CN112028898A - 不同连接链偶联的叶酸靶向卟吩类光敏剂及其合成和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明为不同连接链偶联的叶酸靶向卟吩类光敏剂及其合成和应用，公开了通式(I)的光敏剂、其制备方法及其在肿瘤光动力治疗和肿瘤成像诊断中的应用。在所述光敏剂中，作为肿瘤靶向配基的叶酸通过任选地具有酸性氨基酸片段的不同链长的连接部分与卟吩型光敏部分连接。A‑Lys‑(L)m‑(B)o‑C(I)。

Description

不同连接链偶联的叶酸靶向卟吩类光敏剂及其合成和应用
技术领域
本申请涉及具有肿瘤靶向性的光敏剂、其制备方法及其在肿瘤光动力治疗和肿瘤成像诊断中的应用。在所述光敏剂中，作为肿瘤靶向配基的叶酸(FA)通过任选地具有酸性氨基酸片段的不同链长的连接部分与作为光敏部分(PS)的卟吩类化合物连接。
背景技术
目前，临床上治疗癌症的方法主要包括放疗、化疗和手术治疗三种手段。然而，这些传统的治疗方法在杀伤肿瘤组织的同时也会损伤机体正常的组织，造成全身毒性。光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)是新型的局部的低毒的肿瘤治疗方案。光动力治疗所使用的光敏剂具有较低的暗毒性，并且光动力治疗的直接作用位点是光辐射部位的病变组织，用一定的激发波长照射疾病部位，光敏剂才会被激活从而产生杀伤能力。光敏剂的光学性质决定了其在肿瘤组织部位富集后，可以产生明显的荧光信号，因此，可以将诊断和治疗一体化并为临床手术过程提供指导。
目前的光敏剂主要为卟吩类化合物。卟吩类化合物的吸收波长为约680nm，例如：焦脱镁叶绿酸a(Pyro)、甲基嗜焦素烷基醚衍生物(HPPH)、二氢卟吩e6(Ce6)、维替泊芬(BPD-MA，vertoporfin)和替莫泊芬(Temoporfin，商品名：Foscan)等。焦脱镁叶绿酸a(Pyropheophorbide a,Pyro)在波长668nm下的消光系数为3.79×104L mol-1cm-1，并具有较强的单线态氧量子产率(0.52)，因此具有较强的细胞光动力杀伤活性。但是，Pyro的水溶性差，并且基本上不具有肿瘤定位能力，在肿瘤组织中的浓度低，而在正常组织中的浓度高，在光动力治疗过程中会对正常组织产生较为严重的光毒副作用。因此，通过对Pyro进行结构改造，解决限制其临床应用的缺点，有望开发出所需的光敏剂。
提高光敏剂在肿瘤部位的富集能力，从而能有效增强肿瘤光动力治疗的疗效。通过将光敏剂与在肿瘤表面高表达受体的靶向配基偶联，可赋予光敏剂主动靶向肿瘤的能力，这成为制备肿瘤特异性光敏剂的有效策略。叶酸受体普遍高表达于多数肿瘤细胞表面，并且小分子叶酸可以作为理想的肿瘤靶向配基而被广泛应用于肿瘤成像和治疗领域中。
在第201610628964.X号中国专利申请中，通过将作为肿瘤靶向基团的叶酸经由半胱氨酸与Pyro相连，提高Pyro的肿瘤富集能力。所制备的化合物(Pyro-FA)对叶酸高表达的皮下肿瘤表现出良好的选择能力和非常有效的光动力治疗效果。
在第201710550348.1号中国专利申请中，通过向将小分子靶向配基叶酸与光敏剂Pyro连接的含有半胱氨酸的连接链中引入高度亲水的不同链长的聚乙二醇，改善了Pyro-FA的性能。合成后的化合物具有良好的水溶性，并增强了对肿瘤的靶向富集能力，改善了光敏剂在体内的代谢分布特性，增强了动物水平上的光动力治疗的效果。
虽然通过聚乙二醇连接Pyro与叶酸分子可以提高光敏剂的水溶性，但是仍然存在一些问题。例如，用于PEG化的作为连接链的聚乙二醇的分子量为平均分子量，分子结构不固定，分子量也不固定，化合物纯化比较困难，而且依然不能确定能够使得光敏药物分子具有优异的肿瘤特异富集功能和高效的光敏活化杀能力的具体结构。因此，仍然亟需具有优异的肿瘤靶向性和改善的体内代谢分布特性的光敏剂。
发明概述
一方面，本申请提供了通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐：
A-Lys-(L)m-(B)o-C
(I)
其中
A和C独立地选自叶酸基团(FA)和卟吩型光敏部分(PS)，并且当A和C中的任一个为叶酸基团时，则另一个为卟吩型光敏部分；
Lys表示
Figure BDA0002083987320000021
L独立地选自L1或L2；
Figure BDA0002083987320000022
B表示酸性氨基酸片段；
m为1-5的整数；
o为0或1；以及
p为4-8的整数。
另一方面，本申请提供了制备通式(I)的光敏剂的方法，其包括：
1)合成连接子L；
2)使m个连接子L与Lys连接以获得片段Lys-(L)m；
3)任选地使片段Lys-(L)m与酸性氨基酸片段B连接以获得片段Lys-(L)m-(B)o；
4)将片段Lys-(L)m-(B)o与叶酸FA连接以获得片段Lys-(L)m-(B)o-FA；以及
5)将片段Lys-(L)m-(B)o-FA与卟吩型光敏化合物PS连接以获得通式(I)的光敏剂；或者
6)将片段Lys-(L)m-(B)o与卟吩型光敏化合物连接以获得片段Lys-(L)m-(B)o-PS；以及
7)将片段Lys-(L)m-(B)o-PS与叶酸FA连接以获得通式(I)的光敏剂；
其中Lys、L、m、B、o、FA和PS如上文所定义。
另一方面，本申请提供了包含通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
另一方面，本申请提供了包含通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐的成像诊断剂。
再一方面，本申请提供了通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
再一方面，本申请提供了通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备肿瘤成像诊断剂中的用途。
还一方面，本申请提供了通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备通过光动力疗法来治疗肿瘤的药物中的用途。
附图说明
图1是L1的合成方法示意图。
图2是Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)的合成方法示意图。
图3是Pyro-Lys-(L1)m-Glu-FA(m＝3或5)的合成方法示意图。
图4是Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA的合成方法示意图。
图5是Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA的合成方法示意图。
图6是Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA、Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA、Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA的高效液相色谱分析图。
图7A和图7B分别是Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA的荧光光谱图以及它们在DMSO中的单线态氧量子产率测定图。
图8A至图8D是Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro在不同溶液中的紫外吸收光谱图及在PBS溶液中的单线态氧量子产率测定图。
图9显示了Pyro、Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA、Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA、Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA在体外KB细胞水平上的生物活性。
图10显示了Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬分别在KB和A549细胞中的选择性内吞。
图11显示了Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬分别与叶酸对KB细胞系活性的竞争性抑制。
图12显示了Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬在不同细胞系水平上的生物活性和暗毒性。
图13显示了Pyro、Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA在KB移植瘤小鼠体内随时间分布的药物代谢过程。
图14显示了Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA在KB移植瘤小鼠体内随时间分布的药物代谢过程。
图15A至图15E显示了Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬分别在KB、A431和NCI-N87移植瘤小鼠体内随时间分布的药物代谢过程及它们在各器官组织、肿瘤组织和肿瘤附近肌肉组织的富集(Ht：心；Lv：肝；Sp：脾；Lu：肺；Kn：肾；Tm：肿瘤；Ms；肌肉)。
图16A至图16C分别显示了Pyro和Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA分别对KB、A431和NCI-N87移植瘤小鼠的肿瘤光动力治疗效果。
图17显示了Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro对正常小鼠的急性毒性。
发明详述
一方面，本申请提供了通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐：
A-Lys-(L)m-(B)o-C
(I)
其中
A和C独立地选自叶酸基团(FA)和卟吩型光敏部分(PS)，并且当A和C中的任一个为叶酸基团时，则另一个为卟吩型光敏部分；
Lys表示
Figure BDA0002083987320000041
L表示连接子(linker)，其独立地选自L1或L2；
Figure BDA0002083987320000042
B表示酸性氨基酸片段；
m为1-5的整数；
o为0或1；以及
p为4-8的整数。
在本申请的实施方案中，所述叶酸基团优选地具有如下结构：
Figure BDA0002083987320000051
在本申请的实施方案中，所述卟吩型光敏部分独立地选自Pyro的基团、Ce6的基团、HPPH的基团和Vertoporfin的基团，优选为Pyro的基团或Ce6的基团，更优选为Pyro的基团。
Figure BDA0002083987320000052
在本申请的优选实施方案中，所述Pyro的基团具有结构
Figure BDA0002083987320000053
