WO2015199378A1 - 폴리감마글루타민산 유도체 및 이를 함유한 제제 - Google Patents

폴리감마글루타민산 유도체 및 이를 함유한 제제 Download PDF

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WO2015199378A1
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vitamin
nanoparticles
phenylalanine
glutamic acid
encapsulated
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PCT/KR2015/006220
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김건우
민현호
김진영
김영봉
오유경
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서울대학교산학협력단
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    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
    • C08G69/08—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids derived from amino-carboxylic acids
    • C08G69/10—Alpha-amino-carboxylic acids
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L77/00—Compositions of polyamides obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L77/04—Polyamides derived from alpha-amino carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to the development of nanoparticles and their basic constituents which can encapsulate poorly soluble bioactives and increase their water dispersibility and oxidative stability.
  • Fat-soluble vitamins which are widely used as cosmetic raw materials, are a group of substances in which poor solubility and low stability are problematic. Fat-soluble vitamins are known to not only normalize the metabolic and physiological functions of the skin, but also have antioxidant effects, promote metabolism, increase immunity, and protect the cell wall even at small doses to the skin (Pierre Stocker et al., Biochimica et. Biophysica Acta, 2003, 1621, 1-8; RF Grimble, International Journal for Vitamin and Nutrition, 1997, 67 (5), 312-320).
  • fat-soluble vitamins play an important role in maintaining skin health, such as sun protection, wrinkle improvement, skin drying and keratin prevention, skin moisturizing, and pigmentation prevention.
  • vitamins include vitamin A (retinol), vitamin D (ergocalcinphenol), vitamin E (tocopherol), vitamin K (phyloquinone), and the like, and derivatives of these fat-soluble vitamins include retinyl palmitate and retinyl acetate.
  • these cosmetic raw materials are very unstable physicochemically, they are easily destroyed by heat, light, oxygen, moisture, and alkali.
  • the efficacy and function of the vitamin itself is reduced or discoloration or odor occurs.
  • a poorly soluble drug means a drug that is difficult to dissolve in water because it contains a hydrophobic part in the structure of the compound, and its practical use is often limited due to poor solubility. More than 41% of new drugs are being stopped due to poor solubility, and about one third of drugs listed in the US Pharmacopeia are classified as poorly soluble drugs. Patent No. 2010-0096038).
  • solubilization may be carried out using salts and surfactants.
  • these methods have a problem in that side effects occur due to the toxicity of the solubilizing solvent.
  • Cremophore a solubilizer used due to the poor solubility of the anticancer drug taxol, has side effects that cause severe anaphylactic reactions, hyperlipidemia, aggregation of erythrocytes, and peripheral neuropathy due to the toxicity of cremerpores. H. Gelderblom et al., European Journal of Cancer, (2001), 37,1590-1598.
  • Nanoparticles of synthetic polymeric materials have been studied as a method of enhancing the solubility in aqueous solutions of poorly soluble materials.
  • synthetic polymer nanoparticles there are few polymer nanoparticles applied in actual clinical practice except poly-lactide-glycolide material due to the toxicity problem of decomposition products during decomposition. It is true.
  • polygamma glutamic acid is a polymer in which DL-glutamic acid is combined with gamma-glutamyl. It is a mucus substance, and polygamma glutamic acid is a bacillus isolated from Cheonggukjang, one of Korean traditional fermented foods, Natto in Japan, and Kinema in Nepal.
  • polygamma glutamic acid is an edible, water-soluble and biodegradable polymer that is already widely used as a raw material for cosmetics as an absorbent and moisturizer (Aditya R Bhat et al., AMB express, 2013, (1), 36; Joerg M. Buescher et al., Critical Reviews in Biotechnology, 2007, 27, 1-19).
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Publication No. 2010-0096038
  • Non-Patent Document 1 Pierre Stocker et al., Biochimica et Biophysica Acta, 2003, 1621, 1-8;
  • Non-Patent Document 2 RF Grimble, International Journal for Vitamin and Nutrition, 1997, 67 (5), 312-320;
  • Non-Patent Document 3 H. Gelderblom et al., European Journal of Cancer, (2001), 37,1590-1598;
  • Non-Patent Document 4 Aditya R Bhat et al., AMB express, 2013, (1), 36;
  • Non-Patent Document 5 Joerg M. Buescher et al., Critical Reviews in Biotechnology, 2007, 27, 1-19
  • Another object of the present invention is to provide a cosmetic raw material and a pharmaceutical raw material in which water dispersibility and oxidative stability of poorly soluble bioactive substances are increased.
  • a nanoparticle comprising the polygamma glutamic acid derivative of (1) as a base material having both a hydrophilic group and a lipophilic group;
  • the fat-soluble vitamin of (4) wherein the fat-soluble vitamin is at least one component selected from the group consisting of vitamin A, vitamin D, vitamin E, and vitamin K, retinyl palmitate, retinyl acetate and tocopherol acetate. Phosphorus nanoparticles;
  • the poorly soluble medicine is at least one component selected from the group consisting of paclitaxel, taxol, docetaxel, tamoxifen, clarithromycin, azithromycin and doxorubicin;
  • a pharmaceutical composition comprising the nanoparticles of (7).
  • the polygamma glutamic acid derivatives of the present invention enable the preparation of nanoparticles that can be applied as an efficient delivery system of active substances in cosmetics or medicine.
  • the nanoparticles prepared with the polygamma glutamic acid derivatives of the present invention are hydrophobic inside and hydrophilic on the outside, the poorly soluble material can be stably encapsulated inside the particles. Since it is easily and reliably dispersed, it is possible to apply the poorly soluble active substance to cosmetics or medicine and further provide efficient application.
  • the nanoparticles prepared with the polygamma glutamic acid derivatives of the present invention exhibit the effect of enhancing the physical and chemical stability by blocking the exposure of the active substance from the external environment, and particularly in the case of the active substance which is unstable to oxidation, it is effectively applied to cosmetics or medicine. Make it possible.
  • Example 2 shows an image of the nanoparticles of Example 1-1 taken with a transmission electron microscope
  • Figure 4 is a vitamin A encapsulated in the nanoparticles of Comparative Examples 2-1 and 2-2 and Examples 3-1, 1-1, 3-2 and 3-3 prepared by varying the molecular weight of polygamma glutamic acid, respectively Is the result of measuring the filling rate of
  • Example 5 is a result of testing the water dispersibility of the nanoparticles of Comparative Example 1-1 which is vitamin A itself and Example 1-1 in which vitamin A is encapsulated,
  • Example 6 is a test result of the water dispersibility of the nanoparticles of Comparative Example 1-3 and Vitamin E encapsulated Example 1-3 which is vitamin E itself,
  • Example 7 is a result of testing the water dispersibility of the nanoparticles of Comparative Example 1-5 which is paclitaxel itself and Example 1-5 containing paclitaxel,
  • FIG. 8 shows particle sizes of nanoparticles of Comparative Examples 3-1 and 3-2 and Examples 2-1, 1-1 and 2-2 prepared by varying the bonding ratio of phenylalanine ethyl ester to polygammaglutamic acid.
  • Example 11 is a result of measuring the size change with time of the nanoparticles of Examples 3-1, 1-1, 3-2 and 3-3 prepared by varying the molecular weight of polygamma glutamic acid,
  • Example 13 shows the results of testing the oxidative stability of vitamin A encapsulated in Example 1-1, observed in the presence of 0%, 3% and 10% hydrogen peroxide,
  • FIG. 20 shows the results of experiments comparing the skin absorption of vitamin A from Example 1-1 with the skin absorption of Comparative Example 1-1 (vitamin A itself) on mouse skin mounted on a Franz apparatus.
  • the inventors of the present invention while studying a method of increasing the water dispersibility of poorly soluble bioactive material, has developed a method for producing nanoparticles using polygamma glutamic acid, a natural hydrophilic polymer.
  • Polygamma glutamic acid (Formula 1) derived from nature is a biomaterial having hydrophilicity and is decomposed into glutamic acid upon biodegradation, and it is difficult to form nanoparticles using only non-biotoxic materials or the present material.
  • Amphiphilic polymers can be made by combining hydrophobic residues of amino acid materials, which are also naturally derived from the carboxyl group of polygamma glutamic acid.
  • phenylalanine (Formula 2) was used as the hydrophobic amino acid, and an amphiphilic polygammaglutamic acid derivative was prepared by combining hydrophobic phenylalanine residues with hydrophilic polygammaglutamic acid, and self-assembling in water due to the amphipathy of the derivative Successfully produced nanoparticles.
  • the hydrophobic core portion of the nanoparticles can contain various substances such as poorly soluble drugs and fat-soluble vitamins.
  • a phenylalanine derivative in a form which masks the carboxyl group of phenylalanine.
  • phenylalanine derivatives include phenylalanine methyl ester, phenylalanine ethyl ester, phenylalanine propyl ester, phenylalanine butyl ester, phenylalanine pentyl ester, phenylalanine hexyl ester and phenylalanine benzyl ester.
  • phenylalanine carboxyl group it is efficient to mask the phenylalanine carboxyl group using such a phenylalanine derivative and then combine the amine group of phenylalanine with the carboxyl group of polygammaglutamic acid.
  • phenylalanine ethyl ester may be used as the phenylalanine derivative (Formula 3).
