CN114620709A - 一种产氢的碳点-全细胞生物复合系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种产氢的碳点‑全细胞生物复合系统的制备方法，主要涉及纳米材料碳点(CDs)的制备及表征，复合体系的构建及碳点‑全细胞生物复合系统产氢性能的研究，属于生物质制氢领域。本发明要解决的是典型的全细胞生物在跨膜扩散过程中电子传递动力学迟缓，严重制约了其催化产氢的问题。碳点具有优异的导电性能、原料来源广、生物相容性好，所以可将适量的碳点加入微生物(大肠杆菌BL21)培养基中构建无机纳米材料‑全细胞复合系统来提高产氢性能。本发明所制备的CDs‑E.Coli无机纳米材料‑全细胞生物复合系统三个小时总产氢量能达到0.7mmol，比纯的大肠杆菌提高了75％，有效的提高了产氢效率。

Description

一种产氢的碳点-全细胞生物复合系统
技术领域
本发明属于生物质制氢技术领域；用于产生氢气的碳点-全细胞生物复合系统的制备方法，主要涉及纳米材料碳点(CDs)的制备及表征，碳点-全细胞生物复合系统的构建及复合系统产氢性能的研究。
背景技术
随着世界经济的快速发展，化石燃料燃烧过程中排放的碳和有害气体引起的环境问题变得越来越严重和显著。为了以可持续发展的方式满足世界各国巨大的能源需求，研究开发生态友好型的新能源来解决环境污染问题是迫在眉睫的工作。氢能是清洁能源，因其零碳排放、高转换效率和燃烧产物无毒无污染而成为最有前途的替代能源之一。利用太阳能光催化裂解水制氢是解决能源和环境危机的一种前瞻性策略。然而，光生电子-空穴对的快速复合严重影响了催化剂的光催化活性——减小光生载流子的复合速率，是光催化剂普遍需要解决的难题。
自2012年以来，已经报道了几种无机-生物能源生产系统。这项新技术结合了无机半导体的优异光吸收效率和微生物的高度特异性生物催化能力，以提高能量生产。在混合制氢体系方面，开发了CdS纳米棒与来自芽孢杆菌的纯化的[Fe-Fe]氢化酶的复合物，并且成功地从无机-生物体系中诱导出氢气。表达[Fe-Fe]氢化酶的重组大肠杆菌菌株也与TiO2结合大大提高了产氢量。以甲基紫精为电子转移剂，该体系可连续产生氢气。大肠杆菌作为兼性厌氧菌可以厌氧促进合成内源性[Ni-Fe]氢化酶，并且可以通过基因工程在不将外源氢化酶引入细菌细胞的情况下产生氢。在这项研究中，我们构建了一个无机纳米材料-全细胞生物复合系统，并寻求利用内源细菌[Ni-Fe]氢化酶和碳点的光生电子来提高生物制氢的可能性。进行了一系列实验来制备和表征碳点，无机纳米材料-全细胞生物复合系统的构建及复合系统产氢性能的研究。
发明内容
本发明要解决的是纯细菌细胞生物体系由于跨膜扩散过程中电子传递动力学迟缓，导致产氢效率较低的问题。通过本方法能够在较短时间生产大量的碳点。CDs-E.Coli复合系统结合了碳点优异的光催化性能、良好的导电性以及大肠杆菌的生物催化能力，缩短了电子传递的距离，避免了跨膜过程中的额外能量损失，大大提高了产氢速率。
本发明涉及纳米材料碳点的制备及表征，无机纳米材料-全细胞生物复合系统的构建及复合系统产氢性能的研究，具体是按下述步骤进行的：
步骤一、称取1g固体柠檬酸，加入到100mL的烧瓶中。将烧瓶置于油浴中加热至180℃，保持25min。
步骤二、将50mL0.5mol·L-1氢氧化钠溶液缓慢加入上述烧瓶中，并超声5min使其充分混合。
步骤三、将上述溶液加入到150mL丙酮中，在8000r·min-1下离心5min，取上清液，在旋转蒸发仪上将丙酮蒸干，得到碳点溶液。
步骤四、配置100ml细菌培养液:0.5g酵母浸膏、1g-1.5g蛋白胨、1g-1.2g氯化钠、100ml去离子水，调节PH至7.3-7.4，将培养液放在高压蒸汽灭菌锅中灭菌(121℃20min)。
步骤五、将上述灭菌的培养液静置室温后，按照1:3的比例将大肠杆菌接种在培养液中，将细菌培养液放置在摇床(37℃100rpm)中培养。
