WO2021049768A1 - 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐 및 이의 용도 - Google Patents

레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐 및 이의 용도 Download PDF

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pluronic
chitosan
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nanocapsule
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최원일
김성현
신용철
이증훈
김진화
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주식회사 스킨메드
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Definitions

  • the present invention relates to a nanocapsule coated with chitosan containing retinol or a retinol derivative, and to a use thereof, and more particularly, to retinol or a retinol derivative and pluronic having increased stability and antioxidant effect of retinol or a retinol derivative. It relates to nanocapsules coated with chitosan on nanoparticles and their use.
  • Retinol is a fat-soluble substance, also called vitamin A, and is classified into retinol obtained from animal foods and carotenoids obtained from plant foods. Retinol is known as an essential component for normal cell differentiation and growth of bones, teeth, hair, and nails. In particular, it promotes the differentiation of skin cells and promotes the biosynthesis of collagen, which affects wrinkles, and elastin, which affects elasticity, to reduce wrinkles and increase skin elasticity. It is an anti-aging (wrinkle improvement) ingredient.
  • retinol has a cell proliferation inhibitory activity, so when ingested throughout the body, retinol not only prevents the proliferation of cancer, but also plays an important role in immune function, such as being used as a leukemia therapeutic agent or an anti-inflammatory agent.
  • retinol is difficult to use because of its low absorption rate due to its low solubility in water and its physiological activity degraded by being easily decomposed by light or ultraviolet rays. As a functional food, its utilization is very low.
  • Retinly palmitate is a derivative of retinol and has higher stability than retinol by binding palmitic acid to retinol.
  • Retinyl palmitate is known to prevent cell damage and skin aging due to its excellent antioxidant effect, and is one of the anti-wrinkle functional ingredients notified by the Ministry of Food and Drug Safety.
  • retinyl palmitate is also used as a treatment for acne, and its use in the health functional food, pharmaceutical and cosmetic industries is being highlighted while alleviating diseases caused by vitamin A deficiency such as night blindness.
  • vitamin A deficiency such as night blindness
  • retinol derivatives such as retinol or retinyl palmitate
  • retinol or retinol derivatives reported to date include nanoemulsions, multiple emulsions with antioxidants, cyclodextrin inclusion, solid lipid nanoparticles, and liposomes. Etc. (Kim Yong-no, 2017).
  • the drug is trapped inside and released slowly, and it is difficult to freeze-dry, so storage is not easy.
  • studies on the formation of complexes using cyclic dextrins have been conducted at home and abroad for a relatively long time, but there are problems such as to overcome disadvantages such as toxicity and low solubility.
  • O/W oil in water emulsion
  • W/O water in oil emulsion
  • O/W oil in water emulsion
  • O/W/O oil in water emulsion
  • the emulsion form in which these two basic types exist simultaneously in one system is a multi-emulsion, and among them, the O/W/O form has been widely reported as an attempt to stabilize retinol or a retinol derivative.
  • the structural characteristics of O/W/O in which the two oil phases are separated from each other by an aqueous solution, are being noted as a stable system because retinol is protected from the outside, but industrial applications in food and pharmaceuticals are limited as an oil liquid.
  • the present inventors in the process of developing a delivery system that can increase the antioxidant efficacy by improving the stability of retinol or retinol derivatives, a method for producing nanocapsules having excellent stability in which chitosan is coated on nanoparticles containing Pluronic. It was established, and it was confirmed that the stability of the retinol or the retinol derivative was increased and the antioxidant effect was remarkably improved when retinol or a retinol derivative was supported on such nanocapsules. In addition, it was possible to complete the present invention by confirming that the nanocapsules coated with chitosan containing retinol or a retinol derivative have excellent skin transmittance.
  • Korean Patent Publication No. 2007-0072301 describes the effect of improving the stability and solubility of retinol according to the structure of nanoparticles and nanoparticles prepared by mixing a retinol solution and a chitosan solution, but is added to prevent the oxidation of retinol.
  • the composition is different from the nanocapsules coated with chitosan on the nanoparticles containing retinol or retinol derivatives and pluronics of the present invention, and contains the retinol or retinol derivatives of the present invention.
  • the increased antioxidant effect of chitosan-coated nanocapsules is not described or implied at all.
  • composition of a nanocapsule coated with chitosan containing retinol or a retinol derivative with improved stability of retinol or a retinol derivative without the addition of an antioxidant of the present invention as a composition additionally containing an antioxidant to inhibit the oxidation of the active substance
  • the effect of enhancing skin permeability without treatment with a skin permeation accelerator is not described.
  • An object of the present invention is to provide a nanocapsule coated with chitosan containing retinol or a retinol derivative, and more specifically, to provide a nanocapsule coated with chitosan on the nanoparticles containing retinol or a retinol derivative and Pluronic I have to.
  • an object of the present invention is to provide an antioxidant composition comprising the nanocapsules, a cosmetic composition for improving wrinkles or acne, or a pharmaceutical composition for preventing or treating acne.
  • the present invention relates to a nanocapsule coated with chitosan containing retinol or a retinol derivative, and more particularly, to a nanocapsule coated with chitosan on the nanoparticles containing retinol or a retinol derivative and Pluronic.
  • the nanocapsules include a first step of dissolving retinol or a retinol derivative in an organic solvent, and then adding Pluronic to react at room temperature to prepare a reaction solution; A second step of preparing nanoparticles by dropping the reaction solution of step 1 into distilled water and continuously stirring to evaporate and remove the organic solvent of the reaction solution naturally; And a third step of coating chitosan by adding chitosan to the nanoparticles of step 2; It can be manufactured through a process consisting of.
  • the retinol or retinol derivative may contain more than 0 parts by weight to 10 parts by weight based on 100 parts by weight of Pluronic.
  • the Pluronic is Pluronic L35, Pluronic L43, Pluronic L44, Pluronic L64, Pluronic F68, Pluronic P84, Pluronic P85, Pluronic F87, Pluronic F88, It may be one or more selected from the group consisting of Pluronic F98, Pluronic P103, Pluronic P104, Pluronic P105, Pluronic F108, Pluronic P123, and Pluronic F127.
  • the chitosan may have a molecular weight of 3 to 200 kDa.
  • the chitosan may have a degree of deacetylation of 50 to 90%.
  • the chitosan may be 0.001 to 200 parts by weight based on 100 parts by weight of Pluronic.
  • the nanocapsule may have a particle size of 30 to 500 nm at 32.5 to 37°C.
  • the organic solvent of the first step may be at least one selected from the group consisting of acetone, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, acetonitrile, and tetrahydrofuran.
  • the distilled water in the second step may be used 4 times the volume of the organic solvent in the first step.
  • the nanocapsules may have an antioxidant activity increased by two or more times compared to treatment with retinol or a retinol derivative alone.
  • the nanocapsule may have a skin transmittance of 10 times or more increased compared to treatment with retinol or a retinol derivative alone.
  • the present invention relates to an antioxidant composition containing a nanocapsule coated with chitosan on the nanoparticles comprising the retinol or retinol derivative and pluronic.
  • the present invention relates to a cosmetic composition for improving wrinkles or acne, comprising nanocapsules coated with chitosan on nanoparticles comprising the retinol or retinol derivatives and pluronic.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating acne, comprising nanocapsules coated with chitosan on nanoparticles containing retinol or retinol derivatives and pluronic.
  • the present invention relates to a nanocapsule coated with chitosan containing retinol or a retinol derivative, and more particularly, to a nanocapsule coated with chitosan on the nanoparticles containing retinol or a retinol derivative and Pluronic.
  • the "nanocapsule” is a nano-sized hollow ball-shaped capsule, and various substances, such as an active agent, may be contained in the hollow interior of the nanocapsule.
  • the nanocapsules support retinol or a retinol derivative as an active agent.
  • the nanocapsule of the present invention can be prepared using a manufacturing method known in the art. Preferably, they are a nanoprecipitation method and a membrane re-dispersion method, and more preferably a nanoprecipitation method.
  • the nanocapsule is a first step of dissolving retinol or a retinol derivative in an organic solvent, and then adding Pluronic to react at room temperature to prepare a reaction solution; A second step of preparing nanoparticles by dropping the reaction solution of step 1 into distilled water and continuously stirring to evaporate and remove the organic solvent of the reaction solution naturally; And a third step of coating chitosan by adding chitosan to the nanoparticles of step 2; It can be manufactured through a process consisting of.
  • the organic solvent of the first step may be one or more selected from the group consisting of acetone, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, acetonitrile, and tetrahydrofuran, but is not limited thereto. It is preferably at least one selected from the group consisting of acetone, DMSO, ethanol and acetonitrile, and more preferably acetone.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • ethanol acetonitrile
  • tetrahydrofuran but is not limited thereto. It is preferably at least one selected from the group consisting of acetone, DMSO, ethanol and acetonitrile, and more preferably acetone.
  • the distilled water in the second step may be used 2 to 10 times the volume of the organic solvent in the first step. Preferably, 2 to 5 times are used, more preferably 4 times. If the distilled water is used less than twice the volume of the organic solvent, partial precipitation may occur, and if it is more than 10 times, the chitosan coating may be unstable or the concentration of the nanocapsules may be diluted and a concentration process may be added. Can't do it.
  • Nanocapsules manufactured through the above manufacturing method may be powdered through freeze drying.
  • the freeze-dried powdered nanocapsules are stably redispersed without agglomeration during the freeze-drying process, and stability can be maintained without clumping or precipitation even if stored for a long time in the redispersed state.
  • retinol is a fat-soluble substance, also called vitamin A, and is an essential component for normal differentiation of cells and growth of bones, teeth, hair, nails, and the like.
  • vitamin A vitamin A
  • antioxidant activity promotes the differentiation of skin cells, promotes the biosynthesis of collagen, which affects wrinkles, and elastin, which affects elasticity, to reduce wrinkles and increase skin elasticity.
  • collagen which affects wrinkles
  • elastin which affects elasticity
  • it is a representative anti-wrinkle ingredient.
  • it is known to have excellent acne treatment effect.
  • retinol derivative refers to a compound modified to improve the functionality and stability of retinol, and the retinol derivative is retinyl acetate, retinyl palmitate, and retinoic acid (retinoic acid), but is not limited thereto.
  • the nanocapsule may contain at least one selected from the group consisting of retinol or retinol derivatives, and preferably at least one selected from the group consisting of retinol, retinyl acetate, retinyl palmitate, or retinoic acid is included. .
