WO2022065942A1 - 의료기기 코팅용 조성물 - Google Patents

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WO2022065942A1
WO2022065942A1 PCT/KR2021/013104 KR2021013104W WO2022065942A1 WO 2022065942 A1 WO2022065942 A1 WO 2022065942A1 KR 2021013104 W KR2021013104 W KR 2021013104W WO 2022065942 A1 WO2022065942 A1 WO 2022065942A1
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coating
medical device
composition
stent
blue
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PCT/KR2021/013104
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Inventor
나건
이상희
박진환
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • A61F2/82—Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light

Definitions

  • an object of the present invention is to provide a composition for coating a medical device comprising an endoscopic pigment and a mixed solvent in which the endoscopic pigment is dispersed, and a stent coated with the composition.
  • Methylene blue is a strong cationic photocatalyst that best absorbs light at a wavelength of 670 nm. It can be used for photodynamic therapy because it forms active oxygen when it receives light with a wavelength of 600 nm, and its price is also relatively low. Methylene blue is administered together with saline and epinephrine in endoscopic polyp removal and is used to stain the mucous membrane around polyps. When a polyp is removed, the surrounding tissue is also removed, which in some cases makes it possible to determine whether the benefit of removing the polyp is greater or the risk of tissue damage is greater. In addition, it is used as a dye in chromoendoscopy to distinguish the digestive tract and to distinguish dysplastic cells or cancer-causing cells.
  • the mixed solvent is methanol, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, purified water, ethyl acetate, tetrahydrofuran (tetrahydropuran) and the group consisting of ethanol (ethanol) can be selected from
  • the miscible solvent may vary depending on the medical dye and/or the coating solvent.
  • the miscible solvent may be methanol.
  • indocyanine green when used as an endoscopic dye, the miscible solvent may vary depending on the coating solvent. If the coating solvent is xylene, the miscible solvent is methanol, and if the coating solvent is tetrahydrofuran, the miscible solvent may be dimethylformamide. there is.
  • the present inventors disperse the medical dye in a mixed solvent to which a surfactant is added or not added, and mix it with a coating solvent and a polymer for coating medical devices and coat the stent, so that the medical dye is uniformly coated on the surface of the medical device, It was confirmed that the loss rate also decreased ( FIGS. 13 , 18 and 19 ).
  • the composition for coating a medical device may have a unit mass ratio per medical device area of 0.1 to 50 ⁇ g/cm 2 or a unit mass ratio per medical device weight 0.01 to 5 ⁇ g/ml.
  • 7a is a photograph confirming whether indocyanine green is dissolved after dissolving it in various miscible solvents in order to improve the solubility in xylene.
  • 11 is a result of confirming the phototoxicity of cells according to the presence or absence of light irradiation of methylene blue and toluidine blue.
  • 12A is an optical photograph and a fluorescence photograph of a photoresponsive stent coated with methylene blue or toluidine blue having improved solubility in xylene.
  • 12B is an optical photograph and a fluorescence photograph of a photoresponsive stent coated with methylene blue or toluidine blue with improved solubility in tetrahydrofuran.
  • the photoresponsive stent prepared in Example 3 was coated without being completely dissolved in the solvent because the solvent miscibility was not improved, and it was confirmed that the particle shape was attached to the surface. It was found that this had an effect on the subsequent dissolution experiment, and the surface became more rough after dissolution for 2 weeks.
  • the photoresponsive stent prepared in Example 4 was uniformly coated with improved miscibility, and thus particles were not observed on the surface. Therefore, it is judged that it is necessary to improve the optimum solvent miscibility in the coating material.
  • the amount of methylene blue coated on the photoresponsive stent prepared in Example 3 was 39.3 ⁇ g when silicone was used, and 123.2 ⁇ g when polyurethane was used.
  • the amount of coated toluidine blue was 53.3 ⁇ g when silicone was used and 141.8 ⁇ g when polyurethane was used.
  • the amount of methylene blue coated on the photoresponsive stent prepared in Example 4 was 225.4 ⁇ g when silicone was used, and 538 ⁇ g when polyurethane was used.
  • the amount of coated toluidine blue was 219.8 ⁇ g when silicone was used and 424.7 ⁇ g when polyurethane was used ( FIG. 14 ).
  • the stent piece was placed in the RF cuvette, and 2 ml of a test solution in which Singlet oxygen sensor green (SOSG, Thermofisher science) capable of detecting active oxygen was dissolved was put into the RF cuvette.
  • SOSG solution was prepared using distilled water to a final concentration of 10 ⁇ M in distilled water.
  • a total of 10 J (W s/cm2) was irradiated by repeatedly irradiating 671 nm light at an intensity of 20 mW/cm2 for 20 seconds.
  • Ex/Em 504/525 using a radio frequency spectrometer every 20 seconds. The fluorescence intensity was detected in the wavelength band of nm.
  • the photoresponsive stent with improved solvent miscibility prepared in Example 4 showed almost no difference in SOSG fluorescence intensity in the first measurement result and the second measurement result when xylene was used as the coating solvent (FIG. 15). ).
  • the SOSG fluorescence intensity was slightly decreased in the second measurement result compared to the first measurement result (FIG. 16).
  • the fluorescent dye Before the solubility of the fluorescent dye was improved, the fluorescent dye was eluted in an excessive amount in the initial stage, and thus the ability to form active oxygen was also initially high. However, the ability to form active oxygen is significantly different from the second measured value, but it is not suitable for repeated use of the stent. However, when the solubility is improved, since random dissolution does not occur, the first measured value and the second measured value are similarly measured, suggesting that it is suitable for repeated use.
  • the methylene blue coated on the stent membrane can kill the cells in direct contact with the stent fragment by simply irradiating light.
  • the light intensity was 5 J, all of the effects were shown except for the stent membrane coated at 0.05 mg/ml, and it was confirmed that the stronger the light intensity, the higher the concentration of the coating solution, the more the cells were killed.
  • fluorescence in vivo imaging system (Fluorescence in vivo imaging system, Suwon, Korea) was used using the fluorescence properties of chlorine e6 and hematoporphyrin.
  • a phosphate buffer solution pH 7.0, 37° C.
  • unmodified single chlorine e6 Considering that and single hematoporphyrin is a hydrophobic drug, it was tested in a phosphate buffer solution containing a surfactant (0.1% Tween20, pH 7.0, 37°C).
  • the phosphate buffer solution containing the silicone film was stirred at 50 rpm, The eluted material was subjected to UV quantitative analysis.

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Abstract

본 발명은 의료용으로 사용되고 있는 색소를 포함하는 의료기기 코팅용 조성물에 관한 것으로 상기 조성물을 사용하면 의료용 색소를 의료기기 표면에 고르게 분산시킬 수 있어 의료용 색소의 유지 기간이 현저히 증가하고, 활성산소 생성 효과 또한 우수하므로 광역학 치료 효과를 극대화시킬 수 있으며, 의료기기에서 유실된 색소의 체내 순환에 따른 독성에 관한 우려를 해소할 수 있다.

Description

의료기기 코팅용 조성물
본 발명은 의료용으로 사용되고 있는 색소를 포함하는 의료기기 코팅용 조성물에 관한 것이다.
