WO2021221287A1 - 세포사멸 유도용 기체 전구체를 담지한 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

세포사멸 유도용 기체 전구체를 담지한 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2021221287A1
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nanobubbles
acid
cells
present
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박재형
엄우람
고혜원
송예리
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성균관대학교산학협력단
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    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Definitions

  • the present invention relates to nanoparticles containing a gas precursor for inducing cancer cell death and a composition for preventing or treating cancer based thereon, and to an ultrasound-mediated pharmaceutical composition capable of inducing physical apoptosis of cancer cells.
  • Necroptosis is a programmed form of necrosis or inflammatory apoptosis mechanism. have. Necroptosis causes rupture of cell membranes, and is characterized by a stronger immune response than immunogenic apoptosis induced through conventional chemotherapy or recently emerging photodynamic therapy. There is this. Since this does not involve proteolysis or oxidation in cells, damage-associated molecular pattern (DAMP) and tumor antigens, which lose immunogenicity in the above process, are leaked back to their original state with immunogenicity, effectively promoting an anticancer immune response. due to what can be induced. Due to the above characteristics, it was expected that necroptosis could maximize the therapeutic efficacy by amplifying the responsiveness to the existing anticancer treatment.
  • DAMP damage-associated molecular pattern
  • necroptosis-inducing agents such as TRAIL Tumor necrosis factor-based cytokines, including zVAD, pan-caspase inhibitors, and MLKL interfering RNA have been developed, but their efficacy is limited.
  • necroptosis of vascular cells can promote tumor metastasis, and necroptosis of T lymphocytes has a side effect of inhibiting immune activity of surrounding T lymphocytes. Therefore, the current anticancer treatment through necroptosis has limited clinical use, so it is necessary to develop a necroptosis-inducing agent that selectively acts on cancer cells and does not depend on the expression level of RIPK3/MLKL.
  • the present inventors developed nanoparticles containing gas precursors capable of inducing cancer cell-specific necroptosis-like apoptosis independent of RIPK3 and MLKL proteins, and confirmed the ultrasound-mediated anticancer effect using the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a nanoparticle comprising a biocompatible polysaccharide polymer material and a hydrophobic low molecular material conjugated to the polymer material; and a gas precursor supported on the nanoparticles and vaporized in response to ultrasonic waves, to provide nanobubbles.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the nanobubbles according to the present invention as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the nanobubbles and an immune checkpoint inhibitor according to the present invention as active ingredients.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the nanobubbles according to the present invention and a DPP4 inhibitor (dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i) as active ingredients.
  • a DPP4 inhibitor dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of cancer, comprising the nanobubbles according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides nanoparticles comprising a biocompatible polysaccharide polymer material and a hydrophobic low molecular material conjugated to the polymer material; and a gas precursor supported on the nanoparticles and vaporized in response to ultrasonic waves, to provide a nanobubble.
  • the nanobubbles may be those in which polyethylene glycol [poly(ethylene glycol)] is further bound to the polymer material, but is not limited thereto.
  • the polymer material is carboxymethyl dextran, chitosan, gelatin, collagen, mannan, dextran sulfate, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, hyaluronic acid, alginate, glycogen, amylose, beta-glucan, hydroxy It may be selected from the group consisting of ethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, fucoidan, chondroitin, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the low molecular weight material may be selected from the group consisting of a sound sensitizer, a photosensitizer, a bile acid derivative, and a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the sound sensitizer or the photosensitizer may release reactive oxygen species during sensitization.
  • the sound sensitizer is chlorine (chlorin) e6, benzochlorin (benzochlorin), methylene blue (methylene blue), toluidine blue (toluidine blue), Rose Bengal (Rose Bengal), photoprin (Photofrin), phthalocyanine, napthalocyanine, indocyanine green, BODIPY (boron-dipyrromethene), pheophorbide A, verdin, hematoporphyrin ( It may be selected from the group consisting of hematoporphyrin), protoporphyrin, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the photosensitizer is chlorine e6, photoditazine, radachlorin (Radachlorin), 2-(1-hexylethyl)-2-divinylpyropeophorbead- ⁇ (HPPH) From the group consisting of [2-(1-hexylethyl)-2-devinylpyropheophorbide- ⁇ (HPPH)], phthalocyanine (ZnPc, Zinc Phthalocyanine), Pheophorbide a compound, porphyrins compound, and combinations thereof It may be selected, but is not limited thereto.
  • the nanobubbles may induce activation of eosinophils and natural killer cells (NK cells) by ultrasonication.
  • the bile acid derivative is an amino acid 5 ⁇ -cholanic acid, 5 ⁇ -cholanic acid, cholic acid, and deoxycholic acid.
  • acid chenodeoxycholic acid, lithocholic acid, ursocholic acid, ursodeoxycholic acid, isoursodeoxycholic acid, ragodoxy lagodeoxycholic acid, glycocholic acid, glycodeoxycholic acid, glycochenodeoxycholic acid, dehydrocholic acid, hyocholic acid, hyodioxy It may be selected from the group consisting of cholic acid (hyodeoxycholic acid) and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the amination 5 ⁇ -cholanic acid may be selected from the group consisting of the following (i) to (iv) and combinations thereof:
  • the gas precursor may be a perfluorocarbon series, but is not limited thereto.
  • the perfluorocarbon is perfluoropentane (PFP), perfluoro (2-methylpentane), perfluorohexane (PFH), perfluoromethylcyclohexane (perfluoromethylcyclohexane: PFmH) and may be selected from the group consisting of combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the nanobubbles may induce necroptosis-like apoptosis in a tumor by ultrasound irradiation.
  • the necroptosis may be RIPK3 (receptor-interacting protein kinase 3) or MLKL (mixed lineage kinase domain-like protein) independent, but is not limited thereto.
  • the nanobubbles may induce the outflow of damage-associated molecular pattern (DAMP) from tumor cells by ultrasonic irradiation, but is not limited thereto.
  • DAMP damage-associated molecular pattern
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the nanobubbles according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for ultrasound immunotherapy, comprising the nanobubbles according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering the nanobubbles according to the present invention to a subject.
  • the present invention provides the use of the nanobubbles according to the present invention for the prevention, improvement or treatment of cancer.
  • the present invention provides a use for producing a medicament used for cancer of the nanobubbles according to the present invention.
  • the cancer is lung cancer, gastric cancer, glioma, liver cancer, melanoma, kidney cancer, urothelial cancer, head and neck cancer, Merkel-cell carcinoma, prostate cancer, blood cancer, breast cancer, It may be a cancer selected from the group consisting of colorectal cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, brain cancer, ovarian cancer, bladder cancer, bronchial cancer, skin cancer, cervical cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, bone cancer, and combinations thereof, but is limited thereto no.
  • the pharmaceutical composition may further include an immune checkpoint inhibitor as an active ingredient, but is not limited thereto.
  • the immune checkpoint inhibitor may be an antibody that specifically binds to one or more proteins selected from the group consisting of CTLA-4, PD-1 and PD-L1, but is not limited thereto. .
  • the composition may further include a DPP4 inhibitor (dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i) as an active ingredient, but is not limited thereto.
  • a DPP4 inhibitor dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i
  • the DPP4 inhibitor may be an inhibitor of DPP4 protein activity, but is not limited thereto.
  • the DPP4 protein activity inhibitor is an antibody against DPP-4, sitagliptin, vildagliptin, saxagliptin, linagliptin ), dutogliptin, gemigliptin, alogliptin, anagliptin, evogliptin, berberine, diprotin and lupiol (Lupeol) may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of cancer, comprising the nanobubbles according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for inhibiting metastasis of cancer, comprising administering the nanobubbles according to the present invention to a subject.
  • the present invention provides the use of the nanobubbles according to the present invention for preventing or inhibiting metastasis of cancer.
  • Nanoparticles carrying gas precursors according to the present invention i.e., nanobubble (NB or cNB)
  • NB or cNB nanobubble
  • it since it can induce stronger immunogenicity than immunogenic cell death using conventional anticancer treatment, it is expected to be widely applied to anticancer combination treatment technology using the same.
  • FIGS. 1A to 1C are diagrams illustrating nanoparticles (NB or cNB) carrying two types of gas precursors and an ultrasound-mediated anticancer treatment method using the same:
  • FIG. 1A Ultrasound (US) irradiation includes a sonar sensitizer Schematic diagram showing that the formed nanobubbles generate reactive oxygen species and induce a cavitation effect;
  • FIG. 1B Schematic diagram showing that necroptosis induced by nanobubbles induces the release of intact DAMP, and that effective in situ cancer vaccination is achieved;
  • FIG. 1c Schematic diagram showing a method for inducing ultrasound-mediated apoptosis using nanoparticles (cNP) and nanobubbles (cNB) that do not contain a sonar sensitizer.
  • Figures 2a to 2e are diagrams showing the synthesis route of the amphiphilic polymer-based self-assembly for the production of two types of nanobubbles (NB or cNB) and the chemical structure analysis results thereof: (Figure 2a) PEG-CMD-Ce6 synthetic route; (Fig. 2b) 1 H-NMR spectrum of PEG-CMD; (Fig. 2c) 1 H-NMR spectrum of PEG-CMD-Ce6; ( FIG. 2D ) Synthetic pathway of CMD-CA; (FIG. 2e) 1 H-NMR spectrum of CMD-CA.
  • FIG. 3a to 3j are diagrams showing the results of analysis of physicochemical properties, intracellular uptake and cytotoxicity of two types of nanoparticles (NP or cNP) and nanobubbles (NB or cNB):
  • FIG. 3a NP and transmission electron microscopy images of NBs;
  • Fig. 3b size distribution of NPs and NBs;
  • Fig. 3c Confocal microscopy images of CT26 cells treated with Ce6, nanoparticles (NP) and nanobubbles (NB) (scale bar, 10 ⁇ m);
  • FIG. 3g Transmission electron microscopy images of cNP and cNB;
  • FIG. 3h size distribution of cNPs and cNBs;
  • FIG. 3i confocal microscopy images of CT26 cells treated with nanoparticles (cNP) and nanobubbles (cNB) without sonosensitizer;
  • FIGS. 4a to 4i are diagrams showing the evaluation results of necroptosis-like apoptosis inducing ability and dendritic cell maturity of two types of nanobubbles (NB, FIGS. 4a to 4e; cNB, FIGS. 4f to 4i):
  • Fig. 4a and Fig. 4b Confocal microscopy images of cells stained with Annexin V/PI in RIPK-3 deficient CT26 cells (Fig. 4a), MLKL knockdown CT26 cells and HT29 cells (Fig. 4b) (scale bar, 50 ⁇ m) ;
  • Fig. 4c Western blot analysis of caspase-3 and HMGB1 in cells;
  • FIG. 4d Western blot analysis results of HMGB1 released into the conditioned medium
  • FIG. 4F and FIG. 4G Confocal microscopy images of cells stained with Annexin V/PI in RIPK-3 deficient CT26 cells (FIG. 4F), MLKL knockdown CT26 cells (FIG. 4G)
  • FIG. 4h Western blot analysis results of HMGB1 and HSP70 released from the conditioned medium
  • FIG. 4i Western blot analysis results of HMGN1, GSDME, and IL-33 released from the conditioned medium.
  • Figures 5a and 5b are diagrams showing that nanobubbles (NB) are targeted and accumulated in tumors when intravenously administered to CT26 tumor-bearing mice:
  • Figure 5a Whole body images of fluorescence in vivo (top) and fluorescence intensity over time of quantitative graph (bottom);
  • FIG. 5B In vitro fluorescence images of liver, lung, spleen, kidney, heart and tumor at 24 hours after administration (top) and quantitative graphs of in vitro fluorescence intensity of each organ (bottom).
  • FIG. 6a to 6d are diagrams showing the anticancer efficacy of nanobubbles (NB):
  • FIG. 6a a schematic diagram of a treatment protocol;
  • FIG. 6B a graph showing the mean tumor volume over time;
  • CR complete regression of tumor);
  • FIG. 6D A photograph of an individual dissected tumor of each experimental group (top) and a graph comparing the weight of the tumor (bottom; error bars are standard deviation, ** p ⁇ 0.01).
  • FIG. 7a to 7h are diagrams showing the ability of nanobubbles (NB) to inhibit metastatic lung cancer:
  • FIG. 7a a schematic diagram of a treatment protocol;
  • FIG. 7B graph showing mean tumor volume over time (error bars are standard deviation, ** p ⁇ 0.01);
  • FIG. 7c photographs of dissected individual tumors in each experimental group;
  • FIG. 7e Immunohistochemical staining images of CTLs infiltrated from primary tumor tissues (blue, nucleus; green, CD8 + CTL; scale bar, 100 ⁇ m);
  • FIG. 7a a schematic diagram of a treatment protocol
  • FIG. 7B graph showing mean tumor volume over time (error bars are standard deviation, ** p ⁇ 0.01)
  • FIG. 7c photographs of dissected individual tumors in each experimental group
  • FIG. 7d profile of change in individual tumor volume
  • FIG. 7F H&E stained lung tissue (scale bar, 200 ⁇ m; arrows indicate metastatic nodules in the lung);
  • FIG. 7G Representative photographs of lung tissue stained with India ink (red arrows indicate metastatic nodules in the lungs);
  • Fig. 7h H&E stained spleen tissue (scale bar, 200 ⁇ m).
  • FIGS. 8A to 8E are diagrams showing the anticancer efficacy of nanobubbles (cNB) without a sonosensitizer:
  • FIG. 8A schematic diagram of a treatment protocol;
  • FIG. 8B a graph showing the mean tumor volume over time;
  • FIG. 8c a graph comparing the weights of dissected tumors and spleens of each experimental group;
  • FIG. 8D Immunohistochemical staining images of mature dendritic cells of tumor tissue (blue, nuclei; green, CD80 + dendritic cells);
  • FIG. 8e Mature NK cells (blue, nuclei; green, CD49b + NK cells) of tumor tissue.
  • the present invention relates to nanobubbles that generate gas upon ultrasonic irradiation by supporting a gas precursor in the hydrophobic center of nanoparticles.
  • polyethylene glycol poly(ehtylene glycol)] was conjugated to the main chain of carboxymethyl dextran having excellent biocompatibility and modified to have a long circulation time in the body, and the sound sensitizer chlorine e6 ( chlorin e6; Ce6) was chemically conjugated to the polymer backbone to prepare nanobubbles (PEG-CMD-Ce6) of an amphiphilic polymer.
  • the amphiphilic polymer PEG-CMD-Ce6 prepared as described above forms a self-assembly in an aqueous solution
  • nanobubble (NB) was prepared by encapsulating a gas precursor in the hydrophobic center through hydrophobic interaction with Ce6.
  • the nanobubbles are vaporized and expanded in the cell by a cavitation effect in response to ultrasonic irradiation (refer to the schematic diagram of FIG. 1A ). Accordingly, rupture of the cell membrane is induced, so that necroptosis-like apoptosis and leakage of DAMP are possible.
  • ROS reactive oxygen species
  • nanobubbles of an amphiphilic polymer that does not contain a sonic sensitizer by chemically conjugating a 5 ⁇ -cholanic acid derivative having an amine group to the carboxymethyl dextran main chain, which has excellent biocompatibility. (CMD-CA) was prepared.
  • sonic sensitizer-free nanobubbles were prepared.
  • the NB contains the sonar sensitizer Ce6 and has both a synergistic effect and a therapeutic effect by reactive oxygen species upon ultrasonic irradiation, whereas cNB introduces a bile acid derivative, a hydrophobic chemical that is not sensitive to ultrasonic waves, to reactive oxygen species.
  • cNB introduces a bile acid derivative, a hydrophobic chemical that is not sensitive to ultrasonic waves, to reactive oxygen species.
  • the two types of nanobubbles for inducing apoptosis can kill various types of cancer cells, and further enable combination treatment with various anticancer immunotherapeutic agents.
  • the present invention relates to a nanoparticle comprising a biocompatible polysaccharide polymer material and a hydrophobic low molecular material conjugated to the polymer material; and a gas precursor supported on the nanoparticles and vaporized in response to ultrasonic waves, it is possible to provide nanobubbles.
  • the nanobubbles may be polyethylene glycol [poly(ethylene glycol)] further bound to the polymer material, but is not limited thereto.
  • the “polyethylene glycol [poly(ethylene glycol); PEG]” is a polymer material introduced to improve the retention time in the blood by increasing the hydrophilicity of the nanobubble surface and preventing rapid decomposition due to immune function in the human body. This modification with polyethylene glycol is called pegylation, and through this, it is possible to prepare polymer nanobubbles with reduced liver accumulation and increased blood residence time.
  • the hydrophilicity of the particles is increased, and the recognition from immune function, including macrophages in the human body that engulfs and digests pathogens, wastes, and externally introduced substances, is prevented. It is possible to prevent decomposition in the body through the so-called stealth effect, and increase the residence time of the nanobubbles in the blood.
  • the polyethylene glycol used preferably has a molecular weight between 100 and 150,000, and may have various structures such as linear or branched types.
  • biocompatibility refers to a thing that combines a desired function and safety to a living body in a broad sense, and in a narrow sense it means a biological safety to a living body, that is, non-toxic and sterilizable. Therefore, in the present invention, the term “biocompatible material” can be said to be a material that exhibits a desired function in a living body, has no toxicity of the material itself, and can be sterilized.
  • polysaccharide refers to a large molecule in which three or more monosaccharides form a continuous chain through glycosidic bonds.
  • the polysaccharide of the present invention also includes an oligosaccharide in which a small amount of monosaccharide is condensed. Since polysaccharides have highly reactive hydroxyl groups, amino groups, and carboxylic acid groups in their structure, they can be easily reacted with other compounds to produce derivatives. It is not particularly limited.
  • biocompatible polysaccharide polymer material carboxymethyl dextran, chitosan, gelatin, collagen, mannan, dextran Sulfate (dextran Sulfate), ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, hyaluronic acid, alginic acid, glycogen, amylose, beta-glucan ( ⁇ ) -glucan), hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, fucoidan, chondroitin, and the like, and a person skilled in the art can select an appropriate compound according to the purpose.
  • the low-molecular substance may be selected from the group consisting of a sonosensitizer, a photosensitizer, a bile acid derivative, and a combination thereof, and the sonosensitizer or the photosensitizer may generate active oxygen species during sensitization. It can be released, but is not limited thereto.
  • the term “sonosensitizer” refers to absorbing vibrational energy when exposed to a suitable frequency, and then generating reactive oxygen species (ROS) to damage or destroy cells. means inclusive of substances.
  • ROS reactive oxygen species
  • the nanobubbles of the present invention are selectively accumulated in the tumor tissue and activated in response to ultrasound, they combine with oxygen to generate reactive oxygen species that are highly chemically reactive, and can directly damage cancer cells, It not only gives an indirect effect of killing cancer cells by preventing the supply of nutrients to the cancer tissue by damaging the microvessels around the tumor, but also causes apoptosis or apoptosis as a secondary reaction according to oxidative stress. By inducing an immunological response, it can activate the immune system to attack cancerous tissue, thereby necrosis of tumor tissue cells.
