CN107970448B - 一种光活性纳米复合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光活性纳米复合物及其制备方法与应用，该纳米复合物包括核酸分子和阳离子聚合物，阳离子聚合物由正电性链段、亲水性链段和光敏性链段组成，光敏性链段为螺吡喃链段；制备方法是将阳离子聚合物溶液置于紫外光下照射，然后与核酸分子混合，静置即得。本发明的优点是通过阳离子聚合物与带负电的核酸分子的自发相互作用形成光活性纳米复合物，制备方法、过程简单，既可以作为光控开关又可以作为光敏剂，在指导疾病诊疗与光动力治疗领域有广泛前景。
Description
技术领域
本发明属于高分子化学与生物医学工程领域，具体涉及一种光活性纳米复合物及其制备方法与应用。
背景技术
光动力治疗是指在光敏剂与分子氧的参与下，由合适波长的光源辐照产生活性氧从而破坏病变组织达到治愈效果的微创疗法。活性氧类型主要有：超氧阴离子、羟基自由基、脂质过氧化自由基和单线态氧(1O2)。单线态氧(1O2)是分子氧的单重激发态，其可以通过光敏剂(PS)和三线态基态氧(3O2)之间的细胞代谢或光敏化在哺乳动物细胞的线粒体中产生。由于其氧化能力强，容易通过细胞膜扩散，因此在光动力治疗领域中，1O2已经受到越来越多的关注。然而，光动力治疗因为光敏剂的性质，如水溶性和生物相容性较差，易于漂白而不能有效指导诊疗，发展受到诸多阻碍。
目前已经报道了许多用于克服光敏剂以上缺点提高疗效的方法，其中通过纳米手段构建1O2可控生成光敏剂系统受到越来越多的关注。但是，这些光敏剂系统进入体内之后通常导致机体化学环境的剧烈改变，从而导致严重的毒性；同时，这些光敏剂系统不能有效控制1O2的产生，这会带来额外的光化学毒性，即：患者治疗之后光敏剂不能及时排除体外或是及时关闭1O2产生状态，患者需要在黑暗状态下生活一段时间，给患者的生活带来严重不便。现阶段仅有极少文献报道关于运用二芳基乙烯作为光控开关分子、传统卟啉作为光敏剂来构建可控生成1O2的复合型光敏剂系统。但上述复合型光敏剂系统却存在制备复杂、水溶性差、生理环境下稳定性低等问题，从而限制了其在光动力治疗领域的进一步应用。由此可见，构建可控生成1O2的光敏系统仍然是目前面临的极大挑战。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种含有螺吡喃链段的具有光活性且能够控制1O2生成与否可逆循环的纳米复合物；本发明的第二目的是提供该复合物的制备方法；本发明的第三目的是提供该光活性纳米复合物在活性氧可逆调控方面的应用。
技术方案：本发明所述的光活性纳米复合物，包括核酸分子和阳离子聚合物，所述阳离子聚合物由正电性链段、亲水性链段和光敏性链段组成；所述光敏性链段为螺吡喃链段。
其中，所述阳离子聚合物与核酸分子的质量比为15～60:1；优选的，阳离子聚合物与核酸分子的质量比为20～40:1。
所述阳离子聚合物由摩尔百分比均为5～50％的正电性链段、亲水性链段和光敏性链段组成，三者之和为100％。
本发明采用的正电性链段包括烷基伯胺、烷基仲胺、烷基季铵盐或烷基咪唑，其中所述烷基为C1～C18链，含有0～6个杂原子，在细胞试验中优选烷基咪唑，因为它可以促进纳米粒子溶酶体逃逸；在试管试验中优先烷基胺，因为它压缩核酸分子的能力更好；本发明采用的亲水性链段包括聚乙二醇链段、乙烯吡咯烷酮、水溶性丙烯酰胺、乙烯醇、甜菜碱类、甲基丙烯酸羟丙酯或丙烯酸羟丙酯，优选采用聚乙二醇链段。聚乙二醇链段的封端为H或甲基，聚合度n为3～110，在细胞试验中聚乙二醇链段的作用有两个：第一在纳米颗粒的表面吸附水层，避免与蛋白的相互作用；第二它可以自由伸展，提供位阻，防止与蛋白相互作用。
本发明制备光活性纳米复合物的方法包括以下步骤：将阳离子聚合物溶液置于紫外光下照射，然后与所述核酸分子混合，静置，得到光活性纳米复合物。
其中，所述静置时间为15～120min，优选为20min。
所述阳离子聚合物溶液的制备步骤为：
(1)制备Boc基团保护的阳离子聚合物PBHPS，干燥得到固体；