광역학 치료(photodynamic therapy, PDT)는 광민감성 소재인 광감각제 (photosensitizer)를 이용한 의학적 치료방법이다. 광감각제는 특정 파장의 레이저를 조사하면 주변에 있는 산소를 통해 화학적 반응을 통해 활성산소를 형성하고, 주변 세포들을 산화 스트레스에 의해 일시적인 교란을 주거나 사멸을 일으킨다. 광역학 치료는 주로 암을 치료하기 위한 목적으로 많은 선행연구가 이루어졌으나, 바이러스 및 세균 등의 조절하고자 하는 생물체에 모두 접목할 수 있다. 따라서, 암뿐만 아니라 다양한 질병에 접목 가능한 치료방법이다. 위장관에 광역학 치료를 적용하기 위해서는 먼저 광감각제가 살포되어야 한다. 하지만, 복용 및 살포된 광감각제는 체액의 흐름에 의해 빠른 시간 내에 흘러내려가 생체내 이용률이 매우 낮다는 한계점이 존재한다.
또한, 임상에서 사용되고 있는 광감각제인 포르피린계 화합물, 클로린계 화합물, 박테리오클로린계 화합물, 프탈로시아닌계 화합물, 나프탈로시아닌계 화합물 및 5-아미노레블린 에스테르계 화합물 등은 비교적 고가의 약물이며, 난용성 물질로 여러 가지 응용에 제한점을 지닌다. 아울러 상기 광감각제를 이용한 수많은 연구가 진행되었지만, 임상 사례가 비교적 부족하며 국내 식품의약품안전처에서 허가 받은 약물은 포르피린계 화합물 단 한가지이다.
따라서, 광역학 치료를 효율적으로 수행하기 위해서는 광감각제의 제형을 변화시켜 단점을 개선하거나, 광감각제 이외에 다른 물질을 사용하거나 광역학 치료의 시술법을 변화시키는 등의 방법이 필요하다.
본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하고자 한 것으로 생체내 이용률이 낮은 광감각제 대신 색소 내시경이나 세포 및 조직 염색에 이용되는 색소를 광역학 치료에 이용할 수 있는 방법을 연구하였다. 구체적으로 내시경용 색소를 광역학 치료에 사용되는 스텐트에 코팅할 수 있는 방법을 연구하였고, 코팅 용매에서 가용성이 낮은 내시경용 색소를 혼화 용매에 먼저 분산시킨 후 코팅 용매 및 의료기기 코팅용 고분자와 혼합하여 스텐트에 코팅시키면 색소를 스텐트 표면에 고르게 코팅할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 내시경용 색소 및 내시경용 색소가 분산되는 혼화 용매를 포함하는 의료기기 코팅용 조성물과 상기 조성물로 코팅된 스텐트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 의료용 색소 및 상기 의료용 색소가 분산되는 혼화 용매를 포함하는 의료기기 코팅용 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, "의료용 색소"는 현재 의료계에서 색소 내시경, 조직 염색 등에 사용되고 있는 안정성이 입증된 색소로서 빛을 조사하면 활성산소를 생성하는 색소를 말한다.
본 발명에서, 상기 의료용 색소는 혼화 용매 100중량부에 1 내지 40중량부로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로는 혼화 용매 100중량부 당 5 내지 30 중량부로 포함될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 혼화용매 1 ㎖ 당 내시경용 색소를 10 내지 20 ㎎ 포함할 수 있으며, 의료기기 코팅용 조성물에는 내시경용 색소를 최종 농도 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 활성산소 생성량은 의료기기에 코팅된 내시경용 색소의 농도와 비례하여 증가하나 일정 농도 이후에는 오히려 소실되거나 더 이상 증가하지 않는 포화상태를 보인다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 의료용 색소는 메틸렌블루 (methylen blue), 톨루이딘블루 (toluidin blue), 인도시아닌 그린 (indocyanine green), 프탈로시아닌 (phthalocyanine), 에리스로신 (erythrosin), 로즈벵갈 (rose bengal), 클로린e6 및 헤마토포르피린으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
메틸렌블루는 강력한 양이온성 광촉매로 파장 670 ㎚ 부근의 빛을 가장 잘 흡수하며, 흡수량과 최대 흡수점은 메틸렌블루의 고차 응집체 물질 흡착 여부와 농도 등에 따라 결정된다. 600 ㎚ 파장의 빛을 받았을 때 활성산소를 형성하므로 광역학 치료에 사용될 수 있으며, 가격 또한 비교적 저렴하다. 메틸렌블루는 내시경 용종 제거술에서 생리식염수, 에피네프린과 함께 투여되며 용종 주위의 점막 염색을 위해 사용된다. 용종을 제거할 때 주변 조직이 함께 제거되는데, 경우에 따라 용종 제거의 이득이 더 큰지 조직 손상으로 인한 위험이 더 큰지 판단할 수 있게 한다. 또한, 색소 내시경 (chromoendoscopy)에서 염료로 사용되어 소화관의 구분과 이형성 세포 또는 암 발병 가능 세포를 분별하는 용도로 쓰인다.
메틸렌블루와 같은 색소류는 매우 낮은 농도에서도 선명한 색을 나타내어 의료기기에 코팅 시 생체 내 조직과 색상이 대비되므로 의료기기의 조작을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 클로린e6 및 헤마토포르피린은 친수성으로 개질화될 수 있다. 보다 구체적으로 클로린e6는 메톡시폴리에틸렌글리콜2K, - 메톡시폴리에틸렌글리콜5K, 메톡시폴리에틸렌글리콜30K, 플루로닉F68, 플루로닉F127과 접합되어 친수성이 증가할 수 있고, 헤마토포르피린은 플루로닉F127과 접합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "혼화 용매"는 의료용 색소가 코팅 용매와 잘 혼합될 수 있도록 의료용 색소를 분산시키는 용매를 말한다.
본 발명자들은 상기 의료용 색소를 의료기기 코팅에 사용되는 용매(코팅 용매)인 자일렌 및 테트라하이드로푸란에 용해시켰고, 메틸렌블루 및 톨루이딘블루 모두 거의 용해되지 않는 것을 확인하였다 (도 1). 이에 가용성(용해도)을 높이기 위해 다양한 혼화 용매에 의료용 색소를 분산시키고, 이를 다시 코팅 용매와 혼합하면 의료용 색소의 가용성이 증가하는 것을 확인하였다 (도 2 내지 9).
본 발명에서, 상기 혼화 용매는 메탄올 (methanol), 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide), 디메틸포름아미드 (dimethylformamide), 정제수, 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 테트라하이드로푸란 (tetrahydropuran) 및 에탄올 (ethanol)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 혼화 용매는 의료용 색소 및/또는 코팅 용매에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 내시경용 색소로 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 사용하면 혼화 용매는 메탄올일 수 있다. 또한, 내시경용 색소로 인도시아닌 그린을 사용하면 혼화 용매는 코팅 용매에 따라 달라질 수 있으며, 코팅 용매가 자일렌이면 혼화 용매는 메탄올, 코팅 용매가 테트라하이드로푸란이면 혼화 용매는 디메틸포름아미드일 수 있다. 내시경용 색소가 프탈로시아닌일 때 혼화 용매는 코팅 용매가 자일렌이면 디메틸설폭사이드 또는 디메틸포름아미드일 수 있고, 코팅 용매가 테트라하이드로푸란이면 정제수, 에틸 아세테이트 또는 에탄올일 수 있다.