  • Acoustic sensitizers that can be used in the nanobubbles of the present invention include chlorine e6, benzochlorin, methylene blue, toluidine blue, Rose Bengal, and Photofrin. ), phthalocyanine, napthalocyanine, indocyanine green, BODIPY (boron-dipyrromethene), pheophorbide A, verdin, hematoporphyrin , protoporphyrin, and the like, and a person skilled in the art can select an appropriate compound according to the purpose.
  • the term "photosensitizer” is, after excitation (excitation) when irradiated with light of a specific wavelength, generates a fluorescence signal, or reacts with a surrounding substrate or oxygen to generate reactive oxygen species,
  • the activated reactive oxygen species has the effect of self-destruction or necrosis of surrounding tumor cells.
  • Photosensitizers that can be used in the nanobubbles of the present invention include chlorine e6, photoditazine, Radachlorin, 2-(1-hexylethyl)-2-divinylpyropeophorbead- ⁇ (HPPH) [2 -(1-hexylethyl)-2-devinylpyropheophorbide- ⁇ (HPPH)], phthalocyanine (ZnPc, Zinc Phthalocyanine), Pheophorbide a (Pheophorbide a) compound, porphyrins compound, etc. compounds can be selected.
  • the nanobubbles of the present invention can be induced to activate eosinophils and natural killer cells (NK cells) by ultrasonic treatment.
  • NK cells natural killer cells
  • bile acid derivative refers to a compound having a common core four-membered ring structure, and as a bile acid derivative that can be used in the nanobubbles of the present invention, amination 5 ⁇ -cholanic acid ( aminated 5 ⁇ -cholanic acid, 5 ⁇ -cholanic acid, cholic acid, deoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, lithocholic acid, uric acid ursocholic acid, ursodeoxycholic acid, isoursodeoxycholic acid, lagodeoxycholic acid, glycocholic acid, glycodeoxycholic acid , glycochenodeoxycholic acid, dehydrocholic acid, hyocholic acid, hyodeoxycholic acid, and the like, and a person skilled in the art can select an appropriate compound according to the purpose.
  • the amination 5 ⁇ -cholanic acid may be selected from the group consisting of the following (i) to (iv) and combinations thereof:
  • the gas precursor may be a perfluorocarbon series, for example, perfluoropentane (PFP), perfluoromethylpentane (perfluoro(2-methylpentane)), perfluorohexane (PFH), Perfluoromethylcyclohexane (PFmH) may be used, but is not limited thereto.
  • PFP perfluoropentane
  • PFH perfluorohexane
  • PFmH Perfluoromethylcyclohexane
  • the nanobubbles may induce necroptosis-like apoptosis in a tumor by ultrasound irradiation, and the necroptosis is RIPK3 (receptor-interacting protein kinase 3) or MLKL ( mixed lineage kinase domain-like protein) may be independent.
  • the RIPK3 is known to be a major regulator of the apoptosis mode by necroptosis, and it recruits the executive MLKL to signal necroptosis, which is terminated by rupture of the cytoplasmic membrane and leakage of cell contents from apoptotic cells. phosphorylates Experimental data to date have indicated that RIPK3 and MLKL are essential mechanisms for all necroptotic apoptosis responses.
  • the nanobubbles may induce leakage of damage-associated molecular pattern (DAMP) from tumor cells by ultrasonic irradiation.
  • DAMP damage-associated molecular pattern
  • the nanobubbles may be targeted to a tumor.
  • the two types of nanobubbles (NB or cNB) according to the present invention themselves do not have toxicity to cells, and when irradiated with ultrasound, acoustic cavitation causing necroptosis (acoustic cavitation) ) was confirmed to improve cytotoxicity (see Example 3).
  • necroptosis occurred by cavitation by ultrasound irrespective of reactive oxygen species even in the case of cNB that does not contain a sonosensitizer (see Example 4).
  • apoptosis occurs by a mechanism similar to necroptosis, not apoptosis, and immunogenicity is preserved (damage-associated molecular pattern (DAMP))
  • DAMP damage-associated molecular pattern
  • nanobubbles (NB) according to the present invention were selectively accumulated in the tumor compared to other tissues (see Example 6).
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the nanobubbles according to the present invention as an active ingredient in another aspect.
  • the pharmaceutical composition includes a composition for ultrasound immunotherapy.
  • the present invention may provide a method for preventing or treating cancer, comprising administering the nanobubbles according to the present invention to an individual.
  • the present invention may provide the use of the nanobubbles according to the present invention for the prevention, improvement or treatment of cancer.
  • the present invention may provide a use for producing a medicament for use in cancer of the nanobubbles according to the present invention.
  • composition may further include an immune checkpoint inhibitor as an active ingredient.
  • the composition may further include a DPP4 inhibitor (dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i) as an active ingredient.
  • DPP4 inhibitor dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i
  • the composition may be administered simultaneously (simultaneous), separately (separate) or sequentially (sequential) with the immune checkpoint inhibitor or DPP4 inhibitor, and may be administered single or multiple.
  • nanobubble (NB) in addition to the excellent anticancer effect of nanobubble (NB) in an animal model of cancer, complete remission was observed in 40% of subjects when combined with an immune checkpoint inhibitor, confirming that the anticancer effect was maximized.
  • nanobubbles (cNB) that do not contain a sonic sensitizer also showed excellent anticancer effects, and it was confirmed that the anticancer effect was further maximized when treated with sitagliptin, a DPP4 inhibitor ( see Example 7).
  • prevention refers to any action that inhibits or delays cancer by administering the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which cancer is improved or changed beneficially by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention, and an attempt to obtain useful or desirable results including clinical results.
  • a useful or desirable clinical outcome even if detectable or undetectable, may result in alleviation or amelioration of one or more symptoms or conditions, narrowing the scope of the disease, stabilizing the disease state, inhibiting the occurrence of the disease, inhibiting the spread of the disease, delaying or slowing the progression of the disease. , delay or delay onset of disease, amelioration or alleviation of disease state, and decrease (in part or all).
  • treatment may mean prolonging the survival of a patient beyond that predicted in the absence of treatment.
  • treatment may mean inhibiting disease progression, temporarily slowing the disease progression, and may refer to stopping the disease progression permanently.
  • the term “immune checkpoint inhibitor” refers to an immune checkpoint protein involved in T cell suppression when some cancer cells avoid immunity while utilizing the immune checkpoint of T cells, which are immune cells in the body. ), activates T cells and attacks cancer cells.
  • PD-L1 Programmed death-ligand 1
  • LAG-3 Lymphocyte-activation gene 3
  • TIM-3 T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3) inhibitor
  • TIGIT T cell immunoreceptor with Ig
  • ITIM domains T cell immunoreceptor with Ig
  • VISTA V-domain Ig suppressor of T cell activation
  • the immune checkpoint inhibitor may be an antibody that specifically binds to one or more proteins selected from the group consisting of CTLA-4, PD-1 and PD-L1, but is not limited thereto.
  • DPP4 inhibitor dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i
  • DPP4i dipeptidyl peptidase 4 inhibitor
  • the DPP4 inhibitor may be an inhibitor of DPP4 protein activity, and more specifically, an antibody against DPP-4, sitagliptin, vildagliptin, saxagliptin, lina linagliptin, dutogliptin, gemigliptin, alogliptin, anagliptin, evogliptin, berberine, diprotin ) and lupiol (Lupeol) may be at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the cancer may be deficient in RIPK3 or MLKL protein or down-regulated expression of the protein, but is not limited thereto.
  • the cancer is lung cancer, gastric cancer, glioma, liver cancer, melanoma, kidney cancer, urothelial cancer, head and neck cancer, Merkel-cell carcinoma, prostate cancer, blood cancer, breast cancer, colorectal cancer, colon cancer , rectal cancer, pancreatic cancer, brain cancer, ovarian cancer, bladder cancer, bronchial cancer, skin cancer, cervical cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, bone cancer, and may be a cancer selected from the group consisting of a combination thereof, but the nanobubbles according to the present invention are cancer Since it is based on the principle of exerting an anticancer effect by inducing necroptosis in cells, the pharmaceutical composition according to the present invention can exert an effect on all types of cancer regardless of the type of cancer.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include an appropriate carrier, excipient and/or diluent commonly used to prepare a pharmaceutical composition in addition to the active ingredient.
  • an appropriate carrier excipient and/or diluent commonly used to prepare a pharmaceutical composition in addition to the active ingredient.
  • it can be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injection solutions.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose , microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, and a surfactant usually used.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, and drug activity of the patient. , sensitivity to drug, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on the patient's age, sex, condition, weight, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate and excretion rate, disease type, and drugs used in combination.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to an individual by various routes.
  • it may be administered by oral administration, intranasal administration, transbronchial administration, arterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection or intraperitoneal injection.
  • the daily dosage may be administered once or divided into several times a day.
  • the composition may be in the form of an intravenous or intraperitoneal injection, but is not limited thereto.
  • the present invention may provide a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of cancer, comprising the nanobubbles according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention may provide a method for inhibiting metastasis of cancer, comprising administering the nanobubbles according to the present invention to an individual.
  • the present invention may provide the use of the nanobubbles according to the present invention for preventing or inhibiting metastasis of cancer.
  • metastasis refers to a condition in which a malignant tumor has spread to other tissues away from the diseased organ. As a malignant tumor that starts in one organ progresses, it spreads from the primary site, the organ, to other tissues. Metastasis can be said to be a phenomenon accompanying the progression of malignant tumors, and metastases can occur while malignant tumor cells proliferate and acquire new genetic traits as the cancer progresses. When tumor cells that have acquired new genetic traits invade into blood vessels and lymph glands, circulate through blood and lymph, and settle and proliferate in other tissues, metastasis can occur.
  • composition according to the present invention can prevent and treat the spread of cancer by inhibiting metastasis.
  • the term “inhibition” refers to any action of inhibiting the cancer metastasis by administering the composition according to the present invention.
  • Chlorine e6 (Ce6) and perfluoropentane (PFP) were purchased from Frontier Scientific Inc. (USA) and Apollo Scientific (UK), respectively.
  • RPMI1640 medium, fetal bovine serum (FBS) and penicillin-streptomycin solution were obtained from Gibco (USA).
  • Alexa FluorTM 488 Annexin V/propidium iodide apoptosis kit (Dead Cell Apoptosis Kit) and HRP-conjugated anti-rabbit IgG were purchased from Invitrogen (USA).
  • Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-4 (IL-4) were purchased from PeproTech (USA).
  • FITC anti-mouse CD86 antibody was obtained from Biolegend (USA).
  • NPs and NBs were dissolved in deionized water containing 1% DMSO, 10 ⁇ M RNO and 1.2 mM L-histidine, and this solution (1 ml) was loaded into a homemade agarose mold and sonicated for 300 s. irradiated (power: 30 W, impact coefficient: 20%, pulse repetition frequency: 1 Hz, Y interval: 1 mm).
  • the absorbance of RNO in each sample (n 5) was measured at 405 nm using a UV-vis spectrometer (Agilent 8453 UV-visible Spectroscopy System, Agilent Technology, USA).
  • CT26 Mouse colorectal cancer cell line
  • HT29 human colorectal cancer cell line
  • FBS fetal bovine serum
  • Gibco 1% antibiotic-antifungal
  • CT26 cells were seeded in a glass-bottomed 35-pi cell culture dish, and cultured for 36 hours.
  • Cells were washed with PBS and incubated with Ce6, nanoparticles (NP) and nanobubbles (NB; 100 ⁇ M of Ce6) in serum-free RPMI medium in the dark for 6 hours.
  • NP nanoparticles
  • NB nanobubbles
  • cNBs nanobubbles
  • 1 ⁇ 10 5 CT26 cells were seeded in a glass-bottomed 35-pi cell culture dish, and cultured for 36 hours.
  • Cells were washed with PBS and incubated with cNP and cNB at a concentration of 0.1 mg/mL in serum-free RPMI medium for 6 hours. Thereafter, the cells were washed twice with PBS, fixed with a 2% paraformaldehyde solution, and then stained with DAPI for 10 minutes.
  • NP nanoparticles
  • NB nanobubbles
  • Cytotoxicity was measured after sonication with NP and NB.
  • 2 ⁇ 10 6 CT26 cells were cultured in a 100-pi cell culture dish for 36 hours, and further cells were incubated with Ce6, NP and NB (10 ⁇ M Ce6) for 6 hours and washed twice with PBS.
  • Cells were trypsinized and resuspended in 500 ⁇ l of RPMI1640 medium containing 10% FBS. 200 ⁇ l of the cell suspension was loaded onto an agarose gel and then exposed to ultrasound for 300 s (power: 30 W, impact modulus: 20%, pulse repetition frequency: 1 Hz, Y interval: 1 mm). Then, incubated in 48-well plates for an additional 24 hours, cells were incubated with medium containing 10% CCK-8 solution for 30 minutes, and absorbance was measured at 450 nm with a microplate reader (VERSAmaxTM). did.
  • Cells were further incubated for 1 hour and stained with Alexa FluorTM 488 Annexin V and propidium iodide (PI) for 10 minutes. Then, 200 ⁇ l of the cell suspension was placed in a glass-bottomed 35-pi cell culture dish, which was washed with PBS after 5 minutes and immediately analyzed using a confocal laser scanning microscope (Leica TCS SP8; Leica Microsystems, Germany). did.
  • Alexa FluorTM 488-Annexin V green
  • ⁇ Ex 488 nm
  • ⁇ Em 500-550 nm
  • Propidium iodide red
  • ⁇ Ex 514 nm
  • ⁇ Em 590-650 nm.
  • MLKL mixed lineage kinase domain-like protein
  • CT26 and HT29 cells were treated with 30 nM anti-MLKL siRNA (Bioneer, Korea) using lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, USA) for 48 hours. transfected. Expression of RIPK3 and MLKL in cells was assessed by Western blotting.
  • Anti-RIPK3 antibody (1: 500) and anti-MLKL antibody (1: 500) were treated as a primary antibody, and HPR-conjugated anti-rabbit IgG (1: 1000) was used as a secondary antibody.
  • the harvested supernatant was concentrated twice according to the manufacturer's instructions using a desalting column (Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit-3K, Merck KGaA, Germany). Proteins were separated by electrophoresis using SDS-PAGE gels (12% for GAPDH and HMGB1 in conditioned medium, 16% for caspase-3, HMGB1 from the cell pellet).
  • Anti-caspase-3 antibody (1:1000 and 1:500, 9662S and 9661, Cell Signaling, USA), anti-HMGB1 antibody (1:660, ab79823, Abcam, UK) and anti-GAPDH antibody as primary antibody (1 : 1000, sc-32233, Santa Cruz Biotechnology, USA).
  • HRP-conjugated anti-rabbit IgG (1: 1000, Invitrogen, USA) was used.
  • the blotted film was analyzed using a real-time optical imaging system (LAS-3000; Fuji Photo Film, Japan).
  • the experiment using nano-bubbles (cNB) that does not contain a sonic sensitizer was conducted in the same manner as above, except that the exposure time of ultrasound for cell and animal experiments was set to 300 seconds, but the exposure conditions were changed (power: 10 W, shock Count: 20%, pulse repetition frequency: 1 Hz, Y interval: 1 mm), and the treatment concentration of doxorubicin was 1 ⁇ M.
  • anti-IL-33 antibody (1: 500) anti-GSDME (DFNA5) antibody (1: 100) processed.
  • HRP-conjugated anti-rat IgG (1: 1000, invitrogen, USA) was treated.
  • Bone marrow was obtained from 8-week-old BALB/c mice.
  • Bone marrow-derived dendritic cells are RPMI containing GM-CSF (20 ng/mL), IL-4 (20 ng/mL), 2-mercaptoethanol (50 ⁇ M) and 10% (v/v) FBS. It was prepared by culturing cells in bone marrow in 1640 medium for one week. 1 ⁇ 10 7 CT26 cells were treated with nanoparticles (NP) or nanobubbles (NB; 10 ⁇ M of Ce6) and then irradiated with ultrasound for 300 seconds (power: 30 W, impact coefficient: 20%, pulse repetition frequency) : 1 Hz, Y interval: 1 mm).
  • NP nanoparticles
  • NB nanobubbles
  • BMDCs were stained with FITC-conjugated anti-CD86 antibody for 1 hour and analyzed using a flow cytometer (Guava EasyCyte, Merck Millipore, USA).
  • NB nanobubbles
  • IVIS Lumina K PerkinElmer Inc., USA
  • ⁇ Ex 660 nm
  • ⁇ Em 710 nm
  • a CT26 tumor-bearing model using 4-week-old BALB/c mice was prepared by subcutaneous injection of a CT26 cell suspension (100 ⁇ L) containing 1 ⁇ 10 6 cells in the flank of the mouse. Tumors were grown to a volume of approximately 60-70 mm 3 for 8 days and classified into 9 groups according to the purpose of the experiment: i) saline, ii) US (ultrasound), iii) aPD-L1, iv) NP ( nanoparticles), v) NP + US, vi) NP + US + aPD-L1, vii) NB (nanobubbles), viii) NB + US, ix) NB + US + aPD-L1.
  • NP and NB were administered at a dose of 3 mg Ce6/kg on days 8, 11 and 14, respectively.
  • the tumor was irradiated with ultrasound (time: 600 sec, power: 10 W, shock coefficient: 20%, pulse repetition frequency: 1 Hz, Y interval: 1 mm), and after an additional day, per mouse 100 ⁇ g of aPD-L1 antibody was injected.
  • Tumor volume was calculated as maximum diameter ⁇ minimum diameter 2 ⁇ 0.5.
  • Complete inhibition of tumor growth (CIG) was defined as tumor burdens smaller than the initial point.
  • the tumor was irradiated with ultrasound 6 hours after administration (time: 100 sec, power: 10 W, impact coefficient: 20%, pulse repetition frequency: 1 Hz, Y interval: 2 mm).
  • the anti-CD170 antibody was administered at a dose of 10 ⁇ g on the 7th and 14th days, respectively.
  • DPP4i was administered daily at a dose of 25 mg/kg from day 8 to day 17.
  • a CT26 tumor bearing model using 4-week-old BALB/c mice was prepared by subcutaneous injection of 1 ⁇ 10 6 CT26 cells. On the 7th day, 4 ⁇ 10 5 cells were injected intravenously to induce metastatic lung cancer. On day 8, mice were divided into 7 groups and treated as follows: i) saline, ii) NP (nanoparticle) + US (ultrasound), iii) NB (nanobubble) + US, iv) saline + aPD- L1, v) US + aPD-L1, vi) NP + US + aPD-L1, vii) NB + US + aPD-L1.
  • NP and NB were administered intravenously to tumor-bearing mice on days 8, 11 and 14 at a dose of 1 mg Ce6/kg. 6 hours after administration, the tumor was irradiated with ultrasound (time: 600 s, power: 10 W, impact coefficient: 20%, pulse repetition frequency: 1 Hz, Y interval: 1 mm). One day later, each mouse was injected intraperitoneally with aPD-L1 (100 ⁇ g in saline). Tumor volume was calculated as maximum diameter ⁇ minimum diameter 2 ⁇ 0.5.
