WO2020096318A1 - pH 민감성 탄소 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물전달 - Google Patents

pH 민감성 탄소 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물전달 Download PDF

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sensitive
imidazole
sensitive carbon
drug delivery
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서정덕
김다혜
안민지
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to pH-sensitive carbon nanoparticles, a method of manufacturing the same, and drug delivery using the same.
  • Drug delivery systems using polymers have been mainly studied for the delivery of anti-cancer agents, inducing an increase in the retention time and targeting rate in the body of anti-cancer drugs, thereby reducing side effects of anti-cancer drugs and increasing anti-cancer effects.
  • drug delivery systems that are sensitive to various stimuli (light, pH, magnetic field, temperature, enzymes, etc.) has been actively conducted. They are stably present in normal tissues, and when they reach the cancer site, drugs are released by stimulation, so they can significantly reduce side effects and increase the anti-cancer effect.
  • pH-sensitive drug delivery systems have been studied by targeting the acidity of cancer tissues or cancer cell endosomes (endosomal pH) (W. Park, et al., J. Ameri. Chem. Soc. 138 (34), 10734-10737).
  • the pH around cancer is more acidic (pH ⁇ 7.0) than normal tissue, and this acidification is dependent on the size of the cancer and the distribution of the cancer (ES Lee, et al., J. Control. Release 123 (1), 19-26) ).
  • the drug delivery system using the pH of the cancer tissue uses materials such as chitosan, piperidine, imidazole, histidine, lysine, and glutamic acid.
  • a pH-sensitive drug delivery system is prepared by inducing a combination of hydrazine, oxime, and acetal, which are pH-sensitive bonds.
  • the step of synthesizing the pH-sensitive polymer proceeds over several stages, there are problems such as cost, time, and synthetic yield. Therefore, there is a need for preparation of a non-polymeric pH-sensitive drug delivery system capable of producing a pH-sensitive material in a simple and fast time.
  • carbon nanoparticles are spherical particles that have chemical bonds of sp2 and sp3 based on carbon, and have excellent biocompatibility and safety. In addition, it has a characteristic of exhibiting fluorescence at a specific wavelength due to the chemical bonding of the carbon nanoparticles.
  • biocompatibility and safety can be secured in vivo, and thus there is an advantage of being used as a safer drug delivery agent.
  • An object of the present invention is to provide a non-polymeric pH sensitive carbon nanoparticle having pH sensitivity.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a pH-sensitive carbon nanoparticle that is simple and rapid.
  • another object of the present invention is a pH-sensitive carbon nanoparticle that can be used for the treatment of cancer, photodynamic therapy, or photo-mediated anti-cancer immunity because it can be encapsulated in pH-sensitive carbon nanoparticles and released under weakly acidic conditions. It is to provide a particle-based drug delivery system.
  • the present invention provides a pH-sensitive carbon nanoparticle containing imidazole.
  • the present invention provides a drug delivery system comprising the pH-sensitive carbon nanoparticles and a drug that can be encapsulated within the nanoparticles.
  • the present invention comprises the steps of dissolving citric acid; Preparing a mixed solution by adding an imidazole compound to the solution in which citric acid is dissolved; Preparing the carbon nanoparticles by heat-treating the mixed solution; And dialysis and freeze-drying the prepared carbon nanoparticles. It provides a method for producing a pH-sensitive carbon nanoparticles comprising a.
  • the pH-sensitive nanoparticles according to the present invention can produce carbon nanoparticles that are simpler and faster than the polymerizable pH-sensitive nanoparticles using citric acid and imidazole compounds.
  • pH-sensitive carbon nanoparticles prepared according to the present invention are biocompatible and have safety in vivo.
  • pH-sensitive carbon nanoparticles prepared according to the present invention can encapsulate hydrophobic drugs and photosensitizers, and release drugs under weakly acidic conditions, for anticancer therapy, photodynamic therapy, or photomediated anticancer immunity therapy. It can be used as a drug delivery system.
  • AMI 1- (3-aminopropyl) imidazole
  • 2 is a view showing the production of pH-sensitive carbon nanoparticles through hydrothermal reaction and autoclaving with citric acid and 1- (3-aminopropyl) imidazole.
  • FIG. 3 is a diagram showing the electric charge measured at various pH of (A) the pH-sensitive carbon nanoparticles prepared according to the microwave reaction time, (B) the pH-sensitive carbon nanoparticles prepared according to the microwave reaction time.
  • Figure 4 shows six (1- (3-aminopropyl) imidazole, 4-imidazole acetic acid hydrochloride, 4- (1H-imidazol-1-yl) -aniline, imidazole, L-histidine, 4-imidazole
  • This is a diagram showing the size of the pH-sensitive carbon nanoparticles prepared through the microwave of acrylic acid and the carbon nanoparticles that are not sensitive to pH and the charge measured at pH 7.4 and pH 6.5.
  • Figure 5 shows eight (1- (3-aminopropyl) imidazole, 4-imidazole acetic acid hydrochloride, 4- (1H-imidazol-1-yl) -aniline, imidazole, L-histidine (4, 8 hours) ), 4-imidazole acrylic acid) (4, 8 hours) is a diagram showing the size of the pH-sensitive carbon nanoparticles prepared through the hydrothermal reaction, the charge measured at various pH, and the respective fluorescence images.
  • FIG. 6 is a view showing the size of the pH-sensitive carbon nanoparticles prepared through autoclaving of (1- (3-aminopropyl) imidazole, charges measured at various pHs, and fluorescence images thereof.
  • FIG. 7 shows six (1- (3-aminopropyl) imidazole, 4-imidazole acrylic acid, 4-imidazole acetic acid hydrochloride, 4- (1H-imidazol-1-yl) -aniline, imine containing doxorubicin)
  • This is a diagram showing the particle size of the pH-sensitive carbon nanoparticle-based drug delivery system of dazole, L-histidine) and the transmission electron microscope measured at pH 7.4 and pH 6.5.
  • FIG. 8 shows six (1- (3-aminopropyl) imidazoles, 4-imidazole acrylic acid, 4-imidazole acetic acid hydrochloride, 4- (1H-imidazol-1-yl) -aniline, already loaded with doxorubicin) It is a diagram showing the drug release according to the pH of the pH-sensitive carbon nanoparticle drug carriers of dazole, L-histidine).
  • XPS X-ray photoelectron spectroscopy
  • 10 is a view showing the minimum concentration of drug delivery products generated by hydrophobic drug binding at pH 7.4 and pH 6.5.
  • FIG. 11 is a diagram showing particle changes at pH 7.4 and pH 6.5 of doprubicin-encapsulated CA and API-based pH-sensitive carbon nanoparticle drug delivery systems.
  • FIG. 12 is a diagram showing particle changes at various pH of a doprubicin-encapsulated CA and API-based pH-sensitive carbon nanoparticle drug delivery system.
  • 13 is a diagram showing the normal cytotoxicity evaluation of CA and API-based pH-sensitive carbon nanoparticle drug delivery system.
  • FIG. 14 is a diagram showing cancer cell killing effects of a doprubicin-encapsulated CA and API-based pH-sensitive carbon nanoparticle drug delivery system.
  • 15 (A) to 15 (C) are diagrams showing the effect of influx of doxorubicin into cancer cells at pH 7.4 (B) and pH 6.5 (C) of a CA- and API-based pH-sensitive carbon nanoparticle drug delivery system.
  • (A) and (B) are in vivo anti-cancer effects of doxorubicin-encapsulated CA and API-based pH-sensitive carbon nanoparticle drug delivery system
  • (C) is a diagram showing the in vivo toxicity evaluation of the delivery system.
  • 17 is a diagram showing the anti-cancer effect through in vivo cancer tissue staining of doxorubicin-encapsulated CA and API-based pH-sensitive carbon nanoparticle drug delivery system.
  • FIG. 18 (a) is a view showing a method for manufacturing a photosensitive therapeutic agent based on a pH-sensitive carbon nanoparticle encapsulated with a photosensitizer material, and (b) a change in the therapeutic agent at pH 7.4 and 6.5.
  • 19 is a diagram showing particle changes at pH 7.4 and pH 6.5 of a photosensitive therapeutic agent based on a pH-sensitive carbon nanoparticle encapsulated with a photosensitizer.
  • 20 is a diagram showing the charge at pH 7.4 and pH 6.5 of a photosensitive therapeutic agent based on a pH-sensitive carbon nanoparticle encapsulated with a photosensitizer.
  • Figure 21 is a photosensitive agent material (Ce6, Pheo a) encapsulated pH-sensitive carbon nanoparticle-based photodynamic therapy evaluation of free radical production capacity
  • (B) is a photosensitive agent encapsulated pH-sensitive carbon nanoparticle-based light It is a diagram showing the evaluation of the ability to generate free radicals at pH 7.4, 6.5, compared to a single agent for epidemiological treatment.
  • FIG. 22 is a view showing particle changes at various pH of a pH-sensitive carbon nanoparticle-based photodynamic therapeutic agent encapsulated with a photosensitizer.
  • 23 (a) and 23 (b) are diagrams showing drug release according to the pH of a photosensitive therapeutic agent based on a pH-sensitive carbon nanoparticle encapsulated with a photosensitizer.
  • FIG. 24 is a diagram showing the effect of influx of photosensitive agents into the cancer cells at pH 7.4 and pH 6.5 of a pH-sensitive carbon nanoparticle-based photodynamic therapeutic agent.
  • 25 is a diagram showing the cancer cell killing effect in pH 6.5 of a pH-sensitive carbon nanoparticle-based photodynamic therapeutic agent containing a photosensitizer.
  • 26 (a), (b), and (c) are diagrams showing an in vivo behavior evaluation of a pH-sensitive carbon nanoparticle-based photodynamic therapeutic agent encapsulated with a photosensitizer.
  • FIG. 27 (a) is a diagram showing the in vivo photodynamic anti-cancer effect and immune anti-cancer effect of the pH-sensitive carbon nanoparticle-based photodynamic therapeutic agent in which the photosensitizer is encapsulated, and (b) its toxicity evaluation in vivo.
  • FIG. 28 is a diagram showing an in vivo photodynamically mediated immune cell induction effect of a pH-sensitive carbon nanoparticle-based photodynamic therapeutic agent containing a photosensitizer.
  • 29 is a diagram showing the anti-cancer effect through in vivo cancer tissue staining of a pH-sensitive carbon nanoparticle-based photodynamic therapeutic agent encapsulated with a photosensitizer.
  • FIG. 30 is a diagram showing the effect of inducing photodynamically mediated immune cells through staining of cancer tissues in vivo of a pH-sensitive carbon nanoparticle-based photodynamic therapeutic agent containing a photosensitizer.
  • the present inventors prepared a pH-sensitive carbon nanoparticle containing an imidazole functional group in a carbon nanoparticle simply and quickly using only a microwave, hydrothermal reaction, or autoclaving reaction using a citric acid and an imidazole compound. , These pH-sensitive carbon nanoparticles are capable of encapsulating drugs, and have excellent drug release ability in weakly acidic conditions, thus revealing that they can be used as drug carriers with cancer treatment, photodynamic therapy, or photomediated anti-cancer immune treatment.
  • a pH-sensitive carbon nanoparticle containing an imidazole functional group in a carbon nanoparticle simply and quickly using only a microwave, hydrothermal reaction, or autoclaving reaction using a citric acid and an imidazole compound.
  • the present invention provides a pH-sensitive carbon nanoparticle containing imidazole.
