WO2010126178A1 - 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 암 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 암 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel chlorine e6-folate binding compound, a method for preparing the same, and a pharmaceutical composition for treating cancer containing the same, and more particularly, a compound in the form of a combination of chlorine e6 and folic acid in singlet oxygen in various media.
  • New compounds having useful characteristics for photodynamic therapy for malignant tumors, preparation methods thereof, and photodynamic therapy of solid cancers containing the same as effective ingredients by effectively producing and having significantly superior tumor selectivity compared to conventional porphyrin-based photosensitizers. It relates to a pharmaceutical composition for the following.
  • Photodynamic therapy for malignant tumors is now widely applied in the clinic.
  • One of the important factors defining the efficiency of PDT is its target or selectivity, indicating the extent of selective accumulation of photosensitizers only in tumor tissues in tumor tissues and normal tissues.
  • Higher targeting can increase the effectiveness of PDT, shorten the treatment time, and reduce the side effects of drugs injected into the body.
  • Activating the photosensitizer with light with a specific wavelength generates singlet oxygen and radical species, which is a kind of reactive oxygen species, which directly kills tumor cells and triggers an immunoinflammatory reaction. And damage the tumor microvascular system.
  • most of the conventional photosensitizers accumulate selectively to some extent in tumors, they accumulate in normal tissues including skin.
  • Targeted delivery of photosensitizers may solve these problems. This may be possible by enhancing phototoxicity by improving the degree of selective accumulation of tumor cells. Targeting means binding the photoactivating material directly to a tumor tracking (specific) molecule or using a carrier.
  • Several photosensitizers have already been combined with antibodies to tumor-associated antigens. Ligands such as low density lipoproteins, insulin, steroids, transferrins, epidermal growth factor (EGF), all have been discussed for the targeting of ligand-based photosensitizers to cells that overexpress receptors of these ligands.
  • folic acid receptors are also useful targets for tumor specific drug delivery for the following reasons.
  • folic acid receptors are expressed on tumor cells in ovarian cancer, colon, mamma gland, lung, kidney-cell cancer, epithelial tumor metastasis to the brain and neuroendocrine cancer.
  • polarized epithelial cells Increased folic acid receptor density (polarized epithelial cells: increased density of folic acid receptors depending on the extent of cancer exacerbation).
  • folic acid shows high affinity with its cell surface receptors.
  • the binding of folic acid and macromolecules can improve their delivery to folate receptor-expressing cancer cells in vitro in almost all tested conditions.
  • Folic acid receptor is an adjoint glycosyl phosphatidyl inositol glycoprotein that binds folate and absorbs it into cells through receptor-mediated endocytosis.
  • Physiological folic acid travels through the plasma membrane through specialized endocytosis mediated pathways and into the cytoplasm. After binding to folate receptors on the surface of cancer cells, folate bonds, regardless of size, have been shown to be absorbed into intracellular components called endosomes.
  • the degree of selectivity or target does not exceed the ratio of 10: 1 (cancer cells: normal cells). Accordingly, a method of selectively delivering a photosensitive agent to membrane receptors of a specific cell population has been developed through binding with a vector ligand characteristic to a cell surface such as antibodies, oligosaccharides, transferrins, hormone analogs, and the like. Many studies have shown that drugs used in chemotherapy, when combined with these vectors, are transported five to ten times more in modified cells than otherwise. The cells can bind the binding through receptor-mediated endocytosis without disruption.
  • Folic acid consists of three components and belongs to the vitamin group.
  • folates such as dihydrofolic acid, tetrahydrofolic acid and 5-metil-tetrahydrofolic acid, which are cofactors of enzymes that catalyze the transport of single carbon fragments.
  • Folic acid-dependent enzymes participate in the biosynthesis of purine and pyrimidine nucleotides and the metabolism of amino acids of methionine, histidine, serine and glycine. Because of this, folic acid is an essential ingredient for cell division and growth.
  • Folic acid is absorbed into the blood after it enters the living body and is transported to the tissue along with plasma and red blood cells.
  • Folic acid is difficult to pass through the plasma membrane of a cell with simple diffusion, as long as it is a divalent anion that exhibits distinct hydrophilic specific characteristics. Only at high pharmacological concentrations can folic acid be transported by passive diffusion.
  • folic acid is found in nanomolar concentrations in tissues and serum, which is why cells that absorb and transport these vitamins have a highly effective specific membrane system.
  • TRV transporter of restored vectors
  • TRV also works in tumor cells.
  • the binding force K M of restored folate is within 1-4 ⁇ M.
  • the similarity of the carrier with methotrexate is slightly lower K M within 4-8 ⁇ M and its maximum transport rate is within 1-12 nmol / min per gram of cellular protein.
  • TRV can perform transport through the membrane of folic acid, but its similarity to a given oxygenated folic acid is low (K M is within 100-200 ⁇ M).
  • Folic acid receptors are very similar to substrata in that the binding constant for folic acid is less than 1 nM.
  • Receptor-mediated transport of folic acid is carried out only in one direction, ie inside the cell.
  • Normal tissue cells express very small amounts of folic acid receptors on their surface with a few exceptions.
  • the amount of receptors for folic acid increases on their surface. This quantitative increase in folate receptors allows for more efficient binding of folic acid in significant amounts (more than 610 7 molecules per cell).
  • Such glycoproteins may be referred to as tumor markers, as long as the monoclonal antibodies used for the diagnosis of cancer cells appear to bind very specifically with folic acid.
  • Receptor-mediated transport of folic acid is carried out through endocytosis mechanisms.
  • Receptors operate through a recirculatory mechanism. That is, the ligand repeatedly passes from the plasma membrane to the endosome and vice versa, binding and releasing the molecule.
  • the efficiency of such function is defined by a variety of factors, including: the number of receptors on the cell surface, the concentration of extracellular folate-ligand, the similarity of folic acid to the receptor, the rate of energy-dependent endocytosis, from the endosome The rate of release of receptor molecules, the ability of the receptor to be made repeatedly within the membrane, and the like.
  • the portion associated with the folate receptor in the folate binding agent bound to the drug will enter the cell through receptor-mediated endocytosis, while the other portion will remain on the surface of the cell. Accordingly, two types of treatment strategies can be proposed. Drugs that need to reach intracellular targets can be transported to the cytosol by endocytosis, and drugs that can or should act in the extracellular domain will accumulate on the tumor cell surface while consuming folic acid receptors. .
  • the main feature is that the drug is delivered directly to pathologically modified cells.
  • PDT using a variety of photosensitive agents with therapeutic effects is mediated by changing the physiological conditions of the pathological focus, not directly damaging the tumor cells.
  • hydrophilic stains, especially Chlorin e6 are sensitive to light damage of the vascular system of tumor tissues (effects on the blood vessels of photodynamic therapy), which does not induce direct inactivation of transformed cells and thus tumor growth.
  • Suppress Selective delivery of photosensitizers to tumors is clearly one way to significantly improve the anticancer effects of PDT.
  • Chlorine e6 is a natural component and is not toxic to normal cells of the organism. It also has high photochemical activity against malignant cells compared to other photoactive compounds used in tumor therapy.
  • Chlorine e6 quickly reaches tumor sites from blood and organs, and then accumulates in high concentrations in tumor cells.
  • Laser-activated chlorine E6 provides an anti-tumor immunomodulatory effect by indirectly attenuating cellular immunity as well as indirectly damaging to tumors. Accumulated chlorine in the inflamed areas and regenerated tissues can help to recover from wounds better after surgery and prevent reinfection.
  • the present inventors combine chlorine e6 and folic acid with a terminal linker through hexane-1,6-diamine to effectively generate singlet oxygen in various media and are significantly superior to conventional porphyrin-based photosensitizers.
  • the compound has a significantly superior tumor selectivity compared to conventional porphyrin-based photosensitizers, thereby making it possible to The present invention has been completed by confirming its usefulness in epidemiotherapy.
  • an object of the present invention is to provide a novel chlorine e6-folate binding compound having characteristics that are useful for photodynamic therapy for malignant tumors by having significantly superior tumor selectivity compared to conventional porphyrin-based photosensitizers.
  • Another object of the present invention is to prepare a novel chlorine e6-folate binding compound by combining chlorine e6 and folic acid with a terminal linker via hexane-1,6-diamine or 2,2'-ethylenedioxy-bis-ethylamine. To provide a way.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating solid cancer photodynamically, containing the novel chlorine E6-folate binding compound as an active ingredient.
  • the present invention provides a novel ⁇ - (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6 or ⁇ - ⁇ N- ⁇ 2, which is a novel chlorine e6-folate binding compound represented by the following general formula (1) or (2). -[2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl ⁇ folic acid ⁇ -chlorine e6, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a novel chlorine e6-folate binding compound represented by the following formula (1) or (2), comprising the following steps: Formula 1-[ ⁇ - (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6 Or formula 2- ⁇ - ⁇ N- ⁇ 2- [2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl ⁇ folic acid ⁇ -chlorine e6, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a novel ⁇ - (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6 or ⁇ - ⁇ N- ⁇
  • a pharmaceutical composition for treating solid cancer photodynamically containing as an active ingredient 2- [2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl ⁇ folic acid ⁇ -chlorine e6, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • cancer refers to a complex disease resulting from uncontrolled proliferation and disordered growth of transformed cells, and in the present invention refers to solid cancer for photodynamic therapy.
  • Solid cancer refers to cancer composed of all masses except blood cancer.
  • Solid tumors include brain tumor, low-grade astrocytoma, high-grade astrocytoma, pituitary adenoma, meningioma, cerebral lymphoma, CNS lymphoma, Oligodendroglioma, Craniopharyngioma, Ependymoma, Brain stem tumor, Head & Neck Tumor, Larygeal cancer, Oropharyngeal cancer, Nasal / Nasal cavity / PNS tumor, Nasopharyngeal tumor, Salivary gland tumor, Hypopharyngeal cancer, Thyroid cancer, Oral cavity tumor, Chest Tumor , Small cell lung cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC), thymic cancer (Thymoma), mediastinal tumor,
  • the compounds of formula 1 or formula 2 of the present invention may be prepared with pharmaceutically acceptable salts and solvates according to methods conventional in the art.
  • salts are acid addition salts formed with pharmaceutically acceptable free acids.
  • Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • organic acids and inorganic acids may be used as the free acid
  • hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, and the like may be used as the inorganic acid
  • methanesulfonic acid, p -toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, and maleic acid may be used as the organic acid.
  • maleic acid succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid (gluconic acid), galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carboxylic acid, vanic acid, hydroiodic acid, and the like can be used. It is not limited.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt, but is not limited thereto.
  • Corresponding silver salts may also be obtained by reacting alkali or alkaline earth metal salts with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • Pharmaceutically acceptable salts of the compounds of Formula 1 or Formula 2 include salts of acidic or basic groups which may be present in compounds of Formula 1 or Formula 2 unless otherwise indicated.
  • pharmaceutically acceptable salts may include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulfate, phosphate, hydrogen phosphate, Dihydrogen phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p -toluenesulfonate (tosylate) salts, and the like. It can be prepared through.
  • hexane-1,6-diamine or 2,2 '-(ethylenedioxy) -bis-ethylamine is used for bonding between the two linkers.
  • Chlorine e6 of formula 3 13-carboxy-17- [2-carboxyethyl] -15-carboxymethyl-17,18-trans-dihydro-3-vinyl-8-ethyl-2,7,12,18-tetramethylporphyrin
  • Folic acid ( N- [4 (2-Amino-4-hydroxy pteridin-6-ylmethylamino) benzoyl] -L (+)-glutamic acid) of formula 4 is hexane-1,6-diamine )
  • [ ⁇ - (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine E6, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is a novel chlorine E6-folate binding compound having the structure of Formula 1 of the present invention comprises the following steps: It can be prepared by the method of:
  • ⁇ - ⁇ N- ⁇ 2- [2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl ⁇ folic acid ⁇ which is a novel chlorine E6-folate binding compound having the structure of Chemical Formula 2 of the present invention -Chlorine e6 or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be prepared by a method comprising the following steps:
  • the step of obtaining ⁇ - ⁇ [ tert -butyl- N- (6-aminohexyl)] carbamate ⁇ folic acid may be performed as follows.
  • tert -butyl- N- (6-aminohexyl)] carbamate and dicyclohexylcarbodiimide are added to anhydrous DMSO and folic acid solution in pyridine, and the mixture is stirred for 10-30 hours. do.
  • the filtrate was slowly poured into a strongly stirred solution of anhydrous Et 2 O cooled to 0 ° C., the resulting yellow precipitate was collected by filtration, washed with EtO to remove DMSO residue and vacuum It is dried in a state.
  • the step of obtaining ⁇ - ⁇ N- ⁇ 2- [2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl carbamate ⁇ folic acid may be performed as follows.
  • the step of obtaining ⁇ - (6-aminohexyl) folic acid or ⁇ - ⁇ N- ⁇ 2- [2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl ⁇ folic acid may be performed as follows.
  • obtaining the chlorine e6 succinidyl ester may be performed as follows.
  • N -hydroxysuccinimide and dicyclohexylcarbodiimide are added to a solution of chlorine e6 in anhydrous DMSO and the mixture is stirred at room temperature for 2-6 hours.
  • the solvent is then evaporated and then purified by column chromatography using a 1: 9 (v / v) mixed solvent of acetone: CH 2 Cl 2 as the eluent. Fractions are tested by TLC to collect only those with only one spot and concentrate.
  • the step of preparing [ ⁇ - (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6 or ⁇ - ⁇ N- ⁇ 2- [2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl ⁇ folic acid ⁇ -chlorine e6 It may be performed as follows.
  • Electron absorption spectra and fluorescence spectra were performed to preliminarily confirm the preservation of receptor properties in the conjugates of the novel chlorine e6-folate binding compounds of the present invention. Specific maximums were observed, folic acid specific peaks were observed at 270 nm, folic acid specific shoulders were displayed at 360 nm, and chlorin-equivalent peaks were observed at 660 nm and 700 nm in the fluorescence spectrum of the target conjugate. At 445 nm, specific folate peaks were observed.
