JP2012044130A

JP2012044130A - 正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、これを利用した造影剤及びその製造方法

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Publication number: JP2012044130A
Application number: JP2010232806A
Authority: JP
Inventors: Yon-Dou Choi; ヨンドゥチョイ; Hyun Jin Kim; ヒュンジンキム; Yun Hee Kim; ユンヒキム; Da-Hon Kim; ダホンキム; In-Hou Kim; インホウキム
Original assignee: NAT CANCER CT; NATIONAL CANCER CENTER
Current assignee: NAT CANCER CT; NATIONAL CANCER CENTER
Priority date: 2010-08-19
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2012-03-01
Also published as: US20120045399A1; KR101244140B1; KR20120017556A

Abstract

【課題】正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、これを利用した造影剤及びその製造方法を提供する。
【解決手段】本発明による正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、前記ナノ粒子の表面にコーティングされた多数のカルボキシル基を含有する高分子を含む高分子層と、前記高分子層の表面にアミド結合で連結された陽イオン性物質とを含む。本発明によれば、超常磁性酸化鉄ナノ粒子を親水性且つ強い陽イオン性を有するように、簡単に且つ再現性良く製造することができる。製造された正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、高い細胞内吸収効率及び安定性を有し、非侵襲的生体画像を用いた効果的な造影剤として多様に活用されることができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、常磁性ナノ粒子と、その用途及び製造方法に関し、より詳細には、正電荷に表面が改質された超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、これを利用した造影剤及びその製造方法に関する。

自家免疫疾患、退行性神経疾患及び癌のような疾病のための治療剤として、細胞を利用しようとする試みが続いている。例えば、ヒト間葉系幹細胞は、組職再生のための大きな可能性を示した（非特許文献１）。細胞治療において、患者に投与した細胞が標的位置に正確に移動しているか、そして標的位置に到逹した細胞の量などに関する情報を得ることは非常に重要である。このような目的を達成するために最も多く試みられてきた方法の１つは、磁気共鳴画像（magnetic resonance imaging；ＭＲＩ）造影剤である超常磁性酸化鉄ナノ粒子（superparamagnetic iron oxide nanoparticles；ＳＰＩＯＮ）を幹細胞などに標識した後、生体内に投与し、ＭＲＩ画像から細胞の移動を非侵襲的に追跡することである。幹細胞をＭＲＩ造影剤である超常磁性ナノ粒子で標識する方法は、リポフェクション（lipofection）、エンドサイトーシス（endocytosis）、エレクトロポレーション（electroporation）、マグネトフェクション（magnetofection）など様々な技術が使用されることができるが、通常、陰イオン電荷を帯びたデクストランが表面にコーティングされている超常磁性酸化鉄ナノ粒子をプロタミンスルフェートまたはポリリシンのような陽イオン性ポリペプチドと一定の割合で混合した後、細胞に２４〜３６時間処理し、細胞標識を行う（非特許文献２）。このような方法は、陽イオン性ポリペプチドと超常磁性酸化鉄ナノ粒子の濃度及び混合の割合によって細胞毒性及び標識効率が異なるので、最適の条件を捜す煩雑な作業が必要となり、細胞処理時間が長くて、細胞に良くない影響を及ぼすものと知られている。様々な文献に記載された報告によれば、陽イオン性物質は、細胞内伝達を促進する役目を行う。したがって、仮に超常磁性ナノ粒子の表面が既に充分に強い陽イオンを帯びていたら、プロタミンスルフェートのような補助試薬を使用しなくても、超常磁性ナノ粒子のみを利用して簡単に且つ効率的に細胞標識を行うことができる。

［ＢｕｓｓｏｌａｔｉＢ，ＪＮｅｐｈｒｏｌ２００６；１９：７０６−７０９］［ＡｒｂａｂＡＳ，ｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２００４．１５；１０４（４）：１２１７−２３］

本発明の目的は、正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子及びこれを利用した造影剤を提供することにある。
本発明の他の目的は、正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子の製造方法を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明の一態様は、正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子を提供する。前記ナノ粒子は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、前記ナノ粒子の表面にコーティングされた多数のカルボキシル基を含有する高分子を含む高分子層と、前記高分子層の表面にアミド結合で連結された陽イオン性物質とを含む。

前記正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、＋３０ｍＶ以上の表面ゼタ電位を有することができ、１０乃至５００ｎｍの平均直径を有することができる。
前記高分子層に含まれた高分子は、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリイタコン酸及びこれらの誘導体の中から選択されることができる。

前記高分子層の表面に結合された陽イオン性物質は、アミン基を含有する４次アンモニウムであることができる。
前記酸化鉄ナノ粒子は、マグヘマイト（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）またはマグネタイト（Ｆｅ₃Ｏ₄）を含むことができ、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）及びガドリニウム（Ｇｄ）の中から選択される少なくともいずれか１つをさらに含むことができる。

