KR102106897B1 - 가돌리늄 산화물 나노입자 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자 및 이의 제조방법에서, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자의 제조방법은 친수성 고분자 및 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기를 갖는 프로브를 포함하는 제1 용액과 가돌리늄 수화물을 포함하는 제2 용액을 혼합하는 단계 및 제1 및 제2 용액의 혼합 용액에 염기성 용액을 첨가하는 단계를 포함한다.

Description

가돌리늄 산화물 나노입자 및 이의 제조 방법{GADOLINIUM NANOPARTICLE AND MANUFACTURING METHOD OF THE GADOLINIUM NANOPARTICLE}
본 발명은 가돌리늄 산화물 나노입자에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 중성자 포획치료용 가돌리늄 산화물 나노입자와 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
중성자 포획치료(neutron capture therapy, NCT)는 중성자 포획반응으로부터 방출되는 방사능을 이용하여 암 치료를 목적으로 하는 치료방법의 하나로서, 중성자 포획치료는 기존의 항암 약물을 사용하는 화학요법과는 달리 약리물질을 사용할 필요가 없어 심각한 부작용을 고려할 필요가 없다는 장점을 가지며, 대표적인 중성자 포획치료를 위한 물질로서는 10B와 157Gd를 이용하는 보론 중성자 포획치료(boron neutron capture therapy, BNCT)와 가돌리늄 중성자 포획치료(gadolinium neutron capture therapy, GdNCT)가 있다.
그 중 GdNCT는 안정한 방사성 핵종인 157Gd(자연존재= 15.7%) 기반의 물질을 이용하여 가돌리늄(Gd)의 핵 중성자 흡수 반응(nuclear neutron capture reaction)을 통해 종양 세포 핵 내부의 DNA를 손상시켜 종양 세포를 사멸시키는 방법으로, 157Gd은 현재 BNCT에 사용되는 10B(자연 존재비 = 19.7%)의 3840 barn 보다 67배 높은 257,000 barn의 높은 열 중성자 포획 단면적(large thermal neutron cross section)을 갖는다. 때문에, GdNCT를 이용한 항암 치료는 높은 관심을 받고 있다.
그러나, 가돌리늄은 그 자체가 갖는 독성 문제와 수용 상에서의 저조한 분산안정성을 갖는다는 단점이 있고, 특히, 가돌리늄의 핵 반응 생성물 IC 및 ACK 전자가 짧은 경로 길이(몇 mm)를 갖기 때문에, 성공적인 GdNCT를 위해서는 가돌리늄 기반의 GdNCT제가 종양 세포 핵에 근접하거나 내부에 존재하여야 하지만, 종래의 GdNCT에 적용되는 GdNCT제는 종양 조직(세포)에 대한 낮은 선택성을 가질 뿐만 아니라, 일반적으로 정맥 투여하기에는 너무 큰 크기를 가져(d > 30 nm) 주로 종양내(intratumorally) 또는 복강내(intraperitoneally)로 투여하므로, 종양 세포에 대한 효과적인 치료가 어렵다는 문제가 있다.
이에, 인체에 무해하고 안정적이며, 종양 세포에 대한 선택성이 우수하고 효과적으로 중성자 포획치료에 적용 가능하며, 중성자 포획치료에 적용 시 우수한 종양 세포 사멸력(항암 효과)를 나타낼 수 있는 새로운 NCT용 물질에 대한 연구 및 개발이 더 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 가돌리늄 산화물 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 가돌리늄 산화물 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 중성자 포획치료용 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적을 위한 가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 방법은 친수성 고분자 및 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기를 갖는 프로브를 포함하는 제1 용액과 가돌리늄 수화물을 포함하는 제2 용액을 혼합하는 단계 및 제1 및 제2 용액의 혼합 용액에 염기성 용액을 첨가하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 친수성 고분자는 폴리아크릴산(polyacrylic aicd)를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 프로브는 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기를 갖는 로다민(rhodamine)계 화합물일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제1 용액에서 친수성 고분자의 적어도 일부가 프로브와 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기는 아민기일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 가돌리늄 수화물을 포함하는 용액은 염화가돌리늄 수화물을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 염기성 용액은 수산화나트륨(NaOH) 용액을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 염기성 용액을 첨가하는 단계에서, 표면에 친수성 고분자가 배위 결합된 가돌리늄 산화물 나노입자가 형성되고, 상기 친수성 고분자의 적어도 일부는 프로브와 결합될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 위한 가돌리늄 산화물 나노입자는 상기에서 설명한 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자의 제조방법 중 어느 하나에 따라 제조되고, 표면에 배위 결합된 친수성 고분자를 포함하며, 상기 친수성 고분자의 적어도 일부가 프로브와 결합된 것을 특징으로 한다.
일 실시예에서, 상기 가돌리늄 산화물 나노입자의 직경은 3 nm 미만일 수 있다.
이때, 상기 가돌리늄 산화물 나노입자의 직경은 1 내지 2.5 nm일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 정맥 투여 가능하고, 모세혈관 내에서 자유 유영 가능할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 진단 및 치료가 동시 가능한 테라그노스틱(theragnostics) 나노입자일 수 있다.
이때, 상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 중성자 조사 시 중성자 포획 반응할 수 있다.
이때, 상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 자기 공명 이미지(MRI) 장치 하에서 조영 증강 특성을 가질 수 있다.
이때, 상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 550 nm 내지 570 nm의 파장 범위에서 pH가 감소할수록 형광 세기가 증가할 수 있다.
이때, 상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 종양 세포를 진단 및 치료하는 종양 세포 테라그노스틱 나노입자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 위한 중성자 포획치료용 나노입자는 가돌리늄 산화물 나노입자; 상기 가돌리늄 산화물 나노입자 표면에 배위 결합된 친수성 고분자; 및 상기 친수성 고분자의 적어도 일부와 결합된 프로브를 포함하고, 중성자 조사 시 중성자 포획 반응하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자 및 이의 제조 방법에 따르면, 본 발명에 따라 용이한 공정으로 3 nm 미만의 크기를 갖는 초미세 가돌리늄 산화물 나노입자를 제공할 수 있고, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 표면에 친수성 고분자가 코팅되어 있어 무독성이고 높은 안정성을 나타낼 수 있다. 이에, 작은 크기 및 안정성에 기인하여 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 정맥 투여 가능하고 모세혈관을 통해 자유롭게 순환 가능하며, 높은 세포 흡수력을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 나노입자는 중성자 빔 조사 시, 중성자 포획 반응할 수 있어, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자를 인체에 무해한 무독성의 생체적합 중성자 포획치료용 나노입자로 이용할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 가돌리늄 산화물 나노입자는 MRI 하에서 조영 증강 특성을 갖고, 특히, 표면에 배위 결합된 친수성 고분자의 적어도 일부가 프로브와 결합되어 있어, 특정 조건에서 검출 가능할 수 있다. 때문에, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 T1 MRI 조영제나 형광 검출용 프로브로서 이용 가능하고, 이러한 특성들에 기인하여 본 발명의 나노입자를 진단 및 치료가 동시에 가능한 진단치료제(theragnostic agent)로서 이용할 수 있고, 특히, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 종양 세포를 진단 및 치료하는 종양 세포 진단치료제로서 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 생성된 Rho-NH2 및 Rho-PAA의 합성 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 크기를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 XRD 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 FT-IR 흡수 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 TGA 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 세포 독성을 설명하기 위한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 이완도 및 맵 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 In vivo T1 MR 이미지를 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자를 이용한 GdNCT를 설명하기 위한 도면이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따른 GdNCT 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 GdNCT 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 13a 및 도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 pH에 따른 형광 강도를 설명하기 위한 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자로 처리된 종양 세포 및 정상 세포에서 형광 현미경 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자의 제조방법은 먼저, 친수성 고분자 및 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기를 갖는 프로브(probe)를 포함하는 제1 용액과 가돌리늄 수화물을 포함하는 제2 용액을 혼합하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 제1 용액은 상기 친수성 고분자를 포함하는 친수성 고분자 용액과 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기를 갖는 프로브를 포함하는 프로브 용액을 혼합하여 준비할 수 있다. 상기 친수성 고분자 용액은 유기 용매 중 친수성 고분자 용해된 용액을 의미할 수 있고, 상기 프로브 용액 또한 유기 용매 중 프로브가 용해된 용액을 의미할 수 있다. 이때, 예를 들어, 상기 유기 용매는 테트라하이드로퓨란(THF)일 수 있다. 이때, 일례로, 상기 친수성 고분자 용액과 상기 프로브 용액은 5:1의 몰비(mole ratio)로 혼합하는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우, 상기 제1 용액은 친수성 고분자 및 프로브와 결합된 친수성 고분자의 몰비가 4:1인 용액일 수 있다.