  • the pH-sensitive carbon nanoparticles are prepared using citric acid and imidazole compounds, and the imidazole compounds are 1- (3-aminopropyl) imidazole (1- (3 -aminopropyl) imidazole), 4-imidazoleacetic acid hydrochloride, 4- (1H-imidazol-1-yl) -aniline (4- (1H-imidazol-1-yl) aniline), already Any one or more may be selected from the group consisting of imidazole, L-histidine, and 4-imidazoleacrylic acid, but preferably 1- (3-aminopropyl) imidazole (1- (3-aminopropyl) imidazole).
  • the average particle size of the pH-sensitive carbon nanoparticles is 2 to 10 nm, and may have a negative charge at pH ⁇ 7.0 and a neutral charge or positive charge at pH ⁇ 7.0.
  • the present invention provides a drug delivery system comprising the pH-sensitive carbon nanoparticles and a drug that can be encapsulated within the nanoparticles.
  • the drug may be any one or more selected from the group consisting of a hydrophobic drug, a chlorin-based and a porphyrin-based, and the drug is doxorubicin, paclitaxel, cisplatin, sirolimus ( Sirolimus) and an anticancer agent composed of etoposide or a photosensitizer composed of chlorine e6, pheophorbide a and phthalocyanine, but may be selected, but is not limited thereto. It is not.
  • the weight ratio of the carbon nanoparticles and the drug may be 1: 1 to 15: 1, and the average particle size of the drug carrier may be 50 to 250 nm.
  • the drug delivery system may be destabilized in a slightly acidic environment of pH 7.0 or lower, that is, the structure of the drug delivery system may be changed, and the drug enclosed in the drug delivery system may be released to the outside.
  • the drug delivery system in the present invention is effectively used for drug release at about pH 6.0 to 7.0, which is a weakly acidic condition formed at a disease site such as cancer, to be used for cancer treatment, photodynamic therapy, or photomediated anti-cancer immunotherapy.
  • a disease site such as cancer
  • the pH-sensitive carbon nanoparticle drug delivery system in which the doxorubicin anticancer agent is encapsulated has superior cancer growth inhibition and cancer cell killing effects in vivo than when using a single doxorubicin formulation.
  • the pH-sensitive carbon nanoparticle photodynamic therapeutic agent containing chlorin e6 photosensitizer is superior to accumulation in cancer tissues, inhibition of cancer growth, and cancer cell death in vivo than when using a single chlorin e6 formulation.
  • the photodynamic therapy treatment of the present invention showed an immune anti-cancer effect induced by photodynamic therapy, and thus cancer growth could be inhibited even in the opposite cancer tissue that was not irradiated with laser.
  • the present invention comprises the steps of dissolving citric acid; Preparing a mixed solution by adding an imidazole compound to the solution in which citric acid is dissolved; Preparing the carbon nanoparticles by heat-treating the mixed solution; And dialysis and freeze-drying the prepared carbon nanoparticles. It provides a method for producing a pH-sensitive carbon nanoparticles comprising a.
  • the imidazole compound is 1- (3-aminopropyl) imidazole, 4-imidazoleacetic acid hydrochloride, 4- (1H- Imidazole-1-yl) -aniline (4- (1H-imidazol-1-yl) aniline), imidazole, L-histidine, 4-imidazoleacrylic acid Any one or more may be selected from the group consisting of, preferably 1- (3-aminopropyl) imidazole.
  • the heat treatment reaction of the mixed solution may be selected from any one of the group consisting of microwave pyrolysis reaction, hydrothermal reaction and autoclave reaction.
  • the microwave pyrolysis (pyrolysis) reaction may be reacted to the microwave for 1 to 5 minutes, but preferably for 3 minutes.
  • hydrothermal reaction may be reacted for 4 to 8 hours in an oil bath at 100 to 200 ° C, but preferably for 4 hours in an oil bath at 180 ° C.
  • the autoclave reaction may be reacted for 8 to 12 hours in a 100 to 150 ° C autoclave, but preferably for 8 hours in a 120 ° C autoclave.
  • the pH-sensitive carbon nanoparticles according to the present invention cannot be formed because the carbon nanoparticles having the imidazole structure formed on the surface are not properly formed, thereby treating cancer, photodynamic therapy, or light. Problems that cannot be utilized as drug carriers for the treatment of mediated immune cancer may arise.
  • the average particle size of the pH-sensitive carbon nanoparticles prepared through the heat treatment reaction is 2 to 10 nm, and may have a negative charge at pH ⁇ 7.0 and a neutral charge or positive charge at pH ⁇ 7.0. .
  • a pH-sensitive photodynamic therapeutic agent was prepared by encapsulating a photosensitive agent by hydrophobic interaction between the photosensitive agent and the central portion of the carbon nanoparticles at pH 8 (FIG. 18 (a)), and at pH 7.4, the form of nanoparticle drug delivery system While is maintained, as the charge of the API with a pKa value of 6.9 changes at pH 6.5, the central portion, which was hydrophobic, changes to hydrophilicity, the balance between prime and hydrophilicity is destroyed, and the form of the drug delivery system collapses and the enclosed photosensitive sense By releasing it out of the particle (Fig. 18 (b)), it can be used as a cancer selective drug delivery agent, a photodynamic therapy agent, or a photomediated anticancer immunotherapy agent.
  • the pH-sensitive carbon nanoparticles were prepared using citric acid (CA) and 1- (3-aminopropyl) imidazole (API) as shown in FIG. 1. Specifically, 1 g of citric acid was added to an Erlenmeyer flask and 5 ml of water was added to dissolve it. After that, 1- (3-aminopropyl) imidazole was added to the solution at a concentration of 4 mol of citric acid, respectively. After mixing the solution well, it was put in a microwave oven (1100 W) and operated for 3 minutes to prepare carbon nanoparticles through microwave assistant pyrolysis.
  • CA citric acid
  • API 1- (3-aminopropyl) imidazole
  • the prepared carbon nanoparticles were purified through a dialysis membrane (500 Da) in distilled water for one day, and changed twice with clean distilled water. After one day of dialysis, the solution in the dialysis membrane was lyophilized to recover six pH-sensitive carbon nanoparticles.
  • the pH-sensitive carbon nanoparticles were prepared using citric acid (CA) and 1- (3-aminopropyl) imidazole (API) as shown in FIG. 2.
  • the prepared carbon nanoparticles were purified through a dialysis membrane (500 Da) in distilled water for one day, and changed twice with clean distilled water. After one day of dialysis, the solution in the dialysis membrane was lyophilized to recover six pH-sensitive carbon nanoparticles.
  • the pH-sensitive carbon nanoparticles were prepared using citric acid (CA) and 1- (3-aminopropyl) imidazole (API) as shown in FIG. 2.
  • a pH-sensitive drug delivery system 130 mg of pH-sensitive carbon nanoparticles prepared in Example 1 and 10 mg of doxorubicin were dissolved in 10 ml of dimethyl sulfoxide, respectively. Then, the two dissolved solutions were mixed to prepare nanoparticles through a dialysis membrane (3000 Da) in distilled water.
  • the pH was adjusted to 8.0 using NaOH, and replaced with clean distilled water twice during the day. After a day, the solution in the dialysis membrane was recovered and the aggregated particles were removed through a syringe filter (0.2 ⁇ m), and centrifuge (100 000 Da) was used in a centrifuge at 4000 RPM for 20 minutes. To remove unencapsulated doxorubicin.
  • Example 5 Based on pH-sensitive carbon nanoparticles Photodynamics Treatment and Optical media Preparation of anticancer immunotherapy
  • pH-sensitive photodynamic therapeutic agent 100 mg of pH-sensitive carbon nanoparticles prepared using CA and API through Example 1 and chlorin e6 (chlorine e6; Ce6) or porphyrin-based peo 10 mg of forbid a (pheophorbide a; Pheo a) was dissolved in 10 ml of dimethyl sulfoxide, respectively. Thereafter, the pH-sensitive carbon nanoparticles were mixed with Ce6 or pheo a solution to prepare nanoparticles through a dialysis membrane (3000 Da) in distilled water. When the nanoparticles were prepared through the dialysis membrane, the pH was adjusted to 8.0 using NaOH, and replaced with clean distilled water twice during the day.
  • the solution in the dialysis membrane was recovered and the aggregated particles were removed through a syringe filter (0.2 ⁇ m), and centrifuge (100 000 Da) was used in a centrifuge at 4000 RPM for 20 minutes. To remove unsealed ce6 or pheo a.
  • the pH-sensitive carbon nanoparticles prepared through the pyrolysis synthesis method using a microwave oven set the manufacturing conditions of the pH-sensitive carbon nanoparticles In order to do so, microwaves were set to three conditions of 1 minute, 3 minutes, and 5 minutes to prepare pH-sensitive carbon nanoparticles.
  • the fluorescence of the pH-sensitive carbon nanoparticles prepared as described above was visually compared under UV (335 nm) conditions, purified through a dialysis membrane (500 Da) in distilled water for one day, and replaced with clean distilled water twice. One day after dialysis, the solution in the dialysis membrane was lyophilized to recover the pH-sensitive carbon nanoparticles under three conditions. The collected pH-sensitive carbon nanoparticles were compared and evaluated for their pH sensitivity by measuring the surface charge at each pH.
  • pH-sensitive carbon nanoparticles were prepared under the condition of reacting for 3 minutes with microwaves to conduct experiments.
  • Example 1 Six (1- (3-aminopropyl) imidazole, 4-imidazole acetic acid hydrochloride, 4- (1H-imidazol-1-yl) -aniline, imidazole, L-histidine prepared in Example 1, After dissolving the pH-sensitive carbon nanoparticles of 4-imidazole acrylic acid in distilled water at a concentration of 1 mg / ml, the size of the nanoparticles was measured through a zeta potential particle size analyzer. In addition, in order to confirm the change in the surface charge of the nanoparticles according to the pH, the pH was adjusted using 1 N HCl and NaOH to measure the charge at various pH through a zeta potential particle size analyzer. As a comparative group, it was measured as in the above method using carbon nanoparticles (Comparative Example 1) that do not have sensitivity to pH.
  • the pH was adjusted by using 1 N HCl and NaOH to measure the charge through a zeta potential particle size analyzer at various pHs.
  • the fluorescence intensity of the particles was measured using an fluorescence-labeled bioimaging instrument.
  • the size of the nanoparticles was measured through a zeta potential particle size analyzer.
  • the pH was adjusted using 1 N HCl and NaOH to measure the charge at various pH through a zeta potential particle size analyzer.
  • the fluorescence intensity of the prepared pH-sensitive carbon nanoparticles was measured using an fluorescence-labeled bioimaging instrument.
  • the pH-sensitive carbon nanoparticle-based drug delivery system containing six doxorubicins was found to have a size of about 70 nm.
  • the pH of the nanoparticle drug delivery system was 7.4. While it was maintained, it was confirmed that the morphology of the drug delivery system collapsed at pH 6.5.
  • Example 4 Six kinds of doxorubicin prepared in Example 4 (1- (3-aminopropyl) imidazole, 4-imidazole acrylic acid, 4-imidazole acetic acid hydrochloride, 4- (1H-imidazol-1-yl) -Using a drug release kit (MWCO 10K) at pH 7.4, pH 6.5 PBST (0.01M, tween 80 1%) using pH sensitive carbon nanoparticle drug carriers of aniline, imidazole, L-histidine) Drug release experiments were conducted.
  • MWCO 10K drug release kit
  • the imidazole functional groups on the surface of the pH-sensitive carbon nanoparticles prepared using CA and API were confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS).
  • nile red A hydrophobic fluorescent material called nile red was used to confirm the minimum concentration of the pH-sensitive carbon nanoparticles required for the preparation of the drug delivery system using the pH-sensitive carbon nanoparticles.
