KR101720046B1 - 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 나노제형화된 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 광감작제, 특정 범위의 수소 이온 농도(pH) 조건에서 분리되는 리간드 A, 및 특정 범위의 수소 이온 농도 조건에서 표면 전하가 변하는 리간드 B를 포함하는, 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물, 및 이의 제조 방법에 대한 것이다.

Description

광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물{Self-Assembled Pharmaceutical Composition for Photodynamic Therapy}
본 발명은 나노제형화된 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 광감작제, 특정 범위의 수소 이온 농도(pH) 조건에서 분리되는 리간드 A, 및 특정 범위의 수소 이온 농도 조건에서 표면 전하가 변하는 리간드 B를 포함하는, 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물, 및 이의 제조 방법에 대한 것이다.
암이라고 통칭되는 질병은, 주로 통제할 수 없는 세포의 성장(neoplasia)으로 인하여 발생하는 현상으로서 100가지 이상의 질환이다. 비정상적인 세포의 성장이 세포의 덩어리(tumor)를 이루고 이러한 세포 덩어리가 주위의 조직으로 침투하고 이어서 신체의 다른 부위로 전이(metastasis)되는 현상을 포함한다.
질병의 치료 또는 질병 부위의 진단 효과를 발휘하는 유효 약물 성분을 인체에 투여함에 있어서 중요하게 고려해야 하는 문제는, 투여된 유효 성분이 어느 정도 질병 부위에 전달되는지 여부 문제, 즉 전달 효율의 문제이다. 유효 성분이 원하지 아니하는 정상 조직에 도달하고 작용하여 약물 부작용을 발생시키는 결과를 야기할 수 있고, 또한 정작 약물이 필요한 질병 부위에 전달 되는 약물의 양이 줄어들어 치료 효과를 거두지 못하는 문제가 발생한다.
일부 질병에 대하여 치료 효과를 갖는 약물들 중에는 정상 조직이나 세포에 강한 독성을 나타내어 질병의 치료 효과보다 약물의 부작용이나 세포 독성이 너무 커서 문제가 되는 경우가 많다. 항암 치료제가 정상 조직 세포에도 작용하여 암 조직의 제거나 치료 효과 보다 정상 조직 세포에 나쁜 영향을 미친다.
항암 효과를 갖는 약물은 무려 1,300여종 이상인 것으로 알려지고 있다. 그러나 이렇게 항암 효과를 나타내는 약물들은 정상적인 조직 세포에도 독성을 나타내는 경우가 많아서 항암제의 부작용의 원인이 되며, 암 세포 조직의 특징으로 인하여 항암제 유효성분이 암 조직으로의 전달의 효율이 낮아져서 부작용 대비 치료 효과가 크지 않다는 문제점을 야기한다.
특히, 암 조직 세포의 특성이 다른 다양한 종류의 복제 종양세포를 생성하는 현상인 이종성으로 인해 나노 약물 제형에서 빈번하게 주로 활용하는, 암 세포 조직의 리셉터와 나노 제형 리간드 사이의 친화성을 이용한 암 세포 추적 투여 방식을 어려워짐으로써 나노 제형 항암제를 사용하여 암 치료를 어렵게 한다. 또한, 이러한 암 조직의 이질성 세포 외부 기질은 약물의 침투를 방해하여 약물에 대한 노출을 감소시키고 서서히 약물 저항성을 유발한다. 이러한 특징을 나타내는 암 조직은 세포의 이종성 특성 때문에 항체 표지자에 의한 표적 치료의 한계가 있다.
그러나, 이상과 같은 암 조직은, 세포의 분열 속도가 비정상적으로 빨라지면서 조직의 성장 속도가 빠르게 이루어지기 때문에, 정상 조직에 비하여 암 조직은 약간 성글고 암 조직 내부의 세포간 공극이 증가한다. 또한 암 조직의 표면에는 100nm 정도 크기의 구멍이 다수 존재하며, 암 조직의 표면은 pH 6.0 이하의 산성을 나타낸다는 특징이 있으며, 표면이 음 전하로 하전 되어 있는 특징도 나타난다.
환자들의 종양은 일반적으로 이종(heterogeneous) 세포군을 포함하고, 종양 이종성은, 가장 일반적으로 암 나노기술에 사용되는 수용체-리간드 표적화 전략의 효과에 크게 영향을 미친다. 또한, 이종 종양의 세포외 기질은, 약물 노출을 감소시키고, 점차 약물 내성을 유발하여 약물의 침투를 지연시킨다. 종양 미세 환경은 구멍 난 혈관계, 림프액의 배출 불량, 세포 및 관련된 기질의 높은 밀도에 의한 종양 내 간질액의 압력 증가를 보인다.
따라서, 나노입자 기반 약제의 침투는, 종양 세포사이의 공간으로 치료용 나노입자가 거의 확산되지 아니하면서, 종양 주변영역으로 제한된다. 약물내성의 생리학적, 물리적 매커니즘은 전체로서 대부분의 암 치료가 실패하는 주된 원인이다. 작은 크기와 다양한 기능성의 나노입자가 차세대 항암제로 부상하고 있지만, 전술한 종양 장벽을 극복하기 위하여 종양-관련 자극에만 특이적으로 반응할 수 있는 스마트 나노입자의 개발이 큰 과제로 남아 있다.
자기조립은, 제어가능한 방식으로 독특한 플라즈몬, 광발광 및 자기적 성질을 가지는 나노입자 앙상블(ensemble)을 간단하고, 재생가능하며, 저렴하게 생산하는 방법을 제공한다. 여러 가지의 자극반응성(stimulus-responsive) 조립(assembled) 나노구조체가 생물학 또는 화학 센서로서 시험관내에서 철저하게 연구되었다(Rosi, N. L.; Mirkin, C. A. Chem. Rev. 2005, 105, 1547; Cao, Y. C.; Jin, R.; Mirkin, C. A. Science 2002, 297, 1536; Zagorovsky, K.; Chan, W. C. W. Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 3168; Taton, T. A.; Mirkin, C. A.; Letsinger, R. L. Science 2000, 289, 1757; Pan, Y.; Du, X.; Zhao, F.; Xu, B. Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 2912).
그러나 현재까지, 주로 이러한 본질적인 생리학적 난관 때문에, 이러한 유형의 "스마트" 앙상블은 생체 내에서 거의 연구된 바가 없다. 종양들이 가지고 있는 하나의 공통점은 산성도이다; 미세 환경은 보통 약 6.8 이하의 pH를 가지며, 엔도/리소좀(endo/resosome)은 5.0 내지 5.5 보다 더욱 낮은 pH를 경험한다.
자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)은 현재 살아있는 사람이나 동물의 신체기관을 비침습적이며 실시간으로 영상화할 수 있는 현재까지 가장 뛰어난 영상진단장비 중 하나이다. MRI 조영제는 MRI 영상에서 각 조직과 혈관을 더욱 명확하게 나타나도록 해 보다 정확한 진단이 가능하다.
MRI 조영제는 원하는 부위가 밝게 보이는 T1 조영제와 어둡게 보이는 T2 조영제로 구분된다. T1 조영제로 상자성의 가돌리듐 착물이 널리 사용되고 있으나 일반 가돌리늄 착물의 작은 분자량으로 인해 혈관과 생체 내 체류시간이 짧아 혈관질환 등에서 정확한 진단이 어려운 경우가 있고 신장기능이 떨어지는 사람에게는 전신성 섬유증을 유발할 수 있는 위험성이 보고됐다.
광역학 치료란, 외부에서 조사되는 빛과 산소의 작용에 의하여 화학 작용을 일으키는 광감작제를 사용하여, 치료가 요구되는 특정 조직의 세포를 선택하여 죽이는 방법으로 질병을 치료하는 것을 의미한다. 정상적인 조직 세포에도 영향을 미치게 되는 일반 항암제나 방사선 치료와는 달리, 광역학 치료는 질병 조직 세포를 표적으로 선택하여 죽인다는 점 때문에, 약물이나 방사선 치료의 부작용이 크게 줄어든다는 장점이 있다.
본 발명은, 광역학 치료 약제 조성물의 크기가, 상기에서 설명한 암 조직 표면에 나타나는 100 nm 크기의 구멍보다 작고, 암 조직에 도달하면 약제 조성물의 표면의 하전 상태가 음에서 양으로 바뀜으로써 약제 조성물의 암 조직으로의 접근과 침투를 용이하게 하며, 암 조직의 산성 조건에서 분리되는 링커 부위를 포함하고 있어서 광역학 치료 효과를 발생시키는 광 감작제를 선택적으로 그리고 효과적으로 암 조직에 침투시키고 암 조직 내부에서 광 감작제가 빛에 의해 활성화되어 다량의 활성 산소를 형성하여 암 조직 세포를 죽이는 효과를 발휘할 수 있도록 하여주는 약제 조성물을 제공하는 것을 목표로 한다.
본 발명의 기본적인 목적은 광감작제, 특정 범위의 수소 이온 농도(pH) 조건에서 분리되는 리간드 A, 및 특정 범위의 수소 이온 농도 조건에서 표면 전하가 변하는 리간드 B를 포함하는, 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 광감작제가 결합되어 있으며 특정 범위의 수소 이온 농도(pH) 조건에서 분리되는 리간드 A와, 광감작제가 결합되어 있으며 특정 범위의 수소 이온 농도 조건에서 표면 전하가 변하는 리간드 B를 함유하는 혼합 용액을 클로로포름에 첨가하여 리간드 조성물을 제조하는 단계; 및 (ii) 상기 리간드 조성물로부터 나노제형화된 광역학 치료용 약학 조성물을 분리하는 단계를 포함하는, 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 기본적인 목적은 광감작제, 특정 범위의 수소 이온 농도(pH) 조건에서 분리되는 리간드 A, 및 특정 범위의 수소 이온 농도 조건에서 표면 전하가 변하는 리간드 B를 포함하는, 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물에 있어서, 상기 광감작제는 클로린 E6(chlorin E6 (Ce6))일 수 있다. 또한, 상기 광감작제가 상기 리간드 A 또는 상기 리간드 B에 결합되어 있을 수 있다.
