 항암제 적재율을 약 2배 이상 증가시켰다. 이러한 증가한 적재율은 강력한 결합력으로 항암제가 탄소나노튜브에 결합됨으로써, 결론적으로 암 세포 내에서 장시간에 서서히 탄소나노튜브로부터 항암제가 배출됨에 따라, 미량의 항암제 사용으로도 우수한 항암 효과를 제공할 수 있으며, 이에 따른 항암제 부작용을 저하시킬 수 있다. 또한, 항암제를 펌핑(pumping out)하는 항암제 내성 암 세포에서 치료효과를 극대화시킨다. 이는 종래의 과량의 항암제 투여 부작용을 개선할 수 있게 하며, 파이결합을 이용하여 제조된 탄소나노튜브 기반의 항암제의 항암제 내성 암 세포에 대한 낮은 치료 효과를 극복할 수 있게 한다. 아울러, 장시간 동안 항암제가 암 세포내에 머물면서 지속적으로 배출되기 때문에, 암 세포의 분열 및 증식 시기에 효과적으로 항암 효과를 발휘할 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 탄소나노튜브 기반 항암제의 제조
1-1: 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브의 제조(mwCNT-COOH)
나노 튜브는 반더발스인력(van der Waals attraction)에 의하여 쉽게 응집되는 특성이 있어, 분산시키기 어려운 문제가 있다. 이에, 탄소 나노튜브의 말단 및 결함부위(defect sites)의 탄소 원자를 산화시키기 위하여 산(acid)을 이용하였다. 산 용매를 이용하여 산소를 함유하는 작용기를 탄소나노튜브의 표면에 산화시킴으로써, 카복실기(carboxylic group)와 같은 작용기를 도입할 수 있다. 상기와 같이 카복실기가 표면에 도입되어, 표면 기능화(surface functionalization)된 탄소나노튜브를 하기와 같이 제조하였다.
상기 다중벽 탄소나노튜브의 표면에 카복실기를 도입하는 방법은 (a)강산 용매에 탄소나노튜브를 혼입하여, 산소를 함유하는 작용기를 탄소나노튜브의 표면에 화학적으로 산화시켜 도입하는 단계, 및 (b)상기 산 용매 중에서 초음파 처리하는 단계를 통하여 수행되었다. 구체적으로, 다중벽 탄소나노튜브(multi-wall canbon nanotube, mwCNT)는 직경이 10-30 nm 범위인 SES research 제품(lot NT-0140, catalog # 900-1351, Inc USA) 20 mg을 300℃에서 3시간 동안 전-열처리하여 기포 및 오염물을 제거한 후 H2SO4(98%) 9 ㎖과 HNO3(65%) 3 ㎖을 3:1의 부피비율로 혼합한 후, 수조에서 99분간 동안 초음파처리(sonicate)하고, 자석교반기로 50℃에서 36시간 동안 교반하였다. 그 다음, 상기 용액을 15분 동안 재차 초음파처리하고 100 μm 크기의 망으로 여과한 후, 탈이온화수로 희석하고(1:200 v/v) 200 nm 공극을 가진 PTFE 여과지(Millipore, USA)로 여과하였고, 잔류 용매를 제거하기 위해 수차례 세척하였다. 최종적으로 생성된 mwCNT를 60℃의 진공 오븐에서 건조하였다.
그 후, 본 발명자들은 상기 화학적으로 기능화된 mwCNT-COOH를 스테인레스 철 재질의 의료용 스크레이브(scrape)를 이용하여 상기 필터 멤브레인에서 긁어냈다. 상술한 실험 단계를 통하여 나노튜브의 표면의 결함 위치(defect site)에 카복실 잔기(-COOH)가 생성되었다. 탄소나노튜브의 결함부위를 카복실화시키는 변형은 물 또는 유기용매 내에서 탄소 나노튜브의 용해성을 증가시킨다.
1-2: EDC 링커가 연결된 다중벽 탄소나노튜브의 제조(EDC-mwCNT-COOH)
EDC는 단백질 결합에 사용되는 "zero-length cross-linker"이다. 상기 결합은 연속된 2개의 반응에 의하여 완성된다. 우선 EDC는 카복실기와 반응하여 O-acylisourea 중간 반응물을 생성하고, 상기 중간 반응물은 아민기와 반응하여 안정적인 아마이드(amide)결합을 생성하게 된다. 그러나 상기 O-acylisourea 중산 반응물은 매우 불안정하기 때문에 쉽게 가수분해된다. 이러한 불안정성으로 인하여 결합 효율이 매우 낮다. 이러한 이유로 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 첨가하여 O-acylisourea 중산 반응물을 NHS 에스테르(ester)로 변환시켜 중산 반응물의 안정성을 증가시켰으며, 결과적으로 결합 효율이 10~20배 증가되었다.
구체적으로, mwCNT-COOH에 EDC 링커를 결합시키는 반응은 약 산성을 띠는 MES 버퍼(2-morpholinoethanesulfonic acid)내에서 수행하였다. MES 버퍼(low moisture content≥99%, sigma-aldrich CAT: M3671)는 용액의 pH를 조절하기 위하여 사용하였다. 우선, 3.2 mg의 mwCNT-COOH를 1.6 ㎖의 MES 버퍼(50 mM, pH 5.5)에 넣은 후, 팁 소니케이터(tip sonicator)(company: Misonix sonicators, Product: sonicator 4000)를 이용하여 3초 on/3초 off의 주기로 5분 동안 분산시켰다. 그 후, MES 버퍼(50 mM, pH 5.5)에 용해된 400 mM NHS(N-hydroxysuccinimide, Sigma)를 혼합한 용액을 상기 카르복실화된 mwCNT 용액에 첨가한 후, 30분 동안 볼텍스로 교반하였다. 그 후, MES 버터에 용해된 300 mM의 EDC 용액N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride, Sigma)을 상기 초음파 처리 용액에 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 상기 혼합 용액을 필터튜브(Amicon YM-50, Millipore, USA)로 분주한 후, 3000 rpm으로 10분간 원심분리하고, 적어도 세 번 50 mM MES 버퍼로 세척하여 EDC 링커가 연결된 탄소나노튜브(EDC-mwCNT)를 제조하였다.
1-3: 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조
본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제는 종래의 공유결합을 이용한 항암제에 비하여 항암제의 결합율이 증가되었다. 종래의 기술에 비하여 항암제의 결합율을 증가시키기 위하여, EDC 링커 결합과 약물 결합시의 pH를 조절하였다. EDC 링커가 가장 잘 붙는 조건인 pH 4-6 범위 가운데, pH 5.5를 선택하여 EDC 링커를 최대한 결합유도 하였고, 약물을 결합시킬 때에는 pH 6.1로 상향시켜 약물 적재 최대화 조건인 pH 7-8을 충족하진 못하여도 EDC의 중성화(hydrolysis)를 억제할 수 있는 pH 범위로 조절하였다. 이렇게 2 번에 걸친 pH(pH 5.5 및 6.1)의 변화는 EDC 링커 결합을 안정적으로 유지하는 동시에 약물의 적재를 최대화함으로서 강력한 공유결합을 유도할 수 있다.