  • the production efficiency of singlet oxygen in the homogeneous and heterogeneous systems of the novel chlorine e6-folate-binding compounds of the present invention was found to be optimal for the efficient production of singlet oxygen in the various media. It was confirmed that the characteristics of the.
  • the chlorine e6-folate binding compound of the present invention is remarkably superior to other photosensitive agents of the porphyrine family. It was found to have high photodynamic activity.
  • novel chlorine e6-folate binding compound of the present invention has a feature that is useful in photodynamic therapy for malignant tumors by having significantly superior tumor selectivity as compared to conventional porphyrin-based photosensitizers.
  • composition of the present invention is the above [ ⁇ - (6-aminohexyl) folic acid] -chlorine e6 or ⁇ - ⁇ N- ⁇ 2- [2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl ⁇ folic acid ⁇ -chlorine e6, or In addition to its pharmaceutically acceptable salts, it may contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions.
  • composition of the present invention may be prepared by containing one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above components for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, if necessary, as antioxidants, buffers And other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by an appropriate method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is based on the weight, age, sex, health status, The range varies depending on the diet, the time of administration, the method of administration, the rate of excretion and the severity of the disease.
  • the daily dose of the chlorine e6-folic acid binding compound of the present invention is about 5 to 1,000 mg / kg, preferably 10 to 500 mg / kg, and more preferably administered once to several times a day.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, hormone therapy, drug therapy and biological response modifiers for the treatment of solid cancers.
  • the present invention combines chlorine e6 and folic acid with terminal linkers via hexane-1,6-diamine, effectively producing singlet oxygen in various media and having significantly superior tumor selectivity compared to conventional porphyrin-based photosensitizers.
  • A is a positive mode
  • B is a negative mode measurement results.
  • Figure 3 is the mass spectrometry results of Chlorin e 6 succinidyl ester.
  • A is a positive mode
  • B is a negative mode measurement results.
  • FIG. 10 is a graph comparing the accumulation of free chlorine E6 and chlorine E6 conjugates in HeLa cells over time when exogenous folic acid was added.
  • FIG. 11 is a graph showing cytotoxicity according to the concentration of free chlorine E6 and chlorine E6 conjugates in HeLa cells in the absence of light exposure.
  • FIG. 13 is a graph showing photophotodynamic activity of free chlorine E6 and chlorine E6 conjugates in HeLa cells when irradiated at a dose of 3.3 J / cm 2.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of measuring chlorine E6 accumulation kinetics in Sacoma M-1 in rats and normal tissues when chlorine E6 was administered at doses of 2.5, 5.0 and 10.0 mg / kg.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of measuring the accumulation kinetics of chlorine E6 conjugates in Sacoma M-1 in rats and normal tissues when chlorine E6 conjugates were administered at doses of 2.5, 5.0 and 10.0 mg / kg. .
  • Example 1-1 (Compound I): Synthesis of ⁇ - ⁇ [ tert- butyl- N- (6-aminohexyl)] carbamate ⁇ folic acid (I)
  • N -hydroxysuccinimide (8.7 mg, 7.6 ⁇ 10 -2 mmol) and dicyclohex in a solution of Chlorin e6 (45.37 mg, 7.6 ⁇ 10 -2 mmol) in anhydrous DMSO Silkcarbodiimide (DCC) (8.7 mg, 7.6 ⁇ 10 ⁇ 2 mmol) was added. The mixture was stirred at room temperature for 4 hours. The solvent was evaporated and then purified by column chromatography using a 1: 9 (v / v) mixed solvent of acetone: CH 2 Cl 2 as eluent. Fractions were tested by TLC to collect only those with only one spot and then concentrated. 42 mg were obtained, yielding 79.7%.
  • FIG. 3 Mass spectrometry of the chlorin e 6 succinidyl ester resulted in a molecular weight of 693.74 (FIG. 3).
  • A is a positive mode and B is a negative mode measurement result.
  • N-hydroxysuccinate was dissolved in a solution of Compound II (29.3 mg, 5.45 ⁇ 10 -2 mmol) or Compound II-I (5.45 ⁇ 10 -2 mmol) in anhydrous DMSO and pyridine.
  • Mid-treated Chlorin e 6 (Compound III) (37.7 mg, 5.45 ⁇ 10 ⁇ 2 mmol) was added. After stirring for 24 hours at room temperature, the mixture was slowly poured into a vigorously stirred solution of Et 2 O cooled to 0 ° C. The dark red precipitate was collected by filtration, washed with Et 2 O and CH 2 Cl 2, and dried under vacuum to prepare a final product. 34 mg of the final product Compound IV was obtained using compound II and compound III as a starting material, and the yield was 55.8%.
  • Synthesis of the combination of folic acid and Chlorin e6 prepared in Example 4 is based on the method of conjugation through the initial component, that is, the carboxyl group (-COOH) of folic acid and Chlorin e6.
  • Electron absorption spectra showed specific peaks of chlorin at 400 and 650 nm, folic acid specific peaks at 270 nm, and folic acid specific shoulders at 360 nm.
  • the fluorescence spectra of the target conjugates showed the maximum values corresponding to chlorin at 660 nm and 700 nm, and the specific maximum values of folic acid at 445 nm.
  • Chlorin e6 maintains the ability and ability to generate singlet oxygen in the excited state at 600-700 nm even in the conjugate.
  • Chlorin e6 in the binder showed the same result in both aqueous solution and hydrophobic environment, that is, when the binder was bound to the protein.
  • Chlorin e6 can accumulate in tumor cells and tissues and destroy tumor cells. It is known that a major role in this process is the abnormal operation of the cell membrane. This abnormal behavior is due to the oxidation of protein and lipid components by highly reactive oxidants such as singlet oxygen. This singlet oxygen is formed during the interaction between the oxygen molecules in the body and the photosensitizer molecules under an activated triplet condition. 1 efficiency of 0 2 produced is determined by the following a number of factors, such as: absorption of the photosensitizer, the intensity and emission of triplet quantum conditions, the life of the above conditions, the present solubility and O 2 diffusion under the environment and the like.
  • HAS human serum albumin
  • Electron absorption spectra of the solution under investigation were recorded on Specord UV-Vis. Fluorescence spectra and fluorescence polarity ( ⁇ ) values were recorded on an automated spectrofluorometer (Institute of Physics). The lifetime (t S ) of the photosensitive fluorescence was measured using an impulse fluorometer operating in the photon calculation method.
  • Figure 7 shows the fluorescence spectrum and fluorescence excitation spectrum of Chlorin e6 and Chlorin e6 combination in the buffer.
  • the fluorescence spectra of the two pigments did not depend on the excitation wavelength, and their fluorescence excitation spectrum was almost identical to the absorption spectrum of Chlorin e6. It should be noted, however, that the excitation spectrum of the Chlorin e6 conjugate differs from the absorption spectrum only in the “blue region” of the spectrum, ie 400-500 nm region of the spectrum. There was no absorption band corresponding to the absorption of the vectorial part (folic acid) in the excitation spectrum of the binding.
  • Chlorin e6 conjugates in all systems are in the monomeric state, and that spectral changes are mainly caused by orientational effects.
  • the role of distinctive and oriented interactions in this experiment was small. Chlorin e6 conjugates in all complexes have a hydrophobic environment with the same polarity as pyridine.
  • the photoreaction ( ⁇ ⁇ ) of this process was measured in a relative manner through the integration of singlet oxygen emission intensity at a wavelength of 1270 nm.
  • the excited state was performed on a wavelength of 531 nm (pulse energy 4 microJ, frequency 1 kHz).
  • the test was made in buffer saturated with air at room temperature.
  • Tetra (n-sulfophenyl) porphyn (TSPP) was chosen as the standard for measuring ⁇ ⁇ of Chlorin e6 conjugates.
  • ⁇ ⁇ in D 2 O was considered to be 0.7. In all cases the absorbance of the solutions at the excited wavelength did not exceed 0.1 (coating thickness: 10 mm).
  • A is a coefficient depending on the initial concentration of the interacting reagent
  • k 1 and k 2 represent the increasing and extinction constants of the luminescent signal, respectively.
  • the Chlorin e6 complex has the optimal properties for effectively producing singlet oxygen in various media.
  • the photodynamic activity of the Chlorin e6 conjugates of the present invention is significantly higher than that of other porphyrine-based photosensitive agents. It can be seen that.
  • Table 3 shows the concentrations (relative values of units / 10 4 cl.) Of Chlorin e6 and Chlorin e6 conjugates in HeLa cells.
  • Chlorin e6 Chlorin e6 binder One 0,86 0,40 5 1,45 1,80 10 1,72 2,50 15 0,81 12,5 24 0,40 15,0
  • Chlorin e6 conjugates After 24 hours of exposure, the accumulation of Chlorin e6 conjugates was on average 8-10 times higher than that of free Chlorin e6. Accumulation levels of chlorin e6 conjugates increased continuously over 24 hours, suggesting that active transport through receptor-mediated endocytosis occurs rather than nonspecific cell uptake.
  • folic acid was added to the cell suspension at a concentration of 4 ⁇ M / l before the addition of free Chlorin e6 and Chlorin e6 conjugates. Incubated with free Chlorin e6 and Chlorin e6 combination for 24 hours. The sample was then centrifuged, the supernatant was collected and the precipitate washed again in cold Hank's solution. The second precipitate obtained was put back into Hank's solution.
  • Fluorescence intensity was measured to compare the accumulation of free chlorin e6 and chlorin e6 conjugates in HeLa cells.
  • FIG. 10 shows that 4 ⁇ M / l of free folic acid significantly reduced the accumulation of Chlorin e6 conjugates in HeLa cells ( p ⁇ 0.05).
  • the presence of folic acid did not affect the accumulation of free Chlorin e6.
  • intracellular accumulation of Chlorin e6 was not affected by the presence of antagonistic concentrations of folic acid in the culture medium.
  • the accumulation of Chlorin e6 conjugates decreased in the presence of antagonistic folic acid, it was still shown to be superior to free Chlorin e6. This suggests that the presence of folic acid can also increase nonspecific accumulation.
  • Cytotoxicity was investigated in consideration of cell proliferation intensity, photosensitizer concentration, and optical power . Three flasks containing a single layer of cell were used for this.
  • a monolayer culture of HeLa tumor cells was used as a cell.
  • Cultures of Hela tumor cells were grown in nutrient medium containing nutrient medium 199, or 10% fetal calf serum and 100 mg / ml kanamycin.
  • photosensitizers were added at 1, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 and 30.0 mg / ml, respectively.
  • Flasks with dark cytotoxicity were incubated at 37.5 ° C. for 1 hour. The cells were washed four times using Hank's solution. Add 2.0 ml of fresh nutrient medium and use a "METALAZ" laser medical instrument (wavelength 627.8 nm, 578.2 or 510.6 nm) or "LD 680-2000" (wavelength 670-690 nm) (spectroscopic maximum absorption wavelength of the photosensitive agent to be investigated. Irradiated with a light flux of 40 J / cm 2 at an ice melting temperature for 5, 10, 15 or 20 minutes. After 20-24 hours tumor cells were counted in a Goriaev's chamber.
  • Table 4 shows the number of HeLa cells after incubation for 24 hours as a ratio to the control.
  • the photosensitizer solution to be examined of the nutrient medium was 0.1, 0.5, 1.0, 5.0 or Add to 10 mcg / ml.
  • the flasks were wrapped with a light protective cover and incubated at 37 ° C. for 3.5 hours. It was then washed with Hank's solution and irradiated on ice with a dose of 3.3 joule / cm 2 using a laser medical device "LD 680-2000" (wavelength 670-690 nm). After 20-24 hours effective cell monolayers were dispersed with 0.02% Versene solution and tumor cells were counted in Goriaev's chamber. Three flasks were used for this.
  • Table 5 shows incubation with photosensitizer for 3.5 hours, additional light exposure (PhE) at a dose of 3.3 joule / cm 2, and the number of HeLa cells as a percentage of the control.
  • Chlorin e6 conjugates completely inhibited the proliferation of HeLa cells at a concentration of 5-10 mcg / ml (FIG. 12).
  • Figure 13 shows that Chlorin e6 control photosensitizer showed little phototoxicity under the present experimental conditions.
  • survival measurement tests showed that the use of Chlorin e6 conjugates resulted in improved photosensitivity compared to Chlorin e6 mediated photosensitivity.
  • Chlorin e6 conjugates accumulated on average 10 times higher than Chlorin e6.
  • Tumor cells differ significantly in the number and type of receptors that overexpress compared to normal cells. Overexpression of certain receptors is often used for oncoselective delivery of photosensitizers. In HeLa cells that overexpress folate receptors, folate-targeting ligands are used.
  • the photosensitizers were compared with Chlorin e6 and Chlorin e6 conjugates.
  • the photosensitizers were administered intravenously in Sacoma M-1 rats in the amounts of 2.5, 5.0 and 10.0 mg / kg, followed by two photosensitisers in tumor and normal tissues. Accumulation kinetics was analyzed.
  • This experiment was performed on rats 7-9 days post-tumor, using 100 two-crossed white rats subcutaneously implanted with Sacoma M-1.
  • the photosensitizers were administered once intravenously to each group of rats in low light rooms in amounts of 2.5, 5.0 and 10.0 mg / kg, respectively.
  • Sterile natural isotonic solution of sodium chloride was used as solvent.
  • Accumulation kinetics of photosensitive agents in tumor and normal tissues was performed over 30 minutes, 1-5 hours, and 1-6 days after the administration of the photosensitizers.
  • the catheter tip was placed on tumor tissue and normal tissue every hour after drug administration and the intensity of drug accumulation was recorded at the wavelength corresponding to maximum fluorescence.
  • Obtained digital values of the indexes considered were processed using generally accepted statistical techniques using the computer program Origin 6.1.
  • the significance level was 0.05.
  • FIGS. 14 and 15 Fluorescence intensity data in Sacoma M-1 and normal tissues of rats for the first 5 hours and 1-6 days after administration of Chlorin e6 and Chlorin e6 conjugates are shown in FIGS. 14 and 15. Up to 4-5 hours after administration, the difference in the accumulation of two photosensitizers was 2-3 times higher in tumor tissues than in normal tissues.