  • Nile red was dissolved in acetone at a concentration of 5x10 -5 M, and then prepared as a thin film using an evaporator. Distilled water in which pH-sensitive carbon nanoparticles prepared by CA and API were dissolved in each thin film was adjusted to pH 7.4 and 6.5 to confirm the formation of the drug delivery system through a fluorescence spectrometer. Light irradiation was measured at 520 nm and detection at 618 nm.
  • a drug delivery system was formed at a concentration of 0.958 mg / ml or higher at pH 7.4, and a drug delivery system at a concentration of 4.090 mg / ml or higher at pH 6.5.
  • the pH was about 70 nm, and it was confirmed that the pH was about 1000 nm.
  • NIH-3T3 mouse embryo fibroblast
  • L-929 mouse fibroblast
  • HCT-116 human colon cancer
  • SKBR-3 human breast cancer
  • PANC -1 human pancreas cancer
  • Each of pH 7.4 and pH 6.5 culture medium was treated with pH-sensitive carbon nanoparticle drug delivery systems for each concentration of doxorubicin.
  • doxorubicin alone was treated for each concentration and evaluated.
  • Cell death was analyzed by MTT assay and analyzed at 490 nm using a microplate reader.
  • PANC-1 Human pancreatic cancer
  • Doxorubicin-encapsulated pH-sensitive carbon nanoparticles were treated for 4 hours in pH 7.4 and pH 6.5 culture medium, respectively, for comparative evaluation.
  • Cell inflow was analyzed by fluorescence (460, 590 nm) of carbon nanoparticles (C-dot) and doxorubicin (DOX) using a confocal microscopy.
  • DIC in FIG. 15 (A) is a diagram showing cell morphology
  • C-dot and DOX are each fluorescence
  • Merge is a diagram showing cell morphology and each fluorescence superimposed.
  • HCT-116 Human colon cancer
  • HCT-116 Human colon cancer
  • TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
  • H & E Hematoxylin and eosin stain
  • the particles prepared by the pH-sensitive photodynamic therapy were found to have a size of about 131 nm, and as confirmed by a transmission electron microscope, the shape of the nanoparticle drug delivery system was maintained at pH 7.4, whereas the pH was maintained.
  • the charge of the API having a pKa value of 6.9 changed from 6.5, the central portion, which was hydrophobic, changed to hydrophilicity, and the balance between the hydrophobic and hydrophilic bodies was destroyed, confirming that the form of the drug delivery system collapsed (FIG. 18 (b)).
  • the pH was adjusted using 1 N HCl and NaOH to adjust the zeta potential particle size analyzer at various pHs. The charge was measured through.
  • particles (Ce6 @ CDs) prepared with a pH-sensitive photodynamic therapy containing chlorine e6 have a strong -charge at a pH of 7.4 or higher in vivo and weak at a cancer environment pH of ⁇ 6.5. -It was confirmed to have a charge.
  • Example 5 a fluorescent substance (Singlet oxygen sensor green; SOSG) capable of detecting monooxygen was used to confirm the generation of free radicals of particles prepared with a pH-sensitive photodynamic therapy.
  • SOSG fluorescent substance
  • Example 5 in order to confirm the change of particles according to the pH of the particles prepared by the pH-sensitive photodynamic therapy, after dissolving in distilled water with 0.5 mg / ml of chlorine e6, it was visually confirmed after 24 hours.
  • CT-26 Mae colon cancer cells were used to confirm the influx effect into the cancer cells at pH 7.4 and pH 6.5 using the pH-sensitive photodynamic therapy agent prepared in Example 5.
  • CT-26 (Mouse colon cancer) cells were used in order to confirm the cancer cell killing effect in the cancer environment pH 6.5 of the pH-sensitive photodynamic therapy agent prepared in Example 5.
  • Chlorine e6 alone formulation with pH-sensitive carbon nanoparticle-based photodynamic therapy and other control groups in pH 6.5 culture medium, and samples of carbon nanoparticles having no pH sensitivity (Comparative Example 1) were equal to 1 ⁇ g / ml based on chlorine e6 concentration.
  • CT-26 Mae colon cancer
  • BALB / c nude mice were inoculated into BALB / c nude mice.
  • intravenous injection of chlorine e6 alone formulation Free Ce6
  • concentration of 0.4 mg / ml based on chlorine e6 as a control group with a pH-sensitive photodynamic therapy (Ce6 @ CDs)
  • the behavior in vivo was confirmed using an fluorescence-labeled bioimaging instrument for every 24 hours.
  • CT-26 Mae colon cancer cells were left leg of BALB / c mice ( 1 ⁇ 10 6 cells) and the right leg (5 ⁇ 10 5 cells).
  • chlorin e6 alone formulation as a control group with a pH-sensitive photodynamic therapy, pH-sensitive carbon nanoparticles without drugs, and PBS at 0.4 mg / ml based on chlorin e6 Therefore, 24 hours after intravenous injection, only the left cancer tissue was irradiated with laser. This was repeated twice, and the laser was irradiated with 100 mW / cm 2 of energy for 1000 seconds (100 J / cm 2 ). The size of both cancer tissues was measured for 15 days to confirm the photodynamic and anti-cancer effects.
  • CT-26 Mae colon cancer
  • BALB / c rat left leg (1 ⁇ 10 6 cells) and right leg.
  • 5 ⁇ 10 5 cells was inoculated subcutaneously.
  • chlorin e6 alone formulation as a control group with a pH-sensitive photodynamic therapy, pH-sensitive carbon nanoparticles without drugs, and PBS at 0.4 mg / ml based on chlorin e6 Therefore, 24 hours after intravenous injection, only the left cancer tissue was irradiated with laser.
  • CT-26 Mae colon cancer
  • the chlorin e6 alone formulation, pH-sensitive carbon nanoparticles without drugs, and PBS as 0.4 mg / ml based on chlorin e6 were used as a comparison group with a pH-sensitive photodynamic therapy agent.
  • Laser was irradiated only to the left cancer tissue 24 hours after intravenous injection. This was repeated twice, and the laser was irradiated with 100 mW / cm 2 of energy for 1000 seconds (100 J / cm 2 ).
  • TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
  • H & E Hematoxylin and eosin stain
  • CT-26 Mae colon cancer
  • the chlorin e6 alone formulation, pH-sensitive carbon nanoparticles without drugs, and PBS as 0.4 mg / ml based on chlorin e6 were used as a comparison group with a pH-sensitive photodynamic therapy agent.
  • the pH-sensitive nanoparticle according to the present invention encapsulates a hydrophobic drug or a photosensitizer inside, and releases a hydrophobic drug or photosensitizer at a slightly acidic pH, thereby allowing cancer-selective drug delivery, photodynamic therapy or photo-mediated anti-cancer It was confirmed that it can be used as an immunotherapeutic agent.

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Abstract

본 발명은 pH 민감성 탄소 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물전달에 관한 것으로, 이미다졸(imidazole)이 포함된 pH 민감성 탄소 나노입자를 제조하여 소수성 약물, 광감작제 물질을 봉입할 수 있으며, 약산성 조건에서 약물 방출이 가능하여 항암치료, 광역학 치료, 또는 광매개 항암면역 치료를 위한 약물 전달체로 이용될 수 있다.

Description

pH 민감성 탄소 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물전달
본 발명은 pH 민감성 탄소 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물전달에 관한 것이다.
고분자를 이용한 약물 전달체는 주로 항암제의 전달을 위해 연구되어 왔으며, 항암제의 체내 체류시간 연장과 표적화율의 증가를 유도하여 항암제 부작용을 감소시켰고, 항암효과를 증가시켰다. 하지만, 봉입된 항암제의 방출을 조절할 수 없기 때문에 원하는 효과를 기대하기는 어려웠다. 이에 따라, 여러 가지 자극 (빛, pH, 자기장, 온도, 효소 등)에 민감성을 가지는 약물전달체 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이들은 정상조직에서는 안정하게 존재하다가 암 부위에 도달하였을 때 자극에 의하여 약물이 방출되어 부작용을 현저히 줄이고 항암 효과를 증가시킬 수 있어 각광받고 있다. 특히, 여러 가지 자극 민감성 약물 전달체 중에서 pH 민감성 약물 전달체는 암 조직의 산성도나 암세포 엔도좀 (endosomal pH)을 표적으로 하여 연구되고 있다 (W. Park, 등., J. Ameri. Chem. Soc. 138 (34), 10734-10737). 암 주위의 pH는 정상조직보다 산성화 (pH<7.0) 되어 있으며, 이러한 산성화는 암의 크기와 암의 분포에 의존적이다 (E. S. Lee, 등., J. Control. Release 123 (1), 19-26).
이러한 암 조직의 pH를 이용한 약물 전달체는 종래 키토산, 피페리딘, 이미다졸, 히스티딘, 라이신, 글루탐산 등의 물질을 이용한다. 또한, pH 민감성 결합인 하이드라진(hydrazine), 옥심(oxime), 아세탈(acetal) 등의 결합을 유도하여 pH 민감성 약물 전달체를 제조한다. 하지만 상기 물질을 이용한 pH 민감성 약물 전달체는 합성이 불가피하다. pH 민감성 부위를 부여하기 위하여 상기 물질을 고분자화 하거나 고분자와의 합성을 통해 pH 민감성 약물 전달체를 제조하기 때문이다. 또한, pH 민감성 고분자를 합성하는 단계는 여러단계에 걸쳐 진행되기 때문에, 비용과 시간, 합성 수율 등의 문제점이 존재한다. 따라서, 간편하고 빠른 시간에 pH 민감성 물질을 제조할 수 있는 비고분자성 pH 민감 약물전달체의 제조가 필요하다.
한편, 탄소 나노입자는 구 형태의 입자로 탄소를 기반으로 sp2, sp3의 화학 결합을 가지고 있으며, 생체적합성과 안전성이 뛰어나다. 또한, 탄소 나노입자가 갖는 화학 결합으로 인하여 특정 파장에서 형광을 나타내는 특성을 갖는다. 이러한 탄소 나노입자를 약물 전달체 또는 광역학 치료제 등으로 이용할 경우, 생체 내에서 생체적합성과 안전성을 확보할 수 있으므로, 보다 안전한 약물 전달체로 사용할 수 있는 장점이 있다.
따라서 간편하고, 빠르게 합성 가능하며, 생체적합성과 안정성을 갖춘 비고분자성 pH 민감 탄소 나노입자의 제조 및 이를 이용한 약산성을 띄는 질병으로 약물을 효과적으로 전달하는 기술 또는 광역학 치료제에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 pH 민감성을 가지는 비고분자성 pH 민감 탄소 나노입자를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 간단하고, 빠르게 제조 가능한 pH 민감성 탄소 나노입자의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 pH 민감성 탄소 나노입자에 약물 봉입이 가능하고, 약산성 조건에서 방출 가능하여 암치료, 광역학 치료, 또는 광매개 항암면역 치료의 용도로 활용될 수 있는 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물 전달체를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이미다졸(imidazole)이 포함된 pH 민감성 탄소 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 pH 민감성 탄소 나노입자 및 상기 나노입자 내에 봉입될 수 있는 약물을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 시트르산(citric acid)을 용해 시키는 단계; 상기 시트르산이 용해된 용액에 이미다졸(imidazole) 화합물을 첨가하여 혼합용액을 제조하는 단계; 상기 혼합용액을 열처리 반응하여 탄소 나노입자를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 탄소 나노입자를 투석 및 동결 건조하는 단계; 를 포함하는 pH 민감성 탄소 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 pH 민감 나노입자는 시트르산(citric acid)과 이미다졸(imidazole) 화합물을 이용하여 고분자성 pH 민감 나노입자에 비해 간단하고, 빠르게 pH 민감성을 가지는 탄소 나노입자를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자는 생체적합하며, 생체 내 안전성을 가진다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자는 소수성 약물, 광감작제 물질을 봉입할 수 있으며, 약산성 조건에서 약물 방출이 가능하여 항암치료, 광역학 치료, 또는 광매개 항암면역 치료를 위한 약물 전달체로 이용될 수 있다.