구체적으로, 상술한 바와 같이 EDC 링커가 안정적으로 결합되면서 약물의 적재를 증가시키기 위해서는 하기와 같이 실험을 수행하였다. 상기 실시예 1-2로부터 수득한 EDC-mwCNT 용액을 항암제인 독소루비신(Doxorubicin, DOX)(Sigma-Aldrich, Cat#D1515) 또는 에피루비신 하이드로클로라이드(epirubicin hydrochloride, EPI)(Sigma-Aldrich, Cat#9406)와 각각 혼합하였다. 상기 약물과 탄소나노튜브의 중량비율은 1:4, 1:2 및 1:1로 달리하여 혼합시키고, pH를 6.1로 조장한 후, 플랫폼 교반기(platform shaker)로 4℃에서 적어도 24시간 교반시켰다. 교반 후, 약물과 결합된 EDC-mwCNT 용액을 필터 튜브(Amicon YM-50, Millipore, USA)를 이용하여 3,000 rpm으로 3시간 이상 원심분리를 수행하여 결합하지 못한 잔여 약물을 제거하였다. 그 후, 약물이 로딩된 mwCNT(DOX-mwCNT, EPI-mwCNT)는 PBS 5 ㎖에 녹여서, 하기 실험에 사용하였다.
1-4: 약물 및 EGF가 로딩된 mwCNT의 제조
상기 실시예 1-2로부터 수득한 EDC-mwCNT 용액을 EGF(Sigma, E9644)와 독소루비신(DOX)또는 에피루비신 하이드로클로라이드(EPI)을 혼합하였다. 이때, 혼합 비율은 EDC-mwCNT：약물(독소루비신 또는 에피루비신): EGF=5:5:1 이다. 그 후, 플랫폼 교반기(platform shaker)에서 14~18시간 동안 4℃에서 교반시켰다. 교반 후, 약물 또는 약물과 EGF가 로딩된 EDC-mwCNT 용액은 센트리콘 YM-50 필터 튜브를 이용하여 2,000 rpm에서 원심분리를 수행하여, 상층액을 제거함으로써 결합하지 못한 잔여 약물을 제거하였다. 그 후, 약물이 공유결합된 mwCNT(DOX-mwCNT, EPI-mwCNT)또는 약물과 EGF가 로딩된 mwCNT(Dox-EGF-mwCNT, EPI-EGF-mwCNT)는 PBS 5 ㎖에 녹였다.
1-5: 약물과 EGF가 결합된 조성물의 제조
EGF가 연결된 독소루비신(DOX-EGF)또는 에피루비신(EPI-EGF)는 상기 실시예 1-4에 기재된 방법과 동일한 방법으로 제조되었으며, 약물(독소루비신 또는 에피루비신): EGF의 혼합비율은 5:1이었다.
표 1 본 발명의 일 실시예의 탄소나노튜브 기반의 항암제
명칭 약칭
다중벽 탄소나노튜브 multi walled canbon nantobue mwCNT
독소루비신 doxorubicin DOX
에피루비신 epirubicin EPI
카복실화된 탄소나노튜브 mwCNT-COOH mwCNT-COOH
카복실화된 탄소나노튜브 + EDC 링커 EDC-mwCNT-COOH EDC-mwCNT
카복실화된 탄소나노튜브+항암제 DOX-mwCNT-COOH DOX-mwCNT
EPI-mwCNT-COOH EPI-mwCNT
카복실화된 탄소나노튜브+ EGF+항암제 DOX-EGF-mwCNT DOX-EGF-mwCNT
EPI-EGF-mwCNT EPI-EGF-mwCNT
EGF + 항암제 DOX-EGF
EPI-EGF
실시예 2: 종양 동물모델의 제조
암컷(n=15)BALB/c 누드 마우스(20 g, 경상대학교 의학전문대학원 실험동물실)는 온도가 조절되며, 명주기(6:00-18:00), 자유식이 조건에서 사육하였다.
종양 동물모델을 제조하기 위하여, 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포를 왼쪽 등 부위에 5 X 106개씩 이식하였다. 이식 후, 2 주가 경과한 후, 종양의 부피가 평균 100 mm3에 도달했을 때, 하기 실험예에 사용하였다.
실험예 1: 탄소나노튜브 기반의 항암제의 특성확인
1-1: 탄소나노튜브 및 탄소나노튜브 기반 항암제의 시각화
본 발명자들은 상기 실시예 1-1에서 제조된 mwCNT-COOH의 카복실기를 시각화하기 위해 카르복실기는 200 kV로 작동하는 고해상도 투과 전자현미경(FE-TEM, JEM 2100F, Japan)으로 촬영하였다(도 1). 그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, mwCNT의 바깥쪽 표면이 매끈하지 않고 카르복실화에 의해 울퉁불퉁한 것을 알 수가 있다. 아울러 상기 투과 전자현미경 이미지를 바탕으로 크기를 측정한 결과, 상기 CWCNT-COOH의 직경은 30-50 nm 정도로 측정하였다. 모든 mwCNT 시료는 에탄올에 희석한 후 2분간 초음파처리하고 TEM 촬영을 수행하였다.
도 2는 mwCNT 상에 연결된 독소루비신의 모습은 개략적으로 표현한 것이다. 본 발명자들은 mwCNT에 공유결합된 약물을 시각화하기 위해, mwCNT 상에 연결된 독소루비신을 위해 동결-투과 전자현미경(Cryo-TEM, F20, Tecnai)를 이용하여 시각화하였다(도 3). 그 결과 도 3에 나타난 바와 같이 최초로 탄소나노튜브에 공유결합된 독소루비신을 촬영하는데 성공하였다. 더 나아가 본 발명자들은 독소루비신의 보다 정확한 모습을 시각화하기 위해 고해상도 투과 전자현미경(FE-TEM, JEM 2100F, Japan)을 이용하였다(도 4). 그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 독소루비신은 달걀 모양을 나타내고 있었다.
투과 전자현미경을 이용하여 측정된 DOX, mwCNT-COOH 및 DOX-mwCNT의 입자 크기는 각각 0-40, 350-350 및 500-830 nm로 나타났으며(도 5), PBS에서의 준비된 밀도에 따라 0.1 및 0.5 사이의 다중-분산성(poly-dispersity)을 나타냈다.
1-2: FT-IR 분석을 통한 탄소나노튜브의 카복실화 확인
다중벽 탄소나노튜브의 카복실화를 확인하기 위하여 FT-IR(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 카복실화된 mwCNT의 경우(mwCNT-COOH)의 스펙트럼은 적외선 파수에서 피크를 나타냈으며, 구체적으로 1580과 1710 파수(wave number, cm-1)부근에서 -C-C=O- 결합과 -C=O- 결합에 해당하는 피크가 관찰되었다. 이러한 결과는 카복실기가 mwCNT의 표면에 성공적으로 부착되었음을 입증하는 것이다. 반면, 카복실화 처리를 하지 않은 mwCNT의 스펙트럼에서는 적외선 흡수가 매우 낮게 나타남으로써, -C-C=O- 결합과 -C=O- 결합이 존재하지 않음을 확인할 수 있었다(도 1f 참조).