在本申请的实施方案中，所述酸性氨基酸片段为谷氨酸片段和天冬氨酸片段；优选地，所述谷氨酸片段具有结构
Figure BDA0002083987320000054
以及所述天冬氨酸片段具有结构
Figure BDA0002083987320000055
在本申请的实施方案中，m为1-5的整数；更优选为2、3、4或5，还更优选为3或5；最优选为3。在本申请的实施方案中，o优选为1。在本申请的实施方案中，L2中的重复单元-CH2CH2O-的个数p还可以为4、5、6、7或8，优选为6，即，L2具有结构
Figure BDA0002083987320000056
在本申请的优选实施方案中，-(L)m-具有如下结构之一：
Figure BDA0002083987320000061
在本申请的更优选实施方案中，-(L)m-(B)n-具有如下结构之一：
Figure BDA0002083987320000062
Figure BDA0002083987320000071
在本申请的实施方案中，通式(I)的光敏剂优选地选自如下化合物之一或其药学上可接受的盐：
Pyro-Lys-L1-FA：
Figure BDA0002083987320000072
Pyro-Lys-(L1)2-FA：
Figure BDA0002083987320000073
Pyro-Lys-(L1)3-FA：
Figure BDA0002083987320000074
Pyro-Lys-(L1)4-FA：
Figure BDA0002083987320000081
Pyro-Lys-(L1)5-FA：
Figure BDA0002083987320000082
Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA：
Figure BDA0002083987320000083
Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA：
Figure BDA0002083987320000084
Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA：
Figure BDA0002083987320000085
Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA：
Figure BDA0002083987320000091
另一方面，所述通式(I)的光敏剂的药学上可接受的盐包括药学上可接受的酸加成盐或药学上可接受的碱加成盐，其分别通过使通式(I)的光敏剂与药学上可接受的无机酸或有机酸或者与药学上可接受的无机碱或有机碱反应来获得。
另一方面，本申请提供了制备通式(I)的光敏剂的方法，其包括：
1)合成连接子L；
2)使m个连接子L与Lys连接以获得片段Lys-(L)m；
3)任选地使片段Lys-(L)m与酸性氨基酸片段B连接以获得片段Lys-(L)m-(B)o；
4)将片段Lys-(L)m-(B)o与叶酸FA连接以获得片段Lys-(L)m-(B)o-FA；以及
5)将片段Lys-(L)m-(B)o-FA与卟吩型光敏化合物PS连接以获得通式(I)的光敏剂；或者
6)将片段Lys-(L)m-(B)o与卟吩型光敏化合物连接以获得片段Lys-(L)m-(B)o-PS；以及
7)将片段Lys-(L)m-(B)o-PS与叶酸FA连接以获得通式(I)的光敏剂；
其中Lys、L、m、B、o、FA和PS如上文所定义。
在本申请的实施方案中，连接子L独立地选自如上文所定义的L1或L2，其中L1可以通过下文所描述的合成方法获得，L2可以通过下文所描述的合成方法获得或者可以商购。
Figure BDA0002083987320000092
连接子L1的合成方法
在本申请的实施方案中，步骤2)至步骤5)的合成路线如下所示，其中以3个连接子L1作为-(L)m-的实例，以谷氨酸片段作为酸性氨基酸片段的实例，以Pyro作为卟吩型光敏化合物的实例：
Figure BDA0002083987320000101
通过固相合成和液相合成相结合的方式，以非常简单实用的方式得到了一系列的通式(I)的光敏剂。利用二氯三苯甲基树脂采用Fmoc固相合成多肽的方法合成了具有Lys基团和m个连接子L及任选地具有酸性氨基酸片段的不同链长的连接部分，再与FA配基偶联，最后通过与诸如Pyro的活性酯等卟吩型光敏化合物PS的活性酯进行缩合得到产物(即，通式(I)的光敏剂)，例如Pyro-Lys-L1-FA、Pyro-Lys-(L1)2-FA、Pyro-Lys-(L1)3-FA、Pyro-Lys-(L1)4-FA、Pyro-Lys-(L1)5-FA、Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA、Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA。所述产物用HPLC进行纯度分析，并用HRMS进行分子量表征。
在本申请的实施方案中，本申请提供上述光敏剂的制备方法，其详细的合成路线如图1-5所示。
另一方面，本申请提供了包含通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
术语“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、抗菌剂、防腐剂、等渗剂、无热原水、生理盐水和磷酸盐缓冲溶液等。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。另外，可以包括各种辅料，例如本领域常用的辅料。这些和其它此类化合物描述于文献中，例如Merck Index,Merck&Company,Rahway,NJ。例如，Gilman et al.(Eds.)(1990)；Goodman and Gilman’s:The Pharmacological Basis of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press中描述了在药物组合物中包含各种组分的考虑因素。
本申请公开的通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐的给药可以通过用于具有类似功用的药剂的任何可接受的给药方式实施，包括但不限于口服给药和注射给药，例如皮下、静脉内、局部、透皮、腹膜内和肌内给药等。口服给药和肠胃外给药通常用于治疗作为优选实施方案的主体的适应症。
可以将如上所述的通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐配制成药物组合物以用于治疗肿瘤。使用标准的药物制剂技术，例如Remington's The Science and Practiceof Pharmacy,21st Ed.,Lippincott Williams&Wilkins(2005)中公开的那些，该文献通过引用以其整体并入本文。
另一方面，本申请提供了包含通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐的成像诊断剂。
再一方面，本申请提供了通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
再一方面，本申请提供了通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备肿瘤成像诊断剂中的用途。
还一方面，本申请提供了通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备通过光动力疗法来治疗肿瘤的药物中的用途。
在本申请的实施方案中，所述肿瘤为叶酸受体高表达的癌症，包括但不限于口腔表皮样癌、表皮鳞癌和胃癌。
在本申请中，设计并合成了一系列具有不同链长的任选地具有酸性氨基酸片段如Glu片段和Asp片段的连接部分，并通过该连接部分将作为肿瘤靶向配基的叶酸与诸如Pyro的卟吩型光敏部分连接而获得了通式(I)的光敏剂，然后对所述光敏剂进行了光物理性质研究以及在体外和体内的生物活性评价。
本申请的发明人经研究发现，引入亲水性较强的连接部分和更多的羧基官能团能显著提高诸如Pyro的卟吩型光敏化合物的水溶性，以及提高药物分子的水溶性可以提高药物在肿瘤部位的富集能力并降低药物在小鼠体内的背景吸收。
通过在人口腔表皮样癌KB细胞系(叶酸受体高表达)、人类表皮鳞癌A431细胞系(叶酸受体高表达)、人胃癌NCI-N87细胞系(叶酸受体高表达)、A549人肺癌细胞(叶酸受体低表达)和LO2人正常肝细胞系上以及在KB、A431或NCI-N87三种异种移植肿瘤模型小鼠上对通式(I)的光敏剂进行生物学研究和体内药物代谢研究，发现相比于现有光敏剂Pyro和替莫泊酚，本申请的通式(I)的光敏剂至少具有如下优势之一：显示出良好的肿瘤选择性；对叶酸受体高表达的肿瘤表现出优异的肿瘤特异性富集能力和肿瘤细胞杀伤能力；可以实现快速富集和快速清除；可以降低对正常组织的毒副作用。
因此，本申请的通式(I)的光敏剂在肿瘤光动力治疗领域和肿瘤成像诊断领域具有良好的应用前景，具备开发成药物的潜力，特别是具有含3个连接子(优选地，3个连接子的总分子量为约1K)和1个酸性氨基酸片段的连接部分的通式(I)的光敏剂，例如Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA、Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA，更具备开发成药物的潜力。
实施例
本领域技术人员会理解，下述实施例仅是用于示例性说明本发明但不意味着限制本发明。实施例中未描述的具体技术或条件可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。未注明生产厂商的试剂或仪器均是可以通过市场获得的常规产品。
缩写语
PDT：光动力治疗；Pyro：焦脱镁叶绿酸a；FA：叶酸；Lys：赖氨酸；Glu：谷氨酸；Asp：天冬氨酸；PEG：聚乙二醇；Et2O：乙醚；THF：四氢呋喃；Et3N：三乙胺；DIEA：N,N-二异丙基乙胺；EA：乙酸乙酯；DCM：二氯甲烷；EtOH：乙醇；MeOH：甲醇；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；HCl：盐酸；NaOH：氢氧化钠；NaHCO3：碳酸氢钠；Na2SO4：硫酸钠；MgSO4：硫酸镁；Pd/C：钯/碳；H2：氢气；TFA：三氟乙酸；Tris：三异丙基硅烷；PIP：哌啶；Fmoc-OSu：芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺；HBTU：O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯；HOBt：1-羟基苯并三唑；DCC：二环己基碳二亚胺；DMAP：4-二甲氨基吡啶；EDC：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；NHS：N-羟基丁二酰亚胺；Fmoc：芴甲氧羰基；Boc：叔丁氧羰基；OtBu：叔丁氧基；Cbz-Cl：苄氧羰基氯；HPLC：高效液相色谱；HRMS：高分辨质谱；CEL：聚氧乙烯蓖麻油；Tween-80：失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚，也叫吐温80；PBS：磷酸缓冲液；DPBF：1,3-二苯基异苯并呋喃；ABDA：9，10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸；MTT：噻唑蓝；IC50值：半抑制剂量；KB：人口腔表皮样癌细胞；A431：人表皮癌细胞；NCI-N87：人胃癌细胞；A549：人肺癌细胞；LO2：人正常肝细胞系；SPF：无特定病原体；