친수성 고분자 용액과 프로브 용액을 혼합하면, 상기 프로브의 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기와 친수성 고분자와 반응하여, 친수성 고분자의 적어도 일부가 프로브와 결합함으로써 친수성 고분자의 폴리머 백본의 적어도 일부에 프로브가 컨주게이션(conjugation)된다. 이때, 일례로, 친수성 고분자가 복수의 카르복시기를 포함하고 프로브의 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기가 아민기인 경우, 상기 프로브와 상기 친수성 고분자는 아마이드(amide) 결합할 수 있다.
본 발명의 친수성 고분자는 생체적합한 수 친화적인 고분자로서, 하이드록시기(-OH), 카르복시기(-COOH) 등과 같은 친수성 기능기를 다수 포함하는 고분자일 수 있다. 일례로, 상기 친수성 고분자는 폴리아크릴산(polyacrylic acid)일 수 있다. 폴리아크릴산은 폴리머 당 다수의 카르복시기(모노머 단위 당 1개의 카르복시기를 포함)를 갖는 우수한 표면 코팅 생체적합성 아크릴산에스테르의 중합체이다. 일례로, 본 발명의 친수성 고분자가 폴리아크릴산인 경우, 본 발명의 나노입자는 체내에서 독성 없이 생체 적합하고 우수한 수분산성을 가질 수 있다. 이에 대한 보다 구체적인 설명은 하기에서 본 발명의 나노입자를 설명하면서 후술하도록 한다.
프로브는 특정물질, 부위, 상태 등을 특이적으로 검출하는 물질을 총칭으로, 일례로, 본 발명의 프로브는 특정물질, 부위, 상태 등을 형광 검출 가능한 프로브일 수 있다. 이때, 예를 들어, 형광 검출 가능한 프로브로서 로다민(Rhodamine)계 화합물을 이용할 수 있다. 로다민은 염기성 염료의 하나인 로다민 B 및 그 유도체인 염료의 총칭으로, 푸른 형광이 나는 노란빛을 띤 붉은색을 특징으로 하는 염료이다. 로다민계 화합물은 산성 조건에서는 레드 색, 염기성 조건에서는 무색의 pH에 따라 다른 색을 갖는데, 일례로, 본 발명의 프로브가 로다민계 화합물인 경우, 이러한 특성에 기인하여, 본 발명의 나노입자는 pH에 따라 특정 파장 범위에서 형광 세기가 변화할 수 있다. 즉, 본 발명의 나노입자는 pH-민감성 형광 검출에 이용 가능할 수 있다. 일례로, 상기 특정 파장 범위는 550 nm 내지 570 nm일 수 있다. 이에 대한 보다 구체적인 설명은 하기에서 본 발명의 나노입자를 설명하면서 후술하도록 한다.
본 발명의 프로브는 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기를 갖고 있어서, 상기에서 설명한 바와 같이 상기 친수성 고분자와 결합할 수 있는데, 이때, 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기는 예를 들어 아민기(-NH2)일 수 있다. 예를 들어, 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기가 아민기이고, 상기 친수성 고분자가 폴리아크릴산인 경우, 상기 프로브는 상기 친수성 고분자와 아마이드 결합을 통해 결합될 수 있다.
일례로, 본 발명의 프로브가 로다민계 화합물인 경우, 제1 용액을 준비하기 이전에, 로다민계 화합물에 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
제2 용액은 용매 중 가돌리늄 수화물이 용해된 용액으로, 본 발명의 가돌리늄 수화물은 예를 들어, 염화가돌리늄 수화물(GdCl3·xH2O)일 수 있다. 이때, 트리에틸렌글리콜(TEG)과 같은 용매일 수 있다. 상기에서는 본 발명의 가돌리늄 수화물 및 용매의 특정 예를 들어 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 각각 염화가돌리늄 수화물 및 트리에틸렌글리콜과 같은 특성을 갖는 가돌리늄 수화물이나 용매면 가능할 수 있다.
이어서, 제1 용액 및 제2 용액을 혼합한 용액에 염기성 용액을 첨가하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 염기성 용액은 예를 들어, 수산화나트륨(NaOH) 용액일 수 있고 이때 용매를 일례로 트리에틸렌글리콜일 수 있다.
상기 친수성 고분자 및 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기를 갖는 프로브를 포함하는 제1 용액과 가돌리늄 수화물을 포함하는 제2 용액을 혼합한 혼합 용액에 염기성 용액을 첨가하면, 가돌리늄 산화물 나노입자가 형성되는데, 이때, 상기 가돌리늄 산화물 나노입자의 표면에는 적어도 일부가 프로브와 결합된 친수성 고분자가 존재한다. 즉, 본 발명에 따른 가돌리늄 산화물 나노입자는 상기 나노입자의 가돌리듐과 배위 결합하여 상기 나노입자의 적어도 일부분을 커버하도록 배치된 친수성 고분자를 다수 포함하고, 이때, 상기에서 설명한 바와 같이, 상기 친수성 고분자에는 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기를 통해 프로브가 결합되어 있다.
보다 구체적인 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자의 구조를 친수성 고분자가 폴리아크릴산(PAA)이고 상기 친수성 고분자와 결합 가능한 작용기를 갖는 프로브가 아민기 도입된 로다민(Rho)인 구체적인 실시예를 도시하고 있는 도 1을 참조하여 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자를 설명하기 위한 도면이다.
도 1의 (a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 가돌리늄 산화물 나노입자의 구조를 설명하기 위한 도면이고, (b)는 본 발명의 일 실시예에 따른 가돌리늄 산화물 나노입자의 특성을 설명하기 위한 도면이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 가돌리늄 산화물 입자 코어(도 1의 (a)에서 Gd2O3), 상기 가돌리늄 산화물 입자 코어 표면에 배위 결합된 친수성 고분자(도 1의 (a)에서 PAA) 및 상기 친수성 고분자의 적어도 일부에 결합된 프로브(도 1의 (a)의 Rho)을 포함한다. 이때, 프로브와 친수성 고분자는 친수성 고분자의 작용기(도 1에서는 카르복시기)와 프보브의 작용기(도 1에서는 아민기) 사이의 결합을 통해 컨주게이션된다.
즉, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 가돌리늄 산화물 나노입자(코어) 표면에 코팅된 것과 같이 친수성 고분자가 배위 결합된 구조를 갖고, 때문에, 일반적으로 독성을 나타내는 가돌리늄 산화물을 포함함에도 독성을 나타내지 않아 인체에 무해하다. 또한, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 친수성인 친수성 고분자와 배위 결합되어 있기 때문에 수중에서 높은 안정성을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따르면, 혼합 용액에 염기성 용액을 첨가하여, 가돌리늄 산화물 나노입자를 형성하는 동시에 나노입자 표면에 적어도 일부가 프로브와 결합된 친수성 고분자 코팅층이 형성되는데, 이때, 가돌리늄 산화물 나노입자의 직경은 3 nm 미만일 수 있다.