また、前記正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、前記高分子層の表面にアミド結合で連結された蛍光染料をさらに含むことができ、前記蛍光染料は、ロダミン（rhodamine）、ボディピ（bodipy）、アレクサフルオル（Alexa Fluor）、シアニン（cyanine）及びこれらの誘導体の中から選択されることができる。

また、本発明の他の態様は、前述した正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む造影剤を提供する。
前記造影剤は、磁気共鳴画像、光学画像または、磁気共鳴画像及び光学画像に使用されるものであることができる。

また、本発明のさらに他の態様は、正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子の製造方法を提供する。前記方法は、（ａ）表面が疎水性リガンドでコーティングされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子を用意する段階と、（ｂ）前記ナノ粒子の表面にコーティングされた疎水性リガンドを多数のカルボキシル基を含有する高分子で置換し、親水性高分子層を形成する段階と、（ｃ）前記親水性高分子層の表面に露出したカルボキシル基とアミン基含有陽イオン性物質とを反応させて、アミド結合を形成させる段階とを含む。

また、前記（ｃ）段階は、前記親水性高分子層の表面に露出したカルボキシル基と蛍光染料とを反応させて、アミド結合を形成させる反応をさらに含むことができる。

以上説明したように、本発明によれば、超常磁性酸化鉄ナノ粒子を親水性且つ強い陽イオン性を有するように、簡単に且つ再現性良く製造することができる。製造された正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、高い細胞内吸収効率及び安定性を有し、非侵襲的生体画像を用いた効果的な造影剤として多様に活用されることができる。

但し、本発明の効果は、以上で言及した効果に限定されず、言及していない他の効果は、下記の記載から当業者に明確に理解されることができる。

本実施例による正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子構造の一例を概略的に示す図である。（ａ）、（ｂ）は、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮの透過電子顕微鏡写真である。３次蒸留水に分散させたＴＭＡ−ＳＰＩＯＮ及びフェリデックスのサイズを粒度分析機を用いて測定したグラフである。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）及び牛胎児血清（ＦＢＳ）が含有されたリン酸緩衝液にＴＭＡ−ＳＰＩＯＮを添加し、２２時間放置した後に撮影した写真である。ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮとフェリデックスの緩和能を比較したグラフである。蒸留水、フェリデックス及びＴＭＡ−ＳＰＩＯＮ水溶液のＴ２−強調磁気共鳴画像写真である。ヒト間葉系幹細胞を細胞培養液（対照群）で処理し、プルシアンブルー法で染色した後に撮影した写真である。ヒト間葉系幹細胞をフェリデックスで処理し、プルシアンブルー法で染色した後に撮影した写真である。ヒト間葉系幹細胞をＴＭＡ−ＳＰＩＯＮで処理し、プルシアンブルー法で染色した後に撮影した写真である。ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮ及びフェリデックスの処理濃度による幹細胞生存率を分析したグラフである。（ａ）、（ｂ）は、各々超常磁性酸化鉄ナノ粒子が標識されたヒト間葉系幹細胞の白色光画像及び磁気共鳴画像写真である。蛍光染料が結合されたＴＭＡ−ＳＰＩＯＮと蛍光染料が結合されないＴＭＡ−ＳＰＩＯＮの蛍光強度を比較分析したグラフである。ローズベンガルによるマウス脳虚血モデルであり、脳虚血部位にＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが標識された幹細胞が蓄積されるか否かを時間別に磁気共鳴画像化した結果である。ローズベンガルによるマウス脳虚血モデルであり、脳虚血部位にＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが標識された幹細胞が蓄積されるか否かを時間別に磁気共鳴画像化した結果である（同図の矢印が示す暗い画像部位は、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが標識された幹細胞が存在する部位である）。ローズベンガルによるマウス脳虚血モデルであり、脳虚血部位にＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが標識された幹細胞が蓄積されるか否かを時間別に磁気共鳴画像化した結果である（同図の矢印が示す暗い画像部位は、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが標識された幹細胞が存在する部位である）。ローズベンガルによるマウス脳虚血モデルであり、脳虚血部位にＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが標識された幹細胞が蓄積されるか否かを時間別に磁気共鳴画像化した結果である（同図の矢印が示す暗い画像部位は、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが標識された幹細胞が存在する部位である）。

以下、添付の図面を参照して本発明の好ましい実施例を詳しく説明する。しかし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。また、ここで紹介される実施例は、開示された内容が完全になり且つ当業者に本発明の思想が充分に伝達され得るようにするために提供されるものである。なお、図面において、層及び領域の厚さは、説明の便宜のために、誇張、縮小または省略された部分があり得る。明細書全般にわたって、同一の参照番号は、同一の構成要素を示す。また、以下では、本発明を説明するにあたって、関連された公知の機能または構成に関する具体的な説明が本発明の要旨を不明瞭にすることがあると判断される場合には、その詳細な説明を省略する。