1-3: TGA 분석을 통한 탄소나노튜브의 카복실화 확인
다중벽 탄소나노튜브의 카복실화를 확인하기 위하여 열분석(Thermal Gravimetric Analysis; TGA)을 수행하였다. 구체적으로, TGA 분석을 수행하기 전에 카복실화하지 않은 다중벽 탄소나노튜브(mwCNT)와 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브(mwCNT-COOH)를 60℃, 진공상태에서 가열하여 수분을 완전히 증발시킨 후, TGA 분석을 수행하였다. 상기 TGA 분석은 Q50 TGA(TA, USA)기기를 이용하여, 10℃/분, N2=100 ㎖/분의 조건에서 수행되었다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, mwCNT-COOH는 카복실화하지 않은 mwCNT에 비하여 약 35% 정도 무게가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 mwCNT의 기능화된 사이드 체인(functional side chain)의 소실에 의한 것으로 파악되었다. 역으로, mwCNT의 카복실화 정도는 소실된 무게의 정도라고 할 수 있다(도 7 참조).
1-4: UV-vis 분석을 이용한 탄소나노튜브와 항암제의 결합 확인
상기 실시예 1의 제조방법의 카복실화된 탄소나노튜브에 항암제가 정상적으로 결합여부를 UV-vis(UV-Visible) 흡수 스펙트럼을 통하여 확인하였으며, 이때 분광계(X-ma 3000 series, Human corporation, South Korea)를 이용하였다.
구체적으로, 카본나노튜브에 적재된 항암용량을 측정하기 위하여 PBS에 저장된 나노 항암제를 10~30배 정도 희석하여 용액 상태에서 UV-vis(UV-Visible)흡수 스펙트럼은 분광계(X-ma 3000 series, Human corporation, South Korea)를 이용하여 측정하였다. 상기 mwCNT-COOH에 대한 대조군으로 항암제를 결합하지 않은 COOH-mwCNT를 이용하였다.
그 결과, 도 8 및 9에 나타난 바와 같이, 독소루비신과 에피루비신과 같은 상기 약물이 결합된 나노항암제는 약 490 nm에서 피크가 관찰되었다. 이러한 결과는 약물이 탄소나노튜브에 성공적으로 결합되었음을 의미한다.
한편, mwCNT 상에 공유결합된 독소루비신 또는 에피루비신의 질량비율은 DOX-mwCNT 또는 EPI-mwCNT 사이의 흡수 신호강도의 차이로 결정하였고 용액에서의 질량 밀도는 DOX 및 산화 mwCNT의 선형 표준곡선으로 측정하였다.
또한, 도 9에 나타난 바와 같이, EGF가 추가적으로 결합된 EGF-EPI-mwCNT도 약 490 nm 부근에서 피크가 감소된 것을 감안한다면 일정량의 EGF가 탄소나노튜브에 약물과 함께 결합된 것을 확인할 수 있었다(도 9 참조).
1-5: 탄소나노튜브와 독소루비신 항암 약물의 결합력 측정
본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제에 있어서, 공유결합에 의한 탄소나노튜브와 항암 약물의 결합 정도를 관찰하기 위하여, 물리적으로 결합시킨(physically or non-specifically conjugated) 항암제를 탄소나노튜브에 결합시킨 독소루비신의 형광을 비교 분석하였다. 이때, 탄소나노튜브와 항암제를 물리적으로 결합시킨 항암제는 탄소나노튜브와 항암제를 단순한 파이펫팅을 이용하여 혼합하여 결합시킨 항암약물을 의미하며, 탄소나노튜브 및 항암제를 동일한 양으로 공유 결합시킨 항암제와 비교분석하였다. 또한, 전체 실험에 대한 대조군으로 독소루비신 단일 약물을 이용하였다. 형광광도계(Luminescence spectrometer, Perkin Elmer)를 이용, 독소루비신으로부터 방출되는 형광정도를 분석하여 카본 나노물질에 부착된 항암제의 구조적인 변화정도를 결합된 방식 및 결합정도와 비교하여 분석하였다. 독소루비신은 그 자체로 형광을 나타내는 화합물이기 때문에, 독소루비신의 형광의 강도의 감소는 독소루비신이 탄소나노튜브와 강력하게 결합됨에 따라 구조적인 변화가 일어났다는 것을 의미한다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 독소루비신 단일 항암 약물은 형광이 매우 높으며, 탄소나노튜브, 탄소나노튜브와 공유적으로 결합된 항암제(DOX-mwCNT, covalently conjugated)및 물리적으로 결합된 항암제(DOX-DOX-mwCNT, physically conjugated)는 형광이 매우 낮은 것을 관찰할 수 있었다. 이에, 독소루비신을 제외하고 형광의 세기를 비교한 결과, 공유적으로 결합된 탄소나노튜브로부터 관찰되는 형광의 세기가 물리적으로 결합된 탄소나노튜브 기반의 항암제에 비하여 약 88%정도 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
독소루비신의 형광의 세기를 100%로 하였을 때, 물리적으로 결합된 DOX-mwCNT은 약 6.3%의 형광을 나타내며, 공유결합을 통하여 결합된 DOX-mwCNT는 약 0.8%의 형광을 나타내며, 형광이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 형광의 세기를 결합방법에 따라 비교해 보면, 물리적으로 결합된 DOX-mwCNT를 100%로 보았을 때, 공유적으로 결합된 DOX-mwCNT는 약 12%의 형광을 나타냈다. 이러한 형광세기의 감소는 탄소나노튜브에 의한 간섭 및 강력한 공유결합에 의한 독소루비신의 구조적 변화에 의한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 공유결합을 이용하여 제조된 탄소나노튜브 기반의 항암제에 강력하게 항암제가 결합되어 있음을 입증하는 결과이다.
상술한 실시예 1-3에서 독소루비신과 탄소나노튜브의 중량비를 달리하여 합성된 독소루비신이 공유결합된 탄소나노튜브에서 탄소나노튜브에 대한 독소루비신의 공유결합 중량비를 상술한 방법으로 계산한 결과, 1:4의 중량비로 결합시킨 경우 독소루비신의 중량비는 각각 10%, 17% 및 25-30% 정도로 나타났다. 이에 본 발명자들은 1:1의 중량비로 합성된 독소루비신이 결합된 탄소나노튜브를 DOX-mwCNT-25로 명명하고 이를 이후 실험에 주로 사용하였다.