实验材料的来源
Pyro购自宁波洞密生物科技有限公司；FA、二甘醇酐、EDC、NHS和TFA购自天津希恩思生化科技有限公司；Glu、Lys、Cbz-Cl、Fmoc-OSu、三苯基氯树脂、HATU和HoBt购自吉尔生化(上海)有限公司；4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺和Tris购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；DIEA购自北京百灵威科技有限公司；Fmoc-PEG6-CH2CH2COOH购自成都福瑞康生物科技有限公司；Pd/C购自西安凯立化工有限公司；CO2和H2购自天津六方工业气体经销有限公司；MTT、YF488-Annexin V和PI试剂盒和异氟烷购自天津百倍生物科技有限公司；以及其它常规的生物试剂与化学试剂均购自天津化学试剂经销公司。
实施例1.连接子L1的合成
第一步：Cbz-苯酚的合成
如图1所示，在室温下称取苯酚(300.0g)并溶于500ml四氢呋喃(THF)中，加入三乙胺(Et3N)(532.0ml，1.2eq)，然后用液氮降温至-10℃，再滴加Cbz-Cl(495.0ml，1.1eq)。滴加完毕后，自然升温至室温并搅拌反应过夜。旋蒸除去大部分的THF，加水稀释，并用乙酸乙酯(EA)萃取3次，合并有机相，分别用2N的盐酸(HCl)、饱和碳酸氢钠(NaHCO3)溶液洗涤两次，再用水、饱和食盐水洗涤，经无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，旋蒸除去EA，得黄色油状化合物1(857.4g)，产物未经纯化直接用于下一步反应。
第二步：化合物2的合成
在反应瓶中称取4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺(200.0g)并溶于乙醇(EtOH)(100.0ml)中，并加热至70℃，将化合物1(242.4g，1.0eq)的EtOH(400.0ml)溶液快速滴加至反应瓶中，滴加完毕后在70℃下反应过夜。旋蒸除去EtOH，加入3N的盐酸(HCl)并充分搅拌后，用EA洗，然后用2N的氢氧化钠(NaOH)溶液调节混合物的pH至pH＝10，再用EA萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸镁(MgSO4)干燥，旋蒸除去EA，得黄色油状化合物2(160.0g)，产物未经纯化直接用于下一步反应。
第三步：化合物3的合成
将化合物2(50.0g)溶于二氯甲烷(DCM)(500.0ml)中，加入二甘醇酐(19.6g，1.2eq)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(47.0ml，2.0eq)，在室温搅拌过夜。将反应液依次用1N的盐酸(HCl)、水、饱和食盐水洗，无水硫酸镁(MgSO4)干燥，旋蒸除去DCM，得黄色油状化合物3(55.0g)，产物未经纯化直接用于下一步反应。
第四步：化合物4的合成
将化合物3(55.0g)溶于甲醇(MeOH)(500.0ml)中，加入Pd/C，并用H2置换空气，然后在室温下搅拌过夜。过滤除掉Pd/C，用旋蒸除去滤液中的甲醇，得黄色油状化合物4(39.0g)，产物未经纯化直接用于下一步反应。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.999-10.034(t,1H),8.431-8.555(m,2H),3.863(s,2H),3.754(s,2H),3.342-3.532(m,12H),3.095-3.137(t,2H),2.854-2.903(t,2H),1.743-1.829(m,2H),1.617-1.705(m,2H)。
第五步：L1的合成
将化合物4(12.6g)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(50.0ml)中，并加入芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(15.2g，1.2eq)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(10.0ml，2.0eq)，在室温下搅拌过夜。加入4N的盐酸(HCl)将反应液的pH调节至pH＝3，再用EA萃取3次，合并有机相，分别用水、饱和食盐水洗，无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，旋蒸除去EA，得到粗产物，将其经硅胶柱色谱法纯化，得产物L1(7.0g)，收率33.36％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.850-7.875(d,2H),7.644-7.668(d,2H),7.364-7.412(t,2H),7.239-7.327(t,2H),4.268-4.290(d,2H),4.162-4.207(t,1H),4.081(s,2H),3.923(s,2H),3.335-3.490(m,12H),3.101-3.166(m,2H),2.978-3.042(m,2H),1.562-1.677(m,4H)。
实施例2.Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4、5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA、Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA、Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA的合成
A.利用固相方法合成Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4、5)化合物的通用程序
如图2所示，在合成前1h，用二氯甲烷对载量为1.0mmol/g的三苯基氯树脂(5.0mmol)进行溶胀处理。将Boc-Lys(Fmoc)-OH(1.0g,1.0mmol)和DIEA(680.0μL,4.0mmol)溶解于DCM(10.0mL)中，然后加入到固相合成器中，在室温下反应过夜。用DCM洗6次，然后将配制的封闭液(DCM:MeOH:DIEA＝17:1:2)加入到固相合成器中封闭未反应的氯。用20％的哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Fmoc保护基30分钟，用DMF洗脱6次。将合成的L1(1.5eq)、缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq)和DIEA(4.0eq)溶于DMF中并加入到固相合成器中，在室温下反应过夜，并用DMF洗脱6次，得到Lys-L1。
用20％的哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Fmoc保护基30分钟，再次将合成的L1(1.5eq)、缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq)和DIEA(4.0eq)溶于DMF中并加入到固相合成器中，在室温下反应过夜，并用DMF洗脱6次，得到Lys-(L1)2。
再次用20％的哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Fmoc保护基30分钟，再次将合成的L1(1.5eq)、缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq)和DIEA(4.0eq)溶于DMF中并加入到固相合成器中，在室温下反应过夜，并用DMF洗脱6次，得到Lys-(L1)3。
再次用20％的哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Fmoc保护基30分钟，再次将合成的L1(1.5eq)、缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq)和DIEA(4.0eq)溶于DMF中并加入到固相合成器中，在室温下反应过夜，并用DMF洗脱6次，得到Lys-(L1)4。
再次用20％的哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Fmoc保护基30分钟，再次将合成的L1(1.5eq)、缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq)和DIEA(4.0eq)溶于DMF中并加入到固相合成器中，在室温下反应过夜，并用DMF洗脱6次，得到Lys-(L1)5。
分别将Lys-L1、Lys-(L1)2、Lys-(L1)3、Lys-(L1)4、Lys-(L1)5用二甲基亚砜(DMSO)洗脱3次。向FA(2.2g，5.0mmol)的DMSO(40ml)溶液中加入溶于DMSO(10ml)中的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)(479.3mg，2.5mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(575.5mg,5.0mmol)并避光反应1h，得到化合物FA-NHS。将含有FA-NHS的反应液直接加入到分别偶联了Lys-L1、Lys-(L1)2、Lys-(L1)3、Lys-(L1)4和Lys-(L1)5的固相合成器中，然后分别加入DIEA(680.0μL,4.0mmol)并室温避光反应过夜。用DMSO洗6次，再用DCM洗脱6次，然后加入8mL洗脱液(三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(Tris)/水＝95:2.5:2.5)并室温下洗脱1h。吹走洗脱液中的大部分TFA后加无水乙醚进行沉淀，并用无水乙醚洗涤沉淀三次，室温干燥，得到产物Lys-L1-FA、Lys-(L1)2-FA、Lys-(L1)3-FA、Lys-(L1)4-FA和Lys-(L1)5-FA。每步反应的产物都经高效液相色谱仪(HPLC)检测纯度。