本発明の一実施例によれば、正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子を提供する。
図１は、本実施例による正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子構造の一例を概略的に示す図である。

図１を参照すれば、正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子Ｐは、中心部（コア）に位置する超常磁性酸化鉄ナノ粒子１０と、前記ナノ粒子１０の表面にコーティングされた多数のカルボキシル基を含有する高分子を含む高分子層１２と、前記高分子層１２の表面にアミド結合で連結された陽イオン性物質１４とを含む。

前記中心部に位置する超常磁性酸化鉄ナノ粒子１０は、マグヘマイト（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）またはマグネタイト（Ｆｅ₃Ｏ₄）を含む。このような超常磁性酸化鉄ナノ粒子１０は、外部磁場を受けたとき、磁性を帯びてから、外部磁場を除去すれば、残留の磁気が消えながら残留磁気による副作用がなく、体内で生分解されることができるので、生体適合性に優れているという長所があるので、治療用細胞の磁気共鳴画像（ＭＲＩ）追跡のための細胞標識物質として利用されることができる。また、前記超常磁性酸化鉄ナノ粒子１０は、造影増強効果などのために、必要に応じてマンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）及びガドリニウム（Ｇｄ）の中から選択される少なくともいずれか１つをさらに含むことができる。

前記酸化鉄ナノ粒子１０の表面にコーティングされた高分子層１２を構成する高分子は、多数のカルボキシル基を含有する。前記カルボキシル基は、前記酸化鉄ナノ粒子１０と多重結合点で配位結合を形成するので、前記高分子層１２のコーティング安定性を高めることができ、前記酸化鉄ナノ粒子１０に親水性を付与し、水溶液上で均一に分散され得るようにする。前記多数のカルボキシル基を含有する高分子は、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリイタコン酸及びこれらの誘導体であることができる。但し、これらに限定されるものではなく、カルボキシル基を含有する多様な生体適合性高分子を使用することができる。

前記陽イオン性物質１４は、前記高分子層１２の表面にアミド結合により安定的結合を形成することができ、これにより、強い正電荷特性を有するナノ粒子を提供することができる。前記陽イオン性物質は、例えば、アミン基を含有する４次アンモニウムであることができ、前記アミン基は、前記高分子層１２に含まれたカルボキシル基のうち前記酸化鉄ナノ粒子１０と配位結合を形成しないカルボキシル基と反応し、アミド結合を形成することができる。図１では、前記アミン基を含有する４次アンモニウムの一例として、正電荷を帯びる窒素原子にメチル基が結合された物質を示したが、これに限定されるものではなく、前記メチル基のほか、水溶性を失わない範囲内で他の炭化水素基または含酸素炭化水素基（例えば、ポリオキシエチレン）などが使用されることができる。図１で、Ｒで表示された部分は、炭化水素鎖を示す。

前記正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子Ｐの表面正電荷は、＋３０ｍＶ以上の表面ゼタ電位を有することができ、ナノ粒子間の強い反発力によって、水溶液上で非常に安定した分散性を維持することができる。一方、前記正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子Ｐは、１０〜５００ｎｍの平均直径を有することができ、このような直径範囲内で使用される造影剤の用途によって適切なサイズを有することができる。

また、前記正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子Ｐは、高分子層１２の表面に結合された蛍光染料をさらに含むことができる（図示せず）。前記蛍光染料を導入することによって、前記正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子Ｐは、磁気共鳴画像造影剤だけでなく、光学画像造影剤としても使用されることができる。前記蛍光染料は、酸化鉄ナノ粒子と強い結合を形成するために、前記高分子層１２の表面にアミド結合で連結されることが好ましく、これにより、前記蛍光染料は、体内に注入された後にも、酸化鉄ナノ粒子の表面に残存することができる。前記蛍光染料は、ロダミン（rhodamine）、ボディピ（bodipy）、アレクサフルオル（Alexa Fluor）、シアニン（cyanine）及びこれらの誘導体であることができる。但し、これらに限定されるものではない。

本発明の他の実施例によれば、正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子の製造方法を提供する。前記製造方法は、（ａ）表面が疎水性リガンドでコーティングされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子を用意する段階と、（ｂ）前記ナノ粒子の表面にコーティングされた疎水性リガンドを多数のカルボキシル基を含有する高分子で置換し、親水性高分子層を形成する段階と、（ｃ）前記親水性高分子層の表面に露出したカルボキシル基とアミン基含有陽イオン性物質とを反応させて、アミド結合を形成させる段階と、を含む。