상기 세 가지 다른 중량비로 독소루비신이 공유결합된 탄소나노튜브의 형광을 측정한 결과, 도 11 내지 13에 나타난 바와 같이, 결합시키는 약물의 양이 증가함에 따라, 형광의 세기가 더욱 크게 차이나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 상기 도 10의 결과와 동일하게 물리적 결합에 비하여 공유결합을 이용하였을 때, 형광의 세기가 감소하며, 독소루비신이 더욱 강력하게 탄소나노튜브에 결합되어 있음을 재확인할 수 있었다. 또한, 물리적 결합과 공유 결합간의 결합력의 차이는 독소루비신의 양이 증가함에 따라 더욱 증가하였다(도 11 내지 13).
실험예 2: 생체 내( in vivo ) 실험을 통한 탄소나노튜브 기반의 항암제의 효 과 확인
본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제의 효과를 확인하기 위하여, BALB/c nude 마우스에 투여한 후, 종양의 크기의 변화 정도(도 15), 종양의 무게(도 16) 및 모양(도 17), 동물의 체중(도 18) 및 종양 조직(도 19)을 관찰하였다.
2-1: 종양의 무게 및 크기 변화
우선, 상기 실시예 2에서 MDA-MB-231 세포를 이식하여 제조한 종양동물 모델을 각각 10마리씩 7개 그룹으로 무작위로 나눈 후, PBS에 용해된 0.5 mg/kg의 DOX, mwCNT 및 DOX-mwCNT-25 또는 순수한 PBS(음성대조군) 각각 200 μl를 꼬리 정맥으로 주입하였고, 2, 9 및 16일째 중량을 측정하였으며, 21일간 1주에 두 번 체중과 종양 크기를 측정하였다. 이 때 종양의 부피는 하기 식에 의해 계산되었다:
V (volume) = X (length) x D (width)2/2.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 DOX-mwCNT를 종양 모델 동물의 꼬리정맥에 주입한 실험과정을 개략적으로 도시한 개요도이다.
21일 경과 후 마우스를 희생시킨 후 종양 크기의 변화를 측정하였다. 그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 세 차례 꼬리정맥 주사 후 DOX-mwCNT-25 0.5 mg/kg 처리후의 종양의 크기 및 부피는 5 mg/kg의 순수한 독소루비신 처리시의 그것에 상응하였다. 아울러, 0.5 mg/kg의 순수한 독소루비신은 주목할만한 종양 억제를 나타내지 않았다.
아울러 항암제 투여한 후, 희생된 마우스로부터 종양조직을 채취하여 무게를 측정하였다. 이때 각 군의 유의성을 비교하기 위하여, Prism(GraphPad Software, Inc.)을 이용하여 One-way ANOVA(analysis of variance)로 통계처리 하였다(**P<0.01, ***P<0.001).
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 독소루비신과 DOX-mwCNT-25를 투여한 군에서 종양 조직의 크기가 감소하였으며, DOX-mwCNT-25를 투여한 군의 경우 저용량(0.5 mg/kg)을 투여하였을 때에도 비투여 대조군에 비하여 유의하게 종양 조직의 크기가 감소하였다. 반면, 독소루비신의 경우 고용량(5 mg/kg)을 투여하였을 때에만 대조군에 비하여 유의하게 종양 조직의 크기가 감소하였다.
또한, 이러한 결과는 각 실험군으로부터 종양을 분리한 후 종양의 크기 및 모양을 비교한 도 16 및 17에서도 동일하였다. 상기 도 16의 그래프와 유사하게 독소루비신과 탄소나노튜브 기반의 항암제를 투여한 군에서 종양의 크기가 감소하는 경향을 나타냈으며, 독소루비신 고용량(5 mg/kg)과 탄소나노튜브 기반의 항암제 저용량(0.5 mg/kg)을 투여한 군의 종양의 크기와 모양이 유사하였다(도 16 및 17).
한편, 실험에 사용된 동물들의 시험기간 동안의 체중의 변화를 측정한 결과, 체중 상의 유의한 변화는 관찰되지 않았다(도 18).
고용량의 독소루비신 투여에 의하여 나타나는 암 세포 사멸효과가 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제의 경우, 약 1/10배 정도의 저용량을 투여하였을 때에도 나타났다. 따라서, 독소루비신 약물 자체의 독성 부작용을 피할 수 있으면서, 우수한 항암 효과를 기대할 수 있다.
2-2: 종양 조직의 조직병리학적 관찰
BALB/c nude 마우스에 유방암 세포를 이식한지 2주가 경과한 후, 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제를 투여한 후, 24일 동안 관찰하였다. 그 후, 에틸에테르에 마취시켜, 희생시키고, 종양조직을 채취하였다. 채취한 종양조직의 무게를 측정한 후, 채취한 종양은 10% 포르말린에 24시간동안 고정시키고, 흐르는 물로 씻어준 후, 70, 80, 90, 95, 100% 에탄올에 차례로 담궈서 탈수 시킨다. 그 후 자일렌(xylene)으로 투명화시키고, 파라핀(paraffin)으로 포매한 후, 5 ㅅm의 두께로 절편을 만들어 유리 슬라이드 글라스에 올려놓고, 헤마톡살린-에오신 염색(Hematoxylin and Eosin, H&E)을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, 독소루비신(DOX)을 저용량(0.5 mg/kg) 및 고용량(5 mg/kg)으로 투여한 군의 조직은 비투여 대조군(Cont.)에 비하여 세포 괴사(necrosis)가 증가하여, 조직 가운데 구멍이 뚫려 있는 것을 관찰할 수 있었다. 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25의 경우 저용량을 처리한 군에서 독소루비신 단일 약물에 비하여 암 세포 괴사효과가 현저히 우사하였다. 한편, PBS나 mwCNT만으로 처리된 개체에서는 종양조직에 대한 어떠한 손상도 관찰되지 않았다(도 19). 이러한 결과는 상기 도 15 내지 18로부터 확인된 결과와 마찬가지로, 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제가 종양세포에 대한 항암효과가 우수하며, 독소루비신 단일 약물에 비하여 약물자체의 독성으로 인한 부작용을 낮출 수 있음을 입증하는 것이다.
실험예 3: 탄소나노튜브 기반의 항암제 투여 후 생체 내 분포
본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제를 생체 내(in vivo) 투여를 수행하였을 때, 생체 내에 분포 정도를 확인하였다.
구체적으로, BALB/c nude 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25 또는 독소루비신을 2 mg/kg으로 정맥주사한 후, 투여 30분 및 6시간이 경과한 후 동물을 희생시켰다. 그 후, 종양, 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 위장, 소장, 근육 및 혈액 샘플을 채취하여, 독소루비신의 양을 측정하였다. 혈액은 1% SDS, 1% Triton X-100, 40 mM Tris Acetate, 10 mM EDTA, 10 mM DTT를 포함하는 라이시스 버퍼(lysis buffer)로 녹인 후, 이소프로판올(isopropanol)에 0.75 M 염산을 첨가하여, 15시간 동안 -20℃에 방치한 후, 독소루비신을 추출하였다. 나머지 조직 샘플(100 mg)은 0.25 M sucrose, 40 mM Tris Acetate, 10 mM EDTA를 포함하는 버퍼를 0.5 ㎖ 첨가하여 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후, 그 중 0.2 ㎖에 0.1 ㎖의 10% Triton X-100을 첨가한 후 강하게 교반기로 섞어주고, 이소프로판올(isopropanol)에 0.75 M 염산을 첨가하여, 15시간 동안 -20℃에 방치한 후, 독소루비신을 추출하였다. 이렇게 추출한 독소루비신을 플레이트 리더(plate reader)기로 측정하여 각 샘플내의 함량을 측정하였다.