  • the polygammaglutamic acid derivatives of the present invention are preferably those in which 10 to 60% of the carboxyl groups of polygammaglutamic acid are bonded to the amine group of the phenylalanine derivative. If the conjugation ratio is less than 10%, the ratio of phenylalanine in the polygamma glutamic acid derivative is not sufficient to form a hydrophobic core, so that it is difficult to form micelles and eventually nanoparticles are difficult to form. If the conjugation ratio is more than 60%, the proportion of phenylalanine is excessively high, so that the hydrophobicity is excessive, resulting in aggregation without forming micelles.
  • the molecular weight of poly gamma glutamic acid in the poly gamma glutamic acid derivative of this invention is 3KDa-450KDa.
  • the size of molecules is so small that it is difficult to form micelles in water, and thus it is difficult to manufacture nanoparticles using the same.
  • polygamma glutamic acid derivatives prepared using polygamma glutamic acid having a molecular weight of more than 450 KDa are too large in size to disperse in water, making it difficult to produce nanoparticles.
  • the glutamic acid constituting the backbone constitutes a hydrophilic portion and the substituted phenylalanine portion constitutes a hydrophobic portion. That is, the polygamma glutamic acid derivative of the present invention has amphipathicity. Therefore, the polygamma glutamic acid derivative of the present invention, when dispersed in water, the hydrophilic portion is outward and the hydrophobic portion is collected toward the center of the sphere to form micelles easily, which is the principle of preparing nanoparticles. At this time, since the fat-soluble or poorly soluble active material is naturally located inside the hydrophobic portion of the nanoparticles, the fat-soluble or poorly soluble active material can be easily encapsulated in the nanoparticles.
  • the fat-soluble or poorly soluble active substance If the fat-soluble or poorly soluble active substance is in contact with the water without being encapsulated in the nanoparticle, it will precipitate immediately or float in the water surface if it is an oil, but the oil-soluble or poorly soluble active substance encapsulated in the nanoparticle will be in water. Even when dispersed, since the hydrophilic portion of glutamic acid is occupied on the surface of the nanoparticle, it may be stably dispersed.
  • the active material encapsulated in the nanoparticle is not exposed to the external environment of the nanoparticle and is protected by the nanoparticle constituent, for example, the active material enclosed inside the nanoparticle may be encapsulated even if the external environment of the nanoparticle is an oxidative environment. As a result, the stability is much higher than that of a state exposed to an oxidative environment.
  • the polygamma glutamic acid derivative-based nanoparticles of the present invention are not particularly limited in size as long as they stably form the nanoparticles. However, it is particularly preferable that the size of the nanoparticles is 20 to 350 nm.
  • the active material that can be encapsulated in the polygamma glutamic acid derivative-based nanoparticles of the present invention may be any hydrophobic material and is not particularly limited.
  • the effects of the present invention can be achieved by encapsulating fat-soluble vitamins or poorly soluble drugs.
  • fat-soluble vitamins include vitamin A, vitamin D, vitamin E, and vitamin K, retinyl palmitate, retinyl acetate and tocopherol acetate
  • specific examples of poorly soluble medicines include paclitaxel, taxol, docetaxel, tamoxifen, claris Roman, azithromycin and doxorubicin.
  • the polygammaglutamic acid derivatives of the present invention can be prepared by reacting the phenylalanine derivatives described above with polygammaglutamic acid, and the preparation method can bind the amine group (-NH 2 ) of phenylalanine to the carboxyl group (-COOH) of polygammaglutamic acid. Any method can be applied and can be prepared by methods known to those skilled in the art. Specific examples thereof are described in Experimental Example (A) below, but are not limited thereto.
  • the method for producing nanoparticles using the polygammaglutamic acid derivative of the present invention it is sufficient to disperse it in water by applying a slight mechanical force, for example, by vortexing for about 30 seconds. Since the polygamma glutamic acid derivative of the present invention spontaneously forms micelles in water, nanoparticle formation is spontaneous.
  • the method for encapsulating a fat-soluble or poorly soluble active material in the polygamma glutamic acid derivative-based nanoparticles of the present invention is sufficient to disperse a homogeneous mixture of the polygamma glutamic acid derivative and the active material in water and stir for a short time (vortexing).
  • the homogeneous mixture is a solid dispersion, and the solid dispersion may be prepared by a method known to those skilled in the art. For example, a polygamma glutamic acid derivative and an active substance are dissolved in an appropriate solvent, and then the solvent is removed to remove polygamma. Solid dispersions of glutamic acid derivatives and active substances can be prepared.
  • a rotary pressure reducer or a spray dryer is used as a method of removing a solvent.
  • a rotary pressure reducer or a spray dryer is used as a method of removing a solvent.
  • Specific examples of the method for encapsulating a fat-soluble or poorly soluble active material in the polygamma glutamic acid derivative-based nanoparticles of the present invention are described in Example 1-1, but are not limited thereto.
  • phenylalanine ethyl ester was added to a 15 ml conical tube at a ratio of 1: 387 equivalents, and the mixture was gradually added to a 250 ml round flask with a powder, followed by a solution of 5 ml of sodium hydrogencarbonate 0.3M concentration. After washing, the mixture was added to a 250 ml round flask and reacted for 12 hours.
  • phenylalanine, ethyl (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and carbonic acid were not reacted in tertiary distilled water for one day using a molecular weight cut off (MWCO) 3,500 filter membrane for one day and in methanol (MeOH) for two days. Sodium hydrogen is filtered.
  • MWCO molecular weight cut off
  • MeOH methanol
  • the polygamma glutamic acid conjugated with phenylalanine was transferred from the filtration membrane to the 250 ml round flask to remove methanol (MeOH), which is the result of solvent replacement due to the filtration membrane, using a depressurization apparatus to remove the polygamma glutamic acid derivative of the present invention. And phenylalanine conjugation ratio of 30%).
  • Example (A) All of the polygamma glutamic acid derivatives prepared in Example (A) were dispersed in 50 ml of tertiary distilled water and then lyophilized to obtain white particles as nanoparticles of the present invention. 1 g of nanoparticles prepared as a derivative was obtained.
  • nanoparticles containing fat-soluble vitamins or poorly soluble drugs were prepared in the composition shown in Table 3 below.
  • Comparative Examples 1-1 to 1-5 were prepared by weighing 10 mg of each raw material powder itself, which was not encapsulated, as shown in Table 3 below.
  • the polygammaglutamic acid derivative powder of the present invention prepared in Example (A) was dispersed in D 2 O to measure NMR.
  • the obtained NMR data is shown in Fig. 1, where the peak near 7.0 is the hydrogen peak of the benzene ring of phenylalanine and the peak near 2.0 is the hydrogen peak of methylene of polygammaglutamic acid.
  • the integral value of each peak can be used to determine the graft ratio (%). Comparing four hydrogens of methylene of polygammaglutamic acid based on five hydrogens of benzene ring, the integral value of the hydrogen peak of methylene is 13.23. Thus, about 30% of the carboxyl groups of polygammaglutamic acid are bound to phenylalanine ethyl ester. I could confirm that.
  • Example 1-1 The nanoparticles of Example 1-1 were dispersed in tertiary distilled water and the nanoparticle suspensions were observed by using a transmission electron microscope. 2 is a photographed image. Nano particles encapsulated with vitamin A are well formed and have a uniform size and shape.
  • the nanoparticles of Examples 1-1 and 1-5 were dispersed in tertiary distilled water, respectively, and the particle size was measured using a light scattering nano particle size analyzer (ELSZ-1000, Photal OTSUKA electronics, Japan). (FIG. 3). Both nanoparticles (Example 1-1) encapsulated with vitamin A and nanoparticles (Example 1-5) enclosed with paclitaxel were found to have uniform sizes, and the particle sizes of about 150 nm and 160 nm, respectively, were observed. Indicated.
  • Comparative Example 2-1 prepared with a molecular weight of 1KDa of polygammaglutamic acid, although the bonding ratio was 30%, micelles were not formed and nanoparticles could not be obtained, and thus vitamin A encapsulation rate could not be measured.
  • Comparative Example 2-1 prepared with a molecular weight of 500KDa of polygammaglutamic acid, the nanoparticle manufacturing process was not easy due to the high viscosity of polygammaglutamic acid, and the size was 500 nm due to the high content (conjugation ratio 80%) of phenylalanine. Aggregates were formed. However, even in this case, the vitamin A loading rate was found to be significantly lower than the nanoparticles of the present invention.
  • vitamin A (Comparative Example 1-1) not encapsulated in nanoparticles and vitamin A (Example 1-1) encapsulated in nanoparticles of the present invention was compared.
  • vitamin A (Comparative Example 1-1) not encapsulated in nanoparticles
  • vitamin A was weighed in 1 mg and added to 1 ml of tertiary distilled water, and then ultrasonic waves were used to disperse.
  • Powdered nanoparticles of Example 1-1 containing vitamin A were dispersed in tertiary distilled water at a concentration of 1 mg / ml as vitamin A.
  • vitamin E (Comparative Example 1-3) not encapsulated in nanoparticles and vitamin E (Example 1-3) encapsulated in nanoparticles of the present invention was compared.
  • vitamin E Comparative Examples 1-3 not encapsulated in nanoparticles
  • vitamin E was weighed in 1 mg and added to 1 ml of tertiary distilled water, and then ultrasonic waves were used to disperse.
  • Powdered nanoparticles of Example 1-3 containing vitamin E were dispersed in tertiary distilled water at a concentration of 1 mg / ml as vitamin E.
  • paclitaxel (Comparative Example 1-5) not encapsulated in nanoparticles and paclitaxel (Example 1-5) encapsulated in nanoparticles of the present invention was compared.