B.合成Lys-(L1)m-Glu-FA(m＝3、5)化合物的通用程序
采用与Lys-(L1)m-FA的合成程序相似的程序合成Lys-(L1)m-Glu-FA(m＝3、5)。如图3所示，在用20％的哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Lys-(L1)3上的Fmoc保护基30分钟后，将Fmoc-Glu-OtBu(1.5eq)、缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq)和DIEA(4.0eq)溶于DMF中，并加入到偶联了Lys-(L1)3的固相合成器中，室温反应过夜，得到Lys-(L1)3-Glu。用DMF洗脱3次，再用二甲基亚砜(DMSO)洗脱3次。
按照与Lys-(L1)m-FA的合成方法相同的方法，将新鲜制备的含有FA-NHS的反应液直接加入到偶联了Lys-(L1)3-Glu的固相合成器中，加入DIEA(4.0eq)并室温避光反应过夜。用DMSO洗6次，再用DCM洗脱6次，然后加入8.0mL洗脱液(三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(Tris)/水＝95:2.5:2.5)并室温下洗脱1h。吹走洗脱液中的大部分TFA后加无水乙醚进行沉淀，并用无水乙醚洗涤沉淀三次，并室温干燥，得到产物Lys-(L1)3-Glu-FA。每步反应的产物都经高效液相色谱仪(HPLC)检测纯度。
采用与Lys-(L1)3-Glu-FA的合成程序相似的程序，在用20％的哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Lys-(L1)5上的Fmoc保护基30分钟后，将Fmoc-Glu-OtBu(1.5eq)、缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq)和DIEA(4.0eq)溶于DMF中，并加入到偶联了Lys-(L1)5的固相合成器中，室温反应过夜，得到Lys-(L1)5-Glu。用DMF洗脱3次，再用二甲基亚砜(DMSO)洗脱3次。
按照与Lys-(L1)m-FA的合成方法相似的方法，将新鲜制备的含有FA-NHS的反应液直接加入到偶联了Lys-(L1)5-Glu的固相合成器中，加入DIEA(4.0eq)，并室温避光反应过夜。用DMSO洗6次，再用DCM洗脱6次后，加入8.0mL洗脱液(三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(Tris)/水＝95:2.5:2.5)并室温下洗脱1h。吹走洗脱液中的大部分TFA后加无水乙醚进行沉淀，并用无水乙醚洗涤沉淀三次，室温干燥，得到产物Lys-(L1)5-Glu-FA。每步反应的产物都经高效液相色谱仪(HPLC)检测纯度。
C.Lys-(L2)3-Glu-FA化合物的合成
采用与Lys-(L1)3-Glu-FA的合成程序相似的程序。如图4所示，在合成前1h，用二氯甲烷对载量为1.0mmol/g的三苯基氯树脂(5.0mmol)进行溶胀处理。将Boc-Lys(Fmoc)-OH(1.0g,1.0mmol)和DIEA(680.0μL,4.0mmol)溶解于DCM(10.0mL)中并加入到固相合成器中，室温反应过夜。用DCM洗6次，然后将配制的封闭液(DCM：MeOH：DIEA＝17:1:2)加入到固相合成器中封闭未反应的氯。在用20％的哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Fmoc保护基30min并用DMF洗脱6次后，将商购的L2(1.5eq)、缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq)和DIEA(4.0eq)溶于DMF中并加入到固相合成器中，室温反应过夜，用DMF洗脱6次，得到Lys-L2。重复上述操作两次，得到Lys-(L2)3。
用20％的哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Lys-(L2)3上的Fmoc保护基30分钟后，将Fmoc-Glu-OtBu(1.5eq)、缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq)和DIEA(4.0eq)溶于DMF中，并加入到偶联了Lys-(L2)3的固相合成器中，室温反应过夜，得到Lys-(L2)3-Glu。用DMF洗脱3次，再用二甲基亚砜(DMSO)洗脱3次。按照与Lys-(L1)m-FA的合成方法相似的方法，将新鲜制备的含有FA-NHS的反应液直接加入到偶联了Lys-(L2)3-Glu的固相合成器中，加入DIEA(4.0eq)，并室温避光反应过夜。用DMSO洗6次，再用DCM洗脱6次后，加入8.0mL洗脱液(三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(Tris)/水＝95:2.5:2.5)并室温下洗脱1h。吹走洗脱液中的大部分TFA后加无水乙醚进行沉淀，并用无水乙醚洗涤沉淀三次，室温干燥，得到产物Lys-(L2)3-Glu-FA。每步反应的产物都经高效液相色谱仪(HPLC)检测纯度。
D.Lys-(L1)3-Asp-FA化合物的合成
如图5所示，采用与Lys-(L1)3-Glu-FA的合成程序相似的程序，用20％的哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Lys-(L1)3上的Fmoc保护基30分钟后，将Fmoc-Asp-OtBu(1.5eq)、缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq)和DIEA(4.0eq)溶于DMF中，并加入到偶联了Lys-(L1)3的固相合成器中，室温反应过夜，得到Lys-(L1)3-Asp。用DMF洗脱3次，再用二甲基亚砜(DMSO)洗脱3次。按照与Lys-(L1)m-FA的合成方法相似的方法，将新鲜制备的含有FA-NHS的反应液直接加入到偶联了Lys-(L1)3-Asp的固相合成器中，加入DIEA(4.0eq)，并室温避光反应过夜。用DMSO洗6次，再用DCM洗脱6次，然后加入8.0mL洗脱液(三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(Tris)/水＝95:2.5:2.5)，并室温下洗脱1h。吹走洗脱液中的大部分TFA后加无水乙醚进行沉淀，并用无水乙醚洗涤沉淀三次，室温干燥，得到产物Lys-(L1)3-Asp-FA。每步反应的产物都经高效液相色谱仪(HPLC)检测纯度。
E.Lys-(L1)m-FA(m＝1,2,3,4,5)、Lys-(L1)3-Glu-FA、Lys-(L1)5-Glu-FA、Lys-(L2)3-Glu-FA和Lys-(L1)3-Asp-FA化合物与Pyro的偶联
Pyro-NHS的合成：Pyro(534.3mg,1.0mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)(1.9g,10.0mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(1.2g,10.0mmol)加入到DMF(60.0mL)中，并室温避光反应过夜。加入水，用DCM稀释并萃取，将有机相用水洗3次，饱和食盐水洗，无水硫酸镁(MgSO4)干燥，旋蒸除去DCM，得到黑色固体(788.0mg)，产物未经纯化直接用于下一步反应。
分别将Lys-L1-FA、Lys-(L1)2-FA、Lys-(L1)3-FA、Lys-(L1)4-FA、Lys-(L1)5-FA、Lys-(L1)3-Glu-FA、Lys-(L1)5-Glu-FA、Lys-(L2)3-Glu-FA或Lys-(L1)3-Asp-FA(1.0eq)溶于DMSO中，再加入DIEA(5.0eq)和Pyro-NHS(0.9eq)，并室温避光反应过夜。向反应液中加入无水乙醚进行沉淀，用无水乙醚洗涤沉淀三次，再用DCM洗涤至没有Pyro-NHS为止，得到产物。产物经HPLC检测纯度，并用HRMS表征最终产物的分子量。Pyro-Lys-L1-FA：高分辨质谱(MALDI-TOF)荷质比C72H91N15O15 2+for[M/2+H]+，理论分子量702.8332，我们发现702.8391；Pyro-Lys-(L1)2-FA：高分辨质谱(MALDI-TOF)荷质比C86H117N17O21 2+for[M/2+H]+，理论分子量861.9227，我们发现861.9300；Pyro-Lys-(L1)3-FA：高分辨质谱(MALDI-TOF)荷质比C100H143N19O27 2+for[M/2+H]+，理论分子量1021.0122，我们发现1021.0115；Pyro-Lys-(L1)4-FA：高分辨质谱(MALDI-TOF)荷质比C114H170N21O33 2+for[M/2+H]+，理论分子量1180.1018，我们发现1180.1071；Pyro-Lys-(L1)5-FA：高分辨质谱(MALDI-TOF)荷质比C128H195N23O39 3+for[M/3+H]+，理论分子量893.1275，我们发现893.1352；Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA：高分辨质谱(MALDI-TOF)荷质比C105H159N20O30 2+for[M/2+H]+，理论分子量1085.5335，我们发现1085.5388；Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA：高分辨质谱(MALDI-TOF)荷质比C133H203N24O42 3+for[M/3+H]+，理论分子量936.1417，我们发现936.1480；Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA：高分辨质谱(MALDI-TOF)荷质比C108H157N17O33 2+for[M/2+H]+，理论分子量1111.0565，我们发现1111.0617；Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA：高分辨质谱(MALDI-TOF)荷质比C104H146N20O30 2+for[M/2+H]+，理论分子量1078.5257，我们发现1078.5294。
实施例3.Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1,2,3,4,5)、Pyro-(L1)3-Glu-FA和Pyro-(L1)5-Glu-FA的光谱性质(图7A和图7B，表1)
荧光激发和发射光谱：