  • the retinol or retinol derivative may contain at least 0 parts by weight, which represents the efficacy and effect of the retinol or retinol derivative, based on 100 parts by weight of Pluronic.
  • the amount of the retinol or retinol derivative exceeds 10 parts by weight, the size of the nanoparticles becomes too large, or the nanoparticles do not contain all of the retinol or the retinol derivative, and thus an accurate effective amount of retinol or a retinol derivative cannot be delivered, which is not preferable.
  • Pluronic is a hydrophilic polymer and exhibits a temperature-sensitive property, and derivatives having various hydrophile-lipophile balance (HLB) exist.
  • the Pluronic is a Pluronic having an HLB of 8 to 29, such as Pluronic L35, Pluronic L43, Pluronic L44, Pluronic L64, Pluronic F68, Pluronic P84, Pluronic In the group consisting of P85, Pluronic F87, Pluronic F88, Pluronic F98, Pluronic P103, Pluronic P104, Pluronic P105, Pluronic F108, Pluronic P123 and Pluronic F127 It may be one or more selected, preferably Pluronic having an HLB of 15 to 29, such as Pluronic L35, Pluronic L44, Pluronic L64, Pluronic F68, Pluronic P85, Pluronic Nick F87, Pluronic F88, Pluronic F98, Pluronic P105, Pluronic
  • the nanoparticles are nanoparticles made of retinol or a retinol derivative and pluronic, and the size of the nanoparticles may vary depending on the measurement temperature due to temperature sensitivity. Specifically, the lower the temperature, the larger the particle size may be.
  • the nanoparticles may have a particle size of 5 to 80 nm at 32.5 to 37°C. Preferably it is 5-50 nm.
  • chitosan is a polysaccharide formed by partial deacetylation of chitin, and is a non-toxic, biocompatible, biodegradable polymer material that has high hydrophilicity and high mucosal adhesion properties. .
  • Chitosan has high solubility in an acidic environment and tends to be positively charged, so it easily adheres to mucous membranes, has antibacterial and hemostatic effects, and has antioxidant activity.
  • the chitosan generally exhibits high solubility in acidic solutions such as acetic acid and lactic acid. In the case of chitosan dissolved in the acidic solution, when applied to the human body, it may cause skin irritation or disorder due to a change in pH in the human body.
  • the chitosan of the present invention is easily soluble in water, and problems that appear when chitosan soluble in an acidic solution is used can be overcome.
  • the chitosan may have a molecular weight of 3 to 200 kDa. It is preferably 3 to 100 kDa, more preferably 3 to 20 kDa, and most preferably 3 to 10 kDa. When the molecular weight of the chitosan is more than 200 kDa, the solubility in water or antioxidant activity is low, which is not preferable.
  • the chitosan may have a degree of deacetylation of 50 to 90%.
  • the degree of deacetylation is 70 to 90%, and more preferably, the degree of deacetylation is 90%.
  • the degree of deacetylation of the chitosan is less than 50%, the solubility in water or antioxidant activity is low, which is not preferable.
  • the chitosan may contain 200 parts by weight or less based on 100 parts by weight of Pluronic. It is preferably 0.001 to 200 parts by weight, more preferably 0.001 to 100 parts by weight. If chitosan is less than 0.001 parts by weight, the surface of the nanoparticles is not sufficiently coated with chitosan, so it may be difficult to show a positively charged surface charge. If chitosan is more than 200 parts by weight, the size of the nanocapsules becomes too large or partial precipitation occurs. It is not desirable to be able to.
  • the nanocapsules exhibit temperature-sensitive properties, and a particle size may increase as the temperature decreases.
  • the nanocapsules have a particle size of 1,000 nm or less at 10°C, and the particle size decreases at a temperature higher than 10°C.
  • the nanocapsules preferably have a particle size of 500 nm or less at 32.5 to 37°C, more preferably 30 to 500 nm at 32.5 to 37°C, and more preferably at 32.5 to 37°C. It is 30 to 300 nm, and most preferably, the particle size is 30 to 100 nm at 32.5 to 37°C. If the particle size of the nanocapsules exceeds 500 nm at 32.5 to 37°C, the skin penetration efficiency is low when applied to the skin, which is not preferable.
  • the surface of the nanocapsule is coated with chitosan, the surface charge of the nanocapsule is positively charged, so that skin transmittance and mucosal adhesion may be increased.
  • the skin transmittance of the nanocapsules may be increased by 10 times or more compared to the case where retinol or retinol derivatives contained in the nanocapsules are treated alone, and may be increased by 4 times or more compared to nanoparticles not coated with chitosan. have.
  • the nanocapsules may exhibit an increased antioxidant effect of two times or more compared to the case where retinol or a retinol derivative contained in the nanocapsules is treated alone, and the increased antioxidant effect of the nanocapsules is coated on the nanocapsules. It may be an increase due to the antioxidant activity of chitosan.
  • the nanocapsules can exhibit increased antioxidant effects by preventing decomposition by blocking retinol or retinol derivatives supported thereon from light or ultraviolet rays that may cause structural decomposition due to the structural characteristics of the nanocapsules. The effect can be maintained continuously for a long time.
  • the nanocapsules are made by physical bonding between the pluronic constituting the nanoparticles and the chitosan coated on the surface of the nanoparticles, and use a pluronic-chitosan polymer prepared through chemical bonding between the pluronic and chitosan. Unlike the nanoparticles produced by the method, there is no need for a separate process for producing a polymer, and toxicity due to the binder used for producing the polymer does not need to be considered.
  • the present invention relates to an antioxidant composition
  • an antioxidant composition comprising nanocapsules coated with chitosan on nanoparticles comprising the retinol or retinol derivative and pluronic.
  • the antioxidant composition can maintain the antioxidant effect for a long period of time by preventing decomposition of retinol or retinol derivatives.
  • the antioxidant composition reacts with active oxygen, thereby inhibiting or minimizing damage to a living body caused by active oxygen.
  • the reactive oxygen is very reactive and reacts quickly with biomolecules, causing lipid oxidation, protein denaturation, and DNA damage in biological membranes, and various diseases such as cancer, arteriosclerosis, diabetes, autoimmune diseases, aging, stroke, Parkinson's disease, etc. May increase the risk of developing the disease. Therefore, it is possible to restore the function of cells through the antioxidant effect of the antioxidant composition, prevent or delay the progression of aging, as well as improve the chronic inflammation control and immunity to improve a healthy quality of life.
  • the antioxidant composition may be a cosmetic composition, a pharmaceutical composition, a food composition or an additive composition for cosmetics, pharmaceuticals, food or feed.
  • Cosmetics, pharmaceuticals, foods, feeds, etc. often contain unsaturated fatty acids that can be easily rancid when in contact with air, and rancidity of these unsaturated fatty acids degrades the aroma and taste of cosmetics, medicines, foods, feeds, etc. Therefore, it is possible to suppress rancidity by adding an antioxidant as an additive.
  • the present invention may also be a composition for improving wrinkles or acne containing nanocapsules coated with chitosan on nanoparticles including the retinol or retinol derivatives and pluronic.
  • the cosmetic composition is an adjuvant commonly used in the nanocapsules and cosmetic fields, such as hydrophilic or lipophilic gelling agents, hydrophilic or lipophilic activators, preservatives, antioxidants, solvents, fragrances, fillers, blockers, pigments, odorants or dyes. It may contain.
  • the amount of the auxiliary agent is an amount commonly used in the art, and in any case, the auxiliary agent and its ratio may be selected so as not to adversely affect the desirable properties of the cosmetic composition according to the present invention.
  • the cosmetic composition is one or more selected from the group consisting of lotion, skin softener, skin toner, ampoule, astrigent, cream, foundation, essence, pack, mask pack, soap, body cleanser, cleansing foam, body oil, and body lotion. It may be made of a formulation, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition may be used every day, and may be used for an unspecified period, and preferably, the amount of use, the number of uses, and the period may be adjusted according to the user's age, skin condition, or skin type.
  • the wrinkle-improving cosmetic composition is an active ingredient having anti-wrinkle effect, such as adenosine, polyethoxylate dretinamide, safflower seed extract, Yeongyo extract, Astragalus extract, Schisandra chinensis extract, tocopheryl acetate, oleanolic acid, ubiquinone, hydride It may further include oxydecyl ubiquinone and the like.
  • the cosmetic composition for improving acne may further include an active ingredient having an effect of improving acne.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating acne, comprising nanocapsules coated with chitosan on nanoparticles including retinol or retinol derivatives and pluronic.
  • the pharmaceutical composition may include the nanocapsule and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • Each of the pharmaceutical compositions may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, and other oral formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to a conventional method.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oils.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient in the nanocapsules, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin. It is prepared by mixing the back. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspension propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like may be used.
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the formulation may be used as an external preparation for skin having one formulation selected from ointments, lotions, sprays, patches, creams, and gels.
  • Agents that increase transdermal absorption may include, in particular, dimethylsulfoxide, dimethylacetamide, dimethylformamide, surfactants, alcohols, acetone, propylene glycol or polyethylene glycol.
  • the frequency of application may vary considerably depending on the age, sex, weight of the subject to be treated, the specific disease or pathology to be treated, the severity of the disease or pathology, the route of administration, and the judgment of the prescriber.
  • every week to 4 times a day more preferably 3 times per week to 3 times a day, even more preferably once or twice a day is proposed, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as mice, livestock, humans, and companion animals by various routes. All modes of administration can be expected and may be administered, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, skin, intrauterine dural or cerebrovascular injection. It is preferably administered by skin.
  • the present invention relates to a nanocapsule coated with chitosan containing retinol or a retinol derivative and a use thereof, and more specifically, a nanocapsule coated with chitosan on a nanoparticle containing retinol or a retinol derivative and a pluronic, and uses thereof
  • a method for manufacturing nanocapsules having a particle size of 500 nm or less, particularly 200 nm or less, and excellent stability was established, and chitosan is contained in nanoparticles including retinol or a retinol derivative and pluronic through the established manufacturing method.
  • Coated nanocapsules were prepared.
  • the antioxidant activity of the prepared nanocapsules was increased compared to the retinol or retinol derivative alone, it was confirmed that the antioxidant activity was maintained even during long-term storage, and the skin permeability was also significantly increased.