  • paclitaxel (Comparative Example 1-5) not encapsulated in nanoparticles
  • paclitaxel was weighed at 1 mg and added to 1 ml of tertiary distilled water, and then ultrasonic waves were used to disperse.
  • the powdery nanoparticles of Example 1-5 containing paclitaxel were dispersed in tertiary distilled water at a concentration of 1 mg / ml as paclitaxel.
  • Example 1-5 which is paclitaxel itself, which is not encapsulated in nanoparticles, paclitaxel was not dispersed or dissolved, and a clear layer separation phenomenon occurred.
  • Example 1-5 in which the paclitaxel was encapsulated in the nanoparticles of the present invention, it was confirmed that the paclitaxel-encapsulated nanoparticles were dispersed in the tertiary distilled water in a stable state.
  • Comparative Example 3 prepared by varying the bonding ratio to 0, 5, 10, 30 and 60% to examine the particle size change of the nanoparticles of the present invention according to the bonding ratio of phenylalanine ethyl ester to polygammaglutamic acid.
  • 1 and 3-2 and nanoparticles of Examples 2-1, 1-1, and 2-2 were dispersed in water at a concentration of 1 mg / ml, using a light scattering nano particle size analyzer (ELSZ-1000, Photal OTSUKA electronics, Japan). The particle size of each group was analyzed. The result is shown in FIG.
  • Nanoparticles of Examples 1-5 and 1-6 each containing paclitaxel and tamoxifen were dispersed in water at a concentration of 1 mg / ml based on the inclusion material, and then stored for 2 weeks in a shaded place at room temperature. ELSZ-1000, Photal OTSUKA electronics, Japan) was used to measure the size of the nanoparticles.
  • the size change with time was measured as follows.
  • ELSZ-1000 Light scattering nano particle size analyzer
  • the oxidative stability of the vitamins encapsulated in the nanoparticles of the present invention and the vitamins not encapsulated were compared as follows under severe conditions in the presence of hydrogen peroxide.
  • Vitamin A (Comparative Example 1-1), Vitamin D (Comparative Example 1-2), Vitamin E (Comparative Example 1-3) and Vitamin K (Comparative Example 1-4) were respectively added to tertiary distilled water at a concentration of 1 mg / ml. After the dispersion, hydrogen peroxide was added thereto at a volume ratio of 0%, 3%, and 10%, respectively, and the change of the fat-soluble vitamin concentration after 0.5 hours, 12 hours, 24 hours, 72 hours, and 1 week was measured using a spectrophotometer. Measured. Absorbance was measured at a wavelength of 325 nm for vitamin A, 264 nm for vitamin D, 292 nm for vitamin E, and 247 nm for vitamin K.
  • nanoparticles of Examples 1-1, 1-2, 1-3, and 1-4, each containing vitamin A, vitamin D, vitamin E, and vitamin K, respectively, were tertiary distilled water at a concentration of 1 mg / ml After dispersing in, add hydrogen peroxide at a volume ratio of 0%, 3%, and 10%, respectively, and change the concentration of the fat-soluble vitamin after 0.5 hours, 12 hours, 24 hours, 72 hours, and 1 week using a spectrophotometer. It was measured by.
  • Example 1-1 which is not encapsulated vitamin A itself, it was observed that the stability of vitamin A due to hydrogen peroxide was significantly reduced (FIG. 12). However, in Example 1-1 in which vitamin A is encapsulated in the nanoparticles of the present invention, it was confirmed that oxidative degradation by hydrogen peroxide was prevented and the stability of vitamin A was greatly improved (FIG. 13).
  • Example 1-2 which is not encapsulated vitamin D itself, it was observed that the stability of vitamin D by hydrogen peroxide was significantly reduced (FIG. 14). However, in Example 1-2 in which vitamin D was encapsulated in the nanoparticles of the present invention, it was confirmed that oxidative degradation by hydrogen peroxide was inhibited and the stability of vitamin D was greatly improved (FIG. 15).
  • Comparative Example 1-3 which is vitamin E itself that is not encapsulated, it was observed that the stability of vitamin E by hydrogen peroxide was significantly reduced (FIG. 16). However, in Examples 1-3, in which vitamin E was encapsulated in the nanoparticles of the present invention, it was confirmed that oxidative degradation by hydrogen peroxide was inhibited and the stability of vitamin E was greatly improved (FIG. 17).
  • Comparative Example 1-4 which is vitamin K itself which is not encapsulated, it was observed that the stability of vitamin K due to hydrogen peroxide was significantly reduced (FIG. 18). However, in Examples 1-4 in which vitamin K was encapsulated in the nanoparticles of the present invention, it was confirmed that oxidative degradation by hydrogen peroxide was prevented and the stability of vitamin K was greatly improved (FIG. 19).
  • fat-soluble vitamins such as vitamin A, vitamin D, vitamin E, and vitamin K are all encapsulated in the nanoparticles of the present invention, which can greatly improve their oxidative stability, and thus, nanoparticles based on the polygamma glutamic acid derivatives of the present invention.
  • the use of particles is expected to provide a means to efficiently use fat-soluble vitamins not only economically but also in terms of safety.
  • the skin of Balb / C nude mouse was fixed in a Franz cell, and the absorption pattern of vitamin A was changed in concentration and time. I followed along.
  • the epidermal layer of Balb / C nude mice was separated and fixed to the Franz apparatus. Thereafter, a solution made to make Tween 20 5% (v / v) in a phosphate buffer solution was filled in a Franz apparatus chamber so as to be in close contact with the skin of Balb / C nude mice.
  • the nanoparticles of Example 1-1 containing vitamin A were dispersed in Tris buffer at a concentration of 5 mg / ml based on vitamin A and treated by dropwise addition of 2 ml onto Balb / C nude mouse skin.
  • Comparative Example 1-1 which is not enclosed vitamin A itself, 2ml was added dropwise to Tris buffer solution on the skin of Balb / C nude mouse at a concentration of 5mg / ml.

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Abstract

본 발명은 양친매성인 폴리감마글루타민산 유도체 및 이를 기반으로 하는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명의 나노입자에 지용성 비타민 혹은 난용성 약물을 봉입함으로써 봉입물질의 수 분산성 및 산화적 안정성을 향상시킬 수 있으며 봉입물질이 봉입된 나노입자를 화장품 또는 의약에 사용함으로써 봉일물질의 효율적인 적용을 달성할 수 있다.

Description

폴리감마글루타민산 유도체 및 이를 함유한 제제
본 발명은 난용성 생리 활성물질을 봉입하여 그의 수 분산성 및 산화 안정성을 증가시킬 수 있는 나노입자 및 그의 기본 구성물질의 개발에 관한 것이다.
화장품이나 의약의 원료 물질들 중에는 난용성 및 낮은 안정성이 문제가 되는 물질들이 다수 존재한다. 화장품 원료 물질로 많이 사용되는 지용성 비타민은 난용성 및 낮은 안정성이 문제가 되는 물질군이다. 지용성 비타민은 피부에 소량의 용량으로도 피부의 대사 및 생리기능을 정상화시킬 뿐만 아니라 항산화효과, 신진대사 촉진, 면역력 증가, 세포벽 보호 등의 효과를 보이는 것으로 알려져있다 (Pierre Stocker et al., Biochimica et Biophysica Acta, 2003, 1621, 1-8; RF Grimble, International Journal for Vitamin and Nutrition, 1997, 67(5), 312-320). 또한 피부 미용에 있어서 지용성 비타민은 자외선 차단, 주름 개선, 피부건조 및 각화방지, 피부 보습, 색소침착 방지 등 피부 건강을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 비타민에는 비타민 A(레티놀), 비타민 D(에르고칼시페놀), 비타민 E(토코페롤), 비타민 K(필로퀴논)등이 있으며 이들 지용성 비타민의 유도체로서는 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트 등이 있다. 이들 화장품 원료물질들은 물리화학적으로 매우 불안정하기 때문에 열, 빛, 산소, 습기, 알칼리 등에 의해 쉽게 파괴된다. 또한 비타민 자체의 효능 및 기능이 저하되거나 변색 또는 변취가 발생한다.
난용성 약물은 화합물의 구조상 소수성 부위를 포함하고 있어 물에 잘 녹지 않는 약물을 의미하며, 난용성으로 인해 그 실용성이 제한되는 경우가 많다. 신약으로 개발되는 약물 중 약 41% 이상이 난용성으로 인하여 중도에 개발이 중단되고 있으며, 미국 약전(US Pharmacopeia)에 등재된 약물의 약 1/3이상이 난용성 약물로 분류되고 있다(대한민국 공개특허 제2010-0096038호). 난용성 약물의 용해도를 개선하기 위하여 염의 형성, 계면활성제를 사용하여 가용화 시키기도 하는데 이러한 방법에는 가용화 용제의 독성으로 인하여 부작용이 발생하는 문제가 있다. 항암제인 탁솔 (taxol)의 난용성으로 인하여 사용되는 가용화제인 크레머포어 (cremophore)의 경우, 크레머포어의 독성으로 인한 심각한 아나필락스양 반응, 고지혈증, 적혈구의 응집 및 말초신경병증 등을 일으키는 부작용이 보고되고 있다 (H.Gelderblom et al., European Journal of Cancer, (2001), 37,1590-1598).