荧光发射光谱的记录扫描范围从波长600nm到800nm，激发波长为680nm。荧光激发光谱的记录扫描范围从波长450nm到670nm，发射波长为668nm。将样品均配制成浓度为2.0μM的DMSO溶液。激发和发射的狭缝宽度分别为1nm和2nm。图7A是Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA在DMSO溶液中的荧光激发和发射光谱。由图7A和表1可知，连接部分和FA部分对Pyro部分的光学性能没有明显影响，所有化合物分别在约668nm和672nm处显示最大荧光激发带和发射带。
表1 Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA的光谱数据
Figure BDA0002083987320000181
UV-Vis光谱：
利用美国Cary 5000型紫外分光光度计对Pyro和Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA进行紫外吸收光谱的测定。将样品均配制成浓度为10μM的溶液，溶剂分别为DMSO、含有0.05％Tween-80的磷酸缓冲液(PBS)、含有1％聚氧乙烯蓖麻油(CEL)的磷酸缓冲液(PBS)和PBS溶液(其中各种不同溶剂中DMSO的含量均为0.1％)。在室温下，扫描波长范围从300nm到800nm，分辨率为1nm，扫描速率为每分钟600nm。
通过紫外吸收光谱对Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro进行表征。在DMSO中二者均有较强的吸收峰，吸收波长为λ＝680nm，表现出了典型的非聚集形式，严格符合Beer–Lambert定律。与Pyro相比，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA表现出很好的水溶性。如图8A所示，Pyro在PBS溶液中发生了聚集，吸收峰变宽。然而，Pyro在含有0.05％Tween-80的PBS溶液中和在含有1％聚氧乙烯蓖麻油(CEL)的PBS溶液中的光谱图与其在DMSO中的光谱图相似，其吸收光谱显示几乎没有聚集。Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA在含有0.05％Tween-80的PBS溶液、含有1％聚氧乙烯蓖麻油(CEL)的PBS溶液和PBS溶液中的光谱图都与其在DMSO中的光谱图类似。
以上结果表明，引入连接部分和羧基官能团均能够显著提高Pyro的水溶性，并帮助解决了Pyro在水溶液中聚集的问题。由于只有消除聚集的光敏剂才有光活性，因此，消除光敏剂聚集在生物应用中非常重要。
单线态氧量子产率测定：
使用Pyro作为参比化合物，使用单线态氧淬灭剂1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF，25μM)测量光敏剂在DMSO中的单线态氧量子产率。DPBF能够与单线态氧不可逆地结合，从而造成DPBF在417nm处的吸光度值下降。通过测量DPBF在417nm处的吸光度值变化，间接检测体系内单线态氧的产生。将测试化合物Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA均配制成10μM的DMSO溶液，并取2mL溶液加入到石英比色皿中，再将DPBF加入到测试样品中并混匀。使用波长为680nm的LED灯照射，分别在光照0s、10s、20s、30s、40s、50s、6s和70s后用紫外分光光度计进行扫描，扫描波长范围从350nm到800nm，分辨率为1nm，扫描速率为每分钟600nm。通过将DPBF在417nm处的降低的吸光度值对照射时间进行线性拟合，如图7B所示。根据以下公式计算单线态氧量子产率：
Figure BDA0002083987320000191
其中，ΦStdΔ是参比化合物Pyro在DMSO中的单线态氧量子产率，ΦStdΔ＝0.52、Rs.m.DPBF和RStd DPBF分别是测试化合物和参比化合物在417nm处的吸光度值随照射时间降低的线性斜率，AStd 680和As.m.680分别是测试化合物和参比化合物在680nm处的吸光度值。如表1所示，所有的测试化合物在DMSO中都具有较高的单线态氧量子产率，尤其是化合物Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA产生单线态氧的能力最强。
将在水溶液中的单线态氧量子产率数据(DMSO含量为0.1％)作为参考。在水溶液中的单线态氧测定用ABDA(9，10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸，50nM)作为指示剂。如图8C和8D所示，在不同的光照持续时间下记录400nm处的衰减速率，根据以下公式得到在水溶液中的单线态氧量子产率：
Figure BDA0002083987320000201
其中，KRB和KPS分别是参比化合物(RB)和测试化合物在含1％CEL的PBS溶液、含0.05％Tween-80的PBS溶液和PBS溶液中的分解速率常数，其中RB指的是Rose Bengal，其在水溶液中测得的紫外吸收数据作为对照组数据)。ARB和APS分别代表由参比化合物(RB)和测试化合物吸收的光，其通过对在400-700nm的波长范围内的吸收带进行积分来确定。ФRB是RB的单线态氧量子产率，在水溶液中为0.75。如图8C所示，化合物Pyro在含1％CEL的PBS溶液和含0.05％Tween-80的PBS溶液中都具有较高的单线态氧量子产率，但是由于Pyro较差的水溶性，其在纯PBS溶液中的单线态氧量子产率很低；而化合物Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA在所有溶液中都具有较高的单线态氧量子产率(见图8D所示)。
单线态氧量子产率是光动力治疗中影响细胞杀伤力的最主要因素，因此提高生理溶液中的单线态氧量子产率对光动力治疗非常有帮助。
实施例4.不同光敏化合物在细胞水平上的药物活性的评价
用DMSO将Pyro、Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4、5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA、Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA、Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA、Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA和替莫泊芬均配制成10mM母液。在细胞水平上评价药物活性时，各化合物的稀释液中的DMSO含量均低于千分之一。
细胞的复苏和培养
从液氮中取出KB细胞(人口腔表皮癌细胞系)、A431细胞(人皮肤癌细胞系)、NCI-N87细胞(人胃癌细胞系)、A549细胞(人肺癌细胞系)和LO2细胞(人正常肝细胞系)，并置于37℃的水浴锅中迅速解冻，然后以1000rpm/min离心5min，弃去上清液，加入预热的无叶酸的完全培养基(向无叶酸的基础培养基(含L-谷氨酸和酚红、无叶酸)中添加10％的血清和1％的抗生素，下文简称“培养基”)，并置于5％CO2、37℃培养箱中培养过夜。第二天更换培养基。继续培养至细胞铺满皿底。传代培养2-3次。
1.Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA、Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA、Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA在KB细胞水平上药物活性的评价
将KB细胞以1×104细胞/孔的密度铺于96孔板中，并放置于37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养过夜。将上层清液去除后，向每孔中加入用新鲜的培养基配制的含不同药物浓度的Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA、Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA、Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA或Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA，并放回37℃、5％二氧化碳培养箱中，使药物与细胞孵育4h。将细胞培养板取出，用660nm光源在距离培养板约2cm处给予40mW/cm2的光辐射剂量10min。然后，将96孔细胞培养板放回到细胞培养箱中继续培养过夜。用新鲜的培养基配制0.5mg/ml的MTT溶液。将96孔板中的培养基去除后，每孔中加入100μL的含有MTT的培养基，再放回细胞培养箱中继续培养4h，然后去除细胞培养液，每孔中加入100μL的DMSO，室温摇晃10min，在多功能酶联免疫仪中测定490nm的吸光度。根据吸光度计算细胞的存活率，然后绘制细胞存活率和药物浓度之间关系的药物活力抑制曲线，并计算相应的半数抑制浓度(IC50值)。每个实验组在5个孔上实施，数据表示为平均值±SEM。
实验结果与结论：分别合成了具有不同链长且任选地具有Glu片段的连接部分的化合物Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)或Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA。即，Pyro-Lys-L1-FA、Pyro-Lys-(L1)2-FA、Pyro-Lys-(L1)3-FA、Pyro-Lys-(L1)4-FA、Pyro-Lys-(L1)5-FA、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA，分子量分别是1403.6663、1721.8453、2040.0244、2358.2035、2676.3826、2169.0670和2805.4252。通过细胞毒性实验(MTT测定)来研究Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4、5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA的药物活性变化。
在第201710550348.1号中国专利申请中，通过向将小分子靶向配基叶酸与光敏剂Pyro连接的含有半胱氨酸的连接链中引入高度亲水的不同链长的聚乙二醇，改善了Pyro-FA的性能。合成后的化合物具有良好的水溶性，并增强了对肿瘤的靶向富集能力，改善了光敏剂在体内的代谢分布特性，增强了动物水平上的光动力治疗的效果。