본 발명자들은 계면활성제가 첨가되거나 첨가되지 않은 혼화 용매에 의료용 색소를 분산시키고, 이를 코팅 용매 및 의료기기 코팅용 고분자와 혼합하여 스텐트에 코팅시키면 의료용 색소가 의료기기 표면에 균일하게 코팅되고, 색소의 유실률 또한 감소하는 것을 확인하였다 (도 13, 18 및 19).
따라서, 상기 의료기기 코팅용 조성물은 계면활성제, 코팅 용매 및 의료기기 코팅용 고분자를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "코팅 용매"는 의료기기 코팅용 고분자를 분산시키는 데 사용되는 용매이며, 의료기기에 고분자를 코팅시킨 후에는 휘발시켜 제거한다.
본 발명에서, 상기 코팅 용매는 자일렌 (xylene), 테트라하이드로푸란 (tetrahydrofuran), 다이클로로메테인 (dichloromethane), 부틸 알코올 (butanol), 나프타 (naphtha), 헥세인 (hexane), 헵테인 (heptanes) 및 아세톤 (acetone)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 코팅 용매는 자일렌 또는 테트라하이드로푸란일 수 있다.
본 발명에서, 상기 의료기기 코팅용 고분자는 실리콘 혼화물, 메티콘 (methicone), 디메티콘 (dimethicone), 사이클로메티콘 (cyclomethicone), 폴리실리콘 (polysilicone), 사이클로펜타실록산 (cyclopentasiloxane) 디메티콘 코폴리울 (dimethicone copolyol) 및 이의 유도체, 디메티코놀(dimethiconol) 및 이의 유도체, 폴리우레탄 (polyurethane) 및 이의 유도체, 티타니움나이트라이드 옥사이드(titanium nitride oxide), 카보필름 (carbofilm), 나일론 (nylon), 및 테프론 (teflon)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 의료기기 코팅용 고분자는 실리콘 혼화물 또는 폴리우레탄일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 의료기기 코팅용 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 내시경용 색소 0.001 내지 0.02 중량부, 혼화용매 0.5 내지 10 중량부, 의료기기 코팅용 고분자 7 내지 85 중량부, 코팅용매 0 내지 80 중량부 및 계면활성제 0 내지 10 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 의료기기 코팅용 조성물은 스테인리스 스틸 (stainless steel), 코발트-크롬 합금 (cobalt chrome), 탄탈륨 (tantalum), 니티놀 (nitinol) 및 금 (gold)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 재질로 이루어진 의료기기에 적용될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 의료기기는 스텐트일 수 있으며, 비혈관 및 혈관계 스텐트를 포함할 수 있다.
본 발명자들은 상기 메틸렌블루 또는 톨루이딘 블루를 포함하는 의료기기 코팅용 조성물로 스텐트를 코팅한 후 코팅된 색소의 양을 확인하였다. 그 결과, 색소의 가용성을 개선시키지 않고 코팅시킨 스텐트와 비교하여 가용성을 개선하여 코팅시킨 스텐트에 메틸렌블루 또는 톨루이딘 블루가 더 많이 코팅된 것을 확인하였다 (도 14). 구체적으로 가용성 개선 전과 비교하여 단위 면적당 코팅되는 색소의 양이 약 4배 내지 5배 증가하였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 의료기기 코팅용 조성물은 의료기기 면적당 단위질량비가 0.1 내지 50 ㎍/㎠ 또는 의료기기 무게당 단위 질량비가 0.01 내지 5 ㎍/㎖일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 의료기기 코팅용 조성물로 코팅된 광응답성 스텐트를 제공한다. 상기 광응답성 스텐트는 의료용 색소가 표면에 균일하게 도포되어 있어 색소의 유지기간이 길고, 활성산소 생성능 또한 우수한 특성을 가진다. 활성산소는 위장암, 췌장암, 십이지장암 및 대장암 등의 암 치료뿐만 아니라 비만 및 대사질환을 치료하는 것을 목적으로 하는 의료기기에 응용 가능하다.
본 발명에 따른 의료기기 코팅용 조성물은 의료용 색소를 의료기기 표면에 고르게 분산시킬 수 있어 의료용 색소의 유지 기간이 현저히 증가하고, 활성산소 생성 효과 또한 우수하므로 광역학 치료 효과를 극대화시킬 수 있으며, 의료기기에서 유실된 색소의 체내 순환에 따른 독성에 관한 우려를 해소할 수 있다.
도 1은 메틸렌블루 및 톨루이딘블루를 물, 자일렌 및 테트라하이드로푸란에 각각 용해시켜 가용성을 확인한 결과이다.
도 2는 메틸렌블루의 가용성을 개선하기 위해 다양한 혼화 용매에 용해시킨 후 용해 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 메틸렌블루의 가용성을 개선하기 위해 다양한 혼화 용매에 용해시킨 후 용해 여부를 확인한 사진이다.
도 4는 톨루이딘블루의 가용성을 개선하기 위해 다양한 혼화 용매에 용해시킨 후 용해 여부를 확인한 결과이다.
도 5a는 톨루이딘블루의 자일렌에서의 가용성을 개선하기 위해 다양한 혼화 용매에 용해시킨 후 용해 여부를 확인한 사진이다.
도 5b는 톨루이딘블루의 테트라하이드로푸란에서의 가용성을 개선하기 위해 다양한 혼화 용매에 용해시킨 후 용해 여부를 확인한 사진이다.
도 6은 인도시아닌 그린의 가용성을 개선하기 위해 다양한 혼화 용매에 용해시킨 후 용해 여부를 확인한 결과이다.
도 7a는 인도시아닌 그린의 자일렌에서의 가용성을 개선하기 위해 다양한 혼화 용매에 용해시킨 후 용해 여부를 확인한 사진이다.
도 7b는 인도시아닌 그린의 테트라하이드로푸란에서의 가용성을 개선하기 위해 다양한 혼화 용매에 용해시킨 후 용해 여부를 확인한 사진이다.
도 8은 알루미늄 프탈로시아닌의 가용성을 개선하기 위해 다양한 혼화 용매에 용해시킨 후 용해 여부를 확인한 결과이다.
도 9a는 알루미늄 프탈로시아닌의 자일렌에서의 가용성을 개선하기 위해 다양한 혼화 용매에 용해시킨 후 용해 여부를 확인한 사진이다.
도 9b는 알루미늄 프탈로시아닌의 테트라하이드로푸란에서의 가용성을 개선하기 위해 다양한 혼화 용매에 용해시킨 후 용해 여부를 확인한 사진이다.
도 10은 메틸렌블루와 톨루이딘블루의 빛 조사 유무에 따른 활성산소 형성능을 확인한 결과이다.
도 11은 메틸렌블루와 톨루이딘블루의 빛 조사 유무에 따른 세포 광독성을 확인한 결과이다.
도 12a는 자일렌에서의 가용성이 개선된 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 코팅한 광응답성 스텐트의 광학 사진 및 형광 사진이다.
도 12b는 테트라하이드로푸란에서의 가용성이 개선된 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 코팅한 광응답성 스텐트의 광학 사진 및 형광 사진이다.
도 13은 가용성이 개선된 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 코팅한 광응답성 스텐트의 표면을 용출 시험 전후로 확인한 결과이다.
도 14는 가용성이 개선된 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 코팅한 광응답성 스텐트에서 표면에 코팅된 형광 색소의 양을 정량한 결과이다.