즉, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 3 nm 미만의 직경을 갖고, 이에 기인하여 매우 높은 표면적을 나타낸다. 또한, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 매우 작은 크기를 갖기 때문에, 모세혈관을 통해 혈액 내에서 자유 유영 가능하고 정맥으로 투여 가능하며, 특히, 정맥 투여 후 신장으로 배출될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 중성자 빔 조사 시, 중성자 포획 반응할 수 있다. 중성자 포획 반응은 중성자에 의해 야기되는 핵반응 과정의 일종으로 원자핵이 중성자를 1개 핵 내로 거두어들이는 현상을 말한다. 이 경우 γ선이 방출되는 것이 보통인데 이 핵반응을 중성자 포획 반응 또는 n, γ반응이라고 한다. 본 발명의 중성자 포획치료용 나노입자는 중성자 빔에 의해 중성자를 흡수하여 핵 반응의 결과로 IC(Internal conversion) 및 ACK(Auger-Coster-Kronig) 전자를 생성하는데, 이러한 전자는 세포 내 DNA를 파괴할 수 있다. 즉, 세포를 파괴시킬 수 있다.
따라서, 이러한 특성들 기인하여 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자를 중성자 포획치료(neutron capture therapy, NCT)에 이용할 수 있다. 중성자 포획치료는 이러한 중성자 포획 반응을 이용하는 치료법으로서, 본 발명의 나노입자는 상기에서 설명한 바와 같이, 중성자 조사 시 핵반응에 의해 세포를 사멸시킬 수 있으므로, 중성자 포획치료에 이용 가능하며, 특히, 본 발명의 나노입자는 상기 설명한 바와 같이 친수성 고분자로부터 기인하는 친수성 및 안정성, 작은 크기 및 이에 기인하는 높은 표면적에 기인하여, 정맥 투여로 체내 주입 가능하고 우수한 세포 내 흡수율을 나타낼 수 있으며, 중성자 조사 시 우수한 중성자 포획치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 신장 배출능(renal excretion ability)을 갖기 때문에, 축적되지 않고 배출 가능하여 축적에 의한 부작용이나 악영향을 방지할 수 있다. 일례로, 본 발명의 나노입자는 종양 세포를 중성자 포획 치료하는 종양 세포 중성자 포획치료용 나노입자일 수 있고, 특히, 기존의 수술, 항암, 방사선 요법으로 치료가 힘든 뇌암 등의 치료에 효과적일 수 있다. 이때, 본 발명의 나노입자는 종양 표적 물질을 더 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 우수한 자기이완 특성, 즉, 우수한 자기이완율을 갖는다. 자기이완율(relxaxivity)은 자기공명영상(magnetic resonance image, MRI)에서 조영제가 갖는 조영 증강 정도를 수치화한 것이다. MRI는 자기장 안에서 수소 원자의 스핀이 이완되는 현상을 이용하여, 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보 영상을 얻는 방법으로, MRI 측정 시 외부 물질을 주입하여 영상 대조도를 증가시키는데, 이때 사용되는 물질을 조영제(contrast agent)이다. 조직 내 물분자 핵스핀이 평형 상태로 돌아가는 이완 작용이 조직별로 차이가 있어 조직들 사이의 대조도가 나타나는데, 조영제는 이러한 이완작용에 영향을 미쳐 조직간 이완도 차이를 벌리고 MRI 시그널의 변화를 유발하여 조직간의 대조를 보다 선명하게 하는 역할을 한다. 본 발명의 나노입자는 우수한 자기이완율을 가져 인체 내에서 물에서 수소 원자 이완율을 증가시킴으로써 영상 대조를 향상시킬 수 있다. 때문에, 본 발명의 나노입자를 MRI용 조영제로서 이용할 수도 있다. 이때, 본 발명의 나노입자는 MRI 상에서 목적하는 신체 부위의 영상 신호를 상대적으로 증가시키는 강력한 양성 조영제, T1 조영제일 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자가 pH-민감성 형광 검출 가능한 프로브를 포함하는 경우, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 종양 세포 형광 검출 가능하다. 구체적으로, 본 발명의 프로브가 pH에 따라 형광 강도가 변화하는 pH-민감성 프로브인 경우, 본 발명의 나노입자는 가돌리늄 산화물 나노입자 표면에 배위 결합된 친수성 고분자 리간드의 적어도 일부분이 프로브와 결합되어 있어, pH에 따라 다른 형광 강도를 나타낼 수 있다. 일례로, 상기 pH-민감성 프로브가 로다민계 화합물인 경우, 로다민계 화합물은 산성일수록 적색을 나타내고 염기성일수록 무색을 나타내는데, 일반적으로 정상 세포가 거의 중성의 pH를 갖는 것과 달리, 종양 세포는 정상 세포 보다 산성의 pH를 갖는다. 때문에, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 정상 세포에서 보다 종양 세포에서 높은 적색 형광 강도를 나타낼 수 있고, 이에 기인하여 종양 세포를 형광 검출할 수 있다.
즉, 다시 말하면, 본 발명의 나노입자는 중성자 포획치료제로서 우수한 효과를 가지면서, T1 MRI 조영제나 형광 검출 프로브로 이용 가능하기 때문에, 진단 및 치료가 동시에 가능한 다기능성 진단치료제, 즉, 테라그노스틱제(theragnostic agent)로서 적용할 수 있다. 이때, 특히, 본 발명의 나노입자를 종양 세포를 진단 및 치료하는, 종양 세포 진단치료제로서 사용할 수 있다. 이때, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자는 종양 세포 타겟팅 물질을 더 포함할 수도 있다.
이하에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자 및 이의 제조 방법에 대해 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 나노입자의 제조
친수성 고분자로서 폴리아크릴산, 프로브로서 로다민 B를 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따라 가돌리늄 산화물 나노입자를 제조하였고, 본 발명의 일 실시예에 따른 가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 방법은 도 2와 같이 나타낼 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 2를 참조하여 하기에서 보다 구체적으로 설명될 본 발명에 따른 가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 공정에서, 염화가돌리늄 수화물(GdCl3·xH2O) (99.9%), 폴리아크릴산(polyacrylic acid, PAA) (Mw = ~1800 Da, 분석 표준 등급(analytical standard grade)), 로다민 B(rhodamine B, Rho) (분석 표준 등급), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF) (>99.9%), 트리에틸렌 글리콜(triethylene glycol, TEG) (99%), 에틸렌다이아민(ethylenediamine) (>99%), NaOH (>99.9%), 디클로로메탄(dichloromethane) (>99.8%), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC) (>98%), 및 4-(디메틸아미노)피리딘(4-(Dimethylamino)pyridine, 4-DMAP) (>99%)와 같은 화학 물질들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고 구입한 그대로 사용하였다.
(a) Rho-NH 2 의 합성
먼저, 도 2의 (a)에 도시한 바와 같이, 아민기 도입된 로다민 B(Rho-NH2)를 합성하였다. 구체적으로, 5 mmol Rho, 20 mL 에탄올(>99%, Duksan Chemical, South Korea), 및 3 mL 에틸렌다이아민의 혼합물을 반응 혼합물이 레드 색상을 나타내지 않을 때까지 하룻밤동안 환류하였다(reflux). 이어서, 에탄올을 증발시키고 혼합물을 3차 증류수(triple distilled water)로 세척한 다음, CH2Cl2로 추출하고 Na2SO4로 건조하였다. 그 다음, 유기 상을 실리카겔 컬럼(column)을 사용해(용리제(eluent)로서 DCM : CH3OH = 95 : 5) 농축 및 정제하여, 밝은-옐로우 고체 형태인 Rho-NH2를 수득하였다(1.86 g, 76.8% 수율). Rho-NH2의 형성은 NMR 및 FT-IR 흡수 스펙트럼을 이용하여 확인하였다 (각각, 도 3a의 (a) 및 (b)).