상기 리간드 A는 PEG, 이미다졸기, 카테콜 및 클로린 E6(Ce6)를 함유할 수 있다. 상기 PEG는 이의 친수성에 의해 본 발명의 리간드 조성물의 형상을 유지시키고, 상기 이미다졸기는 본 발명의 리간드 조성물이 pH의 변화에 따라 형상이 변하게 하며, 상기 카테콜은 극미세 산화철 나노입자(ESION)와 결합하고, 상기 Ce6는 적절한 광선이 조사될 때 암 세로를 파괴하는 반응성 산소종(ROS)를 방출한다.
또한, 상기 리간드 B는 PEG, 이미다졸기, 페닐기, 및 Ce6를 함유할 수 있다. 상기 PEG는 이의 친수성에 의해 본 발명의 리간드 조성물의 형상을 유지시키고, 상기 이미다졸기는 본 발명의 리간드 조성물이 pH의 변화에 따라 형상이 변하게 하며, 상기 페닐기는 이의 친유성에 의해 본 발명의 리간드 조성물의 형상을 유지시키고, 상기 Ce6는 적절한 광선이 조사될 때 암 세로를 파괴하는 반응성 산소종(ROS)를 방출한다.
본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물에 있어서, 상기 리간드 A는 다음 화학식 (I)의 화합물일 수 있다.
Figure 112014091843026-pat00001
상기 화학식 (I)에서 n 및 m은 각각 독립적으로 5-500이다. 또한, 상기 화학식 (I)의 이미다졸기는 트리아졸기(triazole) 또는 피페라진기(piperazine)으로 치환될 수 있다.
또한, 본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물에 있어서, 상기 리간드 B는 다음 화학식 (II)의 화합물일 수 있다.
Figure 112014091843026-pat00002
상기 화학식 (II)에서 n 및 m은 각각 독립적으로 5-500이다. 또한, 상기 화학식 (II)의 이미다졸기는 트리아졸기(triazole) 또는 피페라진기(piperazine)으로 치환될 수 있다. 더욱이, 상기 화학식 (II)의 페닐기는 비페닐기(biphenyl), 나프틸기(naphthyl) 또는 인돌기(indole)로 치환될 수 있다.
본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물에 있어서, 상기 리간드 A가 분리되는 pH 또는 리간드 B의 표면전하가 변화되는 pH는 4 내지 7.2일 수 있다.
본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물에 있어서, MRI 조영용 나노입자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 MRI 조영용 나노입자는 산화철 나노입자일 수 있다. 또한, 상기 산화철 나노입자의 크기는 1 nm 내지 100 nm일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 광감작제가 결합되어 있으며 특정 범위의 수소 이온 농도(pH) 조건에서 분리되는 리간드 A와, 광감작제가 결합되어 있으며 특정 범위의 수소 이온 농도 조건에서 표면 전하가 변하는 리간드 B를 함유하는 혼합 용액을 유기용매에 첨가하여 리간드 조성물을 제조하는 단계; 및 (ii) 상기 리간드 조성물로부터 나노제형화된 광역학 치료용 약학 조성물을 분리하는 단계를 포함하는, 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법에 있어서, 상기 광감작제는 클로린 E6(chlorin E6 (Ce6))일 수 있다. 또한, 상기 광감작제가 상기 리간드 A 및 상기 리간드 B에 결합되어 있을 수 있다.
본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법에 있어서, 상기 리간드 A는 상기 화학식 (I)의 화합물이고, 상기 리간드 B는 상기 화학식 (II)의 화합물일 수 있다.
본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법에 있어서, 상기 리간드 A가 분리되는 pH 또는 리간드 B의 표면전하가 변화되는 pH는 4 내지 7.2일 수 있다.
본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법에 있어서, 상기 혼합용액의 용매가 DMSO(dimethyl sulfoxide), DMF(dimethylformamide) 또는 THF(tetrahydrofuran)일 수 있다. 또한, 상기 유기용매는 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane) 또는 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane)일 수 있다.
본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법에 있어서, 상기 리간드 A가, (i) DMF와 CH2Cl2의 혼합물 내에서 β-벤질-L-아스파테이트 N-카르복시 무수물(BLA-NCA)을 중합하여 폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(β-벤질-L-아스파테이트)(PEG-PBLA)를 제조하는 단계; (ii) 상기 (i)단계에서 제조된 PEG-PBLA에 클로린 E6(Ce6)를 결합시켜 플랫폼 리간드를 제조하는 단계; 및 (iii) 상기 플랫폼 리간드를 1-(3-아미노프로필)이미다졸 및 도파민을 사용하여 아미노분해시켜 리간드 A를 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법에 있어서, 상기 리간드 B가 (i) DMF와 CH2Cl2의 혼합물 내에서 β-벤질-L-아스파테이트 N-카르복시 무수물(BLA-NCA)을 중합하여 폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(β-벤질-L-아스파테이트)(PEG-PBLA)를 제조하는 단계; (ii) 상기 (i)단계에서 제조된 PEG-PBLA에 클로린 E6(Ce6)를 결합시켜 플랫폼 리간드를 제조하는 단계; 및 (iii) 상기 플랫폼 리간드를 1-(3-아미노프로필)이미다졸 및 3-페닐-1-프로필아민을 사용하여 아미노분해시켜 리간드 B를 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법에 있어서, 상기 (i)단계의 리간드 조성물과 MRI 조영제용 나노입자를 혼합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 MRI 조영용 나노입자는 산화철 나노입자일 수 있다. 또한, 상기 산화철 나노입자의 크기는 1 nm 내지 100 nm일 수 있다.
본 발명의 광역학 치료용 나노 약제 조성물은 종양의 산성 자극에 반응하는 자기조립 나노구조로써 암 세포에만 선택적으로 약제 조성물을 전달하는 기능을 발휘한다. 따라서 본 발명의 광역학 치료용 나노 약제 조성물은 매우 이른 초기단계의 이종성, 약물내성 종양에 효과적인 광역학 치료가 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 합성된 플랫폼 리간드(PEG-PBLA-Ce6)의 1H-NMR 분석결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 합성된 리간드 A(PEG-p(API & DOPA-L-Asp)-Ce6)의 1H-NMR 분석결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 합성된 리간드 B(PEG-p(API & PPA-L-Asp)-Ce6)의 1H-NMR 분석결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 합성된 플랫폼 리간드, 리간드 A 및 리간드 B의 GPC 곡선이다.
도 5a는 본 발명의 pH-감응성 자기 나노조성물(pH-sensitive magnetic nanoformulation (PMN): 산화철 나노입자와 pH-감응성 리간드들(리간드 A 및 리간드 B)의 자기조립체)에서의 pH-의존적 구조 변화 거동을 보여 주고(삽입도: pH 7.4, 6.8 및 5.5에서의 PMN의 TEM과, 평균 직경이 약 70 nm인 pH 7.4에서의 PMN의 콜로이드성 분산액에 대한 DLS 측정값), 도 5b는 PMN에서의 pH-의존적 구조 변화 및 관련된 자기적/광활성 변화를 나타내는 개념도이며, 도 5c는 1 시간의 배양 후에 PMN(0.1 mg/mL)의 제타 전위 및 DLS 측정값을 pH의 함수로서 나타낸 것이다(DLS 측정은 재료 굴절률 2.42, 용매 굴절률 1.33(물) 및 점도 0.8872를 사용하여 수행되었다).
도 6은 pH-비감응성 나노입자 조립체(pH-insensitive nanoparticle assembly (InS-NP))의 개수에 따른 크기 분포(도 6a), 세기(intensity)에 따른 크기 분포(도 6b) 및 pH 7.4에서의 Ins-NP의 상관관계 데이터를 보여 준다.
도 7a는 선택된 pH 값에서 측정된 PMN 현탁액의 투과율을 보여 주고(삽입도는 전이 pH가 약 6.0인 PMN 용액의 pH-의존적 탁도에 대한 데이터를 보여 준다. pH를 4.0에서 7.5까지(●) 그리고 7.5에서 4.0까지(○) 점진적으로 변화시켰다), 도 7b는 자기조립된 리간드(1) 및 PMN(2)의 pH-의존적 형광 세기 및 근적외선 형광 사진이며, 도 7c는 자기조립된 리간드(1) 및 PMN(2)의 pH-의존적 일중항 산소 발생을 보여 주고, 도 7d는 세 가지 다른 pH값에서 PMN의 농도 구배에 따른 광학, 형광 및 MR(임상 1.5 T MRI 스캐너에서 검사) 사진이며, 도 7e는 PMN의 pH-의존적 자기 완화 특성을 보여 준다.
도 8은 PMN 및 3 nm-크기의 ESION(extreamely small iron oxide nanoparticle)에 대한 XRD(X-선 회절) 패턴을 보여 준다.
도 9는 PMN의 자기적 특성을 보여 준다. 도 9a는 20 kOe 내지 -20 kOe의 자기장 사이에서 PMN의 M-H 곡선이고, 도 9b는 100 Oe하에서 온도가 300 K 내지 4 K까지 변할 때 PMN의 M-T 곡선이다.
