WO2013089411A1 - 유전자 나노 복합체 및 이를 이용한 유전자의 세포 내재화 방법 - Google Patents

유전자 나노 복합체 및 이를 이용한 유전자의 세포 내재화 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2013089411A1
WO2013089411A1 PCT/KR2012/010744 KR2012010744W WO2013089411A1 WO 2013089411 A1 WO2013089411 A1 WO 2013089411A1 KR 2012010744 W KR2012010744 W KR 2012010744W WO 2013089411 A1 WO2013089411 A1 WO 2013089411A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
nanocomposite
polymer
cancer
photosensitizer
Prior art date
Application number
PCT/KR2012/010744
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
나건
박신정
Original Assignee
가톨릭 대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭 대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭 대학교 산학협력단
Priority to US14/364,611 priority Critical patent/US9765335B2/en
Publication of WO2013089411A1 publication Critical patent/WO2013089411A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6939—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being a polysaccharide, e.g. starch, chitosan, chitin, cellulose or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a gene nanocomposite comprising a polymer conjugated with a photosensitizer and a cell internalization method of a gene using the same.
  • Gene therapy is the introduction of normal genes that can replace the genes that cause disease so that genes can function properly. Genetic diseases and other circulatory diseases, immune system diseases, endocrine diseases, cancer, etc. Is considered as a way to heal. However, gene transfer into cells is essential for effective gene therapy. For this purpose, genes may be transferred to cells using physical methods such as methods using carriers such as viral or non-viral vectors, microglass tube injection, ultrasound or electroshock. The method of delivery into is being studied.
  • viral vectors are representative of retroviruses, adenoviruses, lentiviruses, etc., and these are known to have excellent gene transfer efficiency because of their high infectivity.
  • its use is limited due to mutagenesis, insertion of infectious viruses, and the potential for inflammatory reactions in the host when inserted into the host chromosome. Therefore, methods using non-viral vectors such as cationic polymers have been studied because of the simplicity of the manufacturing method or the relatively low risk, which stabilizes genes by forming complexes through electrostatic interaction with negatively charged genes. It is reported that there is an advantage that the intracellular delivery is easy because of the positive charge.
  • cationic polymers may cause serious toxicity when used in an amount less than viral carriers but in order to obtain sufficient effects, and have a disadvantage in that specific delivery of only target cells is difficult.
  • the stability is very low, it is difficult to use in vivo. Therefore, in order to compensate for this, a method of solving the toxicity and blood instability by forming a tertiary complex of a gene / cationic polymer complex and an anionic polymer was studied.
  • the gene / cationic polymer / anionic polymer tertiary complex may have low toxicity, while the gene transfer efficiency is significantly lowered, and there is still a technical difficulty in solving the difficulty of target cell specific delivery.
  • non-viral gene transfer vectors and gene complexes are reported to be internally migrated by endocytosis.
  • the gene / non-biogenic vector complex introduced through endocytosis stays in the endosome, which is then fused with the lysosomes to cause the degradation of the gene by various digestive enzymes present in the lysosomes. Decreases the efficiency significantly. Therefore, the ability of gene / non-viral vector complexes introduced through endocytosis to escape from the endosome and move into the cytoplasm is a very important factor in enhancing gene transfer efficiency.
  • photodynamic therapy is a technology that can treat the lesion site without surgery using a photosensitizer and appropriate light (photons).
  • Porphyrin-type compounds are typical examples of the photosensitizers, which are extracted from latex, mulberry leaves, green algae, etc., have suitable spectroscopic properties, and have relatively high cell permeability. Has the property of causing.
  • Photosensitizers produce free radicals (unary oxygen, oxygen radicals, superoxide and peroxide) when they are excited by light of a specific wavelength. The generated free radicals are involved in the oxidation of lipids, proteins and nucleic acids and the destruction of intracellular structures resulting in cell death.
  • porphyrin derivatives as a photosensitizer material accumulate selectively in cancer cells, because the receptor for low density lipoprotein (LDL) responsible for porphyrin transport is expressed in cancer cells.
  • LDL low density lipoprotein
  • most photosensitizers are poorly soluble and have adverse effects in the human body due to phototoxicity due to the long residence time.
  • the treatment method using a photosensitizer is necessary to irradiate the appropriate light (photons), but there is a disadvantage that can not be used in a bulky tumor due to the limited light transmission to the lesion site.
  • An object of the present invention for solving the above problems, by integrating the gene with a photosensitizer used in photodynamic therapy genes complexes that can improve the cell internalization and gene expression efficiency of genes into mammalian cells and the same It provides a cell internalization method of the gene used.
  • a polymer to which a photosensitizer is conjugated A polymer to which a photosensitizer is conjugated
  • a gene nanocomposite comprising at least one of a gene and a gene / cationic polymer complex.
  • a polymer to which the photosensitizer is conjugated And mixing at least one of a gene and a gene / cationic polymer complex.
  • the present invention applies a photosensitive agent conjugated polymer used in photodynamic therapy to form a gene nanocomposite integrated with a photosensitizer, a gene and an ionic polymer, thereby increasing cell internalization of the gene, and gene Expression efficiency can be improved.
  • a bioactive substance to the nanocomposite can be applied to gene therapy for various diseases using a variety of gene delivery.
  • Figure 1 shows the H1-NMR analysis of the polyethyleneimine photosensitizer conjugate (A) or the acetylated chondroitin sulfate and photosensitizer conjugate (B) according to Examples 1 to 3 of the present invention.
  • Figure 2 shows the particle characteristics of the gene nanocomposites according to Examples 5 and 6 of the present invention.
  • Figure 3 shows the results confirmed by Western blot (A) and polymerase chain reaction (B) the expression of green fluorescent protein and green fluorescent protein mRNA in HCT-116 cells according to Experimental Example 4 of the present invention.
  • Figure 4 shows the results confirmed by Western blot (A) and real-time polymerase chain reaction (B) the effect of inhibiting the expression of EGFR protein and mRNA in HCT-116 cells according to Experimental Example 5 of the present invention.
  • the present invention provides a gene nanocomposite comprising a polymer conjugated with a photosensitizer, and more specifically, a polymer conjugated with a photosensitizer; And a gene nanocomposite comprising at least one of a gene and a gene / cationic polymer complex.
  • the nanocomposite may be used for cell internalization of genes, and more specifically, since the nanocomposite is composed of an optical sensitizer, a gene, and a polymer, when the cell is treated, a receptor-mediated endocytosis ( endocytosis) into the cells.
  • endocytosis a receptor-mediated endocytosis into the cells.
  • photons are irradiated to excite the photosensitizer, and the breakdown of the endosomes or lysosomes is caused by the generation of active oxygen caused by the photosensitizer excitation Can be induced. This can prevent the genetic degradation of the nanocomposite in the cell and can further improve the cell re- internalization rate of the gene.
  • genes can be applied to gene therapy by adding a variety of bioactive substances that are applied to gene therapy.
  • the gene nanocomposite is formed by the electrostatic interaction between the photosensitive agent conjugated polymer and the gene and / or gene / cationic polymer complex.
  • it may be an ionic binder, and more specifically, when the polymer to which the photosensitizer is conjugated exhibits anionicity, and the gene / cationic polymer complex exhibits cationicity, an electrostatic interaction between them may be used to generate genes and light.
  • the sensitizer and the polymer may form an integrated nanocomposite.
  • the photosensitive agent conjugated polymer exhibits cationicity and the gene exhibits anionicity
  • the nanocomposite of the gene, the photosensitizer and the polymer may be formed by electrostatic interaction between them.
  • the particle size of the gene nanocomposite may be 400 nm or less, preferably 300 nm or less, more preferably 50 nm to 300 nm.
  • the photosensitive agent conjugated polymer may form a gene nanocomposite in which a photosensitive agent and a gene are integrated together with a gene and / or a gene / polymer complex, and may induce cell internalization of a gene more safely.
  • the photosensitive agent conjugated polymer is a photosensitive agent conjugated to at least one selected from the group consisting of cationic and anionic polymers, preferably an anionic polymer.
  • the polymer is a polymer having a weight average molecular weight of 100 to 10,000.
  • the anionic polymers include chondroitin-6-sulfate (C6S), heparan sulfate (HS), heparan sulfate proteoglycan (HSPG), heparin, chondroitin-4-sulfate (C4S), chondroitin-6-sulfate (C6S), more It may be at least one member selected from the group consisting of martan sulfate (DS), keratan sulfate (KS) and hyaluronic acid (HA), preferably chondroitin-6-sulfate (C6S) having a repeating unit of 20 to 100.
  • the cationic polymers are linear or branched polyethyleneimine (PEI), glycol chitosan (GC), chitosan, poly-L-lysine (PLL), poly-beta-amino ester polymer, poly (amidoamine) (PAMAM ) Dendrimers and derivatives thereof, and may be at least one selected from the group consisting of polyethyleneimine.