도 15는 가용성이 개선된 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 실리콘으로 코팅한 광응답성 스텐트에서 빛 조사에 따른 활성산소 형성능을 확인한 결과이다.
도 16은 가용성이 개선된 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 폴리우레탄으로 코팅한 광응답성 스텐트에서 빛 조사에 따른 활성산소 형성능을 확인한 결과이다.
도 17은 가용성이 개선된 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 코팅한 광응답성 스텐트에서 빛의 반복 조사에 따른 활성산소 형성능을 확인한 결과이다.
도 18은 가용성이 개선된 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 실리콘으로 코팅한 광응답성 스텐트를 인산완충용액에 담근 후 시간에 따른 형광 색소 유실율을 확인한 결과이다.
도 19는 가용성이 개선된 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 폴리우레탄으로 코팅한 광응답성 스텐트를 인산완충용액에 담근 후 시간에 따른 형광 색소 유실율을 확인한 결과이다.
도 20은 가용성이 개선된 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 코팅한 광응답성 스텐트를 단일 세포층 위에 얹고, 빛을 조사하여 세포 사멸 유무를 확인한 결과이다.
도 21은 스텐트를 친수성으로 개질화된 클로린e6 또는 헤마토포르피린으로 코팅한 후 형광 현미경으로 코팅 여부를 확인한 결과이다.
도 22는 친수성으로 개질화된 클로린e6 또는 헤마토포르피린으로 코팅된 스텐트에서 빛의 세기에 따른 활성산소 형성능을 확인한 결과이다.
도 23은 친수성으로 개질화된 클로린e6 또는 헤마토포르피린으로 코팅된 스텐트의 시간에 따른 형광 색소 유실율을 확인한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 가용화 개선
의료기기에 메틸렌블루 및 톨루이딘블루를 코팅하기 위해서는 이들 색소가 코팅 용매에 잘 용해되어야 한다. 따라서, 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 가용성을 확인하기 위해 의료기기 코팅에 자주 사용되는 물, 자일렌 및 테트라하이드로푸란 (tetrahydrofuran, THF)에 각각 용해시켰다. 그 결과, 메틸렌블루는 물에는 잘 용해되지만 자일렌과 THF에는 전혀 용해되지 않고, 톨루이딘블루는 물에는 잘 용해되지만 자일렌과 THF에서는 거의 용해되지 않는 것을 확인하였다 (도 1). 따라서, 다음과 같이 용해도를 개선하였다.
1-1. 자일렌에서의 가용화 개선
메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 클로로포름, 아세톤, 에탄올, 아세토나이트릴, 이소프로필 알코올, 디메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylforamide) 및 메탄올에 1 ㎎/㎖의 농도로 각각 용해하고, 이의 용해 여부를 비교하였다. 용해되지 않으면 X 용해되면 O로 표기하였으며, 용해 여부는 틴들 효과를 통해 빛의 산란 여부로 판단하였다. 다양한 혼화 용매에 용해시킨 결과, 메틸렌블루 및 톨루이딘블루 모두 메탄올을 제외한 혼화 용매에서는 용해가 이루어지지 않았다. 또한, 톨루이딘블루는 메탄올에 용해되더라도 안정성이 떨어져 한 시간 후에 응집이 관찰되었다. 이에 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 메탄올이 0.5 내지 20.0% 포함된 자일렌 1 ㎖에 0.1 ㎎/㎖로 용해하여 잘 혼화되는 범위를 확인하였고, 안정성이 떨어지면 계면활성제를 0.2 내지 1.0%로 보완하여 스텐트 코팅에 응용하였다 (도 2의 A, 도 3의 A, 도 4의 A 및 도 5의 A).
1-2. 테트라하이드로푸란에서의 가용화 개선
메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 탈이온수, 에틸아세테이트, 에탄올, 디메틸 술폭시드, 디메틸포름아미드 및 메탄올에 1 ㎎/㎖의 농도로 용해하고 이의 용해 정도를 비교하였다. 용해되지 않으면 X 용해되면 O로 표기하였으며, 용해 여부는 틴들 효과를 통해 빛의 산란 여부로 판단하였다. 메틸렌블루 및 톨루이딘블루 모두 메탄올을 제외한 혼화 용매에서는 용해되지 않았다. 또한, 메틸렌블루는 메탄올에 용해되더라도 한 시간 이내로 안정성이 떨어져 응집이 관찰되었다. 이에 메틸렌블루 및 톨루이딘블루를 메탄올이 0.5 내지 20.0% 포함된 테트라하이드로푸란 1 ㎖에 0.1 ㎎/㎖로 용해하여 잘 혼화되는 범위를 확인하였으며, 분산성을 높이기 위해 트윈계 및 스판계 계면활성제를 보조제로 0.2 내지 1.0%로 사용하였다 (도 2의 B, 도 3의 B, 도 4의 B 및 도 5의 B).
실시예 2: 인도시아닌그린 및 프탈로시아닌의 가용화 개선
2-1. 자일렌에서의 가용화 개선
인도시아닌그린 및 프탈로시아닌을 클로로폼, 아세톤, 에탄올, 아세토나이트릴, 이소프로필 알코올, 메탄올, 디메틸설폭사이드, 및 디메틸포름아미드에 1 ㎎/㎖의 농도로 용해하고, 이의 용해 여부를 비교하였다. 용해되지 않으면 X 용해되면 O로 표기하였으며, 용해 여부는 틴들 효과를 통해 빛의 산란 여부로 판단하였다. 메탄올을 제외한 용액에서는 인도시아닌그린 및 프탈로시아닌의 용해가 이루어지지 않았다. 인도시아닌그린 및 프탈로시아닌을 메탄올이 0.5 내지 20.0% 포함된 자일렌 1 ㎖에 0.1 ㎎/㎖로 용해하여 잘 혼화되는 범위를 확인하였으며, 이를 스텐트 코팅에 응용하고자 하였다 (도 6의 A, 도 7의 A, 도 8의 A 및 도 9의 A).
2-2. 테트라하이드로푸란에서의 가용화 개선
인도시아닌그린 및 프탈로시아닌을 증류수, 에틸아세테이트, 에탄올, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 및 메탄올에 1 ㎎/㎖의 농도로 용해하고 이의 용해 정도를 비교하였다. 용해되지 않으면 X 용해되면 O로 표기하였으며, 용해 여부는 틴들 효과를 통해 빛의 산란 여부로 판단하였다. 디메틸포름아미드를 제외한 용매에서는 용해되지 않았으며, 디메틸포름아미드가 0.5 내지 20.0% 포함된 테트라하이드로푸란 1 ㎖에 0.1 ㎎/㎖로 용해하여 잘 혼화되는 범위를 확인하여 스텐트 코팅에 응용하고자 하였다 (도 6의 B, 도 7의 B, 도 8의 B 및 도 9의 B).