(2)将固体溶解、冷却，滴加三氟乙酸或盐酸与1，4-二氧六环的混合液或盐酸与四氢呋喃的混合液，反应后置于缓冲溶液中透析，得到脱除Boc-的阳离子聚合物。
步骤(2)中，所述固体反应0.5～24h，所述缓冲溶液的pH为6.8～7.4。为了更快去除反应体系中的溶剂，步骤(2)中固体反应后在置于缓冲溶液前向溶液中通入惰性气体。由于咪唑的Boc保护基对于存在三氟乙酸的酸性环境极其敏感，因此，0.5h及以上的反应能确保脱保护反应完成，不需要反应24h以节约时间。其中，三氟乙酸反应较快，时间0.5h及以上；盐酸与1，4-二氧六环的混合液或盐酸与四氢呋喃的混合液反应时间需延长。
优选的，步骤(2)中所述缓冲溶液为HEPES缓冲溶液、PBS缓冲溶液、Bis-Tris缓冲溶液、PIPES缓冲溶液或MOPS缓冲溶液。
本发明所述光活性纳米复合物在活性氧可逆调控方面的应用。
发明原理：利用阳离子聚合物与带负电的核酸分子通过正电性链段与带负电的核酸分子之间的静电相互作用、螺吡喃链段经紫外光照后产生MC分子的大平面共轭π-π相互作用及MC分子之间两性离子相互作用等形成光活性纳米复合物。其中，含有的光响应性螺吡喃链段在紫外光(λ1<420nm)照射下能够开环，可见光(λ2>450nm)或黑暗状态下能够闭环，在开环与闭环的切换过程中可以实现螺吡喃荧光与1O2产生的“开”或“关”，因此可以通过给予光活性纳米复合物不同波长光照，实现活性氧的可逆调控。
有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点为：通过特定的阳离子聚合物与带负电的核酸分子的自发相互作用形成光活性纳米复合物，不仅制备方法、过程简单，更重要的是不需要额外引入光敏剂，其自身所含有的光活性物质既可以作为光控开关又可以作为光敏剂；同时，该纳米粒子生物相容性良好，具有较优异的抗疲劳性质与稳定性，在不同波长光照条件下可同时实现荧光成像与1O2生成的“开”或“关”的可逆调控，可有效降低光敏剂体系额外的光毒性，因此在指导疾病诊疗与光动力治疗领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为阳离子聚合物的制备工艺流程图；
图2为光活性纳米复合物的制备工艺流程图；
图3为单体SPMA的制备工艺流程图；
图4为1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓溴化物在CDCl3中的1H NMR图；
图5为9,9,9a-三甲基-2,3,9,9a-四氢-恶唑[3,2-a]吲哚在CDCl3中的1H NMR图；
图6为2-(3',3'-二甲基-6-硝基-3'H-螺-[苯并吡喃-2,2'-吲哚]基)乙醇在CDCl3中的1HNMR图；
图7为1'-(2-甲基丙烯酰氧乙基)-3',3'-二甲基-6-硝基-螺(2H-1-苯并吡喃-2',2'-吲哚啉)在CDCl3中的1H NMR图；
图8为单体Boc-HMA的制备工艺流程图；
图9为甲基丙烯组胺酰胺在D2O中的1H NMR图；
图10为甲基丙烯组胺酰胺在D2O中的13C NMR图；
图11为Boc保护甲基丙烯组胺酰胺在CDCl3中的1H NMR图；
图12为Boc保护甲基丙烯组胺酰胺在CDCl3中的13C NMR图；
图13为Boc保护聚合物PBHPS在CDCl3中的1H NMR图；
图14为阳离子聚合物PHPS在D2O中的1H NMR图
图15为脂溶性聚合物PBHPS的GPC表征结果图；
图16为光活性纳米复合物DLS粒径测试结果图；
图17为光活性纳米复合物形貌表征AFM测试结果图；
图18为光活性纳米复合物AFM表征粒径分布图；
图19为阳离子聚合物和光活性复合物的荧光发射光谱图；
图20为阳离子聚合物溶液在不同紫外光照射时间处理条件下的紫外吸收光谱图；
图21为阳离子聚合物溶液在不同可见光照射时间处理条件下的紫外吸收光谱图；
图22为阳离子聚合物溶液在黑暗状态处理条件下的紫外吸收光谱图；
图23为光活性纳米复合物溶液在不同可见光照射时间处理条件下的紫外吸收光谱图；
图24为光活性纳米复合物溶液在黑暗状态处理条件下的紫外吸收光谱图；