  • the PEG-CMD-Ce6 conjugate (nanobubble; NB) carrying the gas precursor of the present invention was synthesized through a three-step method.
  • the synthetic route is shown in Figure 2a.
  • the manufacturing method for each step will be described in detail.
  • the polymer main chain polyethylene glycol [poly (ethylene glycol); To prepare a carboxymethyl dextran (CMD) derivative conjugated with PEG], reductive amination of CMD with methoxy PEG (mPEG-NH 2 ) having an amine group at the terminal was performed.
  • CMD carboxymethyl dextran
  • DIW deionized water
  • MWCO 12-14 kDa, Spectrum Laboratories, Inc., USA
  • mPEG-NH 2 (0.027 mmol) and CMD (0.0053 mmol) were dissolved in 0.1M borate buffer (pH 8.5), and sodium cyanoborohydride (100 equivalents) was added thereto.
  • the chemical structure of the PEG-CMD was confirmed using 1 H NMR (Varian Unity, 500 Mhz; USA) (FIG. 2b), and the degree of substitution of PEG was confirmed to be 5.38%.
  • an amphiphilic polymer PEG-CMD-Ce6
  • a hydrophobic acoustic sensitizer Chlorin e6 (Ce6)
  • Ce6 was covalently conjugated to PEG-CMD using an esterification reaction.
  • Ce6 (0.11 mmol), DCC (0.33 mmol) and DMAP (0.33 mmol) were dissolved in DMSO and formamide mixed solvent (1:1, v/v) and stirred in the dark for 2 hours to activate the carboxyl group of Ce6.
  • the mixture containing Ce6 was added dropwise to PEG-CMD (0.0063*62.5 mmol) dissolved in 5 ml of the same solvent under stirring, and reacted at room temperature and light blocking condition for 24 hours.
  • the purified solution was filtered through a 0.8 ⁇ m syringe filter and freeze-dried to obtain PEG-CMD-Ce6 as a green powder.
  • the PEG-CMD-Ce6 was subjected to chemical structural analysis using 1 H NMR (FIG. 2c), and the degree of substitution (8.8%, w/w) of Ce6 conjugated to the polymer was calculated using UV-Vis spectroscopy. .
  • nanoparticles (nanobubbles; NB) carrying a gas precursor, perfluoropentane (PFP), a gas precursor, was encapsulated in the hydrophobic center of the PEG-CMD-Ce6-based self-assembly using an emulsion method.
  • PFP perfluoropentane
  • amphiphilic nanoparticles (PEG-CMD-Ce6) were dissolved in deionized water at a concentration of 2 mg/ml, and filtered using a 0.8 ⁇ m disposable filter.
  • the amphiphilic nanoparticle solution was cooled on an ice water bath and mixed with 20 ⁇ l of PFP (2%, v/v).
  • a probe-type ultrasonicator (VCX750, Cole-Palmer, USA) to ultrasonic treatment (21% powder, impact coefficient 16.7%, 90 seconds) to prepare emulsion-type nanobubbles.
  • PEG-CMD-Ce6-based nanoparticles nanoparticles, NPs
  • NP nanoparticles
  • NB nanobubbles
  • a CMD-CA conjugate (cNB) carrying a gas precursor without a sonar sensitizer was synthesized through a three-step method for evaluation of the ability to induce physical apoptosis by synergistic effect.
  • the synthetic route is shown in Figure 2d.
  • cNB will be described in detail with respect to each step of the manufacturing method.
  • a reduction reaction was performed by conjugating ethylenediamine to prepare an amine derivative of 5 ⁇ cholanic acid, which is a hydrophobic molecule.
  • 5 ⁇ cholanic acid 100 mg
  • EDC 110 mg
  • NHS 90 mg
  • DMF 20 mg/mL
  • 1.6 mL of ethylenediamine and 10 mL of DMF were added, stirred for 24 hours, and precipitated on cold deionized water to obtain an off-white product.
  • a 5 ⁇ -cholanic acid derivative having an amine group was chemically conjugated to a carboxymethyl dextran polymer main chain. Specifically, using an amidation reaction in the presence of EDC and NHS as catalysts, a 5 ⁇ -cholanic acid derivative having an amine group was covalently conjugated to carboxymethyl dextran. 100 mg of carboxymethyl dextran was dissolved in formamide at a concentration of 20 mg/mL, and then EDC and NHS dissolved in DMF were added to the reaction for 6 hours.
  • a 5 ⁇ cholanic acid derivative having an amine group equivalent to 0.1 equivalents of the total number of carboxyl groups in carboxymethyl dextran was added and stirred for 24 hours.
  • the purified solution was filtered through a 0.8 ⁇ m syringe filter and freeze-dried to obtain cNP as a white powder.
  • the cNP was subjected to structural analysis using 1 H-NMR (Fig. 2e), and it was confirmed that the 5 ⁇ -cholanic acid derivative having an amine group conjugated to a polymer had a degree of substitution of 6.04%.
  • cNBs nanobubbles
  • PFH perfluorohexane
  • CMD-CA hydrophobic center of the cNP-CA-based self-assembly using an emulsion method.
  • amphiphilic nanoparticles (cNPs) were dissolved in deionized water at a concentration of 2 mg/ml, and filtered using a 0.8 ⁇ m disposable filter.
  • the amphiphilic nanoparticle solution was cooled on an ice water bath and mixed with 20 ⁇ l of PFH (2%, v/v).
  • VCX750 probe-type ultrasonicator
  • the chemical structure analysis of the amphiphilic polymer-based nanoparticles (NP) according to the present invention was performed using 1 H NMR (500 MHz, Varian INOVA, USA), and the results are shown in FIGS. 2b and 2c.
  • the amphiphilic polymer may include a hydrophilic polyethylene glycol (PEG), a polysaccharide polymer, and a hydrophobic low-molecular material (photosensitizer, sonosensitizer, bile acid derivative, etc.).
  • PEG and It was composed of CMD (carboxymethyl dextran), a polysaccharide polymer, and Ce6 (chlorin e6), a sound sensitizer.
  • the amphiphilic polymer-based nanoparticles may include a perfluorocarbon-based gas precursor in the hydrophobic center, and in this embodiment, perfluoropentane (PFP) was used.
  • NP amphiphilic polymer-based nanoparticles
  • NB nanobubbles
  • PEG-CMD-Ce6 with PFP nanobubbles
  • Zetasizer Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, UK
  • transmission electron microscopy Talos F200X; FEI Company, USA
  • nanoparticles (NP, control) and nanobubbles (NB) appeared as spheres with a radius of about 142.3 ⁇ 29.4 nm and 232.8 ⁇ 75.1 nm, respectively, so that NB was a gas precursor PFP in the NP. It was confirmed that it expands as it is encapsulated.
  • FIG. 3c it was observed that Ce6, an acoustic sensitizer, exhibited similar intracellular uptake behavior in all experimental groups (blue, cell nucleus; red, Ce6).
  • PFP was stably maintained in the hydrophobic core of the NB until internalized into the cell, suggesting that the NB can penetrate the cell membrane in response to acoustic cavitation.
  • the hydrodynamic size and distribution of the cNB prepared in Example 1.2 was measured at 635 nm using a dynamic light scattering system (Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, USA), and the morphology was measured by transmission electron microscopy (TEM; Talos F200X; FEI Company, USA) was used for observation. All samples were treated with uranyl acetate (1% in DIW) for negative staining microscopic images.
  • cNB was observed to have a spherical shape with a radius of about 200 nm.
  • cNPs were measured to have radii of about 119.44 ⁇ 9.31 nm and 225.78 ⁇ 25.1 nm.
  • PFH was stably maintained in the hydrophobic core and delivered in a bubble state until cNB was internalized into the cell, suggesting that cNB may rupture the cell membrane in response to acoustic cavitation. is the result of
  • NB nanobubble
  • sonosensitizer was evaluated in colon carcinoma cell line CT26 (colon carcinoma).
  • CT26 colon carcinoma cell line
  • the prepared nanobubbles were treated with various concentrations (1-100 ⁇ g/ml) and cell viability was measured 24 hours later using the CCK-8 assay (for specific methods, refer to the above experimental materials and methods).
  • cytotoxicity of nanoparticles (cNPs) and nanobubbles (cNBs) without sonosensitizer was performed as described in Table 4 of “Experimental Materials and Methods” above.
  • the shape of the cells was observed through a confocal microscope after staining with Annexin V/PI.
  • 2 ⁇ 10 6 RIPK-3 deficient CT26 colorectal cancer cell lines were cultured in 100-pi dishes for 36 hours, and then treated with nanoparticles (NP) or nanobubbles (NB) for 6 hours. After that, it was redispersed in 500 ⁇ l of Annexin V binding buffer, put in a homemade agarose gel, and irradiated with ultrasound, and incubated for an additional 1 hour.
  • Cells were stained with Alexa FluorTM 488 Annexin V and PI (propidium iodide) and observed with a confocal microscope.
  • Nanobubble (cNB) without sonar sensitizer Ability to induce necroptosis-like apoptosis
  • necroptosis induces the release of intact DAMP from the cell, and thus effectively mediates the maturation and activation of dendritic cells. Therefore, in order to verify the leakage of immunogenic DAMP through each nanobubble (NB or cNB)-mediated necroptosis-like apoptosis, the present inventors confirmed the amount of DAMP protein leakage using Western blot. Specifically, CT26 cells were cultured in a 150-pi dish at a density of 4 ⁇ 10 6 cells/dish for 36 hours, then replaced with a culture medium containing nanobubbles (NB) and cultured for an additional 6 hours.
  • NB nanobubbles
  • HMGB1 high mobility group box 1
  • HMGB1 high mobility group box 1
  • the nanobubbles (NB) containing the sound sensitizer were cleaved, a characteristic of apoptosis, when the nanoparticles (NP) were treated and irradiated with ultrasound (NP+US). It was confirmed that the expression of caspase-3 was increased and the HMGB1 protein was present in an oxidized form (oxHMGB1). On the other hand, in the case of nanobubble (NB) treatment and ultrasonic irradiation (NB+US), the expression level of cleaved caspase-3 was significantly reduced compared to the nanoparticle (NP) treatment group, and HMGB1 was converted to an unoxidized form. It was observed to exist and it was confirmed that characteristics such as necroptosis appeared. The above results support the ultrasound-sensitive necroptosis-like apoptosis-inducing ability of nanobubbles (NB).
  • the expression type and efflux amount of the DAMP protein shown in the existing apoptosis and necroptosis by cavitation were confirmed.
  • the release of HMGB1 and HSP70 which induces the maturation of dendritic cells, was observed in the CT26 cells induced by apoptosis through doxorubicin.
  • the release of HMGB1 and HSP70 was observed in the case of CT26 cells treated with nanobubbles (cNB) and ultrasound without a sonic sensitizer, and it was confirmed that the amount of released protein was significantly increased.
  • HMGN1 a DAMP that induces chemotaxis of leukocytes
  • GSDME a DAMP that induces the activation of natural killer cells
  • IL-33 a DAMP that induces the activation of eosinophils
  • the CT26 culture solution extracted in the above example was treated with bone marrow-derived dendritic cells for 24 hours, and then, FITC-anti-CD86 was labeled and flow cytometry was performed.
  • CD86 is a representative costimulatory molecule expressed in dendritic cells, and the degree of maturation of dendritic cells can be judged through its expression level.
  • the cell culture solution extracted from the group treated with nanobubbles (NB) and irradiated with ultrasound was 1.52, respectively, compared to the control group untreated or the group treated with nanoparticles (NP) and irradiated with ultrasound. It was confirmed that a double and 1.16 fold higher amount of CD86 expression was induced. This is thought to be due to inducing the maturation of dendritic cells with high efficiency without oxidizing DAMP and tumor-associated antigens by necroptosis-like apoptosis following cell membrane rupture.
  • necroptosis-like apoptosis can be induced using nanobubbles (NB).
  • NB nanobubbles
  • NB nanobubbles
  • Fig. 5a strong fluorescence signals were observed in the tumors of live mice during the entire period of the test.
  • Fig. 5b the ex vivo image of the tissue excised 24 hours after administration showed the strongest fluorescence signal in the tumor tissue, which shows the high tumor targeting efficiency of NB (Fig. 5b top).
  • the fluorescence intensity in the tumor tissue was 2.74 times and 5.66 times higher than that of the liver and lung, respectively (Fig. 5b bottom).
  • Example 7 Evaluation of cancer treatment efficacy and metastasis inhibition of each nanobubble (NB and cNB) using an animal model
  • Nanobubble (NB) containing sonosensitizers in cancer animal models
  • the CT26 cell line (1 ⁇ 10 6 cells) used in the in vitro-level validation experiment was subcutaneously implanted into mice.
  • a model was made.
  • Nanobubble (NB) according to the present invention was administered to the animal model by intravenous injection at a dose of 3 mg Ce6/kg, and physiological saline and nanoparticles (NP) were administered to the control group. Thereafter, treatment efficacy was evaluated in the presence or absence of ultrasound irradiation.
  • the administration schedule and ultrasound irradiation time are shown in FIG. 6A .
  • the tumor volume was reduced by 88.3% compared to the physiological saline treatment group (Saline or US).
  • a CT26 cell line was implanted subcutaneously in a mouse, and then the CT26 cell line was additionally injected intravenously to prepare an animal model of lung metastasis cancer, Cancer metastasis inhibitory ability was evaluated through India ink staining.
  • the administration schedule and ultrasound irradiation time are shown in FIG. 7A.
  • nanobubbles containing a sonic sensitizer containing gas precursors selectively induce necroptosis-like apoptosis under ultrasonic stimulation, thereby effectively inducing tumor suppression and anticancer immune response, Accordingly, it is expected that the development of various combination treatment technologies will be possible.
  • nanobubbles (cNB) not containing a sound wave sensor A cancer animal model was prepared by subcutaneously transplanting the CT26 cell line (1 ⁇ 10 6 cells) used in the test-tube level validation experiment. In the animal model, nanobubbles (cNB) not containing a sound sensitizer were injected intravenously at a dose of 10 mg/kg.
  • sitagliptin one of the inhibitors (DPP4i) of DPP4 (Dipeptidyl peptidase 4) that inhibits the activity of eosinophils, was evaluated to evaluate the anticancer immunotherapy efficacy by eosinophils and NK cells.
  • sitagliptin was co-administered with cNB.
  • the administration schedule and ultrasound irradiation time are shown in FIG. 8A.
  • the tumor volume was reduced by 24.3 ⁇ 11.1% compared to the control group.
  • the volume of the tumor was reduced by 70.4 ⁇ 26.9%, and the extracted cancer tissue was found to decrease by 76.3 ⁇ 25.7%, confirming that the anticancer effect was further maximized during the combined treatment (the left graph of FIGS. 8b and 8c).
  • CD80 + dendritic cells in cancer tissues were identified by immunofluorescence staining , significantly high CD80 + dendritic cell fluorescence was observed in all groups irradiated with ultrasound to nanobubbles from which HMGB1 could be effectively released (Fig. 8d).
  • CD49b + NK cells induced by eosinophils high fluorescence was observed in the group irradiated with ultrasound to nanobubbles (cNB+US) and the group administered with ultrasound irradiation and DPP4 inhibitor to nanobubbles (cNB+US+DPP4i).
  • Nanoparticles carrying gas precursors according to the present invention i.e., nanobubble (NB or cNB)
  • NB or cNB nanobubble
  • it since it can induce stronger immunogenicity than immunogenic apoptosis using conventional anticancer treatment, it can be widely applied to anticancer combination treatment technology using the same, which is expected to have great industrial use value.

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Abstract

본 발명은 기체 전구체를 함유하는 나노입자(나노기포), 이에 기반한 항암용 조성물 및 상기 나노기포의 제조 방법에 관한 것으로서, 암 세포의 물리적 세포사멸을 유도할 수 있는 초음파 매개 항암제 등에 관한 것이다. 본 발명에 따른 나노기포는 초음파 조사에 의해 종양 부위 선택적으로 RIPK3 및 MLKL 단백질 비의존적 네크롭토시스 유사 세포사멸을 유도하는 효과가 있으며, 따라서 다양한 암종 뿐만 아니라 RIPK3 및 MLKL의 발현이 억제되어 있는 악성 종양의 치료에도 활용 가능하다. 또한, 기존의 항암 치료를 활용한 면역원성 세포사멸보다 강력한 면역원성을 유발할 수 있으므로, 이를 이용한 항암 병용치료 기술에 적용될 수 있다.

Description

세포사멸 유도용 기체 전구체를 담지한 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 암 세포사멸 유도용 기체 전구체를 함유하는 나노입자 및 이에 기반한 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 암 세포의 물리적 세포사멸을 유도할 수 있는 초음파 매개 약학적 조성물에 등에 관한 것이다.
본 출원은 2020년 4월 28일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2020-0051268호 및 2021년 2월 26일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2021-0027001호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
네크롭토시스(necroptosis)는 프로그램된 형태의 괴사(necrosis) 또는 염증성 세포사멸 기작으로서, 2005년 처음 명명된 이래로 2009년부터 RIPK3(receptor-interacting protein kinase 3) 등 관련 주요 인자의 규명이 이루어지고 있다. 네크롭토시스는 세포막의 파열을 유발하는데, 종래의 항암화학 요법(chemotherapy) 또는 최근 부상하고 있는 광역동 치료(photodynamic therapy) 등을 통해 유발되는 면역원성 세포사멸보다 더욱 강한 면역반응을 수반하는 특징이 있다. 이는 세포 내에서의 단백질 분해나 산화 과정을 수반하지 않기 때문에 위 과정에서 면역원성을 상실하는 DAMP(Damage-associated molecular pattern)와 종양항원이 면역원성을 가진 원래의 상태로 유출되어 효과적으로 항암 면역반응을 유도할 수 있는 것에 기인한다. 상기 특징으로 인하여 네크롭토시스가 기존 항암 치료에 대한 반응성을 증폭시켜 치료 효능을 극대화할 수 있을 것으로 예상되었다.