실시예 3: 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루의 용해도가 개선되지 않은 광응답성 스텐트 제조
3-1. 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루와 실리콘 혼화물로 코팅된 광응답성 스텐트 제조
메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 자일렌 1 ㎖에 2.5 ㎎/㎖ 농도로 교반을 통해 섞고, 실리콘 혼화물 4 ㎖을 첨가하여 24시간 교반을 통해 완전히 섞어주었다. 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루가 포함된 실리콘 용액에 스텐트를 딥코팅 방식으로 코팅하고, 자일렌을 제거하기 위해 150℃에서 2시간 휘발하였다. 코팅막의 두께는 마이크로미터기를 사용하여 측정하였으며, 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 코팅 균일성은 형광 이미지 시스템(Fluorescence in vivo imaging system, Neoscience, Suwon, Korea)를 이용해 촬영했다. 스텐트 표면의 매끄러운 정도는 전자현미경을 통해 육안으로 관찰하였다.
3-2. 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루와 폴리우레탄 용액으로 코팅된 광응답성 스텐트 제조
메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 테트라하이드로푸란 5 ㎖에 2.5 ㎎/㎖ 농도로 용해하고, 폴리우레탄 0.4 g을 첨가하여 24시간 교반을 통해 완전히 용해하였다. 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루가 포함된 폴리우레탄 용액에 스텐트를 딥코팅 방식으로 코팅하고, 테트라하이드로푸란을 제거하기 위해 상온에서 6시간 휘발하였다. 코팅막의 두께는 마이크로미터기를 사용하여 측정하였으며, 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 코팅 균일성은 형광 이미지 시스템(Fluorescence in vivo imaging system, Neoscience, Suwon, Korea)를 이용해 촬영했다. 스텐트 표면의 매끄러운 정도는 전자현미경을 통해 육안으로 관찰하였다.
실시예 4: 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 용해도가 개선된 광응답성 스텐트 제조
4-1. 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루와 실리콘 혼화물로 코팅된 광응답성 스텐트 제조
메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 메탄올에 12.5 ㎎/㎖로 용해하고, 이를 자일렌 0.96 ㎖에 0.2 ㎖ 첨가하여 혼화시켰다. 실리콘 혼화물(Nusil, MED-6640) 3.84 ㎖ 및 메틸렌블루가 용해된 자일렌 1.16 ㎖을 혼화하여 내시경용 색소의 최종 농도가 0.5 ㎎/㎖인 스텐트 코팅용액을 제조하였다. 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루가 포함된 스텐트 코팅용액에서 스텐트를 딥코팅 방식으로 코팅하였다. 자일렌 및 메탄올을 제거하기 위해 150℃에서 2시간 동안 휘발하였으며, 코팅막의 두께는 마이크로미터기를 사용하여 측정했다. 메틸렌블루 및 톨루이딘블루 코팅의 균일성은 형광 이미지 시스템(Fluorescence in vivo imaging system, Neoscience, Suwon, Korea)으로 촬영하고, 스텐트 표면의 매끄러운 정도는 전자현미경을 통해 육안으로 관찰하였다.
내시경용 색소의 최종 농도는 0.05, 0.10, 0.50 및 1.00 ㎎/㎖ 농도로 실험을 진행한 후 활성산소 생성량을 고려하여 최종적으로 0.5 ㎎/㎖로 결정하였다.
4-2. 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루와 폴리우레탄 용액으로 코팅된 광응답성 스텐트 제조
메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 메탄올에 50 ㎎/㎖로 용해하고 이 용액을 테트라하이드로푸란 4.95 ㎖에 0.05 ㎖씩 첨가하여 혼화한 뒤, 안정화를 높이기 위하여 0.7%의 트윈20, 트윈80, 또는 스판20을 첨가하였다. 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루가 용해된 테트라하이드로푸란 5 ㎖과 폴리우레탄 400 ㎎을 혼화하여 스텐트 코팅용액을 제조하였다. 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루가 포함된 폴리우레탄 용액에 스텐트를 딥코팅 방식으로 코팅하였다. 테트라하이드로푸란 및 메탄올을 제거하기 위해 25℃에서 6시간 휘발하였으며, 코팅막의 두께는 마이크로미터기를 사용하여 측정했다. 메틸렌블루 및 톨루이딘블루 코팅의 균일성은 형광 이미지 시스템(Fluorescence in vivo imaging system, Neoscience, Suwon, Korea)를 이용하여 촬영하고, 스텐트 표면의 매끄러운 정도를 전자현미경을 통해 육안으로 관찰하였다.
표 1에 본 실시예에서 제조한 가용성이 개선된 코팅 용액의 각 조성물 및 조성비를 기재하였다.
Figure PCTKR2021013104-appb-img-000001
실시예 5: 친수성 클로린e6 및 친수성 헤마토포르피린이 코팅된 광응답성 스텐트 제조
친수성으로 개질화된 클로린e6(예를 들어, 메톡시폴리에틸렌글리콜2K-클로린e6, 메톡시폴리에틸렌글리콜5K-클로린e6, 메톡시폴리에틸렌글리콜30K-클로린e6, 플루로닉F68-클로린e6, 플루로닉F127-클로린e6 등) 및 개질화된 헤마토포르피린 (예를 들어, 플루로닉F127-헤마토포르피린)을 혼화 용매인 테트라하이드로푸란 (클로린e6) 또는 메탄올(헤마토포르피린)에 12.5 ㎎/㎖로 용해하고, 이 용액을 자일렌 0.96 ㎖에 0.2 ㎖ 첨가하여 혼화시켰다. 실리콘 혼화물 3.84 ㎖ 및 자일렌 1.16 ㎖을 혼화하여 스텐트 코팅용액을 제조하여 딥코팅 방식으로 스텐트 조각을 코팅하였다. 자일렌 및 테트라하이드로푸란(또는 메탄올)을 제거하기 위해 150℃에서 2시간 동안 휘발하였으며, 코팅막의 두께는 마이크로미터기로 측정했다. 코팅의 균일성은 형광 이미지 시스템(Fluorescence in vivo imaging system, Neoscience, Suwon, Korea)으로 촬영하였다.
개질화된 클로린e6 또는 헤마토포르피린을 이용한 것은 용매 친화도를 높이고, PEG 또는 플루로닉과 같은 고분자와의 접합으로 분자량이 증가하면 스텐트 표면으로부터 유실률이 감소하기 때문이다. 개질화 방법은 DCC/NHS 촉매를 이용하여 아마이드 결합으로 고분자를 접합시키는 방법을 이용하였다.
실험예 1: 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 활성산소 형성능 확인
1. 실험 목적
형광 색소로서 사용되는 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루가 빛 조사에 따라 활성산소를 형성할 수 있는지 확인하기 위함이다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트의 빛 조사에 따른 활성산소 형성능을 확인하기 위해 일항 산소와 직접적으로 반응하는 형광 탐지 물질인 디메틸안트라센(9, 10-Dimethylanthracene, DMA)과 Singlet oxygen sensor green (SOSG)(InvitrogenTM)을 이용하였다. 디메틸안트라센을 DMSO가 0.8%(부피/부피%) 포함된 증류수에 분산시키고, SOSG는 메탄올이 0.1%(부피/부피%) 포함된 증류수에 분산시켜 활성산소 감지 용액을 제조하였다. 제조된 용액에 광응답성 스텐트를 넣고 670 ㎚ 파장의 빛을 20 ㎽/㎠의 세기로 20초간 반복 조사하여 4J 또는 8J까지 조사했을 때 형성되는 활성산소의 정도를 비교하였다.