난용성 물질의 수용액 중에서의 용해도를 증강시키는 방법으로 합성 고분자 소재의 나노입자가 연구되고 있다. 그러나 합성 고분자 소재 나노입자들의 경우, 분해시의 분해 산물에 의한 독성 문제로 인하여 실제 임상에 적용되는 고분자 소재 나노입자는 폴리-락티드-글리콜리드 (poly-lactide-glycolide)소재를 제외하면 거의 없는 실정이다.
한편 폴리감마글루탐산은 D.L-글루탐산이 감마-글루타밀과 결합된 중합체로, 점액성 물질이며, 폴리감마글루탐산은 한국의 전통 발효식품 중 하나인 청국장과 일본의 낫또, 네팔의 키네마 등에서 분리된 바실러스속 균주로부터 생산되는데, 이 폴리감마글루탐산은 식용, 수용성 및 생분해성 고분자물질로서 흡습제 및 보습제로 이미 화장품의 원료 물질로 널리 이용되고 있다(Aditya R Bhat et al., AMB express, 2013, (1), 36; Joerg M. Buescher et al., Critical Reviews in Biotechnology, 2007, 27, 1-19).
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 대한민국 공개특허 제2010-0096038호
[비특허문헌]
(비특허문헌 1)Pierre Stocker et al., Biochimica et Biophysica Acta, 2003, 1621, 1-8;
(비특허문헌 2)RF Grimble, International Journal for Vitamin and Nutrition, 1997, 67(5), 312-320;
(비특허문헌 3)H.Gelderblom et al., European Journal of Cancer, (2001), 37,1590-1598;
(비특허문헌 4)Aditya R Bhat et al., AMB express, 2013, (1), 36;
(비특허문헌 5)Joerg M. Buescher et al., Critical Reviews in Biotechnology, 2007, 27, 1-19
본 발명은 난용성 생리 활성물질을 봉입하여 그의 수 분산성 및 산화 안정성을 증가시킬 수 있는 나노입자 및 그의 기본 구성물질의 개발을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 난용성 생리 활성물질의 수 분산성과 산화 안정성이 증대된 화장품 원료 및 의약 원료의 제공을 목적으로 한다.
하기와 같은 본 발명의 구체적인 양태를 통하여 상기의 목적을 달성할 수 있었다:
(1) 폴리감마글루탐산의 카르복시기들 중 10 내지 60%가 페닐알라닌 유도체의 아민기와 결합되어 있으며,
상기 페닐알라닌 유도체가 페닐알라닌 메틸 에스터, 페닐알라닌 에틸 에스터, 페닐알라닌 프로필 에스터, 페닐알라닌 부틸 에스터, 페닐알라닌 펜틸 에스터, 페닐알라닌 헥실 에스터 및 페닐알라닌 벤질 에스터로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상의 성분이며,
상기 폴리감마글루타민산의 분자량이 3KDa 내지 450KDa 인 폴리감마글루타민산 유도체;
(2) 친수성기와 친유성기를 함께 가지는 기본물질로서 상기 (1)의 폴리감마글루타민산 유도체를 포함하는 나노입자;
(3) 상기 (2)에 있어서, 나노입자의 크기가 20 내지 350 nm인 나노입자;
(4) 상기 (2) 또는 (3)에 있어서, 지용성 비타민 또는 이의 유도체가 봉입된 나노입자;
(5) 상기 (4)에 있어서, 상기 지용성 비타민이 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 및 비타민 K, 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트 및 토코페롤 아세테이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 성분인 것인 나노입자;
(6) 상기 (4)의 나노입자를 포함하는 화장품 조성물;
(7) 상기 (2) 또는 (3)에 있어서, 난용성 의약이 봉입된 나노입자;
(8) 상기 (7)에 있어서, 상기 난용성 의약이 파클리탁셀, 탁솔, 도세탁셀, 타목시펜, 클라리스로마이신, 아지스로마이신 및 독소루비신으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 성분인 것인 나노입자; 및
(9) 상기 (7)의 나노입자를 포함하는 의약 조성물.
본 발명의 폴리감마글루타민산 유도체는 화장품 혹은 의약에 있어서 활성물질의 효율적인 전달시스템으로 적용가능한 나노입자의 제조를 가능케 한다.
이러한 본 발명의 폴리감마글루타민산 유도체로 제조된 나노입자는 입자의 내부는 소수성이고 외부는 친수성이기 때문에 난용성 물질을 입자 내부에 안정적으로 봉입시킬 수 있으며 봉입된 난용성 물질은 나노입자 상태로서 수 중에 용이하게 안정적으로 분산되므로 난용성 활성물질의 화장품 혹은 의약으로의 적용을 가능케 하며 나아가 효율적인 적용을 제공한다.
또한 본 발명의 폴리감마글루타민산 유도체로 제조된 나노입자는 외부의 환경으로부터 활성물질의 노출을 차단함으로써 물리화학적 안정성을 높이는 효과를 나타내며 특히 산화에 불안정한 활성물질의 경우 효율적으로 화장품 혹은 의약으로의 적용을 가능케 한다.
도 1은 폴리감마글루타민산 유도체 중 페닐알라닌 에틸 에스터의 접합비율을 NMR 데이타로부터 확인한 예시이며,
도 2는 실시예 1-1의 나노 입자를 투과전자현미경으로 찍은 이미지를 나타낸 것이며,
도 3은 실시예 1-1 및 1-5의 나노 입자의 입자크기를 측정한 결과이며,
도 4는 폴리감마글루탐산의 분자량을 달리하여 제조된 비교예 2-1 및 2-2 그리고 실시예 3-1, 1-1, 3-2 및 3-3의 나노 입자에 각각 봉입되어 있는 비타민 A의 봉입율을 측정한 결과이며,
도 5는 비타민 A 자체인 비교예 1-1 및 비타민 A를 봉입시킨 실시예 1-1의 나노 입자의 수분산성을 시험한 결과이며,
도 6는 비타민 E 자체인 비교예 1-3 및 비타민 E를 봉입시킨 실시예 1-3의 나노 입자의 수분산성을 시험한 결과이며,
도 7는 파클리탁셀 자체인 비교예 1-5 및 파클리탁셀을 봉입시킨 실시예 1-5의 나노 입자의 수분산성을 시험한 결과이며,
도 8은 폴리감마글루탐산에 대한 페닐알라닌 에틸 에스터의 접합 비율을 달리하여 제조된 비교예 3-1 및 3-2 그리고 실시예 2-1, 1-1 및 2-2의 나노 입자의 입자크기를 측정한 결과이며,
도 9는 지용성 비타민인 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E 및 비타민 K를 각각 봉입한 실시예 1-1 내지 1-4의 나노 입자의 시간에 따른 크기 변화를 측정한 결과이며,
도 10은 난용성 약물인 파클리탁셀 및 타목시펜를 각각 봉입한 실시예 1-5 및 1-6의 나노 입자의 시간에 따른 크기 변화를 측정한 결과이며,
도 11은 폴리감마글루탐산의 분자량을 달리하여 제조된 실시예 3-1, 1-1, 3-2 및 3-3의 나노 입자의 시간에 따른 크기 변화를 측정한 결과이며,
도 12는 0%, 3% 및 10%의 과산화수소의 존재하에 관찰한 비교예 1-1 (비타민 A 자체)의 산화적 안정성을 시험한 결과이며,
도 13은 0%, 3% 및 10%의 과산화수소의 존재하에 관찰한, 실시예 1-1에 봉입된 비타민 A의 산화적 안정성을 시험한 결과이며,
도 14는 0%, 3% 및 10%의 과산화수소의 존재하에 관찰한 비교예 1-2 (비타민 D 자체)의 산화적 안정성을 시험한 결과이며,
도 15는 0%, 3% 및 10%의 과산화수소의 존재하에 관찰한, 실시예 1-2에 봉입된 비타민 D의 산화적 안정성을 시험한 결과이며,
도 16은 0%, 3% 및 10%의 과산화수소의 존재하에 관찰한 비교예 1-3 (비타민 E 자체)의 산화적 안정성을 시험한 결과이며,
도 17은 0%, 3% 및 10%의 과산화수소의 존재하에 관찰한, 실시예 1-3에 봉입된 비타민 E의 산화적 안정성을 시험한 결과이며,
도 18은 0%, 3% 및 10%의 과산화수소의 존재하에 관찰한 비교예 1-4 (비타민 K 자체)의 산화적 안정성을 시험한 결과이며,
도 19는 0%, 3% 및 10%의 과산화수소의 존재하에 관찰한, 실시예 1-4에 봉입된 비타민 K의 산화적 안정성을 시험한 결과이며,
도 20은 프란츠 장치에 장착된 마우스 피부에 대한, 실시예 1-1로부터의 비타민 A의 피부흡수를 비교예 1-1 (비타민 A 자체)의 피부흡수와 비교하여 실험한 결과이다.
본 발명자들은 난용성 생리활성 물질의 수 분산성을 증가시키는 방법을 연구하던 중, 친수성이 강한 천연 소재 고분자인 폴리감마글루탐산을 이용하여 나노 입자를 제조하는 방법을 개발하였다.
천연 유래인 폴리감마글루탐산 (화학식 1)은 친수성을 가진 생체 소재 물질이며 생분해 시에 글루탐산으로 분해되는 물질로서 생체 독성이 없는 물질이나 본 물질만으로 나노입자를 형성하기는 어렵다. 폴리감마글루탐산의 카르복실기 그룹에, 역시 천연 유래인 아미노산 소재의 소수성 잔기를 결합하여 양친매성 고분자를 만들 수 있다. 본 발명에서는 소수성 아미노산으로는 페닐알라닌 (화학식 2)을 사용하였으며, 친수성 폴리감마글루탐산에 소수성 페닐알라닌 잔기를 결합하여 양친매성의 폴리감마글루탐산 유도체를 제조하였으며, 본 유도체의 양친매성으로 인하여 수중에서 자가 조립하는 나노입자 제조에 성공하였다. 본 나노입자의 소수성 내부 (hydrophobic core) 부분에는 난용성 약물 및 지용성 비타민 등 다양한 물질들을 봉입할 수 있다.