前記（ａ）段階は、共沈（co-precipitation）法、熱分解（thermal decomposition）法、熱水合成（hydrothermal synthesis）法またはマイクロエマルション（microemulsion）法など多様な公知の方法によって行うことができ、好ましくは、熱分解法によって行うことができる。前記熱分解法によれば、ナノ粒子の微細なサイズ調節が可能であり、ナノ粒子のサイズ分布が均一であり、粒子の結晶性が高くて、磁性特性が良いという長所がある。この際、有機溶媒上で合成されたナノ粒子は、ナノ粒子の表面が疎水性リガンド、例えば、オレイン酸、ラウリン酸のような脂肪酸でコーティングされているので、生体内で使用可能な造影剤として活用するためには、ナノ粒子の表面を親水性に改質する手続が必要である。

前記（ｂ）段階は、リガンド置換法によって行うことができる。具体的に、前記（ａ）段階で用意した疎水性リガンドでコーティングされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子を極性有機溶媒の下で多数のカルボキシル基を含有する親水性高分子と混合し、加熱することによって、疎水性リガンドを親水性高分子で置換することができる。この際、前記極性有機溶媒は、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールなどのグリコール系有機溶媒であることができ、前記親水性高分子は、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリイタコン酸及びこれらの誘導体であることができる。但し、これらに限定されるものではない。

前記（ｃ）段階は、カルボキシル基によって負電荷の表面特性を有するナノ粒子を正電荷の表面特性を有するように改質する過程であって、本段階によって導入された陽イオン性物質は、ナノ粒子にコーティングされた高分子層にアミド結合で連結されているので、安定的結合を維持することができる。この際、使用される陽イオン性物質は、４次アンモニウムであることができる。

一方、前記（ｃ）段階は、前記親水性高分子層の表面に陽イオン性物質を結合させる反応に加えて、前記親水性高分子層の表面に蛍光染料を結合させる反応をさらに含むことができる。この場合、好ましくは、前記蛍光染料は、前記親水性高分子層の表面に露出したカルボキシル基とアミド結合により連結されることができる。前記蛍光染料は、ロダミン、ボディピ、アレクサフルオル、シアニン及びこれらの誘導体であることができる。但し、これらに限定されるものではない。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実験例を提示する。但し、下記の実験例は、本発明の理解を助けるためのものに過ぎず、本発明が下記の実験例に限定されるものではない。

〔製造例１：正電荷に表面が改質された超常磁性酸化鉄ナノ粒子の製造〕
・親水性高分子でコーティングされた超常磁性ナノ粒子の製造
超常磁性酸化鉄ナノ粒子（superparamagnetic iron oxide nanoparticles；ＳＰＩＯＮ）は、Nam-Jong PARKなどが２００４年に発表した論文（Ｎａｔｕｒｅｍａｔｅｒｉａｌｓ，３：８９１−８９５（２００４））によって合成した。これによって合成されたナノ粒子は、表面がオレイン酸でコーティングされているので、疎水性表面特性を有する。次に、下記のような方法により、前記オレイン酸を親水性高分子であるポリアクリル酸（polyacrylic acid；ＰＡＡ）で置換した。