图25为光活性纳米复合物溶液在不同紫外光照射时间处理条件下的紫外吸收光谱图；
图26阳离子聚合物溶液与光活性纳米复合物溶液在可见光或黑暗状态衰减动力学图；
图27为光活性纳米复合物溶液在可见光与紫外光照射循环过程中552nm处紫外吸光度相对变化图；
图28为光活性纳米复合物粒径变化；
图29为阳离子聚合物与光活性纳米复合物的荧光量子产率图；
图30为阳离子聚合物与光活性纳米复合物的单线态氧量子产率图；
图31为光活性纳米复合物细胞成像可逆循环图；
图32为光活性纳米复合物细胞内活性氧可逆循环水平测试荧光图；
图33为光活性纳米复合物细胞毒性图；
图34为光活性纳米复合物流式细胞测试图；
图35为光活性纳米复合物活性氧可逆性调控示意图；
图36为光活性纳米复合物的总体结构示意图；
图37为光活性纳米复合物中的聚乙二醇链段为H封端的总体结构示意图；
图38为光活性纳米复合物中的聚乙二醇链段为CH3封端的总体结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
下述的实现方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
实施例1
步骤1：构成阳离子聚合物光敏性链段的螺吡喃单体的制备
即1'-(2-甲基丙烯酰氧乙基)-3',3'-二甲基-6-硝基-螺(2H-1-苯并吡喃-2',2'-吲哚啉)(SPMA)单体及其制备，本发明中参与聚合构成阳离子聚合物的单体之一是SPMA，其结构式如图1所示，SPMA的制备方法包括如下步骤：
(1)1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓溴化物的合成：
将3.18g 2,3,3,-三甲基-3H-吲哚与3.125g 2-溴乙醇溶于30mL乙腈中并置于含有冷凝管的100mL三口烧瓶中，通N2保护，缓慢加热至80℃，反应24h。反应结束后，将反应体系缓慢冷却至室温，旋转蒸发出去乙腈溶剂，得到深红色固体。向其中加入50mL正己烷，碾碎颗粒，超声，过滤。取其中3g于60℃/45mL三氯甲烷中回流溶解，后置于通风橱中重结晶，得到粉红色固体2.6g，产率87％。
性能检测：通过1H NMR(400M Hz,CDCl3)对其结构进行表征，如图4所示，结果显示结构无误。δ(ppm):7.71～7.55(m,4H),4.85(t,2H),4.21(m,2H),3.15(s,3H),1.65(s,6H)。
(2)9,9,9a-三甲基-2,3,9,9a-四氢-恶唑[3,2-a]吲哚的合成：
将2.84g 1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓溴化物分多次加入含有KOH0.9g的50mL水溶液中，20℃搅拌20min，后乙醚萃取(3*20ml)，有机相旋转蒸发除去溶剂，产物为黄色透明油状液体约1.8g，产率90％。
性能检测：通过1H NMR(400M Hz,CDCl3)对其结构进行表征，如图5所示结果显示结构无误。δ(ppm):7.71～7.18(m,4H),3.89～3.46(m,4H),1.43(s,3H),1.39(s,3H),1.18(s,3H)。(3)2-(3',3'-二甲基-6-硝基-3'H-螺-[苯并吡喃-2,2'-吲哚]基)乙醇的合成：
将1.7g 9,9,9a-三甲基-2,3,9,9a-四氢-恶唑[3,2-a]吲哚与2.1g 2-羟基-5-硝基苯甲醛溶于20mL乙醇中，N2保护下，78℃回流反应3h。反应结束后，抽滤，少量乙醇淋洗滤饼，滤饼真空干燥得紫色固体粉末2g，产率71％。
性能检测：通过1H NMR(400M Hz,CDCl3)对其结构进行表征，如图6所示，结果显示结构无误。δ(ppm):8.06～7.16(m,3H),7.13～6.64(m,4H),6.87～6.94/5.86～5.92(m,2H),3.87～3.67(m,3H),3.51～3.28(m,2H),1.33～1.16(s,6H)。