그러나, 대부분의 종양 세포들은 네크롭토시스의 발생에 관여하는 RIPK3 및 MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)의 발현이 현저히 억제되어 있는 것으로 밝혀져, 네크롭토시스 유발 제제들, 예를 들어 TRAIL을 포함하는 종양괴사인자계 사이토카인, zVAD를 포함하는 pan-caspase 억제제, MLKL 간섭RNA 등이 개발되었으나 효능이 제한적이었다. 또한, 혈관 세포의 네크롭토시스는 종양의 전이를 촉진시킬 수 있으며, T 림프구의 네크롭토시스는 주변 T 림프구의 면역 활성을 저해하는 부작용을 가지고 있는 등 부작용도 적지 않다. 따라서 현재 네크롭토시스를 통한 항암 치료는 임상적 활용이 제한적이므로 암 세포에 선택적으로 작용하며 RIPK3/MLKL의 발현 정도에 의존하지 않는 네크롭토시스 유발 제제의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 RIPK3 및 MLKL 단백질에 비의존적인 암 세포 특이적 네크롭토시스 유사 세포사멸을 유도할 수 있는 기체 전구체를 함유한 나노입자를 개발하였고, 이를 활용한 초음파 매개 항암 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 생체적합성의 다당류 고분자 물질 및 상기 고분자 물질에 접합되는 소수성의 저분자 물질을 포함하는 나노입자(nanoparticle); 및 상기 나노입자에 담지되고, 초음파에 감응하여 기화되는 기체 전구체(gas precursor)를 포함하는, 나노기포(nanobubble)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 나노기포를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 나노기포 및 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 나노기포 및 DPP4 억제제(dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i)를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 나노기포를 유효성분으로 포함하는, 암의 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체적합성의 다당류 고분자 물질 및 상기 고분자 물질에 접합되는 소수성의 저분자 물질을 포함하는 나노입자(nanoparticle); 및 상기 나노입자에 담지되고, 초음파에 감응하여 기화되는 기체 전구체(gas precursor)를 포함하는, 나노기포(nanobubble)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노기포는 상기 고분자 물질에 폴리에틸렌 글라이콜[poly(ethylene glycol)]이 더 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 고분자 물질은 카복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 마난(mannan), 덱스트란 설페이트(dextran Sulfate), α-사이클로덱스트린(cyclodextrin), β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginate), 글리코겐(glycogen), 아밀로오스(amylose), 베타글루칸(β-glucan), 하이드록시에틸 셀룰로오스(hydroxyethylcellulose), 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 후코이단(fucoidan), 콘드로이틴(chondroitin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 저분자 물질은 음파감작제, 광감작제, 담즙산 유도체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 음파감작제 또는 광감작제는 감작(sensitization) 시 활성산소종을 방출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 음파감작제는 클로린(chlorin) e6, 벤조클로린(benzochlorin), 메틸렌 블루(methylene blue), 톨루이딘 블루(toluidine blue), 로즈 벤갈(Rose Bengal), 포토프린(Photofrin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 나프탈로시아닌(napthalocyanine), 인도시아닌 그린(indocyanine green), BODIPY(boron-dipyrromethene), 페오포르바이드 A(pheophorbide A), 베르딘(verdin), 헤마토포르피린(hematoporphyrin), 프로토포르피린(protoporphyrin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 광감작제는 클로린 e6, 포토디타진, 라다클로린(Radachlorin), 2-(1-헥실에틸)-2-디비닐피로페오포르비드-α(HPPH)[2-(1-hexylethyl)-2-devinylpyropheophorbide-α(HPPH)], 프탈로시아닌(ZnPc, Zinc Phthalocyanine), 피오포바이드 a(Pheophorbide a) 화합물, 포르피린(phorphyrins) 화합물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 저분자 물질이 담즙산 유도체인 경우 상기 나노기포는 초음파 처리에 의해 호산구 및 NK세포(natural killer cell)의 활성화를 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 담즙산 유도체는 아미노화 5β-콜란산(aminated 5β-cholanic acid), 5β-콜란산(5β-cholanic acid), 콜산(cholic acid), 디옥시콜산(deoxycholic acid), 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 리토콜산(lithocholic acid), 우르소콜산(ursocholic acid), 우르소디옥시콜산(ursodeoxycholic acid), 이소우르소디옥시콜산(isoursodeoxycholic acid), 라고디옥시콜산(lagodeoxycholic acid), 글리코콜산(glycocholic acid), 글리코디옥시콜산(glycodeoxycholic acid), 글리코케노디옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 디하이드로콜산(dehydrocholic acid), 히오콜산 (hyocholic acid), 히오디옥시콜산(hyodeoxycholic acid) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 아미노화 5β-콜란산은 하기 (i) 내지 (iv) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다:
(i) ( R)- N-(2-아미노에틸)-4-((5 S,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-10,13-다이메틸헥사데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-17-일)펜탄아마이드 (( R)- N-(2-aminoethyl)-4-((5 S,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-10,13-dimethylhexadecahydro-1 H-cyclopenta[ a]phenanthren-17-yl)pentanamide);
(ii) (3 S,8 S,9 S,10 R,13 R,14 S,17 R)-10,13-다이메틸-17-[(2 R)-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-3-아민 ((3 S,8 S,9 S,10 R,13 R,14 S,17 R)-10,13-dimethyl-17-[(2 R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1 H-cyclopenta[a]phenanthren-3-amine);
(iii) N-(아미노메틸)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,12 S,13 R,14 S,17 R)-3,12-다이하이드록시-10,13-다이메틸헥사데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-17-일)펜탄아마이드 ( N-(aminomethyl)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,12 S,13 R,14 S,17 R)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethylhexadecahydro-1 H-cyclopenta[ a]phenanthren-17-yl)pentanamide); 및
(iv) ( S)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-3-아미노-10,13-다이메틸헥사데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-17-일)펜타노익 애시드 (( S)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-3-amino-10,13-dimethylhexadecahydro-1 H-cyclopenta[ a]phenanthren-17-yl)pentanoic acid).
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 기체 전구체는 과불화탄소 계열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 과불화탄소는 과불화펜탄(perfluoropentane: PFP), 과불화메틸펜탄(perfluoro(2-methylpentane)), 과불화헥산(perfluorohexane: PFH), 과불화메틸사이클로헥산(perfluoromethylcyclohexane: PFmH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 나노기포는 종양에서 초음파 조사에 의해 네크롭토시스(necroptosis) 유사 세포사멸을 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 네크롭토시스는 RIPK3(receptor-interacting protein kinase 3) 또는 MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein) 비의존적인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 나노기포는 초음파 조사에 의해 종양 세포에서 DAMP(Damage-associated molecular pattern)의 유출을 유도하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포를 유효성분으로 포함하는, 초음파 면역항암용 조성물을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포의, 암의 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포의 암에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 유효성분으로 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 CTLA-4, PD-1 및 PD-L1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 DPP4 억제제(dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i)를 유효성분으로 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 DPP4 억제제는 DPP4 단백질의 활성 억제제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 DPP4 단백질의 활성 억제제는 DPP-4에 대한 항체, 시타글립틴(sitagliptin), 빌다글립틴(vildagliptin), 삭사글립틴(saxagliptin), 리나글립틴(linagliptin), 두토글립틴(dutogliptin), 제미글립틴(gemigliptin), 알로글립틴(alogliptin), 아나글립틴(Anagliptin), 에보글립틴(evogliptin), 베르베린(Berberine), 디프로틴(Diprotin) 및 루피올(Lupeol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포를 유효성분으로 포함하는, 암의 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 전이 억제 방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포의, 암의 전이 예방 또는 억제 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 기체 전구체를 담지한 나노입자, 즉 나노기포(Nanobubble, NB 또는 cNB)는 초음파 조사에 의해 종양 부위 선택적으로 네크롭토시스 유사 세포사멸 유도가 가능하며, 따라서 RIPK3 및 MLKL의 발현이 억제되어 있는 종양의 치료에도 활용이 가능하다. 또한, 기존의 항암 치료를 활용한 면역원성 세포사멸보다 강력한 면역원성을 유발할 수 있으므로, 이를 이용한 항암 병용치료 기술에 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a 내지 도 1c는 두 가지 종류의 기체 전구체를 담지한 나노입자(NB 또는 cNB) 및 이를 활용한 초음파 매개 항암 치료 방법을 나타낸 도이다: (도 1a) 초음파(US) 조사시 음파감작제가 포함된 나노기포는 활성산소종을 생성하고 공동효과(cavitation effect)를 유발함을 나타낸 개략도; (도 1b) 나노기포에 의해 유발된 네크롭토시스가 온전한 DAMP의 방출을 유발하며, 효율적인 in situ 암 예방접종이 이루어짐을 나타낸 모식도; (도 1c) 음파감작제가 포함되지 않은 나노입자(cNP)와 나노기포(cNB) 및 이를 이용한 초음파 매개 세포사멸 유도 방법을 나타낸 개략도.
도 2a 내지 도 2e는 두 가지 종류의 나노기포(NB 또는 cNB) 제조를 위한 양친성 고분자 기반 자가조립체의 합성 경로 및 이의 화학적 구조 분석 결과를 나타낸 도이다: (도 2a) PEG-CMD-Ce6의 합성 경로; (도 2b) PEG-CMD의 1H-NMR 스펙트럼; (도 2c) PEG-CMD-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼; (도 2d) CMD-CA의 합성 경로; (도 2e) CMD-CA의 1H-NMR 스펙트럼.
도 3a 내지 도 3j는 두 가지 종류의 나노입자(NP 또는 cNP) 및 나노기포(NB 또는 cNB)의 물리화학적 특성, 세포 내 흡수 및 세포독성을 분석한 결과를 나타낸 도이다: (도 3a) NP 및 NB의 투과전자현미경 이미지; (도 3b) NP 및 NB의 크기 분포; (도 3c) Ce6, 나노입자(NP) 및 나노기포(NB)로 처리된 CT26 세포의 공초점 현미경 이미지(스케일 바, 10 μm); (도 3d) 상이한 농도의 Ce6에서의 세포생존력 평가 결과(n=5); (도 3e) 초음파(US) 조사에 의한 활성산소종(ROS)의 생성 능력 평가 결과(RNO, p-nitroso- N,N'-dimethylaniline; n=3); (도 3f) Ce6, 나노입자(NP) 및 나노기포(NB)의 초음파-매개 세포독성(n=5, ** p <0.01); (도 3g) cNP 및 cNB의 투과전자현미경 이미지; (도 3h) cNP 및 cNB의 크기 분포; (도 3i) 음파감작제가 포함되지 않은 나노입자(cNP) 및 나노기포(cNB)로 처리된 CT26 세포의 공초점 현미경 이미지; (도 3j) 음파감각제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)의 초음파-매개 세포독성(n=5).
도 4a 내지 도 4i는 두 가지 종류의 나노기포(NB, 도 4a 내지 도 4e; cNB, 도 4f 내지 도 4i)의 네크롭토시스 유사 세포사멸 유도능 및 수지상세포 성숙도 평가 결과를 나타낸 도이다: (도 4a 및 도 4b) RIPK-3 결핍 CT26 세포(도 4a), MLKL 넉다운 CT26 세포 및 HT29 세포(도 4b)에서 Annexin V/PI로 염색된 세포의 공초점 현미경 이미지(스케일 바, 50 μm); (도 4c) 세포에서 caspase-3 및 HMGB1의 웨스턴 블롯 분석 결과; (도 4d) 조정배지에 방출된 HMGB1의 웨스턴 블롯 분석 결과; (도 4e) 골수 유래 수지상세포(BMDC)에서 CD86 발현의 유세포 분석 결과(n=3); (도 4f 및 도 4g) RIPK-3 결핍 CT26 세포(도 4f), MLKL 넉다운 CT26 세포(도 4g)에서 Annexin V/PI로 염색된 세포의 공초점 현미경 이미지; (도 4h) 조정 배지에서 방출된 HMGB1 및 HSP70의 웨스턴 블롯 분석 결과; (도 4i) 조정 배지에서 방출된 HMGN1, GSDME, IL-33의 웨스턴 블롯 분석 결과.
도 5a 및 도 5b는 나노기포(NB)를 CT26 종양 보유 마우스에 정맥 투여하였을 때 종양에 표적화되어 축적됨을 보여주는 도이다: (도 5a) 시간에 따른 생체내 형광의 전신 이미지(상단) 및 형광 강도의 정량 그래프(하단); (도 5b) 투여 후 24시간이 경과된 시점에서 간, 폐, 비장, 신장, 심장 및 종양의 생체외 형광 이미지(상단) 및 각 기관의 생체외 형광 강도의 정량 그래프(하단).
도 6a 내지 도 6d는 나노기포(NB)의 항암 효능을 나타낸 도이다: (도 6a) 처치 프로토콜의 개략도; (도 6b) 시간의 경과에 따른 평균 종양 부피를 나타낸 그래프; (도 6c) 각 실험군에서 개별 종양 부피의 변화 프로파일(n=5; CIG, 종양 성장의 완전한 억제; CR, 종양의 완전한 퇴행); (도 6d) 각 실험군의 해부된 개별 종양의 사진(상단) 및 종양의 무게를 비교한 그래프(하단; 오차 막대는 표준 편차, ** p <0.01).
도 7a 내지 도 7h는 나노기포(NB)의 전이성 폐암 억제능을 나타낸 도이다: (도 7a) 처치 프로토콜의 개략도; (도 7b) 시간의 경과에 따른 평균 종양 부피를 나타낸 그래프(오차 막대는 표준 편차, ** p <0.01); (도 7c) 각 실험군의 해부된 개별 종양의 사진; (도 7d) 각 실험군에서 개별 종양 부피의 변화 프로파일(n=5; CIG, 종양 성장의 완전한 억제; CR, 종양의 완전한 퇴행); (도 7e) 1차 종양 조직에서 침윤된 CTL의 면역조직화학 염색 이미지(파란색, 핵; 녹색, CD8 + CTL; 스케일 바, 100 μm); (도 7f) H&E 염색된 폐 조직(스케일 바, 200 μm; 화살표는 폐의 전이성 결절을 나타냄); (도 7g) 인디아 잉크로 염색된 폐 조직의 대표 사진(붉은색 화살표는 폐의 전이성 결절을 나타냄); (도 7h) H&E 염색된 비장 조직(스케일 바, 200 μm).
도 8a 내지 도 8e는 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)의 항암 효능을 나타낸 도이다: (도 8a) 처치 프로토콜의 개략도; (도 8b) 시간의 경과에 따른 평균 종양 부피를 나타낸 그래프; (도 8c) 각 실험군의 해부된 종양 및 비장의 무게를 비교한 그래프; (도 8d) 종양 조직의 성숙된 수지상세포의 면역조직화학 염색 이미지(파란색, 핵; 녹색, CD80 + 수지상 세포); (도 8e) 종양 조직의 성숙된 NK세포(파란색, 핵; 녹색, CD49b + NK세포).
본 발명은 나노입자의 소수성 중심부에 기체 전구체를 담지하여 초음파 조사 시 기체를 발생시키는 나노기포에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 생체적합성이 우수한 카복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran) 주쇄에 폴리에틸렌 글라이콜[poly(ehtylene glycol)]을 접합하여 긴 체내 순환시간을 갖도록 개질하였으며, 음파감작제인 클로린 e6(chlorin e6; Ce6)를 상기 고분자 주쇄에 화학적으로 접합하여 양친성 고분자의 나노기포(PEG-CMD-Ce6)를 제조하였다.
상기와 같이 제조한 양친성 고분자 PEG-CMD-Ce6는 수용액 상에서 자가조립체를 형성하며, Ce6와의 소수성 상호작용을 통하여 소수성 중심부에 기체 전구체를 봉입함으로써 나노기포(Nanobubble, NB)를 제조하였다. 상기 나노기포는 초음파 조사에 감응하여 케비테이션 효과(cavitation effect)에 의해 세포 내에서 기화 및 팽창하게 된다(도 1a의 모식도 참조). 이에 따라, 세포막의 파열이 유발되어 네크롭토시스 유사 세포사멸 및 DAMP의 유출이 가능하다. 나아가 Ce6에서 방출되는 활성산소종(ROS)에 의하여 종양의 아폽토시스를 유도할 수 있다(도 1b의 모식도 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 생체적합성이 우수한 카복시메틸 덱스트란 주쇄에 아민기를 갖는 5β-콜란산(aminated 5β-cholanic acid) 유도체를 화학적으로 접합하여 음파감작제를 함유하지 않는 양친성 고분자의 나노기포(CMD-CA)를 제조하였다.
상기와 같이 제조한 양친성 고분자의 소수성 중심부에 기체 전구체를 봉입하여 음파감작제 미함유 나노기포(cNB)를 제조하였다. 상기 NB는 음파감작제인 Ce6를 포함하여, 초음파 조사 시 공동효과 및 활성 산소종에 의한 치료 효과를 모두 가짐에 비해, cNB는 초음파에 감응하지 않는 소수성 화학물질인 담즙산 유도체를 도입하여 활성 산소종에 의한 치료효과가 배제된 것으로서, 나노기포의 공동효과만을 이용한 네크롭토시스 유사 세포사멸을 유도할 수 있다(도 1c의 모식도 참조).
따라서 두 종류의 상기 세포사멸 유도용 나노기포는 다양한 종류의 암 세포를 사멸시킬 수 있으며, 나아가 다양한 항암 면역치료 제제와의 병용 치료 또한 가능하도록 한다.
이에, 본 발명은 생체적합성의 다당류 고분자 물질 및 상기 고분자 물질에 접합되는 소수성의 저분자 물질을 포함하는 나노입자(nanoparticle); 및 상기 나노입자에 담지되고, 초음파에 감응하여 기화되는 기체 전구체(gas precursor)를 포함하는, 나노기포(nanobubble)를 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노기포는 상기 고분자 물질에 폴리에틸렌 글라이콜[poly(ethylene glycol)]이 더 결합되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 “폴리에틸렌 글라이콜[poly(ethylene glycol); PEG]”은 나노기포 표면의 친수성을 증가시키고 인체 내 면역기능으로 인한 빠른 분해를 방지하여 혈중 체류 시간을 향상시키기 위하여 도입된 고분자 물질이다. 이와 같이 폴리에틸렌 글라이콜로 개질시키는 것을 페길화(pegylation)라고 하며, 이를 통해 간 축적이 감소되고 혈중 체류 시간이 증가된 고분자 나노기포를 제조할 수 있다. 즉, 나노기포 표면에 폴리에틸렌 글라이콜을 도입함으로써 입자의 친수성이 증가되고, 병원균, 노폐물 및 외부 유입 물질을 포식하고 소화시키는 인체 내의 대식세포(macrophage) 등을 포함하는 면역기능으로부터의 인식을 방지하는 소위 스텔스 효과(stealth effect)를 통한 신체 내에서의 분해를 방지할 수 있으며, 나노기포의 혈중 체류 시간을 증가시킬 수 있다. 이때, 사용되는 폴리에틸렌 글라이콜은 바람직하게는 100 내지 150,000 사이의 분자량을 가지며, 선형 또는 가지형 등의 다양한 구조를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “생체적합성”은, 넓은 의미로서 목적하는 기능과 생체에 대한 안전성을 겸비한 것을 말하며, 좁은 의미로서 생체에 대한 생물학적 안전성, 즉 독성이 없으며 멸균 가능한 것을 의미한다. 따라서 본 발명에서 상기 “생체적합성 물질”이라 함은 생체에서 목적하는 기능을 발휘하며, 재료 자체의 독성이 없고 멸균 가능한 물질이라고 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “다당류”란, 단당류 3개 이상이 글리코시드 결합을 통해서 연속적인 체인(chain)을 만들고 있는 큰 분자를 의미한다. 본 발명의 상기 다당류에는 단당류가 소량 축합되어 있는 올리고당도 포함된다. 다당류는 그 구조 내에 반응성이 매우 좋은 하이드록시기(hydroxyl group), 아미노기(amino group), 카복시산기(carboxylic acid group) 등이 존재하기 때문에 다른 화합물과 반응시켜 유도체를 쉽게 제작할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 나노기포에 사용될 수 있는 상기 “생체적합성의 다당류 고분자 물질”로는 카복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 마난(mannan), 덱스트란 설페이트(dextran Sulfate), α-사이클로덱스트린(cyclodextrin), β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginate), 글리코겐(glycogen), 아밀로오스(amylose), 베타글루칸(β-glucan), 하이드록시에틸 셀룰로오스(hydroxyethylcellulose), 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 후코이단(fucoidan), 콘드로이틴(chondroitin) 등이 있으며, 당업자가 목적에 따라 적절한 화합물을 선택할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 저분자 물질은 음파감작제, 광감작제, 담즙산 유도체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 상기 음파감작제 또는 광감작제는 감작(sensitization) 시 활성산소종을 방출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 “음파감작제(sonosensitizer)”란, 적합한 주파수에 노출되었을 때 진동에너지를 흡수한 후, 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)를 발생시켜 세포를 손상시키거나 파괴할 수 있는 물질을 포괄적으로 의미한다. 상기 음파감작제는 생체에 투여되는 경우 특정 표정 세포(예컨대, 암 세포)에 특이적으로 결합한 후 초음파에 의해 활성화되어 암 세포를 사멸시킬 수 있는 독성물질을 생성함으로써 암세포에 대한 선택적 독성을 나타낸다. 보다 구체적으로, 본 발명의 나노기포가 종양 조직에 선택적으로 축적된 후 초음파에 감응하여 활성화되면서 산소와 결합하여 화학적으로 반응성이 매우 높은 활성산소종을 발생시켜, 암세포를 직접적으로 손상시킬 수 있으며, 종양 주변의 미세 혈관에 손상을 주어 암 조직에 영양분이 공급되지 않도록 하여 암 세포를 사멸시키는 간접적인 효과를 줄 뿐만 아니라, 산화적 스트레스(oxidative stress)에 따른 2차 반응으로 세포자살(apoptosis) 또는 면역학적 반응을 유도하여 암 조직을 공격하도록 면역시스템을 활성화시켜 종양 조직세포를 괴사시킬 수 있다.