まず、オレイン酸でコーティングされた超常磁性ナノ粒子（oleic acid-coated ＳＰＩＯＮ；ＯＡ−ＳＰＩＯＮ）２００ｍｇをトルエン２ｍＬに添加した後、一日間撹拌し、十分に分散した。枝付き丸底フラスコにジエチレングリコール（ＤＥＧ）１６ｍＬとポリアクリル酸（ＰＡＡ、Ｍｗ１，８００）２ｇを添加し、アルゴン（Ａｒ）ガスを流しながら５分間撹拌した後、フラスコ内の温度を１１０℃に上げて３０分間加熱することによって、ＰＡＡがＤＥＧに完全に溶解されるようにした。これにＯＡ−ＳＰＩＯＮが分散しているトルエン溶液２ｍＬを注射器を使用してフラスコ内に注入し、反応温度を２４０℃に上げて６時間さらに反応させた。反応中にアルゴンガスをフラスコ内に続いて供給した。反応終了後には、室温で徐々に冷やし、溶液の温度を低めた。３次蒸留水１５０ｍＬに塩酸（ＨＣｌ）２ｍＬを入れ、溶液のｐＨを約２．６に合わせた強酸性溶液を用意し、この強酸性溶液に上記で得られた反応物を添加し、ＰＡＡでコーティングされたＳＰＩＯＮ（ＰＡＡ−ＳＰＩＯＮ）の沈殿を誘導した。沈殿された超常磁性酸化鉄ナノ粒子を７，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄み液を捨てた後、１００ｍＭＮａＯＨ２０ｍＬを添加し、沈殿物をさらに分散させた。ナノ粒子分散液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓ、Ｉｎｃ．，ＭＷＣＯ５０，０００ｄａｌｔｏｎ）に入れ、３次蒸留水を利用して１８時間透析し、ナノ粒子表面に結合しないＰＡＡなどを除去した。透析を終了した後、シリンジフィルタ（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＧＨＰａｃｒｏｄｉｓｃ，０．２μｍ）を利用して２００ｎｍより大きいサイズのナノ粒子を除去した後、水溶液を液体窒素で凍結した後、凍結乾燥した。２００ｍｇのＯＡ−ＳＰＩＯＮを反応させたとき、平均１００ｍｇの表面負電荷を有するＰＡＡ−ＳＰＩＯＮを得ることができた（約５０％の収率）。
・正電荷に表面が改質された超常磁性ナノ粒子の製造
ナノ粒子表面がポリアクリル酸で置換されたＰＡＡ−ＳＰＩＯＮ１００ｍｇを３次蒸留水１０ｍＬに分散させた後、２−アミノエチルトリメチルアンモニウム（trimethyl ammonium；ＴＭＡ）２００ｍｇをＰＡＡ−ＳＰＩＯＮが分散している水溶液に添加し、３０分間室温で撹拌させた。その後、０．１ＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）５００μＬに０．２ＭになるようにＥＤＣを溶解して添加し、この溶液をＰＡＡ−ＳＰＩＯＮが分散した水溶液に添加し、２時間さらに撹拌させた。透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓ、Ｉｎｃ．，ＭＷＣＯ５０，０００ｄａｌｔｏｎ）に溶液を添加し、３次蒸留水を利用して１８時間透析することによって、ナノ粒子の表面に結合しないＴＭＡなどを除去した。陽イオン性であるトリメチルアンモニウム（ＴＭＡ）で表面が置換された超常磁性酸化鉄ナノ粒子であるＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが分散している水溶液を液体窒素で凍結した後、凍結乾燥し、粉末状態で得た後、４℃で保管した。１００ｍｇのＰＡＡ−ＳＰＩＯＮを反応させたとき、平均５０ｍｇの正電荷に表面電荷が改質されたＴＭＡ−ＳＰＩＯＮを得ることができた（約５０％収率）。

〔分析例１：ＰＡＡ−ＳＰＩＯＮ及びＴＭＡ−ＳＰＩＯＮの形状、電位及び安定性分析〕
ＰＡＡ−ＳＰＩＯＮとＴＭＡ−ＳＩＰＯＮを３次蒸留水に分散させた水溶液を４００メッシュ銅グリッド（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎｃａｒｂｏｎｆｉｌｍ，ｐｒｏｄｕｃｔＮｏ．０１８２４，ＴＥＤＰＥＬＬＡ，ＩＮＣ．）に分注し、一日間乾燥させた後、透過電子顕微鏡（３００ｋＶ，ＦＥＩＴｅｃｎａｉ：Ｆ３０ＳＴ）で観察した。ＰＡＡまたはＴＭＡで置換される前後の酸化鉄ナノ粒子の形状は、円形と均一に現われた。図２（ａ）及び図２（ｂ）は、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮの透過電子顕微鏡写真である。ナノ粒子のコアサイズは、約９．６ｎｍであって、均一な円形状を有することが分かる。

また、各々のＳＰＩＯＮサイズ（hydrodynamic volume）及び表面ゼタ電位を測定するために、ナノ粒子粉末を３次蒸留水で希釈した後、粒度分析機（ＮａｎｏＺｅｔａｓｉｚｅｒ，ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を利用して測定した。ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮの平均ナノ粒子のサイズは、約１０１ｎｍ程度であって、フェリデックス（Ｆｅｒｉｄｅｘ，ＡｄｖａｎｃｅｄＭａｇｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）と類似な分布を示した（図３）。ＰＡＡ−ＳＰＩＯＮのゼタ電位値は、−４１．６±５．３ｍＶであって、超常磁性ナノ粒子の表面が強い負電荷を帯びることが確認され、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮは、＋４０．０±２．２ｍＶであって、ナノ粒子の表面が負電荷から正電荷に変わったことが確認された。＋３０ｍＶ以上の表面ゼタ電位値を有するナノ粒子は、水溶液上で非常に安定した分散を示すものと知られていて、約＋４０ｍＶのゼタ電位を有するＴＭＡ−ＳＰＩＯＮは、蒸留水で２００日間サイズの変化なしに安定的分散状態を維持した。

次に、細胞培養液に添加する牛胎児血清（fetal bovine serum；ＦＢＳ）が存在する条件の下で、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮの分散安定性の試験を行った。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にＦＢＳを各々０、１０、５０ｖ／ｖ％で混合し、これにＴＭＡ−ＳＰＩＯＮ水溶液を添加した後、室温に放置し、ナノ粒子沈殿物の生成可否を観察した。２２時間後にも、すべての条件の下で沈殿物が生成されず、これにより、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮの分散安定性を確認することができた（図４）。