  • the selectivity (mean accumulation in tumors / average accumulation in normal tissues) measured the highest accumulation of Chlorin e6 in rat tumor tissues the first 5 hours after intravenous administration at a dose of 10.0 mg / kg. Showed. For chlorin e6 conjugates, the maximum accumulation was recorded 2-5 hours after intravenous administration at a dose of 5.0 mg / kg.
  • Chlorin e6 conjugates were administered intravenously in amounts of 2.5, 5.0 and 10.0 mg / kg, followed by light exposure at a dose of 100 J / cm 2 followed by measurement of necrotic areas in Sacoma M-1 rats.
  • Antitumor effect of PDT using chlorin e6 conjugate was 100 J / cm using LD 680-2000 laser device 2 After photoexposure at the dose of Monitoring was performed by quantitatively assessing the necrotic area formed in tumors by biostaining with 0.6% Ivan Blue for 24 hours (1 ml per 100 g body weight). The necrosis area is 2 hours after biostaining, the mice were killed with chloroform, the tumor was removed, fixed on the 10% -HOM formalin for 1 hour, the cross section of the largest diameter was taken from the tumor mass, and the photograph was taken with a camera connected to a computer. Dipping and measuring.
  • the program includes an algorithm that can identify Evans blue, which stains the observable area of the tumor. Tumor sites destroyed by direct toxic effects or structural and functional disturbances of microcirculation do not turn blue. The ratio of the total number of uncolored dots to the total number of dots in the area of the tumor slide was considered the destruction efficiency.
  • Tables 6-10 show data for necrotic areas in 75 tissue-terrain slides of subject mice implanted with Sacoma M-1. Necrosis is formed by administering Chlorin e6 conjugates at doses of 2.5, 5.0 and 10.0 mg / kg, irradiating at a dose of 100 J / cm 2 and then performing PDT.
  • Spectroscopic fluorescence analysis of the accumulation of Chlorin e6 and Chlorin e6 conjugates using lifetime laser fluorescence spectroscopy showed that the maximum accumulation of Chlorin e6 in tumor tissues of Sacoma M-1 rats was increased by 10.0 mg / kg. It was shown for the first 5 hours after administration. In addition, the maximum accumulation of Chlorin e6 conjugate was recorded as 2-5 hours after the dose of 5.0 mg / kg.
  • the rats were monitored for the volume growth inhibition effect of sacoma M-1 compared to the control for 24 days, showing inhibition rates of 86.34% to 99.1%.
  • the Chlorin e6 conjugate showed enhanced affinity for tumor cells and cell membranes. Comparing the accumulation in the induced sacoma, it was confirmed that the Chlorin e6 conjugate was much more tumor-oriented than Chlorin e6. Therefore, it can be seen that the efficiency of phototherapy with Chlorin e6 combination is significantly superior to Chlorin e6.
  • the Chlorin e6 combination has the optimal properties for the efficient production of singlet oxygen in various media.
  • the Chlorin e6 binding has a high photodynamic activity over all other porphyrin-based photosensitive agents currently known. .

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Abstract

본 발명은 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 클로린 e6과 엽산이 결합된 형태의 화합물로서 다양한 매질에서 일중항 산소를 효과적으로 생성하고 종래 포르피린 계열의 광민감제에 비해 현저히 우수한 종양 선택성을 가짐으로써 악성종양에 대한 광역학치료에 유용한 특징을 가진 신규 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 광역학적으로 고형암을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 클로린 E6-엽산 결합 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 암 치료용 약학적 조성물
본 발명은 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 클로린 e6과 엽산이 결합된 형태의 화합물로서 다양한 매질에서 일중항 산소를 효과적으로 생성하고 종래 포르피린 계열의 광민감제에 비해 현저히 우수한 종양 선택성을 가짐으로써 악성종양에 대한 광역학치료에 유용한 특징을 가진 신규 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 광역학적으로 고형암을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
악성종양에 대한 광역학치료법(이하 PDT)은 현재 광범위하게 임상에 적용되고 있다. PDT의 효율성을 규정하는 중요한 요소 중의 하나는 표적성 또는 선택성(selectivity)으로서 종양조직과 정상조직에 있어 종양조직에만 광민감제를 선택적으로 축적시키는 정도를 나타낸다. 표적성이 높으면 PDT의 효과성이 높아져 치료시간을 단축시킬 수 있으며, 또한 체내에 주입된 약물의 부작용도 줄일 수 있게 된다. 특정 파장을 지닌 빛으로 광민감제를 활성화시키면 활성산소종의 일종인 일중항산소(singlet oxygen)와 라디칼 종(radical species)을 발생시키게 되는데, 이를 통해 직접적으로 종양세포를 죽이게 되며, 면역염증반응을 일으키고 또한 종양의 미소혈관계에 손상을 입히게 된다. 종래 광민감제들의 대부분이 종양에 일정 정도는 선택적으로 축적이 되었지만, 피부를 포함한 정상조직에도 축적이 된 것으로 나타났다.
광민감제의 표적화 전달로 이러한 문제들을 해결할 수 있을 것이다. 이는 종양세포에 대한 선택적 축적정도를 개선시켜 광독성을 강화함으로써 가능할 수 있다. 표적화란 광활성화 물질을 종양추적(특정적)분자와 직접적으로 또는 캐리어를 이용해서 결합시키는 것을 의미한다. 이미 몇 가지 광민감제들이 종양-관련 항원(antigen)에 대한 항체와 결합된 바 있다. 저밀도 지단백(lipoprotein), 인슐린, 스테로이드, 트랜스페린, 상피세포성장인자(EGF)와 같은 리간드들 모두가, 이러한 리간드의 수용체를 과발현하는 세포로의 리간드-기반 광민감제의 표적화를 위하여 논의되어왔다.
사실, 병변세포에서는 수용체 발현의 변화, 특정 세포표면막 지질과 단백질의 농도 증가 뿐만 아니라 세포적 미세환경(cellular microenvironment)의 변화 등이 모두 일어난다.
수용체 매개전달(receptor mediated delivery)을 이용한 여러 전달전략 중에서, 하기와 같은 이유로 엽산수용체 또한 종양특이적 약물 전달을 위한 유용한 타겟이 된다.
첫째, 엽산수용체들은 난소 암, 결장, 유선(mamma gland), 폐, 신장-세포성 암, 상피 종양의 뇌로의 전이 및 신경 내분비 암에서 종양세포 상에서 발현된다.
둘째, 정상 조직에서 엽산 수용체의 발현은 상피세포의 apical_membrane 상의 위치로 인해 발현이 심각하게 제한되어있어 정상조식에서의 엽산 수용체에 대한 접근은 거의 일어나지 않는다.
셋째, 극성화된 상피세포; 엽산수용체의 밀도가 증가한다(극성화된 상피세포 : 암이 악화된 정도에 따른 엽산수용체의 밀도 증가).
넷째, 엽산이 그것의 세포표면상 수용체와 높은 친화성을 나타낸다. 엽산과 거대분자의 결합은 거의 모든 테스트된 상태에서 시험관 내 엽산수용체-발현 암세포로의 이들의 전달을 개선시킬 수 있다.
엽산수용체(RFA)는 엽산과 결합하여 수용체-매개의 엔도시토시스를 통해 세포 내부로 이를 흡수하는, 수반성(adjoint) 글리코실 포스파티딜 이노시톨 당단백질이다.
비록 엽산수용체에 의한 세포 내로의 엽산 전달에 대한 정확한 작용기전이 확립되어 있지는 않지만, 엽산결합물들이 수용체-매개의 엔도시토시스를 통해 포유류 세포에 파괴되지 않은 채 축적된다는 것은 분명하다.
생리적인 엽산은 특수화된 엔도시토시스 매개 경로를 통해 원형질막을 통과해서 세포질 안으로 이동한다. 암 세포 표면상의 엽산수용체와 결합한 후, 크기에 관계 없이 엽산결합물들은 엔도솜이라 불리는 세포내 성분으로 흡수되는 것으로 보여진다.
일반적으로 이러한 선택성 또는 표적성의 정도는 10:1(암세포:정상세포)의 비율을 넘지 못하고 있다. 이에 항체, 올리고당, 트랜스페린, 호르몬 유사체 등과 같은 세포 표면에 특징적인 벡터 리간드와의 결합을 통해 특정 세포군의 막 수용체에 광민감제를 선택적으로 전달하는 방법이 개발되고 있다. 많은 연구결과들이 화학요법에 쓰이는 약물이 이러한 벡터와 결합되면 그렇지 않은 경우보다 변형된 세포에 5-10배 정도 더 많이 운반되고 있음을 보여주고 있다. 그 세포들은 파괴됨이 없이 수용체-매개 엔도시토시스를 통해서 결합물을 바인드할 수 있다.
엽산은 세 개의 구성부분으로 이루어져 있으며, 비타민그룹에 속한다.
살아있는 유기물은 주로 dihydrofolic acid, tetrahydrofolic acid, 5-metil-tetrahydrofolic acid와 같은 엽산형태로 환원하는데, 이들은 단일 탄소 단편 운반 반응을 촉매하는 효소의 보조인자(cofactor)이다. 엽산의존적 효소들은 퓨린과 피리미딘 뉴클레오티드의 생합성과, 메티오닌, 히스티딘, 세린 및 글리신의 아미노산의 대사에 참여한다. 이 때문에 엽산은 세포분열과 성장에 반드시 필요한 성분이다.
엽산은 생체 내에 들어간 후에 혈액에 흡수되며 플라즈마와 적혈구와 함께 조직으로 운반된다.
동물세포는 엽산을 합성할 수 없기 때문에 원형질막에 있어 엽산을 바인드하고 흡수하는 특별한 시스템의 존재가 사실상 요구된다.
엽산은 뚜렷한 친수성 특이적인 특징을 나타내는 이가 음이온(dianion)인 한, 단순한 확산으로는 세포의 원형질막을 통해서 통과하기 어렵다. 단지 높은 약리학적 농도에서만 수동적인 확산으로 엽산 운반을 할 수 있다.
자연적 생리학 조건에서 엽산은 조직과 혈청 내에서 나노몰 농도로 발견되는데, 이것이 이러한 비타민을 흡수하고 운반하는 세포가 고도로 효과적인 특이한 막 시스템을 가지게 되는 이유이다.
높은 속도로 엽산 운반을 촉진하는 이동성 담체가 있다. 혈액으로의 엽산흡수가 일어나는 소장의 상피세포에 많이 존재한다. 촉매 운반은 다양한 세포에서 엽산 흡수의 주된 경로이다. 그러한 운반의 substrate는 복원된 형태의 엽산으로, 이는 상기 담체가 transporter of restored vectors (TRV)로 불리는 이유이다. 이는 46 kD의 크기을 가지는 당단백질으로 세포 원형질막 내에서 친수성 분자의 막을 통해서 생기는 "채널(channel)"을 형성한다. TRV 매개 운반의 동역학은 Michaelice-Menten 의존적인 것으로 설명된다. 작용하는 속도는 다소 높으며, 엽산과의 유사성은 대략 200 μM로 상대적으로 낮다.
TRV는 종양세포에서도 작용한다. 복원된 엽산의 결합력 KM은 1-4 μM 이내이다. 담체의 메토트렉세이트와의 유사성은 4-8 μM 이내에서 약간 더 낮은 KM이고, 그것의 운반 최대 속도는 세포 단백질 그램당 1-12 nmol/min 이내이다. TRV는 엽산의 막을 통한 운반을 수행할 수 있지만, 주어진 산소처리된 엽산에 대한 그것의 유사성은 낮다 (KM은 100-200 μM 이내이다).
엽산수용체라고 불리는 막 당단백질을 통해 작용하는 수용체-매개의 시스템이 있다. 엽산수용체는 엽산에 대한 결합상수가 1 nM 미만이라는 점에서 substrata와 매우 유사하다는 특징을 가지고 있다.
엽산의 수용체 매개 운반은 한 방향 즉 세포 내부쪽으로만 수행된다. 정상조직의 세포들은 약간의 예외를 제외하고는 매우 적은 양의 엽산수용체만을 그 표면 상에서 발현한다. 그러나, 악성으로 형질변환된 세포들, 특히 폐, 신장, 뇌, 대장, 난소에서의 종양 세포와 백혈병에서의 골수 혈액 세포에서는 엽산에 대한 수용체의 양이 그들의 표면 상에서 증가하게 된다. 이러한 엽산수용체의 양적인 증가로 인해 엽산을 현저한 양(세포당 6107 분자 이상)으로 보다 효과적으로 바인딩할 수 있게 된다. 암세포의 진단에 사용되는 단일클론항체가 엽산과 매우 특이적으로 결합하는 것으로 나타나는 한, 이러한 당단백질은 종양 마커로서 언급되어질 수 있다.
엽산의 수용체 매개 운반은 엔도시토시스 메커니즘을 통해서 수행된다. 수용체는 재순환 메커니즘(recirculatory mechanism)을 통해서 작동한다. 즉, 리간드가 분자를 결합하고 방출하면서, 반복적으로 원형질막으로부터 엔도솜으로 그리고 그 반대로 가로질러 통과한다. 그러한 기능의 효율성은 다음과 같은 다양한 요소들에 의해 규정된다: 세포 표면상의 수용체의 수, 세포 밖 엽산-리간드의 농도, 수용체에 대한 엽산의 유사성, 에너지-의존적 엔도시토시스의 속도, 엔도솜으로부터 수용체 분자 방출 속도, 막 내부에서 반복적으로 만들어지기 위한 수용체의 능력 등.
의약물과 결합한 엽산 결합물에서 엽산 수용체와 연합된 부분은 수용체-매개 엔도시토시스를 통해 세포로 들어가게 되고, 한편 다른 부분은 세포의 표면 상에 머물러 있게 될 것이다. 이에 따라 두 가지 타입의 치료 전략이 제안될 수 있다. 세포 내 타겟까지 접근할 필요가 있는 의약물은 엔도시토시스에 의해 시토졸로 운반될 수 있으며, 세포 밖 영역에서 작용할 수 있거나 작용해야 하는 의약물은 엽산수용체를 소비하면서 종양세포 표면 상에 축적될 것이다.