그 결과, 도 20 및 21에서 나타난 바와 같이, 꼬리 정맥 주사후 30분 및 6시간 후 40% 이상의 DOX-mwCNT-25rk 간과 폐에 축적되는 것을 확인할 수 있었다. 심장, 비장, 위 및 소장 역시 꼬리정맥 주사 후 순수 독소루비신과 비교할 때, DOX-mwCNT-25가 더 많이 축적됨을 알 수 있었다. 이러한 경향은 심장을 제외하고는 6시간 경과 후에도 유지되었다(도 21). 심장에서의 상승된 혈류가 더 우월한 기계적 펌핑에 의해 심장으로부터 DOX-mwCNT의 제거율을 향상시킬지도 모르며 이는 순수 독소루비신이 배설계에 의해 DOX-mwCNT에 앞서 제거되는 것과 관련되어 있을 수 있다. DOX-mwCNT의 종양조직 내로의 축절률(2%)는 종전 연구에서 제시되던 할당율과 거의 동일한 것이었다.
실험예 4: 시험관 내( in vitro ) 실험을 통한 탄소나노튜브 기반의 항암제의 효과 확인
이어 본 발명자들은 상기 생체 내 조건에서 사용된 농도에 상응하는 시험관내 조건의 농도의 약물을 사용하여 세포생동성 실험을 수행하였다. 이는 종양조직에서의 유효 약물 농도는 생체 내 생-분포로부터의 할당률에 의존적이기 때문이다. 꼬리정맥 주사후 생-분포에 기반하여 오직 1-2%의 투여량이 종양조직에 도달한다(도 20 및 21).
4-1: 폐암세포에 대한 항암 효과 확인
A549 세포(1×04 세포/웰(well) CAT: CRL-1658，company: ATCC)는 96웰 플레이트에서 배양하였으며, 웰당 1×104 세포의 비율로 심었으며, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 배양되었다. 이때, 배양기는 CO2 5% 조건에서 37℃의 온도로 습기가 있는 상태로 유지하였다. 24시간 동안 상기 세포를 각각 배양하고, mwCNT-COOH, EPI, EPI-EGF, EPI-mwCNT, 및 EPI-EGF-mwCNT를 각 웰당 0.086, 0.172, 0.345, 0.69, 1.38 μmol/L의 비율로 처리하고, 48시간 동안 더 배양하였다. 그 후, 플레이트내의 약물 용액을 제거한 후, 1 mg/㎖ 농도의 MTT 시약(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드, 3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)을 웰당 100 ㎕씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 더 배양하였다. 그 후, DMSO 용액을 웰당 100 ㎕씩 첨가한 후, 마이크로플레이트 리더기(Model 680, Bio-Rad)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, 탄소나노튜브(mwCNT-COOH)를 처리한 군에 비하여 에피루비신이 포함된 약물을 처리한 군(EPI, EPI-EGF, EPI-mwCNT, EPI-EGF-mwCNT)를 처리한 군에서 폐암세포의 생존율이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 에피루비신이 포함된 약물을 처리한 군 사이에서는 본 발명의 일 실시예에 따른 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브에 에피루비신을 결합시켰을 때(EPI-mwCNT, EPI-EGF-mwCNT), 폐암 세포에 대한 세포사멸 효과가 미량(1 μM)의 항암제 처리량에서도 매우 우수하였다(도 22).
이어, 본 발명자는 독소루비신이 포함된 약물(DOX-EGF, DOX-mwCNT-25, DOX-EGF-mwCNT)를 상기와 동일한 폐암세포인 A549에 처리하였다. 처리 약물을 제외한 조건을 모두 동일하였다. 그 결과, 에피루비신의 암 세포 사멸효과와 유사하게 독소루비신 역시 본 발명의 일 실시예에 따른 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브에 결합되었을 때 가장 우수한 폐암 세포 사멸효과를 나타냈다(도 23).
4-2: 유방암 세포에 대한 항암 효과 확인
이어, 본 발명자는 유방암 세포주를 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제의 암 세포 사멸 효과를 확인하였다.
MDA-MB-231 세포(CAT: HTB-26，company: ATCC)를 96웰 플레이트에서 배양하였으며, 웰당 3×105 세포의 비율로 심었으며, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 배양되었다. 이때, 배양기는 CO2 5% 조건에서 37℃의 온도로 습기가 있는 상태로 유지하고, 24시간 동안 상기 세포를 각각 배양하였다. 그 후, mwCNT-COOH, DOX, 및 DOX-mwCNT-25를 각 웰당 100, 200, 400, 900, 1800, 3200)ng/㎖의 비율로 처리하고, 48시간 동안 더 배양하였다. 그 후, 플레이트내의 약물 용액을 제거한 후, 1 mg/㎖ 농도의 MTT 시약(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)을 웰당 100 ㎕ 첨가하고, 37℃에서 1시간 더 배양하였다. 그 후, DMSO 용액을 웰당 100 ㎕ 첨가한 후, 마이크로플레이트 리더기(Model 680, Bio-Rad)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제인 DOX-mwCNT-25를 약 400 ng/㎖의 농도로 처리시의 유방암 세포 사멸 효과가 독소루비신 단일 약물을 약 1000 ng/㎖로 처리하였을 때의 효과와 동일한 것을 확인할 수 있었다(도 24).
종합하면, 상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 카복실화된 다중벽탄소나노튜브를 이용하여 제조한 항암제는 저용량으로도 독소루비신 단일 약물을 고용량으로 처리시의 효과를 제공할 수 있으며, 이는 극미량으로도 다양한 암 세포에 적용할 수 있음을 입증한 것이다. 또한, 독소루비신, 에피루비신 이외에도 아민기를 가진 다양한 약물에 적용이 가능함을 의미하는 것이다.
실험예 5: 탄소나노튜브 기반의 항암제의 세포내 흡수(uptake)및 배출 (efflux)
5-1: 약물 방출 속도
본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제의 약물 방출 속도는 DOX-mwCNT를 PBS(phosphate buffered saline; pH 7.0)와 ABS(Acetate buffered saline; pH 5.0)에 각각 1 ㎍/㎖의 농도로 녹인 후, 37℃ 배양기에서 로커(rocker)로 흔들어주며, 1, 2, 5, 10, 24, 48, 72, 120, 및 240 시간 동안 방치하였다. 각 시간 샘플은 15,000 rpm으로 15분간 Amicon® Ultra Centrifugal Filters-50K Membrane(Millipore, Ireland)를 이용하여 여과한 후, 플레이트 리더기(plate reader)를 이용하여 470 nm에서 여기(excitation)하고 590 nm 파장에서 측정하였다.