(b) Rho-PAA의 합성
이어서, 도 2의 (b)에 도시한 바와 같이, 로다민 결합 폴리아크릴산(Rho-PAA)을 합성하였다. 0.5 mmol PAA, 0.25 mmol DCC, 및 4-DMAP의 촉매량을 10 mL 드라이 THF(dry THF)에 용해하였다. 그 다음, 드라이 THF에 용해한 0.1 mmol Rho-NH2를 천천히 PAA 용액에 첨가하였고, 2일 동안 실온에서 자석으로 추가 교반하였다. 그 후 THF는 증발시켜 제거하였고 생성물은 디클로로메탄으로 세척한 후 1일 동안 3차 증류수에 대해 투석하여 (MWCO = 1000 Da) 정제하였다. Rho-PAA의 형성은 FT-IR 흡수 스펙트럼과 pH 의존 용액 및 형광 용액 컬러로 확인하였다 (각각 도 3b의 (a) 및 (b)).
도 3b의 (a)를 참조하면, Rho-PAA 합성에 사용된 PAA는 폴리머 당 ~25개의 -COOH 그룹을 갖는다. 이때, 공정 중 사용된 PAA:Rho-NH2 = 5:1의 몰비에 근거한 계산치는 5개의 PAA 분자중 하나가 Rho 하나와 컨쥬게이션되고 다른 것들은 자유 PAA인 것을 확인할 수 있다. 즉, 최종 생성물은 4:1의 몰비의 PAA 및 Rho-PAA 혼합물(PAA + Rho-PAA)임을 확인할 수 있고, 이는 PAA 피크로 압도된 생성물의 FT-IR 흡수 스펙트럼에 의해 확인할 수 있다.
또한, 도 3b의 (b)를 참조하면, 생성물(PAA 및 Rho-PAA 혼합물)은 레드(red) 컬러를 갖는 고체로서 수득되었고 이는 생성물 중 Rho-PAA에 기인한다. 뿐만 아니라, 생성물의 수용액은 레드로 염색되고(도 3b의 (b)의 1-I) 수은 램프를 사용하여 365 nm 조사 후 레드 영역에서 강한 형광(도 3b의 (b)의 2-I)을 나타내었으며, 염기성 pH 값에서는 자유 Rho와 같이 무색 및 무형광을 갖는 것을 확인할 수 있다(각각 도 3b의 (b)의 1-II, 2-II). 즉, 용액 컬러가 자유 Rho와 유사함을 확인할 수 있다.
(c) 나노입자의 합성
그 다음, 도 2의 (c)에 도시한 바와 같이, 본 발명의 가돌리늄 산화물 나노입자를 합성하였다. 구체적으로, 삼목 둥근 바닥 플라스크에 상기에서 제조한 PAA 및 Rho-PAA 혼합물 0.25 mmol 및 2 mmol GdCl3·xH2O의 혼합물을 대기조건 하에서 60℃로 2시간 동안 TEG 20 mL 중에서 투명 레드 전구체 용액이 될 때까지 자석 교반하였다. 이어서, 다른 비커에 10 mL TEG 중 10 mmol NaOH를 준비하고 이를 전구체 용액에 천천히 첨가하였다. NaOH 첨가 후 pH의 9-11로의 증가로 인해 혼합 용액은 레드 컬러를 상실했다. 그 다음, 용액을 12시간 동안 110℃로 자석 교반하였고 실온으로 냉각시켰다. 이어서, 용액을 500 mL 비커로 옮기고 400 mL 에탄올을 첨가한 후 용액을 실온에서 10분 동안 자석 교반하였고 입자가 비커의 바닥에 가라앉을 때까지 3일 동안 냉장고에서 보관하였다. 그 다음, 상등액을 옮겨 붓고(decanted) 남은 용액을 400 mL 에탄올로 채웠다. 이 공정을 5회 반복하였다. 이어서, 생성물 용액은 증발에 의해 에탄올을 제거하도록 적절한 양(< 10mL)의 3차 증류수로 5회 세척하였다. 그 다음, 다양한 특성 평가를 위해, 생성물의 일부는 공기 중에서 건조하여 본 발명에 따른 가돌리늄 산화물 나노입자를 분말로 형성하였고(이하, 나노입자), 남은 생성물은 3차 증류수로 희석하여 본 발명에 따른 가돌리늄 산화물 나노입자를 콜로이드 현탁액(~30 mM Gd)(이하, 나노입자 콜로이드 현탁액)으로 제조하였다.
입자 크기
먼저, 본 발명에 따른 나노입자의 입자 크기를 확인하였다. 이를 위해, 3차 증류수에 희석된 나노입자 콜로이드 현탁액(이하, 샘플) 한 방울을 200-메쉬 구리 격자(200-mesh copper grid) (PELCO no. 160, Ted Pella, Inc., Redding, CA, USA)에 지지된 탄소 필름에 떨어트리고 마이크로피펫 (2-20 mL, Eppendorf, Hamburg, Germany)을 사용하여 필터 페이퍼에 놓았다. 샘플이 있는 구리 격자는 실온에서 1시간 동안 공기 건조시켰다. 그 다음, 샘플이 있는 구리 격자는 측정을 위해 HRTEM (Titan G2 ChemiSTEM CS Probe, FEI, Hillsboro, OR, USA) 내부에 마운트시키고, 200 kV의 가속 전압에서 작동시켰다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 크기를 설명하기 위한 도면이다.
도 4의 (a)에서 (a-1) 내지 (a-VI)는 각각 다른 배율에서의 HRTEM 이미지를 나타내고, 화살표는 본 발명에 따른 나노입자를 나타내며, (a-III)에서 원 영역은 (a-VI)의 원 영역과 동일한 영역을 나타낸다. 도 4의 (b)는 입자 직경 분포를 나타내는 로그-정규 함수 그래프이다.
도 4를 참조하면, 도 4 (a)의 (a-I) 내지 (a-VI)의 HRTEM 이미지에서 도시한 바와 같이, 본 발명에 따른 나노입자 직경은 1.0에서 2.5 nm의 범위를 나타내고, 평균 직경(d avg) 1.5 nm임을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 나노입자가 매우 작은 초미세 나노크기의 입자임을 확인할 수 있다.
결정 구조
본 발명에 따른 나노입자 분말 샘플의 열중량 분석(Thermogravimetric analysis, TGA) 전 및 후의 결정 구조를 확인하였다. TGA는 TGA 장비(SDT-Q 600, TA Instruments, New Castle, DE, USA)를 이용하여 수행하였고, 결정 구조는 여과되지 않은(unfiltered) CuKα (λ = 1.54184 Å) 방사선을 사용하는 분말 XRD 분광계(X-PERT PRO MRD, Philips, Eindhoven, The Netherlands)를 이용하여 측정하였으며, 2θ에서 스캔 단계 및 스캔 범위는 각각 0.033° 및 15-100°였다. 그 결과를 도 5 및 표 1에 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 XRD 결과를 설명하기 위한 도면으로, 도 5에서 'As-prepared'는 제조한 나노입자 분말 샘플(TGA 전)의 XRD 패턴을 나타내고, 'After TGA'는 TGA 처리한 나노입자 분말 샘플의 XRD 패턴을 나타낸다.
표 1은 TGA-처리된 본 발명의 나노입자의 XRD 패턴에서 나타난 모든 피크에 할당된 (hkl) 밀러지수를 나타낸다.
(hkl) 2θ (hkl) 2θ (hkl) 2θ
211 20.120 444 59.164 833 80.341
222 28.569 543 60.554 842 81.530
400 33.141 046 61.852 655 82.718
411 35.171 633 63.196 158 85.004
332 38.993 642 64.431 763 87.382
134 42.577 156 68.308 844 88.580
125 45.961 800 69.496 853 89.777
440 47.533 811 70.749 860 90.870
433 49.124 820 71.984 268 93.206
611 52.105 653 73.172 1022 95.530
026 53.696 822 74.379 765 96.630
145 54.995 831 75.568 871 99.010
622 56.384 662 76.760 - -
631 57.774 840 79.134 - -
도 5와 표 1을 함께 참조하면, TGA 전 및 후 XRD 패턴은 본 발명에 따른 나노입자 분말 샘플이 초미세 입자 직경으로 인해 비정질이지만, TGA-처리된 분말 샘플은 입자 성장으로 인해 입방 구조(cubic structure)를 나타내고, a = 10.82 Å의 셀 상수(constant)를 갖는 것을 확인할 수 있다(JCPDS 카드 번호 43-1014와 일치).