주요한 특징은 약물이 병리적으로 변형된 세포에까지 직접 전달된다는 점이다. 치료효과를 가진 다양한 광민감제들을 이용하는 PDT의 경우, 종양 세포의 직접적인 손상이 아닌, 병소(pathological focus)의 생리학적 조건을 변화시키는 것을 통해 조정된다. 따라서, 친수성 염료(stains), 특히 Chlorin e6은 종양조직의 혈관 시스템의 광 손상에 민감하게 되고(광역학치료법의 혈관에 미치는 효과), 이는 형질 변환된 세포의 직접적인 비활성화를 유도하지 않고 종양의 성장을 억제한다. 광민감제를 종양에 선택적으로 운반하는 것은 PDT의 항암치료효과를 획기적으로 개선시킬 수 있는 한 가지 방법이 될 수 있음이 분명하다.
클로린 e6은 천연성분이며, 유기체의 정상적인 세포에는 독성이 없다. 또한 종양치료에 사용되는 다른 광활성 화합물들과 비교하여 악성 세포에 대해 높은 광화학 활성을 가진다.
클로린 e6은 혈액과 기관으로부터 종양부위로 빨리 도달한 후, 종양세포에 높은 농도로 축적된다.
레이저에 의해 활성화된 클로린 E6는 종양에 대한 직접적인 파괴 효과뿐만 아니라 간접적으로도 세포면역을 약화시켜 항-종양 면역조절 효과를 제공한다. 염증 부위와 재생 조직에 클로린이 많이 축적되면 수술 후 상처의 회복이 보다 잘되게 하며 재감염을 막아준다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 클로린 e6과 엽산을 헥산-1,6-디아민을 통해 말단 링커를 결합시킴으로써 다양한 매질에서 일중항 산소를 효과적으로 생성하고 종래 포르피린 계열의 광민감제에 비해 현저히 우수한 종양 선택성을 가짐으로써 악성종양에 대한 광역학치료에 유용한 특징을 가진 신규 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 제조하고 상기 화합물이 종래 포르피린 계열의 광민감제에 비해 현저히 우수한 종양 선택성을 가짐으로써 악성종양에 대한 광역학치료에 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 종래 포르피린 계열의 광민감제에 비해 현저히 우수한 종양 선택성을 가짐으로써 악성종양에 대한 광역학치료에 유용한 특징을 가진 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 클로린 e6과 엽산을 헥산-1,6-디아민 또는 2,2'-에틸렌디옥시-비스-에틸아민을 통해 말단 링커를 결합시킴으로써 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 클로린 E6-엽산 결합 화합물을 유효성분으로 함유하는, 광역학적으로 고형암을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물인, [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 또는 {γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}엽산}}-클로린 e6, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-1
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-2
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물인, 화학식 1 - [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 또는 화학식 2- {γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}엽산}}-클로린 e6, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제조하는 방법을 제공한다:
엽산과 [tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트 또는 tert-butyl 2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethylcarbamate를 상온, 질소 대기 하에서 반응시켜 γ-{[tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산 또는 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl carbamate}folic acid를 수득하는 단계;
상기 단계의 γ-{[tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산 또는 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl carbamate}folic acid에 트리플루오로-아세트산을 첨가하여 반응시킴으로서 γ-(6-아미노헥실)엽산 또는 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}}엽산을 수득하는 단계;
질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 클로린 e6에 N-히드록시숙신이미드 및 디시클로헥실카보디이미드를 첨가하여 반응시킴으로써 클로린 e6 숙시니딜 에스테르를 수득하는 단계; 및
질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 상기 단계에서 제조한 γ-(6-아미노헥실)엽산 또는 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}}엽산에 클로린 e6 숙시니딜 에스테르를 첨가하여 반응시킴으로써 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 또는 {γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}엽산}}-클로린 e6을 제조하는 단계.
[화학식 1]
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-1
[화학식 2]
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-2
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물인, [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 또는 {γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}엽산}}-클로린 e6, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로서 함유하는, 광역학적으로 고형암을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-1
[화학식 2]
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-2
이하 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어 "암"은 형질전환된 세포의 억제되지 않는 증식과 무질서한 성장 결과로 빚어지는 복합적인 질환을 일컫으며, 본 발명에서는 광역학적 치료를 위해 고형암을 의미한다. 고형암이란 혈액암을 제외한 모든 덩어리로 이루어진 암을 의미한다. 고형암의 종류로는 뇌종양(Brain Tumor), 양성성상세포종 (Low- grade astrocytoma), 악성성상세포종 (High-grade astrocytoma), 뇌하수체 선종 (Pituitary adenoma), 뇌수막종 (Meningioma), 뇌림프종 (CNS lymphoma), 핍지교종 (Oligodendroglioma), 두개내인종 (Craniopharyngioma), 상의세포종 (Ependymoma), 뇌간종양 (Brain stem tumor), 두경부 종양(Head & Neck Tumor), 후두암 (Larygeal cancer), 구인두암 (Oropgaryngeal cancer), 비강/부비동암 (Nasal cavity/PNS tumor), 비인두암 (Nasopharyngeal tumor), 침샘암 (Salivary gland tumor), 하인두암 (Hypopharyngeal cancer), 갑상선암 (thyroid cancer), 구강암 (Oral cavity tumor), 흉부종양(Chest Tumor), 소세포성 폐암 (Small cell lung cancer), 비소세포성 폐암 (NSCLC), 흉선암 (Thymoma), 종격동 종양 (Mediastinal tumor), 식도암 (Esophageal cancer), 유방암 (Breast cancer), 남성유방암 (Male breast cancer), 복부종양 (Abdomen-pelvis Tumor), 위암 (Stomach cancer), 간암 (Hepatoma), 담낭암 (Gall bladder cancer), 담도암 (Billiary tract tumor), 췌장암 (pancreatic cancer), 소장암 (Small intestinal tumor), 대장(직장)암 (Large intestinal tumor), 항문암 (Anal cancer), 방광암 (Bladder cancer), 신장암 (Renal cell carcinoma), 전립선암 (Prostatic cancer), 자궁경부암 (Cervix cancer), 자궁내막암 (Endometrial cancer), 난소암 (Ovarian cancer), 자궁육종 (Uterine sarcoma), 피부암(Skin Cancer) 등이 있다.
본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물들은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명에서, 엽산과 클로린 e6을 결합시키는데 있어 접근 가능한 수용체 부위 범위를 증가시키기 위하여 두 링커의 말초 부분에 결합시킨다. 이때 두 링커 사이 결합을 위하여 헥산-1,6-디아민 또는 2,2'-(에틸렌디옥시)-비스-에틸아민을 이용한다.
즉, 본 발명의 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물 또는 {γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}엽산}}-클로린 e6 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 3의 클로린 e6(13-carboxy-17-[2-carboxyethyl]-15-carboxymethyl-17,18-trans-dihydro-3-vinyl-8-ethyl-2,7,12,18-tetramethylporphyrin)과 하기 화학식 4의 엽산(N-[4(2-Amino-4-hydroxy pteridin-6-ylmethylamino) benzoyl]-L(+)-glutamic acid)이 헥산-1,6-디아민(hexane-l,6-diamine)을 통해 결합됨으로써 상기 화학식 1의 구조로, 또는 2,2'-(에틸렌디옥시)-비스-에틸아민(2,2'-ethylenedioxy)-bis-ethylamine)을 통해 화학식 2의 구조로 제조될 수 있는 것이다.
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
Figure WO-DOC-CHEMICAL-3
화학식 4
Figure PCTKR2009002276-appb-C000004
바람직한 일 양태로서, 본 발명의 화학식 1의 구조를 가지는 신규한 클로린 E6-엽산 결합 화합물인 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 E6 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 단계를 포함하는 방법을 통해 제조될 수 있다:
엽산과 [tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트를 상온, 질소 대기 하에서 반응시켜 γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산을 수득하는 단계;
상기 단계의 γ-{[tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산에 트리플루오로-아세트산을 첨가하여 반응시킴으로서 γ-(6-아미노헥실)엽산을 수득하는 단계;
질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 클로린 E6에 N-히드록시숙신이미드 및 디시클로헥실카보디이미드를 첨가하여 반응시킴으로써 클로린 E6 숙시니딜 에스테르를 수득하는 단계; 및
질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 상기 단계에서 제조한 γ-(6-아미노헥실)엽산에 클로린 E6 숙시니딜 에스테르를 첨가하여 반응시킴으로써 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 E6을 제조하는 단계.
다른 하나의 바람직한 일 양태로서, 본 발명의 화학식 2의 구조를 가지는 신규한 클로린 E6-엽산 결합 화합물인 {γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}엽산}}-클로린 e6 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 단계를 포함하는 방법을 통해 제조될 수 있다:
엽산과 tert-butyl 2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethylcarbamate을 상온, 질소 대기 하에서 반응시켜 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl carbamate}folic acid}를 수득하는 단계;
상기 단계의 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl carbamate}folic acid에 트리플루오로-아세트산을 첨가하여 반응시킴으로서 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}}엽산을 수득하는 단계;
질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 클로린 e6에 N-히드록시숙신이미드 및 디시클로헥실카보디이미드를 첨가하여 반응시킴으로써 클로린 e6 숙시니딜 에스테르를 수득하는 단계; 및
질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 상기 단계에서 제조한 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}}엽산에 클로린 e6 숙시니딜 에스테르를 첨가하여 반응시킴으로써 {γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}엽산}}-클로린 e6을 제조하는 단계.
구체적으로, γ-{[tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산을 수득하는 단계는 하기와 같이 수행될 수 있다.
상온, 질소 대기 하에서, 무수 DMSO와 피리딘 내 엽산 용액에 tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트 및 디시클로헥실카르보디이미드를 첨가하고, 상기 혼합물을 10~30시간 동안 교반한다. 이후 반응 혼합물을 여과한 후, 0℃로 냉각된 무수 Et2O의 강력하게 교반되는 용액 안으로 상기 여과액을 천천히 부어 생성된 노란색의 침전물을 여과하여 모아, EtO로 씻어 DMSO 잔류물을 제거하고 진공 상태에서 건조시킨다.
구체적으로, γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl carbamate}folic acid를 수득하는 단계는 하기와 같이 수행될 수 있다.
상온, 질소 대기 하에서, 무수 DMSO와 피리딘 내 엽산 용액에 2,2'-(에틸렌디옥시)-비스-에틸아민 및 디시클로헥실카르보디이미드를 첨가하고, 상기 혼합물을 10~30시간 동안 교반한다. 이후 반응 혼합물을 여과한 후, 0℃로 냉각된 무수 Et2O의 강력하게 교반되는 용액 안으로 상기 여과액을 천천히 부어 생성된 노란색의 침전물을 여과하여 모아, EtO로 씻어 DMSO 잔류물을 제거하고 진공 상태에서 건조시킨다.
구체적으로, γ-(6-아미노헥실)엽산 또는 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}}엽산을 수득하는 단계는 하기와 같이 수행될 수 있다.
상기 단계에서 만들어진 γ-{[tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산 또는 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl carbamate}folic acid를 트리플루오로-아세트산 (TFA)으로 처리하고, 대기 온도에서 1~5시간 동안 교반한 다음 TFA를 진공 하에서 증발시킨다. 잔류물을 무수 DMF에 넣은 다음, 피리딘을 노란색 침전물이 형성될 때까지 방울방울 넣어준다. 노란색의 침전물을 여과하여 모은 다음 Et2O로 세척하고 진공 하에서 건조시킨다.
구체적으로, 클로린 e6 숙시니딜 에스테르를 수득하는 단계는 하기와 같이 수행될 수 있다.
질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 무수 DMSO 내의 클로린 e6 용액에 N-히드록시숙신이미드 및 디시클로헥실카보디이미드를 첨가하고, 상기 혼합물을 상온에서 2~6 시간 동안 교반한다. 이후 용매를 증발시킨 다음, acetone:CH2Cl2의 1:9(v/v) 혼합용매를 용리액으로 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행함으로써 정제한다. 분획물을 TLC로 시험하여 단 하나의 spot을 가진 것들만 모은 후 농축한다.
구체적으로, [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 또는 {γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}엽산}}-클로린 e6을 제조하는 단계는 하기와 같이 수행될 수 있다.
질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 무수의 DMSO와 피리딘 내 γ-(6-아미노헥실)엽산 또는 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}}엽산 용액에 클로린 e6 숙시니딜 에스테르를 첨가하여 실온에서 12~48 시간 동안 교반한 다음, 0℃로 냉각된 Et2O의 강력하게 교반되는 용액 안으로 상기 혼합물을 천천히 붓는다. 어두운 적색의 침전물을 여과하여 모은 다음, Et2O와 CH2Cl2로 세척한 후 진공 하에서 건조시킨다.
본 발명의 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물에 대하여 결합물 내 수용체 특징 보존 여부를 예비적으로 확인하기 위하여 전자흡수 스펙트럼과 형광 스펙트럼을 수행한 결과, 전자흡수 스펙트럼에서, 400와 650 nm에서 Chlorin의 특이적인 최대치가 나타났으며, 270 nm에서 엽산의 특이적인 최대치가 나타나고 360 nm에서 엽산의 특이적인 shoulder가 나타으며, 대상 결합물의 형광 스펙트럼에서는 660 nm와 700 nm에서 Chlorin에 상응하는 최대치가 나타났으며, 445 nm에서는 엽산의 특이적인 최대치가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물의 동종 그리고 이종 시스템에서의 일중항산소의 생성 효율 조사한 결과, 본 발명 클로린 e6-엽산 결합 화합물이 다양한 매질에서 일중항 산소를 효과적으로 생성하기 위한 최적의 특성을 가지고 있다는 점을 확인할 수 있었다. 또한, 종양세포와 조직에 대한 본 발명 클로린 e6-엽산 결합 화합물의 독특한 향성(tropism)을 고려해보면, 본 발명 클로린 e6-엽산 결합 화합물이 현재 알려져 있는 포르피린(porphirine) 계열의 다른 광민감제들보다 현저히 높은 광역학적인 활성을 가짐을 알 수 있었다.