화학식 1
Figure PCTKR2015006220-appb-C000001
화학식 2
Figure PCTKR2015006220-appb-C000002
페닐알라닌의 아민기 (-NH2)를 폴리감마글루탐산의 카르복실기 (-COOH)에 선택적으로 결합시키기 위해서는 페닐알라닌의 카르복실기를 차폐한 형태의 페닐알라닌 유도체를 이용하는 것이 바람직하다. 페닐알라닌 유도체의 예로서는 페닐알라닌 메틸 에스터, 페닐알라닌 에틸 에스터, 페닐알라닌 프로필 에스터, 페닐알라닌 부틸 에스터, 페닐알라닌 펜틸 에스터, 페닐알라닌 헥실 에스터 및 페닐알라닌 벤질 에스터 등이 있다. 이러한 페닐알라닌 유도체를 이용하여 페닐알라닌 카르복실기를 차폐한 다음 페닐알라닌의 아민기를 폴리감마글루탐산의 카르복실기와 결합시키는 것이 효율적이다. 바람직하게는 상기 페닐알라닌 유도체로서 페닐알라닌 에틸 에스터를 이용할 수 있다 (화학식 3).
화학식 3
Figure PCTKR2015006220-appb-C000003
본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체는 바람직하게는 폴리감마글루탐산의 카르복시기들 중 10 내지 60%가 페닐알라닌 유도체의 아민기와 결합되어 있는 것이다. 이러한 접합비율이 10% 미만일 경우 폴리감마글루탐산 유도체에 있어서 페닐알라닌의 비율이 소수성 내부 (hydrophobic core)를 형성하는데 충분하지 않아 미셀을 형성하기 어렵고 결국 나노입자가 형성되기 어렵다. 접합비율이 60% 초과일 경우 페닐알라닌의 비율이 지나치게 많아져 소수성이 지나쳐 미셀을 형성하지 못한 채 응집 (aggregating)되어 버린다.
본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체 중 폴리감마글루타민산의 분자량은 3KDa 내지 450KDa 인 것이 바람직하다. 분자량이 3KDa 미만인 폴리감마글루타민산을 이용하여 제조된 폴리감마글루탐산 유도체의 경우 분자의 크기가 너무 작아져서 수 중에서 미셀 형성이 어렵고 결국 이를 이용한 나노입자를 제조하기 곤란하다. 반면 분자량이 450KDa 초과인 폴리감마글루타민산을 이용하여 제조된 폴리감마글루탐산 유도체의 경우 분자의 크기가 너무 커져서 수 중에 분산시킬 때 점성이 지나쳐서 역시 나노입자를 제조하기 곤란하다.
이렇게 제조된 본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체는 중심축 (backbone)을 이루는 글루탐산들이 친수성 부분을 구성하고 치환되어 들어간 페닐알라닌 부분이 소수성 부분을 구성한다. 즉 본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체는 양친매성을 갖는다. 따라서 본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체는 수 중에 분산시켰을 때 친수성 부분이 밖을 향하고 소수성 부분이 구의 중심쪽으로 모여 미셀을 용이하게 형성하며 이것이 나노입자를 제조하는 원리가 된다. 이때 지용성 혹은 난용성 활성물질은 나노입자의 내부 소수성 부분의 안쪽에 자연스럽게 위치하게 되므로 지용성 혹은 난용성 활성물질을 나노입자 내에 용이하게 봉입할 수 있는 것이다.
나노입자 내에 봉입되지 않은 상태에서 지용성 혹은 난용성 활성물질이 물에 접하게 되면 바로 석출되거나 오일인 경우 물 표면에 떠올라 바로 층분리가 일어나겠지만, 나노입자 내에 봉입된 지용성 혹은 난용성 활성물질은 수 중에 분산되어도 나노입자 표면에는 글루탐산들에 의한 친수성 부분이 차지하고 있으므로 안정적으로 분산되어 있을 수 있다.
또한 나노입자 내에 봉입된 활성물질은 나노입자 외부 환경에 노출되어 있지 않고 나노입자 구성물질에 의하여 보호되어 있기 때문에 예를 들어 나노입자 외부 환경이 산화적 환경일지라도 내부에 봉입되어 있는 활성물질은, 봉입되어 있지 않아 산화적 환경에 그대로 노출된 상태에 비하여 안정성을 월등하게 보장받을 수 있다.
본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체 기반 나노입자는 나노입자를 안정적으로 형성하기만 하면 나노 단위 내에서 그 크기에 특별한 한정은 없다. 다만, 나노입자의 크기가 20 내지 350 nm인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체 기반 나노입자에 봉입할 수 있는 활성물질로서는 소수성 물질이라면 어느 것이라도 가능하며 특별히 한정되지는 않는다. 예를 들면 지용성 비타민이나 난용성 의약을 봉입하여 본 발명의 효과를 달성할 수 있다. 지용성 비타민의 구체적인 예는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 및 비타민 K, 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트 및 토코페롤 아세테이트 등이 있으며, 난용성 의약의 구체적인 예는 파클리탁셀, 탁솔, 도세탁셀, 타목시펜, 클라리스로마이신, 아지스로마이신 및 독소루비신 등이 있다.
본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체는 상기 기재된 페닐알라닌 유도체를 폴리감마글루탐산과 반응시켜 제조할 수 있으며 그 제조방법은 페닐알라닌의 아민기 (-NH2)를 폴리감마글루탐산의 카르복실기 (-COOH)에 결합시킬 수 있는 방법이라면 어느 것으로라도 적용할 수 있으며 이미 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 그 구체적인 예를 하기 실험예 (가)에 기재하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체를 이용하여 나노입자를 제조하는 방법은 물에 넣고 약간의 기계적 힘을 가하여, 예를 들면 30초 정도 교반 (vortexing)하여 분산시키는 것으로 충분하다. 본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체는 수 중에서 자발적으로 미셀을 형성하므로 나노입자 형성이 자발적으로 이루어지는 것이다.
본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체 기반 나노입자에 지용성 혹은 난용성 활성물질의 봉입방법은, 폴리감마글루탐산 유도체와 활성물질의 균일한 혼합물을 물에 넣고 단시간 교반 (vortexing) 해 줌으로써 분산시키는 것으로 충분하다. 상기 균일한 혼합물은 고체분산체인 것이 바람직하며, 고체분산체는 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있는데 예를 들면 폴리감마글루탐산 유도체와 활성물질을 각각 적절한 용매에 용해시킨 후 용매를 제거하여 폴리감마글루탐산 유도체와 활성물질의 고체분산체를 제조할 수 있다. 용매를 제거하는 방법으로는 예를 들면 회전 감압기 혹은 분무건조기 등이 있다. 본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체 기반 나노입자에 지용성 혹은 난용성 활성물질의 봉입방법의 구체적인 예시를 하기 실시예 1-1 등에 기재하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 실시예 등을 통하여 본 발명의 폴리감마글루타민산 유도체 및 이를 기반으로 하는 나노입자 제조 및 활성물질 봉입에 관하여 구체적인 예를 기술하지만 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것을 아니다.
실시예 (가). 폴리감마글루탐산 유도체의 제조
250ml 둥근 플라스크에 분자량 50KDa의 폴리감마글루탐산 1g을 탄산수소나트륨 0.3M 농도 40ml의 용액에 녹인다. 페닐알라닌과의 커플링을 위해 분자량 50KDa의 폴리감마글루탐산에 1:387의 당량 비율로 에틸(디메틸아미노프로필)카보디이미드 [ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide: EDC]를 1.5g을 탄산수소나트륨 0.3M 농도 5ml에 용해시켜 250ml 둥근 플라스크에 첨가하여 0℃ 환경에서 30분 동안 반응시킨다. 그 후 페닐알라닌 에틸 에스터를 1:387 당량 비율로 1.8g을 15ml 코니칼 튜브 (conical tube)에 담은 후 가루채로 250ml 둥근 플라스크에 단계적으로 녹이면서 첨가한 후 탄산수소나트튬 0.3M 농도 5ml의 용액으로 워싱 후 250ml 둥근 플라스크에 첨가하여 12시간 동안 반응 시킨다.
그 후, MWCO (molcular weight cut off) 3,500의 여과막을 이용하여 하루 동안은 삼차 증류수상에서, 다음 이틀은 메탄올 (MeOH)상에서 반응하지 못한 페닐알라닌, 에틸(디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 그리고 탄산수소나트륨을 여과시킨다.
페닐알라닌이 결합된 폴리감마글루탐산을 여과막에서 250ml 둥근 플라스크로 다시 옮겨 여과막으로 인한 용매치환의 결과인 메탄올(MeOH)을 감압장치를 이용하여 제거하여 본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체 (폴리감마글루탐산의 분자량 50KDa 및 페닐알라닌 접합비율 30%)를 수득하였다.