3. 결과
메틸렌블루 및 톨루이딘블루 모두 빛의 세기가 강해짐에 따라 발생한 활성산소를 탐지할 수 있는 SOSG의 형광 강도가 증가하는 것을 확인하였다. 반면, DMA와 반응시킨 경우 활성산소가 포집됨에 따라 형광을 잃게 되기 때문에 형광강도가 감소하는 것을 알 수 있었다 (도 10).
4. 결과에 따른 결론
빛을 조사함에 따라 SOSG의 형광 강도는 증가하고, DMA의 형광 강도는 감소하였으므로 활성산소가 많이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, DMA의 형광 강도를 통해 수상 및 유기용매 상에서 메틸렌블루와 톨루이딘블루의 활성산소 형성능이 거의 유사하고, 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루의 농도가 높아짐에 따라 활성산소 형성능이 증진되는 것을 알 수 있었다.
실험예 2: 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 세포 광독성 확인
1. 실험 목적
형광 색소로 사용되는 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루의 세포독성을 확인하고 빛 조사에 의한 세포독성이 있는지 확인하기 위함이다.
2. 실험 재료 및 방법
메틸렌블루 또는 톨루이딘블루의 세포독성을 확인하기 위해 마우스 섬유아세포(L929)와 사람 위 세포(AGS) 세포를 48 웰(well)에 2x104 cells/well의 농도로 각 웰에 0.2 ㎖씩 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 각각의 세포에 다양한 농도의 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액을 교환하면서 빛을 1J, 2J, 5J 또는 10J로 조사하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 세포 생존율은 MTT 시험법으로 확인하였다.
3. 결과
광원을 조사하지 않으면 L929, AGS 세포에서 모두 5 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 세포생존율 50% 이하로 나타났다. 광원을 조사한 경우 조사하지 않은 경우에 비해 생존율이 더 많이 감소하는 것을 확인하였다. 메틸렌블루의 경우 빛의 세기가 강해질수록 더 낮은 세포 생존율을 보였다 (도 11).
4. 결과에 따른 결론
형광 색소인 메틸렌블루와 톨루이딘블루는 광원의 유무에 따라 세포독성 여부에 차이가 있으며, 이는 광응답성 스텐트를 제조하기 위한 후보물질로서의 충분한 특성을 지닌다.
실험예 3: 메틸렌블루 및 톨루이딘블루가 코팅된 광응답성 스텐트 관찰
1. 실험 목적
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트의 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 스텐트 표면 코팅 정도와 코팅의 균일성을 판단하기 위해 광학 이미지, 형광 이미지, 및 전자현미경을 통한 이미지를 확인하기 위한 목적이 있다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트에 코팅된 정도를 판단하기 위하여 형광 색소 자체의 형광 성질을 이용하여 형광 이미지 시스템 (Fluorescence in vivo imaging system, Suwon, Korea)으로 형광 이미지를 촬영하였다. 이미지의 형광강도는 NEOimage 소프트웨어로 정량하였다. 스텐트 표면은 전자현미경으로 3 KV의 조건에서 확인하였다.
3. 결과 확인
실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트의 광학 사진과 형광 사진을 확인한 결과, 색소가 균일하게 코팅된 것을 확인할 수 있었다 (도 12). 또한, 실시예 3에서 제조한 광응답성 스텐트는 표면이 매우 거칠었으며, 2주 간의 용출 후에는 거친 정도가 더욱 고조되었다. 반면 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트는 실시예 3에서 제조한 광응답성 스텐트와 비교하여 매끄러운 표면을 갖는 것을 알 수 있었다. 이는 2주 용출 후에도 매끄럽게 유지되었다 (도 13).
4. 결과에 따른 결론
상기 실시예 3에서 제조한 광응답성 스텐트는 용매 혼화도가 개선되지 않아 용매에 완전히 녹지 못한 채 코팅되어 입자 형태가 표면에 달라붙은 것을 확인할 수 있었다. 이는 이후 용출 실험에도 영향을 미친 것으로 나타났으며, 2주간의 용출 후에는 표면이 더욱 거칠어졌다. 반면, 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트는 혼화도가 개선되어 균일한 코팅이 이루어졌으며, 이에 따라 표면에 입자가 관찰되지 않았다. 따라서, 코팅물질에 있어 최적의 용매 혼화도 개선이 필요한 것으로 판단된다.
실험예 4: 스텐트에 코팅된 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 단위면적당 농도 산출
1. 실험 목적
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트에 코팅된 형광 색소 양을 산출하기 위함이다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트의 박막을 용해하기 위해 실리콘과 혼화된 용액을 이용한 경우 자일렌:메탄올 (7:3) 용액 5 ㎖, 폴리우레탄과 혼화된 용액을 이용한 경우 테트라하이드로푸란 : 메탄올 (7:3) 용액을 5 ㎖을 이용하였다. 제조된 용출 용액에 스텐트를 넣고 250 rpm, 25℃에서 48시간 동안 회전 교반기로 교반하였다. 용해된 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 양은 UV 분광 광도계로 정량하고, 스텐트의 단위면적을 측정해 단위면적 대비 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 양을 산출하였다.
3. 결과 확인
상기 실시예 3에서 제조한 광응답성 스텐트에 코팅된 메틸렌블루의 양은 실리콘을 이용한 경우 39.3 ㎍, 폴리우레탄을 이용한 경우 123.2 ㎍이었다. 코팅된 톨루이딘블루의 양은 실리콘을 이용한 경우 53.3 ㎍, 폴리우레탄을 이용한 경우 141.8 ㎍이었다. 상기 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트에 코팅된 메틸렌블루의 양은 실리콘을 이용한 경우 225.4 ㎍, 폴리우레탄을 이용한 경우 538 ㎍이었다. 코팅된 톨루이딘블루의 양은 실리콘을 이용한 경우 219.8 ㎍, 폴리우레탄을 이용한 경우 424.7 ㎍이었다 (도 14).
4. 결과에 따른 결론
메틸렌블루 또는 톨루이딘블루를 실리콘 또는 폴리우레탄과 혼화하여 딥핑법으로 코팅하였을 때, 용매 혼화도가 개선되지 않은 용액에서 코팅할 때와 비교하여 현저히 많은 양의 형광 색소가 코팅된다.
실험예 5: 메틸렌블루 및 톨루이딘블루가 코팅된 광응답성 스텐트의 활성산소 형성능 비교
1. 실험 목적
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트의 빛 조사 세기에 따른 혈성산소 형성능을 확인하고, 반복 실험을 진행하였을 때 용출된 형광 색소에 의한 형성능의 감소 여부를 비교하기 위함이다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 스텐트 조각을 가로X세로 (1 ㎝ X 1 ㎝ = 1 ㎠)으로 제작하여 실험을 진행하였다. 스텐트 조각을 RF 큐벳에 위치하고, 활성산소를 탐지할 수 있는 Singlet oxygen sensor green(SOSG, Thermofisher science)가 용해된 시험용액을 RF 큐벳에 2 ㎖씩 넣어주었다. SOSG 용액은 증류수에 최종 10 μM의 농도가 되도록 증류수를 이용하여 제작하였다. 671 ㎚의 빛을 20 ㎽/㎠의 세기로 20초씩 반복 조사하여 총 10 J (W·s/㎠) 조사했으며, 20초 조사할 때마다 Radio frequency 분광분석기를 이용하여 Ex/Em = 504/525 ㎚의 파장대에서 형광강도를 검출하였다.