도 1은 시트르산(citric acid;CA)과 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole;API)을 마이크로웨이브를 통한 pH 민감성 탄소 나노입자의 제조를 나타낸 도면이다.
도 2는 시트르산과 1-(3-아미노프로필) 이미다졸을 수열반응과 고압 멸균기를 통한 pH 민감성 탄소 나노입자의 제조를 나타낸 도면이다.
도 3은 (A) 마이크로웨이브 반응 시간에 따라 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자의 형광, (B) 마이크로웨이브 반응 시간에 따라 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자의 다양한 pH에서 측정된 전하를 나타낸 도면이다.
도 4는 6가지(1-(3-아미노프로필) 이미다졸, 4-이미다졸아세트산 염산염, 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린, 이미다졸, L-히스티딘, 4-이미다졸 아크릴산)의 마이크로웨이브를 통해 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자 및 pH에 민감성을 가지지 않는 탄소 나노입자의 크기와 pH 7.4, pH 6.5에서 측정된 전하를 나타낸 도면이다.
도 5는 8가지(1-(3-아미노프로필) 이미다졸, 4-이미다졸아세트산 염산염, 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린, 이미다졸, L-히스티딘 (4, 8시간), 4-이미다졸 아크릴산) (4, 8시간)의 수열반응을 통해 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자의 크기, 다양한 pH에서 측정된 전하, 및 각각의 형광 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6은 (1-(3-아미노프로필) 이미다졸의 고압멸균기를 통해 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자의 크기, 다양한 pH에서 측정된 전하, 및 이의 형광 이미지를 나타낸 도면이다.
도 7은 독소루비신이 봉입된 6가지(1-(3-아미노프로필) 이미다졸, 4-이미다졸 아크릴산, 4-이미다졸아세트산 염산염, 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린, 이미다졸, L-히스티딘)의 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물 전달체의 입자 크기 및 pH 7.4, pH 6.5에서 측정된 투과전자현미경을 나타낸 도면이다.
도 8은 독소루비신이 봉입된 6가지(1-(3-아미노프로필) 이미다졸, 4-이미다졸 아크릴산, 4-이미다졸아세트산 염산염, 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린, 이미다졸, L-히스티딘)의 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체들의 pH에 따른 약물방출을 나타낸 도면이다.
도 9는 CA와 API를 이용하여 제조한 pH 민감성 탄소 나노입자의 X-선광전자분광기 (X-ray photoelectron spectroscopy, XPS) 분석을 나타낸 도면이다.
도 10은 pH 7.4와 pH 6.5에서 소수성 약물 결합에 의한 약물 전달체 생성 최소 농도를 나타낸 도면이다.
도 11은 독소루비신이 봉입된 CA와 API 기반 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체의 pH 7.4, pH 6.5에서 입자 변화를 나타낸 도면이다.
도 12는 독소루비신이 봉입된 CA와 API 기반 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체의 다양한 pH에서의 입자 변화를 나타낸 도면이다.
도 13은 CA와 API 기반 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체의 정상세포 독성 평가를 나타낸 도면이다.
도 14는 독소루비신을 봉입한 CA와 API 기반 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체의 암세포 사멸 효과를 나타낸 도면이다.
도 15(A) 내지 (C)는 독소루비신을 봉입한 CA와 API 기반 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체의 pH 7.4(B), pH 6.5(C)에서의 암세포 내 유입 효과를 나타낸 도면이다.
도 16(A), (B)는 독소루비신을 봉입한 CA와 API 기반 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체의 생체 내 항암 효과, (C)는 전달체의 생체 내 독성 평가를 나타낸 도면이다.
도 17은 독소루비신을 봉입한 CA와 API 기반 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체의 생체 내 암 조직 염색을 통한 항암 효과를 나타낸 도면이다.
도 18(a)는 광감작제 물질을 봉입한 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 제조 방법, (b) pH 7.4와 6.5에서의 치료제 변화를 나타낸 도면이다.
도 19는 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 pH 7.4, pH 6.5에서 입자 변화를 나타낸 도면이다.
도 20은 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 pH 7.4, pH 6.5에서 전하를 나타낸 도면이다.
도 21(A)는 광감작제 물질(Ce6, Pheo a)을 봉입한 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 활성산소 생성능 평가, (B)는 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제를 단독 광감작제와 비교하여 pH 7.4, 6.5에서의 활성산소 생성능 평가를 나타낸 도면이다.
도 22는 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 다양한 pH에서의 입자 변화를 나타낸 도면이다.
도 23(a),(b)는 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 pH에 따른 약물방출을 나타낸 도면이다.
도 24는 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 pH 7.4, pH 6.5에서의 암세포 내 유입 효과를 나타낸 도면이다.
도 25는 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의pH 6.5에서의 암세포 사멸 효과를 나타낸 도면이다.
도 26(a), (b), (c)는 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 생체 내 거동평가를 나타낸 도면이다.
도 27(a)는 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 생체 내 광역학 항암 효과 및 면역항암 효과, (b)는 이의 생체 내 독성평가를 나타낸 도면이다.
도 28은 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 생체 내 광역학 매개 면역 세포 유도 효과를 나타낸 도면이다.
도 29는 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 생체 내 암 조직 염색을 통한 항암 효과를 나타낸 도면이다.
도 30은 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 생체 내 암 조직 염색을 통한 광역학 매개 면역 세포 유도 효과를 나타낸 도면이다.
이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 시트르산(citric acid)과 이미다졸(imidazole) 화합물을 이용하여 마이크로웨이브, 수열반응 또는 고압멸균 반응만으로 간단하고, 빠르게 탄소 나노입자에 이미다졸 작용기가 포함된 pH 민감성 탄소 나노입자를 제조하였으며, 이러한 pH 민감성 탄소 나노입자는 약물 봉입이 가능하고, 약산성 조건에서 약물 방출 능력이 뛰어나 암치료, 광역학 치료, 또는 광매개 항암면역 치료 기능을 갖춘 약물 전달체로 이용될 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 이미다졸(imidazole)이 포함된 pH 민감성 탄소 나노입자를 제공한다.
이때, 상기 pH 민감성 탄소 나노입자는 시트르산(citric acid) 및 이미다졸(imidazole) 화합물을 이용하여 제조되며, 상기 이미다졸(imidazole) 화합물은 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole), 4-이미다졸아세트산 염산염(4-imidazoleacetic acid hydrochloride), 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린(4-(1H-imidazol-1-yl)aniline), 이미다졸(imidazole), L-히스티딘(L-histidine), 4-이미다졸 아크릴산(4-imidazoleacrylic acid)으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 선택될 수 있으나, 바람직하게는 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 pH 민감성 탄소 나노입자의 평균 입자 크기는 2 내지 10nm이며, pH ≥ 7.0 에서는 음전하를, pH < 7.0 에서는 중성전하 또는 양전하를 갖을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 pH 민감성 탄소 나노입자 및 상기 나노입자 내에 봉입될 수 있는 약물을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.
이때, 상기 약물은 소수성 약물, 클로린(chlorin)계 및 포르피린(porphyrin)계로 이루어진 군 중에서 어느 하나 이상 선택될 수 있으며, 상기 약물은 독소루비신, 파크리탁셀 (Paclitaxel), 시스플라틴 (Cisplatin), 시로리무스 (Sirolimus) 및 에토포시드 (etoposide)로 구성된 항암제나 클로린 e6(chlorine e6), 페오포르비드 a(pheophorbide a) 및 프탈로시아닌(phthalocyanine)으로 구성된 광감작제 중 어느 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 탄소 나노입자 및 약물의 중량비는 1:1 내지 15:1일 수 있으며, 상기 약물 전달체의 평균 입자 크기는 50 내지 250 nm일 수 있다.
또한, 상기 약물 전달체는 pH 7.0 이하의 약산성 환경에서 불안정화, 즉, 약물 전달체의 구조가 변화되어 약물 전달체 내부에 봉입되어 있는 약물이 외부로 방출될 수 있다.
그러므로 본 발명에서의 약물 전달체는 암과 같은 질환 부위에 형성되는 약산성 조건인 약 pH 6.0 ~ 7.0에서의 약물 방출에 효과적으로 이용되어 암치료, 광역학 치료, 또는 광매개 항암면역 치료의 용도로 활용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 독소루비신 항암제가 봉입된 pH 민감성 탄소나노입자 약물전달체는 단독 독소루비신 제형을 이용했을 때 보다 생체 내 암 성장 저해 및 암세포 사멸 효과가 우수함을 확인하였다.
또한, 클로린 e6 광감작제가 봉입된 pH 민감성 탄소나노입자 광역학 치료제는 단독 클로린 e6 제형을 이용했을 때 보다 생체 내 암 조직에 축적, 암 성장 저해 및 암세포 사멸 효과가 우수함을 확인하였다.
게다가, 본원발명의 광역학 치료제는 광역학 치료에 의해 유도된 면역 항암 효과가 나타나 레이저 조사가 되지 않은 반대편 암 조직에서도 암 성장이 저해될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 시트르산(citric acid)을 용해 시키는 단계; 상기 시트르산이 용해된 용액에 이미다졸(imidazole) 화합물을 첨가하여 혼합용액을 제조하는 단계; 상기 혼합용액을 열처리 반응하여 탄소 나노입자를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 탄소 나노입자를 투석 및 동결 건조하는 단계; 를 포함하는 pH 민감성 탄소 나노입자의 제조방법을 제공한다.
이때, 상기 이미다졸(imidazole) 화합물은 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole), 4-이미다졸아세트산 염산염(4-imidazoleacetic acid hydrochloride), 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린(4-(1H-imidazol-1-yl)aniline), 이미다졸(imidazole), L-히스티딘(L-histidine), 4-이미다졸 아크릴산(4-imidazoleacrylic acid)으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 선택될 수 있으나, 바람직하게는 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole)일 수 있다.
또한, 상기 혼합용액의 열처리 반응은 마이크로웨이브 열분해(pyrolysis) 반응, 수열(Hydrothermal) 반응 및 고압멸균(Autoclave) 반응으로 이루어진 군 중에서 어느 하나 이상 선택될 수 있다.
이때, 상기 마이크로웨이브 열분해(pyrolysis) 반응은 마이크로웨이브에 1 내지 5분 동안 반응시킬 수 있으나, 바람직하게는 3분 동안 반응시킬 수 있다.
또한, 상기 수열(Hydrothermal) 반응은 100 내지 200℃의 유조(oil bath)에서 4 내지 8시간 동안 반응시킬 수 있으나, 바람직하게는 180℃의 유조(oil bath)에서 4시간 동안 반응시킬 수 있다.
또한, 상기 고압멸균(Autoclave) 반응은 100 내지 150℃ 고압멸균기에서 8 내지 12시간 동안 반응시킬 수 있으나, 바람직하게는 120℃ 고압멸균기에서 8시간 동안 반응시킬 수 있다.