더 나아가, 본 발명의 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물의 시험관 내 생물학적 효과를 조사하고자 엽산수용체를 과발현하는 다수의 종양세포 타입 중 하나인 헬라 세포를 이용하여 광활성 화합물의 세포내 축적과 표적화된 운반을 조사한 결과, 24시간 동안 배양한 후에는 클로린 e6-엽산 결합 화합물이 클로린 e6보다 평균적으로 10배 정도 많이 세포내에 축적되는 것을 확인할 수 있었다.
마지막으로, 본 발명의 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물의 생체 내 생물학적 효과를 조사하고자 수명 레이저 형광 분광분석법을 이용하여 클로린 e6과 클로린 e6-엽산 결합 화합물의 축적에 대한 분광학적 형광 분석 수행 결과는, 사코마 M-1 래트의 종양 조직 내 클로린 e6의 최대 축적은 10.0 mg/kg의 양을 정맥투여한 후 처음 5시간 동안임을 보여주고, Chlorin e6 결합물의 최대 축적은 5.0 mg/kg의 양을 투여한 후 2-5시간인 것으로 나타났다. 2.5, 5.0 및 10.0 mg/kg 투여량의 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 이용한 PDT 수행 후, 사코마 M-1 내에 형성된 괴사 면적을 통해 항종양효과를 평가한 결과, 가장 우수한 효과는 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 10.0 mg/kg의 투여량으로 투여했을 때 나타났으며, 이때 괴사율은 66.16%로 나타났다. 클로린 e6-엽산 결합 화합물로 PDT를 한 후 24일간 대조구 대비 래트의 사코마 M-1의 부피 성장 억제 효과를 모니터링한 결과, 86.34% ~ 99.1%의 억제율을 나타냈다.
이러한, 축적정도를 비교한 실험 결과는 클로린 e6-엽산 결합 화합물이 종양세포와 세포막에 대한 강화된 친화성을 가짐을 보여주고 있다. 사코마 내에서의 축적 비교를 통해 클로린 e6-엽산 결합 화합물이 클로린 e6보다 훨씬 더 종양에 대한 향성을 가짐을 확인할 수 있었다. 따라서, 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 이용한 광선요법의 효율성이 클로린 e6에 비해 현저히 우수하다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물은 상기와 같이 종래 포르피린 계열의 광민감제에 비해 현저히 우수한 종양 선택성을 가짐으로써 악성종양에 대한 광역학 치료에 유용한 특징을 가진다.
본 발명의 조성물은 상기 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 또는 {γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}엽산}}-클로린 e6, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 추가하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기한 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 클로린 e6-엽산 결합 화합물의 일일 투여량은 약 5 내지 1,000㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 10 내지 500㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물은 고형암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 클로린 e6과 엽산을 헥산-1,6-디아민을 통해 말단 링커를 결합시킴으로써, 다양한 매질에서 일중항 산소를 효과적으로 생성하고 종래 포르피린 계열의 광민감제에 비해 현저히 우수한 종양 선택성을 가져 악성종양에 대한 광역학치료에 있어 효율성이 현저히 뛰어나 광역학적으로 고형암을 치료하기 위한 치료제로써 유용한, 클로린 e6과 엽산이 결합된 형태의 신규 화합물인 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 γ-{[tert-butyl-N-(6-aminohexyl)]carbamate}folic acid의 질량분석스펙트럼(negative mode) 결과이다.
도 2는 γ-(6-aminohexyl)folic acid의 질량분석스펙트럼 결과이다. 여기에서 A는 Positive mode, B는 Negative mode 측정 결과이다.
도 3은 Chlorin e6 succinidyl ester의 질량분석스펙트럼 결과이다. 여기에서 A는 Positive mode, B는 Negative mode 측정 결과이다.
도 4는 γ-(6-aminohexyl)folic acid]-Chlorin e6 의 질량분석스펙트럼(Positive mode) 결과이다.
도 5는 γ-(6-aminohexyl)folic acid]-Chlorin e6 의 NMR 측정 결과이다.
도 6은 클로린 E6 결합물의 전자흡수 스펙트럼이다.
도 7은 클로린 E6과 클로린 E6 결합물의 형광 스펙트럼 및 형광 여기 스펙트럼을 보여준다.
도 8은 클로린 E6 결합물에 의해 광민감화된 일중항 산소의 발광 동역학 측정 결과이다.
도 9는 시간에 따른 헬라 세포 내 유리 클로린 E6 및 클로린 E6 결합물의 축적 비교 그래프이다.
도 10은 외인성 엽산을 첨가한 경우 시간에 따른 헬라 세포 내 유리 클로린 E6 및 클로린 E6 결합물의 축적 비교 그래프이다.
도 11은 광원노출이 없는 경우 헬라 세포 내 유리 클로린 E6 및 클로린 E6 결합물의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 12은 유리 클로린 E6 및 클로린 E6 결합물의 농도별 광역학적 활성을 나타낸 그래프이다.
도 13은 3.3 J/㎠의 조사량으로 조사한 경우 헬라 세포 내에서 유리 클로린 E6과 클로린 E6 결합물의 광광역학적 활성을 나타낸 그래프이다.
도 14는 2.5, 5.0 및 10.0 mg/kg의 투여량으로 클로린 E6을 투여한 경우 래트 내 사코마 M-1 및 정상 조직 내에서의 클로린 E6 축적 동역학을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 15는 2.5, 5.0 및 10.0 mg/kg의 투여량으로 클로린 E6 결합물을 투여한 경우 래트 내 사코마 M-1 및 정상 조직 내에서의 클로린 E6 결합물 축적 동역학을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1-1(화합물 I): γ-{[tert-butyl-N-(6-aminohexyl)]carbamate}folic acid (I)의 합성
상온, 질소 대기 하에서, 무수 DMSO와 피리딘 내 엽산(1615 mg, 3.66 mmol) 용액에 [tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트(= N-boc-1,6-hexanediamine) (871 mg, 4.03mmol) 및 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(1887 mg, 9.15 mmol)(또는 1,1'-carbonyldiimidazole)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 후, 0℃로 냉각된 무수 Et2O의 강력하게 교반되는 용액 안으로 상기 여과액을 천천히 부었다. 노란색의 침전물을 여과하여 모은 다음, EtO로 씻어 DMSO 잔류물을 제거하고 진공 상태에서 건조시켰다. 2132 mg을 수득하였고, 91.0 %의 수율을 나타냈다.
γ-{[tert-butyl-N-(6-aminohexyl)]carbamate}folic acid의 질량분석스펙트럼(negative mode) 결과 분자량은 639.73으로 나타났다(도 1).
실시예 1-2(화합물 I-I):
γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl carbamate}folic acid
상온, 질소 대기 하에서, 무수 DMSO와 피리딘 내 엽산(3.66 mmol) 용액에 tert-butyl 2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethylcarbamate (4.03mmol) 및 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(9.15 mmol)(또는 1,1'-carbonyldiimidazole)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 후, 0℃로 냉각된 무수 Et2O의 강력하게 교반되는 용액 안으로 상기 여과액을 천천히 부었다. 노란색의 침전물을 여과하여 모은 다음, EtO로 씻어 DMSO 잔류물을 제거하고 진공 상태에서 건조시켰다.
실시예 2: γ-(6-aminohexyl)folic acid (II)의 합성
상기 실시예 1-1 에서 제조되어진 화합물 I(2232 mg, 3.49 mmol) 또는 실시예 1-2에서 제조되어진 화합물 I-I(3.49 mmol)을 트리플루오로-아세트산 (TFA)으로 처리하고, 대기 온도에서 2시간 동안 교반한 다음 TFA를 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 무수 DMF에 넣은 다음, 피리딘을 노란색 침전물이 형성될 때까지 방울방울 넣어주었다. 노란색의 침전물을 여과하여 모은 다음 Et2O로 세척하고 진공 하에서 건조시켜 각각 생성물 II 또는 II-I을 제조하였다. 화합물 I을 출발물질로 하여 제조된 생성물(화합물 II)은 1652 mg을 수득하였고, 수율은 87.9 %를 나타내었다.
상기 생성물(화합물 II) γ-(6-aminohexyl)folic acid의 질량분석스펙트럼 결과 분자량은 538.79으로 나타났다(도 2). 도 2에서 A는 Positive mode, B는 Negative mode 측정 결과이다.
실시예 3: Chlorin e6 succinidyl ester (III)의 합성
질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 무수 DMSO 내의 Chlorin e6(45.37 mg, 7.6 × l0-2 mmol) 용액에 N-히드록시숙신이미드(8.7mg, 7.6 × 10-2 mmol) 및 디시클로헥실카보디이미드(DCC)(8.7 mg, 7.6 × l0-2 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 4 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시킨 다음, acetone:CH2Cl2의 1:9(v/v) 혼합용매를 용리액으로 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행함으로써 정제하였다. 분획물을 TLC로 시험하여 단 하나의 spot을 가진 것들만 모은 후 농축하였다. 42 mg을 수득하였으며, 79.7 %의 수율을 나타내었다.
Chlorin e6 succinidyl ester의 질량분석스펙트럼 결과 분자량은 693.74로 나타났다(도 3). 도 3에서 A는 Positive mode, B는 Negative mode 측정 결과이다.
실시예 4: γ-(6-aminohexyl)folic acid]-Chlorin e6 (IV)의 합성
질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 무수의 DMSO와 피리딘 내 화합물 II(29.3 mg, 5.45 × 10-2 mmol) 또는 화합물 II-I(5.45 × 10-2 mmol) 용액에 N-히드록시숙신이미드 처리된 Chlorin e6 (화합물 III) (37.7 mg, 5.45 × 10-2 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 다음, 0℃로 냉각된 Et2O의 강력하게 교반되는 용액 안으로 상기 혼합물을 천천히 부었다. 어두운 적색의 침전물을 여과하여 모은 다음, Et2O와 CH2Cl2로 세척한 후 진공 하에서 건조시켜 최종생성물을 제조하였다. 출발물질로 화합물 II와 화합물 III을 이용하여 최종생성물 화합물 IV 34 mg을 수득하였고, 수율은 55.8 %를 나타내었다.
최종생성물 화합물 IV인 γ-(6-aminohexyl)folic acid]-Chlorin e6 의 질량분석스펙트럼(Positive mode) 결과 분자량은 1183.46으로 나타났다(도 4).
최종생성물 화합물 IV인 γ-(6-aminohexyl)folic acid]-Chlorin e6 의 NMR 데이터를 도 5에 나타내었다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 12.2 (s, 1H, COOH), 11.68 (s, 1H, COOH), 10.37(s, 1H, NH), 9.78(s, 1H), 9.64(s, 1H), 9.15(s, 1H), 8.88(s, 1H, NH), 8.8(s, 1H), 8.20(q,1H), 7.56(s, 2H), 7.15(s, 2H), 6.89(s, 2H, NH2), 6.38(d, 1H), 6.15(d, 1H), 5.80(s, 1H), 5.40(m, 1H), 4.59(m, 2H) , 4.22(t.2H), 4.02(s, 2H), 3.59(s, 3H), 3.43(s, 3H), 3.20(s, 3H), 3.7(q, 1H), 2.65(m, 1H), 2.08-2.41(m, 8H), 1.89(t, 2H), 1.52-1.78(m, 12H), 1.28(m, 4H), 1.08-1.10(m, 7H), -1.72(s, 1H, NH), -1.96(s, 1H, NH)
실험예 1: 엽산과 Chlorin e6 결합물 내 수용체 특징 보존 예비적 확인
상기 실시예 4에서 제조한 엽산과 Chlorin e6의 결합물의 합성은 초기 성분 즉, 엽산과 Chlorin e6의 카르복실기(-COOH)를 통해서 접합시키는 방법에 기초하고 있다.
상기 결합물이 수용체의 특징을 보존하고 있는지 확인하기 위하여, 결합물에 대하여 전자흡수 스펙트럼과 형광 스펙트럼을 확인하였다.
전자흡수 스펙트럼 결과, 400와 650 nm에서 Chlorin의 특이적인 최대치가 나타났으며, 270 nm에서 엽산의 특이적인 최대치가 나타나고 360 nm에서 엽산의 특이적인 shoulder가 나타났다. 또한, 대상 결합물의 형광 스펙트럼에서는 660 nm와 700 nm에서 Chlorin에 상응하는 최대치가 나타났으며, 445 nm에서는 엽산의 특이적인 최대치가 나타났다.
상기와 같은 실험 결과는 대상 결합물 내의 엽산이 그 수용체적 특징을 완벽하게 보존하고 있음을 알 수 있었다.
유리 Chlorin e6과 결합물 내의 Chlorin e6의 광민감 활성에 대한 비교 실험 결과, Chlorin e6이 결합물 내에서도 600-700 nm에서의 여기상태에서 singlet oxygen을 발생시키는 능력과 광민감 활성을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다. 결합물 내 Chlorin e6의 경우 수용액과, 소수성 환경 즉, 결합물이 단백질과 결합한 경우에 모두 상기와 같은 결과를 나타내었다.
실험예 2: Chlorin e6 결합물의 분광-에너지 특징, 및 동종 그리고 이종 시스템에서의 일중항산소의 생성 효율 조사
Chlorin e6은 종양세포와 조직에 축적되어 종양세포를 파괴할 수 있다. 이러한 과정에서 주요한 역할을 하는 것은 세포 멤브레인의 비정상적 작동임이 알려져 있다. 이러한 비정상적 작동은 단백질과 지질 성분이 일중항산소와 같은 매우 반응성이 강한 산화제에 의해 산화된 것에 기인한 것이다. 이 일중항산소는 체내 산소 분자들과, 활성화된 삼중항 조건(activated triplet condition) 하의 광민감제 분자들 사이의 상호작용 과정에서 형성된 것이다. 102 생성의 효율성은 다음과 같은 많은 인자들에 의해서 결정된다: 감광제의 흡수력, 삼중항 조건의 세기 및 양자 방출량, 상기 조건에서의 수명, 존재하는 환경 하에서의 용해도 및 O2 확산 작용 등. 여기서 유의해야 할 점은 상기에서 언급한 인자들이 민감제의 동종 용액으로부터, 현저한 이종성의 특징을 가지는 생체 시스템과 이들의 복합체로 변환되는 동안 상당히 달라질 수 있다는 점이다. 이점이 본 실험에서 Chlorin e6 결합물의 분광-에너지 특징, 및 다양한 시스템에서의 일중항산소의 생성 효율을 조사하는 이유이다.