步骤六、当细菌培养液的OD600值为0.5时，加入10ml-30ml碳点溶液，过夜培养使碳点和细菌结合。
步骤七、将上述溶液离心(3000rmin-110min)，取沉淀加入到灭菌过的新鲜培养液中(0.5g酵母浸膏、1g-1.5g蛋白胨、1g-1.2g氯化钠、100ml去离子水、12.1mg半胱氨酸、葡萄糖、甲基紫精)在厌氧条件下放入摇床中过夜培养。
步骤八、将上述厌氧培养后的细菌离心(3000rmin-110min)后，放入厌氧反应器中，加入新的灭菌过的培养液中(0.5g酵母浸膏、1g-1.5g蛋白胨、1g-1.2g氯化钠、100ml去离子水、12.1mg半胱氨酸、葡萄糖、甲基紫精)。
步骤九、测量上述厌氧反应器中的氢气含量，从第0小时开始测试，每一个小时测试一次，一共测试3个小时。
本发明通过简单快速的方法合成的碳点：具有良好的光化学稳定性及生物相容性，平均尺寸为1.57nm，更易于进入细菌体内。
本发明中培养使用的细菌大肠杆菌具有环境适应能力较强、生长繁殖快、成本低的特点。
本发明中CDs-E.Coli复合系统的产氢量明显高于纯细菌体系，显著增强了产氢效率，三个小时总产氢量能达到0.7mmol，比纯的大肠杆菌提高了75％，有效的提高了产氢效率。
附图说明
图1是碳点的TEM图。
图2是碳点的XPS图谱。
图3是碳点的XRD图谱。
图4是碳点的FTIR图。
图5是将碳点加入细菌培养液后不同时间段的的OD600值。
图6是CDs-E.Coli复合系统和纯细菌产氢量的对比图。
具体实施方式
实施1:
步骤一、称取1g固体柠檬酸，加入到100mL的烧瓶中。将烧瓶置于油浴中加热至180℃，保持25min。
步骤二、将50mL0.5mol·L-1氢氧化钠溶液缓慢加入上述烧瓶中，并超声5min使其充分混合。
步骤三、将上述溶液加入到150mL丙酮中，在8000r·min-1下离心5min，取上清液，在旋转蒸发仪上将丙酮蒸干，得到碳点溶液。
步骤四、配置100ml细菌培养液:0.5g酵母浸膏、1g-1.5g蛋白胨、1g-1.2g氯化钠、100ml去离子水，调节PH至7.3-7.4，将培养液放在高压蒸汽灭菌锅中灭菌(121℃20min)。
步骤五、将上述灭菌的培养液静置室温后，按照1:3的比例将大肠杆菌接种在培养液中，将细菌培养液放置在摇床(37℃100rpm)中培养。
步骤六、当细菌培养液的OD600值为0.5时，加入10ml-30ml碳点溶液，过夜培养使碳点和细菌结合。
步骤七、将上述溶液离心(3000rmin-110min)，取沉淀加入到灭菌过的新鲜培养液中(0.5g酵母浸膏、1g-1.5g蛋白胨、1g-1.2g氯化钠、100ml去离子水、12.1mg半胱氨酸、葡萄糖、甲基紫精)在厌氧条件下放入摇床中过夜培养。
步骤八、将上述厌氧培养后的细菌离心(3000rmin-110min)后，放入厌氧反应器中，加入新的灭菌过的培养液中(0.5g酵母浸膏、1g-1.5g蛋白胨、1g-1.2g氯化钠、100ml去离子水、12.1mg半胱氨酸、葡萄糖、甲基紫精)。
步骤九、测量上述厌氧反应器中的氢气含量，从第0小时开始测试，每一个小时测试一次，一共测试3个小时。
采用下述试验验证发明效果：
1、光催化剂碳点(CDs)的制备及表征
从TEM图像看出，碳点是准球形的，平均直径为1.57纳米(图1)。据报道，颗粒大小是影响电子-空穴分离效率和纳米材料进入细菌的一个重要因素。半导体的尺寸越小，光生电荷迁移至表面的距离越短，越有利于光生电荷的输运。
XPS分析了碳点的元素组成和表面化学状态。结果表明，碳点的表面是由氧和碳组成的。C1SXPS谱图(图2a)显示三个成分，即C＝C/C-C、C-O/C＝O和O-C＝O的结合能分别为284.7eV、285.4eV和289.3eV。O1SXPS谱图(图2b)在530.0eV和534.8eV处有两个子峰，这可以归结为C＝O、O-C＝O和C-O。