3. 결과 확인
상기 실시예 3에서 제작한 용매 혼화도가 개선되지 않은 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루가 코팅된 스텐트는 코팅 용매와 무관하게 첫 번째 측정 결과 대비 두 번째 측정 결과에서 SOSG 형광강도가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 15 및 도 16).
반면, 상기 실시예 4에서 제조한 용매 혼화도가 개선된 광응답성 스텐트는 코팅 용매로 자일렌을 이용하였을 때 첫 번째 측정 결과와 두 번째 측정 결과에서 SOSG 형광강도가 거의 차이가 없었다 (도 15). 코팅 용매로 THF를 이용하면 첫 번째 측정 결과 대비 두 번째 측정 결과에서 SOSG 형광강도가 다소 감소하였다 (도 16).
또한, 실시예 4에서 제조한 용매 혼화도가 개선된 광응답성 스텐트에 빛을 반복 조사했을 때, 활성산소를 형성할 수 있는지 24시간마다 확인한 결과, 활성 산소가 반복적으로 형성되는 것을 알 수 있었다 (도 17).
4. 결과에 따른 결론
형광 색소의 용해도가 개선되기 전에는 형광 색소가 초기에 과량 용출되어 활성산소 형성능 또한 초기에 높은 것으로 나타났다. 그러나 두 번째 측정값과는 활성산소 형성능이 확연히 차이나 스텐트의 반복 사용에 적합하지 않다. 하지만, 용해도가 개선되면 무작위적인 용출이 발생하지 않기 때문에 첫 번째 측정값과 두 번째 측정값이 유사하게 측정되어 반복 사용에 적합함을 알 수 있다.
실험예 6: 광응답성 스텐트에 코팅된 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 유실률 비교
1. 실험 목적
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트에 코팅된 메틸렌블루 및 톨루이딘블루의 시간에 따른 유실 여부를 확인하기 위함이다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트 표면에 코팅된 친수성 형광 색소 유실 정도를 체내 환경에서 확인하기 위해 스텐트를 인산완충액 (pH 7.0, 37℃에 담그고, 50 rpm으로 교반하였다. 시간의 흐름에 따라 형광사진 촬영 및 용출된 형광 색소를 UV 정량과 함께 진행하였다.
3. 결과 확인
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트의 유실률을 2주 동안 비교하였다. 실리콘과 메틸렌블루를 혼화하여 코팅한 경우 가용화 전에는 총 86.44% (방출량 33.97 ㎍, 초기 코팅량 39.3 ㎍), 가용화 후에는 총 8.59% (방출량 19.36 ㎍, 초기 코팅량 225.4 ㎍)이 형광 색소가 용출되었다. 실리콘과 톨루이딘블루를 혼화하여 코팅한 경우 가용화 전에는 총 57.33% (방출량 30.56 ㎍, 초기 코팅량 53.3 ㎍), 가용화 후에는 총 4.36% (방출량 9.58 ㎍, 초기 코팅량 219.8 ㎍)의 색소가 용출되었다 (도 18 및 표 2).
Figure PCTKR2021013104-appb-img-000002
폴리우레탄과 메틸렌블루를 혼화하여 코팅한 경우 가용화 전에는 총 77.63% (방출량 95.64 ㎍, 초기 코팅량 123.2 ㎍), 가용화 개선 후에는 총 85.65% (방출량 460.80 ㎍, 초기 코팅량 538 ㎍) 용출되었다. 폴리우레탄과 톨루이딘블루를 혼화하여 코팅한 경우 가용화 전에는 총 83.66% (방출량 118.63 ㎍, 초기 코팅량 141.8 ㎍), 가용화 개선 후에는 총 97.68% (방출량 414.85 ㎍, 초기 코팅량 427.85 ㎍) 용출되었다 (도 19 및 표 3).
Figure PCTKR2021013104-appb-img-000003
4. 결과에 따른 결론
실리콘과 메틸렌블루를 혼화하여 코팅한 경우 가용화를 개선함에 따라 2주 후의 유실율이 약 10배 정도 감소하였다. 실리콘과 톨루이딘블루를 혼화하여 코팅한 경우 가용화도를 개선함에 따라 2주 후의 유실율이 약 13배 정도 감소했다. 폴리우레탄과 메틸렌블루를 혼화하여 코팅한 경우 가용화를 개선함에 따라 2주 후의 유실율이 약 10배 정도 감소하였다. 폴리우레탄의 경우 가용화도 개선에 따른 유실율의 변화는 눈에 띄게 관찰되지 않았다. 본 발명의 의료기기 코팅용 조성물을 사용하면 색소의 유지 기간이 월등히 증대하므로 종래의 광역학 치료 효과를 극대화시킬 수 있다.
실험예 7: 메틸렌블루 및 톨루이딘블루가 코팅된 광응답성 스텐트의 빛에 의한 세포 사멸률 확인
1. 실험 목적
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트의 빛에 의한 세포 사멸능을 확인하기 위함이다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 4에서 제조한 광응답성 스텐트의 빛에 의한 세포사멸을 육안으로 확인하기 위해 트립판블루 염색법(Trypan Blue Staining)을 이용하였다. 사람 췌장암세포 (PANC1)을 12wells 세포 배양 플레이트에 5 X 105 cells/well로 분주한다. 24시간 후, 플레이트에 부착된 세포 위에 광응답성 스텐트 조각(7 ㎜ X 7 ㎜, 가로 X 세로)을 올려두고, 670 ㎚의 빛을 1J (50 mW/㎠, 20초) 조사하였다. 30분 후, 4% 트립판블루 용액을 넣어 15분 동안 염색시키고 DPBS를 통해 잔여 트립판블루를 세척한 뒤 현미경을 통해 관찰하였다.
3. 결과 확인
상기 실시예 4에서 제조한 스텐트 막을 단일층으로 형성된 세포 위에 얹어 빛을 조사했을 때 빛의 세기가 높아질수록, 코팅용액의 농도가 높아질수록 트리판블루에 의해 염색된 보라색 세포들이 많이 관찰되어 세포가 사멸된 것을 알 수 있었다 (도 20).
4. 결과에 따른 결론
스텐트 막에 코팅된 메틸렌블루는 단순 빛 조사만으로 스텐트 조각과 직접적으로 맞닿은 세포를 사멸할 수 있다. 빛의 세기가 5 J인 경우 0.05 ㎎/㎖로 코팅된 스텐트막을 제외하고 모두 효과를 보였으며, 빛의 세기가 강해질수록 코팅용액의 농도가 높아질수록 세포가 많이 사멸한 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 개발된 광응답성 스텐트는 빛을 조사함에 따라 활성산소를 형성하므로 스텐트 접촉 부위에서의 세포사멸을 기대할 수 있고, 활성산소는 매우 근접한 거리에서 일시적으로 영향을 미칠 수 있기 때문에, 국소부위의 세포사멸을 기대할 수 있다.
실험예 8: 친수성으로 개질화된 클로린e6가 코팅된 광응답성 스텐트 관찰
1. 실험 목적
상기 실시예 5에서 제조한 광응답성 스텐트의 친수성 클로린e6 및 헤마토포르피린의 스텐트 표면 코팅 정도와 코팅의 균일성을 판단하기 위해 광학 이미지, 형광 이미지를 확인하기 위함이다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 5에서 제조한 광응답성 스텐트에 코팅된 정도를 판단하기 위하여 클로린e6 및 헤마토포르피린의 형광 성질을 이용하여 형광 이미지 시스템 (Fluorescence in vivo imaging system, Suwon, Korea)으로 촬영하였다.