  • the nanocapsules coated with chitosan on the nanoparticles containing retinol or retinol derivatives and Pluronic of the present invention can be used in the development of cosmetics or pharmaceuticals for wrinkle improvement cosmetics or acne improvement or treatment, as well as antioxidant efficacy It is expected that it can be used in cosmetics, pharmaceutical fields, and food industries that require the product.
  • Figure 2 is a result of analyzing the characteristics of the prepared chitosan-coated nanocapsules according to the molecular weight of chitosan, (A) is the size of the nanocapsules, (B) is the polydispersity (PDI) of the nanocapsules, (C ) Shows the surface charge of the nanocapsule, and (D) shows the result of confirming the shape of the nanocapsule.
  • A is the size of the nanocapsules
  • B is the polydispersity (PDI) of the nanocapsules
  • C Shows the surface charge of the nanocapsule
  • D shows the result of confirming the shape of the nanocapsule.
  • FIG. 5 is a solution state of the nanocapsules coated with chitosan containing retinol or retinol derivatives of the present invention, depending on whether retinol or retinol derivatives are supported, and the state of the nanocapsules after freeze-drying (A) and particles according to the content of retinol or retinol derivatives The results of confirming the size (B), polydispersity (DPI) (C) and surface charge (D) are shown.
  • Figure 6 shows the results of confirming the stability of the nanocapsules according to freeze-drying of the chitosan-coated nanocapsules containing retinol or a retinol derivative of the present invention (A) and the long-term storage stability of the freeze-dried nanocapsules (B). .
  • Figure 8 shows the results of confirming the skin transmittance of the nanocapsules coated with chitosan containing retinol or a retinol derivative of the present invention.
  • Example 1-1 Confirmation of the size of nanoparticles according to the type of Pluronic
  • Pluronic is a nonionic material consisting of poly(ethylene oxide), PEO, which is a hydrophilic polymer, and poly(propylene oxide), PPO, which is a hydrophobic polymer.
  • PEO-PPO-PEO triblock copolymer a typical temperature-sensitive polymer, has a unique characteristic that changes reversibly due to changes in internal structure with increasing temperature.
  • Pluronic derivatives with various hydrophile-lipophile balance (HLB) exist according to the number of added moles of PEO and PPO of Pluronic, and HLB of Pluronic affects the particle size when preparing nanoparticles using Pluronic. Can give. Accordingly, the size of the nanoparticles according to the type of Pluronic was confirmed.
  • Nanoparticles were prepared using Pluronic corresponding to HLB 8 to 29. Specifically, 20 mg of Pluronic was dissolved in 1 ml of acetone to prepare a reaction solution. The prepared reaction solution was slowly dropped into 4 ml of tertiary distilled water stirred at 530 rpm and then reacted at room temperature for 12 hours or longer, so that acetone was naturally evaporated and removed to prepare nanoparticles made of pluronic. I did. The particle size of the prepared nanoparticles was analyzed using a particle size analyzer (Zetasizer, Nono-Zs, Malvern) and transmission electron microscopy, and the results are shown in FIG. 1.
  • a particle size analyzer Zetasizer, Nono-Zs, Malvern
  • nanoparticles made of Pluronic corresponding to 8 to 29 had a particle size of 200 nm or less at 37°C.
  • Example 1-2 Manufacture of chitosan-coated nanocapsules
  • Example 1-1 Based on the results of Example 1-1, when manufacturing the chitosan-coated nanocapsule of the present invention, pluronic F127 (poloxamer 407), a biocompatible material approved by the US Food and Drug Administration, was used, and nanoprecipitation Chitosan-coated nanocapsules were prepared using nanoprecipitation.
  • pluronic F127 polyxamer 407
  • nanoprecipitation Chitosan-coated nanocapsules were prepared using nanoprecipitation.
  • a reaction solution 20 mg was dissolved in 1 ml of acetone to prepare a reaction solution.
  • the prepared reaction solution was slowly dropped into 4 ml of tertiary distilled water stirred at 530 rpm and added, and then reacted at room temperature for 12 hours or longer so that acetone was naturally evaporated and removed.
  • PluNC PluNC
  • 20 mg of chitosan having the same weight as Pluronic F127 was added and mixed at room temperature for at least 1 hour to prepare a chitosan-coated nanocapsule (hereinafter referred to as ChiNC) of the present invention.
  • ChiNC chitosan-coated nanocapsule
  • the PluNC was coated using chitosan of various molecular weights, and the shape, size, polydispersity index (PDI) and surface charge of the ChiNC prepared according to the molecular weight of chitosan were measured using a particle size analyzer (Zetasizer, Nono-Zs, Malvern). ) And a transmission electron microscopy (transmission electron microscopy), and the results are shown in FIG. 2.
  • PDI polydispersity index
  • FIG. 2 transmission electron microscopy
  • ChiNC ChiNC 3K, ChiNC 10K, ChiNC 20K coated with chitosan having a molecular weight of 20 kDa (20K) or less was confirmed to have a particle size of 100 nm or less, and molecular weight It was confirmed that ChiNC (ChiNC 50K, ChiNC 100K) coated with chitosan of 50 kDa or more had a particle size of about 200 nm.
  • ChiNC coated with chitosan having a molecular weight of 20 kDa or less (ChiNC 3K, ChiNC 10K, ChiNC 20K) has a dispersion degree of 0.2 or less, and ChiNC coated with chitosan having a molecular weight of 50 kDa or more. (ChiNC 50K, ChiNC 100K) confirmed that the dispersion degree was about 0.2 to 0.3.
  • PluNC without chitosan coating has a negative charge of about -5 mV, whereas when chitosan is coated, all of the chitosan is positively charged regardless of the molecular weight of the chitosan. It was confirmed that there was a band.
  • the chitosan was stably coated on the surface of the nanoparticles made of Pluronic through the above manufacturing method, and according to the molecular weight of the chitosan to be coated, the nanocapsules were It was found that it affects the size and dispersibility. Furthermore, it was found that when the molecular weight of chitosan is 3 to 20 kDa, nanocapsules having a small size and uniform size and stability of the formulation can be prepared.
  • nanocapsules are prepared by coating 10kDa chitosan on nanoparticles prepared using a polymer material other than Pluronic, the polymer material does not contain a stabilizer, so partial precipitation or complete precipitation. This occurred, and it was confirmed that unstable nanoparticles were prepared with a size of the nanoparticles of 300 nm or more, which was undesirable.
  • NIH3T3 cells were aliquoted into a 96-well plate at 10,000 cells per well, and then cultured for 8-12 hours. Thereafter, all of the PluNC or ChiNC prepared in Example 1-2 were treated to be 10 ⁇ g/ml, 20 ⁇ g/ml, 50 ⁇ g/ml, and 100 ⁇ g/ml, respectively, and cultured for 24 hours, and then CCK8 (cell Counting kit-8) and the cell viability was confirmed based on the manual provided by the manufacturer, and the results are shown in FIG. 3. At this time, NIH3T3 cells that were not treated with anything were used as a control, and the cell survival rate for each treatment group was analyzed based on the cell survival rate of the control group as 100%.
  • the chitosan-coated nanocapsule of the present invention is a material having excellent biocompatibility that does not cause cytotoxicity.
  • Chitosan plays an important role in the body's bioregulatory functions such as anticancer, anti-cholesterol, and liver function by activating cells to inhibit aging and strengthening immunity. It is a derived polysaccharide polymer. Chitosan shows a decisive difference in efficacy depending on the degree of deacetylation.
  • DAC 70% chitosan and DAC 90% chitosan showed the highest antioxidant effect, but compared to DAC 70% chitosan, DAC 90% chitosan is known to have better antibacterial activity and better skin permeability. Based on this, it was found that the most optimal chitosan for preparing a chitosan-coated nanocapsule containing retinol or a retinol derivative of the present invention has a molecular weight of 10 kDa and a DAC of 90%.
  • chitosan having a molecular weight of 10 kDa and a DAC of 90%.
  • Example 3-2 Confirmation of the properties of retinol or chitosan-coated nanocapsules containing retinol derivatives according to the content of retinol or retinol derivatives
  • retinyl palmitate 0.4 mg, 1 mg, or 2 mg (2 parts by weight, 5 parts by weight, or 10 parts by weight, respectively, based on 100 parts by weight of Pluronic) in 1 ml of acetone
  • Pluronic F127 20 mg was added and stirred at room temperature for 2 hours to prepare a reaction solution.
  • the prepared reaction solution was slowly dropped into 4 ml of tertiary distilled water stirred at 400 rpm, and acetone was naturally evaporated while stirring for 12 hours or more in a fumehood.
  • RP@ChiNC Chitosan coated nanocapsules
  • the amount of retinol or retinol derivative that can be supported on the chitosan-coated nanocapsules without changing the properties of the nanocapsules is up to 5 weight. I was able to find out.
  • Example 3-3 Stability check of retinol or chitosan-coated nanocapsules containing retinol derivatives according to the content of retinol or retinol derivatives
  • RP@ChiNC containing 5 parts by weight of RP prepared in Example 3-2 was used.
  • Example 3-2 It was prepared by the manufacturing method of Example 3-2, but prepared by RP@ChiNC containing 5 parts by weight of RP before and after freeze-drying. After dispersing the prepared RP@ChiNC in tertiary distilled water or phosphate-buffered saline (PBS), the particle size of the dispersed RP@ChiNC was analyzed using a particle size analyzer and a transmission electron microscope. In addition, in the case of dispersing RP@ChiNC after freeze-drying, particle size was analyzed every week in the process of leaving for four times, and the results are shown in FIG. 6.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • nanocapsules coated with chitosan containing retinol or a retinol derivative of the present invention were stably redispersed without agglomeration of the nanocapsules during the freeze drying process, and excellent stability without clumping or precipitation even after redispersing. It can be seen that it represents. In addition, it was found that nanocapsules with improved stability can be obtained without an additional cryoprotectant.
  • the antioxidant activity of the retinol or retinol derivatives was analyzed.
  • Antioxidant activity was performed in the same manner as in the DPPH assay of Example 3-1, but each sample was prepared and used as follows. After analyzing the content of RP supported in RP@ChiNC containing 5 parts by weight of retinol palmitate (RP) prepared in Example 3-2 through HPLC, RP so that the amount of RP was 2.5 mg/ml. @ChiNC aqueous solution was prepared. 150 ⁇ l of the prepared RP@ChiNC aqueous solution was dispensed into a 96-well plate.