通过X射线衍射图谱(XRD)研究了碳点的晶型结构，发现在22.40°有一个宽峰，对应于碳点的{10.0}面(图3)。
FTIR(图4)显示3355cm-1处的峰是-OH拉伸振动的峰，1579cm-1和1389cm-1处有两个比较强的特征吸收带，分别对应于-COO-的反对称拉伸振动和对称拉伸振动。
2、光催化剂-生物复合体系的构建
在20毫升的菌液中，分别加入6毫升、4毫升、2毫升、0毫升的碳点和0毫升、2毫升、4毫升、6毫升的水，以保持培养液的总体积相同。在不同时间取样测量OD600值，总取样时间为214h，菌液OD600随时间变化情况见(图5)。结果发现，在细菌培养液中加入不同量的碳点溶液并不影响细菌的生长。细菌在前200h处于生长状态，200h后停止生长，这是由于细菌代谢产物的积累和营养物质的消耗造成的。这种情况表明，细菌活性的长期保持归因于碳点具有良好的生物相容性。
3、复合系统产氢性能的研究
为了证明CDs-E.Coli复合系统的性能，在可见光(780nm>λ>420nm)照射下进行了产氢实验。在同样的光照强度下，E.Coli-CDs复合系统的产氢性能明显高于纯细菌培养物(图6)。CDs-E.Colis复合系统三个小时总产氢量能达到0.7mmol，比纯的大肠杆菌提高了75％，有效的提高了产氢效率。
以上结果表明，用于产氢的无机纳米材料-全细胞生物复合系统——CDs-E.Colis复合系统具有良好的产氢性能，该混合系统具有重要的理论意义和实用价值，随着材料化学和合成生物学的发展，该系统将为太阳能的开发利用提供新的途径。

Claims (5)

1.用于产氢的碳点-全细胞生物复合系统的制备方法，其特征在于制备和检测方法是按下述步骤进行的：
步骤一、配置100ml细菌培养液:0.5g酵母浸膏、1g-1.5g蛋白胨、1g-1.2g氯化钠、100ml去离子水，调节PH至7.3-7.4，将培养液放在高压蒸汽灭菌锅中灭菌(121℃20min)；
步骤二、将上述灭菌的培养液静置室温后，按照1:3的比例将大肠杆菌接种在培养液中，将细菌培养液放置在摇床(37℃100rpm)中培养；
步骤三、当细菌培养液的OD600值为0.5时，加入10ml-30ml碳点(CDs)，过夜培养使碳点和细菌结合；
步骤四、将上述溶液离心，取沉淀加入到灭菌过的新鲜培养液中(0.5g酵母浸膏、1g-1.5g蛋白胨、1g-1.2g氯化钠、100ml去离子水、12.1mg半胱氨酸、葡萄糖、甲基紫精)在厌氧条件下放入摇床中过夜培养；
步骤五、将上述厌氧培养后的细菌离心后，放入厌氧反应器中，加入新的灭菌过的培养液中(0.5g酵母浸膏、1g-1.5g蛋白胨、1g-1.2g氯化钠、100ml去离子水、12.1mg半胱氨酸、葡萄糖、甲基紫精)；
步骤六、测量上述厌氧反应器中的氢气含量，从第0小时开始测试，每一个小时测试一次，一共测试3个小时。
2.根据权利要求1所述的用于产氢的碳点-全细胞生物复合系统的制备方法，其特征在于步骤三中细菌培养液的OD600值为0.5。
3.根据权利要求1所述的用于产氢的碳点-全细胞生物复合系统的制备方法，其特征在于步骤四中给细菌换了新鲜培养液并将细菌转移到厌氧瓶中厌氧培养，为下一步厌氧条件下产氢做准备。
4.根据权利要求1所述的用于产氢的碳点-全细胞生物复合系统的制备方法，其特征在于步骤五中在普通培养液中加入了半胱氨酸、葡萄糖、甲基紫精来给细菌提供能量和促进电子转移。
5.根据权利要求1所述的用于产氢的碳点-全细胞生物复合系统的制备方法，其特征在于步骤六中探究了碳点-全细胞生物复合系统的产氢量，该体系三个小时总产氢量能达到0.7mmol，比纯大肠杆菌体系的产氢量提高了75％，有效的提高了产氢效率。
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