이때, 상기의 열처리 조건을 벗어나게 되면 이미다졸(imidazole) 구조가 표면에 형성된 탄소 나노입자가 제대로 형성되지 않아 본 발명에 따른 pH 민감성 탄소 나노입자가 형성될 수 없어 암치료, 광역학 치료, 또는 광매개 면역항암 치료를 위한 약물 전달체로서 활용될 수 없는 문제가 야기될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 열처리 반응을 통하여 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자의 평균 입자 크기는 2 내지 10nm이며, pH ≥ 7.0 에서는 음전하를, pH < 7.0 에서는 중성전하 또는 양전하를 갖을 수 있다.
pH 8에서 광감각제와 탄소 나노입자의 중심 부분의 소수성 상호작용에 의한 광감각제 봉입에 의해 pH 민감성 광역학 치료제를 제조(도 18(a))하였으며, pH 7.4에서는 나노입자 약물전달체의 형태가 유지된 반면, pH 6.5에서 pKa 값이 6.9인 API의 전하가 바뀜에 따라 소수성이였던 중심부분이 친수성으로 변하면서 소수/친수 간의 균형이 파괴되어 약물전달체의 형태가 붕괴되어 봉입되어 있던 광감각제가 입자 밖으로 방출됨으로써(도 18(b)) 암 선택적 약물전달체, 광역학 치료제 또는 광매개 항암면역 치료제로 활용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> pH 민감성 탄소 나노입자들의 마이크로웨이브를 통한 제조
pH 민감성 탄소 나노입자는 도 1과 같이 시트르산(citric acid;CA)과 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole;API)을 이용하여 제조하였다. 자세하게는, 삼각플라스크에 시트르산(citric acid) 1 g을 넣고 5 ml의 물을 넣어 녹였다. 그 후, 상기 용액에 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole)을 시트르산(citric acid)의 4 mol 농도로 각각 넣어주었다. 상기 용액을 잘 섞어준 후 전자레인지 (1100 W)에 넣고 3분간 작동시켜 마이크로웨이브를 이용한 열분해 반응(microwave assistant pyrolysis)을 통해 탄소 나노입자를 제조하였다.
상기 방법과 같은 방법으로 API 대신에 4-이미다졸아세트산 염산염(4-imidazoleacetic acid hydrochloride), 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린(4-(1H-imidazol-1-yl)aniline), 이미다졸(imidazole), L-히스티딘(L-histidine), 4-이미다졸 아크릴산(4-imidazoleacrylic acid)을 사용하여 총 6가지의 pH 민감성 탄소 나노입자를 제조하였다. 제조된 탄소 나노입자는 증류수에 투석막 (500 Da)을 통해 하루동안 정제하였고, 깨끗한 증류수로 2번 갈아주었다. 투석 하루 후 투석막 안의 용액을 동결건조하여 6가지의 pH 민감성 탄소 나노입자를 회수하였다.
<실시예 2> pH 민감성 탄소 나노입자들의 수열반응을 통한 제조
pH 민감성 탄소 나노입자는 도 2와 같이 시트르산(citric acid;CA)과 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole;API)을 이용하여 제조하였다.
자세하게는, 테프론 반응 챔버 (Teflon reactor chamber)에 시트르산(citric acid) 1 g을 넣고 5 ml의 물을 넣어 녹였다. 그 후, 상기 용액에 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole)을 시트르산(citric acid)의 4 mol 농도로 각각 넣어주었다. 상기 용액을 잘 섞어준 후 테프론 반응 챔버를 스테인리스 반응기 (Stainless steel)에 넣고 4시간 동안 180℃의 유조 (oil bath)에 넣어 수열반응 (hydrothermal synthesis)을 통해 탄소 나노입자를 제조하였다.
상기 방법과 같은 방법으로 API 대신에 4-이미다졸아세트산 염산염(4-imidazoleacetic acid hydrochloride), 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린(4-(1H-imidazol-1-yl)aniline), 이미다졸(imidazole), L-히스티딘(L-histidine), 4-이미다졸 아크릴산(4-imidazoleacrylic acid)을 사용하여 총 6가지의 pH 민감성 탄소 나노입자를 제조하였다. 제조된 탄소 나노입자는 증류수에 투석막 (500 Da)을 통해 하루동안 정제하였고, 깨끗한 증류수로 2번 갈아주었다. 투석 하루 후 투석막 안의 용액을 동결건조하여 6가지의 pH 민감성 탄소 나노입자를 회수하였다.
<실시예 3> pH 민감성 탄소 나노입자들의 고압멸균기를 통한 제조
pH 민감성 탄소 나노입자는 도 2와 같이 시트르산(citric acid;CA)과 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole;API)을 이용하여 제조하였다.
자세하게는, 테프론 반응 챔버 (Teflon reactor chamber)에 시트르산(citric acid) 1 g을 넣고 5 ml의 물을 넣어 녹였다. 그 후, 상기 용액에 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole)을 시트르산(citric acid)의 4 mol 농도로 각각 넣어주었다. 상기 용액을 잘 섞어준 후 테프론 반응 챔버를 스테인리스 반응기 (Stainless steel)에 넣고 8시간 동안 120℃에서 고압멸균기를 이용하여 pH 민감성 탄소 나노입자를 제조하였다. 제조된 탄소 나노입자는 증류수에 투석막 (500 Da)을 통해 하루동안 정제하였고, 깨끗한 증류수로 2번 갈아주었다. 투석 하루 후 투석막 안의 용액을 동결건조하여 pH 민감성 탄소 나노입자를 회수하였다.
< 실시예 4> 독소루비신이 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물 전달체 제조
pH 민감성 약물 전달체를 제조하기 위하여 실시예 1을 통해 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자 130 mg과 독소루비신 10 mg을 다이메틸설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide)에 각각 10ml에 녹였다. 그 후, 녹인 두 용액을 혼합하여 증류수에서 투석막 (3000 Da)을 통해 나노입자를 제조하였다. 투석막을 통한 나노입자 제조 시, NaOH를 이용하여 pH 8.0로 조절하여 진행하였으며, 하루 동안 2번의 깨끗한 증류수로 갈아주었다. 하루 뒤 투석막 안의 용액을 회수하고 실린지 필터(syringe filter, 0.2 ㎛)를 통해 응집된(aggregation) 입자들을 제거하였고, 4000 RPM, 20 분 동안 원심분리기에서 센트리콘(centricon)(10000 Da)을 이용하여 봉입되지 않은 독소루비신을 제거하였다.
< 실시예 5> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제 및 광매개 항암 면역 치료제 제조
pH 민감성 광역학 치료제를 제조하기 위하여 실시예 1을 통해 CA, API를 이용하여 제조한 pH 민감성 탄소나노입자 100 mg과 클로린(chlorin)계인 클로린 e6(chlorine e6;Ce6) 또는 포르피린(porphyrin)계인 페오포르비드 a(pheophorbide a;Pheo a) 10 mg을 다이메틸설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide) 10ml에 각각 녹였다. 그 후, pH 민감성 탄소 나노입자와 Ce6 또는 pheo a 용액을 혼합하여 증류수에서 투석막 (3000 Da)을 통해 나노입자를 제조하였다. 투석막을 통한 나노입자 제조 시, NaOH를 이용하여 pH 8.0로 조절하여 진행하였으며, 하루 동안 2번의 깨끗한 증류수로 갈아주었다. 하루 뒤 투석막 안의 용액을 회수하고 실린지 필터(syringe filter, 0.2 ㎛)를 통해 응집된(aggregation) 입자들을 제거하였고, 4000 RPM, 20 분 동안 원심분리기에서 센트리콘(centricon)(10000 Da)을 이용하여 봉입되지 않은 ce6 또는 pheo a를 제거하였다.
<비교예 1> pH에 민감성을 가지지 않는 탄소 나노입자 제조
pH 민감성을 가지지 않는 탄소 나노입자를 제조하기 위하여 CA와 글리세롤(Glycerol) 및 시스테아민(cysteamine)을 이용하여 제조하였다.
자세하게는, 삼각플라스크에 시트르산(citric acid) 1 g을 넣고 5 ml의 물을 넣어 녹였다. 그 후, 상기 용액에 글리세롤(glycerol) 10 ml과 시스테아민(cysteamine) 0.5 g을 넣어주었다. 상기 용액을 잘 섞어준 후 전자레인지 (1100 W)에 넣고 전자레인지를 3분간 작동시켜 마이크로웨이브를 이용한 열분해 반응(microwave assistant pyrolysis)을 통해 탄소 나노입자를 제조하였다. 제조된 탄소 나노입자는 증류수에 투석막 (500 Da)을 통해 하루동안 정제하였고, 깨끗한 증류수로 2번 갈아주었다. 투석 하루 후 투석막안의 용액을 동결건조하여 pH에 민감성을 가지지 않는 탄소 나노입자를 회수하였다.
< 실험예 1> pH 민감성 탄소 나노입자들의 마이크로웨이브를 통한 제조 조건 설정
전자레인지를 통한 열분해 합성 방법을 통해 제조되는 pH 민감성 탄소 나노입자는 전자레인지의 마이크로웨이브(microwave) 파장의 에너지에 따라 탄소 나노입자의 생성 효율이 달라지므로, pH 민감성 탄소 나노입자의 제조 조건을 설정하기 위하여 마이크로웨이브(microwave)를 1분, 3분, 5분의 3가지 조건으로 설정하여 pH 민감성 탄소 나노입자를 제조하였다.
자세하게는, 삼각플라스크에 시트르산(citric acid) 1 g을 넣고 5 ml의 물을 넣어 녹였다. 그 후, 상기 용액에 API를 CA의 4 mol 농도로 넣어주었다. 상기 용액을 잘 섞어준 후 전자레인지 (1100 W)에 넣고 각각 1, 3, 5분간 작동시켜 마이크로웨이브를 이용한 열분해 반응(microwave assistant pyrolysis)을 통해 탄소 나노입자를 제조하였다.
상기와 같이 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자의 형광을 UV (335 nm) 조건에서 육안으로 비교하였으며, 증류수에 투석막 (500 Da)을 통해 하루동안 정제하였고, 2번 깨끗한 증류수로 갈아주었다. 투석 하루 후, 투석막 안의 용액을 동결건조하여 3가지 조건의 pH 민감성 탄소 나노입자를 회수하였다. 회수한 pH 민감성 탄소 나노입자는 각각의 pH에서 표면 전하를 측정하여 pH 민감성을 나타내는지 비교 평가하였다.
실험 결과, 도 3(A)와 같이 3분에서 가장 강한 형광을 나타냈으며, 도 3(B)와 같이 암 환경 pH인 6.5에서 양전하를 나타내었다. 그러나 1분을 마이크로웨이브(microwave)에 노출시킨 경우 에너지가 작아 탄소 나노입자가 제대로 제조되지 않으며, 5분을 노출 시킨 경우 너무 많은 에너지로 인하여 이미다졸(imidazole) 구조가 많이 붕괴되어 pH 민감성 탄소 나노입자가 제대로 제조되지 않은 것으로 판단되었다.
이하, pH 민감성 탄소 나노입자는 마이크로웨이브로 3분 반응한 조건에서 제조하여 실험을 수행하였다.
< 실험예 2> 마이크로웨이브를 통해 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자의 크기 및 표면 전하 측정
상기 실시예 1에서 제조한 6 가지(1-(3-아미노프로필) 이미다졸, 4-이미다졸아세트산 염산염, 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린, 이미다졸, L-히스티딘, 4-이미다졸 아크릴산)의 pH 민감성 탄소 나노입자를 증류수에 1 mg/ml 농도로 녹인 후 제타전위입도분석기를 통하여 나노입자의 크기를 측정하였다. 또한, pH에 따른 나노입자 표면 전하의 변화를 확인하기 위하여 1 N HCl, NaOH를 이용하여 pH를 조절하여 다양한 pH에서 제타전위입도분석기를 통하여 전하를 측정하였다. 비교군으로 pH에 민감성을 가지지 않는 탄소 나노입자(비교예 1)를 이용하여 상기 방법과 같이 측정하였다.