  • PEI polyethyleneimine
  • GC glycol chitosan
  • PLL poly-L-lysine
  • PAMAM poly-beta-amino ester polymer
  • Dendrimers and derivatives thereof may be at least one selected from the group consisting of polyethyleneimine.
  • the photosensitizer is a material that absorbs a light source having a specific wavelength and is excited, and reacts with the surrounding substrate or oxygen in the excited state to generate active oxygen.
  • the photosensitizer can be used without limitation as long as it is applicable to the human body, specifically, porphyrin-based (porphyrins) compound, chlorines (chlorines) compound, bacteriochlorines (bacteriochlorines), phthalocyanine (Phthalocyanines), It may be one or more selected from the group consisting of phthalocyanine-based compounds (naphthalocyanines) compounds and 5-aminolevulin ester compounds (5-aminolevuline esters), preferably a porphyrin-based compound.
  • the photosensitizer is benzoporphyrin, meso-tetraphenylporphyrin, meso-tetra (4-sulfonatophenyl) porphine )), Pheophytin a, pheophorbide a, chlorin e6, tetrasulfophthalocyanine, aluminum phthalocyanine, and the like.
  • the gene may be used without limitation as long as it is applicable to gene therapy, and preferably may be a gene encoding green fluorescence protein and a therapeutic gene that exhibits anticancer effects such as Si-RNA and Sh-RNA. .
  • it may be a bioactive material that can be applied to various gene therapies.
  • the therapeutic gene may be EGFR sh-RNA or the like that inhibits an EGFR (Epidermal growth factor receptor) gene, and the physiologically active substance may be oligouncleotide, ribozyme, plasmid, or antisense. Gene (antisense DNA) and the like.
  • the gene according to the present invention may include one or more of the above-mentioned genes and bioactive substances.
  • the gene / cationic polymer complex is formed by an electrostatic interaction between a negatively charged gene and a cationic polymer, and the gene is as mentioned above.
  • the cationic polymer is a polymer having a weight average molecular weight of 100 to 100,000, for example, linear or branched polyethyleneimine (PEI), glycol chitosan (GC), chitosan, poly-L-lysine (PLL), poly- It may be at least one selected from the group consisting of beta-amino ester polymers, poly (amidoamine) (PAMAM) dendrimers and derivatives thereof, preferably polyethylenimine.
  • PEI polyethyleneimine
  • GC glycol chitosan
  • PLL poly-L-lysine
  • PAMAM poly (amidoamine) dendrimers and derivatives thereof, preferably polyethylenimine.
  • the particle size of the gene / cationic polymer composite may be 300 nm or less, preferably 250 nm or less, and more preferably 50 nm to 250 nm.
  • the present invention provides a method for producing the gene nanocomposite.
  • the method for preparing the gene nanocomposite includes preparing a polymer to which a photosensitizer is conjugated, and mixing the same.
  • the preparing of the polymer to which the photosensitizer is bonded is a step of bonding the photosensitizer to the polymer.
  • the photosensitizer and polymer are as mentioned above.
  • the mixing ratio of the polymer to the photosensitizer in the step of preparing the polymer to which the photosensitizer is bonded is 1: 1 to 1:30 (mol / mol), preferably 1: 1 to 1:10, more preferably 1: 1 to 1: 5 (mol / mol).
  • the mixing ratio When the mixing ratio is included in the above range, it prevents the change of polymer properties that may inhibit the formation of the gene nanocomposites such as the structure and charge change of the polymer due to the photosensitizer and lowers the toxicity of the cells by the photosensitizer or the polymer. Can be.
  • the mixing step is a step of preparing a complex by mixing and reacting at least one of a gene and a gene / cationic polymer complex and a polymer conjugated with a photosensitizer.
  • the mixing ratio of one or more of the genes and the polymer / cationic polymer complexes to the photosensitive agent conjugated polymer is 1: 0.1 to 1: 100 (w / w), preferably 1: 0.5 to 1: 70 (w / w).
  • the mixing ratio is included in the above range, the gene nanocomposite is well formed according to the electrostatic interaction between the photosensitive agent conjugated polymer and the gene and / or gene / cationic polymer complex. It is possible to improve the internalization rate and gene expression efficiency of the gene is smoothly generated.
  • a polymer in which the photosensitizer is conjugated in the mixing step And one or more of genes and gene / cationic polymer complexes, and reacted at 18 to 37 ° C. for 20 minutes to 1 hour.
  • the method may further include preparing the gene / cationic polymer complex after preparing the polymer to which the photosensitizer is conjugated when the gene / cationic polymer complex is mixed in the mixing step.
  • the step of preparing the gene / cationic polymer complex is a step of mixing the gene and the cationic polymer to prepare a complex by the electrostatic interaction between them. For example, ionic conjugates of genes and cationic polymers can be formed.
  • the N / P ratio (the number of nitrogen atoms of the cationic polymer / the number of phosphate atoms of the gene) is 0.1 to 100, preferably 0.1 to 50. When the N / P ratio is included within the above range, the gene stabilization by the cationic polymer is well achieved to increase the cell uptake rate and form a stable gene nanocomposite.
  • the present invention provides a method for cell internalization of a gene using the gene nanocomposite.
  • the method may induce cell internalization of genes by fusing gene therapy and photodynamic therapy to enhance gene expression and maximize gene therapy effects.
  • the cell internalization method includes processing a gene nanocomposite for processing a gene nanocomposite on a cell and irradiating a light source for irradiating the cell with a light source after the processing step.
  • the gene processing step may be incubated for 10 minutes to 24 hours, preferably 10 minutes to 10 hours at room temperature to 50 °C, preferably room temperature to 40 °C.
  • the room temperature is not particularly limited, but may be 15 to 25 °C.
  • the content of the gene nanocomposite in the step of treating the gene nanocomposite may be appropriately selected according to the type of cell, patient condition, treatment method, etc., preferably 0.01mg to 10mg / kg body weight.
  • the cells are mammalian-derived cells, more specifically squamous cell carcinoma, cervical cancer, cervical cancer, prostate cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, brain tumor, breast cancer, liver cancer, skin cancer, esophageal cancer, testicular cancer, kidney Cancer cells of cancer, colon cancer, rectal cancer, gastric cancer bladder cancer, ovarian cancer and bile duct cancer; It may be one or more selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells and fat stem cells.
  • the irradiating the light source may irradiate a light source to a cell treated with the gene nanocomposite to excite a photosensitizer, and generate an active oxygen according to the excitation of the photosensitizer to secrete an enzyme that decomposes a gene in a cell. Destroys endosomes or lysosomes, and increases cellular internalization of genes.
  • the wavelength, intensity, irradiation amount, etc. of the photons can be appropriately adjusted according to the type of the photosensitizer, the amount of the photosensitizer, the cell type, and the like.
  • energy up to / cm 2 preferably 0.1 to 200 J / cm 2 , more preferably 0.1 to 20 J / cm 2 , more preferably 0.1 to 10 J / cm 2 , most preferably 0.1 to 2 J / Irradiation with an energy of cm 2 may induce sufficient activity of the photosensitizer and lower the incidence of cytotoxicity.
  • the cell internalization method may be applied to a gene therapy method, and more specifically, it may be applied to a gene therapy method for treating genetic diseases, circulatory diseases, immune system diseases, endocrine diseases, cancer diseases, and stem cells.
  • a light sensitizer (50 mg) as shown in Chemical Formula 1 was added to N-hydroxysuccinimide (HoSu), N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (N, N'-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC) and Dissolve together in DMSO.
  • Dicyclohexylurea (DCU) produced after the reaction for 6 hours was removed using a filter, the reaction was mixed with 100mg polyethyleneimine (MW25000) dissolved in DMSO and reacted for 24 hours.
  • the reaction solution was dialyzed with primary distilled water for 2 days using a dialysis membrane (Spectra / Por; mol.wt.cutoff size, 1000). After dialysis, the reaction was lyophilized, and a polyethylenimine-photosensitizer conjugate of Formula 2 was obtained through this procedure.
  • Acetylated chondroitin sulfate (0.1 g) prepared in Example 2 was dissolved in DMSO (20 ml). N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 4-dimethylaminopyridine (4-dimethylaminopyridine, DMAP) is added at 1.5 times the molar ratio of the photosensitizer, respectively. Each of the two solutions was stirred at room temperature for 3 hours, then mixed and reacted for 24 hours. To remove unreacted photosensitizer, dialysis membrane (Spectra / Por; mol.wt.cutoff size, 3000) was used for dialysis with primary distilled water for 2 days. After dialysis, the reaction product was lyophilized, and an anionic polymer conjugated with a photosensitizer such as Chemical Formula 4 was obtained through this process.
  • a photosensitizer such as Chemical Formula 4
  • Example 1 with 2 ⁇ g of shRNA, EGFR shRNA, which causes interference of GFP (Green fluorescence protein) or EGFR (Epidermal growth factor receptor) genes to prepare ionic complexes of gene / polyethylenimine-photosensitizers 2 ⁇ g of the polyethylenimine-photosensitive sensitizer was prepared by placing it in ⁇ -MEM (Minimum essential medium eagle alpha modification, hyclone, USA) without FBS and reacting at room temperature for 10 minutes.