도 10은 세 개의 다른 pH 값에서 InS-NP의 농도 구배에 대한 MR 팬텀 영상이다.
도 11a는 pH 7.4 또는 6.8에서(4시간 배양) 유동 세포 분석법으로 분석한 HCT116 암 세포에 대한 PMN(1 μg/mL Ce6(chlorin E6)와 동등)의 세포 흡수를 보여 주고(삽입도는 pH 7.4 및 6.8에서(4 시간 배양) 다른 농도의 PMN으로 처리한 HCT116 암 세포의 근적외선 형광 영상을 보여준다), 도 11b는 HCT116 암 세포 내에서 활성화된 PMN의 공초점 현미경 사진(엔도좀/리소좀은, 선택적으로 리소좀을 표지하는 리소트래커 그린으로 염색하였다)이며, 도 11c는 HCT116 암 세포에 의한 PMN 흡수에 대한 바이오TEM(BioTEM) 사진이고, 도 11d 및 11e는 각각 레이저 조사가 없거나(도 11d) 레이저 조사가 있는 경우(도 11e)에서 PMN 및 유리된 Ce6에 노출된 HCT116 세포의 MTT 분석결과이며, 도 11f는 다양한 PMN의 농도(0, 12.5, 25, 또는 50 g Fe/mL)의 PMN으로 4시간 동안 배양된 HCT116 암 세포 펠릿(1 × 106 cells)의 형광(상부) 및 MR(하부) 사진이다.
도 12a 및 12b는 각각 HCT116 종양을 포함하는 누드 마우스에 PMN 또는 InS-NP를 정맥 주사(2 mg Fe/kg)하기 전 및 1 시간 후 또는 2 시간 후의 종양 부위의 생체 내 T1-가중 MR 사진 및 컬러매핑된(color-mapped) 사진이고(점선 영역은 종양의 위치를 나타낸다), 도 12c는 PMN 및 InS-NP의 주사 후, 신호 세기 향상(ROIi/ROI0) 대 시간의 플롯이며, 도 12d는 누드 마우스 에서 PMN 및 InS-NP에 대한 혈액 순환 데이터(플라즈마 철 농도 vs 시간)(삽입도 참조; 각 그룹당 n = 3)이고, 도 12e는 정맥주사 12 시간 후 HCT116종양 내에서, PMN이 InS-NP에 비해 2 배 이상 증가함을 보여 주는 ICP-AES(Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy, ICP-AES) 분석 결과이며, 도 12f는 PMN, InS-NP 또는 유리 Ce6(0.2 mg/kg Ce6와 동등)의 정맥 주사 후 HCT116 종양을 포함하는 누드 마우스의 생체 내 NIR 영상이고, 도 12g는 PMN의 정맥 주사 후 누드 마우스 종양 조직에서 종양 세포에 의한 Ce6 흡수를 보여 주는 공초점 레이저 주사현미경(CLSM) 사진이다(점선 영역은 종양의 위치를 나타낸다).
도 13은 치료한 지 24시간 후에 추출된 장기의 형광 사진(도 13a) 및 이에 상응하는 측정된 신호 세기(도 13b)이다.
도 14a는 PMN-기반의 표적화된 광역학 치료를 보여 주는 사진이고, 도 14b는 동종 및 이종 종양에서 PMN 및 Ins-NP의 PDT 효능에 대한 예시 및 비교이며, 도 14c는 SDF-1, P-gp 및 CD31에 대한 이종 종양의 면역조직화학적 염색을 보여 주고, 도 14d는 PDT 활성화 전 및 후의 동종 HCT116 종양을 포함하는 마우스의 사진(상부)과 세포자멸에 의한 종양세포 사멸의 측면에서 치료 효과를 결정하기 위한 종양 조직 단면에 대한 H&E 염색 및 TUNEL 염색(하부)을 보여주며, 도 14e는 치료 후 4개의 군에서의 동종 HCT116 종양의 부피를 보여 주고, 도 14f는 PDT 활성화 전 및 후의 이종 종양을 포함하는 마우스 사진(상부)과 세포자멸에 의한 종양 세포 사멸의 측면에서 치료 효과를 결정하기 위한 H&E 염색 및 TUNEL 염색을 보여 주며, 도 14g는 치료 후 4개의 군에서의 이종 종양의 부피를 보여 준다.
도 15는 HCT116 종양을 포함하는 마우스(도 15a) 및 이종 CT26 종양을 포함하는 마우스(도 15b)에 대한 PDT 치료를 하는 동안의 체중 측정 결과이다.
도 16a는 PMN 또는 PBS 완충용액이 투여된 누드 마우스(n = 4)로부터 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 염기성 인산염(ALP) 및 D-락테이트 디하이드로게나제(D-LDH)에 대한 혈청 생화학 결과이고, 도 16b는 H&E로 염색된 심장, 신장, 간, 폐 및 비장의 조직학적 검사 사진이다.
이하, 다음의 실시예 또는 도면을 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예 또는 도면에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.
실시예 1. 리간드 합성
폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(β-벤질-L-아스파테이트)(PEG-PBLA)를 주형으로 사용하여, 리간드 A 및 리간드 B를 합성하였다(반응식 1).
Figure 112014091843026-pat00003
(반응식 1)
PEG-PBLA를 제조하기 위하여, β-벤질-L-아스파테이트 N-카르복시 무수물(BLA-NCA)(3 g, 12 mmol)을, DMF(20 mL) 및 CH2Cl2(50 mL) 혼합물 내, 40℃에서 말단 1차 아미노기인 α-메톡시-ω-아미노-폴리(에틸렌 글리콜)(MW = 2,000 Da, 240 mg, 120 mol)로부터 개시하여 중합하였다. PEG-PBLA를 에테르(3L)에서 3회 침전시켜 정제 하였다. PEG-PBLA-Ce6(플랫폼 리간드)를 합성하기 위하여, Ce6를 종래의 카르보디이미드 반응을 통하여 PEG-PBLA의 아민기에 부착하였다. 상기 PEG-PBLA(0.5 g, 32.5 mol)와, Ce6(23.4 mg, 39.0 μmol), 디사이클로헥실카르보디이미드(9.6 mg, 46.8 μmol) 및 N-하이드록시석신이미드(5.4 mg, 46.8 μmol)의 혼합물을 DMSO(5 mL)에 각각 독립적으로 용해하였고, 상기 용액들을 축합반응 전에 3 시간 동안 충분히 교반하였다. 다음으로 상기 두 반응 용액을 혼합하고 실온에서 교반하였다. 24 시간 후, 상기 반응 혼합물을 여과하여 불용성 부산물(예를 들면, 디사이클로헥실우레아)을 제거하였고, 2 일간 탈이온수에 투석하였다(Spectra/Por; 분자량 차단 크기, MWCO: 1,000 Da). 상기 최종 용액을 동결건조하여 플랫폼 리간드를 얻었다.
1-(3-아미노프로필)이미다졸(API) 및 도파민과 함께 상기 플랫폼 리간드를 아미노분해하여 리간드 A를 합성하였다. PEG-PBLA-Ce6(0.5 g , 18.5 μmol)를 DMSO(5 mL)에 용해시킨 다음, 25℃의 질소 대기 하에서 1시간 동안 도파민(0.1 g, 0.7 mmol)과 반응시켰다. 다음으로, API(0.5 g , 3.9 mmol)를 25℃의 질소 하에서 첨가하였고, 4 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각된 0.1 N HCl(20 mL) 수용액에 적가하고, 0.01 N HCl 용액에 3번 투석하였다(Spectra/Por; MWCO: 1,000 Da). 상기 최종 용액을 동결건조하여 리간드 A를 얻었다.
API 및 3-페닐-1-프로필아민(PPA)과 함께 상기 플랫폼 리간드를 아미노분해하여 리간드 B를 합성하였다. PEG-PBLA-Ce6(0.5 g, 18.5 μmol)를 DMSO(5 mL)에 용해한 후, 1 시간 동안 25℃의 질소 하에서 PPA(0.1 g, 0.9 mmol)와 반응시켰다. 다음으로, API(0.5 g , 3.9 mmol)를 25℃에서 질소 하에서 첨가하였고, 4 시간 동안 교반하였다. 반응 후에, 상기 혼합물을 냉각된 0.1 N HCl 수용액(20 mL)에 적가하였고, 0.01 N HCl 수용액에 3회 투석하였다(Spectra/Por; MWCO: 1,000 Da). 상기 최종 용액을 동결건조하여 리간드 B를 얻었다.
플랫폼 리간드에 대하여 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)(도 1): δ = 9.7 ppm (1H, s, -CH= of Ce6), 8.1 ppm (1H, s, -NH-), 7.3 ppm (5H, s, -CH2C6 H 5-), 5.0 ppm (2H, -CH 2C6 H 5-), 4.6 ppm (1H, m, -NHCHC=O.), 3.5 ppm (182H, s, -CH 2CH 2O- of mPEG), 3.2 ppm (3H, s, CH 3- of mPEG) and 2.9 - 2.5 ppm (2H, m, CHCH 2C=O).
리간드 A에 대하여 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)(도 2): δ = 7.8 ppm (1H, s, -NCH=N- of imidazole ring), 7.7 ppm (1H, s, -NCH=CH- of imidazole ring), 7.3 ppm (1H, s, -CHCH=N- of imidazole ring), 6.6 - 6.5 ppm (1H, m, -CH2=CHCH- and -CH2CH=CH- of dopa), 6.4 ppm (1H, m, =CHCO- of dopa), 4.5 ppm (1H, m, -NHCHC=O-), 4.2 ppm (2H, m, =NCH 2CH2), 3.5 ppm (182H, s, -CH 2CH 2O- of mPEG chain), 3.0 ppm (2H, m, -NHCH 2CH2-), and 2.8 - 2.5 ppm (2H, m, CHCH 2C=O).