(4)1'-(2-甲基丙烯酰氧乙基)-3',3'-二甲基-6-硝基-螺(2H-1-苯并吡喃-2',2'-吲哚啉)(SPMA)的合成：
将2.0g 2-(3',3'-二甲基-6-硝基-3'H-螺-[苯并吡喃-2,2'-吲哚]基)乙醇与1.27g三乙胺溶于30mL二氯甲烷中，1.19g甲基丙烯酰氯溶于20mL二氯甲烷中，置于恒压滴液漏斗内，氩气保护下，冰水浴，避光，缓慢滴加，控制在30min滴加完成。滴加后，整个反应体系置于室温下，氩气保护，避光，反应过夜。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，得到淡黄色固体。重新溶于二氯甲烷后加入硅胶，旋转蒸发除去溶剂，flash自动柱分离系统分离，淋洗剂V正己烷：V二氯甲烷＝1:2，收集洗脱液，旋转蒸发后真空干燥得到0.9g最终产物，产率约40％。
上述反应的流程如图3所示；每一步反应的产物经过1H NMR的表征，如图4～7所示，核磁谱图确认化合物结构正确，所制备最终产物为SPMA。
性能检测：通过1H NMR(400M Hz,CDCl3)对其结构进行表征，如图7所示，结果显示结构无误。δ(ppm):7.98～8.06(m,2H),7.17～7.24(m,1H),7.10(d,1H),6.87(q,2H),6.68～6.77(m,2H),6.07/5.57(d,2H),5.86(d,1H),4.3(t,2H),3.28～3.51(m,2H),1.90(s,3H),1.30(s,3H),1.16(s,3H)。
步骤2：构成阳离子聚合物的正电性单体的制备
即Boc保护甲基丙烯组胺酰胺(Boc-HMA)单体及其制备，本发明中参与聚合构成阳离子聚合物的另外一种单体是Boc-HMA，其结构式如图1所示。Boc-HMA的制备方法包括如下步骤：
(1)甲基丙烯组胺酰胺的合成：
将组胺二盐酸盐2.01g溶10mL去离子水中，置100mL内置磁子的圆底烧瓶中，冰水浴；将1.2g甲基丙烯酰氯溶于10mL二氯甲烷中，置于25mL恒压滴液漏斗中；将氢氧化钠1.31g溶于10mL去离子水中，置于25mL恒压滴液漏斗中，将盛有甲基丙烯酰氯与氢氧化钠溶液的滴液漏斗同时开启，保证冰水浴下一个小时滴完，并剧烈搅拌，同时冷凝水回流，滴加后移去冰水浴，室温下继续搅拌反应4h。反应完成后静置一段时间，取水相置于-80℃冰箱中冷冻4h，后进行冷冻干燥。冷冻干燥后样品呈现白色粉末状，称重约3.5g，其中包含产物与盐。将白色粉末溶于50mL异丙醇中，搅拌得到白色悬浮液，过滤，10mL异丙醇冲洗滤饼，共60mL溶有产物的异丙醇溶液，通过旋转蒸发除去部分溶剂后投入到大量正己烷中进行重结晶，最终得到白色晶体1.52g，产率约为78％。
性能检测：通过1H NMR(400M Hz,D2O)、13C NMR(101M Hz,D2O)对其结构进行表征，分别如图9和图10所示，结果显示结构无误。1H NMR,δ(ppm):7.72(s,1H),6.92(s,1H),5.57and 5.38(d,2H),3.49(t,2H),2.82(t,2H),1.86(s,3H)。
1C NMR,δ(ppm):168.4,135.69,134.6,129.83,127.01,116.76,39.04,25.81,23.6。
(2)Boc保护甲基丙烯组胺酰胺(Boc-HMA)的合成：
将1.0g甲基丙烯组胺酰胺与0.565g三乙胺溶解在15mL N,N-二甲基甲酰胺中，冰水浴下搅拌20min，使甲基丙烯组胺酰胺能够完全溶解，后滴加含有1.243g二碳酸二叔丁酯(Boc)2O的N,N-二甲基甲酰胺(5mL)溶液，滴加完毕后，恢复至室温，继续搅拌反应48h。反应结束后，溶液澄清透明。因为N,N-二甲基甲酰胺与去离子水混合会放出大量的热，因此，保证冷水浴下向其中缓慢滴加25mL去离子水，用三氯甲烷(10mL*3)萃取，收集有机相并向其中加入硅胶，旋转蒸发除去溶剂，采用flash自动柱分离系统分离，淋洗剂V正己烷：V乙酸乙酯＝95:5，过渡至乙酸乙酯100，收集洗脱液旋转蒸发后真空干燥得到淡黄色、半固体状粘性液体1.6g，产率约72％。