6가지(1-(3-아미노프로필) 이미다졸, 4-이미다졸아세트산 염산염, 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린, 이미다졸, L-히스티딘, 4-이미다졸 아크릴산)의 pH 민감성 탄소 나노입자와 비교예 1의 pH에 민감성을 가지지 않는 탄소 나노입자(cysteamine;시스테아민)를 확인한 결과, 도 4에서와 같이 모두 약 5 nm의 크기를 갖는 것으로 확인하였다.
또한, 표면 전하를 확인한 결과 도 4에서와 같이 생체 내 pH인 7.4에서는 -전하를 갖으며, 암 환경 pH인 ~6.5에서는 +전하를 갖는 것을 확인하였다. 반면에, pH에 민감성을 가지지 않는 탄소 나노입자(비교예 1)의 경우, pH 민감성 탄소 나노입자와 비슷한 입자크기를 갖으나, pH에 상관없이 계속 -전하를 나타내는 것을 확인하였다.
< 실험예 3> 수열반응을 통해 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자의 크기, 표면 전하 및 형광 강도 측정
상기 실시예 2에서 제조한 8 가지(1-(3-아미노프로필) 이미다졸, 4-이미다졸아세트산 염산염, 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린, 이미다졸, L-히스티딘 (4, 8시간), 4-(이미다졸 아크릴산)(4, 8시간)의 pH 민감성 탄소 나노입자를 증류수에 10 mg/ml 농도로 녹인 후, 제타전위입도분석기를 통하여 나노입자의 크기를 측정하였다. 또한, pH에 따른 나노입자 표면 전하의 변화를 확인하기 위하여 1 N HCl, NaOH를 이용하여 pH를 조절하여 다양한 pH에서 제타전위입도분석기를 통하여 전하를 측정하였다. 또한, 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자의 형광 강도를 인비보 형광 이미징 (fluorescence-labeled bioimaging instrument)을 이용하여 측정하였다.
8가지(1-(3-아미노프로필) 이미다졸, 4-이미다졸아세트산 염산염, 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린, 이미다졸, L-히스티딘(4, 8시간), 4-(이미다졸 아크릴산)(4, 8시간)의 pH 민감성 탄소 나노입자를 확인한 결과, 도 5에서와 같이 모두 약 4 nm의 크기를 갖는 것으로 확인하였다.
또한, 표면 전하를 확인한 결과 도 5에서와 같이 생체 내 pH인 7.4에서는 -전하 혹은 전하가 없으며, 암 환경 pH인 ~6.5에서는 전하가 증가하거나 +전하를 갖는 것을 확인하였다. 또한, 각각의 제조된 탄소 나노입자의 형광을 측정한 결과 모두 강한 형광을 띄고 있음을 확인하였다.
< 실험예 4> 고압멸균기를 통해 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자의 크기 및 표면 전하 측정
상기 실시예 3에서 제조한 1-(3-아미노프로필) 이미다졸 기반 pH 민감성 탄소 나노입자를 증류수에 10 mg/ml 농도로 녹인 후, 제타전위입도분석기를 통하여 나노입자의 크기를 측정하였다. 또한, pH에 따른 나노입자 표면 전하의 변화를 확인하기 위하여 1 N HCl, NaOH를 이용하여 pH를 조절하여 다양한 pH에서 제타전위입도분석기를 통하여 전하를 측정하였다. 또한, 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자의 형광 강도를 인비보 형광 이미징 (fluorescence-labeled bioimaging instrument)을 이용하여 측정하였다.
이렇게 제조된 pH 민감성 탄소 나노입자를 확인한 결과, 도 6에서와 같이 약 3 nm의 크기를 갖는 것으로 확인하였다.
또한, 표면 전하를 확인한 결과 도 6에서와 같이 생체 내 pH인 7.4에서는 -전하를 갖으며, 암 환경 pH인 ~6.5에서는 +전하를 갖는 것을 확인하였다. 또한, 만들어진 탄소 나노입자의 형광을 측정한 결과 강한 형광을 띄고 있음을 확인하였다.
< 실험예 5> 독소루비신이 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물전달체의 입자 확인
상기 실시예 4에서 제조된 6가지(1-(3-아미노프로필) 이미다졸, 4-이미다졸아세트산 염산염, 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린, 이미다졸, L-히스티딘, 4-이미다졸 아크릴산)의 독소루비신이 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물전달체의 입자 크기를 제타전위입도분석기와 투과전자현미경을 통하여 확인하였다. 각각 증류수에 1 mg/ml 농도로 녹인 후 측정하였으며, 투과전자현미경의 경우 pH 7.4, pH 6.5 2가지의 pH에서 확인하였다.
그 결과, 도 7과 같이 6가지의 독소루비신이 봉입된 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물전달체는 약 70 nm의 크기를 갖는 것으로 나타났으며, 투과전자현미경으로 확인한 결과 pH 7.4에서는 나노입자 약물전달체의 형태가 유지된 반면, pH 6.5에서 약물전달체의 형태가 붕괴되는 것을 확인하였다.
< 실험예 6> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물 전달체의 pH에 따른 약물방출실험
상기 실시예 4에서 제조한 독소루비신을 봉입한 6가지(1-(3-아미노프로필) 이미다졸, 4-이미다졸 아크릴산, 4-이미다졸아세트산 염산염, 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린, 이미다졸, L-히스티딘)의 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체들의 이용하여 pH 7.4, pH 6.5 PBST (0.01M, tween 80 1%)에서 약물방출 키트(kit) (MWCO 10K)를 이용하여 약물방출실험을 진행하였다.
그 결과, 도 8과 같이 CA와 API를 이용하여 제조한 pH 민감성 탄소 나노기반 약물 전달체가 pH 6.5에서는 약 70 %까지 방출되어 가장 많은 약물을 방출하는 것을 확인하였다.
이하, CA와 API를 이용하여 제조한 pH 민감성 탄소 나노입자 및 약물 전달체에 대하여 추가적인 실험을 수행하였다.
<실험예 7> pH 민감성 탄소 나노입자 표면 작용기 확인
CA와 API를 이용하여 제조한 pH 민감성 탄소 나노입자의 표면에 이미다졸(imidazole) 작용기를 X-선광전자분광기 (X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)를 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 9와 같이 총 C, N, O의 3가지의 원소가 존재하며, N1s 스펙트럼(spectrum) 분석 결과 피롤(pyrrole)에 존재하는 N-H와 C=N-C 결합이 확인되었다. 이를 통해 이미다졸(imidazole) 작용기가 끊어지지 않고 탄소 나노입자 표면에 존재하는 것을 알 수 있었다.
<실험예 8> 소수성 결합에 의한 약물전달체 생성 최소 농도 확인
pH 민감성 탄소 나노입자를 이용한 약물전달체 제조 시 필요한 pH 민감성 탄소 나노입자의 최소 농도를 확인하기 위하여 나일 레드(nile red)라는 소수성 형광 물질을 이용하였다. 나일 레드(nile red)를 아세톤에 5x10-5 M 농도로 녹인 후 증발기를 이용하여 얇은 필름(thin film)으로 제조하였다. 제조한 얇은 필름(thin film)에 CA, API로 제조한 pH 민감성 탄소 나노입자를 농도별로 녹인 증류수를 pH 7.4와 6.5로 조절하여 넣어주어 약물전달체 형성을 형광분도계를 통하여 확인하였다. 빛 조사는 520 nm, 검출은 618 nm로 측정하였다.
그 결과, 도 10과 같이 pH 7.4에서는 0.958 mg/ml 농도 이상에서 약물전달체를 형성하였으며, pH 6.5에서는 4.090 mg/ml 농도 이상에서 약물전달체를 형성하는 것을 확인하였다.
< 실험예 9> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물전달체의 pH에 따른 입자 변화 확인
상기 실시예 4에서 제조한 독소루비신을 봉입한 CA와 API 기반 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체의 pH 7.4, pH 6.5에서의 입자 변화를 확인하였다. 독소루비신 기준 1 mg/ml로 증류수에 녹인 후 0.1 N HCl, NaOH를 이용하여 pH를 5분 간격으로 pH 7.4와 pH 6.5로 반복 조절하면서 제타전위입도분석기를 통하여 크기를 측정하였다.
그 결과, 도 11과 같이 pH 7.4에서는 약 70 nm 크기를 나타냈으며, pH 6.5에서는 약 1000 nm의 크기를 나타내는 것으로 확인하였다.
< 실험예 10> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물전달체의 pH에 따른 입자 형태 확인
상기 실시예 4에서 제조한 독소루비신을 봉입한 CA와 API 기반 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체의 다양한 pH에 따른 입자의 변화를 확인하기 위하여 독소루비신 기준 1 mg/ml로 증류수에 녹인 후, 24시간 후에 이를 육안으로 확인하였다.
그 결과, 도 12와 같이 생체 내 pH인 7.0~ 이상의 경우 입자가 안정하게 유지되는 것을 확인한 반면, 암 환경 pH인 ~6.5 이하의 경우 입자에 봉입되어 있던 독소루비신이 입자 밖으로 방출됨에 따라 뭉쳐 가라앉아 있는 것을 확인하였다.
<실험예 11> pH 민감성 탄소 나노입자의 정상세포 독성 평가
상기 실시예 1에서 제조한 CA, API기반 pH 민감성 탄소 나노입자의 정상세포 독성 평가를 하기 위해, NIH-3T3 (mouse embryo fibroblast), L-929 (mouse fibroblast) 세포를 이용하였다. pH 7.4 배양액에 pH 민감성 탄소 나노입자를 농도별로 4시간 동안 처리한 후 24시간 뒤에 세포 사멸율을 MTT assay를 이용하여 마이크로플레이트 리더(microplate reader)기를 이용하여 570 nm에서 분석하였다.
그 결과, 도 13과 같이 두 가지 세포에서 모두 pH 민감성 탄소 나노입자 농도 기준 1 mg/ml까지 독성이 나타나지 않는 것으로 보아 생체 친화성이 뛰어난 것으로 판단된다.
< 실험예 12> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물전달체의 암세포 사멸 효능 확인
상기 실시예 4에서 제조한 독소루비신을 봉입한 CA와 API 기반 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체의 암세포 사멸 효과를 확인하기 위하여, HCT-116(human colon cancer), SKBR-3(human breast cancer), PANC-1(human pancreas cancer) 세포를 이용하였다. 각각 pH 7.4, pH 6.5 배양액에 pH 민감성 탄소 나노입자 약물 전달체를 독소루비신 농도별로 처리하였고, 비교군으로 독소루비신 단독적으로 농도별로 처리하여 비교 평가하였다. 세포 사멸은 MTT assay를 이용하였으며, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)기를 이용하여 490 nm에서 분석하였다.
그 결과, 도 14와 같이 단독적으로 독소루비신을 처리(Free DOX)한 모든 세포는 pH에 상관없이 약 50 ug/ml에서 사멸하였으나, 독소루비신을 봉입한 pH 민감성 탄소 나노입자 전달체는 pH 6.5에서 붕괴되어 pH 7.4 보다 높은 세포 사멸률을 나타낸 것으로 확인하였다.