실시예 (나) 내지 (바). 폴리감마글루탐산 유도체의 제조
폴리감마글루탐산의 분자량 및 폴리감마글루탐산에 대한 페닐알라닌 에틸 에스터의 접합 비율을 하기 표 1과 같이 조정한 것을 제외하고는 상기 실시예 (가)와 동일한 방법으로 본 발명에 따르는 폴리감마글루탐산 유도체를 각각 제조하였다. 폴리감마글루탐산에 대한 페닐알라닌 에틸 에스터의 접합 비율 조정을 위하여 반응에 사용한 폴리감마글루탐산, 페닐알라닌 에틸 에스터 및 EDC의 당량비는 하기 표 2와 같이 사용하였다.
표 1 폴리감마글루탐산 유도체의 제조
실시예 폴리감마글루탐산의 분자량 폴리감마글루탐산에 대한 페닐알라닌 에틸 에스터의 접합 비율 (%)
(가) 50KDa 30
(나) 50KDa 10
(다) 50KDa 60
(라) 10KDa 30
(마) 100KDa 30
(바) 300KDa 30
표 2 폴리감마글루탐산 유도체 중 페닐알라닌의 접합비율 변화를 위한 반응물질들의 사용비
당량비 (mole/mole) 폴리감마글루탐산 페닐알라닌 에틸 에스터 EDC
실시예 (가) 1 387 387
실시예 (나) 1 77 77
실시예 (다) 1 271 271
실시예 (라) 1 31 31
실시예 (마) 1 309 309
실시예 (바) 1 2322 2322
실시예 (사). 나노 입자의 제조
상기 실시예 (가)에서 제조한 폴리감마글루탐산 유도체를 모두 삼차 증류수 50ml에 분산시킨 후 동결건조 하여 하얀색 파우더로서 본 발명의 나노입자 (폴리감마글루탐산의 분자량 50KDa 및 페닐알라닌 접합비율 30%의 폴리감마글루탐산 유도체로 제조된 나노입자) 1g을 수득하였다.
실시예 (아) 내지 (타). 나노 입자의 제조
상기 실시예 (나) 내지 (바)에서 제조한 폴리감마글루탐산 유도체를 각각 삼차 증류수 50ml에 분산시킨 후 동결건조 하여 하얀색 파우더로서 본 발명의 나노입자들을 각각 수득하였다.
실시예 1-1. 비타민 A가 봉입된 나노 입자의 제조
실시예 (가)에서 제조한 폴리감마글루탐산 유도체를 10mg/ml의 농도로 메탄올(MeOH)에 용해시켰다. 또한 비타민 A는 10mg/ml의 농도로 클로로포름에 용해시켰다. 그런 다음, 두 용액을 질량 비율 1:1로 섞은 후 회전 감압기를 이용하여 용매를 제거한 뒤 삼차증류수 1ml로 분산시키고 교반하여 나노 입자 현탁액을 수득하였다. 그 후, 동결건조를 하여 나노입자를 분말 형태로 보관하였다.
실시예 1-2 내지 3-3. 봉입물질이 봉입된 나노 입자의 제조
상기 실시예 1-1과 동일한 방법에 따라, 본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체를 이용하여 지용성 비타민 혹은 난용성 약물을 봉입한 나노 입자를 하기 표 3과 같은 조성으로 제조하였다.
표 3 폴리감마글루탐산 유도체 기반 나노입자의 제조
실시예 폴리감마글루탐산의 분자량 폴리감마글루탐산에 대한 페닐알라닌 에틸 에스터의 접합 비율 (%) 나노입자 내 봉입물질
1-1 50KDa 30 비타민 A
1-2 50KDa 30 비타민 D
1-3 50KDa 30 비타민 E
1-4 50KDa 30 비타민 K
1-5 50KDa 30 파클리탁셀
1-6 50KDa 30 타목시펜
2-1 50KDa 10 비타민 A
2-2 50KDa 60 비타민 A
3-1 10KDa 30 비타민 A
3-2 100KDa 30 비타민 A
3-3 300KDa 30 비타민 A
비교예 1-1 내지 1-5. 봉입물질 원료분말
비교예 1-1 내지 1-5은 하기 표 3과 같이, 봉입되지 않은 원료분말 자체 각각을 10 mg으로 무게를 재어 준비하였다.
비교예 2-1 내지 3-2.
상기 실시예 1-1과 동일한 방법에 따라, 하기 표 4와 같은 조성으로 조성물을 제조하였다.
표 4 비교예의 조성
비교예 폴리감마글루탐산의 분자량 폴리감마글루탐산에 대한 페닐알라닌 에틸 에스터의 접합 비율 (%) 나노입자 내 봉입물질
1-1 - - 비타민 A 자체
1-2 - - 비타민 D 자체
1-3 - - 비타민 E 자체
1-4 - - 비타민 K 자체
1-5 - - 파클리탁셀 자체
2-1 1KDa 30 비타민 A
2-2 500KDa 80 비타민 A
3-1 50KDa 0 비타민 A
3-2 50KDa 5 비타민 A
실험예 1. 폴리감마글루탐산 유도체 중 페닐알라닌 에틸 에스터의 접합 비율 확인
실시예 (가)에서 제조한 본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체 분말을 D2O에 분산시켜 NMR을 측정하였다.
얻어진 NMR 데이타는 도 1에 도시하였으며, 7.0 부근의 피이크가 페닐알라닌의 벤젠고리의 수소 피이크이고 2.0 부근의 피이크가 폴리감마글루탐산의 메틸렌의 수소 피이크이다. 각각의 피이크의 적분값을 이용하여 접합비율 (graft ratio: %)을 정할 수 있다. 벤젠고리의 수소 5개를 기준으로 폴리감마글루탐산의 메틸렌의 수소 4개를 비교하는데 메틸렌의 수소 피이크의 적분값이 13.23으로 나온 것으로 보아 폴리감마글루탐산의 카르복시기 중 약 30%에 페닐알라닌 에틸 에스터가 결합된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 나노 입자의 성상 확인
실시예 1-1의 나노 입자를 삼차증류수에 분산시키고 이렇게 형성된 나노 입자 현탁액에 대하여 투과전자현미경을 이용하여 나노 입자 성상을 관찰하였다. 도 2는 촬영한 이미지이다. 비타민 A가 봉입된 나노 입자가 잘 형성되어 있으며 균일한 크기와 모양을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 나노 입자의 크기 측정
실시예 1-1 및 1-5의 나노 입자를 각각 삼차증류수에 분산시키고 이렇게 형성된 나노 입자 현탁액에 대하여 광산란 나노 입도 분석장비 (ELSZ-1000, Photal OTSUKA electronics, Japan)를 이용하여 입자크기를 측정하였다(도 3). 비타민 A가 봉입된 나노 입자 (실시예 1-1)와 파클리탁셀이 봉입된 나노 입자 (실시예 1-5) 모두 균일한 크기를 가지고 있음을 확인할 수 있었으며 각각 약 150 nm 및 160 nm의 입자 크기를 나타내었다.
실험예 4. 폴리감마글루탐산의 분자량에 따른 비타민 A의 봉입율 변화
폴리감마글루탐산의 분자량에 따른, 본 발명의 나노입자 내 비타민 A의 봉입율 변화를 살펴보기 위하여 폴리감마글루탐산의 분자량을 1KDa 및 500KDa, 그리고 10, 50, 100 및 300KDa로 각각 달리하여 제조된 비교예 2-1 및 2-2 그리고 실시예 3-1, 1-1, 3-2 및 3-3의 나노 입자에 대하여 비타민 A의 봉입율을 측정하고 비교하였다.
먼저 비교예 2-1 및 2-2 그리고 실시예 3-1, 1-1, 3-2 및 3-3의 나노 입자를, 동결건조하여 얻어진 분말 상태로 그대로 0.1 mg을 취하여 메탄올 : 클로로포름 = 1 : 1 의 부피 비율로 제조한 용액 1 ml을 이용하여 나노 입자를 파괴하였다. 분광광도계를 이용해 325 nm에서의 흡광도를 측정하여, 비타민 A의 검량선식에 대입하여 봉입되어 있던 비타민 A의 양을 확인하였다. 그런 다음, 나노 입자에 봉입하기 위해 첨가했던 비타민 A의 처음 양 대비 분광광도계를 이용해 측정한 비타민 A의 양의 비율을 백분율로 계산하였다. 산출된 각각의 봉입률은 도 4에 도시하였다.
폴리감마글루탐산의 분자량 10, 50, 100 및 300KDa로 각각 제조된 실시예 3-1, 1-1, 3-2 및 3-3의 나노 입자의 경우 모두 우수한 비타민 A 봉입률을 나타내었다. 폴리감마글루탐산의 상기 분자량 범위 (10 내지 300KDa) 내에서는 분자량에 따라 비타민 A 봉입률에 큰 차이를 보이지는 않았지만 분자량 50KDa을 사용한 실시예 1-1이 가장 높은 봉입률을 나타내었다.
한편 폴리감마글루탐산의 분자량 1KDa으로 제조된 비교예 2-1의 경우 접합비율은 30%로 적절하였음에도 불구하고 미셀이 형성되지 않아 나노 입자를 얻을 수 없었으며 따라서 비타민 A 봉입률을 측정할 수 없었다.
또한 폴리감마글루탐산의 분자량 500KDa으로 제조된 비교예 2-1의 경우 폴리감마글루탐산의 높은 점도로 인하여 나노 입자 제조 공정이 용이하지 않았으며, 높은 함량 (접합비율 80%)의 페닐알라닌으로 인하여 크기 500 nm 이상의 응집체(aggregate)가 형성되기는 하였다. 그러나 이 경우에도 비타민 A 봉입률은 본 발명의 나노 입자들에 비하여 현저히 저조함을 확인하였다.