〔分析例２：緩和能（relaxivity）分析〕
フェリデックス（ＡｄｖａｎｃｅｄＭａｇｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）とＴＭＡ−ＳＰＩＯＮを各々３次蒸留水に分散させた後、誘導結合プラズマ−原子放出分光法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を利用して分散溶液内の鉄濃度を測定した。その結果、各々フェリデックス１１ｍｇＦｅ／ｍＬ及びＴＭＡ−ＳＩＰＯ２．３ｍｇＦｅ／ｍＬと確認された。この溶液を蒸留水で希釈し、さまざまな濃度の溶液を作った後、７−ＴｅｓｌａＭＲＩ（ＢｒｕｋｅｒＢｉｏｓｐｉｎＭＲＩ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して各濃度別に１／Ｔ２値を求め、１／Ｔ２値と濃度のグラフから緩和能（ｒ２）値を得た。超常磁性酸化鉄ナノ粒子のＭＲ画像造影能力を示すｒ２値を比較した結果、ＴＭＡ−ＳＩＰＯＮがフェリデックスより４．４倍大きいことが分かる（図５）。また、７−ＴｅｓｌａＭＲＩを利用したＴ２−強調画像（溶液の濃度＝０．６９８μｇＦｅ／ｍＬ、ＴＲ＝２５００ｍｓｅｃ、ＴＥ＝８．５ｍｓｅｃ）から、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮがフェリデックスに比べてＴ２をさらに短くし、画像をさらに暗くすること（negative-enhanced contrast）を確認した（図６）。

〔分析例３：幹細胞標識効率分析〕
１２−ウェルプレートにポリリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｐ７８９０）でコーティングされた円形カバースリップを配置し、これにヒト間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，Ｌｏｎｚａ，ＰＴ−２５０１）を１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの数字に分注した後、２４時間１０％ＦＢＳを含むＭＥＭａｌｐｈａ培地で培養した。各々フェリデックスとＴＭＡ−ＳＰＩＯＮ分散水溶液を１ｍＬ無血清培地に０．０２５ｍｇＦｅ／ｍｌ濃度に希釈し、ウェルに添加した後、４時間処理した。その後、血清が入っている培地に交替し、２時間さらに培養し、細胞を染色した。細胞染色は、細胞内ＳＰＩＯＮの標識効率を分析するために、プルシアンブルー染色技法を使用するが、１０％酢酸（Ｓｉｇｍａ，３２００９９）と１０％ヘキサシアノ鉄(II)酸カリウム（potassium ferrocyanide）（Ｓｉｇｍａ，Ｐ３２８９）溶液を反応する直前に十分に混合した後、細胞に処理した後、２０分間反応させた。反応後、リン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．４，ＮａＣｌ１３８ｍＭ）で洗浄し、細胞核と細胞質染色のために各ウェルに１ｍＬのヌクレアーファストレッド溶液（Nuclear fast red solution）（Ｓｉｇｍａ，Ｎ３０２０）を処理し、５分間反応させた。反応が終わった後、リン酸緩衝液で洗浄し、５０倍率光学顕微鏡（Ｚｉｅｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察し、イメージを得た。

図７、図８及び図９は、各々ヒト間葉系幹細胞を細胞培養液（対照群）、フェリデックス及びＴＭＡ−ＳＰＩＯＮで処理し、プルシアンブルー法で染色した後に撮影した写真である。図７の場合、細胞内に青色に染色された部分が見られないことを目視により確認することができた（図７は白黒画像であるので、青色は黒色で表示されるが、同図では図８に示す様な黒色の斑点は見られない）。図８の場合、一部の細胞が弱い青色に染色されたことを目視により確認することができた（図８は白黒画像であるので、同図では青色の染色部分は散在する黒色の斑点で示されている）。これに対し、図９の場合、すべての細胞が強い青色に染色されたことを目視により確認することができた（図９は白黒画像であるので、同図では青色の染色部分は全体に広がる濃い黒色の斑点で示されている）。これにより、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが細胞内に効率的に吸収されたことが分かる。すなわち既存の商用化された超常磁性酸化鉄ナノ粒子の場合、細胞内透過を補助することができるプロタミンスルフェートのような補助剤を必要とするが、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮは、補助剤がなくても、４時間ぶりに細胞に入ることを確認することができる。これは、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮ表面の正電荷が細胞内透過を容易にすることを示す結果と言える。