리간드 B에 대하여 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)(도 3): δ = 7.8 ppm (1H, s, -NCH=N- of imidazole ring), 7.7 ppm (1H, s, -NCH=CH- of imidazole ring), 7.3 ppm (1H, s, -CHCH=N- of imidazole ring), 7.3 - 7.2 (5H, m, -CH2C6 H 5- of PPA), 4.5 ppm (1H, m, -NHCHC=O-), 4.2 ppm (2H, m, =NCH 2CH2), 3.5 ppm (182H, s, -CH 2CH 2O- of mPEG chain), 3.0 ppm (2H, m, -NHCH 2CH2-), and 2.8-2.5 ppm (2H, m, CHCH 2C=O).
GPC 측정에서(도 4), 모든 고분자 리간드는 단봉형(unimodal) 분자량 분포를 보여주었는데, 이는 공중합체 생성물 내에 동종중합체(homopolymer) 잔기가 없음을 나타낸다. 상기 리간드의 Ce6 함유량을 형광 분광법 (λex = 650 nm 및 λem = 675 nm, 표 1)에 의해 확인하였다.
플랫폼 리간드, 리간드 A 및 리간드 B의 구조적 특성
구분 공중합체 DP
(BLA)a 		DS
(API)b 		DS
(PPA)c 		DS
(Dopa)d 		DS
(Ce6)e 		PDIf Mn g
플랫폼
리간드		 PEG1-PBLA60-Ce61 60 - - - 1 1.11 16,000
리간드 A PEG1-p(API55&Dopa5-L-Asp)60-Ce61 60 55 - 5 1 1.14 17,200
리간드 B PEG1-p(API50&PPA10-L-Asp)60-Ce61 60 50 10 - 1 1.09 16,100
a 1H-NMR 결과에 기초한 BLA의 중합도
b 1H-NMR 결과에 기초한 API의 치환도(degree of substitution)
c 1H-NMR 결과에 기초한 PPA의 치환도
d 1H-NMR 결과에 기초한 Dopa의 치환도
e 형광 분광분석에 기초한 Ce6의 치환도
f GPC에 의해 수평균 분자량(Mn), 중량평균 분자량(Mw) 및 다분산 지수(polydispersity index, PDI = Mw/Mn)를 결정하였다.
g 1H-NMR에 의해 결정된 바와 같다.
실시예 2. ESION 의 합성
ESION을, 이전에 보고된 방법(Kim, B. H.; Lee, N.; Kim, H.; An, K.; Park, Y. I.; Choi, Y.; Shin, K.; Lee, Y.; Kwon, S. G.; Na, H. B.; Park, J. G.; Ahn, T. Y.; Kim, Y. W.; Moon, W. K.; Choi, S. H.; Hyeon, T. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12624)을 사용하여 올레일 알콜 존재 하에 아이언-올레이트 착화합물의 열분해를 통하여 합성하였다. 간단히, 1.8 g의 아이언-올레이트 착화합물(2 mmol), 0.57 g의 올레산(2 mmol) 및 1.61 g의 올레일 알콜(6 mmol)을 실온에서 10 g의 디페닐 에테르에 용해시켰다. 상기 혼합물을 10℃/min의 일정한 승온 속도로 250℃로 가열 한 다음, 비활성 대기 하에서 30분 동안 상기 온도를 유지하였다. 상기 반응이 진행됨에 따라, 초기의 갈색 투명한 용액이 흑색으로 변했다. 상기 반응 후, 나노입자를 함유하는 상기 혼합물을 가열기로부터 제거하고 실온으로 냉각 한 후, 50 mL의 아세톤을 첨가하여 상기 나노입자를 침전시켰다. 상기 나노입자를 4 시간 동안 40,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛화하였고, 상기 상등액을 경사(decant)하였으며, 상기 나노입자를 n-헥산 또는 클로로포름에 재분산시켰다.
실시예 3. PMN 의 제조
자기조립을 위해, 15 mg의 리간드 A 및 15 mg의 리간드 B를 DMSO 3 mL 내에서 혼합하여 제조한 용액을, 5 mL의 클로로포름 내의 콜로이드성 ESION(0.4 mg의 Fe/mL)에 천천히 첨가하였다. 상기 혼합물을 30분 동안 실온에서 진탕 배양(incubated on a shaker)하였다. 다음으로, 클로로포름을 진공 하에 증발시켜 완전히 제거하였고, 총 부피가 5 mL가 될 때까지 DMSO 내의 상기 콜로이드성 현탁액에 탈이온수를 첨가하였다. 투석막(Spectra/Por; MWCO: 12,000 Da)을 사용하여 상기 DMSO를 탈이온수로 완전히 치환시켰다. 초과 리간드를 원심분리하여 제거하였고, 스핀 필터(Millipore, MWCO: 100,000 Da, 10,000, 10 분)로 3회 내지 5회 세척하였다. 이렇게 생성된 나노입자를 물에 재분산시켰다.
실시예 4. 자기조립 리간드의 제조
3 mL의 DMSO에 15 mg의 리간드 A 및 15 mg의 리간드 B의 혼합 용액을 5 mL의 클로로포름에 천천히 첨가하였다. 상기 혼합물을 30분 동안 실온에서 진탕 배양하였다. 이후, 클로로포름을 진공 하에서 증발시켜 완전히 제거하였다. 그 후, 총 부피가 5 mL가 될 때까지 DMSO 내의 콜로이드성 용액에 탈이온수를 첨가하였다. DMSO를 투석막(Spectra/Por; MWCO: 12,000 Da)을 사용하여 탈이온수로 완전히 치환시켰다. 초과 리간드를 원심 분리하여 제거하거나 스핀 필터(Millipore, MWCO: 100,000 Da, 10,000, 10 min)로 3회 내지 5회 세척하였다. 이렇게 생성된 나노입자를 물에 재분산시켰다.
실시예 5. pH - 비감응성 나노입자 조립체( InS - NP )의 제조
3 mL의 DMSO에 30 mg의 플랫폼 리간드를 혼합하여 제조된 용액을, 5 mL의 클로로포름 내의 콜로이드성 ESION(0.4 mg의 Fe/mL) 현탁액에 천천히 첨가하였다. 상기 혼합물을 30분 동안 실온에서 진탕 배양하였다. 다음으로, 클로로포름을 진공 하에 증발시켜 완전히 제거하였다. 그 후, 총 부피가 5 mL가 될 때까지 DMSO 내의 콜로이드성 용액에 탈이온수를 첨가하였다. DMSO를 투석막(Spectra/Por; MWCO: 12,000 Da)을 사용하여 탈이온수로 완전히 치환시켰다. 초과 리간드를 원심분리하여 제거하거나 스핀 필터(Millipore, MWCO: 100,000 Da, 10,000, 10 분)로 3회 내지 5회 세척하였다. 이렇게 생성된 나노입자를 물에 재분산시켰다.
실시예 6. 재료의 특성 분석
TEM 측정은 200 kV에서 작동하는 JEOL EM-2010 현미경으로 수행하였다. 분말 X-선 회절 패턴을 회전 산화극 및 Cu Kα 방사원 (λ = 0.15418 nm)을 갖춘 Rigaku D/Max-3C 회절 분석기로 얻었다. 본 발명자들은 ICPS-7500 분광기(Shimadzu)를 사용하는 유도결합형 플라즈마 방출 분광분석법(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy, ICP-AES) 및 유도결합형 플라즈마 방출 분광기(inductively coupled plasma - optical emission spectrometer, ICP-OES) (PerkinElmer Optima 4300 DV)로 원소 분석을 수행하였다. UV/visible 흡수 스펙트럼은 UV-2450 분광광도계(Shimadzu, Japan)로 수집하였다. 입경 및 제타 전위는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments, Malvern, UK)로 측정하였다. 크기 데이터 분석을 위하여, 소재 굴절률(2.42), 소재의 흡광도(0.2), 분산제 굴절률(1.33), 및 분산제 점도(0.8872)를 사용하였다. 자기적 특성은 초전도 양자간섭계(superconducting quantum interface device, SQUID) 자력계(Quantum Design MPMS XL)를 사용하여 조사하였다. 수력학적 크기는 25℃에서 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) (Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK))기기를 사용하여 얻었다.
실시예 7. 임계 응집 농도( CAC ) 측정
2차 증류된 증류수 내의 Hoechst 33342 저장 용액(1.4 x 10-3 M)을 제조하였고 4℃에서 저장하였다. 1.0 x 10-3 mg/mL 내지 1.0 mg/mL의 농도에서 상기 Hoechst 33342 용액을 시료를 함유하는 용액과 혼합하였다. 각 시료 용액 내의 Hoechst 33342의 최종 농도는 7.0 x 10-4 M이었다. 각각 λex = 355 nm 및 λem = 457 nm인 RF-5310PC(Shimadzu, Japan)을 사용하여 형광을 측정하였고 슬릿 폭은 각각 ex = 3 nm 및 em = 3 nm이었다.
실시예 8. 다른 pH 에서 PMN 의 투과율 측정
PMN 용액(2 mg/mL, Ce6 부착 없음)의 광 투과율의 측정값을 500 nm에서 UV-Visible 분광 광도계를 사용하여 얻었고, 이때 0.1 N 염산을 첨가하여 용액의 pH값이 7.5에서 4.0로 서서히 감소하였고, 0.1 N NaOH 용액을 첨가하여 상기 용액의 pH를 4.0에서 7.5로 증가시켰다.