그 결과, 도 25에 나타난 바와 같이, 0~6시간, 12~72시간에 2차례에 걸쳐서 약물이 서서히 방출되는 것을 확인할 수 있었으며, 약물 방출 속도가 6시간(first release)및 50시간(second release)동안 지속적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 암세포의 내부에서의 항암제의 2차 방출(12~72시간)은 일반적으로 암세포의 증식기간(12-48시간)에 해당되며, 이 시기에 집중적으로 탄소나노튜브로부터 항암제가 지속적으로 방출되어 유효한 항암 효과를 제공한다는 것을 의미한다. 또한, PBS에서보다 ABS에서의 방출 속도가 다소 증가하였는데, PBS는 생체 내 중성 pH 조건의 환경을 의미하며, ABS는 엔도솜에 의한 물질이동의 최종단계인 리소좀(lysosome)내부의 pH 5.0인 상태에 해당되므로, 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT의 ABS와 PBS에서의 방출 속도 비교 결과는 DOX-mwCNT가 생체내로 투여된 후, 안정적인 상태로 세포로 전달되어 세포 내에서 탄소나노튜브로부터 방출될 수 있음을 시사한다.
5-2: 세포 내로의 인입(uptake)및 배출(efflux) 정도
본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제의 세포 내로의 인입(uptake)및 배출(efflux)정도를 처리 농도 및 처리 시간에 따라 관찰하였다. 이때, 대조군으로 독소루비신 단일 약물을 처리한 군을 이용하였다.
본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25과 독소루비신을 웰당 1x104 세포의 비율로 24웰 플레이트에 배양된 MDA-MB-231 유방암 세포에 12.5, 50, 200 ng/㎖으로 각각 처리한 후, 2시간 경과 후 세포를 고정하고, 형광현미경에서 594 nm 파장으로 관찰하였다(도 26). 독소루비신 자체가 형광물질이므로, 관찰되는 형광의 세기로 세포 내에 흡수된 독소루비신 또는 DOX-mwCNT-25의 양을 판단하였다. 도 26에서 독소루비신 처리 농도에 따른 유방암 세포로의 인입(intake) 정도와 유방암 세포로부터의 배출(efflux) 정도를 비교하였다. 독소루비신과 DOX-mwCNT 처리군에서 독소루비신의 형광 강도가 처리농도에 비례하여 증가하며, 상기 군 사이에서는 큰 차이가 나타나지 않는 것으로 관찰되었다(도 26).
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25과 독소루비신을 웰당 1x104 세포의 비율로 24웰 플레이트에 배양된 MDA-MB-231 유방암 세포에 100 ng/㎖로 각각 처리하였다. DOX-mwCNT-25와 독소루비신 처리 2시간 이후, 배양액을 제거하고 PBS로 세 번 세척하고, 항암제가 제거된 배지를 첨가하여 24시간 동안 MDA-MB-231 유방암 세포의 배출(efflux) 정도를 형광현미경으로 관찰하였다(도 27). 도 27에서 배양액에서 독소루비신을 제거한 후, 0, 2, 6, 12, 24시간이 경과한 후의 독소루비신의 배출(efflux)을 형광현미경을 통하여 관찰한 결과, DA-MB-231 세포에서 24시간 경과 후 약 40% 정도의 DOX-mwCNT-25가 남아있는 것으로 관찰된 반면, 순수한 독소루비신은 MDA-MB-231 세포에 의해 6-12시간 동안 완벽하게 배출되는 것으로 나타났는데(도 27), 이러한 차이는 처리량이 증가할수록(10에서 200 ng/ml로) 더욱 크게 나타났다. 이때, 0 시간은 독소루비신을 제거하고, PBS 완충액으로 세포를 세척한 후 2시간 이 경과한 시점을 의미한다.
이러한 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제(DOX-mwCNT)는 공유결합에 의하여 탄소나노튜브에 강력하게 결합되어 있기 때문에, 항암제 내성에 대한 배출(efflux)을 무력화(nullify)시키며 단일 항암제에 비하여 세포 내에 머무는 시간이 길고, 암 세포의 증식 기간 동안 지속적으로 약물을 방출한다는 것을 입증하는 것이다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브를 적용한 항암제는 미량의 용량만으로도 항암제의 치료학적 효과를 증가시킬 수 있으며, 항암제에 대한 내성을 가진 암에 대하여도 극대화된 치료효과를 증가시킬 수 있음을 의미한다.
아울러, 본 발명자들은 흡수된 독소루비신 신호의 분해를 보여주는 고배율 이미지 분석을 독소루비신과 후기 엔도좀 표지인자를 동시에 염색함으로써 24시간 동안 수행하였다. 형광현미경으로 고해상도로 관찰한 결과 핵으로부터 독소루비신의 완전한 제거 후 후기 엔도좀은 거의 관찰되지 않았다(도 28의 A). 따라서, 후기 엔도좀은 핵으로부터 배출된 독소루비신의 외부 수송체의 역할을 수행하는 것임을 알 수 있다. 반면, DOX-mwCNT-25로 24시간 처리된 세포의 핵에서는 후기 엔도좀 신호가 감소되지 않았다(도 28의 B).
더 나아가, DOX-mwCNT-25를 둘러싸고 있는 상당량의 초기 엔도좀 소포가 핵과 융합되고 있음이 24시간 경과 후에도 확인되었다. 이는 DOX-mwCNT-25를 둘러싸는 엔도좀 소포가 단지 2시간의 DOX-mwCNT 노출에 의해 24시간 경과 후에 조차도 엔도좀 또는 후기 엔도좀을 통해 핵으로 지속적으로 접근하고 독소루비신을 방출한다는 것에 대한 최초의 발견이다(도 28).
5-3: 암세포의 펌핑(pumping)작용으로 분석
본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제가 항암제에 대하여 내성을 갖는 암에 대하여 치료학적 효과가 있는지의 여부를 Mrp-1(multiple drug resistance protein 1)발현을 통하여 확인하였다. Mrp-1 유전자는 다중약물내성(multi drug resistance)을 갖는 암 세포에서 과발현된다는 것이 보고된 바 있으며, Mrp-1 발현 억제에 의하여 MRP-1 기질 약물의 치료효과가 증가한 결과가 보고된 바 있다(Kuss, B. J., et al., Int. J. Cancer, 98: 128-133, 2002).
본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT 또는 독소루비신을 MRP1이 발현되는 것으로 알려진 MDA-MB-231 유방암 세포를 6 웰 플레이트에 4x105세포/웰의 비율로 심은 후, 독소루비신과 DOX-mwCNT를 100 ng/㎖로 2시간 동안 처리하였다. 이에 대한 대조군으로 탄소나노튜브를 348 ng/㎖로 동일시간 처리하였다.