2-1 실험 방법
안료 단백질 복합물은, 동일한 버퍼에서 녹인 특정한 양의 광민감제를, 인간 혈청 알부민(HAS) 용액에 첨가함으로써 형성되었다. 본 실험에서 HAS와 Chlorin e6결합물의 몰농도 비율은 2.5:1이었다. 유사한 방법으로 detergent micelle(Triton Х-100, С=10-3М)에 광감제를 포함시켰다. 계란에서 지질의 겔 여과와 안료 분산을 통해 추출한 레시틴 유래의 단일층 리포좀과 클로린 결합물과의 복합체가 형성되었다.
조사 대상 용액의 전자흡수 스펙트럼은 Specord UV-Vis 상에서 기록되었다. 형광 스펙트럼과 형광 극성도 (Р) 값은 자동 분광형광계(Institute of Physics) 상에서 기록되었다. 광민감제 형광의 수명(tS)은 광양자 계산 방식으로 작동하는 임펄스 형광계를 사용하여 측정하였다.
InP/InGaAsP 반도체 광음극을 가진 새로운 Hamamatsu FEU에 기초하여 nanosecond time resolution으로 950-1400 nm의 범위에서 발광(luminescence) 신호를 기록할 수 있는 매우 민감한 laser fluorometer를 사용했다.
2-2 분광학적 파라미터
실온 하의 약알칼리 버퍼 (рН 7.4 - 8.1)에서, Chlorin e6 결합물의 전자 흡수 스펙트럼은 수소화된 이중 C = C 결합을 갖는 포르피린 유리 염기의 특이적인 구조를 보였다(도 6). 흡수 스펙트럼의 주요 특징은 660 nm에서의 강한(ε = 4.8 104 M-1cm-1) Qx (0-0) 밴드이었고, 이 위치는 대부분의 생물학적 조직의 스펙트럼 창(spectral window)이 되었다.
도 7은 버퍼에서의 Chlorin e6와 Chlorin e6 결합물의 형광 스펙트럼 및 형광 여기 스펙트럼을 보여준다. 두 안료의 형광 스펙트럼은 여기 파장에 의존하지 않았으며, 이들의 형광 여기 스펙트럼은 Chlorin e6의 흡수 스펙트럼과 거의 일치하였다. 다만 Chlorin e6 결합물의 여기 스펙트럼은 스펙트럼의 "파란 영역" 즉, 스펙트럼의 400~500nm 영역에서만 흡수 스펙트럼과 다르다는 점에 주목해야 한다. 결합물의 여기 스펙트럼에서 vectorial part(엽산)의 흡수에 상응하는 흡수 밴드는 나타나지 않았다.
Chlorin e6 결합물과, HSA, 리포좀, 또는 detergent micelle이 복합체를 형성하게 되면 안료의 흡수 스펙트럼과 형광 스펙트럼에서 장파색방 이동(bathochromic shift)을 일으키게 된다. 그러나, 형광 광반응(B)의 증가가 관찰되었으며, 이는 Kravec 적분 값의 변화없이 수명이 증가(tS)하는 것과 관련이 있다.
표 1 다른 시스템에서 Chlorin E6 결합물의 형광 파라미터
시스템(System) l 00 abs Nm l 00 fl nm t S ns B
H2O, pH 8.1 657 664 4.3 0.16
Triton X-100, pH 8.1 665 670 5.7 0.19
HSA, pH 8.1 664 669 5.2 0.18
리포좀(Liposomes), pH 8.1 665 670 5.4 0.21
디메틸 설폭사이드 661 672 4.6 -
피리딘 666 673 5.0 0.18
테트라하이드로퓨란 667 573 5.0 -
메탄올 662 667 4.8 -
매질의 극성이 감소하는 유기 용매에서도 Chlorin e6 결합물의 분광 파라미터의 유사한 변화가 관찰되었다.
얻어진 결과의 분석으로부터 모든 시스템에서의 Chlorin e6 결합물이 단량체적인 상태(monomeric state)에 있으며, 분광적 변화가 주로 배향 효과(orientational effects)에 의해 발생한다는 결론을 이끌어 낼 수 있다. 본 실험에서 특유하고 배향적인 상호 작용의 역할은 작았다. 모든 복합체에서 Chlorin e6 결합물은 극성이 피리딘과 동일한 소수성의 환경을 가진다.
2-3 광물리학적 파라미터
Chlorin e6 결합물의 상호결합성 전환(intercombinative conversion)의 효과적인 양자 효율성은 상대적 방법으로 측정되었다. 이 방법에 따르면, 기저 상태의 적은 소모 상태에서(≤ 10%) 하기 수학식 1이 성립한다.
[규칙 제26조에 의한 보정 23.09.2009]　
수학식 1
Figure WO-DOC-MATHS-1
[규칙 제26조에 의한 보정 23.09.2009]　　
상기 식에서,
Figure WO-DOC-FIGURE-171a
및
Figure WO-DOC-FIGURE-171b
는 각각 Chlorin e6 결합물의 상호결합성 전환 및 표준 물질의 광반응,
Figure WO-DOC-1
및
Figure WO-DOC-2
는 각각 측정 파장에서의 조사대상 용액 및 표준 용액의 삼중항-삼중항 흡수의 최대 편이(deviations),
Figure WO-DOC-3
및
Figure WO-DOC-4
는 각각 CHLORIN과 표준 물질의 일중항 소멸 및 삼중항-삼중항 흡수의 몰비(molar rates) 차이,
Figure WO-DOC-5
및
Figure WO-DOC-6
는 각각 CHLORIN과 표준 물질에 의해 상응하여 흡수된 빛의 점유율(shares)이다.
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
Figure WO-DOC-7
및
Figure WO-DOC-8
값은 여기된 삼중항 상태에서 조사하고자 하는 모든 분자를 실질적으로 옮긴 후에 측정되었다. 이러한 조건에서, ΔD = C
Figure WO-DOC-9
Tl 이다. 여기에서, C는 용액 내 물질의 몰농도를 가리키며, l은 광학 경로(optical way)의 길이를 가리킨다. γ를 측정하기 위한 표준 물질로는 벤졸에서의 γ 값이 1과 동일한 것으로 여겨지는, Pd(II)-octa ethyl porphyn (Pd (II) - OEP)이 선택되었다.
Figure WO-DOC-10
T의 파라미터를 측정할 때 여기 파장 상에서의 용액의 흡광도는 γ가 0.5일때 0.2를 초과하지 않았고, Chlorin e6 결합물의 상응하는 농도는 0.7 × 10-6 및 1.75 × 10-5 M을 초과하지 않았다.
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
측정된
Figure WO-DOC-FIGURE-11
T 및 γ 값을 하기 표 2에 나타내었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 12.08.2010]　
다양한 시스템에서의 Chlorin e6 결합물의 광물리학적 파라미터 및 1O2 생성 효율성
표 2
Figure WO-DOC-TABLE-2
[규칙 제26조에 의한 정정 23.09.2009]　
상기 표 2에 제시되어있는 Chlorin e6 결합물의 광물리학적 파라미터는 안료의 monomer state에 대해 특징적인 것이다. 모든 시스템에 있어 B + γ
Figure WO-DOC-MATHS-1
1 인한, 그것의 환경과 상관없이 Chlorin e6 결합물의 분자에서 일어나는 전자적 여기 에너지 감소의 주된 경로가 상호결합성 전환이라고 할 수 있다. 이 과정의 광반응성은 높게 나타나며(γ
Figure WO-DOC-MATHS-1
0.7), 모든 시스템에서 실질적으로 유사하게 나타난다. 그러나, 여기된 삼중항 상태의 수명은 산소가 제거된 용액(τt 0)과 산소로 포화된 용액(τt)에서 현저하게 다르게 나타났다.
안료의 리포솜 형을 보면, 버퍼 용액에 비해서 τt 0 값이 거의 2.5배 정도 낮은 수준이다. 리포솜에서의 Chlorin e6 결합물의 P값(P = 0.13)이 높은 것은 지질 이중층 내에 안료가 다소 단단한 원형으로 존재한다는 증거이다. 이러한 상황과 함께, 리포솜과 복합체를 이루고 있는 Chlorin e6 결합물의 광물리학적 특성을 고려하면, τt 0의 값이 감소한 것으로 관찰되는 것은 아마도 불포화 지방산 지질 사슬의 탄소-탄소 이중결합에 의한 안료의 삼중항 상태의 퀀칭(quenching)에 의한 것이라고 추측할 수 있을 것이다.
2-4 산소 분자에 의한, Chlorin e6 결합물의 여기된 삼중항 상태의 퀀칭
상기 표 2에 제시된 데이터는, 용액과 생체 시스템에 있는 산소 분자가 Chlorin e6 결합물의 여기된 삼중항 상태를 퀀칭하는 특이적인 특징을 분석하는데 도움을 준다. τt 0과 τt의 얻어진 값, 수용액에서의 O2의 농도(2.6 × 10-4 M), 피리딘에서의 O2의 농도(8.3 × 10-4 M)를 고려하고, 또한 물과 막(membrane) 간의 분배비가 3과 동일하다는 점을 고려하면, 다음 수학식 2를 이용하여 산소로 Chlorin e6 결합물의 삼중항 상태를 퀀칭하는 이분자적 속도상수를 측정할 수 있다.
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
Figure WO-DOC-MATHS-2
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
이 시스템에서,
Figure WO-DOC-12
값은 버퍼 용액, 피리딘 및 지질 이중층에서 Chlorin e6 결합물에 대하여 각각 1.5 × 109, 4.5 × 109, 및 9 × 109 M-1 c-1이었다. 안료-단백질 및 미셀 복합체에서, Chlorin e6 결합물의
Figure WO-DOC-12
값은 각각 2.5 × 109, 및 1.5 × 109 M-1 c-1이었다. 이러한 값은 만일 단백질 매트릭스 및 Trixon X-100 미셀 내 O2 농도가 수용액에서의 O2 농도와 다르지 않다면 올바른 값이라 할 수 있다. 명백하게, 비극성 매질 내에서의 O2 용해도가 H2O 내에서의 그것의 용해도보다 몇 배 더 높다고 알려져 있는 한, 이는
Figure WO-DOC-12
값의 상한이다. 안료-단백질 복합체 내 산소 분자에 의한 Chlorin e6 결합물의 여기된 삼중항 상태 퀀칭의 특이한 특징을 살펴보았다. 단백질 트립토판일(tryptophaniles)의 형광은 O2에 의해 효과적으로 퀀칭되고, 상응하는 퀀칭의 이분자적 속도상수는 2 × 109 M-1 c-1 ~ 5 × 109 M-1 c-1의 범위라는 점이 알려져 있다. 한편, 구형 단백질의 X-선 구조 분석 데이터는 그들의 아미노산 잔기가 치밀하게 몰려 있음을 나타내었다. 이는 O2와 같은 분자의 확산에 대해 상당한 입체적 장애를 주는 원인이 되었다.
2-5 일중항 산소의 생성
이 과정의 광반응(φΔ)은 1270 nm의 파장에서 일중항 산소 발광 세기의 적분을 통해서 상대적인 방법으로 측정되었다. 여기상태는 531 nm (펄스 에너지 4 microJ, 주파수 1kHz)의 파장 상에서 수행되어졌다. 테스트는 실온에서 공기로 포화된 버퍼용액 내에서 이루어졌다. Tetra(n-sulfophenyl) porphyn (TSPP)을 Chlorin e6 결합물의 φΔ 측정을 위한 표준물질로 선택하였다. D2O 내 φΔ는 0.7인 것으로 고려되어졌다. 모든 경우에 있어 여기상태 파장에서 용액들의 흡광도는 0.1를 초과하지 않았다(코팅 두께: 10 mm).
Chlorin e6 결합물에 의해 광민감화된 일중항 산소의 발광 동역학 측정 결과가 도 8에 나타나 있다.
일중항 산소 발광의 동역학 곡선 분석을 위하여 하기 함수가 사용되었다.
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
Figure WO-DOC-13
상기 식에서, A는 상호작용하는 시약의 초기 농도에 의존하는 계수이고, k1 과 k2는 각각 발광 시그널의 증가상수와 소멸상수를 나타낸다.
광민감제 삼중항 상태의 비활성화 속도 상수 Kτ가 산소 분자 삼중항 상태의 비활성화 상수 KΔ를 초과하는 경우, 증가상수 k1는 Kτ에 상응하고 소멸상수 k2는 KΔ에 상응하게 된다. Kτ < KΔ 인 경우에는, 일중항 산소 발광의 동역학이 역으로 일어나게 된다. 이 경우, k2 = Kτ이며 k1 = KΔ 이다. Extinguishers가 존재하지 않는, 공기로 포화된 용액 내에서서는 첫번째 경우가 실현되었다. 따라서, 동역학 데이터에 근거하여 일중항 산소의 수명과 삼중항 상태의 수명을 계산할 수 있다.
그러므로, 동역학 곡선에 근거해서 다음과 같이 Chlorin e6 결합물의 τt 및 τΔ의 값을 얻었다: 2.0±0.2 microsec. 및 3.6±0.2 microsec. Chlorin e6 결합물의 삼중항 상태의 수명의 언급된 값들은, flesh-photolysis의 방법을 통해서 얻은 τt 및 문헌으로부터 알려진 값인 τΔ와 상관이 있다. Chlorin e6 결합물의 일중항 산소의 광민감성 형태(photosensitizing form) 광반응은 용액의 рH를 0.7(рH 8.1) 내지 0.52(рH 6.0)로 낮춤에 따라 감소하였다. 이는 pH를 낮춤에 따라 Chlorin e6 결합물의 결집이 발생하는 것과 관련이 있다.