FT-IR 스펙트럼
또한, 본 발명의 나노입자의 표면 코팅을 확인하기 위해, FT-IR 흡수 스펙트럼을 확인하였다. FT-IR 흡수 스펙트럼은 FT-IR 흡수 분광계(Galaxy 7020A, Mattson Instruments, Inc., Madison, WI, USA)를 이용하여 400-4000 cm-1의 범위에서 기록하였고, 측정을 위해, 본 발명에 따른 나노입자 분말 샘플을 핫 플레이트 상에서 40℃로 한 주 동안 건조하여 수분을 제거하였다. 건조된 분말 샘플의 펠렛(pellets)은 KBr에서 준비하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 FT-IR 흡수 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 6을 참조하면, 본 발명의 나노입자 분말 샘플로부터 2920 cm-1에서 C-H, 1400 cm-1에서 COO-, 그리고 1065 cm-1에서 C-O의 특징적인 대칭 신장(symmetric stretches), 및 1550 cm-1에서 COO-의 비대칭 신장을 확인할 수 있고, 이는 나노입자 표면에 PAA 및 Rho-PAA 혼합물이 성공적으로 표면 코팅되었음을 나타낸다. 이때, 1704 cm-1에서 PAA 및 Rho-PAA의 C=O 대칭 신장은 샘플에서 COO-의 대칭 및 비대칭 신장으로 분열되었고 적색-편이(red-shifted)되었음을 나타내고, 이는 나노입자 표면에서 Gd3+와 PAA 및 Rho-PAA의 COO- 사이의 전기적 결합에 의해 야기된다(표면 코팅 구조에 대한 도 1의 (a) 참조). 이러한 유형의 결합은 COO-의 하드산(hard acid)-Gd3+의 하드염기(hard base)형 상호작용에 해당하며, 분열 및 적색-편이는 다양한 -COOH 그룹의 리간드로 코팅된 금속 산화물 나노입자에서 나타나는 결과로, 즉, 본 발명에 따라 PAA 및 Rho-PAA 리간드로 코팅된 가돌리늄 나노입자를 제조하였음을 확인할 수 있다.
열중량 분석(TGA)
또한, 나노입자 표면에서 PAA 및 Rho-PAA 혼합물의 표면 코팅량을 확인하기 위해, TGA 장비(SDT-Q 600, TA Instruments, New Castle, DE, USA)를 이용하여 TGA 곡선을 기록하였다. 유기 화합물들이 400℃ 이하에서 번아웃(burn out)되기 때문에, TGA 곡선은 공기 플로우(flow) 하에서 실온 및 900℃ 사이에서 스캔하였다. 표면 코팅의 양은 물 및 공기 탈착(desorption) 때문에 실온 내지 105℃ 사이의 초기 질량 강하(mass drop)의 공제(subtraction) 후 TGA 곡선의 질량 강하로부터 추정하였다. 그 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 TGA 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 7을 참조하면, 실온에서 ~105℃ 사이의 9.4%의 초기 질량 강하는 물 및 공기 탈착 때문이고, 이후 64.9%의 질량 강하는 공기 중 PAA 및 Rho-PAA의 연소(burning) 때문이며, 25.7%의 잔여 질량은 Gd2O3 에 기인하고, 이는 도 S6의 XRD 패턴으로부터 확인된다. 한편, 나노입자 단위 표면적 당 코팅된 리간드의 평균수에 대응하는 그래프팅(grafting) 밀도는 Gd2O3의 벌크 밀도(7.41 g cm-3), 상기 추정된 64.9%의 표면 코팅량, 그리고 HRTEM 이미지로 확인된 1.5 nm의 d avg를 이용하여 1.5 nm-2인 것을 확인할 수 있고, 그래프팅 밀도를 나노입자 표면적(πd avg 2)와 곱하면 나노입자 당 코팅된 리간드의 평균수는 ~10인 것으로 추정된다. 즉, 이는 두 개의 Rho-PAA 및 여덟 개의 PAA가 각 나노입자에 평균적으로 코팅됨을 의미한다.
Gd 농도
본 발명에서 Gd 농도는 3차 증류수 중 현탁된 나노입자 콜로이드 현탁액으로부터 ICPAES (IRIS/AP, Thermo Jarrell Ash Co., Franklin, MA, USA)를 사용하여 확인하였고, 이때, 콜로이드 현탁액은 측정 전 산으로 전처리하여 용액에서 나노입자 콜로이드를 완전히 용해하였다.
In vitro 세포독성
세 개의 세포주(cell lines) DU145, NCTC1469 및 U87MG를 대상으로 나노입자 콜로이드 현탁액의 In vitro 세포독성을 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 측정하였고, ATP(아데노신삼인산, adenosine triphosphate)는 Victor 3 luminometer (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 정량화하였다. 구체적으로, DU145, NCTC1469, 및 U87MG 세포주 각각을 별도의 24-웰 세포 배양 플레이트(24-well cell culture plate)에 심고(seed) 24시간 동안 배양하였다(5 × 104 세포 밀도, 웰 당 500 mL 세포, 5% CO2, 및 37℃). 또한, 소독된(sterile) PBS 용액으로 농축된 나노입자 콜로이드 현탁액을 현탁액 중 최종 Gd 농도가 10, 50, 100, 200, 및 500 μM Gd이 되도록 희석하여 다섯 개의 희석 용액을 준비하고, 각각의 테스트 세포들을 2 mL의 희석된 샘플 용액 각각으로 처리하였다. 그 다음, 처리된 세포들을 48시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 평균 세포 생존력을 얻기 위해 두 번 측정하였고, 그 다음 비처리된 대조군 세포들 (0.0 μM Gd)에 대하여 정규화(normalized)하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 세포 독성을 설명하기 위한 도면이다.
도 8의 (a)는 NCTC1469 및 U87MG에서 비코팅된 가돌리늄 산화물(Gd2O3) 입자의 세포 생존력을 나타내는 도면이고, (b)는 DU145, NCTC1469 및 U87MG에서 본 발명에 따른 나노입자(코팅 가돌리늄 산화물 나노입자)의 세포 생존력을 나타내는 도면이다.
도 8을 참조하면, 먼저, 가돌리늄은 독성인 것으로 잘 알려져 있는 것처럼, 비코팅된 Gd2O3 입자는 (Sigma-Aldrich, USA로부터 구매) NCTC149 및 U87MG 종양 세포주 모두에서 높은 독성을 나타내는 것으로 확인할 수 있다(도 8의 (a) 참조). 만약 자유 가돌리늄 이온(Gd3+)이 조직에 증착된다면 가돌리늄 MRI 조영제는 신성 전신 섬유화증(nephrogenic systemic fibrosis, NSF)를 유발할 수 있어, 코팅층이 없는 Gd2O3 나노입자 자체는 생의학 어플리케이션에 사용될 수 있다는 한계가 있다. 그러나, 본 발명에 따른 나노입자는 상기에서 확인한 바와 같이 Gd2O3 나노입자 표면이 친수성 및 생체적합성 PAA로 코팅되어 있고 이중 일부가 Rho로 기능화되어 있어, 도 8b에서 도시한 바와 같이, 500 μM Gd의 가돌리늄 농도에서도 DU145 세포주에서 ~93%, NCTC1469 세포주에서 ~99%, 그리고 U87MG 세포주에서 ~80%의 높은 세포 생존력을 나타냄을 확인할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 나노입자가 우수한 생체적합성을 갖는 것을 확인할 수 있다.