처리 2시간 후, mwCNT, Dox, DOX-mwCNT가 포함되지 않은 10% FBS가 포함된 DMEM 배지로 교환한 후, 2, 6, 12, 24, 36 시간대 별로 세포로부터 RNA를 분리하여, Mrp-1 mRNA 수준을 관찰하였다. 이때, TRIZOL(invitrogen, USA)과 클로로포름(chloroform)을 이용하여 상기 세포로부터 RNA를 분리하였으며, 그 후 동량의 아이소프로판올(isopropanol)에 상기 RNA를 2시간 이상 반응시킨 후, 정량하여 RT-PCR(reverse transcriptase PCR)을 수행하였다.
그 결과, 도 29에 나타난 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제를 처리한 세포에서는 Mrp-1의 발현이 지속적으로 유지되는 반면, 독소루비신의 경우 처리 6시간 이후 Mrp-1의 발현이 감소하였다.
이를 단백질 수준에서 확인하기 위해 MRP-1 단백질에 대한 웨스턴 분석을 수행하였는데, 독소루비신과 DOX-mwCNT-25 사이에 MRP-1의 단백질 발현에 있어서 유의한 차이가 있음을 확인하였다(도 30). 특히, MRP-1 단백질 합성은 24시간 경과시 순수한 독소루비신의 경우 약한 MRP-1 밴드와 비교하여 DOX-mwCNT-25에 대하여 상항조절된채로 유지되었다. Mdr-1 및 Mrp-1 유전자가 MDA-MB-231에 대한 약물 저항성을 매개한다는 보고가 있음에도 불구하고, Mrp-1만의 발현은 세포에 대한 짧은 약물 노출시간(2시간) 때문에 본 실험에서 거의 검출되지 않았다.
이러한 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제가 유방암 세포내에서 지속적으로 분비됨에 따라 MRP1이 항암제를 배출(pumping)하기 위해서 발현이 감소하지 않고 유지되고 있음을 입증하는 것이다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제는 지속적으로 탄소나노튜브로부터 항암제가 배출되고 있어, 장시간동안 치료효과를 제공할 수 있음을 시사한다.
실험예 6: 후기 엔도좀-리소좀 전달 및 산성 리소자임 조건에서의 급격한 약 물 방출
일련의 식세포작용 개시 경로을 조사하는 것은 세포내 수준에서의 약물전달을 이해하는데 필수적이다. DOX-mwCNT의 엔도좀 전달의 기전의 장점은 이러한 유형의 입자가 일반적으로 세포질로부터 세포외 공간으로의 약물 배출을 경험하지 않는다는데 있다. 후기 엔도좀 표지자를 분석하면 이들의 리소좀이나 골지체로의 수송 전에 흡수된 DOX-mwCNT의 직접적인 관찰이 가능한데, 이는 후기 엔도좀 시기가 초기 엔도좀(접근 중인 약물) 및 리소좀(분해 중인 약물) 사이에 위치하고 있기 때문이다. 종래 연구에서 나노 약물의 가능한 엔도좀 및 리소좀 전달을 언급하기는 하였으나, 엔도좀 또는 리소좀이 나노입자로부터 약물 방출 지점이라는 것에 대한 명백한 증거는 없었다.
본 발명자들은 이에, 엔도좀 표지자와 독소루비신을 고해상도 현미경을 이용하여 동시에 관찰함으로써, 후기 엔도좀이 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX-mwCNT-25의 약물 배출에 있어서 중요한 역할을 수행함을 입증하였다(도 31의 A 내지 G).
도 31의 A 내지 G는 엔도좀-리소좀 시기 동안 약물방출에 대한 증거를 제공하는데, 이는 독소루비신이 후기 엔도좀에는 풍부하게 존재하는 반면, 리소좀에서는 결핍되어 있기 때문이다. 후기 엔도좀에 대한 확대된 사진을 보면 후기 엔도좀으로부터 독소루비신의 핵으로의 확산을 관찰할 수 있다(도 31의 C). 이는 후기 엔도좀에 둘러싸인 나노입자로부터 독소루비신이 방출되는 것에 대한 최초의 증거이다. 독소루비신 및 리소좀에 대한 사진을 보면 접근 중인 엔도좀(적색: 초기 또는 후기 엔도좀에서의 독소루비신)과 소포 내에서 감소된 독소루비신을 가진 내외부로 향하는 리소좀(녹색)이 동시에 존재하고 있음을 알 수 있다(도 31의 G 내지 F). 확대된 사진을 통해 리소좀 소포로부터 독소루비신의 확산을 확인할 수 있다(도 31의 G). MDA-MB-231 세포의 핵 근위에서 더 많은 리소좀이 발견되었기 때문에 핵을 둘러싸고 있고, 후기 엔도좀 및 리소좀에 둘러싸여 있는 풍부한 산 가수분해 효소가 독소루비신과 mwCNT 사이의 아마이드 결합을 절단시킬 수 있는 충분한 분해효소 활성을 가지고 있다.
상기 관찰된 현상을 이해하기 위해, 엔도-리소좀 경로에서의 공유결합으로 연결된 mwCNT로부터 독소루비신의 급격한 방출을 이해하기 위한 시험관내 약물 방출 실험을 수행하였다. 먼저, 세포 외부 환경(PBS)에서는 240 시간까지의 시간 경과에 따라 독소루비신의 구별되는 방출은 나타나지 않았다(도 31의 J). 10% FBS에서의 독소루비신의 방출은 시간 경과에 따라 증가된 방출을 나타내, DOX-mwCNT 결합이 혈액 환경 하에서는 수 시간 경과 후 서서히 분해됨을 시사한다(도 31의 J). 더 나아가, 고안된 약물의 연결은 중성 및 산성 조건에서 모두 매우 안정한 것으로 나타났다(도 31의 J). 따라서, 약물 방출 분석 결과 고안된 DOX-mwCNT 항암제가 세포외 조건 하에서 매우 안정한 것으로 나타났다. 더 나아가, 세포내 조건 하에서의 약물 방출 역시 조사되었다. 놀랍게도 중성 조건(pH 7)에서의 높은 리소자임 농도에서 유의한 방출이 관찰되었고 산성 환경으로의 동시 자극 및 더 높은 리소자임 농도에 의해 유의한 급격한 방출이 가능함을 알 수 있었다(도 31의 J). 관찰된 방출은 mwCNT에 공유결합에 의해 연결된 mwCNT를 절단시키기 위한 최적화된 조건은 산성 가수분해효소를 요구한다는 것을 뒷받침한다. 후기 엔도좀과 리소좀이 리소자임을 포함하는 40종류의 산성 가수분해효소로 구성되어 있다는 점을 고려할 때, 수득된 데이터는 후기 엔도좀 및 리소좀 시기에 독소루비신에 대한 매우 높은 선택성에 대한 증거를 제공한다. 마지막으로, 동결 투과 전자현미경 이미지는 mwCNT로부터 독소루비신의 절단 및 mwCNT로의 리소자임 결합에 대한 증거를 제공한다(도 31의 H 및 I). 리소자임 결정화에 상응하는 다양한 형태가 동결-투과 전자현미경 이미지회절 패턴에 의해 확인되었다(도 31의 I). 중요하게도, 개발된 DOX-mwCNT-25가 독소루비신 및 독소루비신이 리포좀에 봉입된 DOXIL과 비교하여 다수의 엔도좀 소포를 유도하며, 이는 통상적인 약물(DOX 및 DOXIL)보다 더 유리한 조건을 제공한다. 도 31의 K는 엔도-리소좀 경로를 통한 탄소나노튜브로부터 공유결합된 약물의 전달 경로를 개략적으로 표시한 도면이다.