  • ⁇ -MEM Minimum essential medium eagle alpha modification, hyclone, USA
  • a gene / cationic polymer complex was prepared as follows. GFP gene or plasmid (Clontech, USA) was used to prepare the complex. 2 ⁇ g of plasmid and 2 ⁇ g of polyethyleneimine were added to ⁇ -MEM (Minimum essential medium eagle alpha modification, hyclone, USA) without FBS. After the reaction was prepared for 10 minutes at room temperature.
  • GFP gene or plasmid (Clontech, USA) was used to prepare the complex. 2 ⁇ g of plasmid and 2 ⁇ g of polyethyleneimine were added to ⁇ -MEM (Minimum essential medium eagle alpha modification, hyclone, USA) without FBS. After the reaction was prepared for 10 minutes at room temperature.
  • ⁇ -MEM Minimum essential medium eagle alpha modification, hyclone, USA
  • the photosensitizer was mixed in a ratio of 1: 1, 1: 5, 1:10, and 1:50 in mass ratio and then incubated at room temperature for 30 minutes to form a nano ion composite.
  • a signal around 1.8-2.2 ppm was detected in the 1H-NMR peak of chondroitin sulfate acetate, indicating that acetate formation of chondroitin sulfate was achieved.
  • the 1H-NMR peak of chondroitin sulfate acetate-photosensitizer detected a photosensitizer specific signal in the vicinity of 3.1-3.3 ppm, indicating that the photosensitizer was conjugated to the acetateized chondroitin sulfate.
  • the particle size of the gene / polyethylenimine-photosensitizer ion complex was about 150 nm, and the surface charge showed a strong positive charge of +35 mV.
  • the ion complex of the gene / cationic polymer complex and chondroitin sulfate acetate-photosensitizer was about 200 nm, and the surface charge showed a strong negative charge of about 18 to -40 mV as the mass ratio of the anionic polymer photosensitizer increased. Based on this experiment, the ratio of the gene / cationic polymer complex and anionic polymer photosensitizer used in Experiment 3 was fixed at (1:50 mass ratio).
  • HCT-116 a human colorectal cancer cell, was purchased from Korea Cell Line Bank, and RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640) containing 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% penicillin / streptomycin (Gibco, USA).
  • HCT-116 Human colon cancer cells
  • HCT-116 Human colon cancer cells
  • HCT-116 were cultured by dispensing in a 35 mm culture dish, and grown to about 70% of the culture dish area, and treated with the prepared nano ion conjugates. After 4 hours, the cells were irradiated with 0-1.0 J / cm 2 laser using a near-infrared laser (HeNe laser, 633 nm), and after 24 hours of further incubation in a 37 ° C. incubator, gene expression was confirmed.
  • HeNe laser near-infrared laser
  • Green fluorescent protein expression was confirmed by Western blot and polymerase chain reaction in order to confirm the efficiency of green fluorescent protein gene transfer to human colorectal cancer cells (HCT-116) by photo sensitizer and near infrared laser at the protein level.
  • transfection of human colon cancer cells (HCT-116) was performed in the same manner as in Experimental Example 3, and then cells were collected by trypsin-EDTA and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. .
  • the whole protein was purified using a protein separation buffer (40 mM Tris-HCl, pH8.0, 120 mM NaCl, 0.5% NP-40, 2 ⁇ g / ml aprotinin, 2 ⁇ g / ml leupetin, 100 ⁇ g / ml PMSF). Separated. The amount of total protein was measured using the BCA Protein Assay Kit (Thermo, USA).
  • a protein separation buffer 40 mM Tris-HCl, pH8.0, 120 mM NaCl, 0.5% NP-40, 2 ⁇ g / ml aprotinin, 2 ⁇ g / ml leupetin, 100 ⁇ g / ml PMSF.
  • the separated protein was quantified by the above method, and the same amount of protein was loaded on a 12% SDS polyacrylamide gel, followed by electrophoresis, and the separated protein was transferred to a PVDF membrane (Bio-Rad, USA) by a transblot device (Bio-Rad, USA).
  • the membranes were incubated for 1 hour and 30 minutes in 5% fat-free dry milk dispersed in TBS-T (25 mM Tris-HCL, pH7.4, 150 mM NaCl, 0.2% Tween 20) to block nonspecific protein binding.
  • Mouse anti-GFP was incubated at 4 ° C.
  • trypsin-EDTA was treated and cells were collected and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, 1 ml of Trizol solution (sigma, USA) was added to each sample, and the cells were gently pulverized by pipetting, followed by mixing with 200 ⁇ l of chloroform. After incubation at room temperature for 5 minutes, it was centrifuged at 13000xg for 15 minutes at 4 ° C. The colorless supernatant was then transferred to a new tube, incubated for 10 min with 500 ⁇ l of isopropyl alcohol. After centrifugation at 4 ° C.
  • RNA pellet was dissolved in distilled water treated with DEPC (diethyl pyrocarbonate) and the concentration was measured using a spectrophotometer.
  • the gene sequence of the primer used in the scheme is shown in Table 2 below, ß-actin primer was used as a control.
  • the polymerase chain reaction product was confirmed by electrophoresis using 1% agarose gel after taking 5 ⁇ l.
  • the ionic complex of the gene / polyethylenimine-photosensitizer showed the increase in the expression of the green fluorescent gene and the band appeared thick as the laser was irradiated.
  • EGFR shRNA an inhibitory gene of the EGFR gene
  • Example 5 was prepared in the nanocomposite (1:50 mass ratio) as in Example 5 and transfected into cells in the same manner as in Experiment 3. . Then EGFR gene inhibition effect was confirmed through real-time polymerase chain reaction.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 유전자 나노 복합체 및 이를 이용한 유전자의 세포 내재화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 광감작제가 접합된 고분자; 및 유전자 및 유전자/양이온성 고분자 복합체 중 1종 이상;을 포함하는 유전자 나노 복합체 및 이를 이용한 유전자의 세포 내재화 방법을 제공한다. 본 발명은 포유동물 유래 세포 내로 유전자 전달 효율 및 유전자 발현을 보다 향상시킬 수 있다.

Description

유전자 나노 복합체 및 이를 이용한 유전자의 세포 내재화 방법
본 발명은 광감작제가 접합된 고분자를 포함하는 유전자 나노 복합체 및 이를 이용한 유전자의 세포 내재화 방법에 관한 것이다.
유전자 치료란 질병을 유발하는 유전자를 대신할 수 있는 정상 유전자를 외부로부터 도입함으로써 유전자가 본래 기능을 나타내게 할 수 있도록 하는 것으로, 유전적 질병과 그 외 순환기계 질환, 면역계 질환, 내분비 질환, 암 등을 치유하기 위한 방법으로 고려되고 있다. 하지만, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 세포내로의 유전자 전달이 필수적이며, 이를 위해, 바이러스 혹은 비 바이러스 벡터 등의 전달체를 이용한 방법, 미세유리관 주입법, 초음파 또는 전기충격법 등의 물리적 방법을 이용하여 유전자를 세포내로 전달하는 방법이 연구되고 있다.
상기 바이러스 혹은 비 바이러스 벡터 등의 전달체를 이용한 방법에서 바이러스 벡터로는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 등의 대표적이며, 이들은 감염성이 높기 때문에 유전자 전달 효율이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 하지만 숙주의 염색체 내에 삽입 시 돌연변이 유발, 감염성 바이러스 생성, 숙주 내 염증반응 유발 가능성으로 인해 사용이 제한되고 있다. 따라서, 양이온성 고분자 등의 비 바이러스성 벡터를 이용하는 방법이 제조방법의 간편성이나 상대적으로 낮은 위험성 때문에 많이 연구되고 있으며, 이는 음전하를 띄고 있는 유전자와 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성하여 유전자를 안정화시키고, 양전하를 띄고 있기 때문에 세포 내 전달이 용이하다는 장점이 있다고 보고되고 있다.
하지만, 양이온성 고분자는 바이러스성 전달체보다는 덜하나 충분한 효과를 얻기 위해 필요한 양을 사용할 경우에 심각한 독성을 유발할 수 있고, 목적 세포만의 특이적 전달이 어려운 단점이 있다. 또한, 혈중에서 다양한 단백질과 결합을 이룰 수 있기 때문에 안정성이 매우 떨어지므로 생체 내에서는 이용하기 어렵다. 따라서, 이러한 점을 보완하기 위하여 유전자/양이온성 고분자 복합체와 음이온성 고분자와의 3차 복합체를 형성시켜 독성과 혈중 불안정성을 해결하는 방법이 연구되었다. 하지만, 이러한 유전자/양이온성 고분자/음이온성 고분자 3차 복합체는 독성은 낮출 수 있으나 반면 유전자 전달 효율이 현저히 낮아지며 또한 여전히 목적 세포 특이적 전달의 어려움을 해결하기에는 기술적 어려움이 있다.