이완도 및 맵 이미지
T 1 및 T 2 이완 시간과 R1 및 R2 맵 이미지를 니 코일(knee coil) (MSK-Extreme, ONI Medical Systems, Inc., Wilmington, MA, USA)이 구비된 1.5 T MRI 스캐너 (GE 1.5 T Signa Advantage, GE Medical Systems, Chicago, IL, USA)를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 농축 나노입자 콜로이드 현탁액을 3차 증류수로 희석하여 다섯 개의 수용액 희석 샘플 용액들(각각 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 및 0.0625 mM Gd)을 준비하였다. 그 다음 희석 용액들 및 3차 증류수를 사용하여 T 1 및 T 2 이완 시간과 R1 및 R2 맵 이미지를 측정하였다. 이어서, 샘플 용액의 r 1 및 r 2 수 양성자 이완도는 각각 Gd 농도 대 1/T 1 및 1/T 2 의 플롯(plots)의 기울기로부터 추정하였다. T 1 이완 시간 측정은 역전회복 방법(inversion recovery method)을 이용하여 수행하였고, 이 방법에서, TI는 1.5 T에서 다양했고 50 내지 1750 ms의 범위에서 35개의 다양한 TI 값을 획득하였다. 그 다음, T 1 이완 시간을 다양한 TI 값들에서 측정된 신호 강도에 맞춘 비선형 최소제곱(least square)으로부터 얻었다. T 2 이완 시간을 측정하기 위해서, Carr-Purcell-Meiboom-Gill 펄스 시퀀스(Carr-Purcell-Meiboom-Gill pulse sequence)를 다중 스핀-에코(spin-echo) 측정에 사용하였다. 총 34개의 이미지들을 10 내지 1900 ms의 범위에서 34개의 다른 TE 값들로부터 획득하였다. T 2 이완 시간은 다양한 TE 값들에서 다중 스핀-에코 측정에 대한 평균 픽셀 값들에 적합한 비선형 최소제곱으로부터 얻었다. 그 결과를 도 9에 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 이완도 및 맵 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 9의 (a)는 Gd 농도에 따른 1/T 1 및 1/T 2 의 플롯(plots)을 나타내고, 기울기는 각각 r 1 및 r 2 값에 대응한다. 도 9의 (b)는 나노입자 콜로이드 현탁액의 용량 의존적 R1 및 R2 맵 이미지를 나타낸다.
먼저, 도 9의 (a)를 참조하면, 역전 시간(inversion time)에 기반하여 얻어진 T1 이완시간에 의존하는 자기이완도(r1)와, 에코 시간(echo time)에 기반하여 얻어진 T2 이완시간에 의존하는 자기이완도(r2)가 각각 1/T 1 및 1/T 2 플롯 대 Gd 농도로부터, 22.6 및 29.5 s-1mM-1 (r 2/r 1 = 1.3)인 것을 확인할 수 있다. 특히, r 1 값은 상용 Gd-킬레이트 보다 6배 더 높은 값으로, 이러한 더 높은 r 1 값 및 1에 가까운 r 2/r 1 비(=1.3)는 본 발명의 나노입자가 강력한 T1 MRI 조영제로 이용 가능함을 의미하고, 이와 같은 높은 r 1 값은 본 발명에 따른 나노입자의 초미세 입자 크기 및 PAA 친수성 표면 코팅에 기인할 수 있다.
또한, 도 9의 (b)를 참조하면, 도 9의 (a)를 참조하여 설명한 바와 같이, 명확히 Gd 농도가 증가함에 따라 용량-의존적 대조 향상을 나타내는 in vitro R1 및 R2 맵 이미지로부터 본 발명의 나노입자가 강력한 T1 MRI 조영제로서 이용 가능함을 확인할 수 있다.
In vivo T 1 MR 이미지 측정
상기 이완도 측정에서 사용된 것과 동일한 MRI 스캐너를 사용하여 In vivo T1 MR 이미지를 확인하였다. 동물 실험은 한국 지침에 따라 수행하였고 경북대학교 동물 실험 위원회에 의해 승인되었다. In vivo T1 MR 이미지를 확인하기 위해, ICR (Institute of Cancer Research, USA) 마우스 (~30 g)를 산소 중 1.5% 이소플루레인(isoflurane)으로 마취시키고, 나노입자 콜로이드 현탁액을 마우스 꼬리 정맥에 투여하기 전 및 투여한 후에 In vivo T1 MR 이미지를 확인하였다. 투여량은 kg 당 ~0.1 mmol Gd였고, 측정 중, 마우스의 온도는 따뜻한 워터 블랭킷(warm water blanket)을 사용하여 ~37℃로 유지하였다. 측정 후, 마취로부터 회복된 마우스는 음식과 물에 자유롭게 접근 가능한 우리에 두었다. 측정에 사용된 파라미터들은 하기와 같다: 외부 MR 장(external MR field) = 1.5 T; 온도 = 37℃; NEX = 4; FOV = 6 mm; 상(phase) FOV = 0.5; 매트릭스 크기(matrix size) = 256 × 192; 슬라이스 두께 = 1 mm; 공간 갭(spacing gap) = 0.5 mm (관 방향(coronal)) 및 2.0 mm (축 방향(axial)); 픽셀 밴드폭 = 15.63 Hz; TR = 500 ms; 및 TE = 13 ms. 그 결과를 도 10에 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 In vivo T1 MR 이미지를 나타내는 도면이다.
도 10의 (a)는 실험용 쥐에 정맥 투여 전, 35분 후 및 4시간 후의 1.5 T에서 in vivo T1 MR 이미지를 나타내고, (b)는 심장(hear), 간(liver), 신장(kidneys) 및 방광(bladder)에서의 SNR을 나타내며, 도 10에서 H는 심장, L은 간, K는 신장 및 B는 방광을 나타낸다.
도 10을 참조하면, 시간에 따라 1.5 T에서 기록한 T1 MRI 이미지로부터, 실험용 쥐에 본 발명의 나노입자 콜로이드 현탁액을 정맥 투여 후 양성 대조 향상이 명확히 간, 심장, 신장 및 방광에서 나타남을 확인할 수 있다(도 10의 (a) 참조). 또한, 도 10의 (b)에 도시한 바와 같이, 간, 심장 및 신장에서 SNR(신호 대 잡음비(Signal to noise ratio))은 초기에 증가되었고 그 다음 시간에 따라 천천히 감소하였으나 방광에서는 4시간까지 증가하였으며, 이는 본 발명의 나노입자의 느린 신장 배출을 의미한다. 본 발명의 나노입자는 초미세 입자 크기에 기인하여 신장 배출되는데, 이때, Rho가 FITC 및 플루오레신과 같은 다른 유기 염료에서와 같이, 비공유결합적으로 알부민(albumin), 피브리노겐(fibrinogen), 및 글로불린(globulins) 혈장 내 단백질과 결합할 수 있고, 그 결과 신장 배출을 늦출 수 있다. 때문에, 표면에 PAA에 컴쥬케이션된 Rho에 의해 본 발명의 나노입자는 느린 신장 배출을 나타낼 수 있다. 실험용 쥐는 in vivo 실험 후 사망하지 않았다. 또한, 도 10의 (b)에서 도시한 바와 같은 SNR 플롯으로부터 그리고 프리-SNR(pre-SNR) 값에 대한 외삽법(extrapolations) 후 기준선 보정과 함께 플롯의 하프 영역을 사용하여, 심장 및 간에서 나노입자 콜로이드의 반감기가 ~155분으로 추정되었다. 즉, 실험용 쥐에서 본 발명의 나노입자의 반감기는 ~155분임을 확인할 수 있다.
즉, 강력한 T1 MRI 조영제로 본 발명의 나노입자의 효과를 확인할 수 있다.
In vitro GdNCT 실험
GdNCT 실험은 한국원자력의학원(Korea Institute of Radiological & Medical Sciences)에 설치된 방사선 조사 시설 및 사이클로트론(MC50, Scanditronix, Sweden)를 이용하여 수행하였다. 이는 열 중성자 빔을 생성하도록 9Be 타겟(직경 = 17 mm)을 사용하여 35 MeV 및 20 μA에서 작동시켰다. GdNCT 실험 절차는 도 11에 제공된다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자를 이용한 GdNCT를 설명하기 위한 도면이다.