使用细胞膜表面叶酸受体表达量高的KB(人口腔表皮癌细胞)进行研究。如图9所示，发现L1链的引入显著提高药物活性。在第201610628964.X号中国专利中，同样在KB细胞水平上的药物活性研究中，Pyro-FA的IC50值约为500nM；在第201710550348.1号中国专利申请中，筛选出的最优选的化合物Pyro-PEG1K-FA对阳性KB细胞的IC50值约为136nM。如表2所示，当引入L1后，Pyro-Lys-L1-FA的IC50值为53.32nM，Pyro-Lys-(L1)2-FA的IC50值为23.15nM。随着继续增加L1，即，测试化合物分别是Pyro-Lys-(L1)3-FA、Pyro-Lys-(L1)4-FA、Pyro-Lys-(L1)5-FA时，药物活性变化不再明显。在引入Glu(谷氨酸)基团后，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA的IC50值为1nM，Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA的IC50值为约22nM。与第201710550348.1号中国专利中的最优选化合物Pyro-PEG1K-FA相比，本申请的Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA对阳性KB细胞的半数抑制浓度(IC50值)降低了上百倍，即对阳性细胞系的杀伤力提高了上百倍。
在Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA的基础上，将L1替换成L2，得到化合物Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA(分子量为2220.1130)，其药物活性与Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA相似，IC50值约为7.6nM。将Glu片段替换成Asp片段(天冬氨酸片段)，得到化合物Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA(分子量为2155.0514)，IC50值约为12.03nM”。
表2 Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4、5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA、Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA、Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA对KB细胞的药物活性
Figure BDA0002083987320000221
2.Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬分别在KB和A549细胞系中的选择性内吞实验
分别取对数期的叶酸受体高表达的KB细胞和叶酸受体低表达的A549细胞。在超净工作台中，用0.05％-胰酶-EDTA(Gibco)消化KB和A549细胞。在显微镜下计数后，配制成一定浓度的细胞悬浮液，然后在6孔板中以每孔5×104个细胞的密度加入细胞悬浮液，并在二氧化碳培养箱内培养16h。将Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬与Pyro(作为对照组品)分别配制成10mM的DMSO母液，再用相应的完全培养基稀释成不同药物浓度(0.1nM、1nM、10nM、20nM和100nM)的稀释液，在细胞培养箱中继续避光培养4h。除去6孔板中含药物的培养基，并用PBS洗1遍，然后每孔中加入200μL胰酶在37℃下消化3～5min，并在4℃下以1000rpm/min离心3min。用200μL PBS重选细胞，并用BD FACSCalibur流式细胞仪测定荧光强度(λex＝635nm；λem＝645-677nm)。
实验结果与结论：利用光敏剂具有荧光激发和发射的性质直接检测光敏剂被细胞吸收的含量。根据上文的Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA的激发和发射光谱调节流式细胞仪的参数，通过流式细胞仪直接检测Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA在叶酸受体高表达的KB细胞系与叶酸受体低表达的A549细胞系中被选择性吸收的对比。如图10所示，在低浓度的药物剂量(0.1nM)下，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA能够被KB细胞吸收，并且随着药物浓度的增加，被KB细胞内吞的量逐渐增加，而在高达100nM的浓度下，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA被A549细胞吸收的量非常少，在两种细胞系中所吸收的Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA的量有着显著的差异。作为对照组的Pyro和替莫泊芬，在叶酸受体高表达KB细胞系和叶酸受体低表达A549细胞系中都没有体现出明显的被选择性吸收的差异。
3.Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬分别与叶酸对KB细胞系活性的竞争性抑制实验
按照与上文所述方法相似的方法，将KB细胞以5×104细胞/孔的密度铺于6孔板中，并在二氧化碳培养箱内培养16h。配制含1mM叶酸的培养基，并加入到6孔板的孔中，与细胞孵育4h，然后更换分别含有不同浓度(10nM、100nM、250nM和500nM)的Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬的新鲜培养基，并在细胞培养箱中继续孵育4h，随后置于660nm的光源下，照射10min。在细胞培养箱中继续避光培养12h后，用胰酶消化细胞，并在流式管中在4℃下以1000rpm/min离心3min。对于每个流式管，用100μL的1×结合缓冲液重悬细胞，并分别加入1μL PI工作液和4μL YF488-Annexin V，在冰上避光孵育15min。然后，向每管中再次加入400μL的1×结合缓冲液，通过BD FACSCalibur流式细胞仪检测细胞凋亡情况。YF488-Annexin V用488nm激光激发，检测药物的荧光发射光谱在530nm处(FITC通道)，PI通道发射光谱约在617nm处。
实验结果与结论：为了证实叶酸和叶酸受体在介导药物的结合和内吞过程中的作用，即，叶酸配基的靶向结合能力，将过量的小分子叶酸(1mM)提前加入到细胞培养基中，通过小分子叶酸的竞争性抑制作用使细胞对Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA的摄取减少，从而达到竞争性抑制Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA的细胞毒性作用。如图11所示，叶酸分子能够明显抑制Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA对KB细胞的杀伤能力，而Pyro和替莫泊芬对细胞的杀伤能力并没有受到额外加入的叶酸分子的影响。这些实验结果证实，在给予光辐射的条件下，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA通过与叶酸受体的结合并经受体介导的内吞作用进入细胞，从而发挥其光动力活性。
4.Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬在不同细胞系水平上的药物活性评价及暗毒性分析
将KB细胞、A431细胞、NCI-N87细胞、A549细胞和LO2细胞分别以1×104细胞/孔的密度铺于96孔板中，并在培养箱中培养16h。分别将相应浓度的Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA或替莫泊芬加入培养孔中，并将培养板置于细胞培养箱中培养4h，再置于660nm的光源下，以40mW/cm2的光强照射10min，然后在细胞培养箱中继续过夜培养。用含MTT的新鲜培养基替换原来的培养基，与细胞共同孵育4h，然后对每孔用100μL的二甲基亚砜置换培养基，测定490nm的吸光度，每个实验组在5个孔上实施，数据表示为平均值±SEM。
暗毒性是指在没有光辐射激发光敏剂的情况下，光敏剂会对细胞产生的毒性。作为理想的光敏剂应无明显的无激发暗毒性。我们使用体外细胞活力抑制实验来评估Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬的暗毒性水平。按照上述方法将五种细胞铺于96孔板中并培养16h，然后分别加入相应浓度的Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA或替莫泊芬。将培养板置于细胞培养箱中培养4h，用新鲜培养基更换含药物的培养基，并将培养基在避光条件下放置过夜。通过上述细胞活性实验，使用MTT法测定黑暗条件下药物对细胞活力的影响。
实验结果与结论：具有不同叶酸受体表达量的各个细胞系被用来评价Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA的药物活性，并在相同的实验条件下，Pyro和替莫泊芬对不同细胞系的杀伤效果作为本实验的对照组进行评价。如图12所示，在使用的药物浓度范围内，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA、Pyro和替莫泊芬在给予的特定光照条件下对不同细胞系的杀伤能力体现出剂量依赖性关系。
表3 Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬在不同细胞系上的光毒性和暗毒性
Figure BDA0002083987320000241
如表3所示，在给予24J/cm2的光照条件下，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA对叶酸受体表达量较高的KB细胞系、A431细胞系和NCI-N87细胞系的杀伤能力明显高于叶酸受体表达量相对较低的A549细胞系和LO2细胞系。
通过软件计算，可知Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA对KB细胞系的IC50值为1.403nM，对A431细胞系的IC50值为103.3nM，对NCI-N87细胞系的IC50值为94.48nM，而Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA对A549细胞系的IC50值为2864nM，对正常的人肝细胞系LO2的IC50值为2330nM。Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA对KB细胞系的杀伤活性是对A549细胞系杀伤活性的2000倍和对LO2细胞系杀伤活性的1660倍。而对照组Pyro和替莫泊芬对不同细胞系的IC50值均在65～80nM和100～200nM之间，仅有微弱的差异，而这种微弱的差异来自于不同细胞系对Pyro和替莫泊芬的敏感性不同。