또한, 위와 같은 비 바이러스성 유전자 전달 벡터와 유전자 복합체는 엔도사이토시스 (endocytosis)에 의해 내부 이행된다고 보고되어 있다. 하지만 이와 같이 엔도사이토시스를 통해 이입된 유전자/비바이서성 벡터 복합체는 엔도좀 (endosome) 내에 체류하게 되며 이는 곧 융해소체와 융합하여 융해소체 내에 존재하는 각종 소화 효소들에 의해 유전자의 분해가 일어나 유전자 효율을 현저히 떨어뜨린다. 따라서, 엔도사이토시스를 통해 이입된 유전자/비 바이러스성 벡터 복합체가 엔도좀으로부터 이탈하여 세포질로 이동하는 능력이 유전자 전달 효율을 높이는데 매우 중요한 요소로 작용한다.
한편, 광역학 치료법 (photodynamic therapy, PDT)은, 광감작제 (photosensitizer)와 적절한 빛 (광자)를 이용하여 병변 부위를 수술 없이 치료할 수 있는 기술이다. 이에 사용되는 광감작제로는 포르피린 (porphyrin) 류의 화합물이 대표적이며, 이는 잠분이나 뽕잎, 녹조류 등에서 추출되고 적합한 분광학적 특성을 가지며, 세포투과력이 비교적 큰 적색광(700-900 nm)에 의해 전자 전이를 일으키는 성질이 있다. 광감작제는 특정 파장의 빛에 의해 여기 (excitation) 될 때 활성 산소 (일항 산소, 산소 라디칼, superoxide 및 peroxide)를 생성해 낸다. 생성된 활성 산소는 지질, 단백질 및 핵산의 산화와 세포내 구조의 파괴에 관여하여 세포의 사멸을 초래한다.
또한, 광감작제 물질로서 포르피린 유도체는 암세포 선택적으로 축적되는데, 이는 포르피린 수송을 담당하는 저밀도지방단백질 (low density lipoprotein, LDL)에 대한 수용체가 암세포에 많이 발현되어 있기 때문이라 설명된다. 그러나 대부분의 광감작제는 난용성이며, 인체 잔류시간이 길어 나타나는 광독성으로 인해 인체에서 부작용이 나타난다. 또한, 광감작제를 이용한 치료방법은 적적한 빛 (광자)의 조사가 필수적이나, 병변 부위로의 빛 투과 제한으로 부피가 큰 종양에는 사용이 불가능한 단점이 있다.
따라서 광역학 치료법과 유전자, 항암제, 단백질 약물 등의 약물 치료를 단독으로 수행하는 것이 아닌 상기 두 치료 방법을 융합하여 그 치료 효과를 높일 수 있는 방법이 연구되고 있다. 하지만 기존의 방법은 유전자, 항암제 혹은 단백질 약물이 광감작제와 동시에 목적 부위에 전달하는 것이 아닌 광감작제를 선 주입한 후 약물을 일정 시간 지난 뒤 광자를 조사하는 방법을 사용하고 있다. 이러한 방법은 각 약물을 여러 차례 걸쳐 주입해야 하며, 병변 부위로 만의 전달이 불가능하며, 광감작제와 치료용 약물이 일체형이 아니므로 두 약물이 세포 내 동일한 부분에 위치하지 않을 수 있다는 단점이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은, 광역학치료에 사용되는 광감작제와 유전자를 일체화시켜 포유동물 유래 세포로의 유전자의 세포 내재화 및 유전자 발현 효율을 향상시킬 수 있는 유전자 나노 복합체 및 이를 이용한 유전자의 세포 내재화 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 양상은,
광감작제가 접합된 고분자; 및
유전자 및 유전자/양이온성 고분자 복합체 중 1종 이상을 포함하는 유전자 나노 복합체에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상은,
광감작제를 고분자에 접합시켜 광감작제가 접합된 고분자를 제조하는 단계;
상기 광감작제가 접합된 고분자; 및 유전자 및 유전자/양이온성 고분자 복합체를 중 1종 이상을 혼합하는 단계;를 포함하는 유전자 나노 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은,
본 발명에 의한 유전자 나노 복합체를 세포에 처리하는 유전자 나노 복합체를 처리하는 단계; 및
상기 처리단계 이후에 상기 세포에 광원을 조사하는 광원을 조사하는 단계;를 포함하는 유전자의 세포 내재화 방법에 관한 것이다.
본 발명은 광역학치료에 사용되는 광감작제가 접합된 고분자를 적용하여, 광감작제, 유전자 및 이온성 고분자가 일체화된 유전자 나노 복합체를 형성하고, 이를 이용하여 유전자의 세포 내재화를 증가시키고, 유전자 발현 효율을 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 나노 복합체에 생리활성물질을 더 추가하여 다양한 유전자 전달을 이용한 각종 질병에 대한 유전자 치료에 적용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 3에 따른 폴리에틸렌이민 광감작제 접합체 (A) 또는 아세틸화된 콘드로이친 설페이트와 광감작제 접합체 (B)의 H1-NMR 분석을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 5 와 6에 따른 유전자 나노 복합체의 입자 특성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실험예 4에 따른 HCT-116 세포에서의 녹색 형광 단백질 및 녹색 형광 단백질 mRNA의 발현을 웨스턴 블롯 (A)과 중합효소 연쇄반응 (B)을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실험예 5에 따른 HCT-116 세포에서의 EGFR 단백질 및 mRNA의 발현 억제 효과를 웨스턴 블롯 (A)과 실시간 중합효소 연쇄반응 (B)을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 관하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 광감작제가 접합된 고분자를 포함하는 유전자 나노 복합체를 제공하는 것이며, 보다 구체적으로 광감작제가 접합된 고분자; 및 유전자 및 유전자/양이온성 고분자 복합체 중 1종 이상을 포함하는 유전자 나노 복합체에 관한 것이다.
유전자 나노 복합체
상기 나노 복합체는 유전자의 세포 내재화용으로 이용될 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 나노 복합체는 광감작제, 유전자 및 고분자가 일체화로 이루어져 있으므로, 세포에 처리할 경우에 수용기 (receptor) 매개 엔도사이토시스 (endocytosis)를 통한 세포로의 흡수가 이루어진다. 또한, 엔도좀 혹은 라이소좀 내의 다양한 효소에 의한 유전자의 분해를 막기 위해서 광자를 조사하여 광감작제를 여기시키고, 상기 광감작제의 여기에 따른 활성산소의 발생으로 엔도좀 혹은 라이소좀의 붕괴를 유도할 수 있다. 이로 인하여 세포 내에서 상기 나노 복합체의 유전자 분해를 방지할 수 있고 상기 유전자의 세포 재내화율을 보다 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 유전자 외에 유전자 치료에 적용되는 다양한 생리활성물질을 추가하여 유전자 치료에 적용할 수 있다.
상기 유전자 나노 복합체는 광감작제가 접합된 고분자와 유전자 및/또는 유전자/양이온성 고분자 복합체 간의 정전기적 상호작용으로 형성된 것이다. 예를 들어, 이온 결합체일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 광감작제가 접합된 고분자가 음이온성을 나타내고, 유전자/양이온성 고분자 복합체가 양이온성을 나타낼 경우에 이들 간의 정전기적 상호 작용으로 유전자, 광감작제 및 고분자가 일체화된 나노 복합체를 형성할 수 있다. 또한, 상기 광감작제가 접합된 고분자가 양이온성을 나타내고, 유전자가 음이온성을 나타낼 경우에 이들 간의 정전기적 상호 작용으로 유전자, 광감작제 및 고분자가 일체화된 나노 복합체를 형성할 수 있다.
상기 유전자 나노 복합체의 입자 크기는 400 nm 이하일 수 있고, 바람직하게는 300 nm 이하, 더 바람직하게는 50 nm 내지 300 nm이다.
광감작제가 접합된 고분자
상기 광감작제가 접합된 고분자는 유전자 및/또는 유전자/고분자 복합체와 함께 광감각제와 유전자가 일체화로 이루어진 유전자 나노 복합체를 형성할 수 있고, 보다 안전하게 유전자의 세포 내재화를 유도할 수 있다.
상기 광감작제가 접합된 고분자는 광감작제가 양이온성 및 음이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 접합된 것이며, 바람직하게는 음이온성 고분자이다. 상기 고분자는 중량평균 분자량 100 내지 10,000인 고분자이다. 상기 음이온성 고분자는 콘드로이틴-6-설페이트 (C6S), 헤파란설페이트 (HS), 헤파란설페이트 프로테오글리칸 (HSPG), 헤파린, 콘드로이틴-4-설페이트 (C4S), 콘드로이틴-6-설페이트 (C6S), 더마탄 설페이트 (DS), 케라탄 설페이트 (KS) 및 히알루론산 (HA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 반복단위가 20 내지 100인 콘드로이틴-6-설페이트 (C6S)이다.