본 발명의 나노기포에 사용될 수 있는 음파감작제로는 클로린(chlorin) e6, 벤조클로린(benzochlorin), 메틸렌 블루(methylene blue), 톨루이딘 블루(toluidine blue), 로즈 벤갈(Rose Bengal), 포토프린(Photofrin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 나프탈로시아닌(napthalocyanine), 인도시아닌 그린(indocyanine green), BODIPY(boron-dipyrromethene), 페오포르바이드 A(pheophorbide A), 베르딘(verdin), 헤마토포르피린(hematoporphyrin), 프로토포르피린(protoporphyrin) 등이 있으며, 당업자가 목적에 따라 적절한 화합물을 선택할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “광감작제”란, 특정 파장의 빛에 조사되었을 때 여기(excitation)된 후, 형광 신호를 생성하거나, 주변의 기질 또는 산소와 반응하여 활성산소종을 생성하고, 생성된 활성산소종은 주변의 종양 세포를 자멸 또는 괴사시키는 효과가 있다.
본 발명의 나노기포에 사용될 수 있는 광감작제로는 클로린 e6, 포토디타진, 라다클로린(Radachlorin), 2-(1-헥실에틸)-2-디비닐피로페오포르비드-α(HPPH)[2-(1-hexylethyl)-2-devinylpyropheophorbide-α(HPPH)], 프탈로시아닌(ZnPc, Zinc Phthalocyanine), 피오포바이드 a(Pheophorbide a) 화합물, 포르피린(phorphyrins) 화합물 등이 있으며, 당업자가 목적에 따라 적절한 화합물을 선택할 수 있다.
한편, 본 발명의 나노기포에 저분자 물질로서 담즙산 유도체를 사용한 경우, 상기 나노기포는 초음파 처리에 의해 호산구 및 NK세포(natural killer cell)의 활성화가 유도될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “담즙산 유도체”에서, “유도체”는 공통의 핵심 4원 고리 구조를 갖는 화합물을 의미하며, 본 발명의 나노기포에 사용될 수 있는 담즙산 유도체로는 아미노화 5β-콜란산(aminated 5β-cholanic acid), 5β-콜란산(5β-cholanic acid), 콜산(cholic acid), 디옥시콜산(deoxycholic acid), 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 리토콜산(lithocholic acid), 우르소콜산(ursocholic acid), 우르소디옥시콜산(ursodeoxycholic acid), 이소우르소디옥시콜산(isoursodeoxycholic acid), 라고디옥시콜산(lagodeoxycholic acid), 글리코콜산(glycocholic acid), 글리코디옥시콜산(glycodeoxycholic acid), 글리코케노디옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 디하이드로콜산(dehydrocholic acid), 히오콜산 (hyocholic acid), 히오디옥시콜산(hyodeoxycholic acid) 등이 있으며, 당업자가 목적에 따라 적절한 화합물을 선택할 수 있다.
특히, 상기 아미노화 5β-콜란산은 하기 (i) 내지 (iv) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다:
(i) ( R)- N-(2-아미노에틸)-4-((5 S,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-10,13-다이메틸헥사데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-17-일)펜탄아마이드 (( R)- N-(2-aminoethyl)-4-((5 S,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-10,13-dimethylhexadecahydro-1 H-cyclopenta[ a]phenanthren-17-yl)pentanamide);
(ii) (3 S,8 S,9 S,10 R,13 R,14 S,17 R)-10,13-다이메틸-17-[(2 R)-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-3-아민 ((3 S,8 S,9 S,10 R,13 R,14 S,17 R)-10,13-dimethyl-17-[(2 R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1 H-cyclopenta[a]phenanthren-3-amine);
(iii) N-(아미노메틸)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,12 S,13 R,14 S,17 R)-3,12-다이하이드록시-10,13-다이메틸헥사데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-17-일)펜탄아마이드 ( N-(aminomethyl)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,12 S,13 R,14 S,17 R)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethylhexadecahydro-1 H-cyclopenta[ a]phenanthren-17-yl)pentanamide); 및
(iv) ( S)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-3-아미노-10,13-다이메틸헥사데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-17-일)펜타노익 애시드 (( S)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-3-amino-10,13-dimethylhexadecahydro-1 H-cyclopenta[ a]phenanthren-17-yl)pentanoic acid).
본 발명에 있어서, 상기 기체 전구체는 과불화탄소 계열일 수 있으며, 예를 들면 과불화펜탄(perfluoropentane: PFP), 과불화메틸펜탄 (perfluoro(2-methylpentane)), 과불화헥산(perfluorohexane: PFH), 과불화메틸사이클로헥산(perfluoromethylcyclohexane: PFmH) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 나노기포는 종양에서 초음파 조사에 의해 네크롭토시스(necroptosis) 유사 세포사멸을 유도하는 것일 수 있으며, 상기 네크롭토시스는 RIPK3(receptor-interacting protein kinase 3) 또는 MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein) 비의존적인 것일 수 있다. 상기 RIPK3는 네크롭토시스에 의한 세포사멸 양식의 주요 조절 인자로 알려져 있으며, 세포질막의 파열 및 사멸한 세포로부터 세포 내용물의 누출에 의해 종결되는 네크롭토시스를 신호하기 위해 집행자인 MLKL을 모집하고 인산화한다. 현재까지의 실험 데이터는 RIPK3 및 MLKL이 모든 네크롭토시스 세포사멸 반응에 필수적인 기구임을 나타내고 있었다.
본 발명에 있어서, 상기 나노기포는 초음파 조사에 의해 종양 세포에서 DAMP(Damage-associated molecular pattern)의 유출을 유도하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 나노기포는 종양에 표적화되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 두 종류의 나노기포(NB 또는 cNB) 자체는 세포에 대한 독성을 갖지 않으면서도, 초음파를 조사하는 경우 네크롭토시스를 유발하는 음향 공동화(acoustic cavitation)에 의해 세포독성이 향상됨을 확인하였다(실시예 3 참조).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 암세포에 NB 또는 cNB를 처리하고 초음파가 조사될 때 아폽토시스가 아닌 네크롭토시스와 유사한 형태의 세포사멸이 일어남을 확인하였으며, 나아가 이는 RIPK3/MLKL 독립적인 방식으로 발생함을 확인하였다. 특히, 음파감작제를 포함하지 않는 cNB의 경우에도 활성 산소종과 무관하게 초음파에 의한 공동현상에 의해 네크롭토시스가 일어남을 발견하였다(실시예 4 참조).
뿐만 아니라, 본 발명의 일 실시예에서는 암세포에 NB 또는 cNB를 처리하고 초음파를 조사한 경우 아폽토시스가 아닌 네크롭토시스와 유사한 기작으로 세포사멸이 발생하여 면역원성이 보존된 DAMP(damage-associated molecular pattern)이 유출됨을 확인하였으며, 이에 따라 수지상세포의 성숙이 유도됨을 보임으로써 항암 면역치료와의 병용치료 가능성을 제시하였다. 특히, 음파감작제를 포함하지 않는 cNB는 기존의 수지상세포의 활성화만 관여가 가능한 아폽토시스와는 다르게 NK세포와 호산구의 활성화를 유도하여 더욱 효과적으로 항암 면역반응을 유도할 수 있음을 새롭게 발견하였다(실시예 5 참조).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 나노기포(NB)가 다른 조직과 비교하여 종양에 선택적으로 축적됨을 확인하였다(실시예 6 참조).
따라서 상기와 같은 실시예에 의해, 본 발명은 다른 양태로서 본 발명에 따른 나노기포를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 초음파 면역항암용 조성물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포의, 암의 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포의 암에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 조성물은 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 유효성분으로 더 포함하는 것일 수 있다.
더욱이, 본 발명에 있어서 상기 조성물은 DPP4 억제제(dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i)를 유효성분으로 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 면역관문 억제제 또는 DPP4 억제제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 암 동물모델에서 나노기포(NB)의 뛰어난 항암 효과와 더불어 면역관문 억제제와의 병용시 40%의 개체에서 완전관해가 관찰되어 항암 효과가 극대화됨을 확인하였다. 또한, 암 동물모델에서 음파감작제를 함유하지 않은 나노기포(cNB)도 뛰어난 항암 효과를 나타냈으며, DPP4 억제제인 시타글립틴(sitagliptin)을 병용하여 처리하면 항암 효과가 더욱 더 극대화됨을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 명세서에서 사용된 용어 “예방”이란, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “치료”란, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, 임상적 결과를 포함하는 유용한 결과 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 시도를 의미한다. 유용한 또는 바람직한 임상적 결과는 검출 가능하거나 가능하지 않더라도, 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선, 질병 범위의 축소, 질병 상태의 안정화, 질병 발생의 억제, 질병 확산의 억제, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 발병의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 감퇴(부분 또는 전체)를 포함할 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, “치료”는 치료의 부재에서 예측되는 것 이상으로 환자의 생존이 연장되는 것을 의미할 수 있다. 또한, “치료”는 질병 진행의 억제, 일시적으로 질병 진행의 늦춤을 의미할 수 있으며, 질병의 진행을 영원히 정지시키는 것과 관련될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “면역관문 억제제”는 일부 암세포가 체내 면역세포인 T 세포의 면역 체크포인트를 활용하면서 면역을 회피하는 경우에, T 세포 억제에 관여하는 면역 체크포인트 단백질(Immune Checkpoint Protein)의 활성화를 차단하여 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 작용을 하는 면역 항암제의 일종으로서, CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 억제제, PD-1(Programmed cell death protein 1) 억제제, PD-L1(Programmed death-ligand 1) 억제제, LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3) 억제제, TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3) 억제제, TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains) 억제제 및 VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation) 억제제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 CTLA-4, PD-1 및 PD-L1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, “DPP4 억제제(dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i)”는 DPP4의 효소활성에 매우 중요한 활성 포켓의 구조분석을 통하여 선택적으로 효소활성을 억제하는 비교적 분자량이 작은 화학적 합성물질을 지칭하는 것으로서, 주로 제2형 당뇨병 치료에 사용되고 있다. 본 발명에 있어서, 상기 DPP4 억제제는 DPP4 단백질의 활성 억제제일 수 있으며, 보다 구체적으로 DPP-4에 대한 항체, 시타글립틴(sitagliptin), 빌다글립틴(vildagliptin), 삭사글립틴(saxagliptin), 리나글립틴(linagliptin), 두토글립틴(dutogliptin), 제미글립틴(gemigliptin), 알로글립틴(alogliptin), 아나글립틴(Anagliptin), 에보글립틴(evogliptin), 베르베린(Berberine), 디프로틴(Diprotin) 및 루피올(Lupeol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 RIPK3 또는 MLKL 단백질이 결핍되어 있거나 상기 단백질의 발현이 하향 조절되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암일 수 있으나, 본 발명에 따른 나노기포는 암 세포에 네크롭토시스를 유발하여 항암 효과를 발휘하는 원리에 근거하므로, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 암의 종류에 관계없이 모든 종류의 암에 대하여 효과를 발휘할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적 조성물로 제조하기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여, 비강 내 투여, 경기관지 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일일 투여량은 하루 일회 내지 수회 나누어 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 정맥 주사제 또는 복강 주사제 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포를 유효성분으로 포함하는, 암의 전이 억제용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 전이 억제 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 나노기포의, 암의 전이 예방 또는 억제 용도를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 폐 전이암 동물모델에서 나노기포의 뛰어난 암 전이 억제능을 확인하였으며, 림프증식증과 같은 부작용 또한 나타나지 않음을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 명세서에서 사용된 용어, “전이(metastasis)”는 악성 종양이 발병한 장기에서 떨어진 다른 조직으로 전파한 상태를 말한다. 하나의 장기에서 시작한 악성 종양이 진행함에 따라 처음 발생한 원발 부위인 장기로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는데, 이렇게 원발 부위로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는 것을 전이라 할 수 있다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상이라고 할 수 있는데, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 새로운 유전 형질을 획득하면서 전이가 일어날 수 있다. 새로운 유전 형질을 획득한 종양 세포가 혈관과 림프선으로 침입하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착, 증식하게 되면 전이가 일어날 수 있다. 전이가 발생하는 조직에 따라, 간암, 신장암, 폐암, 위암, 대장암, 직장암, 췌장암 등 각종 암 질환이 유발될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 전이를 억제하여 암이 퍼지는 것을 예방 및 치료할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “억제”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암 전이를 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험 재료 및 방법
1. 실험 재료
1.1. 소수성 저분자 물질로서 음파감작제를 포함하는 나노기포(NB) 관련
카복시메틸 덱스트란(carboxymethy dextran; CMD) 나트륨 염(Mw = 10-20 kDa), 과요오드산 나트륨(sodium periodate; NaIO 4), 시안화수소화붕소나트륨(sodium cyanoborohydride), DCC( N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide), DMAP(4-dimethylaminopyridine), DMSO(dimethyl sulfoxide), 포름아마이드 및 2-머캅토에탄올은 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich Co., 미국)에서 구입하였다. 메톡시 폴리(에틸렌 글라이콜) 아민(mPEG-NH 2, Mw = 5 kDa)은 라이산 바이오(Laysan Bio, Inc. 미국)로부터 구입하였다. 클로린 e6(Ce6) 및 과불화펜탄(perfluoropentane; PFP)은 각각 프론티어 사이언스(Frontier Scientific Inc., 미국) 및 아폴로 사이언티픽(Apollo Scientific Ltd., 영국)에서 구입하였다. RPMI1640 배지, 소태아혈청(FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신 용액은 깁코(Gibco, 미국)로부터 입수하였다. Alexa Fluor™ 488 Annexin V/propidium iodide 아폽토시스 키트(Dead Cell Apoptosis Kit) 및 HRP-접합 anti-rabbit IgG는 인비트로젠(Invitrogen, 미국)에서 구입하였다. 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; GM-CSF) 및 인터루킨-4 (IL-4)는 페프로텍(PeproTech, 미국)에서 구입하였다. FITC anti-mouse CD86 항체는 바이오레전드(Biolegend, 미국)로부터 입수하였다. anti-RIPK3 항체, anti-MLKL 항체, anti-카스파제-3 항체 및 anti-절단 카스파제(cleaved caspase)-3 항체는 셀시그널링(미국)으로부터, anti-GAPDH 항체는 산타크루즈 바이오테크놀로지(미국)로부터 구입하였다. anti-mouse PD-L1(aPD-L1) 및 anti-mouse CD8 alpha-Alexa Fluor™ 488 접합 항체는 각각 바이오엑스셀(Bio X Cell, 미국) 및 R&D 시스템즈(미국)로부터 얻었다.
1.2. 소수성 저분자 물질로서 담즙산 유도체를 포함하는 나노기포(cNB) 관련
5β-콜란산(5β-cholanic acid), 에틸렌디아민(ethylene diamine), 독소루비신(doxorubicin), EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide), NHS(N-Hydroxysuccinimide)는 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich Co., 미국)에서 구입하였다. 과불화헥산(perfluorohexane; PFH)는 아폴로 사이언티픽(Apollo Scientific Ltd., 영국)에서 구입하였다. anti-HSP70 항체, anti-GSDME(DFNA5) 항체, FITC anti-mouse CD80 및 FITC anti-mouse CD49b 항체는 산타크루즈 바이오테크놀로지(미국)로부터 구입하였다. anti-HMGN1(HMG14) 항체는 펩프로테크 (Peprotech, 미국)에서 구입하였다. anti-IL-33 항체는 R&D 시스템즈(미국)로부터 구입하였다.
2. 인비트로(in vitro) 초음파 처리 및 활성산소종 생성 능력 평가
모든 시험관내 실험은 3% 아가로스(A1018, 바이오세상, Korea) 용액을 사용하여 제조한 수제 아가로스 몰드(내경 12 mm, 외경 30 mm)를 사용하여 수행하였다. 몰드의 내부는 세포 부착을 방지하기 위해 TPX 필름(유상, 대한민국)으로 포장하였다. 초음파는 습식 고강도 집속 초음파 시스템(VIFU-2000, Alpinion medical system, 대한민국)을 이용하여 조사하였다. 세포 및 동물 실험에 대한 초음파의 노출 시간은 300초로 하였다(전력: 30W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 1 mm).
나노입자(NP) 및 나노기포(NB)의 활성산소종(ROS) 생성 능력은 RNO(p- nitroso- N,N'-dimethylaniline)을 사용한 블리칭(bleaching) 시험에 의해 정량적으로 평가하였다. NP 및 NB(3 μM의 Ce6)를 1% DMSO, 10 μM RNO 및 1.2 mM L-히스티딘를 함유하는 탈이온수에 용해하고, 이 용액(1 ml)을 수제 아가로스 몰드에 로딩하여 300초 동안 초음파로 조사하였다(전력: 30W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 1 mm). 각 샘플(n = 5)의 RNO의 흡광도는 UV-vis 분광계(Agilent 8453 UV-visible Spectroscopy System, Agilent Technology, 미국)를 사용하여 405 nm에서 측정하였다.