3. 결과에 따른 결론
상기 실시예 5에서 제조한 광응답성 스텐트는 실리콘만 코팅된 대조군(CON)은 형광이 검출되지 않았지만, 광응답제가 코팅된 경우 형광 tlsgh가 검출되었다. 친수성으로 개질화되지 않은 단일 클로린e6와 단일 헤마토포르피린보다 개질화되어 분자량이 커진 클로린e6 및 헤마토포르피린이 더 강한 형광강도로 검출되었다. 클로린e6 및 헤마토포르피린은 화학적 개질화가 진행되었음에도 불구하고 스텐트 표면에 균일하게 잘 코팅되는 것을 확인할 수 있었다 (도 21).
실험예 9: 친수성으로 개질화된 클로린e6가 코팅된 광응답성 스텐트의 활성산소 형성능 확인
1. 실험 목적
상기 실시예 5에서 제조한 광응답성 스텐트의 빛 조사 세기에 따른 혈성산소 형성능을 확인하기 위함이다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 5에서 제조한 스텐트 조각을 가로X세로 (1 ㎝ X 1 ㎝ = 1 ㎠)으로 제작하여 실험을 진행하였다. 스텐트 조각을 RF 큐벳에 위치하고, 활성산소를 탐지할 수 있는 Singlet oxygen sensor green(SOSG, Thermofisher science)가 용해된 시험용액을 RF 큐벳에 2 ㎖식 넣어주었다. SOSG 용액은 증류수에 최종 10μM의 농도가 되도록 제작하였다. 671 ㎚의 빛을 20 mW/㎠의 세기로 20초씩 반복 조사하여 총 8J(W·s/㎠) 조사했으며, 20초 조사할 때마다 RF 분광분석기를 이용하여 Ex/Em = 504/525 ㎚의 파장대에서 형광강도를 검출하였다.
3. 결과 확인 및 결론
상기 실시예 5에서 제조한 메톡시폴리에틸렌글리콜5k-클로린e6, 플루로닉F127-클로린e6, 및 플루로닉F127-헤마토포르피린이 코팅된 스텐트 조각을 이용하여 레이저 조사에 따른 활성산소 형성능을 확인했다. 화학반응을 통한 개질화가 진행되었음에도 불구하고 광응답제의 활성산소 형성능이 유지되는 것을 확인할 수 있었다 (도 22).
실험예 10: 광응답성 스텐트에 코팅된 친수성 클로린e6 및 헤마토포르피린의 유실률 비교
1. 실험 목적
상기 실시예 5에서 제조한 광응답성 스텐트에 코팅된 친수성 클로린e6 및 헤마토포르피린의 시간에 따른 유실 여부를 확인하기 위함이다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 5에서 제조한 광응답성 스텐트 표면에 코팅된 친수성 클로린e6 및 헤마토포르피린의 유실을 체내 환경에서 확인하고자 인산완충액 (pH 7.0, 37℃에서 실험하였다. 대조군으로 개질되지 않은 단일 클로린e6와 단일 헤마토포르피린은 소수성 약물임을 감안하여 계면활성제가 첨가된 인산완충액 (0.1% Tween20, pH 7.0, 37℃에서 실험하였다. 실리콘 필름이 담긴 인산완충액을 50 rpm으로 교반하여, 시간의 흐름에 따라 용출된 물질을 UV 정량 분석하였다.
3. 결과 확인 및 결론
상기 실시예 5에서 제조한 광응답성 스텐트의 유실률을 5일간 비교하였다. 단일 클로린e6의 경우 실리콘 필름을 1.00 ㎎/㎖ 농도의 용액으로 제작한 경우 23.53%, 개질화한 경우 분자량의 증가로 6.01% 유실된 것을 확인할 수 있었다. 단일 헤마토포르피린의 경우 실리콘 필름을 1.00 ㎎/㎖ 농도로 용액을 제작한 경우 14.54%, 개질화한 경우 분자량의 증가로 2.43% 유실된 것을 확인할 수 있었다 (도 23).
따라서, 클로린e6와 헤마토포르피린은 화학적 접합에 의해 개질화되면서 분자량이 증가하여 스텐트 표면에서의 유실율을 감소시킬 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

Claims (12)

  1. 의료용 색소 및 의료용 색소가 분산되는 혼화 용매를 포함하는 의료기기 코팅용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 의료기기 코팅용 조성물은 계면활성제, 코팅 용매 및 의료기기 코팅용 고분자를 추가로 포함하는, 의료기기 코팅용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 의료용 색소는 메틸렌블루 (methylen blue), 톨루이딘블루 (toluidin blue), 인도시아닌 그린 (indocyanine green), 프탈로시아닌 (phthalocyanine), 에리스로신 (erythrosin), 로즈벵갈 (rose bengal), 클로린e6 및 헤마토포르피린으로 이루어진 군에서 선택되는, 의료기기 코팅용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 의료용 색소는 혼화 용매 100중량부에 1 내지 40중량부로 포함되는, 의료기기 코팅용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 클로린e6 및 헤마토포르피린은 친수성으로 개질화된 것인, 의료기기 코팅용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 혼화 용매는 메탄올 (methanol), 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide), 디메틸포름아미드 (dimethylformamide), 정제수, 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 테트라하이드로푸란 (tetrahydropuran) 및 에탄올 (ethanol)로 이루어진 군에서 선택되는, 의료기기 코팅용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 내시경용 색소가 메틸렌블루 또는 톨루이딘블루이면, 혼화 용매는 메탄올인, 의료기기 코팅용 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 코팅 용매는 자일렌 (xylene), 테트라하이드로푸란 (tetrahydrofuran), 다이클로로메테인 (dichloromethane), 부틸 알코올 (butanol), 나프타 (naphtha), 헥세인 (hexane), 헵테인 (heptanes) 및 아세톤 (acetone)으로 이루어진 군에서 선택되는, 의료기기 코팅용 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 상기 의료기기 코팅용 고분자는 실리콘 혼화물, 메티콘 (methicone), 디메티콘 (dimethicone), 사이클로메티콘 (cyclomethicone), 폴리실리콘 (polysilicone), 사이클로펜타실록산 (cyclopentasiloxane) 디메티콘 코폴리울 (dimethicone copolyol) 및 이의 유도체, 디메티코놀(dimethiconol) 및 이의 유도체, 폴리우레탄 (polyurethane) 및 이의 유도체, 티타니움나이트라이드 옥사이드(titanium nitride oxide), 카보필름 (carbofilm), 나일론 (nylon), 및 테프론 (teflon)으로 이루어진 군에서 선택되는, 의료기기 코팅용 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 의료기기는 스텐트인, 의료기기 코팅용 조성물.
  11. 제2항에 있어서, 상기 의료기기 코팅용 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 내시경용 색소 0.001 내지 0.02 중량부, 혼화용매 0.5 내지 10 중량부, 의료기기 코팅용 고분자 7 내지 85 중량부, 코팅용매 0 내지 80 중량부 및 계면활성제 0 내지 10 중량부를 포함하는, 의료기기 코팅용 조성물.
  12. 제1항의 의료기기 코팅용 조성물로 코팅된 광응답성 스텐트.
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