  • aqueous solution of 2.5 mg/ml of retinyl palmitate (RP) or an aqueous solution obtained by dispersing ChiNC (nanocapsules coated with chitosan) having the same weight as RP@ChiNC was dispensed by 150 ⁇ l to compare the antioxidant activity.
  • each sample prepared above was stored at 37° C. and 100 rpm for 4 weeks, and the change in antioxidant activity was confirmed weekly in the same manner as in the DPPH assay of Example 3-1, and the content of RP was analyzed through HPLC analysis.
  • the results are shown in Fig. 7 and Table 1 below.
  • the content of RP was calculated by converting the content after 1 week and 4 weeks into a percentage of 2.5 mg/ml at week 0 as 100%.
  • the nanocapsules coated with chitosan containing retinol or retinol derivatives of the present invention improve structural stability of retinol or retinol derivatives to prevent decomposition, thereby continuously maintaining the antioxidant efficacy of retinol or retinol derivatives, as well as antioxidant activity. I could see that it promotes.
  • a formulation containing a drug is applied to a donor chamber, a physiological saline solution such as phosphate buffered saline (PBS) is filled in the receptor chamber, and between the donor chamber and the receptor chamber.
  • PBS phosphate buffered saline
  • a permeable layer such as a permeable membrane, animal skin, or cell cultured skin, skin permeability and the like can be measured by measuring the amount of the drug passing through the permeable layer in the donor chamber and passing through the receptor chamber.
  • the human cadaver skin was fixed between the receptor chamber and the donor chamber, and the donor chamber RP@ChiNC containing 5 parts by weight of RP prepared in Example 3-2 was added to 5 mg/ml.
  • RP was treated alone as a control.
  • the conditions of the receptor chamber were adjusted to 37°C, 600 rpm, and 500 ⁇ l samples were taken from the receptor chamber at 0.5, 1, 2, 3, 8, 12, and 24 hours, and the content of RP for each hour was measured by HPLC. The transmittance was measured, and the results are shown in FIG. 8.
  • the skin permeability of the nanocapsules coated with chitosan containing retinol or retinol derivatives of the present invention is very excellent, and the transdermal delivery rate of retinol or retinol derivatives is increased through such excellent skin permeability, thereby increasing the excellent physiological activity of retinol. It could be expected that it could be represented.

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Abstract

본 발명은 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐 및 이의 용도에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐 및 이의 용도에 관한 것으로, 500㎚ 이하, 특히나 200㎚ 이하의 입자 크기를 갖고 안정성이 우수한 나노캡슐 제조 방법을 확립하였고, 확립한 제조 방법을 통해 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노 입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐을 제조하였다. 또한, 상기 제조된 나노캡슐의 항산화 활성은 레티놀 또는 레티놀 유도체 단독에 비해 증가하였으며, 장기 보관시에도 항산화 활성이 유지되는 것을 확인하였으며, 피부 투과율도 현저히 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노 입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐을 주름 개선용 화장품 또는 여드름 개선 또는 치료를 위한 화장료 또는 의약품 개발에 이용할 수 있을 뿐만 아니라 항산화 효능을 필요로 하는 화장품, 의약 분야, 식품 산업에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐 및 이의 용도
본 발명은 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 레티놀 또는 레티놀 유도체의 안정성 및 항산화 효과를 증가시킨 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노 입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐 및 이의 용도에 관한 것이다.
레티놀(retinol)은 비타민 A라고도 불리는 지용성 물질로 동물성 식품에서 얻어지는 레티놀과 식물성 식품에서 얻어지는 카로티노이드로 구분된다. 레티놀은 세포의 정상적인 분화와 뼈, 이, 머리카락, 손톱 등의 성장에 필수적인 성분으로 알려져 있다. 특히, 피부세포의 분화를 촉진하고 주름에 영향을 주는 콜라겐과 탄력에 영향을 주는 엘라스틴 등의 생합성을 촉진하여 주름을 감소시키고 피부 탄력을 증대시키는 효능이 있어 인지도가 가장 높고, 유효성이 검증된 대표적인 항노화(주름 개선) 성분이다. 또한, 레티놀은 세포 증식 억제 활성이 있어 전신에 섭취되었을 때 암의 증식을 예방하는 작용을 할뿐만 아니라 백혈병 치료제, 항염증제로도 쓰이는 등 면역 기능에 중요한 역할을 하고 있다.
레티놀은 여러 유용한 장점들에도 불구하고 물에 대한 낮은 용해도로 인한 낮은 흡수율과 빛이나 자외선에 의해 쉽게 분해되어 생리활성이 저하되는 단점이 있어 활용하기가 어려운 상황이며, 더불어 가공적성에서의 제약이 많아 기능성 식품으로써 활용이 매우 낮은 상황이다.
레티닐 팔미테이트(retinly palmitate)는 레티놀의 유도체로 레티놀에 팔미트산을 결합해 레티놀보다 높은 안정성을 가진다. 레티닐 팔미테이트는 뛰어난 항산화 효능을 가져 세포의 손상 및 피부 노화를 막는다고 알려져 있으며, 식품의약품안전처를 통해 고시된 주름개선 기능성 성분 중 하나이다. 또한, 레티닐 팔미테이트는 여드름 치료제로도 사용되고 있으며, 야맹증과 같은 비타민 A 결핍으로 인한 질병을 완화하면서 건강기능식품, 제약 및 화장품 산업에서의 활용이 조명되고 있다. 그러나 팔미트산을 결합해 안정성을 높였음에도 불구하고 빛, 산화, 열, 습도와 같은 다양한 환경 요인으로 인해 쉽게 변성 및 파괴되어 시간이 흐를수록 낮은 항산화 효능을 보인다.
따라서 레티놀 또는 레티닐 팔미테이트와 같은 레티놀 유도체들의 기능을 효율적으로 극대화하기 위해서는 이들의 안정성을 향상시키고 생체 흡수율을 증가시켜 체내에서 활성을 나타낼 수 있도록 하는 전달시스템의 제조가 반드시 필요하다.
레티놀과 같은 소수성 기능 성분들의 전달시스템을 제조함에 있어 고려해야 할 중요한 점은, 첫째, 전달하고자 하는 기능 성분들의 안정성이 유지될 수 있어야 하며, 둘째, 인체 내로 유입되었을 때 소수성 기능 성분의 생체이용률을 향상시켜 기능 성분들의 활성이 제대로 체내에서 발휘될 수 있느냐 하는 것이다.
최근까지 보고된 레티놀 또는 레티놀 유도체들의 전달시스템으로는 나노에멀젼(nanoemulsion), 항산화제 첨가 다중에멀젼(multiple emulsion), 환형덱스트린(cyclodextrin) 포접, 고체 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle), 리포솜(liposome) 등이 있다(김용노, 2017). 그러나 상기와 같은 전달시스템의 경우, 약물이 안에 갇혀 느리게 방출되고, 동결 건조하는데 어려움이 있어 보관이 용이하지 않다. 또한, 환형덱스트린을 이용한 복합체 형성에 관한 연구는 국내외에서 비교적 오랜 시간 동안 진행되어 왔으나, 독성이나 낮은 용해도 등의 단점을 극복해야 하는 문제점 등이 있다.
상기 레티놀 또는 레티놀 유도체의 전달시스템 중 가장 많이 이용되는 것은 에멀젼으로, 가장 일반적인 형태는 수중유적형(oil in water emulsion, O/W)과 유중수적형(water in oil emulsion, W/O)이며, 이 기본적인 두 가지 타입이 한 시스템에 동시에 존재하는 에멀젼 형태가 다중에멀젼으로서, 그 중에서도 특히 O/W/O 형태가 레티놀 또는 레티놀 유도체를 안정화시키기 위한 시도로 많이 보고되고 있다. 두 개의 오일 상이 수용액에 의해서 서로 분리되어 있는 O/W/O의 구조적인 특성은 레티놀이 외부로부터 보호되어 안정한 시스템으로 주목되고 있지만, 오일 액상으로 식품 및 제약에서 산업적 응용이 제한된다.
이에 본 발명자들은, 레티놀 또는 레티놀 유도체들의 안정성을 향상시켜 항산화 효능을 증가시킬 수 있는 전달시스템을 개발하는 과정에서, 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 안정성이 우수한 나노캡슐 제조 방법을 확립하였고, 이러한 나노캡슐에 레티놀 또는 레티놀 유도체를 담지한 경우에 레티놀 또는 레티놀 유도체의 안정성이 증가되고, 항산화 효과 또한 현저히 향상되는 것을 확인하였다. 또한, 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 피부 투과율이 우수하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래선행기술인 한국공개특허 제2007-0072301호에는 레티놀 용액 및 키토산 용액을 혼합하여 제조된 나노입자 및 나노입자의 구조에 따른 레티놀의 안정성 및 용해성 개선 효과가 기재되어 있으나, 레티놀의 산화 방지를 위해 추가의 항산화제를 포함하고 있어, 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐과는 그 구성이 차이가 있으며, 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 증가 된 항산화 효과는 전혀 기재 및 암시되어 있지 않다. 또한, 한국등록특허 제1815225호에는 비타민 A와 같은 유효물질의 산화 억제를 통해 안정성이 개선된, 플루로닉을 포함하는 나노입자 및 피부투과촉진제 처리를 통한 나노입자의 피부 투과 증가 효과가 기재되어 있으나, 유효물질의 산화 억제를 위해 항산화제를 추가로 포함하는 구성으로, 본 발명의 항산화제 추가 없이 레티놀 또는 레티놀 유도체의 안정성이 증진된 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 구성과는 차이가 있으며, 피부투과촉진제 처리 없이 피부 투과율이 증진되는 효과는 기재되어 있지 않다.
비특허문헌인 Scalia, S., et al., (2015)에는 키토산으로 코팅된 나노입자의 피부 투과 증가 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 구성과 차이가 있으며, 레티놀 또는 레티놀 유도체의 안정성 증진 효과는 기재되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐을 제공하는 데 있으며, 보다 구체적으로는 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노 입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 나노캡슐을 포함하는 항산화용 조성물, 주름 개선용 또는 여드름 개선용 화장료 조성물 또는 여드름 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐에 관한 것이다.
상기 나노캡슐은, 레티놀 또는 레티놀 유도체를 유기용매에 녹인 후, 플루로닉을 첨가하여 상온에서 반응시켜 반응용액을 제조하는 1단계; 상기 1단계의 반응용액을 증류수에 떨어뜨리고 지속적으로 교반하여 반응용액의 유기용매를 자연 증발시켜 제거하여 나노입자를 제조하는 2단계; 및, 상기 2단계의 나노입자에 키토산을 첨가하여 키토산을 코팅하는 3단계; 로 이루어진 과정을 통해 제조될 수 있다.