한편, 음파감작제가 포함되지 않아 활성산소종이 생성되지 않는 나노기포(cNB)를 이용한 실험도 상기와 동일하게 진행하였으며, 다만 세포 및 동물실험에 대한 초음파의 노출 시간은 300초로 하되 노출 조건을 달리하였다(전력: 10W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 2 mm).
3. 세포 배양 및 세포성 흡수 이미징
마우스 대장암 세포주(CT26) 및 인간 대장암 세포주(HT29)는 ATCC(MD, 미국)로부터 구입하였고, 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 항생제-항진균제를 함유하는 RPMI1640 배지(Gibco, 미국)에서 37 ℃ 온도에서 CO 2 인큐베이터로 배양하였다. 유리 바닥의 35-pi 세포배양 접시에 1 × 10 5 개의 CT26 세포를 시딩하고, 36시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 6시간 동안 어두운 곳에서 무혈청 RPMI 배지에서 Ce6, 나노입자(NP) 및 나노기포(NB; 100 μM의 Ce6)와 배양하였다. 그 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 2% 파라포름알데하이드 용액으로 고정한 후 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)로 10분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하고, DAPI (청색; λEx = 405 nm, λEm = 450-500 nm) 및 Ce6 (적색; λEx = 633 nm, λEm = 650-730 nm)을 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Leica TCS SP8; Leica Microsystems, 독일)을 사용하여 분석하였다.
한편, 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)를 이용한 실험을 위해, 유리 바닥의 35-pi 세포배양 접시에 1 × 10 5개의 CT26 세포를 시딩하고, 36시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 무혈청 RPMI 배지에서 0.1 mg/mL 농도의 cNP 및 cNB와 6시간 배양하였다. 그 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 2% 파라포름알데하이드 용액으로 고정한 후 DAPI로 10분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하고, DAPI (청색; λEx = 405 nm, λEm = 450-500 nm) 및 Cy5.5 (적색; λEx = 633 nm, λEm = 650-730 nm)을 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Leica TCS SP8; Leica Microsystems)을 사용하여 분석하였다.
4. 세포 생존능(cell viability) 평가
나노입자(NP) 및 나노기포(NB)의 세포 독성은 세포 계수 키트-8(CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., 미국)을 사용한 비색(colorimetric) 분석을 사용하여 평가하였다. 1 × 10 4 개의 CT26 세포를 96-well 플레이트의 각 well에 시딩하고 24시간 동안 배양한 다음, 1 내지 100 μg/ml의 NP 및 NB와 함께 24시간 동안 배양 한 후 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 10% CCK-8 용액이 함유된 배지와 함께 30분 동안 배양하고, 마이크로 플레이트 리더(VERSAmaxTM; Molecular Devices Corp., 미국)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
NP 및 NB를 이용한 초음파 처리 후 세포독성을 측정하였다. 2 × 10 6 개의 CT26 세포를 100-pi 세포배양 접시에서 36시간 동안 배양하고, 추가로 세포를 Ce6, NP 및 NB(10μM의 Ce6)와 함께 6시간 동안 배양한 후 PBS로 2회 세척하였다. 세포에 트립신을 처리하고 10% FBS를 함유하는 500 μl의 RPMI1640 배지로 재현탁시켰다. 200 μl의 세포 현탁액을 아가로스 젤에 로딩한 후 300초 동안 초음파에 노출시켰다(전력: 30W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 1 mm). 이어서, 48-well 플레이트에서 추가로 24시간 동안 배양하고, 세포를 10% CCK-8 용액을 함유하는 배지와 함께 30분 동안 인큐베이한 후, 마이크로 플레이트 리더(VERSAmaxTM)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)를 이용한 실험도 상기와 동일하게 진행하였으며, 다만 세포 및 동물실험에 대한 초음파의 노출 시간을 300초로 하되 노출 조건을 달리하였다(전력: 10W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 2 mm).
5. Annexin V/PI 염색을 이용한 세포 사멸 분석(cell death assay)
100 mm 배양 접시에서 2 × 10 6 개의 CT26 세포를 36시간 동안 배양하였다. 그리고, 세포를 나노입자(NP) 및 나노기포(NB; 10 μM의 Ce6)와 함께 6시간 동안 배양한 후 PBS로 2회 세척하였다. 세포에 트립신을 처리하고 Annexin V 결합 버퍼를 함유하는 500 μl의 1% FBS로 재현탁한 후 200 μl의 세포 현탁액을 아가로스 젤에 로딩한 다음 300초 동안 초음파에 노출시켰다(전력: 30 W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 1 mm). 세포를 1시간 동안 추가로 배양하고 10분 동안 Alexa Fluor™ 488 Annexin V 및 요오드화 프로피디움(propidium iodide; PI)로 염색하였다. 이어서, 200 μl의 세포 현탁액을 유리 바닥의 35-pi 세포 배양 접시에 넣어주고, 이를 5분 후에 PBS로 세척한 후 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Leica TCS SP8; Leica Microsystems, 독일)을 사용하여 즉시 분석하였다. 각각의 형광체(fluorophore)은 다음과 같은 조건으로 관찰하였다: Alexa Fluor™ 488-Annexin V, 녹색, λEx = 488 nm, λEm = 500-550 nm; 요오드화 프로피디움, 적색, λEx = 514 nm, λEm = 590-650 nm.
음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)를 이용한 실험도 상기와 동일하게 진행하였으며, 다만 세포 및 동물실험에 대한 초음파의 노출 시간을 300초로 하되 노출 조건을 달리하였고(전력: 10W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 2 mm), 독소루비신의 처리 농도는 1 μM로 하였다.
6. siRNA 형질주입(transfection)
MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein) 넉다운 세포를 제조하기 위해, CT26 및 HT29 세포를 48시간 동안 리포펙타민 RNAiMAX(Invitrogen, 미국)를 사용하여 30 nM의 항-MLKL siRNA(Bioneer, 대한민국)로 형질감염시켰다. 세포에서 RIPK3 및 MLKL의 발현은 웨스턴 블롯팅에 의해 평가되었다. 1차 항체로서 anti-RIPK3 항체(1 : 500) 및 anti-MLKL 항체(1 : 500)를 처리하고, 2차 항체로서 HPR이 접합된 anti-rabbit IgG(1 : 1000)을 사용하였다.
7. 웨스턴 블롯(Western blot)
150 mm 배양 접시에서 4 × 10 6 개의 CT26 세포를 36 시간 동안 배양하고, 나노입자(NP) 및 나노기포(NB; 10 μM의 Ce6)와 함께 6시간 동안 추가로 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 트립신을 처리하였다. 트립신을 처리한 세포를 10% FBS를 함유하는 500 μl의 RPMI1640 배지로 재현탁시켰다. 200 μl의 세포 현탁액을 아가로스 젤에 로딩한 후 300초 동안 초음파에 노출시켰다(전력: 30W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 1 mm). 초음파 처리된 세포를 추가로 1시간 동안 배양한 다음 상층액을 수확하였다. 수확한 상층액은 탈염 컬럼(Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit-3K, Merck KGaA, 독일)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 두 번 농축하였다. 단백질은 SDS-PAGE 젤(조정배지에서 GAPDH 및 HMGB1의 경우 12%, 카스파제-3의 경우 16%, 세포 펠릿의 HMGB1)을 사용하여 전기영동을 통해 분리되었다. 1차 항체로서 anti-카스파제-3 항체(1 : 1000 및 1 : 500, 9662S 및 9661, Cell Signaling, 미국), anti-HMGB1 항체(1 : 660, ab79823, Abcam, 영국) 및 anti-GAPDH 항체(1 : 1000, sc-32233, 산타 크루즈 바이오 테크놀로지, 미국)를 처리하였다. 2차 항체로는 HRP이 접합된 anti-rabbit IgG(1 : 1000, Invitrogen, 미국)를 사용하였다. 블로팅된 막은 실시간 광학 영상 시스템(LAS-3000; Fuji Photo Film, 일본)을 사용하여 분석하였다.
한편, 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)를 이용한 실험도 상기와 동일하게 진행하였으며, 다만 세포 및 동물실험에 대한 초음파의 노출 시간을 300초로 하되 노출 조건을 달리하였고(전력: 10W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 1 mm), 독소루비신의 처리 농도는 1 μM로 하였다. 1차 항체로는 anti-HSP70 항체(1 : 650), anti-HMGN1 항체(1 : 500), anti-IL-33 항체(1 : 500), anti-GSDME(DFNA5) 항체(1 : 100)을 처리하였다. 2차 항체로는 HRP이 접합된 anti-rat IgG(1 : 1000, invitrogen, 미국)를 처리하였다.
8. 골수 유래 수지상세포(Bone marrow-derived dendritic cell)의 성숙도 평가
골수는 8주령의 BALB/c 마우스로부터 얻었다. 골수 유래 수지상세포(BMDC)는 GM-CSF(20 ng/mL), IL-4(20 ng/mL), 2-머캅토에탄올(50 μM) 및 10%(v/v) FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지로 일주일 동안 골수에서 세포를 배양함으로써 제조하였다. 1 × 10 7 개의 CT26 세포를 나노입자(NP) 또는 나노기포(NB; Ce6의 10 μM)로 처리한 후 300초 동안 초음파를 조사하였다(전력: 30 W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 1 mm). 6시간 경과 후, 3 mL의 CT26 세포 배양 상층액을 6-well 플레이트로 옮기고, 24시간 동안 각각의 well 당 4 × 10 6 개의 BMDC와 함께 배양하였다. 최종적으로, BMDC를 FITC가 접합된 anti-CD86 항체로 1시간 동안 염색하고, 유세포 분석기(Guava EasyCyte, Merck Millipore, 미국)를 사용하여 분석하였다.
9. 인비보(in vivo) 생체분포거동(biodistribution) 분석
모든 동물 실험은 한국과학기술연구원(KIST) 동물실험윤리위원회(IACUC)의 지침에 따라 수행되었다. 나노기포(NB)의 체내 분포는 CT26 종양을 보유한 4주령의 BALB/c 누드 마우스 모델을 사용하여 평가하였다. 구체적으로, 마우스의 측면에 1 × 10 6 개의 세포를 함유하는 CT26 세포 현탁액(100 μL)을 피하 주사하여 종양을 접종하고 14일 동안 종양을 거의 150 mm 3으로 성장시켰다. 나노기포(200 μM의 Ce6)를 마우스의 꼬리에 정맥내 주사하고 실시간 광학 영상 시스템(IVIS Lumina K; PerkinElmer Inc., 미국; λEx = 660 nm, λEm = 710 nm)을 사용하여 24시간 동안 모니터링 하였다. 이어서, 간, 폐, 신장, 비장, 심장 및 종양을 포함한 주요 기관을 수확하고 실시간 광학 영상 시스템을 사용하여 분석하였다.
10. 항종양 생장 시험
4주령 BALB/c 마우스를 사용한 CT26 종양-보유 모델은 마우스의 측면에 1 × 10 6 개의 세포를 함유하는 CT26 세포 현탁액(100 μL)의 피하 주사에 의해 제조되었다. 종양을 8일 동안 거의 60-70 mm 3 부피까지 성장시키고, 실험 목적에 따라 다음의 9개 군으로 분류하였다: i) 식염수, ii) US(초음파), iii) aPD-L1, iv) NP(나노입자), v) NP + US, vi) NP + US + aPD-L1, vii) NB(나노기포), viii) NB + US, ix) NB + US + aPD-L1. NP 및 NB는 3 mg Ce6/kg 용량으로 각각 8, 11 및 14일째에 투여되었다. 투여 후 6시간이 경과된 시점에서 종양에 초음파(시간: 600초, 전력: 10W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 1 mm)를 조사하였고, 추가일 후에 마우스 당 100 μg의 aPD-L1 항체를 주사하였다. 종양의 부피는 최대 직경 × 최소 직경 2 × 0.5로 계산되었다. CIG(Complete inhibition of tumor growth)는 초기 지점보다 작은 종양크기(tumor burdens)로 정의되었다.
한편, 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)를 이용한 실험의 경우에는 실험 목적에 따라 다음의 7개 군으로 분류하였다: i) N.T., ii) DPP4i, iii) DPP4i + aCD170, iv) US(초음파), v) cNB + US, vi) cNB + US + DPP4i, vii) cNB + US + DPP4i + aCD170. cNB는 10 mg/kg의 용량으로 각각 8, 11, 14 및 17일째에 투여되었다. 투여 6시간 후 초음파를 종양에 조사하였다(시간: 100초, 전력: 10W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 주파수: 1 Hz, Y 인터벌: 2 mm). anti-CD170 항체는 각각 7일째, 14일째에 10 μg의 용량으로 투여하였다. DPP4i는 8일째부터 17일째까지 25 mg/kg의 용량으로 매일 투여하였다.
11. 전이성 종양에 대한 항종양 효능 시험
4주령 BALB/c 마우스를 사용한 CT26 종양 보유 모델은 1 × 10 6 개의 CT26 세포를 피하 주사하여 제조하였다. 7일째 되는 날, 전이성 폐암을 유도하기 위해 4 × 10 5 개의 세포를 정맥내 주사하였다. 8일째에, 마우스를 7개의 군으로 나누고 다음과 같이 처리하였다: i) 식염수, ii) NP(나노입자) + US(초음파), iii) NB(나노기포) + US, iv) 식염수 + aPD-L1, v) US + aPD-L1, vi) NP + US + aPD-L1, vii) NB + US + aPD-L1. NP 및 NB를 1 mg Ce6/kg의 용량으로 8, 11 및 14일째 되는 날 종양 보유 마우스에 정맥내 투여하였다. 투여 6시간 후, 초음파를 종양에 조사하였다(시간: 600초, 전력: 10W, 충격 계수: 20%, 펄스 반복 빈도: 1 Hz, Y 인터벌: 1mm). 하루 후, aPD-L1(염수 중의 100 μg)을 각 마우스에 복강내 주사하였다. 종양의 부피는 최대 직경 × 최소 직경 2 × 0.5로 계산되었다. 22일째에, 마우스에서 폐를 적출하고, 15% 인디아 잉크 용액으로 염색한 후 Fekete's solution(70 mL의 EtOH, 10 mL의 포르말린, 5 mL의 아세트산 및 15 mL의 탈이온수)을 사용하여 48시간 동안 고정하였다.
12. 엑스비보 조직학적 분석(ex vivo histology)
22일째 되는 날 마우스의 폐, 비장 및 종양을 적출하고 4% 파라포름알데하이드 용액으로 고정시켰다. 조직을 파라핀에 매립하고, 슬라이드 글라스에서 두께 4 μm의 슬라이스로 절단하였다. CD8 + T 림프구를 관찰하기 위해, 조직을 anti-mouse CD8 alpha-Alexa Fluor™ 488 접합 항체(1 : 200)로 염색하고 DAPI Fluoromount G(SouthernBiotech, 미국)로 마운트하였다. 슬라이드는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Leica TCS SP8)을 사용하여 관찰하였다. 또한, 현미경 슬라이드 스캐너(Aperio CS2; Leica Biosystems, 독일)를 사용하여 H&E(hematoxylin and eosin)으로 염색된 조직 슬라이드를 관찰하였다.
음파 감각제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)를 이용한 실험의 경우, CD80 + 수지상세포 및 CD49b + NK세포(natural killer cell)를 관찰하기 위해, 조직을 FITC anti-mouse CD80 접합항체(1 : 100) 및 FITC anti-mouse CD49b 접합항체(1 : 100)로 염색하였다.
실시예 1. 기체 전구체를 담지한 나노입자의 제조
1.1. 소수성 저분자 물질로서 음파감작제를 포함하는 나노기포(NB)의 제조
본 발명의 기체 전구체를 담지한 PEG-CMD-Ce6 접합체(나노기포; NB)는 3단계 방법을 통해 합성하였다. 합성 경로는 도 2a에 나타내었다. 이하, 각 단계별 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
1.1.1. PEG-CMD 고분자 주쇄의 제조
먼저, 고분자 주쇄인 폴리에틸렌 글라이콜[poly(ethylene glycol); PEG]이 접합된 카복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran; CMD) 유도체를 제조하기 위해, 말단에 아민기를 갖는 메톡시 PEG(mPEG-NH 2)와 CMD의 환원성 아미노화 반응(reductive amination)을 수행하였다.
이를 위하여, 기존에 보고된 방법에 따라 과요오드산 나트륨(NaIO 4)을 사용하여 CMD를 산화시켰다. 구체적으로, 0.013 mmol CMD를 탈이온수(DIW)에 50 mg/mL의 농도로 용해시킨 후, NaIO 4(10 당량)를 상기 용액에 첨가하였다. 반응은 실온 및 어두운 조건에서 3시간 동안 진행하였다. 이어서, 반응 혼합물을 셀룰로스 투석막(MWCO = 12-14 kDa, Spectrum Laboratories, Inc., 미국)을 사용하여 48시간에 걸쳐 증류수로 투석한 후 동결 건조하였다. 다음으로, mPEG-NH 2(0.027 mmol) 및 CMD(0.0053 mmol)를 0.1M 붕산염 버퍼(pH 8.5)에 용해시킨 후 시안화수소화붕소나트륨(sodium cyanoborohydride; 100 당량)을 첨가하였다. 상기 용액을 45 ℃에서 72시간 동안 교반하고, 투석막(MWCO = 6-8 kDa)을 사용하여 3일 동안 증류수로 투석한 후 동결 건조하여 PEG-CMD 고분자 주쇄를 수득하였다. 상기 PEG-CMD의 화학적 구조는 1H NMR(Varian Unity, 500 Mhz; 미국)를 이용하여 확인하였으며(도 2b), PEG의 치환도는 5.38 %로 확인되었다.
1.1.2. 음파감작제(sonosensitizer)의 접합
소수성의 기체 전구체 봉입을 위해 PEG-CMD 고분자 주쇄에 소수성의 음파감작제인 클로린 e6(Chlorin e6; Ce6)를 화학적으로 접합하여 양친성 고분자인 PEG-CMD-Ce6를 합성하였다.
구체적으로, 촉매로서 DCC( N, N'-Dicyclohexylcarbodiimide) 및 DMAP(4-(dimethyl amino) pyridine)의 존재 하에, 에스테르화(esterification) 반응을 이용하여 Ce6을 PEG-CMD에 공유 접합시켰다. Ce6(0.11 mmol), DCC(0.33 mmol) 및 DMAP(0.33 mmol)을 DMSO와 포름아마이드 혼합 용매(1:1, v/v)에 용해한 후 어두운 조건에서 2시간 동안 교반하여 Ce6의 카복시기를 활성화시키고, 동일한 용매 5 ml에 녹아있는 PEG-CMD(0.0063*62.5 mmol)에 상기 Ce6을 포함하고 있는 혼합물을 교반하에 한 방울씩 첨가하여 상온 및 차광 상태에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 일련의 메탄올 및 증류수(1/1, v/v)로 24시간 동안 투석하고, 투석막(MWCO = 6-8 kDa)을 사용하여 추가로 48시간 동안 증류수로 투석함으로써 미반응물을 제거하였다. 정제된 용액을 0.8 μm 주사기 필터로 여과하고 동결 건조하여 녹색 분말의 PEG-CMD-Ce6를 수득하였다.