실험예 5. 나노입자에의 봉입에 의한 지용성 비타민 및 난용성 약물의 수 분산성 향상 확인 실험
지용성 비타민 및 난용성 약물의 수 분산성 (water dispersability)이 본 발명의 나노입자에 봉입한 후 향상되는지 그 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다.
실험예 5-1. 비타민 A의 수 분산성
나노입자에 봉입하지 않은 비타민 A (비교예 1-1)와 본 발명의 나노입자에 봉입된 비타민 A (실시예 1-1)의 수 분산성을 비교 실험하였다. 먼저, 나노입자에 봉입하지 않은 비타민 A (비교예 1-1)의 경우, 비타민 A를 1 mg으로 무게를 재어 삼차증류수 1ml에 가한 다음, 분산을 시키기 위해 초음파를 이용하였다. 비타민 A가 봉입된 실시예 1-1의 분말상의 나노입자는 비타민 A로서 1mg/ml의 농도로 삼차증류수에 분산시켰다.
이렇게 각각 삼차증류수에 분산시킨 상태를 사진 찍어 수 분산성의 차이를 비교하였다 (도 5). 그 결과, 나노입자에 봉입하지 않은 비타민 A 자체인 비교예 1-1의 경우 비타민 A는 수 분산되거나 용해되지 않고 명확한 층 분리 현상이 일어났다. 그러나 본 발명의 나노입자에 비타민 A가 봉입되어 있는 상태인 실시예 1-1의 경우, 비타민 A가 봉입된 나노입자가 삼차증류수에 안정된 상태로 분산됨을 확인할 수 있었다.
실험예 5-2. 비타민 E의 수 분산성
나노입자에 봉입하지 않은 비타민 E (비교예 1-3)와 본 발명의 나노입자에 봉입된 비타민 E (실시예 1-3)의 수 분산성을 비교 실험하였다. 먼저, 나노입자에 봉입하지 않은 비타민 E (비교예 1-3)의 경우, 비타민 E를 1 mg으로 무게를 재어 삼차증류수 1ml에 가한 다음, 분산을 시키기 위해 초음파를 이용하였다. 비타민 E가 봉입된 실시예 1-3의 분말상의 나노입자는 비타민 E로서 1mg/ml의 농도로 삼차증류수에 분산시켰다.
이렇게 각각 삼차증류수에 분산시킨 상태를 사진 찍어 수 분산성의 차이를 비교하였다 (도 6). 그 결과, 나노입자에 봉입하지 않은 비타민 E 자체인 비교예 1-3의 경우 비타민 E는 수 분산되거나 용해되지 않고 명확한 층 분리 현상이 일어났다. 그러나 본 발명의 나노입자에 비타민 E가 봉입되어 있는 상태인 실시예 1-3의 경우, 비타민 E가 봉입된 나노입자가 삼차증류수에 안정된 상태로 분산됨을 확인할 수 있었다.
실험예 5-3. 파클리탁셀의 수 분산성
나노입자에 봉입하지 않은 파클리탁셀 (비교예 1-5)과 본 발명의 나노입자에 봉입된 파클리탁셀 (실시예 1-5)의 수 분산성을 비교 실험하였다. 먼저, 나노입자에 봉입하지 않은 파클리탁셀 (비교예 1-5)의 경우, 파클리탁셀를 1 mg으로 무게를 재어 삼차증류수 1ml에 가한 다음, 분산을 시키기 위해 초음파를 이용하였다. 파클리탁셀이 봉입된 실시예 1-5의 분말상의 나노입자는 파클리탁셀로서 1mg/ml의 농도로 삼차증류수에 분산시켰다.
이렇게 각각 삼차증류수에 분산시킨 상태를 사진 찍어 수 분산성의 차이를 비교하였다 (도 7). 그 결과, 나노입자에 봉입하지 않은 파클리탁셀 자체인 비교예 1-5의 경우 파클리탁셀은 수 분산되거나 용해되지 않고 명확한 층 분리 현상이 일어났다. 그러나 본 발명의 나노입자에 파클리탁셀이 봉입되어 있는 상태인 실시예 1-5의 경우, 파클리탁셀이 봉입된 나노입자가 삼차증류수에 안정된 상태로 분산됨을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 접합 비율에 따른 나노 입자의 입자크기 변화
폴리감마글루탐산에 대한 페닐알라닌 에틸 에스터의 접합 비율에 따른, 본 발명의 나노 입자의 입자크기 변화를 살펴보기 위하여 접합 비율을 0, 5, 10, 30 및 60%로 각각 달리하여 제조된 비교예 3-1 및 3-2 그리고 실시예 2-1, 1-1 및 2-2의 나노 입자를 1mg/ml 의 농도로 수 분산하여 광산란 나노 입도 분석장비 (ELSZ-1000, Photal OTSUKA electronics, Japan)를 이용하여 각 그룹의 입자크기를 분석하였다. 그 결과는 도 8에 도시하였다.
페닐알라닌이 접합되지 않은 비교예 3-1의 경우 나노입자가 형성되지 않았으며, 페닐알라닌 접합 비율이 5%인 비교예 3-2의 경우에도 페닐알라닌의 비율이 소수성 내부 (hydrophobic core)를 형성하는데 충분하지 않아 나노입자가 형성되지 않았다 (도 8). 이에 반해서 접합 비율 10, 30 및 60%로 각각 제조된 실시예 2-1, 1-1 및 2-2의 나노 입자의 경우 입자 크기가 50~300 nm사이에서 잘 형성되어 있는 것을 확인할 수 있었으며 접합 비율이 10, 30 및 60%로 증가함에 따라 입자크기가 작아지는 것으로 나타났다 (도 8).
실험예 7. 지용성 비타민 및 난용성 약물이 봉입된 폴리글루탐산 기반 나노입자의 분산 안정성 (dispersion stability in water)
실험예 7-1. 지용성 비타민이 봉입된 나노입자의 분산 안정성
지용성 비타민이 봉입된 본 발명의 나노입자들의 수용액 중에서의 분산 안정성을 확인하기 위하여 시간에 따른 크기 변화를 다음과 같이 측정하였다. 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E 및 비타민 K를 각각 봉입한 실시예 1-1 내지 1-4의 나노 입자를 봉입물질 기준 1mg/ml의 농도로 수 분산시킨 후 상온의 차광된 장소에서 2주간 보관하면서 매일 광산란 나노 입도 분석장비(ELSZ-1000, Photal OTSUKA electronics, Japan)를 이용하여 나노 입자의 크기를 측정하였다.
그 결과, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E 및 비타민 K가 각각 봉입되어 있는 실시예 1-1, 1-2, 1-3 및 1-4의 나노 입자들 모두의 크기가 14일 동안 80~200 nm 사이에서 잘 유지되어, 나노입자의 수 분산 안정성을 확인할 수 있었다(도 9).
실험예 7-2. 난용성 약물이 봉입된 나노입자의 분산 안정성
난용성 약물이 봉입된 본 발명의 나노입자들의 수용액 중에서의 분산 안정성을 확인하기 위하여 시간에 따른 크기 변화를 다음과 같이 측정하였다. 파클리탁셀 및 타목시펜을 각각 봉입한 실시예 1-5 및 1-6의 나노 입자를 봉입물질 기준 1mg/ml의 농도로 수 분산시킨 후 상온의 차광된 장소에서 2주간 보관하면서 매일 광산란 나노 입도 분석장비(ELSZ-1000, Photal OTSUKA electronics, Japan)를 이용하여 나노 입자의 크기를 측정하였다.
그 결과, 파클리탁셀 및 타목시펜가 각각 봉입되어 있는 실시예 1-5 및 1-6의 나노 입자들 모두의 크기가 14일 동안 100~200 nm 사이에서 잘 유지되어, 나노입자의 수 분산 안정성을 확인할 수 있었다(도 10).
실험예 8. 폴리감마글루탐산의 분자량에 따른 나노입자의 분산 안정성
폴리감마글루탐산의 분자량에 따른, 본 발명의 나노입자의 수용액 중에서의 분산 안정성을 확인하기 위하여 시간에 따른 크기 변화를 다음과 같이 측정하였다. 폴리감마글루탐산의 분자량을 10, 50, 100 및 300KDa로 각각 달리하여 제조된 실시예 3-1, 1-1, 3-2 및 3-3의 나노 입자를 봉입물질 비타민 A를 기준으로 1mg/ml의 농도로 수 분산시킨 후 상온의 차광된 장소에서 2주간 보관하면서 매일 광산란 나노 입도 분석장비(ELSZ-1000, Photal OTSUKA electronics, Japan)를 이용하여 나노 입자의 크기를 측정하였다.
그 결과, 폴리감마글루탐산의 분자량을 10, 50, 100 및 300KDa로 각각 달리하여 제조된 실시예 3-1, 1-1, 3-2 및 3-3의 나노 입자들 모두의 크기가 14일 동안 50~200 nm 사이에서 잘 유지되어, 나노 입자의 저장에 따른 입도 안정성을 확인할 수 있었다(도 11). 또한 이러한 입도 안정성은 사용된 폴리감마글루탐산의 분자량 3KDa 내지 450KDa의 범위내에서는 큰 차이 없이 모두 안정함을 알 수 있었다.