상기 양이온성 고분자는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌이민 (PEI), 글라이콜 키토산 (GC), 키토산, 폴리-L-리신 (PLL), 폴리-베타-아미노 에스터 고분자, 폴리(아미도아민)(PAMAM) 덴드리머 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌이민이다.
상기 광감작제는 특정 파장의 광원을 흡수하여 여기되고, 상기 여기 상태에서 주변의 기질 또는 산소와 반응하여 활성 산소를 발생하는 물질이다. 상기 광감작제는 인체에 적용가능한 것이라면 제한 없이 이용될 수 있으며, 구체적으로, 포르피린계(porphyrins) 화합물, 클로린계(chlorines) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorines) 화합물, 프탈로시아닌계(Phthalocyanines) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminolevuline esters) 화합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 포르피린계 화합물이다. 보다 구체적으로, 상기 광감작제는 벤조포르피린 (benzoporphyrin), 메소-테트라페닐포르핀 (meso-tetraphenylporphyrin), 메소-테트라(4-설포네이토페닐)포르핀(meso-tetra(4-sulfonatophenyl)porphine)), 페오피틴 a (pheophytin a), 페오포비드 a(pheophorbide a), 클로린 e6 (chlorin e6), 테트라설포프탈로시아닌 (tetrasulfophthalocyanine), 알루미늄 프탈로시아닌(aluminum phthalocyanine) 등일 수 있다.
유전자 및 유전자/고분자 복합체
상기 유전자는 유전자 치료에 적용 가능한 것이라면 제한 없이 사용될 수 있고, 바람직하게는 녹색 형광 단백질 (green fluorescence protein)을 암호화하는 유전자 및 Si-RNA 및 Sh-RNA 등의 항암 효과를 나타내는 치료용 유전자 일 수 있다. 또한, 다양한 유전자 치료에 적용할 수 있는 생리활성물질일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 치료용 유전자는 EGFR (Epidermal growth factor receptor) 유전자를 억제하는 EGFR sh-RNA 등일 수 있고, 상기 생리활성물질은 올리고누클레오티드(oligoouncleotide), 리보자임(ribozyme), 플라스미드(plasmid), 안티센스 유전자(antisense DNA) 등일 수 있다. 본 발명에 의한 유전자는 상기 언급한 유전자 및 생리활성 물질 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 유전자/양이온성 고분자 복합체는 음전하를 띠는 유전자와 양이온성 고분자 간의 정전기적 상호 작용으로 형성된 것이며, 상기 유전자는 상기 언급한 바와 같다. 상기 양이온성 고분자는 중량평균 분자량 100 내지 100,000인 고분자이며, 예를 들어, 선형 또는 분지형 폴리에틸렌이민 (PEI), 글라이콜 키토산 (GC), 키토산, 폴리-L-리신 (PLL), 폴리-베타-아미노 에스터 고분자, 폴리(아미도아민)(PAMAM) 덴드리머 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌이민이다.
상기 유전자/양이온성 고분자 복합체의 입자 크기는 300 nm 이하일 수 있고, 바람직하게는 250 nm 이하, 더 바람직하게는 50 nm 내지 250 nm이다.
본 발명은 상기 유전자 나노 복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 유전자 나노 복합체의 제조방법은 광감작제가 접합된 고분자를 제조하는 단계, 및 혼합하는 단계를 포함한다.
상기 광감작제가 접합된 고분자를 제조하는 단계는 광감작제를 고분자에 접합시키는 단계이다. 상기 광감작제 및 고분자는 상기 언급한 바와 같다. 상기 광감작제가 접합된 고분자를 제조하는 단계에서 고분자 대 광감작제의 혼합비는 1:1 내지 1:30(mol/mol)이며, 바람직하게는 1:1 내지 1:10이며, 더 바람직하게는 1:1 내지 1:5(mol/mol)이다. 상기 혼합비가 상기 범위 내로 포함되면 광감작제로 인해 고분자의 구조 및 전하 변화 등과 같은 유전자 나노 복합체의 형성을 저해할 수 있는 고분자 특성 변화를 방지하고, 광감작제 또는 고분자에 의한 세포의 독성 유발을 낮출 수 있다.
상기 혼합하는 단계는 유전자 및 유전자/양이온성 고분자 복합체 중 1종 이상과 광감작제가 접합된 고분자를 혼합하고 반응시켜 복합체를 제조하는 단계이다.
상기 혼합하는 단계에서 유전자 및 유전자/양이온성 고분자 복합체 중 1종 이상 대 광감작제가 접합된 고분자의 혼합비는 1:0.1 내지 1:100(w/w)이며, 바람직하게는 1:0.5 내지 1:70(w/w)이다. 상기 혼합비가 상기 범위 내로 포함되면 광감작제가 접합된 고분자와 유전자 및/또는 유전자/양이온성 고분자 복합체 간의 정전기적 상호 작용에 따른 유전자 나노 복합체의 형성이 잘 이루어지고, 광감작제에 의한 활성산소의 발생이 원활하게 이루어져 유전자의 내재화율 및 유전자 발현 효율을 보다 향상시킬 수 있다.
상기 혼합하는 단계에서 광감작제가 접합된 고분자; 및 유전자 및 유전자/양이온성 고분자 복합체 중 1종 이상을 혼합하고 18 내지 37 ℃에서 20 분 내지 1 시간 동안 반응시킬 수 있다.
또한, 상기 혼합하는 단계에서 유전자/양이온성 고분자 복합체를 혼합할 경우에 상기 광감작제가 접합된 고분자를 제조하는 단계 이후에 상기 유전자/양이온성 고분자 복합체를 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 유전자/양이온성 고분자 복합체를 제조하는 단계는 유전자 및 양이온성 고분자를 혼합시켜 이들 간의 정전기적 상호 작용에 의한 복합체를 제조하는 단계이다. 예를 들어, 유전자 및 양이온성 고분자의 이온 결합체를 형성할 수 있다. 상기 고분자 복합체를 제조하는 단계에서 N/P비(양이온성 고분자의 질소 원자 개수/유전자의 인산염 원자 개수)는 0.1 내지 100이며, 바람직하게는 0.1 내지 50이다. 상기 N/P비가 상기 범위 내로 포함되면 양이온성 고분자에 의한 유전자 안정화가 잘 이루어져 세포 흡수율을 높이고, 안정적인 유전자 나노 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명은 상기 유전자 나노 복합체를 이용한 유전자의 세포 내재화 방법을 제공한다.
상기 방법은 유전자 치료와 광역학 치료를 융합하여 유전자의 세포 내재화를 유도하여 유전자 발현을 향상시키고, 유전자 치료 효과를 극대화시킬 수 있다.
상기 세포 내재화 방법은 유전자 나노 복합체를 세포에 처리하는 유전자 나노 복합체를 처리하는 단계 및 상기 처리단계 이후에 상기 세포에 광원을 조사하는 광원을 조사하는 단계를 포함한다.
상기 유전자 처리단계는 상온 내지 50 ℃, 바람직하게는 상온 내지 40 ℃에서 10 분 내지 24 시간, 바람직하게는 10 분 내지 10 시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 상기 상온은 특별히 한정하지 않으나, 15 내지 25 ℃일 수 있다.
상기 유전자 나노 복합체를 처리하는 단계에서 유전자 나노 복합체의 함량은 세포의 종류, 환자 상태, 치료방법 등에 따라서 적절하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 0.01mg 내지 10mg/kg body weight이다.
상기 유전자 나노 복합체를 처리하는 단계에서 세포는 포유류 유래 세포이며, 보다 구체적으로 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암 방광암, 난소암 및 담관암의 암세포; 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포 및 지방 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 광원을 조사하는 단계는 유전자 나노 복합체가 처리된 세포에 광원을 조사하여 광감작제를 여기시키고, 상기 광감작제의 여기에 따른 활성산소를 발생시켜 세포 내의 유전자를 분해시키는 효소 등을 분비하는 엔도좀 또는 라이소좀 등을 파괴하고, 유전자의 세포 내재화를 증가시킨다.
상기 광원을 조사하는 단계에서 광자의 파장, 강도, 조사량 등은 광감작제의 종류, 광감작제의 처리양 및 세포의 종류 등에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 파장 500 내지 700 nm 의 광원을, 200 J/cm2이하 에너지, 바람직하게는 0.1 내지 200 J/cm2, 더 바람직하게는 0.1 내지 20 J/cm2, 더 바람직하게는 0.1 내지 10 J/cm2, 가장 바람직하게는 0.1 내지 2 J/cm2의 에너지로 조사하여 광감작제의 충분한 활성을 유도하면서 세포 독성의 발생을 낮출 수 있다.