상기 PEG-CMD-Ce6는 1H NMR를 이용하여 화학적 구조 분석을 실시하였고(도 2c), UV-Vis 분광계를 이용하여 고분자에 접합된 Ce6의 치환도(8.8%, w/w)를 계산하였다.
1.1.3. 기체 전구체(gas precursor)의 봉입
기체 전구체를 담지한 나노입자(나노기포; NB)를 제조하기 위하여, 기체 전구체인 과불화펜탄(perfluoropentane; PFP)을 에멀젼 방법을 사용하여 PEG-CMD-Ce6 기반 자가조립체의 소수성 중심부에 봉입하였다.
구체적으로, 탈이온수에 양친성 나노입자(PEG-CMD-Ce6)를 2 mg/ml의 농도로 용해하고, 0.8 ㎛ 크기의 일회용 필터를 사용하여 여과하였다. 상기 양친성 나노입자 용액은 얼음 수조 상에서 냉각한 후 20 μl의 PFP(2%, v/v)와 혼합하였다. 그리고 프로브형 초음파기(VCX750, Cole-Palmer, 미국)를 사용하여 초음파를 처리(21% 분말, 충격 계수 16.7%, 90초)함으로써 에멀전 형태의 나노기포를 제조하였다. 이후 실험에서는 PFP가 봉입되지 않은 PEG-CMD-Ce6 기반 나노입자(nanoparticles, NP)를 대조군으로 사용하였다. 나노입자(NP) 및 나노기포(NB)의 유체역학적 크기 및 분포는 동적 광산란 시스템(Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, 미국)을 사용하여 635 nm에서 측정되었으며, 형태는 투과전자현미경(TEM; Talos F200X; FEI Company, 미국)을 사용하여 관찰하였다. 모든 샘플은 음성 염색된 현미경 이미지를 위해 우라닐 아세테이트(1% in DIW)로 처리하였다.
1.2. 소수성 저분자 물질로서 담즙산 유도체를 포함하는 나노기포(cNB)의 제조
본 발명의 다른 구현예로서, 공동효과에 의한 물리적 세포사멸 유도능력 평가를 위해 음파감작제가 포함되지 않은, 기체 전구체를 담지한 CMD-CA 접합체(cNB)를 3단계 방법을 통해 합성하였다. 합성 경로는 도 2d에 나타내었다. cNB는 이하, 각 단계별 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
1.2.1. 아민기를 갖는 5β-콜란산(aminated 5β-cholanic acid) 유도체의 제조
먼저, 소수성 분자인 5β콜란산의 아민기 유도체를 제조하기 위해 에틸렌다이아민(ethylenediamine)을 접합하여 환원반응을 수행하였다. 구체적으로, 5β콜란산(100 mg), EDC(110 mg) 및 NHS(90 mg)를 DMF에 20 mg/mL의 농도로 용해시킨 뒤, 질소하에 4시간 동안 반응을 진행하였다. 이어 1.6 mL의 에틸렌다이아민과 10 mL의 DMF를 첨가한 뒤 24시간 동안 교반하고, 차가운 탈이온수 상에서 침전하여 미색의 생성물을 수득하였다.
1.2.2. 카복시메틸 덱스트란 및 5β-콜란산 유도체의 접합
음파감작제를 함유하지 않는 자가조립체 나노입자(cNP)를 제조하기 위해, 카복시메틸 덱스트란 고분자 주쇄에 아민기를 갖는 5β-콜란산 유도체를 화학적으로 접합하였다. 구체적으로, 촉매로서 EDC 및 NHS 존재하에 아마이드화(amidation) 반응을 이용하여, 아민기를 갖는 5β-콜란산 유도체를 카복시메틸 덱스트란에 공유 접합시켰다. 100 mg의 카복시메틸 덱스트란은 20 mg/mL의 농도로 포름아마이드에 용해시킨 뒤, DMF에 용해된 EDC 및 NHS를 첨가하여 6시간 동안 반응을 진행하였다. 이어, 카복시메틸 덱스트란의 총 카복시기 수의 0.1 당량의 아민기를 갖는 5β콜란산 유도체를 첨가하고 24시간 동안 교반하였다. 반응용액을 일련의 DMSO 및 증류수로 24시간 동안 투석하고, 투석막(MWCO = 6-8 kDa)을 사용하여 추가로 48시간 동안 증류수로 투석함으로써 미반응물을 제거하였다. 정제된 용액을 0.8 μm 주사기 필터로 여과하고 동결 건조하여 백색 분말의 cNP를 수득하였다.
상기 cNP는 1H-NMR을 이용하여 구조 분석을 실시하였고(도 2e), 고분자에 접합된 아민기를 갖는 5β콜란산 유도체는 6.04%의 치환도를 가지는 것으로 확인되었다.
1.2.3. 기체 전구체(gas precursor)의 봉입
음파감작제가 함유되지 않은 나노기포(cNB)를 제조하기 위하여, 기체 전구체인 과불화헥산(perfluorohexane; PFH)을 에멀젼 방법을 사용하여 cNP(CMD-CA) 기반 자가조립체의 소수성 중심부에 봉입하였다. 구체적으로, 탈이온수에 양친성 나노입자(cNP)를 2 mg/ml의 농도로 용해하고, 0.8 μm 크기의 일회용 필터를 사용하여 여과하였다. 상기 양친성 나노입자 용액은 얼음 수조 상에서 냉각한 후 20 μl의 PFH(2%, v/v)와 혼합하였다. 그리고 프로브형 초음파기(VCX750, Cole-Palmer, 미국)를 사용하여 초음파를 처리(21% 분말, 충격 계수 16.7%, 90초)함으로써 에멀전 형태의 나노기포를 제조하였다.
실시예 2. 각 나노기포(NB 및 cNB)의 물리화학적 특성 분석
2.1. 음파감작제를 포함하는 나노기포(NB)의 물리화학적 특성
본 발명에 따른 양친성 고분자 기반 나노입자(NP)의 화학적 구조 분석은 1H NMR (500 MHz, Varian INOVA, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 그 결과는 도 2b 및 도 2c에 나타내었다. 상기 양친성 고분자는 친수성의 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol; PEG)과 다당류 고분자 및 소수성의 저분자 물질(광감작제, 음파감작제, 담즙산 유도체 등)을 포함할 수 있는데, 본 실시예에서는 PEG와 다당류 고분자인 CMD(carboxymethyl dextran) 및 음파감작제인 Ce6(chlorin e6)로 구성하였다. 또한, 상기 양친성 고분자 기반 나노입자는 소수성 중심부에 과불화탄소(perfluorocarbon) 계열의 기체 전구체를 포함할 수 있고, 본 실시예에서는 과불화펜탄(perfluoropentane, PFP)을 사용하였다.
상기 실시예 1.1에서 제조한 양친성 고분자 기반의 나노입자(NP; PFP를 담지하지 않은 PEG-CMD-Ce6)와 나노기포(NB; PFP를 담지한 PEG-CMD-Ce6)의 특성을 평가하기 위해, 제타사이저(Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, 영국) 및 투과전자현미경(Transmission electron microscopy; Talos F200X; FEI Company, 미국)을 사용하여 입자의 형태, 크기 분포, 및 표면전하를 측정하였다.
각 실험군의 입자 크기 및 표면 전하는 하기 표 1에 나타내었다.
시료 크기 (nm) 표면전하 (Zeta potential, ζ)
NP 142.3 ± 29.4 -33.8 ±7.2 mV
NB 232.8 ± 75.1 -54.1 ± 6.7 mV
도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, 나노입자(NP, 대조군) 및 나노기포(NB)는 각각 약 142.3 ± 29.4 nm 및 232.8 ± 75.1 nm의 반경을 갖는 구형으로 나타나, NB는 NP에 기체 전구체 PFP가 봉입됨에 따라 팽창함을 확인하였다. 또한, 도 3c에 나타난 바와 같이, 음파감작제인 Ce6가 모든 실험군에서 유사한 세포 내 흡수 거동을 보임이 관찰되었다(파란색, 세포 핵; 붉은색, Ce6). 특히, 세포에 내재화 될 때까지 PFP가 NB의 소수성 코어에 안정적으로 유지됨을 확인하였으며, 이는 NB가 음향 공동화(acoustic cavitation)에 반응하여 세포막을 투과할 수 있음을 암시하는 결과이다.
2.2. 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)의 물리화학적 특성
상기 실시예 1.2에서 제조된 cNB의 유체역학적 크기 및 분포는 동적 광산란 시스템(Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, 미국)을 사용하여 635 nm에서 측정되었으며, 형태는 투과전자현미경(TEM; Talos F200X; FEI Company, 미국)을 사용하여 관찰하였다. 모든 샘플은 음성 염색된 현미경 이미지를 위해 우라닐 아세테이트(1% in DIW)로 처리하였다.
그 결과 도 3g에 나타난 바와 같이, cNB는 200 nm 가량의 반경을 가지는 구형의 형상을 가지는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 도 3h에 나타난 바와 같이, cNP는 약 119.44 ± 9.31 nm 및 225.78 ± 25.1 nm의 반경을 가지는 것으로 측정되었다. 또한, 도 3i에 나타난 바와 같이, cNB는 세포에 내재화될 때까지 PFH가 소수성 코어에 안정적으로 유지되어 기포상태로 전달됨을 확인하였으며, 이는 cNB가 음향 공동화에 반응하여 세포막을 파열할 수 있음을 암시하는 결과이다.
실시예 3. 각 나노기포(NB 및 cNB)의 세포 독성 및 세포사멸 유도능 평가
3.1. 음파감작제를 포함하는 나노기포(NB)의 세포 독성 및 세포사멸 유도능
음파감작제를 포함하는 나노기포(NB)의 세포독성은 대장암 세포주 CT26(colon carcinoma)에서 평가하였다. 먼저, 96-well 플레이트에 1×10 4 cells/well의 밀도로 시딩(seeding)한 후 36시간 동안 배양하였다. 이후 제조된 나노기포를 다양한 농도(1-100 μg/ml)로 처리한 후 24시간 후에 CCK-8 분석법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다(구체적인 방법은 상기 실험 재료 및 방법 참조).
그 결과 도 3d에 나타난 바와 같이, 초음파를 조사하지 않는 조건에서는 나노입자(NP) 및 나노기포(NB) 모두 CT26 세포에 대한 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
다음으로, 나노기포의 초음파 감응 세포사멸 유도능을 평가하기 위하여, 2×10 6 개의 CT26 세포를 100-pi 디쉬에서 36시간 동안 배양하고, 일정 농도의 Ce6 (10 μM Ce6)를 함유하는 나노입자 및 나노기포를 6시간 동안 처리한 후, 300초 동안 동일한 조건으로 초음파를 조사하였다. 초음파 조사 이후 48-well 플레이트에 세포를 재분산 시켜 24시간 동안 추가 배양을 진행하고, CCK-8 분석법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
그 결과 도 3e 및 3f에 나타난 바와 같이, 양친성 고분자 내의 Ce6에 의하여 초음파 조사 시에만 선택적으로 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)이 발생하며(도 3e), 이에 의하여 세포 독성이 증가함을 알 수 있었다(도 3f). 특히, 동량의 Ce6를 처리한 경우와 비교하여 나노기포(NB)는 활성산소종 발생량이 감소하였음에도 불구하고(도 3e), 초음파 조사 시 기포 발생에 의한 세포독성이 향상되는 거동을 나타내었는바(도 3f), 이는 나노기포(NB)의 네크롭토시스 유발 음향 공동화에 의해 세포사멸 유도능이 향상된 것임을 증명한 것이다.
3.2. 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)의 세포 독성 및 세포사멸 유도능
음파감작제가 포함되지 않은 나노입자(cNP) 및 나노기포(cNB)의 세포 독성은 상기 “실험 재료 및 방법”의 목차 4에서 서술한 바와 같이 수행되었다.
그 결과, 도 3j에 나타난 바와 같이 초음파를 조사하지 않는 조건에서는 cNB를 함유한 RPMI 배양액상에서 CT26의 세포 생존율은 미처리군 대비 89.5 ± 18.65%로 유의한 감소가 나타나지 않았으나, 초음파 조사 시(cNB+US) 공동현상에 의한 세포독성이 발생하여 세포의 생존율이 66.5 ± 3.73%로 감소하는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 각 나노기포(NB 및 cNB)의 네크롭토시스 유사 세포사멸 유도능 확인
4.1. 음파감작제를 포함하는 나노기포(NB)의 네크롭토시스 유사 세포사멸 유도능
음파감작제 포함 나노기포의 세포사멸 기전을 검증하기 위하여, Annexin V/PI 염색 후 공초점 현미경을 통하여 세포의 형상을 관찰하였다. 구체적으로, 2×10 6 개의 RIPK-3 결핍 CT26 대장암 세포주를 100-pi 디쉬에서 36시간 동안 배양한 후, 나노입자(NP) 또는 나노기포(NB)를 6시간 동안 처리하였다. 이 후, 500 μl의 Annexin V 결합 버퍼에 재분산하여 수제 아가로스 젤(agarose gel)에 넣고 초음파를 조사하여 추가적으로 1시간 동안 배양하였다. 세포를 Alexa FluorTM 488 Annexin V 및 PI(propidium iodide)로 염색한 뒤 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 4a에 나타난 바와 같이, 초음파 조사 자체로는 세포에 독성이 나타나지 않음을 확인하였으며, 나노입자(NP)를 처리한 세포에서는 아폽토시스(apoptosis)의 특성(세포의 염색질 응축 및 포스파티딜 세린의 외부화)이 관찰된 반면, 나노기포(NB)를 처리한 세포에서는 세포막 파열에 의한 세포 형태의 손상이 관찰되었다. 즉, 나노기포(NB)를 처리하고 초음파를 조사한 경우 세포막의 붕괴에 의한 염색질, 세포질 성분 및 막 단편의 누출이 관찰되었으며, 이는 네크롭토시스에 의한 세포사멸과 매우 유사한 거동이다. 흥미롭게도, RIPK3 및 MLKL 발현에 관계없이, 세포는 NB로 처리하고 초음파가 조사될 때 네크롭토시스의 형태학적 특징을 나타내었고(도 4b), 이러한 결과는 세포의 네크롭토시스가 RIPK3/MLKL-독립적 방식으로 발생했음을 시사하는 것이다.
4.2. 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)의 네크롭토시스 유사 세포사멸 유도능
다음으로, 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)를 처리한 경우의 세포사멸 유도능을 조사하였다.
먼저, 도 4f에 나타난 바와 같이 초음파 조사 자체로는 세포에 독성이 나타나지 않음을 확인하였으며, 독소루비신(DOX)를 처리한 세포에서는 아폽토시스(apoptosis)의 특성(세포의 염색질 응축 및 포스파티딜 세린의 외부화)이 관찰되었다. 이와 비교하여, 나노기포(cNB)를 처리한 세포에서는 세포막 파열에 의한 세포 형태의 손상이 관찰되었다. 즉, 나노기포에서 나타나는 네크롭토시스에 의한 세포사멸은 활성 산소종와 무관하게 초음파에 의한 공동현상으로 일어남을 뒷받침하는 것이다.
또한, 도 4b의 결과와 같이 상기 실시예 4.1의 나노기포(NB)와 마찬가지로, 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)에서도 RIPK3 및 MLKL 발현에 관계없이 세포의 네크롭토시스가 RIPK3/MLKL-독립적 방식으로 발생할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. DAMP 유출 거동 평가 및 수지상세포 성숙도 평가
5.1. DAMP(damage-associated molecular pattern) 유출 거동 평가
아폽토시스(apoptosis)와는 다르게 네크롭토시스(necroptosis)는 세포로부터 온전한 DAMP의 방출을 유발하며, 따라서 수지상세포의 성숙 및 활성화를 효과적으로 매개한다. 이에, 본 발명자들은 각 나노기포(NB 또는 cNB) 매개 네크롭토시스 유사 세포사멸을 통한 면역원성 DAMP의 유출을 검증하기 위해, 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용하여 DAMP 단백질의 유출양을 확인하였다. 구체적으로, CT26 세포를 4×10 6 cell/dish의 밀도로 150-pi 디쉬에서 36시간 동안 배양한 뒤, 나노기포(NB)가 포함된 배양액으로 교체하여 추가로 6시간 배양하였다. 세포를 분리시킨 후, 수제 아가로스 젤에 넣고 초음파를 조사하여 추가적으로 1시간 동안 배양하였다. 이후, 세포와 배양액을 각각 추출하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하여 단백질을 크기 별로 분리하고, NB의 경우는 anti-GAPDH, anti-HMGB1, anti-카스파제-3 항체를, cNB의 경우는 anti-HSP70, anti-HMGN1, anti-IL-33, anti-GSDME(DFNA5) 항체를 통하여 각 단백질을 염색하여 화학발광영상(LAS-3000; Fuji Photo Film, 일본)을 통해 관찰하였다. 방출된 DAMP 중 HMGB1(High mobility group box 1)은 산화-환원 상태에 따라 면역학적으로 다른 기능을 갖는다고 알려져 있으며, 따라서 HMGB1은 네크롭토시스에 대한 대표적인 마커로 여겨진다.
먼저, 음파감작제를 포함하는 나노기포(NB)는 도 4c 및 도 4d에 나타난 바와 같이, 나노입자(NP)를 처리하고 초음파를 조사한 경우(NP+US)에는 아폽토시스(apoptosis)의 특징인 cleaved caspase-3의 발현이 증가되고 HMGB1 단백질이 산화된 형태(oxHMGB1)로 존재함이 확인되었다. 반면에 나노기포(NB)를 처리하고 초음파를 조사한 경우(NB+US)에는 cleaved caspase-3의 발현 수준이 나노입자(NP) 처리군과 비교하여 현저하게 감소하였으며, HMGB1이 산화되지 않은 형태로 존재하는 것으로 관찰되어 네크롭토시스와 같은 특징이 나타남을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 나노기포(NB)의 초음파 감응 네크롭토시스 유사 세포사멸의 유도능을 뒷받침하는 것이다.
추가적으로, 기존 아폽토시스와 공동현상에 의한 네크롭토시스에서 나타나는 DAMP 단백질의 발현 종류와 유출양을 확인하였다. 그 결과, 도 4h에서 나타난 바와 같이, 독소루비신을 통해 아폽토시스를 유도한 CT26 세포의 경우 수지상세포의 성숙을 유도하는 HMGB1과 HSP70의 방출이 관찰되었다. 이와 유사하게, 음파감작제를 포함하지 않은 나노기포(cNB)와 초음파를 처리한 CT26 세포의 경우 HMGB1과 HSP70의 방출이 관찰되었으며, 방출된 단백질의 양은 현저하게 증가함을 확인하였다. 반면, 백혈구의 화학주성을 유도하는 DAMP인 HMGN1, 자연살해 세포의 활성화를 유도하는 DAMP인 GSDME 및 호산구의 활성화를 유도하는 DAMP인 IL-33의 경우 독소루비신을 통해 아폽토시스를 유도한 CT26 세포에서는 유출이 되지 않았으며, 나노기포와 초음파를 처리한 CT26 세포에서만 특이적으로 유출이 됨을 확인하였다. 이러한 결과는 나노기포와 초음파의 공동현상을 통해 유도하는 네크롭토시스의 경우, 기존의 수지상세포의 활성화만 관여가 가능한 아폽토시스와는 다르게 NK세포와 호산구의 활성화를 유도하여 더욱 효과적으로 항암 면역반응을 유도할 수 있음을 시사하는 것이다.