性能检测：通过1H NMR(400M Hz,CDCl3)、13C NMR(101M Hz,CDCl3))对其结构进行表征，分别如图11和图12所示，结果显示结构无误。1H NMR,δ(ppm):8.03(s,1H),7.16(s,1H),5.73/.31(d,2H),3.59(dt,2H),2.78(t,2H),1.97(s,3H),1.62(s,9H)。
13C NMR,δ(ppm):168.3,146.94,141.1,139.97,136.77,119.53,113.73,85.67,39.19,27.89,26.40,18.64。
Boc-HMA[M],HRMS,calculated for[M+H]+:280.1661,found[M+H]+:280.1656。
上述反应的流程如图8所示，每一步反应的产物经过1H NMR与13C NMR的表征，最终产物经核磁谱图、高分辨质谱确认化合物结构正确，所制备最终产物为Boc-HMA。
步骤3：阳离子聚合物(PHPS)及其制备
将步骤1制备的螺吡喃单体SPMA、步骤2制备的正电性单体Boc-HMA及市购的亲水性单体PEGMA作为原料，首先合成Boc基团保护的聚合物(PBHPS)，然后在三氟乙酸的作用下除去Boc保护基团，得到阳离子聚合物(PHPS)。其中，正电性单体不仅限于Boc-HMA这类烷基叔胺单体，还可以为烷基伯胺、烷基仲胺、烷基季铵盐或烷基咪唑，其中烷基为C1～C18链，含有0～6个杂原子；亲水性单体不仅限于PEGMA，还可以为乙烯吡咯烷酮、水溶性丙烯酰胺、乙烯醇、甜菜碱类、甲基丙烯酸羟丙酯或丙烯酸羟丙酯。
(1)Boc基团保护的聚合物(PBHPS)的合成：
Boc基团保护的聚合物(PBHPS)的结构式如图1所示。其制备方法包括以下步骤：向装有磁力搅拌子的5mL史莱克瓶中加入Boc-HMA(23mg，0.082mmol)，PEGMA(49.5mg，0.137mmol)，SPMA(23.1mg，0.055mmol)的无水DMF(0.5mL)溶液，然后向混合物中加入偶氮二异丁腈(0.76mg，0.005mmol)作为自由基聚合的引发剂。将反应混合液搅拌约10s直到变得均匀。溶液在搅拌状态下用氩气鼓泡45min后，将烧瓶密封并置于恒温在70℃的油浴中。在黑暗中聚合24h后，通过将反应烧瓶浸入冷冻液(-30℃)中淬灭反应。将聚合物溶液滴加到大量预冷的无水乙醚(25mL)中，并在8000rpm离心15min，后除去上清液，沉淀重新用三氯甲烷溶解，再在大量无水乙醚中沉淀，离心，反复进行上述溶解-沉淀-离心操作3次后得到Boc基团保护的聚合物PBHPS，然后共聚物PBHPS在40℃的高真空中干燥，得到棕色固体(51mg，53.4％)。
性能检测：通过1H NMR(400M Hz,CDCl3)对其结构进行表征，如图13所示，结果显示结构无误，同时根据各基团的特征峰位移积分面积计算各组分所占比例。通过体积排阻色谱(GPC)对聚合物PBHPS的分子量(Mn,Mw)与分子量分布指数(PDI)进行测试。
(2)阳离子聚合物(PHPS)的合成：
除去Boc保护基团的阳离子聚合物(PHPS)的结构式如图1所示，其制备方法包括以下步骤：将40mg Boc基团保护的共聚物PBHPS溶于0.5mL二氯甲烷中，同时在冰浴中冷却。将0.5mL三氟乙酸小心的通过注射器滴加到溶液中。滴加完毕后将反应液温度恢复至室温，在室温下反应3h后，向溶液中通氮气鼓泡除去溶剂，并在HEPES缓冲溶液(10mM，pH＝7.0)中透析(MWCO＝7000Da)，得到Boc-去保护的阳离子聚合物PHPS。
性能检测1通过1H NMR(400M Hz,D2O)对其结构进行表征，如图14所示，结果显示结构无误。
性能检测2阳离子聚合物光响应性检测
紫外与荧光测试如图19～22所示，由图20可知：每隔10s测试一次，随时间增加，MC链段吸光度逐渐增强，MC组分逐渐增加，约120s达到开环最大程度；由图21可知：每隔20s测试一次，随时间增加，MC链段吸光度逐渐减少，MC组分逐渐减少，闭环态SP组分逐渐增加；由图22可知：每隔20min测试一次，可见随时间增加，由于热弛豫效应，MC链段吸光度逐渐降低，MC组分逐渐减少，闭环SP组分逐渐增加；