상기 세포 내재화 방법은 유전자 치료방법에 적용될 수 있으며, 보다 구체적으로 유전적 질병, 순환계 질환, 면역계 질환, 내분비 질환, 암질환 치료, 줄기세포를 이용한 치료를 위한 유전자 치료 방법에 적용될 수 있다.
이하 본 발명을 하기의 실시예 및 비교예에 의하여 보다 구체적으로 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 예에 지나지 않으며, 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.
[ 실시예 1]
폴리에틸렌이민 광감작제의 접합
하기의 화학식 1과 같은 광감작제(50mg)를 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide, HoSu), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC)와 함께 DMSO에 녹인다. 6시간 동안 반응한 후 생성된 Dicyclohexylurea (DCU)는 필터를 이용하여 제거하였고, 그 외 반응물을 DMSO에 녹여진 폴리에틸렌이민 (MW25000) 100mg과 혼합한 후 24시간 반응하였다. 반응 액을 투석막 (Spectra/Por; mol.wt. cutoff size, 1000)을 이용하여 2일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하였고, 본 과정을 통해 하기의 화학식 2와 같은 폴리에틸렌이민-광감작제 접합체를 수득하였다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2012010744-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2012010744-appb-I000002
[ 실시예 2]
음이온성 고분자 콘드로이친 설페이트의 아세틸화
콘드로이친 설페이트 (Carl ROTH, 5197, Germany) 1g을 포름아미드 (Kanto chemical, Japan) 10 ml에 녹인 후, 피리딘 (Junsei, Japan)을 2 ml을 첨가하고 30분 후 아세트산 무수물 (Junsei, Japan)을 2 ml 첨가하였다. 12시간 동안 반응시킨 후 반응액을 투석막 (Spectra/Por; mol.wt. cutoff size, 3000)을 이용하여 2일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하였고, 본 과정을 통해 하기의 화학식 3과 같은 아세틸화된 콘드로이친 설페이트를 수득하였다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2012010744-appb-I000003
[ 실시예 3]
음이온성 고분자 콘드로이친 설페이트와 광감작제의 접합
상기 실시예 2에서 제조한 아세틸화된 콘드로이친 설페이트 (0.1g)을 DMSO (20ml)에 녹인다. 하기의 화학식 1과 같은 광감작제(5mg)를 DMSO에 녹인 후 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC), 4-디메틸아미노프리딘(4-dimethylaminopyridine, DMAP)을 각각 광감작제의 몰비의 1.5배로 첨가한다. 두 용액을 각각 상온에서 3시간 동안 교반 한 후 섞고 24시간 동안 반응하였다. 미반응된 광감작제를 제거하기 위하여 투석막 (Spectra/Por; mol.wt. cutoff size, 3000)을 이용하여 2일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하였고, 본 과정을 통해 하기의 화학식 4와 같은 광감작제가 접합된 음이온성 고분자를 수득하였다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2012010744-appb-I000004
[ 실시예 4]
유전자/폴리에틸렌이민- 광감작제의 이온 복합체 제조
유전자/폴리에틸렌이민-광감작제의 이온 복합체를 제조하기 위하여 GFP유전자 (Green fluorescence protein, 녹색형광유전자) 혹은 EGFR (Epidermal growth factor receptor) 유전자의 간섭을 일으키는 shRNA, 즉 EGFR shRNA 2 μg와 실시예 1의 폴리에틸렌이민-광감작제 2 μg을 FBS가 포함되지 않은 α-MEM(Minimum essential medium eagle alpha modification, hyclone, USA)에 석어 준 후 상온에서 10분간 반응시켜 제조하였다.
[ 실시예 5]
유전자/ 양이온성 고분자와 음이온성 고분자 광감작제의 이온 복합체 제조
먼저 유전자/양이온성 고분자 복합체를 하기와 같이 제조하였다. 복합체의 제조시 GFP 유전자 혹은 플라스미드 (Clontech, USA)를 사용하였고, 플라스미드 2 μg과 폴리에틸렌이민은 2 μg을 FBS가 포함되지 않은 α-MEM(Minimum essential medium eagle alpha modification, hyclone, USA)에 석어 준 후 상온에서 10분간 반응하여 제조하였다. 유전자/양이온성 고분자와 음이온성 고분자 광감작제의 이온 결합체를 제조하기 위하여 상기 유전자/양이온성 고분자 복합체와 FBS가 포함되지 않은 α-MEM(alpha-minimum essential medium)에 녹인 화학식 4의 음이온성 고분자 광감작제를 질량비로 1:1, 1:5, 1:10 및 1:50 비율로 혼합한 이후 30 분 동안 상온에서 인큐베이션하여 나노 이온 복합체를 형성하였다.
[ 실험예 1]
콘드로이친 설페이트의 아세틸화 - 광감작제의 접합 검증
콘드로이친 설페이트의 아세틸화-광감작제의 접합을 검증하기 위하여 1H-NMR (Avancek 300, Bruker, Germany)을 통해 확인하였으며 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1 에 나타낸 것과 같이, 콘드로이친 설페이트 아세테이트의 1H-NMR 피크에서 1.8-2.2 ppm 부근의 신호가 검출되었으며 이는 콘드로이친 설페이트의 아세테이트화가 이루어졌음을 나타낸다. 또한, 콘드로이친 설페이트 아세테이트-광감작제의 1H-NMR 피크에서는 광감작제 특유의 신호가 3.1-3.3 ppm 부근에서 검출되었으며 이는 아세테이트화된 콘드로이친 설페이트에 광감작제가 접합되었다는 것을 나타낸다.
[ 실험예 2]
나노 이온 복합체의 입자 특성 및 형태 분석
유전자/폴리에틸렌이민-광감작제 그리고 유전자/양이온 고분자 복합체와 콘드로이친 설페이트 아세테이트-광감작제의 비율에 따른 나노 이온 복합체의 입자 특성을 확인하기 위하여 상기 실시예 4 및 5와 같이 제조하였고, Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, UK) 를 이용하여 분석하였다.
도 2 에 나타낸 것과 같이 유전자/폴리에틸렌이민-광감작제 이온 복합체의 입자 사이즈는 약 150 nm였으며, 표면전하는 +35mV의 강한 양전하를 띄는 것을 확인하였다. 또한 유전자/양이온 고분자 복합체와 콘드로이친 설페이트 아세테이트-광감작제의 이온 복합체는 약 200 nm였으며, 표면전하는 음이온성 고분자 광감작제의 질량비가 증가할수록 약 18 내지 -40mV의 강한 음전하를 띄는 것을 확인하였다. 본 실험을 바탕으로 실험예 3에 이용된 유전자/양이온 고분자 복합체와 음이온성 고분자 광감작제의 비율을 (1:50 질량비)로 고정하였다.
[ 실험예 3]
나노 이온결합체와 광자조사를 이용한 암세포로의 트랜스펙션 ( transfection )
상기 실시예 4 및 5에서 제조한 유전자/폴리에틸렌이민-광감작제의 이온 복합체 및 유전자/양이온 고분자 복합체와 콘드로이친 설페이트 아세테이트-광감작제(1:50 질량비)의 이온 복합체를 이용한 유전자 전달 효율을 확인하기 위하여 암세포에 트랜스펙션 (transfection)을 실시하였다. 세포는 인간대장암 세포인 HCT-116을 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였으며, 10% FBS (fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, USA) 을 포함하는 RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640, hyclone, USA) 에 현탁시키고, 배양접시에 분주한 후 37 ℃, 5 % 배양기에서 배양하였다. 인간대장암세포 (HCT-116)를 35 mm 배양 접시에 분주하여 배양한 후 배양 접시 면적의 70% 정도 성장하였을 때, 제조한 나노 이온 결합체를 각각 처리하였다. 4시간 후에 세포를 근적외선 레이저 (HeNe laser, 633 nm)를 이용하여 0 내지 1.0 J/cm2의 레이저를 조사하였으며 그런 후 37 ℃ 배양기에서 24 시간 추가 배양 한 후 유전자발현을 확인하였다.
[ 실험예 4]
웨스턴 블럿과 중합효소 연쇄반응을 통한 중간엽 줄기세포의 녹색 형광 단백질 발현 확인
광감작제와 근적외선 레이저에 의한 인간대장암세포(HCT-116)로의 녹색 형광 단백질 유전자 전달 효율을 단백질 수준에서 확인하기 위하여 녹색 형광 단백질의 발현을 웨스턴 블럿과 중합효소 연쇄반응을 통해 확인하였다. 웨스턴 블럿을 수행하기 위해서는 실험예 3과 동일한 방법으로 인간대장암세포(HCT-116)로의 트랜스펙션 (transfection)을 수행한 후 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 수거하고 1500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 단백질 분리 버퍼 (40Mm Tris-HCl, pH8.0, 120mM NaCl, 0.5% NP-40, 2μg/ml aprotinin, 2 μg/ml leupetin, 100 μg/ml PMSF)를 사용하여 전체 단백질을 분리하였다. 전체 단백질의 양은 BCA 단백질 분석 키트 (Thermo, USA)를 이용하여 측정하였다.