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
상기 표 2에서 분명하게 볼 수 있듯이, 피리딘과 버퍼 용액 내에서 Chlorin 결합물의 분자들은 1O를 매우 효율적으로 생성하였다. 용액 내 단백질의 존재는 τΔ를대략 1.1까지 감소시키는데, 이는 이분자적 퀀칭 상수,
Figure WO-DOC-14
= 1.5 × 108 M-1c-1에 상응하는 것이다. 용액 내 안료 농도(3.1×10-6 M) 및 단백질의 농도(Cσ= 9.3×10-6M), 상수값(κCB=1.2×106M-1) 및 Chlorin e6 결합물(n = 1)과 결합하는 위치의 수를 알고 있으므로, 다음 수학식 3을 사용하여 안료-단백질 복합체에 포함된 민감제 분자의 점유율을 측정할 수 있다.
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
Figure WO-DOC-MATHS-3
[규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
상기 식에서, r 및 C는 각각 결합된 단백질 안료의 농도 및 비결합된 단백질 안료의 농도이며,
Figure WO-DOC-15
이다. 본 실험에서는 90%와 동일하다. 이는 해당 F 값을 단백질 구체 내에 결합되어있는 Chlorin e6 결합물 분자들의 생성 효율성으로서 간주할 수 있는 이유이다. 이는 또한 Triton Х-100의 미셀 내에 포함되어 있는 안료 분자들에도 적용가능하다. 그러나 안타깝게도 단일층 막과 Chlorin e6 결합물의 복합체 형성을 다루는데 있어서는 몇 가지 방법상의 문제로 인해 F값을 측정할 수 없었다. 그러나, 지질 이중-층 내 Chlorin e6 결합물의 광물리학적 파라미터들을 고려하면, 1O2 생성 효율성이 다른 연구된 복합체 내에서 보다도 최소한 더 낮지는 않아야 할 것이라고 주장할 수 있을 것이다.
본 실험결과를 고려해볼 때, Chlorin e6 결합물이 다양한 매질에서 일중항 산소를 효과적으로 생성하기 위한 최적의 특성을 가지고 있다는 점을 확인할 수 있었다. 또한, 종양세포와 조직에 대한 본 발명 Chlorin e6 결합물의 독특한 향성(tropism)을 고려해보면, 본 발명 Chlorin e6 결합물이 현재 알려져 있는 포르피린(porphirine) 계열의 다른 광민감제들보다 현저히 높은 광역학적인 활성을 가짐을 알 수 있었다.
실험예 3: 본 발명 Chlorin e6 결합물의 시험관 내 생물학적 효과 조사
3.1 축적 및 경쟁 분석
광활성 화합물의 세포내 축적과 표적화된 운반은, 엽산수용체를 과발현하는 다수의 종양세포 타입 중 하나인 헬라 세포를 이용하여 조사하였다.
[규칙 제26조에 의한 보정 23.09.2009]　
세포를 3일간 배지 199에서 배양하여 Hank's 용액/배지 199 (9/1)에 이식했다. 3시간 후에 트립신을 이용하여 기질로부터 세포를 수집하여 Hank's 용액에 옮겼다(105
Figure WO-DOC-FIGURE-1
Figure WO-DOC-FIGURE-2
/ml). 세포 현탁액에 Chlorin e6 결합물을 2×10-7 M/l의 농도로 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. 1 시간, 그리고 5, 10, 15, 24 시간 후에, 시료를 원심분리하고, 침전물을 차가운 Hank's 용액 내에서 세척한 후, 상기 침전물을 Hank's 용액에 초기 현탁액 내 세포 농도까지 넣었다. 얻어진 시료 내의 Chlorin e6과 Chlorin e6 결합물의 상대적 농도는
Figure WO-DOC-FIGURE-4
에서의 현탁액의 형광 세기로 측정하였다.
표 3에 헬라 세포 내의 Chlorin e6과 Chlorin e6 결합물의 농도(상대적인 값 units/104 cl.)를 나타내었다.
표 3
배양시간(hours) Chlorin e6 Chlorin e6 결합물
1 0,86 0,40
5 1,45 1,80
10 1,72 2,50
15 0,81 12,5
24 0,40 15,0
상기 표 3을 통해, 유리의 Chlorin e6과 엽산과 결합된 Chlorin e6 결합물 모두 세포에 축적됨을 알 수 있다. 그러나, 축적의 동역학은 다르게 나타나고 있다. 대부분의 유리 Chlorin e6이 5시간 이내에 세포에 축적되는 반면에, Chlorin e6 결합물의 축적은 20시간에 걸쳐 선형적으로 증가하고 있다.
6시간 배양한 후에, Chlorin e6 결합물의 축적 수치가 유리 Chlorin e6의 축적 수치보다 뚜렷하게 높게 나타나고 있다(도 9).
24시간 노출한 후에 Chlorin e6 결합물의 축적 수치는 유리 Chlorin e6의 축적 수치보다 평균적으로 8-10배 가량 높게 나타났다. Chlorin e6 결합물의 축적 수치가 24시간에 걸쳐 지속적으로 증가하였는데, 이는 비특이적인 세포 흡수 보다는 수용체-매개의 엔도시토시스를 통한 활발한 운반이 일어남을 시사하는 것이다.
외인성 엽산의 존재가 유리 Chlorin e6 와 Chlorin e6 결합물의 헬라 세포내의 축적에 미치는 영향을 조사하기 위해서, 엽산을 유리 Chlorin e6 와 Chlorin e6 결합물 첨가 전에 4 μM/l의 농도로 세포 현탁액에 첨가한 후에 유리 Chlorin e6와 Chlorin e6 결합물과 함께 24시간 동안 배양했다. 이후에 시료를 원심분리하고, 상청액을 수거하고 침전물을 차가운 Hank's 용액 내에서 다시 세척하였다. 수득된 두번째 침전물을 다시 Hank's 용액에 넣었다.
형광 세기를 측정하여 헬라 세포 내 유리 chlorin e6과 chlorin e6 결합물의 축적량을 비교하였다.
24시간 노출 후에, Chlorin e6 결합물의 축적량이 유리 Chlorin e6의 축적량보다 많았다. 도 10은 4 μM/l의 유리 엽산이 헬라 세포에서의 Chlorin e6 결합물의 축적을 상당량 감소시켰음을 보여준다(p < 0.05). 반면에 엽산의 존재는 유리 Chlorin e6의 축적량에는 영향을 미치지 않았다. 사실상, Chlorin e6의 세포 내 축적은 배양 매질 내 길항적인 농도의 엽산의 존재에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, 길항적인 엽산의 존재 하에서 Chlorin e6 결합물의 축적이 감소하더라도, 여전히 유리 Chlorin e6에 비해서는 우월한 것으로 나타났다. 이는 엽산의 존재가 또한 비특이적인 축적을 증가시킬 수 있음을 제시하는 것이다.
3.2 세포독성(항증식성 분석)
세포의 증식 과정 강도, 광민감제의 농도, 및 광학적 파워를 고려하여 세포 독성을 조사하였다. 이를 위해 단일층의 세포를 담은 3개의 플라스크가 사용되었다.
세포로는 헬라 종양 세포의 단일층 배양물을 사용하였다.
헬라 종양 세포의 배양물을 영양배지 199, 또는 10% 우태아 혈청 및 100 mg/ml의 카나마이신을 첨가한 헤모히드롤리제이트 함유 영양 배지 내에서 성장시켰다.
플라스크 내에 세포 배양물을 접종(영양 배지 2.0 ml 당 100,000 cells) 한 후 4일째에 광민감제를 각각 1, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0, 30.0 mg/ml씩 첨가하였다.
광-보호 커버(dark cytotoxicity)를 가진 플라스크는 1 시간 동안 37.5 ℃에서 배양하였다. 세포를 Hank's 용액을 이용하여 4회 세척하였다. 신선한 영양 배지 2.0 ml를 첨가하고 "METALAZ" 레이져 의료기구(파장 627.8 nm, 578.2 또는 510.6 nm) 또는 "LD 680-2000"(파장 670-690 nm) (조사하고자 하는 광민감제의 분광학적 최대 흡수 파장에 따라)의 광선속(light flux)으로 5, 10, 15 또는 20 분 동안 얼음이 녹는 온도에서 40 J/㎠의 조사량으로 조사하였다. 20-24 시간 후에 Goriaev's 챔버 내에서 종양 세포를 계수하였다.
표 4는 24시간 동안 배양 후 헬라 세포의 수를 대조구에 대한 비율로서 보여주고 있다.
표 4
광민감제 농도(μm) Chlorin e6 Chlorin e6 결합물
1 101.3 102.1
2.5 99.1 95.6
5.0 98.4 94.1
10.0 95.5 95.9
20.0 90.0 89.0
30.0 89.7 86.6
상기 표 4를 통해 알 수 있듯이, 약 90%의 생존율을 보이는 실험결과들을 통해 헬라 세포와 광활성 화합물인 Chlorin e6과 Chlorin e6 결합물을 24시간 동안 배양하더라도 광원노출이 없는 경우에는 세포독성을 유발하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다(도 11). 또한, 엽산을 첨가하더라도 Chlorin e6에서 세포독성이 보이지 않는 성질이 변형되지 않았다.
3.3 Chlorin e6 대 Chlorin e6 결합물의 광독성(광역학적인 활성) 분석
헬라 세포 배양물에 대한 광민감제들의 광역학 효과를 조사하기 위해, 플라스크에 세포 배양물이 이식된 후 3일째에 영양배지의 조사하고자 하는 광민감제 용액을 최종 농도가 0.1, 0.5, 1.0, 5.0 또는 10 mcg/ml가 되도록 첨가하였다. 플라스크들을 광 보호 커버로 싸고 37 ℃에서 3.5 시간 동안 배양시켰다. 그 다음 Hank's 용액으로 세척한 후 얼음 상에서 레이저 의료기기 "LD 680-2000"(파장 670-690 nm)를 이용하여 3.3 joule/cm2의 조사량으로 조사되었다. 20-24시간 후에 유효한 세포 단일층을 0.02% Versene 용액으로 분산시키고, 종양 세포를 Goriaev's 챔버에서 계수하였다. 이를 위해 3개의 플라스크를 사용했다.
표 5는, 3.5 시간 동안 광민감제로 배양시키고 3.3 joule/㎠의 조사량으로 광노출(PhE)을 추가로 시킨 다음 헬라 세포의 수를 대조구에 대한 비율로 나타낸 것이다.
표 5
광민감제 농도(mcg/ml) Chlorin e6 Chlorin e6 결합물
0,1 87,1 65,1
0,5 83,6 42,3
1,0 64,7 12,6
5,0 19 0,1
10,0 3,8 -
광역학적 활성에 대한 분석으로 이의 높은 효율성을 확인할 수 있었다. 5-10 mcg/ml의 농도에서 Chlorin e6 결합물은 헬라 세포의 증식을 완전히 억제하였다(도 12).
다른 실험에서, 세포들은 광민감제와 함께 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 얼음 상에서 동일한 레이저기기인 "LD 680-2000"(파장 670-690 nm)를 이용하여 1.5-15 joule/cm2의 조사량으로 조사되었다.
도 13은 본 실험 조건에서 Chlorin e6 대조구 광민감제가 광독성을 거의 보이지 않았음을 보여준다. 반면에, 생존 측정 테스트는 Chlorin e6 결합물을 사용함으로써 광민감도가 Chlorin e6 매개의 광민감도에 비해 향상됨을 보여주었다.
본 실험은 Chlorin e6의 광생물학적 활성이 엽산결합을 통해 향상되었음을 보여주었다.
따라서, 엽산수용체를 과발현하는 헬라 세포를 이용하여 24시간 동안 배양한 후에는 Chlorin e6 결합물이 Chlorin e6보다 평균적으로 10배 정도 많이 축적되었다.
종양세포들은 정상세포와 비교해서 과발현하는 수용체의 수와 유형이 상당히 다르게 나타난다. 특정 수용체의 과발현 현상이 광민감제의 종양선택적 운반에 종종 이용된다. 엽산수용체를 과발현하는 헬라 세포의 경우 folate-targeting ligand를 이용하게 된다.
Chlorin e6 결합물의 헬라 세포에의 축적은 엽산 특이적인 것이며 비결합 Chlorin e6보다 훨씬 더 크게 이루어진다고 결론 내릴 수 있다.
실험예 4: 본 발명 Chlorin e6 결합물의 생체 내 생물학적 효과 조사
4-1 사코마 M-1 래트에 대한 광 노출시 광민감제의 축적 동역학
먼저, 사코마 M-1 래트에 대한 광 노출시 광민감제의 축적 동역학를 조사하였다.
광민감제로는 Chlorin e6과 Chlorin e6 결합물을 비교하였으며, 상기 광민감제를 사코마 M-1 래트에 2.5, 5.0 및 10.0 mg/kg의 양으로 정맥 투여한 다음 종양 조직과 정상 조직 내 두 광민감제의 축적 동역학을 분석하였다.
본 실험은 사코마 M-1이 피하 이식된 100 마리의 이계 교배한 화이트 래트를 이용하여 종양이식 후 7-9일 된 래트를 대상으로 수행되었다. 광민감제들은 조도가 낮은 실내에서 각각 2.5, 5.0 및 10.0 mg/kg의 양으로 각 군의 래트에 일회 정맥 투여되었다. 염화나트륨의 멸균 자연 등장 용액을 용매로서 사용하였다. 광민감제의 종양조직과 정상조직에의 축적 동역학 분석은 광민감제 투여 후 30분, 1-5시간, 그리고 1-6일간에 걸쳐 수행되었다.
래트의 사코마 M-1 및 정상 조직(둔부 피부 조직) 내에서의 광민감제의 축적 동역학은 컴퓨터화된 형광 분광분석기를 이용한 수명 측정법으로 수행되었다. 이러한 목적을 위하여, 헬륨-네온 진단 레이저인 "LHN 633-25"와 함께 레이저-섬유 스펙트럼 분석기(laser-fiber spectrum analyzer)인 "LESA-6"를 사용하였다. 이로써 광섬유 프로브가 도달할 수 있는 어떠한 기관이나 조직에서도 광민감제의 축적 정도를 국부적으로 평가할 수 있었다.
실시간 모니터링을 위해서 약제투여후 매시간 카테터의 끝부분을 종양 조직과 정상조직 위에 올려놓고 약제축적의 강도를 최대 형광에 대응하는 파장에서 기록했다.