因此，靶向配基—叶酸的引入使得Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA能够对具有不同叶酸受体表达量的细胞系产生选择性杀伤能力，这有利于降低光敏药物对正常组织的杀伤作用。
在相同的药物浓度范围内，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA在没有光照情况下对不同细胞系均没有体现出明显的细胞毒性，证明Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA符合理想的光敏剂在无光照情况下没有毒副作用的重要属性。
实施例5.不同化合物在小鼠体内的分布特点及对肿瘤的治疗效果的评价小鼠皮下肿瘤模型的建立：
小鼠的皮下肿瘤模型分别为KB肿瘤模型、A431肿瘤模型和NCI-N87肿瘤模型。6～8周龄的雌性BALB/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并一直饲养在SPF级的环境中。具体的实验方法如下：首先按照小鼠的数量计算所需的肿瘤细胞的数量，合理地大量培养相应的肿瘤细胞。在本实验的各个肿瘤模型中，每只小鼠需3×106个细胞。在所培养的细胞占培养皿底板的约80％的空间后，将细胞用与传代类似的方式进行消化，并在预先冷却至4℃的离心机中以1000rpm离心3分钟。弃去上清液，将细胞用PBS悬浮均匀，然后吸取10μL并置于细胞计数板中进行计数。根据计数结果配制成细胞悬液，按每只小鼠皮下注射100μL的量计算。
小鼠皮下肿瘤接种方法：将小鼠用15％异氟烷麻醉后，在小鼠的背部右侧用75％酒精擦拭消毒，然后用注射器吸取100μL(3×106个细胞)肿瘤细胞悬液，并将细胞注入小鼠的皮下，然后将针尖倒转，拔出小鼠体内，并做好标记。在5天后，每2天检测一次小鼠肿瘤的体积大小情况，并记录肿瘤体积和小鼠的体重变化。
1.Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA在KB移植瘤小鼠体内随时间分布的药物代谢过程
由于光敏药物的荧光特性，因此可以利用Xenogen IVIS小动物活体成像系统来研究光敏药物在体内的分布情况。构建小鼠皮下肿瘤KB肿瘤模型(每组5只小鼠)。在小鼠的皮下肿瘤长到约200mm3时，先将小鼠用15％异氟烷短时麻醉，然后放置于Xenogen IVIS小动物活体成像仪中，用λex＝640nm、λem＝695-770nm、曝光时间为5s的参数扫描各组小鼠。将此时小鼠肿瘤部位和身体其余部位的自发荧光值作为背景扣除。然后，将小鼠分别通过尾静脉注射50nmol的Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA(每只小鼠静脉给药的DMSO含量为2.5％)，并由注射时间点作为起点，用活体成像系统扫描给药后0.5h、1h、2h、3h、4h和6h的药物分布情况。
实验结果与结论：利用小动物活体成像系统研究Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA在KB肿瘤模型小鼠体内的药物分布随时间的变化。当经尾静脉给予50nmol的Pyro-Lys-(L1)m-FA(m＝1、2、3、4或5)、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA后，在不同时间点(0.5h、1h、2h、3h、4h和6h)分别用15％异氟烷将小鼠麻醉，扫描此时小鼠体内的药物分布。如图13所示，对于Pyro-Lys-L1-FA、Pyro-Lys-(L1)2-FA、Pyro-Lys-(L1)3-FA、Pyro-Lys-(L1)4-FA和Pyro-Lys-(L1)5-FA而言，随着L1的引入和增加，化合物在肿瘤组织中的分布比例越来越多。当给予小鼠相同剂量的Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA或Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA后，化合物可在给药后1h快速集中于小鼠的肝脏、肾脏和肿瘤组织部位，并随着时间的延长，药物被逐渐代谢；在给药后2h，肝脏中的化合物含量明显降低，化合物主要富集于肿瘤部位。
该实验结果表明，在注射相同剂量药物的情况下，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA均具有较强的快速的在肿瘤部位富集的能力。
2.Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA和Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA在KB移植瘤小鼠体内随时间分布的药物代谢过程
利用上述方法构建小鼠皮下肿瘤KB肿瘤模型(每组5只小鼠)。在小鼠的皮下肿瘤长到约200mm3时，给予小鼠相同剂量(50nmol)的Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA或Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA(每只小鼠静脉给药的DMSO含量小于2.5％)，并以注射时间点作为起点，用活体成像系统扫描尾静脉给药后1h、2h、4h、6h、9h和24h时药物在小鼠体内的分布情况。
实验结果与结论：如图14所示，Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA在给药后2h时可快速富集于肿瘤和肝脏组织，在给药后4h～6h时肝脏中的含量明显降低，化合物主要富集于肿瘤组织中，在给药24h后，小鼠体内的药物几乎全都通过代谢排出。Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA在给药后2h时也可快速富集于肿瘤组织部位，其在小鼠体内的代谢速度比Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA快。
3.Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬分别在KB、A431或NCI-N87移植瘤小鼠体内随时间分布的药物代谢过程以及它们在各器官、肿瘤和肌肉组织中的富集(Ht:心；Lv:肝；Sp:脾；Lu:肺；Kn:肾；Tm:肿瘤；Ms:肌肉)
用多种荷瘤的雌性BALB/c裸鼠研究Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA的药物代谢特点，并用Pyro和替莫泊芬作为对照组。
在小鼠后背部接种KB细胞或A431细胞或NCI-N87细胞(每组5只小鼠)。在肿瘤体积长至约200mm3时，按照上述方法扫描未作处理的小鼠以作为背景对照。然后通过尾静脉分别向各组小鼠注射50nmol的Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA或替莫泊芬(每只小鼠静脉给药的DMSO含量小于2.5％)，并以注射时间点作为起点。对Pyro和Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA组小鼠，分别扫描给药后0.5h、1h、2h、3h、4h和6h小鼠体内的药物分布情况，而对于替莫泊芬组小鼠，扫描给药后0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、12h、1d、2d、3d、4d、6d和8d小鼠体内的药物分布情况。
给药后24h时，处死小鼠，将各组小鼠的各器官组织、肿瘤组织以及肌肉组织取出，并通过活体成像仪扫描各组小鼠的各器官组织、肿瘤组织及肌肉组织中所含有的化合物量。利用活体成像系统的软件，计算肿瘤部位的平均荧光强度和各个组织的总平均荧光强度，并计算两者的比值，此比值能够反应光敏药物在肿瘤内的平均富集程度以及该光敏药物在降低皮肤毒性方面的应用潜力。ROI(region of interest)的单位表示为：[p/sec/cm2/sr]/[μW/cm2]。
实验结果与结论：使用叶酸受体高表达的KB肿瘤模型和叶酸受体中等表达的A431和NCI-N87肿瘤模型研究Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA在小鼠体内的分布特点，并以Pyro和替莫泊芬作为对照。如图15A、15B和15C所示，在KB肿瘤模型的荷瘤小鼠中，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA在尾静脉注射后1h开始在肿瘤组织中富集，在2h时在小鼠身体的其余部位的荧光背景明显降低，在肿瘤组织中的荧光强度明显高于在周围的皮肤组织和肝脏组织中的荧光强度。
Pyro和替莫泊芬在此肿瘤模型中的分布情况和Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA截然不同。在尾静脉注射后，Pyro在小鼠的肝脏组织中有明显的大量富集，并随着给药后时间的延长，Pyro在肿瘤组织中没有明显的积累作用，而持续在小鼠的肝脏组织中有大量积累。替莫泊芬在给药前期分布在小鼠体内的荧光并不明显，在给药后2h，在小鼠的肝脏组织中可见荧光，并随着给药后时间的延长，小鼠肝脏组织中的药物含量逐渐增多，并向肿瘤组织转移；在给药后24h时，小鼠肿瘤组织中的药物量达到最大值，并有一部分药物开始向肺组织转移，药物在体内的代谢时间长达8d。
Pyro、Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA和替莫泊芬在A431及NCI-N87肿瘤模型小鼠中的分布特点与KB肿瘤模型小鼠中的分布特点相似。Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA在给药后2h时可观察到在肿瘤组织部位有明显的富集，而Pyro一直大量聚集于肝脏组织并在肿瘤组织中未有明显的积累作用，以及替莫泊芬在给药后12h～24h时在肿瘤组织中的积累量达到最大值，并在体内的代谢时间依然长达8d。
另外，各个肿瘤模型的小鼠在给药后24h时被处死，并取出各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾及肿瘤和肌肉组织，并直接在动物活体成像仪中进行对比观察。如图15E所示，给药后24h，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA在KB、A431和NCI-N87肿瘤组织和肾脏组织中均有大量富集，而在肝脏组织中含量较少。绝大部分的Pyro累积在肝脏组织中。替莫泊芬虽然也聚集在肿瘤组织部位，但也大量地累积在肝、肺、肾等组织中。如图15D所示，在KB、A431和NCI-N87肿瘤小鼠模型中，尾静脉给药后2h时，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA在肿瘤组织中的积累量与在解剖出的所有组织中的总积累量的比值均是最高的。