분리된 단백질을 상기 방법으로 정량하여 동일양의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아미드겔에 로딩한 후 전기 영동하였고 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인(Bio-Rad, USA)으로 트랜스블럿 기기 (Bio-Rad, USA)를 사용하여 트렌스퍼 하였다. 상기 멤브레인을 TBS-T (25mM Tris-HCL, pH7.4, 150mM NaCl, 0.2% Tween 20)에 분산시킨 5% 무지방 건조 밀크에서 1시간 30분간 인큐베이션 하여 비특이적인 단백질 결합을 차단하였다. 마우스 항-GFP을 일차항체로 사용하여 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션 하였으며 이 후 TBS-T로 세척한 후 HRP (horseradish peroxidase immunostaing) 가 부착된 항-마우스 goat IgG을 이차항체로 사용하여 2시간 동안 인큐베이션 하였다. TBS-T 용액으로 세척한 후 ECL(enhanced chemiluminescence, GE Healthcare, USA) 솔루션을 이용하여 X-ray 필름에 감광시켜 나타나는 밴드를 확인하였다.
중합효소 연쇄반응을 통해 녹색 형광 단백질 mRNA발현을 확인하기 위해서는 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 수거한 뒤 1500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, Trizol 용액 (sigma, USA) 1ml을 각 시료에 넣은 후 피펫팅으로 부드럽게 세포를 깬 후 200 μl의 클로로포름을 넣고 섞어 주었다. 5분간 실온에서 인큐베이션 후 이를 13000xg로 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 그런 후, 무색의 상층액을 새로운 튜브로 옮겨 500 μl의 이소프로필 알콜을 넣고 10분간 인큐베이션하였다. 이를 13000xg로 15분간 4℃에서 원심분리한 후 상층액은 제거하고 75 % 에탄올로 세척 후 펠렛을 5분간 건조하였다. 분리된 RNA 펠렛은 DEPC (diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수에 녹인 후 분광광도계를 이용하여 농도를 측정하였다.
추출된 RNA 중 1μg을 외가닥 cDNA 합성 키트 (intron, korea)를 이용하여 외가닥 cDNA를 합성하였다. 표 1와 같이 추출된 RNA 1μg과 sterile water를 총 9.5 μl가 되도록 맞춘 후 Oligo(dT)151μl씩 첨가하였다. 75℃, 5분간 인큐베이션 후에 얼음에서 1분간 방치하였다. 이 후 반응액을 하기 조성물과 혼합하고 42℃, 60분, 70℃ 5분 인큐베이션 하여 외가닥 cDNA를 합성하였고 sterile water를 이용하여 희석하였다.
표 1
성분 함량
RNase inhibitor 1.0 μl
5x RT buffer 4.0 μl
dNTP 2.0 μl
DTT 2.0 μl
AMV RT enzyme 0.5 μl
총량 9.5 μl
중합 효소 연쇄반응을 실시하기 위하여 합성된 cDNA 중 2 μl를 취하여 녹색 형광 단백질 유전자의 프라이머와 Taq 중합효소를 혼합한 후 95℃, 5분 방치하여 다른 효소의 활성을 저해 시키고, 95℃에서 1분 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 2분을 반복하는 사이클을 32 회 수행하여 유전자를 연쇄 중합하였다.
상기 반응식에서 사용한 프라이머의 유전자 서열은 하기 표 2에 나타내었으며, ß-actin 프라이머를 대조군으로 사용하였다. 또한, 상기 중합효소 연쇄반응 산물은 5 μl를 취한 후 1% 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동하여 확인하였다.
표 2
유전자 중합효소연쇄반응을 위한프라이머 염기서열
GFP 센스 TGA ACC GCA TCG AGC TGA AGG G
안티센스 TCC AGC AGG ACC ATG TGA TCG C
EGFR 센스 ATG CTC TAC AAC CCC ACC AC
안티센스 GCC CTT CGC ACT TCT TAC AC
β-actin 센스 CCA CGA AAC TAC CTT CAA CTC C
안티센스 TCA TAC TCC TGC TGC TTG CTG ATC C
도 3의 A에 나타낸 웨스턴 블럿과 중합효소 연쇄반응 결과와 같이, 유전자/폴리에틸렌이민-광감작제의 이온 복합체의 경우 레이저를 조사함에 따라 녹색형광유전자의 발현이 증가하여 밴드가 굵게 나타남을 보였다.
또한 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, 유전자/양이온 고분자 복합체와 음이온성 고분자 복합체의 경우 레이저를 조사하지 않은 군 보다 레이저를 조사하였을 때 녹색형광유전자 발현이 높게 나타났으며 0.5 J/cm2을 조사하였을 때 가장 발현율이 높게 나타났다. 또한 이때의 유전자 발현은 유전자/양이온 고분자 복합체와 콘드로이친 설페이트 아세테이트-광감작제의 이온 복합체를 이용한 군이 유전자/폴리에틸렌이민-광감작제의 이온 복합체를 처리하고 레이저를 조사한 군보다 높게 나타나는 것을 확인하였다. 따라서, 하기 실험에서는 모두 유전자/양이온 고분자 복합체와 콘드로이친 설페이트 아세테이트-광감작제의 이온 복합체를 이용한 유전자 전달을 수행하였다.
[ 실험예 5]
EGFR shRNA 유전자 전달 효과 확인
치료용 유전자를 전달하고 이의 전달효과를 평가하기 위하여 EGFR 유전자의 억제 유전자인 EGFR shRNA를 실시예 5와 같이 나노 복합체(1:50 질량비)를 제조하고 실험예 3과 같은 방법으로 세포에 트렌스팩션 하였다. 그런 후 EGFR 유전자 억제 효과를 실시간 중합효소 연쇄반응을 통하여 확인하였다.
EGFR mRNA유전자를 실시간 중합효소 연쇄반응을 통하여 확인하기 위해서는 실험예 4에 나타낸 바와 같이 세포를 수거한 뒤 총 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다.
실시간 중합 효소 연쇄반응을 실시하기 위하여는 합성된 cDNA 중 2 μl를 취하여 실시간 중합 효소 연쇄반응을 위한 EGFR 유전자의 프라이머와 SYBR green PCR master Mix와 혼합한 후 Real-time PCR System (Applied Biosystems, Warrington, UK) 을 통해 mRNA 발현을 측정하였다. 실시간 중합 효소 연쇄반응을 위한 프라이머는 상기 표 2에 나타내었다.
도 4의 실시간 중합효소 연쇄반응결과에서 EGFR mRNA의 발현이 레이저를 조사하지 않은 군 보다 레이저를 0.5 J/cm2조사하였을 때 가장 억제되었으며 약 20% 이하의 발현 억제 효과를 보였다.

Claims (23)

  1. 광감작제가 접합된 고분자; 및
    유전자 및 유전자/양이온성 고분자 복합체 중 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 광감작제가 접합된 고분자는 광감작제가 양이온성 및 음이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 접합된 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 광감작제는 포르피린계(porphyrins) 화합물, 클로린계(chlorines) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorines) 화합물, 프탈로시아닌계(Phthalocyanines) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminolevuline esters) 화합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 광감작제가 접합된 고분자에서 음이온성 고분자는 콘드로이틴-6-설페이트 (C6S), 헤파란 설페이트 (HS), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (HSPG), 헤파린, 콘드로이틴-4-설페이트(C4S), 콘드로이틴-6-설페이트 (C6S), 더마탄설페이트 (DS), 케라탄 설페이트 (KS) 및 히알루론산 (HA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체
  5. 제2항에있어서,
    상기 광감작제가 접합된 고분자에서 양이온성 고분자는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌이민 (PEI), 글라이콜 키토산 (GC), 키토산, 폴리-L-리신 (PLL), 폴리-베타-아미노 에스터 고분자, 폴리(아미도아민) (PAMAM) 덴드리머 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 유전자/양이온성 고분자 복합체에서 양이온성 고분자는 100 내지 100,000의 중량평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 유전자/양이온성 고분자 복합체에서 양이온성 고분자는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌이민 (PEI), 글라이콜 키토산 (GC), 키토산, 폴리-L-리신 (PLL), 폴리-베타-아미노 에스터 고분자, 폴리(아미도아민) (PAMAM) 덴드리머 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 유전자/양이온성 고분자 복합체에서 N/P비(양이온성 고분자의 질소 원자 개수/유전자의 인산염 원자 개수)는 0.1 내지 100인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 나노 복합체에서 유전자 및 유전자/양이온성 고분자 복합체 중 1종 이상 대 광감작제가 접합된 고분자의 혼합비는 1:0.1 내지 1:100(w/w)인 것을 특징으로 유전자 나노 복합체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 유전자는 올리고누클레오티드(oligoouncleotide), 리보자임(ribozyme), 플라스미드(plasmid) 및 안티센스 유전자(antisense DNA), Si-RNA 및 Sh-RNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 유전자는 녹색 형광 단백질 (green fluorescence protein)을 암호화하는 유전자 또는 EGFR (Epidermal growth factor receptor) 유전자를 억제하는 EGFR sh-RNA 인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 나노 복합체의 입자 크기는 400nm 이하인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 나노 복합체는 광감작제가 접합된 양이온성 고분자; 및
    유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 나노 복합체는 광감작제가 접합된 음이온성 고분자; 및
    유전자/양이온성 고분자 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 나노 복합체는 유전자의 세포 내재화용인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체.