도 11을 참조하면, 도 11에 도시한 바와 같이, 본 발명의 나노입자를 이용한 GdNCT 실험은 4 단계; 세포 배양, 본 발명의 나노입자(즉, 샘플) 및 Gadovist로 세포 처리, 열 중성자 빔 조사 및 집락형성 분석(clonogenic assay)으로 구성된다. 구체적으로, 두 개의 6-세포 웰 플레이트(6-cell well plate)를 세포 배양에 사용하였고, 각 플레이트의 세포 웰들은 3개의 그룹으로 나눠 대조군, 샘플 및 Gadovist이 각각의 플레이트에서 1 세포 웰을 사용하도록 하였다. 세포 배양 단계에서, U87MG 종양 세포를 각 플레이트의 3개의 세포 웰들에 심고 24시간 동안 배양하였다(5 × 104 세포 밀도, 웰 당 500 mL 세포, 5% CO2, 및 37℃). 세포 처리 단계에서 미처리(0.0 mM Gd), 샘플 세포는 샘플로 처리(0.5 mM Gd), 그리고 Gadovist 세포는 Gadovist로 처리(0.5 mM Gd)하였다. 처리 및 비처리(즉, 대조군) 세포는 모두 24시간 동안 배양하였고 그 다음 처리 세포는 자유 나노입자 콜로이드 및 Gadovist를 제거하기 위해 PBS 용액으로 3회 세척하였다. 조사 단계에서, 도 11의 우측 세포 웰 플레이트는 열 중성자 빔을 12분 동안 조사하였고, 해당하는 방사선량은 ~6 Gy이며, 좌측 세포 웰 플레이트는 조사하지 않았다. 집락형성 분석 단계에서, 두 개의 6-세포 웰 플레이트들의 각 세포 웰에서 500 및 1000 세포를 페트리 디쉬(직경 = 6 mm)에 옮겼다. 이 2개의 세포 수(500 및 1000)는 세포 생존력의 일관성을 확인하는데 사용하였다. 이 방법으로 총 12 또는 6 세트의 세포 디쉬를 집락형성 분석을 위해 준비하였다(도 11의 하단 참조). 여기서, 각 그룹의 각각의 세트는 2개의 세포 수들에 대한 비조사(0 min) 및 조사(12 min) 세포 디쉬로 구성된다. 6 세트의 세포 디쉬들은 모두 콜로니를 형성하도록 2주 동안 배양하였다. 그 다음, 세포 생존력을 집락형성 분석 포로토콜을 사용하여 분석하였고 세포를 카운팅하여 측정하였다(모든 세포에 대해 세포 배양에서부터 집락형성 분석까지 동일한 시간으로 GdNCT 실험을 수행하였다). 그 결과를 도 12a 및 도 12b에 나타낸다.
먼저, 도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따른 GdNCT 효과를 설명하기 위한 도면으로, 콜로니 형성 2주 후 촬영된 6세트의 세포 디쉬의 사진을 나타낸다.
도 12a에서, 대조군(0.0m MGd), Gadovist(0.5mM Gd) 및 샘플(0.5 mM Gd)에서 0 min 및 12 min은 각각 열 중성자 빔 조사 시간을 나타내고, 이때, 조사량은 각각 0 (즉, 비방사) 및 6 Gy에 해당한다.
아울러, 각 세트에서 조사 세포(도 12a에서 12 min)의 세포 생존력은 대응하는 비조사 세포(도 12a에서 0 min)에 대하여 정규화(normalized)하였고 이를 히스토그램으로 플롯화하였다. 또한, 샘플 및 Gadovist의 것으로부터 대조군 세포 사멸을 삭감하여, 샘플 및 Gadovist의 네트 세포 사멸(net cell deaths)를 추정하고 히스토그램에 플롯화하였다. 그 결과를 도 10에 나타낸다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 GdNCT 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 12b의 (a)는 대조군, Gadovist 및 샘플에 대한 비조사된 세포에 대하여 정규화된 조사된 U87MG 종양 세포의 세포 생존력을 나타내는 히스토그램이고, (b)는 샘플 및 Gadovist로부터 정규화된 대조군 세포 사멸을 삭감하여 얻은 샘플 및 Gadovist의 네트 세포 사멸(net cell deaths)을 나타내는 히스토그램이다.
도 12b을 도 12a와 함께 참조하면, 먼저, 500 및 1000 두 개의 세포 수의 세포 생존력 사이의 일관성이 나타남을 확인할 수 있고, 이에, 도 12b의 (a)에 도시한 바와 같이, 500 및 1000 세포 수의 세포 생존력의 평균(Average)을 비교하였다. 세포 생존력을 비교하면, 본 발명의 나노입자가 Gadovist를 처리한 세포에서 보다 세포 생존력이 감소하였음을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 나노입자에 의해 더 많은 세포가 사멸함을 확인할 수 있다. 그러나, 대조군에서도 세포가 사멸됨을 확인할 수 있고, 이는 고용량의 열 중성자 빔의 조사에 의한 세포 자체의 의한 손상에 기인한다. 이에, 세포 자체의 손상에 의한 영향을 제외하기 위해, 샘플 및 Gadovist의 것으로부터 대조군 세포 사멸을 삭감하여 샘플 및 Gadovist의 세포 생존력을 비교하면(도 12b (b) 도시), 본 발명에 따른 샘플은 28.1%의 평균 네트 세포 사멸을 나타냄을 확인할 수 있고, 이것은 Gadovist 보다 1.75배 더 높다. 종양 세포에서 GdNCT의 효과는 축적된 Gd-농도에 비례하므로, 본 발명의 샘플에서의 더 높은 세포 사멸력은 Gadovist 보다 본 발명에 따른 나노입자가 세포에 더 많이 흡수됨을 의미하며, 이에 따라, 본 발명에 다른 나노입자의 GdNCT 효과가 더 우수함을 확인할 수 있다.
pH-의존 형광 스펙트럼 측정
다양한 pH 값들로 3차 증류수에 현탁된 나노입자 콜로이드 현탁액의 형광 스펙트럼은 형광 분광광도계(Cary Eclipse, Agilent Tech., Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 기록하였다. 먼저, 유리 전극이 구비된 디지털 pH-미터(CyberScan pH 10, Eutech Instrument, Vernon Hills, IL, USA)로 pH 값을 모니터링하면서 1 M HCl이나 1 M NaOH 용액을 소량 첨가하여 pH 4.0, 4.3, 5.2, 6.0, 6.4, 7.0, 7,7의 다양한 pH 값을 갖는 나노입자 콜로이드 현탁액(2 mM Gd)을 준비하였다. 측정을 위해, 각 샘플 용액을 4개의 광학적으로 투명한 측면을 갖는 큐벳(cuvette) (Sigma-Aldrich, 4 mL)에 넣고, 이를 분광계의 다크 챔버(dark chamber)에 설치하였다. λex = 562 nm의 수은 램프를 사용하였다. 그 결과를 도 13a 및 도 13b에 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 pH에 따른 형광 강도를 설명하기 위한 도면이다.
도 13a은 pH 4.0, 4.3, 5.2, 6.0, 6.4, 7.0, 7,7의 다양한 pH 값을 갖는 나노입자 콜로이드 현탁액(2 mM Gd)의 λex = 562 nm 조사 전(a) 및 후(b)를 나타내는 사진이고, 도 13b은 파장에 따른 형광 강도를 나타내는 그래프이다.