< 실험예 13> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물전달체의 pH에 따른 세포 내 유입 효과 확인
상기 실시예 4에서 제조한 독소루비신 봉입 pH 민감성 탄소나노입자를 이용하여 pH 7.4, pH 6.5에서의 암세포 내로의 유입효과를 확인하기 위하여, PANC-1 (Human pancreatic cancer) 세포를 이용하였다. 각각 pH 7.4, pH 6.5 배양액에 독소루비신 봉입 pH 민감성 탄소나노입자를 4시간 처리하여 비교 평가하였다. 세포 유입은 공초점 현미경(Confocal microscopy)을 이용하여 탄소 나노입자(C-dot)와 독소루비신(DOX)의 형광(460, 590 nm)으로 분석하였다.
도 15(A)의 DIC는 세포의 형태를 나타내는 도면이며, C-dot과 DOX는 각각의 형광을 나타내고, Merge는 세포의 형태와 각 형광들을 겹쳐서 나타낸 도면이다.
그 결과, 도 15(A), (B)와 같이 생체 내 pH인 7.4에서는 pH 민감성 탄소 나노입자에 봉입된 독소루비신의 세포 내 유입 정도가 저조한 것을 확인한 반면, 암 환경 pH인 6.5의 경우(도 15(A), (C)) 나노입자가 붕괴되어 봉입되어 있던 독소루비신이 입자 밖으로 방출됨에 따라 유입 정도가 증가하는 것을 탄소 나노입자 자체의 형광(C-dot)과 독소루비신의 형광(DOX)의 세기 증가를 통해 간접적으로 확인하였다.
< 실험예 14> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물전달체의 생체 내 암 성장 저해 효과 확인
상기 실시예 4에서 제조한 독소루비신 봉입 pH 민감성 탄소나노입자의 생체 내 항암 효과를 확인하기 위해, HCT-116 (Human colon cancer) 세포를 BALB/c 쥐의 피하(1×107 cells)에 접종하였다. 암 조직의 크기가 약 100 mm3에 도달하였을때, 독소루비신 봉입 pH 민감성 탄소 나노입자와 비교군으로 독소루비신 단독 제형, 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자, PBS를 독소루비신 기준 2 mg/ml로 하여 정맥 주사하였다. 그 후 15일 동안 암 조직의 크기를 측정하여 항암 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 16(A), (B)와 같이 단독 독소루비신, 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자, PBS를 정맥 주사한 결과 암이 계속적으로 성장하는 것을 확인한 반면, 독소루비신 봉입 pH 민감성 탄소 나노입자의 경우 암세포 성장이 크게 저해되는 것을 확인하였다. 또한, 도 16(C)와 같이 단독 독소루비신을 제외하고 다른 제형의 생체 내 독성이 나타나지 않아 쥐의 몸무게가 일정한 것을 확인하였다.
< 실험예 15> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 약물전달체의 생체 내 암 조직 염색을 통한 항암 효능 확인
상기 실시예 4에서 제조한 독소루비신 봉입 pH 민감성 탄소나노입자의 생체 내 항암 효과를 확인하기 위해, HCT-116 (Human colon cancer) 세포를 BALB/c 쥐의 피하(1×107 cells)에 접종하였다. 암 조직의 크기가 약 100 mm3에 도달하였을때, 독소루비신 봉입 pH 민감성 탄소 나노입자와 비교군으로 독소루비신 단독 제형, 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자, PBS를 독소루비신 기준 2 mg/ml로 하여 정맥 주사하였다. 15일 후 암 조직을 적출하여 Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) 방법과 Hematoxylin and eosin stain (H&E) 방법을 이용하여 암세포 사멸 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 17과 같이 독소루비신 봉입 pH 민감성 탄소나노입자를 주사한 경우가 단독 독소루비신, 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자, PBS보다 암 세포의 사멸 효과가 더 확연히 나타남을 조직 염색을 통해 확인하였다.
<실험예 16> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 입자 확인
상기 실시예 5에서 pH 8에서 광감각제와 탄소 나노입자의 중심 부분의 소수성 상호작용에 의한 광감각제 봉입에 의해 제조된 pH 민감성 광역학 치료제로 제조된 입자(도 18)의 pH에 따른 입자 변화를 확인하기 위해, 클로린e6 기준 1 mg/ml로 증류수에 녹인 후 0.1 N HCl, NaOH를 이용하여 pH 7.4와 pH 6.5에서의 제타전위입도분석기와 투과전자현미경을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 19와 같이 pH 민감성 광역학 치료제로 제조된 입자는 약 131 nm의 크기를 갖는 것으로 나타났으며, 투과전자현미경으로 확인한 결과 pH 7.4에서는 나노입자 약물전달체의 형태가 유지된 반면, pH 6.5에서 pKa값이 6.9인 API의 전하가 바뀜에 따라 소수성이였던 중심부분이 친수성으로 변하면서 소수/친수 간의 균형이 파괴되어 약물전달체의 형태가 붕괴되는 것을 확인하였다(도 18(b)).
< 실험예 17> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 표면 전하 확인
상기 실시예 5에서와 같이 pH 민감성 광역학 치료제로 제조된 입자의 pH에 따른 나노입자 표면 전하의 변화를 확인하기 위하여 1 N HCl, NaOH를 이용하여 pH를 조절하여 다양한 pH에서 제타전위입도분석기를 통하여 전하를 측정하였다.
그 결과, 도 20에서와 같이 클로린 e6가 봉입된 pH 민감성 광역학 치료제로 제조된 입자(Ce6@CDs)는 생체 내 pH인 7.4이상에서는 강한 -전하를 갖으며, 암 환경 pH인 ~6.5에서는 약한 -전하를 갖는 것을 확인하였다.
< 실험예 18> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 활성산소 생성 확인 및 pH에 따른 활성산소 생성능 확인
상기 실시예 5에서와 같이 pH 민감성 광역학 치료제로 제조된 입자의 활성산소 발생 확인을 위하여 일항산소를 감지할 수 있는 형광물질 (Singlet oxygen sensor green; SOSG)을 이용하였다.
자세하게는, SOSG를 녹인 용액 1 ml과 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제를 녹인 용액 1 ml를 섞어 주고, 670 nm 레이저를 조사하였다. 레이저는 20 mW/cm2의 에너지로 조사하였으며, 10초 (0.2 J/cm2)마다 형광분광광도계를 이용하여 형광 세기(intensity)를 측정하여 활성산소 생성을 확인하였다. 또한, pH에 따른 활성산소 발생 효율을 측정하기 위해 생체 내 pH인 7.4와 암 환경 pH인 6.5에서의 pH 민감성 광역학 치료제를 녹인 용액 1 ml과 SOSG 용액 1 ml을 섞어 주고, 670 nm 레이저를 조사하였다. 레이저는 50 mW/cm2의 에너지로 조사하였고, 10초 (0.5 J/cm2)마다 형광분광광도계를 이용하여 형광 세기(intensity)를 측정하여 활성산소 생성을 확인하였다.
그 결과, 도 21(A)와 같이 단독적으로 존재하는 Pheo A와 Ce6는 일항산소 생성을 거의 하지 않는 것으로 나타난 반면, 각각의 pheo A와 Ce6을 봉입한 pH 민감성 탄소 나노입자는 일항산소를 효율적으로 생성하는 것을 확인하였다.
또한, 도 21(B)와 같이 단독적으로 존재하는 Ce6의 경우 pH 변화의 유무에 상관없이 일항산소 생성을 거의 하지 않는 것으로 나타난 반면, pH 민감성 나노입자의 경우, 암 환경의 pH인 6.5에서 입자가 풀리면서 생체 내 pH 7.4보다 더 효율적으로 일항산소를 생성하는 것을 확인하였다.
< 실험예 19> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 pH에 따른 입자 변화 확인
상기 실시예 5에서와 같이 pH 민감성 광역학 치료제로 제조된 입자의 pH에 따른 입자의 변화를 확인하기 위하여 클로린 e6 기준 0.5 mg/ml로 증류수에 녹인 후, 24시간 후에 이를 육안으로 확인하였다.
그 결과, 도 22와 같이 생체 내 pH 7.0~ 이상의 경우 입자가 안정하게 유지되는 것을 확인한 반면, 암 환경 pH인 ~6.5 이하의 경우 입자에 봉입되어 있던 클로린 e6가 입자 밖으로 방출됨에 따라 뭉쳐 가라앉아 있는 것을 확인하였다.
< 실험예 20> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 pH에 따른 약물방출실험
상기 실시예 5에서 제조한 pH 민감성 광역학 치료제로 제조된 입자를 이용하여 pH 7.4, pH 6.5 PBST (0.01M, tween 80 1%)에서 약물방출 키트(kit) (MWCO 10K)를 이용하여 약물방출실험을 진행하였다.
그 결과, 도 23(a)와 같이 pH 민감성 탄소 나노기반 광역학 치료제가 pH 6.5에서는 약 80 %까지 방출되었으며, 도 23(b)와 같이 12시간 후에 pH 7.4에서 pH 6.5로 버퍼를 바꿔줌에 따라 방출 효과가 크게 향상되는 것을 확인하였다.
< 실험예 21> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 pH에 따른 세포 내 유입 효과 확인
상기 실시예 5에서 제조한 pH 민감성 광역학 치료제를 이용하여 pH 7.4, pH 6.5에서의 암세포 내로의 유입효과를 확인하기 위하여, CT-26 (Mouse colon cancer) 세포를 이용하였다. 각각 pH 7.4, pH 6.5 배양액에 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제를 4시간 처리하였고, 비교군으로 클로린 e6를 단독적으로 처리하여 비교 평가하였다. 세포 유입은 공초점 현미경(Confocal microscopy)을 이용하여 탄소 나노입자와 클로린 e6의 형광(460, 665 nm)으로 분석하였다.
그 결과, 도 24와 같이 생체 내 pH인 7.4에서는 클로린 e6 단독 처리군과 pH민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 세포 내 유입 정도가 유사한 것을 확인한 반면, 암 환경 pH인 6.5의 경우 입자가 붕괴되어 봉입되어 있던 클로린 e6가 입자 밖으로 방출됨에 따라 암세포 내 유입 정도가 증가하는 것을 탄소 나노입자 자체의 형광(IDCDs)과 클로린 e6(Ce6)의 형광의 세기 증가를 통해 간접적으로 확인하였다.
< 실험예 22> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 암 환경 pH에서의 암세포 사멸 효능 확인
상기 실시예 5에서 제조한 pH 민감성 광역학 치료제의 암 환경 pH인 6.5에서의 암세포 사멸 효과를 확인하기 위하여, CT-26 (Mouse colon cancer) 세포를 이용하였다. pH 6.5 배양액에 pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제 및 다른 비교군으로 클로린 e6를 단독 제형, pH 민감성을 가지지 않는 탄소 나노입자(비교예 1) 샘플을 클로린 e6 농도 기준 1 μg/ml으로 동일하게 처리하고, 이에 670 nm 레이저를 조사하였다. 레이저는 50 mW/cm2의 에너지로 20초 (2 J/cm2) 조사하였다. 세포 사멸은 MTT assay를 이용하였으며, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)기를 이용하여 570 nm에서 분석하였다.
그 결과, 도 25와 같이 단독적으로 클로린 e6를 처리(Free Ce6)한 세포는 레이저를 조사한 그룹의 경우(Free Ce6(+)) 50 %가 사멸하였지만, 클로린 e6를 봉입한 pH 민감성 탄소 나노입자((Ce6@CDs)에 레이저를 조사한 경우(Ce6@CDs(+)) 약 80%의 높은 세포 사멸률을 나타낸 것으로 확인하였다.