  16. 광감작제를 고분자에 접합시켜 광감작제가 접합된 고분자를 제조하는 단계;
    상기 광감작제가 접합된 고분자; 및 유전자 및 유전자/양이온성 고분자 복합체 중 1종 이상을 혼합하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 광감작제가 접합된 고분자를 제조하는 단계에서 고분자 대 광감작제의 혼합비는 1:1 내지 1:30(mol/mol)인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체의 제조방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 유전자/양이온성 고분자 복합체에서 N/P비(양이온성 고분자의 질소 원자 개수/유전자의 인산염 원자 개수)는 0.1 내지 100인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체의 제조방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 혼합하는 단계에서 유전자 및 유전자/양이온성 고분자 복합체 중 1종 이상 대 광감작제가 접합된 고분자의 혼합비는 1:0.1 내지 1:100(w/w)인 것을 특징으로 하는 유전자 나노 복합체의 제조방법.
  20. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 유전자 나노 복합체를 세포에 처리하는 유전자 나노 복합체를 처리하는 단계; 및
    상기 처리단계 이후에 상기 세포에 광원을 조사하는 광원을 조사하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자의 세포 내재화 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 세포는 포유류 유래 세포인 것을 특징으로 하는 유전자의 세포 내재화 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 포유류 유래 세포는 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암 방광암, 난소암 및 담관암의 암세포; 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포 및 지방 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 유전자의 세포 내재화 방법.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 광원을 조사하는 단계는 500 내지 700 nm 파장의 광자를 200 J/cm2이하의 에너지로 조사하는 것을 특징으로 하는 유전자의 세포 내재화 방법.
PCT/KR2012/010744 2011-12-12 2012-12-11 유전자 나노 복합체 및 이를 이용한 유전자의 세포 내재화 방법 WO2013089411A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/364,611 US9765335B2 (en) 2011-12-12 2012-12-11 Gene nanocomposite, and cellular internalization method of gene using same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2011-0133244 2011-12-12
KR20110133244 2011-12-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013089411A1 true WO2013089411A1 (ko) 2013-06-20

Family

ID=48612797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2012/010744 WO2013089411A1 (ko) 2011-12-12 2012-12-11 유전자 나노 복합체 및 이를 이용한 유전자의 세포 내재화 방법

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9765335B2 (ko)
KR (1) KR101518298B1 (ko)
WO (1) WO2013089411A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103536934A (zh) * 2013-09-06 2014-01-29 苏州大学 一种基于pamam的自组装纳米基因载体复合物及其制备方法
CN105037736A (zh) * 2015-06-05 2015-11-11 青岛科技大学 壳聚糖接枝超支化聚合物聚酰胺胺、其制备方法和应用

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160286801A1 (en) 2013-03-15 2016-10-06 Suncor Energy Inc. Herbicidal Compositions
WO2017057784A1 (ko) * 2015-09-30 2017-04-06 (주)나노팜 여드름 피부개선을 위한 광민감성 물질을 함유한 건식다중캡슐형 조성물 및 그의 제조방법
GB201519375D0 (en) * 2015-11-03 2015-12-16 Univ Cardiff Photodynamic therapy complex
CN107970448B (zh) * 2017-12-01 2020-12-15 南京大学 一种光活性纳米复合物及其制备方法与应用
CN110115765B (zh) * 2019-05-30 2020-11-10 福州大学 兼具分子靶向/基因/光热治疗的纳米复合物的制备方法
CN112587676B (zh) * 2020-11-26 2022-02-22 中国科学院长春应用化学研究所 一种多功能阳离子柔性纳米颗粒及其制备方法和应用
CN114306368A (zh) * 2022-01-07 2022-04-12 中南大学 CircHOMER1的应用和结直肠癌治疗制剂
KR102676400B1 (ko) * 2022-05-24 2024-06-18 건국대학교 산학협력단 테트라키스(4-카복시페닐)포피린 그라프트 키토산 및 이의 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090091079A (ko) * 2008-02-22 2009-08-26 이화여자대학교 산학협력단 코어-셀 구조를 갖는 유전자-무기 나노하이브리드 복합체 및 이의 제조방법
KR20100120473A (ko) * 2009-05-06 2010-11-16 서울대학교산학협력단 Ｓａｒｓ 백신 나노전달체

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101141410B1 (ko) 2009-10-23 2012-05-04 국립암센터 광감각제 - 금속나노입자 전하 복합체 및 이를 함유하는 광역학 치료 또는 진단을 위한 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090091079A (ko) * 2008-02-22 2009-08-26 이화여자대학교 산학협력단 코어-셀 구조를 갖는 유전자-무기 나노하이브리드 복합체 및 이의 제조방법
KR20100120473A (ko) * 2009-05-06 2010-11-16 서울대학교산학협력단 Ｓａｒｓ 백신 나노전달체

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM, WON JONG: "Gene Delivery System by Polymeric Nanocomplexes", POLYMER SCIENCE AND TECHNOLOGY, vol. 19, no. 2, 2008, pages 125 - 129 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103536934A (zh) * 2013-09-06 2014-01-29 苏州大学 一种基于pamam的自组装纳米基因载体复合物及其制备方法
CN105037736A (zh) * 2015-06-05 2015-11-11 青岛科技大学 壳聚糖接枝超支化聚合物聚酰胺胺、其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20150225723A1 (en) 2015-08-13
KR20130066521A (ko) 2013-06-20
US9765335B2 (en) 2017-09-19
KR101518298B1 (ko) 2015-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2013089411A1 (ko) 유전자 나노 복합체 및 이를 이용한 유전자의 세포 내재화 방법
US20200085742A1 (en) Nanoscale carriers for the delivery or co-delivery of chemotherapeutics, nucleic acids and photosensitizers
WO2016133254A1 (ko) 세포의 지질막에서 유래된 나노소포체 및 이의 용도
WO2012081799A1 (en) Polynucleotide delivering complex for target cell
AU2013279748B2 (en) Conjugate of a photosensitiser and chitosan and uses thereof
WO2018186725A1 (ko) 암 치료용 약학 조성물
WO2011049256A1 (ko) 광감각제 - 금속나노입자 전하 복합체 및 이를 함유하는 광역학 치료 또는 진단을 위한 조성물
WO2020096318A1 (ko) pH 민감성 탄소 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물전달
Huang et al. Genetic recombination of poly (l-lysine) functionalized apoferritin nanocages that resemble viral capsid nanometer-sized platforms for gene therapy
Kang et al. Immunostimulation of tumor microenvironment by targeting tumor-associated macrophages with hypoxia-responsive nanocomplex for enhanced anti-tumor therapy
Qu et al. Drug-drug conjugates self-assembled nanomedicines triggered photo−/immuno-therapy for synergistic cancer treatments
CN114533894A (zh) 一种具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物及其制备方法和应用
WO2016068617A1 (ko) 폴리올계 삼투압적 폴리디자일리톨 폴리머 유전자 전달체 및 이의 용도
Zhang et al. A zwitterionic polymer-inspired material mediated efficient CRISPR-Cas9 gene editing
Ma et al. Hierarchical-unlocking virus-esque NanoCRISPR precisely disrupts autocrine and paracrine pathway of VEGF for tumor inhibition and antiangiogenesis
WO2021221287A1 (ko) 세포사멸 유도용 기체 전구체를 담지한 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US10159736B2 (en) Plant virus particles for delivery of photosensitive agents
WO2021091281A1 (ko) 비강투여에 의한 효과적인 뇌전달 기술
Jia et al. Controlled siRNA Release of Nanopolyplex for Effective Targeted Anticancer Therapy in Animal Model
WO2019235746A1 (ko) 비강투여에 의한 효과적인 뇌전달 기술
WO2012133997A1 (ko) 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체 및 이를 이용한 유전자 치료
Liebers et al. Highly efficient destruction of squamous carcinoma cells of the head and neck by photochemical internalization of Ranpirnase
JP6108369B2 (ja) 核酸内包高分子ミセル複合体及びその製造方法
WO2023287009A1 (ko) 초음파 감작제가 탑재된 종양 표적화 엑소좀 및 이의 제조방법
WO2022191567A1 (ko) Covid-19를 포함하는 호흡기 바이러스 감염증, 바이러스 감염에 의한 폐섬유증, 또는 호흡기 질환 예방 또는 치료를 위한 초음파 방식 연무식 흡입기를 이용한 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 투여용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12857519

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14364611

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12857519

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1