실험예 7: 탄소나노튜브 기반의 항암제의 세포 독성
7-1: 사이토카인 및 간 효소를 이용한 안정성 평가
본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제의 안정성을 확인하기 위하여, 실시예 2의 종양동물 모델에 투여한 후, 사이토카인(cytokine)및 간 효소를 측정하였다.
구체적으로, 실시예 2의 종양동물 모델에 독소루비신 또는 DOX-mwCNT를 저용량(0.5 mg/㎖)또는 고용량(5 mg/kg)으로 투여한 후, 2일이 경과한 후 혈액을 채취하여 TNF-alpha, IFN-gamma, IL-2, IL-4, IL-6, GOT 및 GPT를 분석하였다(녹십자 의뢰). 이에 대한 대조군으로는 PBS만 투여한 마우스의 혈액 샘플을 이용하였다. 실시된 실험 방법은 다음과 같다. 실험예 3에서 희생시킨 쥐의 종양과 장기를 적출하기 전 우심실에서 혈액을 각 개체당 500 ㎕씩 채취하고, 진공시험관(vacutainer)에 담아 원심분리기에 15분 동안 분당 3000회로 혈장을 분리하였다. 이후 20℃로 냉동시켜 녹십자의료재단 의학유전체연구소에 분석을 의뢰하였다.
그 결과, 도 32에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제를 투여한 군은 대조군과 유사하거나 낮은 수준으로 사이토카인이 분비되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 간 효소인 GOT와 GPT 수치를 통하여 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제의 안정성을 확인할 수 있었다.
7-2: 간 클리어런스(clearance) 분석
BALB/c nude 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 mwCNT를 10 mg/kg으로 1회 정맥주사한 후, 1, 4, 및 12주가 경과한 후, 마우스를 희생시켰다. 희생시킨 마우스는 개복하여 장기를 관찰하였다. 그 결과, 폐와 간 조직에 탄소나노튜브의 분포가 집중되어 있었다. 그러나 정맥주사 후, 1, 4, 및 12주의 시간이 경과함에 따라, 간의 mwCNT 잔존량이 감소하는 것이 관찰되었다(도 33 참조).
이어, 헤마톡살린-에오신 염색 방법을 이용하여, 탄소나노튜브가 집중되어 분포된 간 조직의 손상도를 확인하였다. 간 조직은 10% 포르말린에 24시간 동안 고정시키고, 흐르는 물로 씻어준 후, 70, 80, 90, 95, 100% 에탄올에 차례로 담궈서 탈수시켰다. 그 후 자일렌(xylene)으로 투명화시키고, 파라핀(paraffin)포매한 후, 5 μm의 두께로 절편을 만들어 유리 슬라이드 글라스에 올려놓고, 헤마톡살린-에오신 염색(Hematoxylin and Eosin, H&E)을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 34에 나타난 바와 같이, mwCNT를 투여한 간 조직은 탄소나노튜브가 잔존되어 있어, 조직 내에 검은색 점이 관찰되었으나, 시간이 경과함에 따라 이러한 mwCNT의 잔존량이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 34 참조). 이러한 결과는 MWCN 투여에 의하여 관찰되는 간 조직 집중적인 분포 및 잔존은 시간이 경과함에 따라 간 자제의 정화작용에 의해서 해결될 수 있음을 입증하는 것이다. 또한, MWCN가 간 조직에 집중적으로 분포되는 정도에 비하여, 간 손상의 정도가 매우 미미하였기 때문에, 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제가 생체 내(in vivo) 독성 문제를 유발하지 않는다는 것을 의미한다.
종합하면, 본 발명은 암 세포내에서 탄소나노튜브에 공유적으로 결합된 항암제가 탄소나노튜브로부터 서서히 방출되면서, 단일 항암제 대비 극미량의 투여로 유효하며, 탄소나노튜브 또는 항암제에 의한 독성을 유발하지 않고 항암효과를 제공할 뿐만 아니라, 항암제 내성 암 세포에 대해서 치료효과를 기대할 수 있음을 입증한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 탄소나노튜브 기반의 항암제는 독소루비신 단일 항암제에 비하여 약 1/10 배 정도의 미량으로도 더욱 우수한 항암효과를 제공할 수 있는데, 이는 독소루비신의 구조적 변화가 일어날 정도로 탄소나노튜브와 공유결합을 통하여 강력하게 결합되어, 장시간 서서히 방출되기 때문이다. 또한, 이러한 암 세포 내에서의 지속적인 방출은 암 세포의 항암제를 방출(efflux)시키는 내성 문제를 해결할 수 있게 하며, 더욱이 암 세포의 증식 및 분열의 시기에 본 발명의 탄소나노튜브로부터 항암제가 지속적으로 방출되어, 항암 효과를 극대화 시킬 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (15)

  1. (a) 다중벽 탄소나노튜브의 표면을 카복실기로 개질시키는 단계;
    (b) 상기 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브를 pH 5.2~5.5의 조건에서 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride) 링커를 결합하는 단계; 및
    (c) 상기 EDC 링커가 결합된 다중벽 탄소나노튜브를 pH 5.9~6.2의 조건에서 항암제와 결합시키는 단계를 포함하는, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 다중벽 탄소나노튜브는 5 내지 50 nm의 직경을 갖는, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 다중벽 탄소나노튜브는 100 내지 350 nm의 길이를 갖는, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 다중벽 탄소나노튜브의 표면은 10~35% 카복실기를 갖도록 개질된, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항암제는 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride) 링커에 의하여 카복실화된 다중벽 탄소나노튜브에 공유적으로 결합된, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항암제는 아민 계열 화합물인, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 시스-플라틴(cis-platin), 미토마이신-C 또는 다우노마이신(daunomycin)인, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    추가로 상피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF)가 항암제와 함께 결합될 수 있는, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암의 치료에 사용되는, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 다중벽 탄소나노튜브를 강산 용매에 혼입한 후, 초음파 처리하여 카복실기를 표면에 도입시키는, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 상온에서 MES(2-morpholinoethanesulfonic acid) 용액에 카복실화된 탄소나노튜브를 분산시킨 후, NHS(N-hydroxysuccinimide) 용액을 첨가하고, 초음파 처리를 수행하여 EDC 링커를 결합시키는, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)는 0~20℃에서 14~18시간 동안 교반하여 항암제를 결합시키는, 탄소나노튜브 기반의 항암제의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조방법에 의하여 제조된, 탄소나노튜브 기반의 항암제.
  14. 제13항의 탄소나노튜브 기반의 항암제를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 또는 췌장암인, 암 치료방법.
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