以上实验结果表明，注射相同剂量药物的情况下，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA在多种肿瘤模型中均具有较强的肿瘤富集能力，并且在体内的循环时间相对较短。
4.Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA分别对KB、A431和NCI-N87移植瘤小鼠的肿瘤光动力治疗效果
使用具有不同叶酸受体表达量的KB、A431、NCI-N87肿瘤模型研究Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA的治疗效果。
将3×106个KB细胞皮下接种于小鼠的背部右侧。在大约18d后，小鼠的肿瘤体积达到约200mm3。将KB移植瘤小鼠随机分为如下5组：(1)200μL PBS/光+(光照)(对照组)；(2)60nmol Pyro/光-(不光照)；(3)60nmol Pyro/光+(光照)；(4)60nmol Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA/光-(不光照)；和(5)60nmolPyro-Lys-(L1)3-Glu-FA/光+(光照)，每组5只小鼠(每只小鼠静脉给药的DMSO含量为3％)。各光照组给予的光照能量为120J/cm2(200mW/cm2，10min)。将尾静脉给药后2h作为小鼠光动力治疗的照射时间点。每两天用游标卡尺记录小鼠肿瘤的体积变化，并记录小鼠的体重变化。当小鼠的肿瘤体积达到1500mm3时，小鼠被认为死亡并停止记录，持续观察小鼠至95天。
用上述方法分别在小鼠皮下接种3×106个A431或NCI-N87肿瘤细胞，并将小鼠随机分为如下三组(每组5只)：(1)PBS/光+(光照)；(2)60nmolPyro/光+(光照)；和(3)60nmolPyro-Lys-(L1)3-Glu-FA/光+(光照)。在尾静脉给药后2h时将660nm波长的光以200mW/cm2照射肿瘤组织部位10min，并每两天监测小鼠的肿瘤体积和小鼠体重变化。小鼠的肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝长×宽2×0.5。
实验结果与结论：如图16A所示，给予光照后，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA/光+组的小鼠肿瘤附近出现炎性水肿，2d后水肿情况得到缓解，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA/光+组的小鼠肿瘤部位结痂且肿瘤体积开始缩小，两周后痂掉落完全且肿瘤消失，持续观察95天未见复发。而Pyro/光+组的小鼠肿瘤部位炎症较轻，2d后水肿几乎消退，没有结痂现象，肿瘤体积在短时间内得到抑制；但在10d后肿瘤体积快速增长。PBS/光+组的小鼠在光照后皮肤未出现水肿现象，并且肿瘤体积与只给药不光照组(Pyro/光-组和Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA/光-组)的小鼠的肿瘤体积一样快速增长，在光照或给药后约18d时肿瘤体积很快达到1500mm3。在没有光照或光敏剂的实验组中，均没有产生对肿瘤体积增长的抑制作用。
用上述方法分别对A431和NCI-N87移植瘤小鼠进行光动力治疗。
Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA/光+组的小鼠在光照后也出现水肿现象，并且小鼠的肿瘤体积逐渐缩小，但是在第一次光动力治疗后的15～25天内，一些小鼠的肿瘤再次增长。当复发瘤长至约100mm3时，分别对复发瘤进行第二次给药治疗(同样是尾静脉给药60nmol，给药后2h给予光照能量200J/cm2)。在之后监测的两个月里，肿瘤没有再出现复发的迹象。
对于Pyro组，用相同的条件进行光动力治疗。如图16B和16C所示，在给予光照后，A431和NCI-N87肿瘤的生长也在短时间内被抑制，但很快就继续增长至1500mm3。实验结果表明，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA具有在肿瘤组织中特异性富集的能力，因此以Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA为光敏剂的光动力治疗效果优于Pyro的治疗效果。
通过监测小鼠的体重变化来间接监测在光动力治疗过程中测试化合物对小鼠的生理状态造成的影响。如图16A、16B和16C中的第一列图所示，在KB、A431和NCI-N87肿瘤模型小鼠中，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA/光+组的小鼠体重均在第一次治疗后10d有降低的趋势，但随后体重慢慢增加，直至跟其余各组的小鼠体重一样，趋于平稳，并呈缓慢上升的趋势。该组小鼠经过一次或两次光动力治疗后存活率均可达到100％。
因此，Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA是一种高效的具有低毒副作用的可用于抗肿瘤的光动力治疗的光敏剂。
5.Pyro和Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA对KB移植瘤小鼠的急性毒性试验评价
体重为18～20g的雌性BALB/c裸鼠在给药前禁食6h，然后将小鼠分为三组(每组5只)：(1)5μL DMSO+1μL蓖麻油，避光；(2)500nmol Pyro+1μL蓖麻油，避光；和(3)500nmolPyro-Lys-(L1)3-Glu-FA，避光。每隔2d给一次药，共给药4次，每天检测各组小鼠的体重变化，并监测小鼠的生理反应及行为表现。
实验结果与结论：如图17所示，尾静脉注射为500nmol的高剂量药物4次后，在不给予任何光照的情况下，小鼠的体重呈维持状态，并且没有发生死亡现象。每次给药后，各组小鼠均没有出现恶心、流涎、呕吐等中毒现象，也没有明显的躁动行为。因此，可初步认为光敏剂Pyro和Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA在小鼠体内的毒性较小，为后续Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA的开发提供了潜在的可能。
上文对本申请中涉及的一般性描述和对其具体实施方案(包括实施例)的描述不应理解为对本发明技术方案构成限制。在不违背所涉及的发明构成要素的前提下，本领域所属技术人员根据本发明可以对上文一般性描述或/和具体实施方案(包括实施例)中公开的技术特征进行增加、减少或组合，形成属于所属发明的其它技术方案，它们也同样在本发明的保护范围。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.通式(I)的光敏剂或其药学上可接受的盐：
A-Lys-(L)m-(B)o-C
(I)
其中
A和C独立地选自叶酸基团和卟吩型光敏部分，并且当A和C中的任一个为叶酸基团时，则另一个为卟吩型光敏部分；
Lys表示
Figure FDA0002083987310000011
L表示连接子，其独立地选自L1或L2；
Figure FDA0002083987310000012
B表示酸性氨基酸片段；
m为1-5的整数；
o为0或1；以及
p为4-8的整数。
2.如权利要求1所述的光敏剂，其中所述叶酸基团具有如下结构：
Figure FDA0002083987310000013
3.如权利要求1或2所述的光敏剂，其中所述卟吩型光敏部分独立地选自Pyro的基团、Ce6的基团、HPPH的基团和Vertoporfin的基团，优选为Pyro的基团，所述Pyro的基团优选地具有结构
Figure FDA0002083987310000014
Figure FDA0002083987310000021
4.如权利要求1-3中任一项所述的光敏剂，其中所述酸性氨基酸片段为谷氨酸片段或天冬氨酸片段；所述谷氨酸片段优选地具有结构
Figure FDA0002083987310000022
以及所述天冬氨酸片段优选地具有结构
Figure FDA0002083987310000023
5.如权利要求1-4中任一项所述的光敏剂，m优选为2、3、4或5，更优选为3或5；最优选为3；o优选为1；所述L2中的重复单元-CH2CH2O-的个数p为4、5、6、7或8，优选为6。
6.如权利要求1所述的光敏剂，其中-(L)m-(B)n-具有如下结构之一：
Figure FDA0002083987310000024
Figure FDA0002083987310000031
7.如权利要求1所述的光敏剂，其中所述通式(I)的光敏剂选自如下化合物之一或其药学上可接受的盐：
Pyro-Lys-L1-FA：
Figure FDA0002083987310000032
Pyro-Lys-(L1)2-FA：
Figure FDA0002083987310000033
Pyro-Lys-(L1)3-FA：
Figure FDA0002083987310000034
Pyro-Lys-(L1)4-FA：
Figure FDA0002083987310000041
Pyro-Lys-(L1)5-FA：
Figure FDA0002083987310000042
Pyro-Lys-(L1)5-Glu-FA：
Figure FDA0002083987310000043
Pyro-Lys-(L1)3-Glu-FA：
Figure FDA0002083987310000044
Pyro-Lys-(L2)3-Glu-FA：
Figure FDA0002083987310000045
Pyro-Lys-(L1)3-Asp-FA：
Figure FDA0002083987310000051
8.制备权利要求1-7中任一项所述的光敏剂的方法，其包括：
1)合成连接子L；
2)使m个连接子L与Lys连接以获得片段Lys-(L)m；
3)任选地使片段Lys-(L)m与酸性氨基酸片段B连接以获得片段Lys-(L)m-(B)o；
4)将片段Lys-(L)m-(B)o与叶酸FA连接以获得片段Lys-(L)m-(B)o-FA；以及
5)将片段Lys-(L)m-(B)o-FA与卟吩型光敏化合物PS连接以获得通式(I)的光敏剂；或者
6)将片段Lys-(L)m-(B)o与卟吩型光敏化合物连接以获得片段Lys-(L)m-(B)o-PS；以及
7)将片段Lys-(L)m-(B)o-PS与叶酸FA连接以获得通式(I)的光敏剂；
其中Lys、L、m、B、o、FA和PS如权利要求1-7中任一项所定义。
9.权利要求1-7中任一项所述的光敏剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
10.权利要求1-7中任一项所述的光敏剂在制备肿瘤成像诊断试剂中的用途。
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