상기 레티놀 또는 레티놀 유도체는 플루로닉 100중량부를 기준으로 0중량부 초과~10중량부가 포함된 것일 수 있다.
상기 플루로닉은 플루로닉 L35, 플루로닉 L43, 플루로닉 L44, 플루로닉 L64, 플루로닉 F68, 플루로닉 P84, 플루로닉 P85, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88, 플루로닉 F98, 플루로닉 P103, 플루로닉 P104, 플루로닉 P105, 플루로닉 F108, 플루로닉 P123 및 플루로닉 F127로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 키토산은 분자량이 3~200kDa인 것일 수 있다.
상기 키토산은 탈아세틸화도가 50~90%인 것일 수 있다.
상기 키토산은 플루로닉 100중량부를 기준으로 0.001~200중량부일 수 있다.
상기 나노캡슐은 32.5~37℃에서 입자 크기가 30~500㎚일 수 있다.
상기 1단계의 유기용매는 아세톤, DMSO(dimethyl sulfoxide), 에탄올, 아세토니트릴(acetonitrile) 및 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 2단계의 증류수는 1단계의 유기용매의 부피를 기준으로 4배를 이용할 수 있다.
상기 나노캡슐은 레티놀 또는 레티놀 유도체 단독 처리와 대비하여 항산화 활성이 2배 이상 증가될 수 있다.
상기 나노캡슐은 피부 투과율이 레티놀 또는 레티놀 유도체 단독 처리와 대비하여 10배 이상 증가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐을 함유하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 상기 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐을 함유하는 주름 개선용 또는 여드름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐을 함유하는 여드름 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "나노캡슐"은 나노 크기의 속이 비어 있는 공 모양의 캡슐로, 나노캡슐의 비어 있는 내부에 다양한 물질, 예컨대 활성제를 담을 수 있다.
상기 나노캡슐은 활성제로 레티놀 또는 레티놀 유도체를 담지한 것이다.
본 발명의 나노캡슐은 당 업계에 공지된 제조 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 나노침전법 및 막재분산법이고, 더 바람직하게는 나노침전법이다.
가장 바람직하게, 상기 나노캡슐은 레티놀 또는 레티놀 유도체를 유기용매에 녹인 후, 플루로닉을 첨가하여 상온에서 반응시켜 반응용액을 제조하는 1단계; 상기 1단계의 반응용액을 증류수에 떨어뜨리고 지속적으로 교반하여 반응용액의 유기용매를 자연 증발시켜 제거하여 나노입자를 제조하는 2단계; 및, 상기 2단계의 나노입자에 키토산을 첨가하여 키토산을 코팅하는 3단계; 로 이루어진 과정을 통해 제조할 수 있다.
상기 1단계의 유기용매는 아세톤, DMSO(dimethyl sulfoxide), 에탄올, 아세토니트릴(acetonitrile) 및 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 아세톤, DMSO, 에탄올 및 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고, 더 바람직하게는 아세톤이다.
상기 2단계의 증류수는 상기 1단계의 유기용매 부피를 기준으로 하여 2~10배를 이용할 수 있다. 바람직하게는 2~5배를 이용하며, 더 바람직하게는 4배를 이용한다. 상기 증류수가 유기용매 부피를 기준으로 2배 미만을 사용할 경우에는 부분적으로 침전이 발생할 수 있고, 10배 초과일 경우에는 키토산 코팅이 불안정하거나 나노캡슐의 농도가 희석되어 농축 공정이 추가될 수 있어 바람직하지 못하다.
상기 제조 방법을 통해 제조된 나노캡슐은 동결 건조를 통해 분말화 할 수 있다.
상기 동결 건조하여 분말화 된 나노캡슐은 동결 건조 과정 중 뭉침 현상이 없이 안정적으로 재분산 되며, 재분산 된 상태에서 장기간 보관하더라도 뭉침이나 침전 없이 안정성을 유지할 수 있다.
본 발명에 있어서, "레티놀"은 비타민 A라고도 불리는 지용성 물질로, 세포의 정상적인 분화와 뼈, 이, 머리카락, 손톱 등의 성장에 필수적인 성분이다. 특히나, 항산화 활성이 우수하며, 피부세포의 분화를 촉진하고 주름에 영향을 주는 콜라겐과 탄력에 영향을 주는 엘라스틴 등의 생합성을 촉진하여 주름을 감소시키고 피부 탄력을 증대시키는 효능이 있어, 유효성이 검증된 대표적인 주름 개선 성분이다. 또한, 여드름 치료 효과가 우수하다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, "레티놀 유도체"는 레티놀의 기능성 및 안정성을 향상시키기 위해 변형시킨 화합물을 의미하는 것으로, 상기 레티놀 유도체는 레티닐 아세테이트(retinyl acetate), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate) 및 레티노익산(retinoic acid)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 나노캡슐에는 레티놀 또는 레티놀 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 포함될 수 있고, 바람직하게는 레티놀, 레티닐 아세테이트, 레티닐 팔미테이트 또는 레티노익산으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 포함된다.
상기 레티놀 또는 레티놀 유도체는 플루로닉 100중량부를 기준으로 레티놀 또는 레티놀 유도체의 효능 및 효과를 나타내는 가장 최소한의 0중량부 초과가 포함될 수 있다. 바람직하게는 0중량부 초과~10중량부가 포함되며, 더 바람직하게는 0.001~10중량부가 포함되며, 가장 바람직하게는 0.001~5중량부가 포함된다. 상기 레티놀 또는 레티놀 유도체가 10중량부 초과일 경우에는 나노입자의 크기가 너무 커지거나, 나노입자에 레티놀 또는 레티놀 유도체가 모두 포함되지 않아 정확한 유효량의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 전달할 수 없어 바람직하지 못하다.
본 발명에 있어서, "플루로닉(pluronic, poloxamer)"은 친수성 고분자로 온도 감응성 성질을 나타내며, 다양한 HLB(hydrophile-lipophile balance)를 가진 유도체가 존재한다. 상기 플루로닉은 HLB가 8~29인 플루로닉, 예컨대, 플루로닉 L35, 플루로닉 L43, 플루로닉 L44, 플루로닉 L64, 플루로닉 F68, 플루로닉 P84, 플루로닉 P85, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88, 플루로닉 F98, 플루로닉 P103, 플루로닉 P104, 플루로닉 P105, 플루로닉 F108, 플루로닉 P123 및 플루로닉 F127로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 HLB가 15~29인 플루로닉, 예컨대, 플루로닉 L35, 플루로닉 L44, 플루로닉 L64, 플루로닉 F68, 플루로닉 P85, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88, 플루로닉 F98, 플루로닉 P105, 플루로닉 F108 및 플루로닉 F127로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 나노입자는 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉으로 이루어진 나노입자로, 온도 민감성 성질로 인해 측정 온도에 따라 나노입자의 크기가 달라질 수 있다. 구체적으로, 온도가 낮을수록 입자 크기가 커질 수 있다.
상기 나노입자는 32.5~37℃에서 입자 크기가 5~80㎚인 것일 수 있다. 바람직하게는 5~50㎚이다.
본 발명에 있어서, "키토산(chitosan)"은 키틴의 부분적인 탈아세틸화에 의해 형성되는 다당류로서 독성이 없는 생체적합성, 생분해성이 높은 고분자 물질로 친수성이 높고 점막부착성이 높은 성질을 가지고 있다. 키토산은 산성 환경에서 용해도가 높고 양전하를 띠는 경향이 있어 점막질 같은 곳에 쉽게 부착하는 성질이 있고, 항균성과 지혈효과가 있으며, 항산화 활성을 가진다. 상기 키토산은 일반적으로 아세트산, 락트산 등과 같은 산성 용액에 높은 용해도를 보인다. 상기 산성 용액에 용해된 키토산의 경우, 인체에 적용시 피부 자극이나 인체 내 pH의 변화로 인한 장애 등을 유발할 수 있다.
반면에, 본 발명의 키토산은 물에 쉽게 용해되는 것으로, 산성 용액에 용해되는 키토산을 이용하는 경우에 나타나는 문제점들을 극복할 수 있다.
상기 키토산은 분자량이 3~200kDa인 것일 수 있다. 바람직하게는 3~100kDa이고, 더 바람직하게는 3~20kDa이며, 가장 바람직하게는 3~10kDa이다. 상기 키토산의 분자량이 200kDa 초과일 경우에는 물에 대한 용해도 또는 항산화 활성이 낮아 바람직하지 못하다.
상기 키토산은 탈아세틸화도가 50~90%인 것일 수 있다. 바람직하게는 탈아세틸화도가 70~90%인 것이고, 더 바람직하게는 탈아세틸화도가 90%인 것이다. 상기 키토산의 탈아세틸화도가 50% 미만인 경우에는 물에 대한 용해도 또는 항산화 활성이 낮아 바람직하지 못하다.
상기 키토산은 플루로닉 100중량부를 기준으로 200중량부 이하를 포함할 수 있다. 바람직하게는 0.001~200중량부이고, 더 바람직하게는 0.001~100중량부이다. 키토산이 0.001중량부 미만이면 나노입자의 표면이 키토산에 의해 충분히 코팅되지 않아 양전하의 표면 전하를 나타내기 어려울 수 있으며, 키토산이 200중량부 초과이면 나노캡슐의 크기가 너무 커지거나 부분적으로 침전이 발생할 수 있어 바람직하지 못하다.
상기 나노캡슐은 온도 민감성 성질을 나타내는 것으로, 온도가 낮을수록 입자 크기가 커질 수 있다. 상기 나노캡슐은 10℃에서 입자 크기가 1,000㎚이하인 것으로, 10℃ 보다 높은 온도에서는 입자 크기가 작아진다.
상기 나노캡슐은 바람직하게는 32.5~37℃에서 입자 크기가 500㎚ 이하이고, 더 바람직하게는 32.5~37℃에서 입자 크기가 30~500㎚이고, 더욱 바람직하게는 32.5~37℃에서 입자 크기가 30~300㎚이며, 가장 바람직하게는 32.5~37℃에서 입자 크기가 30~100㎚이다. 상기 나노캡슐의 입자 크기가 32.5~37℃에서 500㎚ 초과이면 피부에 적용 시 피부 투과 효율이 낮아 바람직하지 못하다.