도 13b을 도 S7과 함께 참조하면, 본 발명의 나노입자 현탁액의 컬러가 산성일수록 자유 Rho와 유사함을 확인할 수 있고, 예측한 바와 같이, 수성 나노입자 콜로이드 현탁액은 산성 PH 값일수록 더 강한 형광 강도를 나타냄을 확인할 수 있다(방출 파장(Emission wavelength, λem) = 582 nm, 여기 파장(Excitation wavelength, λex) = 562 nm).
pH-의존 형광 종양 세포 검출
DU145 종양 및 NCTC1469 정상 세포를 각각 24-웰 배양 플레이트에 웰 당 1.0 × 104 및 1.5 × 104의 밀도로 심고, 세포 독성 측정에서와 유사한 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포는 농축 콜로이드 현탁액을 살균 PBS 용액으로 희석하여 준비한 나노입자 콜로이드 현탁액(2.5 mM Gd, 2 μL)으로 처리하였고, 대조군으로서 무처리 및 Rho로 처리하였으며, 그 다음 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 처리 세포를 혈청-프리 배지로 두 번 세척한 후, 처리 및 비처리(즉, 대조군) 세포의 형광 현미경 이미지를 λex = 562 nm에서 수은 램프로 형광 현미경(IX 51, Olympus, Japan)을 사용하여 정상 및 종양 세포에서 형광 현미경 이미지를 촬영하였다. 그 결과를 도 14에 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자로 처리된 종양 세포 및 정상 세포에서 형광 현미경 이미지를 설명하기 위한 도면이다.
도 14의 (a)는 무처리 대조군, (b)는 Rho-처리 대조군 (1.0 mM Rho), (c)는 본 발명에 따른 샘플-처리 세포에서의 형광 이미지를 나타내고(λex = 562 nm), (I)는 DU145 종양 세포, (II)는 NCTC1469 정상 세포를 나타낸다.
도 14를 참조하면, DU145 종양 및 NCTC1469 정상 세포 둘 다에서 무처리 대조군은 형광이 나타나지 않았다(도 14의 (a)). Rho-처리 세포에서는 NCTC1469 정상 세포 보다 DU145 종양 세포에서 더 밝은 형광이 나타나고, 이는 예측한 바와 같이 종양 세포의 pH가 거의 중성인 정상 세포 보다 더 산성이기 때문으로 (도 14의 (b)), 즉, Rho가 pH 민감성 종양 세포 검출 프로브로서 제공될 수 있음을 의미한다. 또한, 본 발명의 나노입자 처리 세포에서도, 나노입자에 컨쥬게이션된 Rho로 인해 NCTC1469 정상 세포 보다 DU145 종양 세포에서 더 강한 형광이 나타나는 것을 확인할 수 있다(도 14의 (c)). 따라서, 본 발명의 나노입자가 pH-민감성 종양 세포 검출 능력을 갖고, 이를 이용하여 종양 세포를 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
즉, 상기에서 확인한 바를 소결하면, 본 발명에 따라, 로다민 B(이하, Rho)와 부분적으로 컨쥬케이션된 친수성 폴리아크릴산(polyacrylic acid, PAA) (PAA:Rho의 몰비 = 5:1) 코팅된 단분산(monodisperse) 및 초미세 가돌리늄 산화물(Gd2O3) 나노입자(d avg = 1.5 nm), 즉, 본 발명에 따른 나노입자를 합성하였고, 본 발명의 나노입자는 부분적으로 로다민 B와 컨주게이션된 PAA 코팅으로 인해 무독성이고 안정하며 다기능성 종양 진단치료제(tumor theragnostic agent)로서 우수한 성능을 갖는 것을 확인할 수 있다. 구체적으로, 먼저, 본 발명의 나노입자는 종래의 가돌리늄-킬레이트 보다 6배 높은 22.6 s-1mM-1의 매우 높은 종방향 수 양성자 이완도(longitudinal water proton relaxivity) (r 1) (r 2/r 1 = 1.3, r 2 = 역 수 양성자 이완도), 그리고 정맥 투여 후 실험용 쥐(nude mouse)에서 T1 자기 공명 이미지에서의 높은 양성 대조 향상을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 나노입자는 강력한 T1 자기 공명 이미지 조영제로서 잘 기능함을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 나노입자를 in vitro 가돌리늄 중성자 포획 치료에 적용한 결과, 열 중성자 빔 조사 후 상용 Gadovist 사용 시 보다 1.75배 높은 U87MG 종양 세포 사멸 (28.1% 네트 값(net value))을 나타냄을 확인할 수 있고, 이는 본 발명의 나노입자가 우수한 중성자 포획치료 효과를 나타냄을 의미한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 나노입자의 pH-의존 형광 종양 세포 검출 결과, 컨쥬케이션된 Rho가 pH-민감 형광 종양 세포 검출 능력을 제공하기 때문에 본 발명의 나노입자가 종양 세포에서 일반 세포에서 보다 강한 형광 강도를 나타냄을 확인할 수 있다.
따라서, 상기에서 확인한 바와 같은 결과들에 기인하여, 본 발명의 나노입자가 다기능성 종양 진단치료제로서 가능함을 확인할 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (18)

  1. 다수의 카르복시기(carboxy group)를 포함하는 단량체의 친수성 고분자 및 상기 카르복시기의 적어도 일부와 아마이드(amide) 결합 가능한 작용기를 갖는 프로브를 혼합하여 제1 용액을 제조하는 제1 단계;
    상기 제1 용액에 가돌리늄 수화물을 포함하는 제2 용액을 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 제2 단계; 및
    상기 혼합 용액에 염기성 용액을 첨가하는 제3 단계;를 포함하고,
    제조된 가돌리듐 산화물 나노입자는,
    산화가돌리늄(Gd2O3) 나노입자;
    상기 나노입자의 가돌리늄과 배위 결합하여, 상기 나노입자 표면을 코팅하고 있는 카르복시기(carboxy group)를 포함하는 단량체의 친수성 고분자; 및
    상기 친수성 고분자의 카르복시기와 아마이드(amide) 결합된 프로브;를 포함하는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 고분자는 폴리아크릴산(polyacrylic aicd)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는 로다민(rhodamine)계 화합물인 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 카르복시기와 결합 가능한 작용기는 아민기인 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 가돌리늄 수화물은 염화가돌리늄 수화물을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 염기성 용액은 수산화나트륨(NaOH) 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제 1단계 동안,
    상기 카르복시기의 적어도 일부가 프로브와 아마이드 결합된 친수성 고분자가 합성되고,
    제 3단계 동안, 상기 제1 단계에서 합성된 친수성 고분자가 표면에 배위 결합된 가돌리늄 산화물 나노입자가 형성되는 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자의 제조 방법.
  9. 산화가돌리늄(Gd2O3) 나노입자;
    상기 나노입자의 가돌리늄과 배위 결합하여, 상기 나노입자 표면을 코팅하고 있는 카르복시기(carboxy group)를 포함하는 단량체의 친수성 고분자; 및
    상기 친수성 고분자의 카르복시기와 아마이드(amide) 결합된 프로브;를 포함하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 가돌리늄 산화물 나노입자의 직경은 3 nm 미만인 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 가돌리늄 산화물 나노입자의 직경은 1 nm 내지 2.5 nm인 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 정맥 투여 가능하고 모세혈관 내에서 자유 유영 가능한 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 진단 및 치료가 동시 가능한 테라그노스틱(theragnostics) 나노입자인 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 중성자 조사 시 중성자 포획 반응하는 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 자기 공명 이미지(MRI) 장치 하에서 조영 증강 특성을 갖는 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 550 nm 내지 570 nm의 파장 범위에서 pH가 감소할수록 형광 세기가 증가하는 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 가돌리늄 산화물 나노입자는 종양 세포를 진단 및 치료하는 종양 세포 테라그노스틱 나노입자인 것을 특징으로 하는,
    가돌리늄 산화물 나노입자.
  18. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 제조된 가돌리늄 산화물 나노입자를 포함하는,
    중성자 포획 치료제.
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Bioconjugate Chem., 2005, Vol.16, pp.995-999.*
유성민, 2012년 8월, 서울대학교 이학석사 학위논문.*

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