〔分析例４：細胞毒性試験〕
超常磁性酸化鉄ナノ粒子の処理濃度による細胞毒性効果の試験を行うために、フェリデックスとＴＭＡ−ＳＰＩＯＮを無血清細胞培養液に各々０、０．１２、０．２５、０．５、１ｍｇＦｅ／ｍｌの濃度で製造した。ヒト間葉系幹細胞を９６ウェルプレートに１×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに分注し、２４時間培養した後、既存の細胞培養液を除去し、超常磁性酸化鉄ナノ粒子が分散した細胞培養液をウェル当たり１００μＬずつ添加した後、４時間培養した。反応後には、ＣＣＫ−８分析法を利用して細胞生存率を測定した。図１０によれば、０．５ｍｇＦｅ／ｍｌの濃度までは、フェリデックスとＴＭＡ−ＳＰＩＯＮがいずれも細胞毒性を示さないし、１ｍｇＦｅ／ｍｌでは、フェリデックスの場合、約８０％の生存率を示すのに対し、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮは、同濃度で９０％以上の生存率を示した（＊、ｐ＝０．００７で統計的に有意な値であることを確認した）。

〔分析例５：超常磁性酸化鉄ナノ粒子が標識された幹細胞のＴ２−強調画像比較分析〕
超常磁性酸化鉄ナノ粒子が標識された幹細胞がＴ２−強調ＭＲ画像で現われる造影効果を確認するために、３×１０⁵個のヒト間葉系幹細胞を６ウェルプレートで２４時間培養した後、細胞培養液に分散したフェリデックスとＴＭＡ−ＳＰＩＯＮを各々０．０２５ｍｇＦｅ／ｍｌの濃度で４時間処理した。上澄み液を除去し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，２５２００）で処理し、ヒト間葉系幹細胞を取り外し、１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。リン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．４，ＮａＣｌ１３８ｍＭ）でペレットを２回洗浄し、幹細胞表面に吸着しているナノ粒子を除去し、７Ｔ−ＭＲＩ装備を利用してＴ２−強調画像（ＴＥ＝７．６ｍｓｅｃ，ＴＲ＝２０００ｍｓｅｃ）を得た。

図１１（ａ）及び図１１（ｂ）は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子が標識されたヒト間葉系幹細胞の白色光画像及び磁気共鳴画像写真である（図１１（ａ）及び図１１（ｂ）の写真左側から対照群、フェリデックス処理試料及びＴＭＡ−ＳＰＩＯＮ処理試料）。図１１（ｂ）を参照すれば、同濃度でフェリデックスで標識した場合よりＴＭＡ−ＳＰＩＯＮで標識したヒト間葉系幹細胞の場合がＴ２−強調磁気共鳴画像でさらに暗く見えることを確認することができる。

〔製造例２：蛍光染料が結合されたＴＭＡ−ＳＰＩＯＮ製造〕
ＰＡＡ−ＳＰＩＯＮにＴＭＡと５−ＴＡＭＲＡカダベリン（５ｍｇ／ｍｌ，５−Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ，ＡｎａＳｐｅｃＩｎｃ．，ＣＡ９４５５５）を１０００：１割合で添加し、３０分間撹拌した後、０．１ＭＥＤＣ（０．１ＭＭＥＳ緩衝液，ｐＨ４．７）を添加し、２時間反応させた後、２日間暗室で透析したことを除いて、前記製造例１と同一の方法を行い、蛍光染料が結合されたＴＭＡ−ＳＰＩＯＮを製造した。

〔分析例６：蛍光測定〕
前記製造例２で製造された蛍光染料が結合されたＴＭＡ−ＳＰＩＯＮと蛍光染料が結合されないＴＭＡ−ＳＰＩＯＮ（対照群）の蛍光を測定して比較した。比較結果、図１２に示されたように、蛍光染料が結合されたＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが対照群に比べて５８０〜５９０ｎｍで約１７倍の高い蛍光強度を示すことを確認した（実線は対照群、点線は５−ＴＡＭＲＡが結合されたＴＭＡ−ＳＰＩＯＮ）。これから、細胞及び生体内で磁気共鳴画像だけでなく、蛍光画像測定も可能であることを確認することができる。