상기 나노캡슐은 표면이 키토산으로 코팅되어 있어 나노캡슐의 표면 전하가 양전하를 띠어 피부 투과율 및 점막 접착성이 증가할 수 있다.
상기 나노캡슐의 피부 투과율은 나노캡슐에 포함되어 있는 레티놀 또는 레티놀 유도체를 단독으로 처리한 경우에 대비하여 10배 이상 증가될 수 있으며, 키토산이 코팅되지 않은 나노입자와 대비하여 4배 이상 증가될 수 있다.
또한, 상기 나노캡슐은 나노캡슐에 포함되어 있는 레티놀 또는 레티놀 유도체를 단독으로 처리한 경우에 대비하여 2배 이상의 증가된 항산화 효과를 나타낼 수 있으며, 상기 나노캡슐의 증가된 항산화 효과는 나노캡슐에 코팅되어 있는 키토산의 항산화 활성으로 인한 증가일 수 있다.
또한, 상기 나노캡슐은 나노캡슐의 구조적 특징에 의해 이에 담지 되어 있는 레티놀 또는 레티놀 유도체를 이들의 구조적 분해를 일으킬 수 있는 빛이나 자외선으로부터 차단함으로써 분해를 방지하여 증가된 항산화 효과를 나타낼 수 있으며, 항산화 효과를 지속적으로 장기간 유지할 수 있다.
상기 나노캡슐은 나노입자를 구성하는 플루로닉과 나노입자의 표면에 코팅되는 키토산 간의 물리학적 결합에 의해 이루어지는 것으로, 플루로닉과 키토산의 화학적 결합을 통해 제조된 플루로닉-키토산 중합체를 이용하여 제조하는 나노입자와 달리, 중합체 제조 공정이 별도로 필요가 없으며, 중합체 제조를 위해 사용되는 결합제에 의한 독성을 고려하지 않아도 된다.
또한, 본 발명은 상기 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐을 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.
상기 항산화용 조성물은 레티놀 또는 레티놀 유도체의 분해를 방지함으로써 장기간 지속적으로 항산화 효과를 유지할 수 있다.
상기 항산화용 조성물은 활성 산소와 반응함으로써 활성 산소에 의한 생체 손상을 억제하거나 최소화 할 수 있다. 상기 활성 산소는 반응성이 매우커서 생체 분자들과 빠르게 반응하여 생체막의 지질산화, 단백질 변성, DNA 손상 등을 초래하며, 암, 동맥경화증, 당뇨병, 자가면역질환, 노화, 뇌졸중, 파킨슨병 등 각종 질환의 발병 위험성을 증가시킬 수 있다. 따라서 항산화용 조성물에 의한 항산화 효과를 통해 세포의 기능을 회복할 수 있으며, 노화의 진행을 예방 또는 지연시킬 뿐만 아니라 만성 염증 제어 및 면역력을 향상시켜 건강한 삶의 질을 높일 수 있다.
상기 항산화용 조성물은 구체적인 양태에 있어서 화장료 조성물, 약제학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장품, 의약품, 식품 또는 사료의 첨가제 조성물일 수 있다.
상기 화장품, 의약품, 식품 또는 사료 등에는 공기와의 접촉시 쉽게 산패할 수 있는 불포화 지방산이 포함되는 경우가 많고, 이러한 불포화 지방산의 산패는 화장품, 의약품, 식품, 사료 등의 향, 맛 등을 저하시킬 수 있으므로, 항산화제를 첨가제로 첨가하여 산패를 억제시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐을 함유하는 주름 개선용 또는 여드름 개선용 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기 나노캡슐 및 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 또는 염료를 함유할 수 있다.
상기 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 앰플, 아스트리젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 마스크팩, 비누, 바디클렌져, 클렌징폼, 바디오일 및 바디로션으로 이루어지 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화장료 조성물은 매일 사용할 수 있으며, 또한, 정해지지 않은 기간 동안에도 사용할 수 있고, 바람직하게는 사용자의 연령, 피부상태 또는 피부타입에 따라 사용량, 사용횟수 및 기간을 조절할 수 있다.
상기 주름 개선용 화장료 조성물은 주름 개선 효과가 있는 유효성분, 예컨대, 아데노신, 폴리에톡실레이트드레틴아마이드, 홍화씨 추출물, 연교 추출물, 황기 추출물, 오미자 추출물, 토코페릴 아세테이트, 올레아놀릭산, 유비퀴논, 하이드록시데실 유비퀴논 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 여드름 개선용 화장료 조성물은 여드름 개선 효과가 있는 유효성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐을 함유하는 여드름 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 약학 조성물은 상기 나노캡슐 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 나노캡슐에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 제형에 특별한 제한을 두지는 않으나, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제 및 겔제 중에서 선택되는 1종의 제형을 갖는 피부 외용제로 사용될 수 있다. 경피 흡수를 증가시키는 제제, 예를 들면 비한정적인 의미로 특히 디메틸설폭사이드, 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드, 계면활성제, 알코올, 아세톤, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜을 포함할 수 있다. 도포 빈도는 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 상당히 변할 수 있으며, 도포 빈도는 매달 내지 1일 10회, 바람직하게는 매주 내지 1일 4회, 더 바람직하게는 1주당 3회 내지 1일 3회, 보다 더 바람직하게는 1일 1회 또는 2회가 제안되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간, 반려동물 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 피부, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는 피부 투여이다.
본 발명은 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐 및 이의 용도에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐 및 이의 용도에 관한 것으로, 500㎚ 이하, 특히나 200㎚ 이하의 입자 크기를 갖고 안정성이 우수한 나노캡슐 제조 방법을 확립하였고, 확립한 제조 방법을 통해 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노 입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐을 제조하였다. 또한, 상기 제조된 나노캡슐의 항산화 활성은 레티놀 또는 레티놀 유도체 단독에 비해 증가하였고, 장기 보관시에도 항산화 활성이 유지되는 것을 확인하였으며, 피부 투과율도 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노 입자에 키토산이 코팅된 나노캡슐을 주름 개선용 화장품 또는 여드름 개선 또는 치료를 위한 화장료 또는 의약품 개발에 이용할 수 있을 뿐만 아니라 항산화 효능을 필요로 하는 화장품, 의약 분야, 식품 산업에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 플루로닉의 종류에 따른 제조된 나노입자의 크기를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 키토산의 분자량에 따른 제조된 키토산이 코팅된 나노캡슐의 특성을 분석한 결과로, (A)는 나노캡슐의 크기를, (B)는 나노캡슐의 다분산성(PDI)을, (C)는 나노캡슐의 표면 전하를, (D)는 나노캡슐의 형태를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 키토산이 코팅된 나노캡슐의 세포 독성 여부를 확인한 결과이다.
도 4는 키토산의 탈아세틸화도 및 분자량에 따른 항산화 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 레티놀 또는 레티놀 유도체 담지 여부에 따른 용액 상태 및 동결 건조 후의 나노캡슐의 상태(A)와 레티놀 또는 레티놀 유도체 함유량에 따른 입자 크기(B), 다분산성(DPI)(C) 및 표면 전하(D)를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 6은 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 동결 건조에 따른 나노캡슐의 안정성(A) 및 동결 건조한 나노캡슐의 장기 보관 안정성(B)을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 7은 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 항산화 활성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 8은 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 피부 투과율을 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 키토산이 코팅된 나노캡슐 제조>
실시예 1-1. 플루로닉 종류에 따른 나노입자의 크기 확인
플루로닉(pluronic, poloxamer)은 친수성 고분자인 폴리(에틸렌옥사이트)(poly(ethylene oxide), PEO)와 소수성 고분자인 폴리(프로필렌옥사이드)(poly(propylene oxide), PPO)로 구성된 비이온성의 PEO-PPO-PEO 삼중블록공중합체로서 대표적인 온도 감응성 고분자로, 온도 증가에 따른 내부 구조 변화에 의해 가역적으로 변하는 독특한 특징을 가지고 있다. 플루로닉의 PEO 및 PPO의 부가몰수에 따라 다양한 HLB(hydrophile-lipophile balance)를 가진 플루로닉 유도체가 존재하며, 플루로닉의 HLB는 플루로닉을 이용한 나노입자 제조시 입자 크기에 영향을 줄 수 있다. 이에 플루로닉 종류에 따른 나노입자의 크기를 확인하였다.
HLB 8~29에 해당되는 플루로닉을 이용하여 나노입자를 제조하였다. 구체적으로, 플루로닉 20㎎을 아세톤 1㎖에 녹여 반응용액을 제조 하였다. 제조한 반응용액을 530rpm으로 교반하고 있는 4㎖의 3차 증류수에 천천히 떨어뜨려 투입한 후, 12시간 이상 상온에서 각각 반응시켜 아세톤이 자연적으로 증발되어 제거되도록 하여 플루로닉으로 이루어진 나노입자를 제조하였다. 제조한 나노입자의 입자 크기를 입도분석기(Zetasizer, Nono-Zs, Malvern)와 투과전자현미경(transmission electron microscopy)을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보듯이, 플루로닉 F127 및 플루로닉 F68로 이루어진 나노입자의 경우에 25℃에서 300㎚ 이하, 37℃에서는 200㎚ 이하의 입자 크기를 보여주었고, 온도에 따라 입자의 크기가 영향을 받는다는 것을 확인하였다.
또한, 플루로닉 F127 및 플루로닉 F68 이외에도 8~29에 해당되는 플루로닉으로 이루어진 나노입자의 경우에도 37℃에서 200㎚ 이하의 입자 크기를 갖는 것을 확인하였다.
실시예 1-2. 키토산이 코팅된 나노캡슐 제조
상기 실시예 1-1의 결과를 바탕으로, 본 발명의 키토산이 코팅된 나노캡슐 제조시 미국 식약처에서 승인 받은 생체적합성 물질인 플루로닉 F127(pluronic F127, poloxamer 407)을 이용하였고, 나노침전법(nanoprecipitation)을 이용해 키토산이 코팅된 나노캡슐을 제조하였다.