실험예 9. 나노입자 내 봉입에 의한 지용성 비타민의 산화 안정성 증강 효과
본 발명의 나노입자에 봉입된 비타민과 봉입하지 않은 비타민의 산화 안정성 (oxidative stability)을 과산화수소 존재하의 가혹 조건 하에서 다음과 같이 비교 실험하였다.
비타민 A (비교예 1-1), 비타민 D (비교예 1-2), 비타민 E (비교예 1-3) 및 비타민 K (비교예 1-4)를 각각 1 mg/ml 농도로 삼차증류수에 분산시킨 후 여기에 과산화수소를 0%, 3%, 10%의 부피 비율로 각각 첨가하여 0.5시간, 12시간, 24시간, 72시간 및 1주일 경과 후 해당 지용성 비타민 농도의 변화를 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 비타민 A는 325 nm, 비타민 D는 264 nm , 비타민 E는 292 nm, 비타민 K는 247 nm의 파장에서의 흡광도를 측정하였다.
또한, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E 및 비타민 K이 각각 봉입된 실시예 1-1, 1-2, 1-3 및 1-4의 나노입자를 각각 봉입물질 기준 1 mg/ml 농도로 삼차증류수에 분산시킨 후 여기에 과산화수소를 0%, 3%, 10%의 부피 비율로 각각 첨가하여 0.5시간, 12시간, 24시간, 72시간 및 1주일 경과 후 해당 지용성 비타민 농도의 변화를 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
그 결과를 도 12 내지 19에 도시하였다.
봉입되어 있지 않은 비타민 A 자체인 비교예 1-1의 경우 과산화수소에 의한 비타민 A의 안정성이 현저하게 감소하는 것이 관찰되었다(도 12). 그러나, 본 발명의 나노입자에 비타민 A가 봉입되어 있는 실시예 1-1의 경우, 과산화수소에 의한 산화 분해가 저지되어 비타민 A의 안정성이 크게 향상되는 것이 확인되었다(도 13).
봉입되어 있지 않은 비타민 D 자체인 비교예 1-2의 경우 과산화수소에 의한 비타민 D의 안정성이 현저하게 감소하는 것이 관찰되었다(도 14). 그러나, 본 발명의 나노입자에 비타민 D가 봉입되어 있는 실시예 1-2의 경우, 과산화수소에 의한 산화 분해가 저지되어 비타민 D의 안정성이 크게 향상되는 것이 확인되었다(도 15).
봉입되어 있지 않은 비타민 E 자체인 비교예 1-3의 경우 과산화수소에 의한 비타민 E의 안정성이 현저하게 감소하는 것이 관찰되었다(도 16). 그러나, 본 발명의 나노입자에 비타민 E가 봉입되어 있는 실시예 1-3의 경우, 과산화수소에 의한 산화 분해가 저지되어 비타민 E의 안정성이 크게 향상되는 것이 확인되었다(도 17).
봉입되어 있지 않은 비타민 K 자체인 비교예 1-4의 경우 과산화수소에 의한 비타민 K의 안정성이 현저하게 감소하는 것이 관찰되었다(도 18). 그러나, 본 발명의 나노입자에 비타민 K가 봉입되어 있는 실시예 1-4의 경우, 과산화수소에 의한 산화 분해가 저지되어 비타민 K의 안정성이 크게 향상되는 것이 확인되었다(도 19).
이상의 결과로부터 지용성 비타민인 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E 및 비타민 K는 모두 본 발명의 나노입자에 봉입시킴으로써 그의 산화적 안정성을 크게 향상시킬 수 있으며 따라서 본 발명의 폴리감마글루탐산 유도체를 기반으로 한 나노입자를 이용함으로써 지용성 비타민들을 경제적으로뿐만 아니라 안전성 측면에서도 효율적으로 이용할 수 있는 수단을 제공할 것으로 기대된다.
실험예 10. 나노입자에 봉입된 비타민 A의 피부 흡수 효과
본 발명의 나노입자에 봉입된 비타민 A의 피부 흡수 효과를 관찰하기 위하여 Balb/C 누드마우스 (nude mouse)의 피부를 프란츠 장치 (Franz cell)에 고정하여, 비타민 A의 흡수 양상을 농도와 시간에 따라 알아보았다.
구체적으로, Balb/C 누드마우스의 표피층을 분리하여 프란츠 장치에 고정하였다. 그 후, 트윈 20을 인산완충용액에 5%(v/v)가 되도록 만든 용액을 프란츠 장치 챔버 (chamber)에 각각 10ml씩 Balb/C 누드마우스의 피부에 밀착할 수 있게 채워주었다. 비타민 A가 봉입된 실시예 1-1의 나노입자를 비타민 A 기준 5mg/ml의 농도로 트리스 완충액 (Tris buffer)에 분산시켜 Balb/C 누드마우스의 피부 위에 2ml 적가하여 처리하였다.
또한, 봉입되지 않은 비타민 A 자체인 비교예 1-1의 경우도 트리스 완충액에 5mg/ml의 농도로 Balb/C 누드마우스의 피부 위에 2ml 적가하여 처리하였다.
피부 위에 처리한 후, 1시간, 2시간, 4시간 째의 시간 포인트에서 프란츠 장치 챔버의 5% 트윈 20/PBS (v/v)용액의 200 ㎕를 취하여 비타민 A를 UV/Vis 분광계를 이용하여 325nm 파장에서 UV 흡광도를 관찰하여 비타민 A의 경피 흡수를 관찰하였다.
실험 결과, 본 발명의 나노입자에 봉입된 비타민 A의 경우 (실시예 1-1) 봉입하지 않은 비타민 A (비교예 1-1)에 비해 1시간째에 약 40배, 2시간째에 약 38배, 4시간째에 약 23배 피부 흡수가 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 20).

Claims (9)

  1. 폴리감마글루탐산의 카르복시기들 중 10 내지 60%가 페닐알라닌 유도체의 아민기와 결합되어 있으며,
    상기 페닐알라닌 유도체가 페닐알라닌 메틸 에스터, 페닐알라닌 에틸 에스터, 페닐알라닌 프로필 에스터, 페닐알라닌 부틸 에스터, 페닐알라닌 펜틸 에스터, 페닐알라닌 헥실 에스터 및 페닐알라닌 벤질 에스터로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상의 성분이며,
    상기 폴리감마글루타민산의 분자량이 3KDa 내지 450KDa 인 폴리감마글루타민산 유도체.
  2. 친수성기와 친유성기를 함께 가지는 기본물질로서 제1항의 폴리감마글루타민산 유도체를 포함하는 나노입자.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 나노입자의 크기가 20 내지 350 nm인 나노입자.
  4. 제 2항 또는 3항에 있어서, 지용성 비타민 또는 이의 유도체가 봉입된 나노입자.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 지용성 비타민이 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 및 비타민 K, 레티닐 팔미테이트, 레티닐 아세테이트 및 토코페롤 아세테이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 성분인 것인 나노입자.
  6. 제 4항의 나노입자를 포함하는 화장품 조성물.
  7. 제 2항 또는 3항에 있어서, 난용성 의약이 봉입된 나노입자.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 난용성 의약이 파클리탁셀, 탁솔, 도세탁셀, 타목시펜, 클라리스로마이신, 아지스로마이신 및 독소루비신으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 성분인 것인 나노입자.
  9. 제 7항의 나노입자를 포함하는 의약 조성물.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101835643B1 (ko) 2017-04-26 2018-04-19 국민대학교 산학협력단 고선택성 유전자 증폭을 위한 양친성 고분자 화합물 및 그를 이용한 핵산 증폭 방법
KR102054417B1 (ko) * 2018-06-06 2019-12-10 주식회사 한국생명과학연구소 자외선차단 제제를 함유하는 화장료 조성물
WO2024107038A1 (ko) * 2022-11-17 2024-05-23 (주)한국생명과학연구소 에틸 페닐알라닌 아미도 콜라겐 및 이를 포함하는 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010095912A2 (ko) 2009-02-23 2010-08-26 성균관대학교 산학협력단 난용성 약물 나노복합체의 제조방법

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKAGI, TAKAMI ET AL.: "Hydrolytic and enzymatic degradation of nanoparticles based on amphiphilic poly(gamma-glutamic acid)-graft-1-phenylalanine copolymers.", BIOMACROMOLECULES., vol. 7, no. 1, 2006, pages 297 - 303, XP055248672 *
AKAGI, TAKAMI ET AL.: "Preparation and characterization of biodegradable nanoparticles based on poly(gamma-glutamic acid) with 1-phenylalanine as a protein carrier.", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE., vol. 108, no. 2-3, 2005, pages 226 - 236, XP029329450, ISSN: 0168-3659 *
LALATSA, AIKATERINI ET AL.: "Amphiphilic poly(1-amino acids) - New materials for drug delivery.", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE., vol. 161, no. 2, 2012, pages 523 - 536, XP028492684, ISSN: 0168-3659 *
MANOCHA, BHAVIK ET AL.: "Production and characterization of gamma-polyglutamic acid nanoparticles for controlled anticancer drug release.", CRITICAL REVIEWS IN BIOTECHNOLOGY., vol. 28, no. 2, 2008, pages 83 - 99, XP055248677, ISSN: 0738-8551 *
MATSUSAKI, MICHIYA ET AL.: "Stably-dispersed and surface-functional bionanoparticles prepared by self-assembling amphipathic polymers of hydrophilic poly(gamma-glutamic acid) bearing hydrophobic amino acids.", CHEMISTRY LETTERS., vol. 33, no. 4, 2004, pages 398 - 399, XP008119524, ISSN: 0366-7022 *

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