고려되어진 지수의 획득한 디지털 수치를 컴퓨터 프로그램 Origin 6.1을 사용하여 일반적으로 인정된 통계기법으로 처리하였다. 유의수준은 0.05이었다.
Chlorin e6과 Chlorin e6 결합물의 투여 후 처음 5시간과 1-6일 동안 래트의 사코마 M-1 및 정상 조직 내 형광 세기 데이터를 도 14 및 도 15에 나타내었다. 투여 후 4-5시간까지는 투여량에 관계없이 두 광민감제의 축적정도의 차이가 정상조직보다 종양조직에서 2-3배 높게 나타났다.
선택율(종양에서의 평균 축적도/정상조직에서의 평균 축적도) 측정결과는 10.0 mg/kg의 투여량으로 정맥투여 한 후 처음 5시간에 래트의 종양 조직에서 Chlorin e6의 가장 높은 축적이 이루어짐을 보여주었다. Chlorin e6 결합물의 경우에는 최대 축적이 5.0 mg/kg의 투여량으로 정맥투여 한 후 2-5시간에 기록되었다.
4-2 사코마 M-1 래트에 대한 광 노출시 광민감제의 항-종양 효과
2.5, 5.0 및 10.0 mg/kg의 양으로 Chlorin e6 결합물을 정맥 투여한 후, 100 J/㎠의 조사량으로 광 노출시킨 다음 사코마 M-1 래트 내 괴사된 면적을 측정하였다.
Chlorin e6 결합물을 사용한 PDT의 항종양 효과는 레이저 기기인 LD 680-2000을 사용하여 100 J/cm2의 조사량으로 광노출시킨 후 24시간 동안 0.6% 이반 블루로 생체 염색하여(체중 100g 당 1 ml) 종양 내에 형성되는 괴사 면적을 정량적으로 평가함으로써 모니터링 하였다. 괴사 면적은 생체 염색 2시간 후에 실험대상 쥐들을 클로로포름으로 죽이고 종양을 떼어내서 10%-HOM 포르말린에 한 시간 동안 고착시킨 다음, 종양덩이에서 지름이 가장 큰 횡단면을 채취하여 컴퓨터에 연결된 카메라로 사진을 찍어서 측정하였다.
PDT로 인해 형성된 괴사 영역을 정량적으로 측정하기 위해 특수한 프로그램과 컴퓨터를 사용하여 조직-지형적 종양 슬라이드의 색조(color tint)를 분석하는 방법을 사용했다.
이 프로그램에는 종양의 관찰가능한 영역을 염색한, 청색(Evans blue)을 식별할 수 있는 알고리즘이 포함되어 있다. 직접적인 독성 효과나 미소순환의 구조적, 기능적 교란에 의해 파괴된 종양부위는 청색으로 물들지 않는다. 종양 슬라이드의 영역 안에 있는 총 점(dots)의 수에 대한 착색되지 않은 총 점의 수의 비율을 파괴 효율성으로 간주하였다.
사코마 M-1에서 Chlorin e6 결합물의 축적에 대하여 분광학적-형광 모니터링을 통해 얻은 데이터에 기반하여, 종양에 대한 광 조사는 Chlorin e6 결합물을 정맥투여한 후 1시간 및 4시간이 지난 후 수행되었다.
이를 위해 레이저 의료기기 "
Figure PCTKR2009002276-appb-I000030
"(BIOSPEC, Moscow)를 이용해서, 670 nm의 노출파장으로 100 J/cm2의 조사량으로 조사하였다. 출력밀도는 0.51 W/cm2, 출력전력은 0.4 W, 조사광 직경은 1 cm이었다. 조사시간은 3.27초였다. 발광전력에 대한 모니터링은 레이저 디바이스 "
Figure PCTKR2009002276-appb-I000031
"이 내장된 일반적인 파워미터에 의해 수행되었다.
표 6 내지 표 10은 사코마 M-1이 이식된 실험대상 쥐들의 75개의 조직-지형적 슬라이드 내 괴사면적에 대한 데이터를 나타내고 있다. 여기서 괴사는 Chlorin e6 결합물을 각각 2.5, 5.0 및 10.0 mg/kg의 투여양으로 투여하고 100 J/cm2의 조사량으로 조사한 후 PDT를 수행하여 형성된 것이다.
Chlorin e6 결합물을 2.5 mg/kg의 양으로 투여한 PDT의 경우 25.56 ± 1.65%의 괴사율을 나타냈고, 5.0 mg/kg의 양을 투여한 경우에는 괴사율이 34.16 ± 2.16%로 증가했다. 10.0 mg/kg의 양을 투여하고 4시간 광조사를 한 경우에는 66.16±3.83%의 괴사율을 기록했다. 가장 현저한 항-종양 효과는 Chlorin e6 결합물을 10.0 mg/kg의 양으로 투여하고 1 시간 동안 광조사한 경우에 기록되었다.
표 6 Chlorin e6 결합물을 2.5 mg/kg의 양으로 투여하고 약 투여후 4 시간에 100 J/cm2의 조사량으로 PDT를 수행한 후 사코마 M-1 래트의 조직-지형적 슬라이드의 괴사 면적
슬라이드 번호 사코마 M-1 슬라이드 면적, ㎠ 괴사면적, ㎠　 전체 면적 대비 괴사면적 비율, %　
1 2.409 0.568 24
2 2.209 0.378 17
3 2.457 0.460 19
4 2.735 0.409 15
5 2.687 0.488 18
6 2.761 0.864 31
7 2.635 0.832 32
8 2.611 0.858 33
9 2.394 1.038 43
10 2.519 0.899 36
11 2.190 0.498 23
12 2.348 0.579 25
13 2.394 0.754 32
14 2.571 0.778 30
15 2.780 0.996 36
16 2.363 0.661 28
17 2.093 0.565 27
18 2.212 0.795 36
19 2.636 0.627 24
20 2.805 0.808 29
21 2.587 0.414 16
22 2.504 0.357 14
23 2.942 0.394 13
24 2.471 0.369 15
25 2.377 0.547 23
X± 2.508 0.637 25.56
Sd 0.042 0.041 1.651
표 7 Chlorin e6 결합물을 5.0 mg/kg의 양으로 투여하고 약 투여후 4 시간에 100 J/cm2의 조사량으로 PDT를 수행한 후 사코마 M-1 래트의 조직-지형적 슬라이드의 괴사 면적
슬라이드 번호 사코마 M-1 슬라이드 면적, ㎠ 괴사면적, ㎠ 전체 면적 대비 괴사면적 비율, %
1 2.149 0.433 20
2 2.412 0.668 28
3 2.640 0.691 26
4 1.886 0.521 28
5 2.664 0.792 30
6 2.450 0.732 30
7 2.913 0.837 29
8 2.845 0.994 35
9 2.409 0.931 39
10 2.510 0.998 40
11 1.937 0.474 24
12 1.374 0.602 44
13 1.598 0.901 56
14 1.412 0.642 46
15 1.663 0.947 57
16 1.814 0.978 54
17 2.226 0.548 25
18 1.813 0.531 29
19 2.292 0.489 21
20 3.105 0.927 30
21 2.227 0.647 29
22 3.117 0.841 27
23 2.835 0.810 29
24 2.172 0.662 30
25 1.924 0.932 48
X± 2,255 0.741 34.16
Sd 0.100 0.036 2.163
표 8 Chlorin e6 결합물을 10.0 mg/kg의 양으로 투여하고 약 투여후 4 시간에 100 J/cm2의 조사량으로 PDT를 수행한 후 사코마 M-1 래트의 조직-지형적 슬라이드의 괴사 면적
슬라이드 번호 사코마 M-1 슬라이드 면적, ㎠ 괴사면적, ㎠ 전체 면적 대비 괴사면적 비율, %
1 1.399 0.913 65
2 1.368 0.908 66
3 1.422 1.026 72
4 1.533 1.196 78
5 1.734 1.606 93
6 1.672 1.539 92
7 1.724 1.473 85
8 1.574 1.423 90
9 2.207 0.720 33
10 2.503 0.860 32
11 1.961 1.009 51
12 2.105 1.231 58
13 1.891 1.690 89
14 2.007 1.803 90
15 1.719 1.346 78
16 1.460 0.988 68
17 2.613 0.762 29
18 1.655 1.313 79
19 2.124 1.075 51
20 2.414 1.279 53
21 2.034 1.405 69
22 2.357 1.165 49
23 2.451 1.297 53
24 1.668 1.199 72
25 1.557 0.919 59
X± 1.886 1.205 66.16
Sd 0.075 0.058 3.828
표 9 종양 이식 후 시간(일)에 따른 ㎤으로 표현된, Chlorin e6 결합물을 이용한 PDT 수행 후 래트 내 사코마 M-1의 성장 역학
　 　 7 10 12 14 17 19 21 24
대조구 0.46±0.03 1.36±0.09 2.75±0.34 4.03±0.43 8.87±0.66 11.53±0.6 16.61±0.59 18.61±0.78
2,5 mg/kg +　100 J/㎠ for 1 h 0.25±0.03 0.28±0.03 0.34±0.06 0.41±0.09 0.46±0.11 0.69±0.27 0.96±0.38 1.19±0.48
5 mg/kg +　100 J/㎠ for 1 h 0.29±0.02 0.300±.03 0.30±0.03 0.30±0.03 0.37±0.05 0.47±0.11 0.50±0.14 0.54±0.17
10 mg/kg +　100 J/㎠ for 1 h 0.20±0.03 0.19±0.04 0.17±0.03 0.17±0.03 0.17±0.03 0.17±0.03 0.20±0.03 0.20±0.03
표 10 Chlorin e6 결합물을 이용한 PDT 수행 후 래트의 사코마 M-1의 대조구 대비 부피 성장 억제 비율
투여량　 시간(일)에 따른 래트의 사코마 M-1의 부피 성장 억제율
7 10 12 14 17 19 21 24
2,5 mg/100 g +100 J/㎠ for 1 h 47,5 79,4 87,6 89,8 94,8 94,1 94,2 93,6
5 mg/100 g +100 J/㎠ for 1 h 36,9 77,9 89,1 92,6 95,8 95,9 96,9 97,1
10 mg/100 g +100 J/㎠ for 1 h 56,5 86,0 93,8 95,8 98,1 95,2 98,8 98,9
수명 레이저 형광 분광분석법을 이용하여 Chlorin e6과 Chlorin e6 결합물의 축적에 대한 분광학적 형광 분석 수행 결과는, 사코마 M-1 래트의 종양 조직 내 Chlorin e6의 최대 축적은 10.0 mg/kg의 양을 정맥투여한 후 처음 5시간 동안임을 보여주었다. 아울러, Chlorin e6 결합물의 최대 축적은 5.0 mg/kg의 양을 투여한 후 2-5시간인 것으로 기록되었다.
2.5, 5.0 및 10.0 mg/kg 투여량의 Chlorin e6 결합물을 이용한 PDT 수행 후, 사코마 M-1 내에 형성된 괴사 면적을 통해 항종양효과를 평가한 결과, 가장 우수한 효과는 Chlorin e6 결합물을 10.0 mg/kg의 투여량으로 투여했을 때 나타났으며, 이때 괴사율은 66.16%로 나타났다.
Chlorin e6 결합물로 PDT를 한 후 24일간 대조구 대비 래트의 사코마 M-1의 부피 성장 억제 효과를 모니터링한 결과, 86.34% ~ 99.1%의 억제율을 나타냈다.
축적정도를 비교한 실험 결과는 Chlorin e6 결합물이 종양세포와 세포막에 대한 강화된 친화성을 가짐을 보여주고 있다. 상기와 같은 유도된 사코마 내에서의 축적 비교를 통해 Chlorin e6 결합물이 Chlorin e6보다 훨씬 더 종양에 대한 향성을 가짐을 확인할 수 있었다. 따라서, Chlorin e6 결합물을 이용한 광선요법의 효율성이 Chlorin e6에 비해 현저히 우수하다는 것을 알 수 있다.
본 실험결과를 고려해볼 때, Chlorin e6 결합물은 다양한 매질에서 일중항 산소를 효과적으로 생성하기 위한 최적의 특성을 가지고 있다는 결론을 내릴 수 있다. 또한 종양세포와 조직에 대한 Chlorin e6 결합물의 독특한 향성(tropism)을 고려해보면, Chlorin e6 결합물이 현재 알려져 있는 모든 포르피린 계열의 다른 광민감제들을 뛰어넘는 높은 광역학적 활성을 가진다는 것을 알 수 있을 것이다.

Claims (4)

  1. [규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
    하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    Figure WO-DOC-CHEMICAL-1
    Figure WO-DOC-CHEMICAL-2
  2. [규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
    하기 단계를 포함하는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 신규한 클로린 e6-엽산 결합 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제조하는 방법: 엽산과 [tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트 또는 tert-butyl 2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethylcarbamate를 상온, 질소 대기 하에서 반응시켜 γ-{[tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산 또는 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl carbamate}folic acid를 수득하는 단계; 상기 단계의 γ-{[tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산 또는 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl carbamate}folic acid에 트리플루오로-아세트산을 첨가하여 반응시킴으로서 γ-(6-아미노헥실)엽산 또는 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}}엽산을 수득하는 단계; 질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 클로린 e6에 N-히드록시숙신이미드 및 디시클로헥실카보디이미드를 첨가하여 반응시킴으로써 클로린 e6 숙시니딜 에스테르를 수득하는 단계; 및 질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 상기 단계에서 제조한 γ-(6-아미노헥실)엽산 또는 γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}}엽산에 클로린 e6 숙시니딜 에스테르를 첨가하여 반응시킴으로써 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 또는 {γ-{N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}엽산}}-클로린 e6을 제조하는 단계.
    Figure WO-DOC-CHEMICAL-1
    Figure WO-DOC-CHEMICAL-2
  3. [규칙 제26조에 의한 보정 20.07.2009]　
    하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 클로린 e6-엽산 결합 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로서 함유하는, 광역학적으로 고형암을 치료하기 위한 약학적 조성물:
    Figure WO-DOC-CHEMICAL-1
    Figure WO-DOC-CHEMICAL-2
  4. 제 3항에 있어서, 상기 고형암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는 광역학적으로 고형암을 치료하기 위한 약학적 조성물.
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