구체적으로, 플루로닉 F127 20㎎을 아세톤 1㎖에 녹여 반응용액을 제조 하였다. 제조한 반응용액을 530rpm으로 교반하고 있는 4㎖의 3차 증류수에 천천히 떨어뜨려 투입한 후, 12시간 이상 상온에서 반응시켜 아세톤이 자연적으로 증발되어 제거되도록 하여 플루로닉으로 이루어진 나노입자(이하, PluNC라 함)를 확보하였다. 확보한 PluNC에 플루로닉 F127과 동일한 중량인 20㎎의 키토산을 넣고 상온에서 1시간 이상 섞어주어, 본 발명의 키토산이 코팅된 나노캡슐(이하, ChiNC라 함)을 제조하였다. 이때, 다양한 분자량의 키토산을 이용하여 PluNC에 코팅 하였고, 키토산의 분자량에 따라 제조된 ChiNC의 형태, 크기, 다분산성 지수(polydispersity index, PDI) 및 표면 전하를 입도분석기(Zetasizer, Nono-Zs, Malvern)와 투과전자현미경(transmission electron microscopy)을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2(A)의 입자 크기를 확인한 결과에서 보듯이, 분자량이 20kDa(20K) 이하의 키토산으로 코팅된 ChiNC(ChiNC 3K, ChiNC 10K, ChiNC 20K)은 100㎚ 이하의 입자 크기로 확인되고, 분자량이 50kDa 이상의 키토산으로 코팅된 ChiNC(ChiNC 50K, ChiNC 100K)은 약 200㎚의 입자 크기를 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 도 2(B)의 다분산성의 경우에는 분자량이 20kDa 이하의 키토산으로 코팅한 ChiNC(ChiNC 3K, ChiNC 10K, ChiNC 20K)은 분산도가 0.2 이하이고, 분자량이 50kDa 이상의 키토산으로 코팅한 ChiNC(ChiNC 50K, ChiNC 100K)는 분산도가 0.2~0.3 정도임을 확인하였다.
도 2(C)의 표면 전하의 경우에는 키토산이 코팅되지 않은 PluNC는 자체 표면 전하 값이 -5㎷ 정도의 음전하를 띠는 반면에, 키토산이 코팅된 경우에는 키토산의 분자량에 상관없이 모두 양전하를 띠는 것을 확인하였다.
도 2(D)의 나노캡슐 형태의 경우에는 나노캡슐이 구형의 구조를 나타내며, 키토산의 분자량이 커짐에 따라 나노캡슐의 크기도 커지는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 키토산으로 코팅된 나노캡슐의 경우, 상기 제조 방법을 통해 키토산이 플루로닉으로 이루어진 나노입자 표면에 안정적으로 코팅되었다는 것을 알 수 있었고, 코팅되는 키토산의 분자량에 따라 나노캡슐의 크기 및 분산성에 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 나아가 키토산의 분자량이 3~20kDa일 경우에 크기가 작고, 균일한 크기로 제형의 안정성이 확보된 나노캡슐을 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
본 명세서에서는 보여주지 않았으나, 상기 플루로닉 외에 다른 고분자 물질을 이용하여 제조한 나노입자에 10kDa의 키토산을 코팅하여 나노캡슐을 제조한 경우에는, 고분자 물질에 안정화제가 포함되지 않아 부분적 침전이나 완전 침전이 발생하고, 나노입자의 크기도 300㎚ 이상으로 불안정한 나노입자가 제조되어 바람직하지 않은 것을 확인하였다.
<실시예 2. 키토산이 코팅된 나노캡슐의 세포 독성 확인>
상기 실시예 1-2에서 제조한 키토산이 코팅된 나노캡슐(ChiNC)의 세포 독성 유발 여부를 확인하였다.
NIH3T3 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 10,000개가 되도록 분주한 후, 8~12시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 실시예 1-2에서 제조한 PluNC 또는 ChiNC 모두를 각각 10㎍/㎖, 20㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖가 되도록 처리하고 24시간 동안 배양한 후, CCK8(cell counting kit-8) 및 제조사로부터 제공받은 매뉴얼을 바탕으로 세포 생존율을 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 NIH3T3 세포를 대조군(control)으로 하여, 대조군의 세포 생존율을 100% 기준으로 하여 각각의 처리군에 대한 세포 생존율을 분석하였다.
도 3에서 보듯이, PluNC 또는 모든 ChiNC가 모든 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 키토산이 코팅된 나노캡슐이 세포 독성을 일으키지 않는 생체적합성이 우수한 물질임을 알 수 있었다.
<실시예 3. 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐 제조>
상기 실시예 1-2의 나노침전법으로 제조한 키토산이 코팅된 나노캡슐을 레티놀 또는 레티놀 유도체의 안정성 증진 및 인체 내 전달을 위한 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 제조 조건을 확인하고 나노캡슐을 제조하였다.
실시예 3-1. 키토산의 항산화 효과 확인
키토산은 세포를 활성화시켜 노화를 억제하고, 면역력을 강화하여 항암 작용, 항콜레스테롤 작용, 간 기능 개선작용 등 인체의 생체 조절 기능에 중요한 역할을 수행하는 것으로, 키틴의 탈아세틸화(deacetylation)에 의해 유도된 다당류 중합체이다. 키토산은 탈아세틸화도에 따라 효능에 결정적인 차이를 나타낸다. 이에 따라, 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐에 있어서, 레티놀 또는 레티놀 유도체의 안정성뿐만 아니라 항산화 효과에 있어서, 키토산의 영향을 확인하기 위해, 키토산의 탈아세틸화도에 따른 항산화 효과를 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 어세이를 통해 비교 분석하였다.
분자량이 각각 10kDa, 20kDa, 50kDa 및 100kDa이며, 탈아세틸화도가 각각 50%(DAC 50%), 70%(DAC 70%) 및 90%(DAC 90%)인 12종의 키토산을 이용하여 10㎎/㎖의 키토산 수용액을 제조하였다. 96웰 플레이트에 각각의 키토산 수용액 150㎕씩을 분주하고, 각각의 웰에 0.2㎎/㎖의 DPPH 용액(메탄올을 용매로 이용) 150㎕을 첨가한 후, 빛이 들어오지 않도록 차단하고 상온에서 30분간 반응시켰다. 이때, 키토산 대신 3차 증류수를 DPPH 용액과 반응시킨 것을 대조군으로 사용하였다. 이후에 515㎚에서 흡광도를 측정하였고, 측정한 흡광도를 하기 식 1을 이용하여 각각의 키토산에 다른 항산화 효능을 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
[식 1]
Figure PCTKR2020010624-appb-img-000001
도 4에서 보듯이, 키토산의 탈아세틸화도(DAC)가 높고, 분자량이 낮을수록 키토산의 항산화 효능이 높은 것을 확인하였다.
나아가 DAC 70%의 키토산 및 DAC 90%의 키토산 모두 가장 높은 항산화 효과를 보여주었으나 DAC 70%의 키토산과 비교하였을 때 DAC 90%의 키토산이 항균력에 있어서 더 우수하고, 더 좋은 피부 투과율을 가진다고 알려져 있는 바, 이를 바탕으로, 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐 제조를 위한 가장 최적의 키토산은 분자량이 10kDa이며, DAC 90%를 가지는 것임을 알 수 있었다.
따라서 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐 제조 시 분자량이 10kDa이며, DAC 90%를 갖는 키토산을 이용하기로 하였다.
실시예 3-2. 레티놀 또는 레티놀 유도체 함유량에 따른 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 특성 확인
본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 레티놀 또는 레티놀 유도체 함유량에 따른 입자 크기 변화를 확인하였고, 레티놀 또는 레티놀 유도체의 대표 물질로 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate, RP)를 이용하였다.
레티닐 팔미테이트(RP) 0.4㎎, 1㎎ 또는 2㎎(플루로닉 100중량부를 기준으로 각각 2중량부, 5중량부 또는 10중량부)을 1㎖의 아세톤에 녹인 후, 플루로닉 F127 20㎎을 첨가하여 상온에서 2시간 동안 교반하여 반응용액을 제조하였다. 제조한 반응용액을 400rpm으로 교반하고 있는 4㎖의 3차 증류수에 천천히 떨어뜨리고, 흄후드(fumehood) 내에서 12시간 이상 교반하면서 자연적으로 아세톤이 증발하도록 하였다. 아세톤이 제거된 플루로닉으로 이루어진 나노입자가 포함되어 있는 3차 증류수에 10kDa, 90% DAC 키토산 20㎎을 첨가한 뒤 2시간 동안 400rpm으로 교반하여 반응시키고, 3일간 동결 건조하여 레티놀이 포함되어 있는 키토산이 코팅된 나노캡슐(이하 RP@ChiNC)을 제조하였다. 제조된 RP@ChiNC의 입자 크기, 다분산성 지수 및 표면 전하를 입도분석기와 투과전자현미경을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5(A)의 제조된 용액 상태의 나노캡슐 또는 동결 건조된 나노캡슐의 육안 관찰 결과에서 보듯이, 키토산이 코팅된 나노캡슐(ChiNC)에 레티닐 팔미테이트를 담지(RP@ChiNC)하더라도 투명한 나노캡슐 용액을 유지하는 것을 확인하였고, 동결 건조를 통해 분말 형태의 RP@ChiNC를 얻을 수 있음을 확인하였다.
또한, 도 5(B)의 RP의 함유량에 따른 RP@ChiNC의 입자 크기(diameter)를 확인한 결과에서 보듯이, RP의 함유량이 증가할수록 입자 크기가 커지는 것을 확인하였다. RP를 포함하지 않은 ChiNC와 2중량부의 RP를 포함하는 RP@ChiNC 입자 크기는 약 55㎚정도로 유사하였고, 5중량부의 RP를 포함하는 RP@ChiNC 입자 크기는 약 65㎚인 반면에, 10중량부의 RP를 포함하는 RP@ChiNC 입자 크기는 약 104㎚ 정도임을 확인하였다.
도 5(C)의 RP의 함유량에 따른 RP@ChiNC의 다분산성(PDI)을 확인한 결과에서 보듯이, RP를 포함하지 않은 ChiNC와 2중량부, 5중량부 또는 10중량부의 RP를 포함하는 RP@ChiNC 모두 0.3 이하로, 모든 나노캡슐이 균일한 크기로 제조되었음을 확인하였다.
도 5(D)의 RP의 함유량에 따른 RP@ChiNC의 표면 전하를 확인한 결과에서 보듯이, RP를 포함하지 않은 ChiNC에 비해 RP를 포함하는 RP@ChiNC의 표면 전하 값이 RP의 함유량이 높아질수록 낮아지는 경향을 보이나, 큰 차이는 없는 것을 확인함으로써, RP가 양전하를 띠는 키토산으로 코팅된 나노캡슐에 안정적으로 담지 되었음을 알 수 있었다.