실시예 9. pH -의존적 형광 세기 측정
PMN 또는 자기조립 리간드(2 mg/mL, 650 nm의 여기 및 675 nm의 방출)의 형광 세기를, 0.1 N 염산 용액을 첨가하여 용액의 pH를 7.5에서 4.0으로 서서히 감소시키면서, 형광 플레이트 리더(fluorescence plate reader (Tecan Genios, Durham, NC))를 사용하여 측정하였다.
실시예 10. pH -의존적 일중항 산소의 생성( SOG ) 측정
SOG(singlet oxygen generation)를 평가하기 위하여, 다른 pH의 시료(2 mg/mL, 100 μL)를 일중항 산소 센서 그린(singlet oxygen sensor green (SOSG), 2.0 μM, 100 μL)과 혼합하였다. 4 분 동안 5 mW/cm2 세기에서, 670 nm의 레이저 원(Institute of Electronics)을 조사(irradiation)하여 SOG를 유도하였다. 시료의 SOG를 결정하기 위한 조사(irradiation) 후 SOSG 형광을 검출하였다(λex = 494 nm, λem = 534 nm). SOSG 형광 증가와 백그라운드의 비교에 의해 SOG를 평가되었다.
실시예 11. 세포 배양
HCT116(인간의 결장암, KCLB No. 10247) 세포, CT26(쥐의 결장직장암종 세포, KCLB No. 80009) 및 M2-10B4(쥐의 골수 간질 세포, KCLB No. 21972)를 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)에서 얻었다. HCT116 세포를, 10% 우태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 10 mL의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640) 배지에서 배양하였다. CT26 세포를, 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 배양하였다. M2-10B4를, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 모든 세포의 배양 조건은 37℃, 습도 100% 및 CO2 5% 이었다. 24 시간 동안 CT26 세포에 노출되는 DOX 투여량을 증가(1, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 및 5000 ng/mL)시킨 후, 다음 투여량에 노출되기 전에 3일 내지 4일의 회복기간을 주며 약물 내성 CT26 세포(CT26/MDR)를 성장시켰다. 다음으로, CT26/MDR을 냉동시켰고 액체 질소에 저장하였다. CT26/MDR의 새로운 분취량(fresh aliquots)을 모든 실험에 사용하여 약물 민감성 표현형(drug sensitive phenotype)으로 전환되지 않게 하였다.
실시예 12. pH -의존적 세포 흡수( cell uptake )
HCT116 세포를 다른 pH에서 PMN, InS-NP 및 Ce6에 노출시켜 각각의 세포 흡수를 확인하였다. 상기 세포를 2 시간 동안 배양하였고, 세척햇으며, 수확 한 후 DPBS에 재현탁시켰다. 시험관내(in vitro) 세포 흡수를 유동 세포계수기(Beckman, San Jose, CA, USA)를 사용하여 정량하였다. 각 시료 10,000 세포(게이트 이벤트(gated events))를 계수하였고, 유리된 Ce6의 형광을 로그 설정(logarithmic setting)(FL4 ; λem = 670 nm)으로 검출하였다. 이들의 형광(FL4)이 비처리 세포 현탁액의 세포 형광에 비해 높으면, 세포를 양성으로 계수하였다. 각 실험을 CXP 분석 프로그램을 사용하여 통계적으로 분석하였다.
실시예 13. 공초점 레이저 주사 현미경
공초점 레이저 주사 현미경(LSM 510 Meta; Zeiss, Germany)을 사용하여 형광 영상화를 수행하였다. 120 μm의 최적의 핀홀(pinhole) 크기를 선정하여, 초점 평면의 위와 아래의 탈초점(out-of-focus) 평면에서 방출된 형광을 배제하였다. 여기/방출 파장은 DAPI에 대해 340/488nm, FITC에 대해 490/520nm, RITC에 대해 555/578nm 그리고 Ce6에 대해 650/670nm이었다. 형광 영상을 LSM Image Browser software(Zeiss)를 사용하여 분석하였다.
실시예 14. 세포 MR 영상화
PMN으로 세포를 표지하기 위하여, HCT116 세포를 10 mL 배지의 배양 접시에 접종하였고, 하룻밤 동안 성장시켰다. 이어서, 0, 12.5, 25 및 50 mg/mL의 PMN을 첨가하였다. 4 시간 후, 상기 세포를 PBS로 2회 세척하였고 1 mL의 트립신/EDTA를 첨가하여 분리시켰다. 원심분리 후, 세포를 배양 배지에 분산시켰고, 1.5 mL의 시험관으로 옮겼다. 5분 동안 1,000 rpm에서 원심분리하여 세포 펠렛을 제조하였다. T1-가중 MR 영상을 1.5 T MR 스캐너(Signa Excite, GE Healthcare) 상의 헤드 코일을 사용하여 얻었다.
실시예 15. 약동력학적 분석
혈장 농도-시간의 실험을 위해, 마우스의 꼬리 정맥을 통해 PMN 및 InS-NP를 각각(2 mg의 Fe/kg) 주사하였다. 상기 주사 후 1분, 30분, 1시간, 3시간, 8시간 및 20시간에서 혈액을 수집하였다. 10분 동안 1,000rpm에서 원심분리하여 적혈구로부터 혈장을 분리하였다. 그 후, 각 혈액 시료용 혈장(100 μL)을 12 시간 동안 실온에서 70% 질산(1mL)과 혼합한 후, 원심분리(5분, 10,000 rpm)하였고, 상등액을 2% 질산으로 5배 희석한 후에 유도결합형 플라즈마 방출 분광기(inductively coupled plasma optical emission spectrometer analysis)(ICP-OES, Optima 4300 DV, Perkin-Elmer)에 사용하였다. PMN 또는 InS-NP(2 mg Fe/kg)를 주사한 지 12 시간 후에 상기 종양의 철 흡수를 측정하였다. 절개한 종양 조직의 무게를 측정하고, 균질화하였으며 섬광 혼합물(scintillation mixture)로 처리하였다. 다량의 60% 질산을 각 시료에 첨가하였고 조직을 60 ℃에서 24 시간 동안 배양한 후, 상기 용액을 30분 동안 13,000rpm에서 원심분리하였고, 상등액을 2% 질산으로 10 배 희석하였다. 종양 내 철 흡수량 측정을 ICP- OES로 수행하였고, 종양 내 상기 나노입자 흡수를 g Fe/g 조직으로 계산하였다.
실시예 16. 면역조직화학
종양 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였고, 5 미크론 두께의 슬라이스로 냉동절개하였다. SDF-1 및 P-gp를 항-SDF-1 항체(abcam) 및 항-P-당단백질 항체(abcam)로 면역표지(immunolabel)하였고, 이후, 추가로 공초점 레이저 주사 현미경 분석을 하기 위해 상기 시료를 RITC(λex/λem, 555/578 nm) 또는 FITC(λex/λem, 490/520 nm)가 접합된(conjugated) 이차 항체를 사용하여 실온에서 60분 동안 배양하였다.
실시예 17. 종양 조직학
조직학적 분석을 위하여, 대조군 및 처리된 마우스의 종양 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였고 5 미크론 두께의 슬라이스로 냉동절개하였으며, 헤마톡실린 및 에오신(matoxylin & eosin, H&E)으로 염색하였으며 TUNEL법으로 표지화하였고, 디지털 현미경(Leica QWin) 및 공초점 레이저 주사현미경(LSM 510 Meta; Zeiss, Germany)으로 검사하였다.
실시예 18. PMN 의 생체 내 독성 평가
건강한 누드 마우스에 PMN 또는 정상 생리식염수(대조군)의 현탁액을 정맥 주사하였다. 2 주 후,상기 마우스를 희생시켰고 주요 장기를 수집하였다. 심장, 간, 비장, 신장 및 폐를 H&E로 염색하였다. ALT, AST, ALP 및 D-LDH의 시약 키트를, 안구 적출에 의해 채취한 혈액에서 분리한 혈청을 분석하기 위해 사용하였다.
실시예 19. 시험관 내 세포 흡수
종양 세포의 PMN 흡수를, 다른 pH조건(pH7.4 및 6.8)에서, KODAK In Vivo Image Station (Image Station 4000 MM; Kodak, New Haven, CT, USA) 및 유세포 분석기(Beckman, San Jose, CA, USA)를 사용하여 모니터링 하였다. HCT116 세포(1 × 105 cells/mL)를 37℃, RPMI-1640 배지(pH 7.4 또는 6.8, 1 %의 페니실린-스트렙토마이신 첨가)에서 2시간 동안 각 시료와 함께 배양한 다음 분석하였다. 현미경 관찰 중의 광퇴색(photobleaching)을 개선하기 위하여, 안티-페이드 마운팅 솔루션(anti-fade mounting solution)(5% N-프로필 갈레이트, 47.5% 글리세롤, 및 47.5% Tris-HCl, pH 8.4) 한 방울을 상기 세포에 첨가하였다.
실시예 20. 생체 내 연구
모든 생체 연구는 미합중국 국립보건원(National Institutes of Health)이 출판한 the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH publication no. 85-23, 1985, revised 1996)를 따랐고, 한국 카톨릭 대학교(Republic of Korea)의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)로부터 승인된 프로토콜의 가이드라인 하에 마우스를 보존하였다.