〔分析例７：磁気共鳴画像法を用いたＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが標識されたヒト間葉系幹細胞の生体移動画像追跡効能評価〕
まず、脳虚血モデルを作るために、４匹のＢａｌｂ／ｃ−ｎｕｍｏｕｓｅ（Ｏｒｉｇｉｎ，７〜８ｗｅｅｋｓ）を呼吸麻酔させた後、光感覚剤であるローズベンガル（rose bengal）をマウスのしっぽ静脈に５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈投与した。マウスの頭皮を剥がし、矢状縫合と冠状縫合の接合点の左側部位に５３０ｎｍレーザーを利用して２０ｍＷで１０分間照射し、レーザーが照射された部位で脳虚血を誘導した。光の照射が終わった後、頭皮を縫合し、一日間安定化させ、翌日、脳虚血部位を７−ＴｅｓｌａＭＲＩでＴ２−強調画像を確認した（図１３，ＴＲ＝２５００ｍｓｅｃ，ＴＥ＝３５ｍｓｅｃ，ｓｌｉｃｅｔｈｉｃｋｎｅｓｓ＝０．７ｍｍ）。図１３に示されたように、光感覚剤を利用した脳虚血モデルがよく作られたことが分かる。その後、０．０１ｍｇＦｅ／ｍｌの濃度のＴＭＡ−ＳＰＩＯＮを１×１０⁵個のヒト間葉系幹細胞に４時間処理し、リン酸緩衝液で標識されないＴＭＡ−ＳＰＩＯＮを除去し、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが標識された幹細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで処理し、細胞を分離した。０．０５ｍＬ培地に分散した幹細胞を０．５ｍＬインシュリン注射器（３０Ｇ、SUNGSIMメディカルＣＯ．ＬＴＤ．）に移した後、マウスのしっぽに静脈投与した。ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが標識されたヒト間葉系幹細胞を注射した後、１日、２日、７日目に磁気共鳴画像を撮影し、脳虚血部位に幹細胞の移動があるか否かを観察した。ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮが標識された幹細胞を静脈投与した後、１日目には、脳虚血部位に少しの幹細胞が観察され（図１４）、２日目には、さらに多い量の幹細胞が脳虚血部位に移動して蓄積されていることを磁気共鳴画像から確認することができる（図１５）。幹細胞投与後の７日目には、脳虚血部位が回復していて、端部に相変らず相当な幹細胞が存在することを確認することができる（図１６）。これは、ＴＭＡ−ＳＰＩＯＮで標識されたヒト間葉系幹細胞が静脈血管を通じて損傷された脳部位に移動することを磁気共鳴画像で追跡するのに有用に利用されることができることを示す結果である。

以上説明したように、本発明によれば、超常磁性酸化鉄ナノ粒子を親水性且つ強い陽イオン性を有するように、簡単に且つ再現性良く製造することができ、製造された正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、高い細胞内吸収効率及び安定性を有するので、非侵襲的生体画像を用いた効果的な造影剤として多様に活用されることができる。これに加えて、細胞表面に存在する特定の受容体などと結合することができるリガンドや抗体を追加に結合し、多様な誘導体の合成が可能であると期待される。

以上、本発明を好ましい実施例により詳細に説明したが、本発明は、前記実施例に限定されず、本発明の技術的思想及び範囲内で当分野における通常の知識を有する者によってさまざまな変形及び変更が可能である。

Claims

超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、
前記ナノ粒子の表面にコーティングされた多数のカルボキシル基を含有する高分子を含む高分子層と、
前記高分子層の表面にアミド結合で連結された陽イオン性物質と、を含むことを特徴とする請求項１に記載の正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子。
前記正電荷は、＋３０ｍＶ以上の表面ゼタ電位を有することを特徴とする請求項１に記載の正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子。
前記正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、１０乃至５００ｎｍの平均直径を有することを特徴とする請求項１に記載の正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子。
前記高分子は、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリイタコン酸及びこれらの誘導体の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子。
前記陽イオン性物質は、アミン基を含有する４次アンモニウムであることを特徴とする請求項１に記載の正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子。
前記酸化鉄ナノ粒子は、マグヘマイト（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）またはマグネタイト（Ｆｅ₃Ｏ₄）を含むことを特徴とする請求項１に記載の正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子。
前記酸化鉄ナノ粒子は、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）及びガドリニウム（Ｇｄ）の中から選択される少なくともいずれか１つをさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子。
前記高分子層の表面にアミド結合で連結された蛍光染料をさらに含むことを特徴とすることを特徴とする請求項１に記載の正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子。
前記蛍光染料は、ロダミン（rhodamine）、ボディピ（bodipy）、アレクサフルオル（Alexa Fluor）、シアニン（cyanine）及びこれらの誘導体の中から選択されることを特徴とする請求項８に記載の正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子。
請求項１乃至９のいずれか１つに記載の正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む造影剤。
前記造影剤は、磁気共鳴画像、光学画像、または磁気共鳴画像及び光学画像に使用されるものであることを特徴とする請求項１０に記載の造影剤。
（ａ）表面が疎水性リガンドでコーティングされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子を用意する段階と、
（ｂ）前記ナノ粒子の表面にコーティングされた疎水性リガンドを多数のカルボキシル基を含有する高分子で置換し、親水性高分子層を形成する段階と、
（ｃ）前記親水性高分子層の表面に露出したカルボキシル基とアミン基含有陽イオン性物質とを反応させて、アミド結合を形成させる段階と、を含む正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子製造方法。
前記（ｃ）段階は、前記親水性高分子層の表面に露出したカルボキシル基と蛍光染料とを反応させて、アミド結合を形成させる反応をさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の正電荷性の超常磁性酸化鉄ナノ粒子製造方法。