상기 결과들을 통해, 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 경우, 키토산이 코팅된 나노캡슐에 나노캡슐의 특성 변화 없이 담지 될 수 있는 레티놀 또는 레티놀 유도체의 양은 최대 5중량부임을 알 수 있었다.
실시예 3-3. 레티놀 또는 레티놀 유도체 함량에 따른 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 안정성 확인
본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 안정성을 확인하고자, 상기 실시예 3-2에서 제조한 5중량부의 RP를 포함하는 RP@ChiNC를 이용하였다.
상기 실시예 3-2의 제조 방법으로 제조하되 동결 건조 전과 후의 5중량부의 RP를 포함하는 RP@ChiNC로 각각 준비하였다. 준비된 RP@ChiNC를 3차 증류수 또는 PBS(phosphate-buffered saline)에 분산시킨 후, 입도분석기와 투과전자현미경을 이용하여 분산된 RP@ChiNC의 입자 크기를 분석하였다. 또한, 동결 건조 후의 RP@ChiNC를 분산시킨 경우에는 4중 동안 방치하는 과정에서 매주 마다 입자 크기를 분석하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6(A)의 동결 건조에 따른 RP@ChiNC의 안정성을 확인한 결과에서 보듯이, 동결 건조 된 5중량부의 RP를 포함하는 RP@ChiNC를 3차 증류수 또는 PBS에 분산시킨 후의 입자 크기가 상기 실시예 3-2에서 확인된 동결 건조된 입자 크기인 65㎚와 유사한 것을 확인하였고, 동결 건조 전의 입자 크기와 비교하였을 때 동결 건조 후의 입자 크기가 감소된 것을 통해, 동결 건조 과정에서 입자의 뭉침이 없었다는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 6(B)의 동결 건조 된 RP@ChiNC를 3차 증류수 또는 PBS에 분산시킨 후 상온에서 4주 동안 보관하는 과정에서의 RP@ChiNC의 안정성을 확인한 결과에서 보듯이, 4주 동안 RP@ChiNC 입자 크기가 증가하지 않을 것을 확인함으로써 3차 증류수 또는 PBS 내에서 RP@ChiNC가 뭉침 현상이나 침전 없이 안정적으로 유지되는 것을 알 수 있었다.
이를 통해, 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐은 동결 건조 과정 중 나노캡슐의 뭉침 현상이 없어 안정적으로 재분산 되는 것을 알 수 있었고, 재분산 후에도 뭉침이나 침전 없이 우수한 안정성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한, 추가의 동결보존제(cryoprotectant) 없이도 안정성이 개선된 나노캡슐을 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4. 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐에 의한 레티놀 또는 레티놀 유도체 안정성 증진 효과 확인>
본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐 내 담지 된 레티놀 또는 레티놀 유도체의 장기 안정성 확인을 위해 레티놀 또는 레티놀 유도체의 항산화 활성을 분석하였다.
항산화 활성은 상기 실시예 3-1의 DPPH 어세이와 동일한 방법으로 진행하되, 각각의 시료는 다음과 같이 준비하여 이용하였다. 상기 실시예 3-2에서 제조한 5중량부의 레티놀 팔미테이트(RP)를 포함하는 RP@ChiNC 내에 담지 되어 있는 RP의 함량을 HPLC를 통해 분석한 후, RP의 양이 2.5㎎/㎖이 되도록 RP@ChiNC 수용액을 준비하였다. 준비한 RP@ChiNC 수용액을 96웰 플레이트에 150㎕씩 분주하였다. 또한, 2.5㎎/㎖의 레티닐 팔미테이트(RP) 수용액 또는 RP@ChiNC와 동일한 중량의 ChiNC(키토산이 코팅된 나노캡슐)를 분산시킨 수용액을 150㎕씩 분주하여 항산화 활성을 비교하였다. 나아가, 상기에서 준비한 각각의 시료는 37℃, 100rpm에서 4주간 보관하면서 매주 상기 실시예 3-1의 DPPH 어세이와 동일한 방법으로 항산화 활성 변화를 확인하였고, HPLC를 분석을 통해 RP의 함량을 분석하여, 그 결과를 도 7 및 하기 표 1에 나타내었다.
RP의 함량은 0주차의 2.5㎎/㎖을 100%로 하고 1주 및 4주 후의 함량을 백분율로 환산하여 계산하였다.
Figure PCTKR2020010624-appb-img-000002
도 7에서 보듯이, 0일차의 RP의 항산화 활성은 51%인데 반해, 동일한 양의 RP를 포함하는 RP@ChiNC은 95%로 매우 높은 항산화 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 4주간 보관하는 과정에서 RP의 항산화 활성은 지속적으로 감소하여 4주 후에는 7%의 항산화 활성을 나타냈다. 반면에, RP@ChiNC는 2주까지도 항산화 활성에 변화가 없고, 4주 후에도 85%의 항산화 활성을 유지하고 있는 것을 확인하였다. 추가적으로 RP를 담지하지 않은 ChiNC의 경우에는 0주차부터 4주차까지 45%의 항산화 활성이 지속적으로 유지되는 것을 확인하였다.
또한, 상기 표 1에서 보듯이, 37℃, 100rpm에서 4주간 보관하는 과정에서 RP는 분해되어 그 함량은 급격히 감소하는 반면에, RP@ChiNC에 담지 된 RP은 분해되지 않아 함량이 그대로 유지되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐은 레티놀 또는 레티놀 유도체의 구조적 안정성을 개선하여 분해를 방지함으로써 레티놀 또는 레티놀 유도체의 항산화 효능을 지속적으로 유지시킬 뿐만 아니라 항산화 활성을 증진시킨다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5. 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 경피 전달 효과 확인>
약물 또는 유효성분의 경피로의 전달 제형의 개발은 제약 및 화장품 업계에서 주목하고 있는 분야이다. 이에 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 피부 투과율을 프란츠 확산 셀 시스템(Franz diffusion cell system)을 이용하여 확인하였다.
프란츠 확산 셀 시스템은 도너 챔버(donor chamber)에 약물을 포함하는 제형을 적용하고, 리셉터 챔버(receptor chamber)에는 PBS(phosphate buffered saline)와 같은 생리 식염수 등을 충전시키고, 도너 챔버와 리셉터 챔버 사이에는 투과막, 동물 피부 또는 세포배양 피부 등과 같은 투과층을 고정시켜 준 후, 도너 챔버에서 투과층을 통과하여 리셉터 챔버로 투과되는 약물의 양을 측정함으로써 피부 투과도 등을 측정할 수 있다.
프란츠 확산 셀 시스템의 리셉터 챔버에는 0.05% 폴리소르베이트 80(polysorbate 80)이 포함된 PBS 5㎖을 넣어 준 후, 리셉터 챔버와 도너 챔버 사이에 사람 사체 피부(human cadaver skin)를 고정시키고, 도너 챔버에 상기 실시예 3-2에서 제조한 5중량부의 RP를 포함하는 RP@ChiNC을 5㎎/㎖이 되도록 넣었다. 이때, 대조군으로 RP를 단독으로 처리하였다. 리셉터 챔버의 조건을 37℃, 600rpm으로 조절하고, 0.5, 1, 2, 3, 8, 12, 24 시간에 리셉터 챔버에서 500㎕씩 샘플을 채취하여, 각 시간별 RP의 함량을 HPLC로 측정하여 피부 투과율을 측정하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보듯이, RP를 단독으로 처리한 경우에는 피부 투과가 거의 일어나지 않는 반면에, RP@ChiNC을 처리한 경우에는 처리 시간 시간에 따라 피부 투과율이 증가하였고, 12시간 이후에는 RP 단독에 비해 10배 이상의 증가된 피부 투과율을 나타내는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 레티놀 또는 레티놀 유도체를 포함하는 키토산이 코팅된 나노캡슐의 피부 투과율이 매우 우수하며, 이러한 우수한 피부 투과율을 통해 레티놀 또는 레티놀 유도체의 경피 전달율이 증가됨으로써 레티놀의 우수한 생리학적 활성을 나타낼 수 있음을 예상할 수 있었다.

Claims (16)

  1. 레티놀 또는 레티놀 유도체 및 플루로닉을 포함하는 나노입자에 키토산이 코팅된 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노캡슐은,
    레티놀 또는 레티놀 유도체를 유기용매에 녹인 후, 플루로닉을 첨가하여 상온에서 반응시켜 반응용액을 제조하는 1단계;
    상기 1단계의 반응용액을 증류수에 떨어뜨리고 지속적으로 교반하여 반응용액의 유기용매를 자연 증발시켜 제거하여 나노입자를 제조하는 2단계; 및,
    상기 2단계의 나노입자에 키토산을 첨가하여 키토산을 코팅하는 3단계;
    로 이루어진 과정을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 레티놀 또는 레티놀 유도체는 플루로닉 100중량부를 기준으로 0중량부 초과~10중량부가 포함되는 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 플루로닉은 플루로닉 L35, 플루로닉 L43, 플루로닉 L44, 플루로닉 L64, 플루로닉 F68, 플루로닉 P84, 플루로닉 P85, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88, 플루로닉 F98, 플루로닉 P103, 플루로닉 P104, 플루로닉 P105, 플루로닉 F108, 플루로닉 P123 및 플루로닉 F127로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 키토산은 분자량이 3~200kDa인 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 키토산은 탈아세틸화도가 50~90%인 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 키토산은 플루로닉 100중량부를 기준으로 0.001~200중량부인 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 나노캡슐은 32.5~37℃에서 입자 크기가 30~500㎚인 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 1단계의 유기용매는 아세톤, DMSO(dimethyl sulfoxide), 에탄올, 아세토니트릴(acetonitrile) 및 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 2단계의 증류수는 1단계의 유기용매의 부피를 기준으로 4배인 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 나노캡슐은 레티놀 또는 레티놀 유도체 단독 처리와 대비하여 항산화 활성이 2배 이상 증가되는 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 나노캡슐은 피부 투과율이 레티놀 또는 레티놀 유도체 단독 처리와 대비하여 10배 이상 증가된 것을 특징으로 하는 나노캡슐.
  13. 제1항 또는 제2항의 나노캡슐을 함유하는 항산화용 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항의 나노캡슐을 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항의 나노캡슐을 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항의 나노캡슐을 함유하는 여드름 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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