실시예 21. pH - 감응성 자기 나노조성물( PMN )의 특성
본 발명은 Ce6가 그래프팅된 폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(-벤질-L-아스파테이트)(PEG-PBLA-Ce6)를 합성하여, 측면의 벤질 에스테르기가 친핵성 공격을 통해 1차 아민과 즉시 반응하는 플랫폼 리간드를 제공하였다. 이미다졸(pKa = 약 6.8)은 이온화될 수 있는 작용기로서 쉽게 통합되어 종양 미세 환경에 pH 감응성을 부여하였다. 이러한 플랫폼에 기초하여, 두 개의 리간드 유도체: 리간드 A 및 B를 추가로 설계하였다. 리간드 A에 대하여, 카테콜기(catechol group)을 추가함으로써 자기조립(self-assembly)를 용이하게 하였는데, 이는 상기 카테콜기가 산화철 나노입자에 대한 고친화도 앵커(high-affinity anchor)로서 작용할 수 있기 때문이다. 이와 대조적으로, 3-페닐-1-프로필아민을 사용하여 리간드 B의 소수성(hydrophobicity)을 조절하여, 약 5.5인 종양 엔도/리소좀의 pH에 의해 활성화될 수 있는 PMN의 임계 상전이(critical phase transition)를 생성하였다. ESION, 리간드 A 및 리간드 B의 공조립(coassembly)에 의해 상기 PMN을 제조하였다(반응식 2).
Figure 112014091843026-pat00004
(반응식 2)
ESION(약 3 nm)이 상기 리간드들의 펩타이드 블록의 수력학적 크기(약 60개의 잔기; 약 20 nm 길이)보다 매우 작기 때문에, 카테콜이 고정된(catechol-anchored) 리간드 A가 ESION의 측면을 둘러싸는 것이 가능했다. 따라서 상기 기능화가 ESION이 콜로이드성 마그네토-코어 쉘(colloidal magneto-core shell) 구조체 내부로 유도된 자기조립되는 것을 가능하게 하기 때문에, 이러한 기능화된 ESION은 종래의 양친매성 이중블록 공중합체(diblock copolymer)의 고분자-금속 유사체(polymer-metal analogue)로서 간주될 수 있다(반응식 3). 그러면, 상기 소수성 코어는 ESION과, 종양-감지 고분자 리간드의 소수성 블록으로 구성된다.
Figure 112014091843026-pat00005
(반응식 3)
투과전자현미경(TEM) 사진(도 5a)에 의하면 상기 PMN의 입자 크기는 약 60 nm이었다. 상기 PMN은 물에 잘 분산되었으며, 동적 광산란법(DLS)에 의해 측정된 수력학적 직경은 70 ± 5 nm인 것으로 밝혀졌고(도 5a), 이는 수동 종양 표적화(passive tumor targeting)를 위한 투과도 증가 및 보유 효과(enhanced permeability and retention (EPR) effect)에 적합하다. 대조군으로서, ESION 및 플랫폼 리간드를 조립하여 pH-비감응성 나노입자 조립체(pH-insensitive nanoparticle assembly (InS-NP))를 제조하였고(도 6), 이는 PMN과 크기가 유사하였다.
본 발명의 새로운 리간드 설계는, 세포 흡착 및 침투의 증가뿐 아니라 PMN의 엔도/리소좀의 pH 의존적 치료진단 활동을 위해, 2단계의 pH 활성화를 가능하게 하여 종양 주변에서 표면 전하 역전(surface change reversal)을 유도했다. 이러한 pH 의존적 구조적 변화(pH-dependent structural transformation)를 도 5b에 개략적으로 나타내었다. 먼저, PMN은 pH 7.4에서 약하게 음전하를 띈다. 상기 종양 환경 내의 pH의 저하는, 팽윤의 원인이 되는 상기 착화합물의 극성을 역전시키는 이미다졸의 이온화를 증가시키고(도 5c), 이로써 인접한 음이온성 세포들과의 정전기적 상호작용으로 인하여 페이로드 전달(payload delivery) 및 세포 내재화(cell internalization)가 향상된다. 내재화가 일어나면, 엔도좀의 pH가 5.5 내지 6.0으로 감소함에 따라, 입자가 더욱 이온화된다. 이 시점에서 PMN의 코어의 소수성 상호작용은 약화되고, 상기 이온화된 유니머(unimer)는 서로 반발하여, DLS(도 5c) 및 TEM(도 5a) 모두에서 확인된 바와 같이, 완전한 분리가 이루어진다. 산-염기 적정은(도 7a) pH 5.5 내지 6.0의 임계 pH 구간에서 투과율(%T)의 급격한 하락을 보여주었다. pH가 다시 증가하였을 때, %T의 회복은 이력현상을 보였고(hysteretic), 따라서 이는 가역적인 pH 의존적 조립/분리(assembly/disassembly)과정을 보여준다. 결론적으로, PMN의 광활성(photoactivity), 즉 일중항 산소 발생(singlet oxygen generation, SOG) 및 형광은, 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer)로 인하여 pH 7.4에서 소멸된다. pH < 6에서, 분리되면, 상기 광활성은 급격히 회복되었고, 이는 다른 자기조립된 고분자 리간드에서 관찰된 바와 유사하다(도 7b 및 7c). 흥미롭게도, PMN은 자기조립 고분자 리간드보다 2 배 더 낮은 임계 응집 농도(약 0.01 mg/mL)를 보였는데, 이는 개선된 콜로이드 안정성을 나타내는 고분자 사슬 얽힘(polymer chain entanglement) 때문인 것으로 보인다.
PMN의 X선 회절(X-ray diffraction, XRD) 패턴은 ESION과 유사하였고(도 8), PMN은 스핀-캔팅 효과(spin-canting effect)때문에 약한 자기화(magnetization)를 보인다(도 9). 물에서 PMN의 pH-의존적 구조 변화는 양자 이완에 영향을 주는 것으로 예상된다. ESION 표면 상의 다섯 개의 홀전자(S=5/2)를 가진 다수의 고스핀 철 이온(high-spin Fe(III))을 고려하면, Fe3 + 종들과 물의 직접적인 배위(coordination)는 PMN의 수직 이완도(r1)에 대한 주요 원인이다. 다른 pH 값(같은 철 농도)에서, PMN의 T1 MR 팬텀(phantom)의 세기 변화는 대응하는 형광 영상화 결과와 잘 맞았다(도 7d). PMN은 pH 7.4에서, 43.95 mM-1·s-1의 수평 이완도(r2)와 3.30 mM-1·s-1의 r1을 나타내었고, pH가 7.4에서 5.5로 감소함에 따라 r1-증가 및 r2-감소를 수반하는 것이 관찰되었다(도 7e). 이는 pH가 감소함에 따라 리간드가 양자화되고 친수성을 얻은 것이라 추정된다. 결과적으로, 배위된 물 분자 수와 Fe3+와의 배위 지속시간 모두 증가될 것이다. 더욱이, pH-유도 분리(pH-induced disassembly)가 일어나면서, 분리된 ESION은 초기의 PMN에 비해 더 낮은 r2를 보인다. 조영 효과(contrast effect)의 효율이 완화도(r1)를 통해 평가되지만, 과도하게 높은 r2가 T1 조영제로서의 사용을 배제시킬 수 있기 때문에, 상기 r2/r1 비율 또한 양성 T1 영상화(positive T1 imaging)에서 중요한 역할을 한다. pH가 감소함에 따라, PMN의 r2/r1 비율은 r2에 따라 현저하게 감소한다. 마지막으로, PMN은 pH 5.5에서, 3.87 mM-1·s-1의 특정 r1값 및 5.8의 낮은 r2/r1 비율을 가지며, 이는 T1-가중 영상화(T1-weighted imaging)에서 밝은 신호(bright signal)로 나타난다. 따라서, pH 7.4에서 PMN의 양성 T1 MR 조영(positive T1 MR contrast)은 소광되었지만, pH 5.5에서 크게 회복되었으며, 이는 PMN가 산성 종양 영역에 대한 민감한 T1 MR 영상화(sensitive T1 MR imaging)에 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 반면에, InS-NP의 MR 조영은 pH에 의존하지 않았다(도 10). 본 발명자들이 아는 바에 의하면, 이는 종양 pH-감응성 T1 MR 영상화에 사용될 수 있는 pH-감응성 T1 조영을 보여주는 생체적합성 산화철 나노입자에 대한 첫 번째 실례이다. Gd3 +-기반 T1 조영제 또한 pH 자극에 반응하도록 설계될 수 있으나, Gd3 +은 일반적으로 짧은 혈액 반감기를 가져서, 고해상도 종양 영상화를 위한 종양 내 축적을 방해한다. 더욱이, Gd3 +-기반의 조영제는 잠재적으로 독성이 있을 수 있고; 가돌리늄 함유 조영제를 사용한 신부전 환자에게서 심각한 부작용이 관찰됨에 따라 미국 FDA는 최근 Gd3 +-기반의 MR 조영제와 신성 전신 섬유화증(nephrogenic system fibrosis, NSF)에 대해 경고하였다. 이러한 부작용이 환자의 5 % 미만에서 발생하는 매우 드문 경우일 지라도, 본 발명자들은 산화철 나노입자가 생물학적 및 대사적으로 더욱 친화적인 대안을 제공할 수 있다고 믿는다. 산화철 기반의 PMN 제조에 생분해성 고분자 펩타이드를 사용하면, 최종 생성물이 더욱 긴 혈액 반감기를 가지고 임상적 번역(clinical translation)을 위해 더 큰 생체적합성을 갖게 한다.