< 실험예 23> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 생체 내 거동 평가
상기 실시예 5에서 제조한 pH 민감성 광역학 치료제의 생체 내 거동을 확인하기 위해, CT-26 (Mouse colon cancer) 세포를 BALB/c nude 쥐에 접종하였다. 암 조직의 크기가 약 50~100 mm3에 도달하였을때, pH 민감성 광역학 치료제(Ce6@CDs)와 비교군으로 클로린 e6 단독 제형(Free Ce6)을 클로린 e6 기준 0.4 mg/ml로 하여 정맥 주사한 후 24시간 동안 시간 별로 인비보 형광 이미징 (fluorescence-labeled bioimaging instrument)을 이용하여 생체 내 거동을 확인하였다.
그 결과, 도 26(a)와 같이 단독 클로린 e6를 정맥 주사한 비교군은 생체 내 제거 시스템에 의해 빠르게 형광이 사라지는 것을 확인한 반면, pH 민감성 광역학 치료의 경우 나노입자의 특징인 증진된 침투 및 체류 효과 (Enhanced permeability and retention effect, EPR effect)에 의해 암 조직에 축적되어 24시간 후에도 체류가 되는 것을 확인하였다. 또한, 도 26(b), (c)와 같이 24시간 후 주요 장기(간(Liver), 심장(Heart), 폐(Lung), 비장(Spleen), 신장(Kidney)) 및 암 조직(Tumor)을 적출하여 형광을 관찰하고 이를 수치화였을 때, 단독 클로린 e6보다 pH 민감성 광역학 치료의 경우 암 조직에 약 4배 정도 더 축적된 것을 확인하였다.
< 실험예 24> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 생체 내 광역학 항암 효과 및 면역 항암 효과 확인
상기 실시예 5에서 제조한 pH 민감성 광역학 치료제의 생체 내 항암 효과 및 광역학 기반 면역 유도로 인한 항암 효과를 확인하기 위해, CT-26 (Mouse colon cancer) 세포를 BALB/c 쥐의 왼쪽 다리 (1×106 cells)와 오른쪽 다리 (5×105 cells)의 피하에 접종하였다. 암 조직의 크기가 약 50 mm3에 도달하였을때, pH 민감성 광역학 치료제와 비교군으로 클로린 e6를 단독 제형, 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자, PBS를 클로린 e6 기준 0.4 mg/ml로 하여 정맥 주사한 뒤 24시간 후 왼쪽 암 조직에만 레이저를 조사하였다. 이를 두 번 반복하여 진행하였으며, 레이저는 100 mW/cm2의 에너지로 1000초 (100 J/cm2) 조사하였다. 15일 동안 양쪽의 암 조직의 크기를 측정하여 광역학 항암 효과 및 그로 인한 면역 항암 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 27(a)와 같이 단독 클로린 e6(Free Ce6), 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자 (Carbon dots), PBS를 정맥 주사한 결과 레이저 조사 유무에 관계없이 빠르게 암이 성장하는 것을 확인한 반면, pH 민감성 광역학 치료제에 레이저를 조사한 경우(Ce6@CDs(+)) 왼쪽 암의 광역학 매개 항암 효과가 나타나 암세포 성장이 크게 저해되는 것을 확인하였다. 또한, 오른쪽 암은 광역학 치료에 의해 유도된 면역 항암 효과로 인해 레이저 조사가 되지 않음에도 불구하고 암세포 성장이 저해되는 것을 확인하였다. 또한, 도 27(b)와 같이 각 제형의 생체 내 독성이 나타나지 않아 쥐의 몸무게가 일정한 것을 확인하였다.
< 실험예 25> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 광역학 기반 면역 세포 유도 확인
상기 실시예 5에서 제조한 pH 민감성 광역학 치료제의 광역학 기반 면역 유도를 확인하기 위해, CT-26 (Mouse colon cancer) 세포를 BALB/c 쥐의 왼쪽 다리 (1×106 cells)와 오른쪽 다리 (5×105 cells)의 피하에 접종하였다. 암 조직의 크기가 약 50 mm3에 도달하였을때, pH 민감성 광역학 치료제와 비교군으로 클로린 e6를 단독 제형, 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자, PBS를 클로린 e6 기준 0.4 mg/ml로 하여 정맥주사한 뒤 24시간 후 왼쪽 암 조직에만 레이저를 조사하였다. 이를 두 번 반복하여 진행하였으며, 레이저는 100 mW/cm2의 에너지로 1000초 (100 J/cm2) 조사하였다. 5일 후, 각 쥐에서 암 조직을 제거하여 암 조직으로 침투한 세포 독성 T세포 (Cytotoxic T cell)의 분포를 Anti-CD3, Anti-CD8 항체를 이용하여 유세포 분석기를 통해 확인하였다.
그 결과, 도 28과 같이 pH 민감성 광역학 치료제(Ce6@CDs)에 레이저를 조사해 준 왼쪽 암의 경우 단독 클로린 e6(Ce6), 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자 (Carbon dots), PBS를 정맥 주사한 후 레이저를 조사해 준 경우보다 약 10배 이상의 면역세포가 유도된 것을 확인하였다. 또한, 레이저를 조사하지 않은 pH 민감성 광역학 치료제의 오른쪽 암의 경우에도 광역학 기반 면역 유도 효과가 나타나 단독 클로린 e6 주사한 후 레이저를 조사해 준 경우보다 약 3배 가량의 면역세포가 유도된 것을 확인하였다.
< 실험예 26> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 생체 내 암 조직 염색을 통한 항암 효능 확인
상기 실시예 5에서 제조한 pH 민감성 광역학 치료제의 암 조직내 항암 효능을 확인하기 위해, CT-26 (Mouse colon cancer) 세포를 BALB/c 쥐에 접종하였다. 암 조직의 크기가 약 50 mm3에 도달하였을때, pH 민감성 광역학 치료제와 비교군으로 클로린 e6 단독 제형, 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자, PBS를 클로린 e6 기준 0.4 mg/ml로 하여 정맥 주사한 뒤 24시간 후 왼쪽 암 조직에만 레이저를 조사하였다. 이를 두 번 반복하여 진행하였으며, 레이저는 100 mW/cm2의 에너지로 1000초 (100 J/cm2) 조사하였다. 15일 후 암 조직을 적출하여 Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL)방법과 Hematoxylin and eosin stain (H&E)방법을 이용하여 암세포 사멸 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 29와 같이 pH 민감성 광역학 치료제에 레이저를 조사해 준 암의 경우 단독 클로린 e6(Ce6), 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자 (Carbon dots), PBS를 정맥 주사한 후 레이저를 조사해 준 경우보다 암 세포의 사멸 효과가 더 확연히 나타남을 조직 염색을 통해 확인하였다.
< 실험예 27> pH 민감성 탄소 나노입자 기반 광역학 치료제의 암 조직내 유도된 면역 세포 확인
상기 실시예 5에서 제조한 pH 민감성 광역학 치료제의 암 조직내 유도된 면역 세포를 확인하기 위해, CT-26 (Mouse colon cancer) 세포를 BALB/c 쥐에 접종하였다. 암 조직의 크기가 약 50 mm3에 도달하였을때, pH 민감성 광역학 치료제와 비교군으로 클로린 e6 단독 제형, 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자, PBS를 클로린 e6 기준 0.4 mg/ml로 하여 정맥 주사한 뒤 24시간 후 왼쪽 암 조직에만 레이저를 조사하였다. 이를 두 번 반복하여 진행하였으며, 레이저는 100 mW/cm2의 에너지로 1000초 (100 J/cm2) 조사하였다. 15일 후 암 조직을 적출하여 Immunohistochemistry 방법을 이용하여 암 조직 내로 유도된 면역세포를 확인하였다.
그 결과, 도 30과 같이 pH 민감성 광역학 치료제에 레이저를 조사해 준 암의 경우 단독 클로린 e6, 약물이 봉입되지 않은 pH 민감성 탄소 나노입자 (Carbon dots), PBS를 정맥 주사한 후 레이저를 조사해 준 경우보다 암 조직 내로 유도된 T세포와 NK세포의 분포가 더 월등한 것을 조직 염색을 통해 확인하였다.
이를 통해 본 발명에 따른 pH 민감성 나노입자는 소수성 약물 또는 광감작제를 내부에 봉입하고, 약산성의 pH에서 소수성 약물 또는 광감작제의 방출이 가능하여 암 선택적 약물전달체, 광역학 치료제 또는 광매개 항암면역 치료제로 활용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (16)

  1. 이미다졸(imidazole)이 포함된 pH 민감성 탄소 나노입자.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 pH 민감성 탄소 나노입자는 시트르산(citric acid) 및 이미다졸(imidazole) 화합물을 이용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 탄소 나노입자.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 이미다졸(imidazole) 화합물은 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole), 4-이미다졸아세트산 염산염(4-imidazoleacetic acid hydrochloride), 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린(4-(1H-imidazol-1-yl)aniline), 이미다졸(imidazole), L-히스티딘(L-histidine), 4-이미다졸 아크릴산(4-imidazoleacrylic acid)으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 탄소 나노입자.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 이미다졸(imidazole) 화합물은 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole)인 것을 특징으로 하는 pH 민감성 탄소 나노입자.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 pH 민감성 탄소 나노입자는 pH ≥ 7.0 에서는 음전하를, pH < 7.0 에서는 중성전하 또는 양전하를 갖는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 탄소 나노입자.
  6. 제 1항에 의한 pH 민감성 탄소 나노입자 및 상기 나노입자 내에 봉입될 수 있는 약물을 포함하는 약물 전달체.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 약물은 소수성 약물, 클로린(chlorin)계 및 포르피린(porphyrin)계로 이루어진 군 중에서 어느 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 약물은 독소루비신, 파크리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 시로리무스(Sirolimus) 및 에토포시드(etoposide)로 구성된 항암제나 클로린 e6(chlorine e6), 페오포르비드 a(pheophorbide a) 및 프탈로시아닌 (phthalocyanine)으로 구성된 광감작제 중 어느 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 pH 7.0 이하에서 불안정화 되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 암치료, 광역학 치료 및 광매개 항암면역 치료로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 선택되는 용도로 이용되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  11. 시트르산(citric acid)을 용해 시키는 단계;
    상기 시트르산이 용해된 용액에 이미다졸(imidazole) 화합물을 첨가하여 혼합용액을 제조하는 단계;
    상기 혼합용액을 열처리 반응하여 탄소 나노입자를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 탄소 나노입자를 투석 및 동결 건조하는 단계;
    를 포함하는 pH 민감성 탄소 나노입자의 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 이미다졸(imidazole) 화합물은 1-(3-아미노프로필) 이미다졸(1-(3-aminopropyl) imidazole), 4-이미다졸아세트산 염산염(4-imidazoleacetic acid hydrochloride), 4-(1H-이미다졸-1-일)-아닐린(4-(1H-imidazol-1-yl)aniline), 이미다졸(imidazole), L-히스티딘(L-histidine), 4-이미다졸 아크릴산(4-imidazoleacrylic acid)으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 탄소 나노입자의 제조방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 혼합용액의 열처리 반응은,
    마이크로웨이브 열분해(pyrolysis) 반응, 수열(Hydrothermal) 반응 및 고압멸균(Autoclave) 반응으로 이루어진 군 중에서 어느 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 탄소 나노입자의 제조방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 마이크로웨이브 열분해(pyrolysis) 반응은,
    마이크로웨이브에 1 내지 5분 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 탄소 나노입자의 제조방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 수열(Hydrothermal) 반응은,
    100 내지 200℃의 유조(oil bath)에서 4 내지 8시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 탄소 나노입자의 제조방법.
  16. 제 13항에 있어서,
    상기 고압멸균(Autoclave) 반응은,
    100 내지 150℃ 고압멸균기에서 8 내지 12시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 pH 민감성 탄소 나노입자의 제조방법.
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