5.2. 수지상세포의 성숙도 평가
상기 실시예의 실험에서 추출한 초음파 조사 이후의 CT26 배양액을 골수 유래 수지상세포(bone marrow-derived dendritic cells)에 24시간 동안 처리한 다음, FITC-anti-CD86을 표지하여 유세포분석을 수행하였다. CD86은 수지상세포에 발현되는 대표적인 공동자극분자(costimulatory molecules)로서, 이의 발현 수준을 통하여 수지상세포의 성숙 정도를 판단할 수 있다.
그 결과 도 4e에 나타난 바와 같이, 나노기포(NB)를 처리하고 초음파를 조사한 군에서 추출한 세포배양액은, 아무것도 처리하지 않은 대조군 또는 나노입자(NP)를 처리하고 초음파를 조사한 군과 비교하여 각각 1.52배 및 1.16배 높은 양의 CD86 발현이 유도됨을 확인하였다. 이는 세포막 파열에 따른 네크롭토시스 유사 세포사멸에 의하여 DAMP 및 종양 관련 항원이 산화되지 않고 높은 효율로 수지상세포의 성숙을 유도하는 것에 기인한 것으로 사료된다.
상기 결과들을 종합하면, 나노기포(NB)를 이용하여 RIPK3/MLKL 비의존적 네크롭토시스 유사 세포사멸을 유도할 수 있으며, 이 경우 다량의 HMGB1이 손상 없이 방출되어 면역세포인 수지상세포의 성숙을 효과적으로 유도함을 증명한 것이다. 따라서 상기와 같은 네크롭토시스 유사 세포사멸은 높은 면역원성을 가짐에 따라 항암 면역치료와의 병용치료 가능성을 시사하는 것이다.
실시예 6. 나노기포(NB)의 종양 축적 거동 확인
상기 실시예 5를 통해 나노기포(NB)의 RIPK3 독립적인 네크롭토시스 및 수지상세포의 성숙을 이끌어내는 능력을 입증한 후, 본 발명자들은 종양 보유 마우스에 NB를 전신 투여(systemic administraion)한 후 광학 이미징 기술을 사용하여 NB의 종양 축적 거동을 평가하였다.
그 결과 도 5a에 나타난 바와 같이, 시험한 전체 기간 동안 살아있는 마우스의 종양에서 강한 형광 신호가 관찰되었다. 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이 투여 24시간 후 적출된 조직의 생체외 이미지는 종양 조직에서 가장 강한 형광 신호를 나타내었고, 이는 NB의 높은 종양 표적화 효율을 보여주는 것이다(도 5b 상단). 정량적으로, 종양 조직에서의 형광 강도는 간 및 폐의 형광 강도보다 각각 2.74배 및 5.66배 높았다(도 5b 하단). 종합하면, 이러한 결과는 NB가 수동적 표적화 기작(passive targeting mechanism)에 의해 효과적으로 종양에 도달할 수 있음을 밝혀낸 것이다.
실시예 7. 동물모델을 이용한 각 나노기포(NB 및 cNB)의 암 치료 효능 및 전이 억제능 평가
7.1. 암 동물모델에서 나노기포(NB)의 항암 효과 및 병용치료 효과 확인
암 동물모델에서 음파감작제를 포함하는 나노기포(NB)의 치료 효능을 평가하기 위해, 상기 시험관 수준의 검증 실험에서 사용하였던 CT26 세포주(1 × 10 6 개)를 마우스의 피하에 이식함으로써 암 동물모델을 제조하였다. 상기 동물모델에 본 발명에 따른 나노기포(NB)를 3mg Ce6/kg의 투여량으로 정맥주사(intravenous injection) 하였으며, 대조군은 생리식염수 및 나노입자(NP)를 투여하였다. 그 후 초음파 조사 유무에 따른 치료 효능을 평가하였다. 투여 일정 및 초음파 조사 시점은 도 6a에 나타내었다.
그 결과 도 6b 내지 6d에 나타난 바와 같이, 초음파를 조사한 나노기포 처리군(NB+US)의 경우 생리식염수 처리군(Saline 또는 US)에 비하여 종양의 부피가 88.3% 감소되는 것으로 나타났다.
또한, 병용치료 가능성을 확인하기 위하여 대표적인 면역관문 억제제인 anti-PD-L1 항체를 함께 투여하여 치료 효능을 비교한 결과, 도 6b 내지 도 6d에 나타난 바와 같이, 나노기포(NB) 및 anti-PD-L1을 병용 투여하고 초음파를 조사한 경우 40%의 완전관해(complete remission)가 관찰되었으며, 적출한 암 조직의 무게가 anti-PD-L1 단독투여군과 비교하여 97.03% 감소하는 것으로 나타나, 병용 투여시 항암 효과가 더욱 극대화됨을 확인하였다.
7.2. 전이암 동물모델에서 나노기포(NB)의 암 전이 억제 효과 확인
본 발명에 따른 음파감작제 포함 나노기포(NB)의 암 전이 억제 효과를 확인하기 위해, CT26 세포주를 마우스의 피하에 이식한 후, 추가적으로 CT26 세포주를 정맥주사하여 폐전이 암 동물모델을 제조하여, 인디아 잉크 염색법(india ink staining)을 통해 암 전이 억제능을 평가하였다. 투여 일정 및 초음파 조사 시점은 도 7a에 나타내었다.
그 결과 나노기포(NB)와 anti-PD-L1을 병용 투여하고 초음파를 조사한 군(NB+US+aPDL1)에서 암의 성장이 현저하게 억제됨을 확인하였으며(도 7b 내지 도 7d 참조). 면역형광염색법으로 암 조직 내의 CD8 + 세포를 확인하였을 때 NB+US+aPDL1 군에서 월등히 많은 CD8 + T 세포가 분포하고 있음을 확인하였다(도 7e 참조).
또한, 도 7f 및 도 7g에 나타난 바와 같이, H&E 염색 및 인디아 잉크 염색을 실시한 결과 NB+US+aPDL1 군에서 대조군과 비교하여 폐로의 암 전이가 현저하게 억제됨을 확인하였다.
더불어 비장(spleen)을 적출하여 H&E 염색을 통해 림프증식증(lymphoid hyperplasia)과 같은 부작용이 나타나는지 여부를 조사해 본 결과, 도 7h에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 NB+US+aPDL1 군에서는 부작용이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통하여 기체 전구체를 함유한 음파감작제 함유 나노기포가 초음파 자극 하에서 선택적으로 네크롭토시스 유사 세포사멸을 유발함으로써, 효율적으로 종양 억제 및 항암 면역반응을 유도할 수 있음을 증명한 것이며, 이에 따라 다양한 병용치료 기술 개발이 가능할 것으로 기대된다.
7.3. 암 동물모델에서 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)의 항암 효과 및 병용치료 효과 확인
암 동물모델에서 나노기포와 공동현상에 의한 치료 효능을 평가하기 위하여, 음파감각제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)를 투여한 뒤 종양 성장 억제효능을 평가하였다. 상기 시험관 수준의 검증 실험에서 사용하였던 CT26 세포주(1 × 10 6개)를 마우스의 피하에 이식함으로써 암 동물모델을 제조하였다. 상기 동물모델에 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)를 10 mg/kg의 투여량으로 정맥주사(intravenous injection) 하였다. 그 후 초음파 조사 유무에 따른 치료 효능을 평가하였으며, 호산구와 NK세포에 의한 항암 면역치료 효능을 평가하기 위하여 호산구의 활동을 저해하는 DPP4(Dipeptidyl peptidase 4)의 억제제(DPP4i) 중 하나인 시타글립틴(sitagliptin)을 cNB와 병용 투여하였다. 투여 일정 및 초음파 조사 시점은 도 8a에 나타내었다.
그 결과, 도 8b 및 8c에 나타난 바와 같이 음파감작제가 포함되지 않은 나노기포(cNB)에 초음파를 조사한 군의 경우, 대조군에 비하여 종양의 부피가 24.3 ± 11.1% 감소되는 것으로 나타났다. 또한, 호산구와 NK세포를 통한 항암 면역 효과를 확인하기 위하여, 종양 내에서 DPP4i인 시타글립틴을 함께 투여하여 치료 효능을 비교한 결과, 종양의 부피가 70.4 ± 26.9% 감소되고, 적출한 암 조직의 무게가 76.3 ± 25.7% 감소하는 것으로 나타나 병용 치료 시 항암 효과가 더욱 극대화됨을 확인하였다(도 8b 및 도 8c의 좌측 그래프). 반면, 호산구를 억제하는 항체(aCD170)를 처리한 경우, DPP4의 억제제와의 병용 시 나타나는 항암 효과가 사라짐을 확인하였다(도 8c의 좌측 그래프). 따라서 나노기포와 초음파의 공동현상에 의해 유도되는 네크롭토시스 유사 세포사멸의 경우, 종양 내에서 호산구의 활성화를 유도하고 이로 인한 항암 면역반응을 수반하는 것으로 사료된다.
더불어, 종양 유래 사이토카인 및 유출된 표류성 암 세포에 의한 비장 비대증의 관찰을 위해 비장(spleen)을 적출하여 무게를 측정한 결과, 대조군 대비 나노기포에 초음파를 조사 및 DPP4 억제제를 병용 투여한 경우(cNB+US+DPP4i 군) 약 33.8 ± 21.7% 감소한 것을 확인하였다(도 8c의 우측 그래프). 이와 비교하여, 이외의 군에서는 비장의 무게에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 상기 결과는 나노기포(cNB)에 초음파 조사 및 DPP4 억제제를 병용 투여한 경우, 호산구의 항암 면역반응에 의해 혈류로 유출되는 암 세포와 종양 유래 사이토카인이 억제됨에 따른 것으로 사료된다.
추가적으로, 면역형광염색법에 의해 암 조직 내의 CD80 + 수지상세포를 확인하였을 때, 효과적으로 HMGB1이 유출될 수 있는 나노기포에 초음파를 조사한 모든 군에서 유의적으로 높은 CD80 + 수지상세포의 형광이 관찰되었다(도 8d). 반면, 호산구에 의해 유도되는 CD49b + NK세포의 경우 나노기포에 초음파를 조사한 군(cNB+US) 및 나노기포에 초음파 조사 및 DPP4 억제제를 병용 투여한 군(cNB+US+DPP4i)에서 높은 형광을 나타내었으나, 호산구를 억제하는 항체를 처리한 경우(cNB+US+DPP4i+aCD170) 형광의 세기가 현저히 감소됨을 확인하였다(도 8d). 이는 나노기포와 초음파의 공동현상을 통한 네크롭토시스 유사 세포사멸이 효과적인 수지상세포 활성화뿐만 아니라 호산구 활성화를 통한 NK세포의 활성화가 가능함을 뒷받침하는 것이다.
상기의 결과를 통하여 기체 전구체를 함유한 담즙산 유도체 기반 나노기포가 초음파 자극하에서 선택적으로 네크롭토시스 유사 세포사멸을 유발하고, 이로써 효율적인 종양 억제 및 항암 면역반응을 유도할 수 있음을 증명한 것이다. 이는 기존의 아폽토시스에서 나타나는 수지상세포의 활성화와 더불어 호산구 및 NK세포의 활성화를 통해 더욱 효과적인 항암 면역반응이 유도되는 것에 기인한 것으로 사료된다. 이에 따라, 다양한 병용 치료 기술의 개발이 가능할 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 기체 전구체를 담지한 나노입자, 즉 나노기포(Nanobubble, NB 또는 cNB)는 초음파 조사에 의해 종양 부위 선택적으로 네크롭토시스 유사 세포사멸 유도가 가능하며, 따라서 RIPK3 및 MLKL의 발현이 억제되어 있는 종양의 치료에도 활용이 가능하다. 또한, 기존의 항암 치료를 활용한 면역원성 세포사멸보다 강력한 면역원성을 유발할 수 있으므로, 이를 이용한 항암 병용치료 기술에 널리 적용될 수 있어 산업상 이용 가치가 클 것으로 예상된다.

Claims (27)

  1. 생체적합성의 다당류 고분자 물질 및 상기 고분자 물질에 접합되는 소수성의 저분자 물질을 포함하는 나노입자(nanoparticle); 및
    상기 나노입자에 담지되고, 초음파에 감응하여 기화되는 기체 전구체(gas precursor)를 포함하는, 나노기포(nanobubble).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노기포는 상기 고분자 물질에 폴리에틸렌 글라이콜[poly(ethylene glycol)]이 더 결합된 것인, 나노기포.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 물질은 카복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 마난(mannan), 덱스트란 설페이트(dextran Sulfate), α-사이클로덱스트린(cyclodextrin), β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginate), 글리코겐(glycogen), 아밀로오스(amylose), 베타글루칸(β-glucan), 하이드록시에틸 셀룰로오스(hydroxyethylcellulose), 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 후코이단(fucoidan), 콘드로이틴(chondroitin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 나노기포.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 저분자 물질은 음파감작제, 광감작제, 담즙산 유도체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 나노기포.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 음파감작제 또는 광감작제는 감작(sensitization) 시 활성산소종을 방출하는 것인, 나노기포.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 음파감작제는 클로린(chlorin) e6, 벤조클로린(benzochlorin), 메틸렌 블루(methylene blue), 톨루이딘 블루(toluidine blue), 로즈 벤갈(Rose Bengal), 포토프린(Photofrin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 나프탈로시아닌(napthalocyanine), 인도시아닌 그린(indocyanine green), BODIPY(boron-dipyrromethene), 페오포르바이드 A(pheophorbide A), 베르딘(verdin), 헤마토포르피린(hematoporphyrin), 프로토포르피린(protoporphyrin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 나노기포.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 광감작제는 클로린 e6, 포토디타진, 라다클로린(Radachlorin), 2-(1-헥실에틸)-2-디비닐피로페오포르비드-α(HPPH)[2-(1-hexylethyl)-2-devinylpyropheophorbide-α(HPPH)], 프탈로시아닌(ZnPc, Zinc Phthalocyanine), 피오포바이드 a(Pheophorbide a) 화합물, 포르피린(phorphyrins) 화합물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 나노기포.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 저분자 물질이 담즙산 유도체인 경우 상기 나노기포는 초음파 처리에 의해 호산구 및 NK세포(natural killer cell)의 활성화를 유도하는 것인, 나노기포.
  9. 제4항에 있어서,
    상기 담즙산 유도체는 아미노화 5β-콜란산(aminated 5β-cholanic acid), 5β-콜란산(5β-cholanic acid), 콜산(cholic acid), 디옥시콜산(deoxycholic acid), 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 리토콜산(lithocholic acid), 우르소콜산(ursocholic acid), 우르소디옥시콜산(ursodeoxycholic acid), 이소우르소디옥시콜산(isoursodeoxycholic acid), 라고디옥시콜산(lagodeoxycholic acid), 글리코콜산(glycocholic acid), 글리코디옥시콜산(glycodeoxycholic acid), 글리코케노디옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 디하이드로콜산(dehydrocholic acid), 히오콜산 (hyocholic acid), 히오디옥시콜산(hyodeoxycholic acid) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 나노기포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 아미노화 5β-콜란산은 하기 (i) 내지 (iv) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 나노기포:
    (i) ( R)- N-(2-아미노에틸)-4-((5 S,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-10,13-다이메틸헥사데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-17-일)펜탄아마이드 (( R)- N-(2-aminoethyl)-4-((5 S,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-10,13-dimethylhexadecahydro-1 H-cyclopenta[ a]phenanthren-17-yl)pentanamide);
    (ii) (3 S,8 S,9 S,10 R,13 R,14 S,17 R)-10,13-다이메틸-17-[(2 R)-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-3-아민 ((3 S,8 S,9 S,10 R,13 R,14 S,17 R)-10,13-dimethyl-17-[(2 R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1 H-cyclopenta[a]phenanthren-3-amine);
    (iii) N-(아미노메틸)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,12 S,13 R,14 S,17 R)-3,12-다이하이드록시-10,13-다이메틸헥사데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-17-일)펜탄아마이드 ( N-(aminomethyl)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,12 S,13 R,14 S,17 R)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethylhexadecahydro-1 H-cyclopenta[ a]phenanthren-17-yl)pentanamide); 및
    (iv) ( S)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-3-아미노-10,13-다이메틸헥사데카하이드로-1 H-사이클로펜타[ a]페난트렌-17-일)펜타노익 애시드 (( S)-4-((3 R,5 R,8 R,9 S,10 S,13 R,14 S,17 R)-3-amino-10,13-dimethylhexadecahydro-1 H-cyclopenta[ a]phenanthren-17-yl)pentanoic acid).
  11. 제1항에 있어서,
    상기 기체 전구체는 과불화탄소 계열인 것인, 나노기포.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 과불화탄소는 과불화펜탄(perfluoropentane: PFP), 과불화메틸펜탄 (perfluoro(2-methylpentane)), 과불화헥산(perfluorohexane: PFH), 과불화메틸사이클로헥산(perfluoromethylcyclohexane: PFmH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 나노기포.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 나노기포는 종양에서 초음파 조사에 의해 네크롭토시스(necroptosis) 유사 세포사멸을 유도하는 것인, 나노기포.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 네크롭토시스는 RIPK3(receptor-interacting protein kinase 3) 또는 MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein) 비의존적인 것인, 나노기포.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 나노기포는 초음파 조사에 의해 종양 세포에서 DAMP(Damage-associated molecular pattern)의 유출을 유도하는 것인, 나노기포.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 나노기포를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암인 것인, 약학적 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 조성물은 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 유효성분으로 더 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 면역관문 억제제는 CTLA-4, PD-1 및 PD-L1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것인, 약학적 조성물.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 조성물은 DPP4 억제제(dipeptidyl peptidase 4 inhibitor, DPP4i)를 유효성분으로 더 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 DPP4 억제제는 DPP4 단백질의 활성 억제제인 것인, 약학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 DPP4 단백질의 활성 억제제는 DPP-4에 대한 항체, 시타글립틴(sitagliptin), 빌다글립틴(vildagliptin), 삭사글립틴(saxagliptin), 리나글립틴(linagliptin), 두토글립틴(dutogliptin), 제미글립틴(gemigliptin), 알로글립틴(alogliptin), 아나글립틴(Anagliptin), 에보글립틴(evogliptin), 베르베린(Berberine), 디프로틴(Diprotin) 및 루피올(Lupeol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 약학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 나노기포를 유효성분으로 포함하는, 암의 전이 억제용 약학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 나노기포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
  25. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 나노기포의, 암의 예방, 개선 또는 치료 용도.
  26. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 나노기포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 전이 억제 방법.
  27. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 나노기포의, 암의 전이 예방 또는 억제 용도.
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