실시예 22. 시험관 내 및 생체 내 MRI
Litz Coil(직경, 100 mm; 길이, 85 mm; DOTY Scientific Inc., NC, USA)을 사용하는 1.5 T MR 스캐너(Signa Excite; GE Healthcare)를 사용하여 MRI 검사를 수행하였다. 실온의 다른 pH 값의 배지 내에서, 다른 농도의 PMN에 대해 고속 스핀 에코(fast spin echo, FSE) 시퀀스를 사용하여 스핀-격자 및 스핀-스핀 이완 시간(T1 및 T2)을 측정하였다. T1 측정을 위해, 시계(Field of View, FOV)는 75 × 75 mm, 슬라이스 두께(SL) = 3 mm, 에코 시간(TE) = 9.3 ms 그리고 반복 시간(TR) = 505.2, 525.0, 545.0, 565.0, 585.0, 605.0, 625.0, 645.0, 665.0, 685.0, 705.0, 730.0, 755.0, 805.0, 855.0, 905.0, 955.0, 1005.0, 1055.0, 1105.0 ms로 설정하였다. T2 측정을 위해, 다음과 같은 파라미터가 사용되었다: FOV = 100 mm * 100 mm, SL = 3mm, TR = 4000 ms, TE = 10.9, 21.7, 43.5, 54.4, 65.2, 87.0, 119.6, 141.3, 163.1, 174.0 ms. 수직 이완도(relaxivitiy)(R1) 및 수평(R2) 이완도를 ri=(1/Ti1/Ti0)/c로부터 계산하였고, 상기 c는 mM 단위의 PMN의 철 농도이고, Ti는 농도 c에서의 이완 시간이며, Ti0는 물의 이완 시간이고, T1 및 T2 에 대하여 i는 1 및 2이다. FSE 시퀀스( FOV=100 mm * 100 mm, SL = 3 mm)를 사용하여 세포 MR 영상을 얻었다. T1 측정을 위해, TR = 400 ms 및 TE = 10 ms가 사용된 반면, T2 측정을 위해서는 TR = 4000 ms 및 TE = 86.72 ms가 사용되었다. 생체 내 종양의 MR 진단을 위해, 2 mg Fe/kg 체중의 투여량으로 PMN을 꼬리 정맥에 주사하였다. 다음으로, 마우스를 1.5 T MR 스캐너(Signa Excite, GE Healthcare)에 위치시켰으며, FSE 시퀀스는 다음의 파라미터를 사용하였다: FOV = 90 mm × 90 mm, SL = 2 mm, 플립 각(FA) = 90°, T1 MR 영상화에 대해 TR = 400 ms, TE = 10 ms, 및 T2 MR 영상화에 대해 TR = 3000 ms, TE = 101 ms. 횡단면 영상을 얻었고 Onis Dicom Viewer(DigitalCore, Tokyo, Japan)를 사용하여 분석하였다.
PMN은, 형광 및 유동세포계수법(flow cytometry result)에 의해 입증(도 11a)된 바와 같이, pH 7.4에서 보다 pH 6.8에서 더 높은 세포흡수를 보여주었다. 이와 대조적으로, Ce6 및 InS-NP는 pH 변화에 영향을 받지 아니하였다. 세포 흡수를 위해, TEM(도 11c)으로 산화철 나노입자를 조사했고, 상기 산화철 나노입자는 엔도좀에 흡수되었다. 또한, 공초점 레이저 주사현미경(CLSM)을 사용하여 Ce6 염료를 조사했고(도 11b), PMN의 형광은 리소트래커 그린(Lysotracker Green)의 형광과 완벽히 융합되었다. 상기 Ce6 신호의 존재는, PMN가 엔도좀 내에서 형광 탈억제(fluorescence dequenching)를 위하여 실제로 분리되었다는 것을 암시한다. 결과적으로, PMN은 어둠 속에서는 세포 독성(cytotoxicity)을 보이지 아니 하였으나(도 11d), pH 6.8에서 조명 아래에서는 Ce6에 비해 더 효율적으로 세포 사멸을 유도하였다(도 11e). PMN로 표지된 인간의 대장암종(HCT116)의 MR 조영 및 형광(도 11f)은 이중모드 영상화(dual-modal imaging) 능력을 추가로 확인시켜 주었다.
생체 내에서 PMN을 사용하여 초기 단계의 종양 진단을 수행하였다. 어떠한 종양-표적화 모이어티(moiety)의 결합이 없고, InS-NP 주입과 대조적으로, PMN 주입에 의해 직경 약 3mm의 초소형 HCT116 종양에서 현저한 T1 향상이 나타났고(도 12a 내지 12c), 따라서 이들의 성공적인 종양 표적화 및 pH 의존적 T1 MR 조영 효과를 확인하였다. 약동력학 연구에 의하면, PMN(t1 /2, PMN = 2.90 h) 및 InS-NP(t1 /2, InS - NP = 2.19 h) 모두 긴 혈액 순환 시간(blood circulation time)을 보였다(도 12d). 그러나, 특히, 종양에서의 PMN 축적은 InS-NP에 비해 2배 이상 더 높았다(도 12e). 더욱이, PMN은 마우스의 종양의 고해상도 형광 영상화를 가능하게 하였다(도 12f). 절단된 장기의 거시적 형광 영상화는 PMN의 상당한 종양 축적을 보여주었고(도 13), 세포수준 이하의 CLSM(subcellular CLSM)은 종양 세포에 의한 PMN의 흡수를 확인해 주었다(도 12g). 이러한 결과는 PMN이 매우 효율적인 암의 조기진단을 위한 유망 후보물질임을 나타낸다.
실시예 23. 시험관 내 및 생체 내 광역학 치료( PDT )
시험관 내 PDT를 위하여, HCT116 세포(5 × 104/well)를 전술한 재료와 함께 배양하였다. 이후, 2분 동안 670 nm의 레이저 공급원(Institute of Electronics)으로 상기 세포를 조사함으로써 광감작 실험을 실시하였다. 세포 수준에서의 출력을 5 mW/cm2로 고정하였다. 세포 생존률을 MTT 분석을 사용하여 평가하였다. 흡광도 세기를 마이크로플레이트 리더(Bio-Tek, VT, USA)를 사용하여 595 nm에서 측정하였다. 또한, 대조군 세포의 병행 세트(parallel set)를 사용하였는데, 상기 각 물질들과 함께 배양된 세포를 레이저 조사에 노출시키지 아니하였다. 생체 내 PDT를 위해, Matrigel(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)과 무혈청 배지의 1:1 혼합물 100 μL 내에 HCT116 세포를 피하 이식함으로써 6주령의 수컷 BALB/c 누드마우스의 옆구리(flank) 내에서 HCT116 종양을 성장시켰다. 100 μL의 무혈청 배지 내에서 CT26 (1 × 105 cells), CT26/MDR (1 × 105 cells), 및 M2-10B4 세포(1 × 105 cells)의 혼합물을 피하 주입함으로써 6주령의 수컷 BALB/c 누드마우스의 옆구리에서 이종(heterogeneous) CT26 종양을 성장시켰다. 상기 종양 세포를 접종한 지 10일 후, 다음과 같이 PDT 치료를 하였다: 1군, 오직 식염수; 2군, 오직 유리된 Ce6; 3군, InS - NPs; 그리고 4군, PMN(Ce6 2 mg/kg 체중에 해당). 주사한 지 2시간 후에 KODAK image station (Image Station 4000 MM; Kodak, New Haven, CT)을 사용하여 근적외선(NIR) 영상을 얻었다. 주사한 지 12 시간 후에 670㎚의 레이저(250 mW/cm2, 20분)로 종양 부위를 조사함으로써 1군 내지 4군에서 레이저 처료를 하였다. 전술한 PDT 치료를 5일 후 반복하였다. 버니어 캘리퍼스를 사용하여 첫 PDT 치료 1주일 후에 종양 크기를 3회 측정하였고, 종양 부피를 폭(a)과 높이(b) 측정값으로부터 계산하였다(V = a2 × b/2, 상기 식에서 a≤ b). 종양의 부피가 1,000 mm3으로 측정되거나, 고통의 첫 징후가 나타나거나, 또는 이식한 지 15일 내지 21일 사이에, 모든 마우스를 희생시켰다.
PMN의 치료 효과를 탐색하기 위하여, 생체 내 광역학 치료(photodynamic therapy, PDT)를 실시하였다(도 14). PDT는 임상적으로 승인되었으며, 빛을 조사받으면 세포독성이 있는 일중항 산소 발생(singlet oxygen generation, SOG)을 초래하는 광감작제(photosensitizer)에 의존하는, 암 치료용 최소 침습 시술이다. 그러나 현재 이용가능한 광감작제는 종양 선택성이 결여되어 있어, 정상 조직에 원치 않는 손상을 초래한다. 본 발명의 PMN 시스템에서는, 상기 광감작제의 활성이 표적 종양 부위에 도달할 때까지 자기소광될(self-quenched) 수 있고, 상기 종양 부위에서 이러한 억제가 종양 pH 자극, 구체적으로 세포내 pH 자극에 의해 급격히 역전될 수 있으므로, 매우 특이적인 효능 부위로 이끈다. PMN을 주사받고 빛을 조사받은 HCT116 종양을 포함하는 마우스(tumor-bearing mouse)는, InS-NP 또는 유리 Ce6(free Ce6)로 처리된 마우스에 비해, 상당한 종양 퇴화를 보여 주었다(도 14d 및 14e). 상세하게는, 주사후 1 주일에서, 상기 종양은 흉터 조직만 남기고 거의 완전히 파괴되었다. 향상된 항종양 효과는 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin (H&E)) 염색과 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉-엔드 표지화(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling, TUNEL) 염색에 의해 확인되었다. 이러한 결과는, PMN을 사용하는 pH-표적화된 PDT가 동종(homogeneous) HCT116 이종이식(xenograft)에서 성공하였음을 명확하게 보여주었다.
임상 암 치료에 더욱 부합하도록, 더 이종성이고(heterogeneous) 약물 내성을 가진 종양에서의 PMN 치료 효과를 추가로 입증하였다. 본 발명자들은, PMN의 pH-표적화 방식이 종양의 이종성에 의해 영향받지 않고, PDT가 비특이적 메커니즘으로 죽이기 때문에, 약물 내성 세포가 이의 미접촉 카운터파트(naive counterpart)와 동일하게 예민하다고 가정하였다. 이러한 가설을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 마우스에서 매우 이종적이고 약물 내성을 가진 CT26 종양을 개발하였다. 상기 이종 CT26 종양은, 항암제의 활발한 유출(active efflux)에 관련된 P-당단백질(P-glycoprotein, P-gp)과, 신생혈관생성(angiogenesis, CD31)을 유도하는 간질세포유래 인자-1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)을 과발현시킨다(도 14c). 결과적으로, CT26 종양은, 동종 HCT116 종양에 비해 매우 빠른 성장속도를 갖는 임상 종양에 대한 생리학적 관련 모델을 제공하였다. 특히, InSNP는, 비처리된 대조군과 대비하여, 동종 HCT116 및 이종 CT26 종양 모두에서 약간의 종양 성장 억제를 일으켰다(도 14f 및 14g). 그러나, 상기 이종 모델이 매우 공격적으로 성장하여 InS-NP에서 관찰된 긍정적 효과 너무 미약할 정도이었다. 이와 대비하여, CT26 종양포함 마우스 및 동종 HCT116 종양포함 마우스 모두에서 PMN은 동일하게 극적인 종양 파괴를 보여주었다(도 14f 및 14g). PMN으로 처리된 군에서 종양 조직 및 미세혈관뿐만 아니라 섬유아세포 내의 많은 세포들이 상당히 파괴된 반면에, InS-NP 또는 Ce6로 처리된 군에서는 명백한 손상이 관찰되지 아니하였다(도 14f 및 14g). 따라서, pH 표적화는 상기 PMN의 향상된 항암 치료 효능에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 결과적으로, 최초로, 본 발명자들은 pH-감응성 PDT를 통하여 약물내성 이종 종양의 치료를 성공적으로 입증했으며, 이는 PMN을 높은 약물내성 이종 종양을 포함한 다양한 종양 치료에 적용할 수 있다는 것을 보여준다. 또한, PDT치료를 통해 체중의 큰 손실이 없음이 관찰되었고(도 15), 조직 병리 검사 및 혈청 화학 검사(도 16)를 포함하는 일련의 생체내 생체적합성 테스트에서 PMN이 높은 생체 적합성이 있음이 입증되었다.

Claims (22)

  1. 광감작제, 특정 범위의 수소 이온 농도(pH) 조건에서 분리되는 리간드 A, 및 특정 범위의 수소 이온 농도 조건에서 표면 전하가 변하는 리간드 B를 포함하고,
    상기 광감작제는 클로린 E6(Ce6)이고, 상기 광감작제가 상기 리간드 A 및 상기 리간드 B에 결합되어 있는 것임을 특징으로 하고,
    상기 리간드 A가 하기 화학식 (I)의 화합물인 것임을 특징으로 하고,
    상기 리간드 B가 하기 화학식 (II)의 화합물인 것임을 특징으로 하는 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물:
    Figure 112017003517198-pat00026

    상기 화학식 (I)에서 n 및 m은 각각 독립적으로 5-500이고,
    Figure 112017003517198-pat00027

    상기 화학식 (II)에서 n 및 m은 각각 독립적으로 5-500이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
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  6. 제1항에 있어서, 상기 특정 범위의 pH가 4 내지 7.2인 것임을 특징으로 하는 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, MRI 조영용 나노입자를 추가로 포함하는 것인 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 MRI 조영용 나노입자가 산화철 나노입자인 것임을 특징으로 하는 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 산화철 나노입자의 크기가 1 nm 내지 100 nm인 것임을 특징으로 하는 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물.
  10. (i) 광감작제가 결합되어 있으며 특정 범위의 수소 이온 농도(pH) 조건에서 분리되는 리간드 A와, 광감작제가 결합되어 있으며 특정 범위의 수소 이온 농도 조건에서 표면 전하가 변하는 리간드 B를 함유하는 혼합 용액을 클로로포름에 첨가하여 리간드 조성물을 제조하는 단계; 및
    (ii) 상기 리간드 조성물로부터 나노제형화된 광역학 치료용 약학 조성물을 분리하는 단계를 포함하고,
    상기 광감작제는 클로린 E6(Ce6)이고,
    상기 리간드 A가 하기 화학식 (I)의 화합물인 것임을 특징으로 하고,
    상기 리간드 B가 하기 화학식 (II)의 화합물인 것임을 특징으로 하는 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법:
    Figure 112017003517198-pat00028

    상기 화학식 (I)에서 n 및 m은 각각 독립적으로 5-500이고,
    Figure 112017003517198-pat00029

    상기 화학식 (II)에서 n 및 m은 각각 독립적으로 5-500이다.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제10항에 있어서, 상기 (i)단계의 혼합 용액의 용매가 DMSO, DMF 및 THF로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 (i)단계의 혼합 용액의 유기용매가 클로로포름, 디클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법.
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  17. 제10항에 있어서, 상기 특정 범위의 pH가 4 내지 7.2인 것임을 특징으로 하는 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법.
  18. 제10항에 있어서, 상기 리간드 A가
    (i) DMF와 CH2Cl2의 혼합물 내에서 β-벤질-L-아스파테이트 N-카르복시 무수물(BLA-NCA)을 중합하여 폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(β-벤질-L-아스파테이트)(PEG-PBLA)를 제조하는 단계;
    (ii) 상기 (i)단계에서 제조된 PEG-PBLA에 클로린 E6(Ce6)를 결합시켜 플랫폼 리간드를 제조하는 단계; 및
    (iii) 상기 플랫폼 리간드를 1-(3-아미노프로필)이미다졸 및 도파민을 사용하여 아미노분해시켜 리간드 A를 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는, 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법.
  19. 제10항에 있어서, 상기 리간드 B가
    (i) DMF와 CH2Cl2의 혼합물 내에서 β-벤질-L-아스파테이트 N-카르복시 무수물(BLA-NCA)을 중합하여 폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(β-벤질-L-아스파테이트)(PEG-PBLA)를 제조하는 단계;
    (ii) 상기 (i)단계에서 제조된 PEG-PBLA에 클로린 E6(Ce6)를 결합시켜 플랫폼 리간드를 제조하는 단계; 및
    (iii) 상기 플랫폼 리간드를 1-(3-아미노프로필)이미다졸 및 3-페닐-1-프로필아민을 사용하여 아미노분해시켜 리간드 B를 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는, 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법.
  20. 제10항에 있어서, 상기 (i)단계의 리간드 조성물과 MRI 조영용 나노입자를 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것임을 특징으로 하는 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 MRI 조영용 나노입자가 산화철 나노입자인 것임을 특징으로 하는 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 산화철 나노입자의 크기가 1 nm 내지 100 nm인 것임을 특징으로 하는 광역학 치료용 자기조립형 약학 조성물 제조 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200074296A (ko) 2018-12-14 2020-06-25 대한민국(농촌진흥청장) 산누에나방 빌리버딘을 이용한 가시광 검출 바이오 광센서

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101765335B1 (ko) * 2014-09-26 2017-08-22 서울대학교산학협력단 암 세포 조영용 ｍｒｉ 조영제 조성물
KR102094200B1 (ko) * 2017-02-28 2020-03-27 중앙대학교 산학협력단 인돌-3-아세트산을 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물
CN109395105B (zh) * 2018-11-05 2021-09-28 中山大学 一种聚氨基酸声敏剂及其制备方法与应用
CN111228488B (zh) * 2020-01-16 2022-10-14 成都大学 一种LDH-Ce6-Ag纳米复合材料的制备方法
CN113082217B (zh) * 2021-04-02 2022-09-02 天津大学 聚合物前药修饰的氧化铁纳米粒子及其制备方法
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Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011518890A (ja) * 2009-04-29 2011-06-30 ドイアテクフ コリア シーオー．，エルティーディー． 新規のクロリンｅ６−葉酸結合化合物、その製造方法、およびそれを含有する癌治療用薬学的組成物
BR112012019459A2 (pt) * 2010-02-03 2017-10-17 Signal Pharm Llc identificação de mutação de lkb1 como um biomarcador preditivo para sensibilidade para inibidores de tor quinase.
KR101685646B1 (ko) * 2010-12-29 2016-12-13 한화케미칼 주식회사 홍합 접착단백질 모방을 통한 나노입자를 수계 매질에 분산시키는 생체적합성 분산 안정화제
KR101721570B1 (ko) * 2011-06-22 2017-03-30 한화케미칼 주식회사 산화철 나노입자 기반 림프절 이미징용 ｍｒｉ 조영제 및 이를 이용하여 림프절을 조영하는 방법
KR101765335B1 (ko) * 2014-09-26 2017-08-22 서울대학교산학협력단 암 세포 조영용 ｍｒｉ 조영제 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biomaterial, 2013, 34(36), 9227-9236*
Nanoscale, 2014, 6(22), 13383-13390*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200074296A (ko) 2018-12-14 2020-06-25 대한민국(농촌진흥청장) 산누에나방 빌리버딘을 이용한 가시광 검출 바이오 광센서

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