初始状态下，PHPS溶液在450～700nm区域内无吸收，在紫外光(365nm:2mW/cm2)照射下约1min，明显新生成最大吸收在549nm处的强吸收峰，这属于开环态MC的吸收峰。然后在可见光(λ2,520nm:20mW/cm2)或黑暗状态下处理不同时间，开环态MC的吸收峰强度逐渐降低，表明MC逐渐转变为闭环态SP；其中，可见光处理半衰期为1.5min，黑暗状态处理半衰期1.5h。上述SP-MC转变过程可以在不同波长条件下可逆循环多次。通过紫外与荧光测试表明阳离子聚合物PHPS的光响应性优异。
上述反应的流程如图1所示；每一步反应的产物经过1H NMR的表征，最终确认所制备阳离子聚合物为PHPS，其GPC测试结果如图15所示。
步骤4：光活性纳米复合物及其制备
光活性纳米复合物通过阳离子聚合物PHPS(以下如无特殊说明，均简称为聚合物)与核酸分子自组装形成，新鲜制备或是经过紫外光照射的光活性纳米复合物的结构和光活性纳米复合物在可见光或是黑暗状态下经过一段时间后结构如图2所示。其制备方法包括：在阳离子聚合物PHPS与核酸分子相互作用之前，用紫外光(365nm:2mW/cm2)照射使46.6mol％的螺吡喃保持在开环MC状态。然后，保证阳离子聚合物PHPS与核酸分子的质量比为30，将二者在HEPES缓冲溶液(10mM,pH＝7.0)中等体积混合，值得注意的是要将质量少的一方加入到质量多的体系中，即：将核酸分子溶液加入到阳离子聚合物溶液PHPS中，混合速度适度，过程小心，混合结束后室温静置20min，即可制备得到光活性纳米复合物。制备过程如图2所示。
步骤5：光活性纳米复合物的性能检测
(1)光活性纳米复合物形貌及表面性质测试
光活性纳米复合物的形貌及表面性质通过动态光散射(DLS)与原子力显微镜(AFM)等手段测试。
DLS测试：使用配备有动态光散射的Zetasizer纳米仪在25℃下测量光活性纳米复合物的流体动力学直径和表面电荷，测试重复进行3×30次。对于数据分析，使用25℃下纯水的粘度(0.8905mPas)和折射率(1.333)。光活性纳米复合物的流体动力学直径由斯托克斯-爱因斯坦方程计算，并用聚合物微球作为标准纳米粒子进行尺寸校准。光活性纳米复合物的ζ-电位在包含1mM的氯化钾溶液中于25℃下测量，并通过应用Smoluchowski方程从获得的电泳迁移率计算。
DLS测试结果如图16所示，表明光活性纳米复合物的水动力学直径约200nm(Z-average Diameter)，并且呈现较小的分散指数。
ζ-电位测试结果表明：光活性纳米复合物的表面电势约+6.1mV～+8.3mV，这是因为PEG链段、MC链段对正电荷的遮蔽作用导致的。ζ-电位测试结果如表1所示。
表1光活性纳米复合物ζ-电位测试结果
AFM测试：将光活性纳米复合物溶液(50μL，核酸分子的浓度为10μg/mL)沉积在新鲜剥制的云母基材上，室温静置3min。然后将溶液在温和的氮气流下干燥。使用由Nanoscope 8.10软件控制的Bruker DimensionICON的标准硅探针在ScanAsyst模式下进行AFM成像。使用软件自校准模式将悬臂振荡频率调谐到悬臂的共振频率。以1.0-1.5Hz的扫描速率记录256×256图像，采样密度为每像素15-380nm2。仅使用该软件处理原始AFM图像进行背景去除(平滑)。
AFM测试结果如图17和图18所示，表明光活性纳米复合物基本呈现大致的球形，基于数量统计结果显示直径约126nm；高度约40nm，高度分布呈现单一的尖峰，说明光活性纳米复合物粒子中间物质密度较高，表明阳离子聚合物具有较强的核酸压缩能力，光活性纳米复合物是阳离子聚合物与核酸分子的复合体。
(2)光活性纳米复合物的光响应性
将制备得到的光活性纳米复合物溶液在紫外光(λ1,365nm:2mW/cm2)和可见光(λ2,520nm:20mW/cm2)或黑暗状态下处理不同时间，测试紫外吸光度。光活性纳米复合物的紫外吸光度测试如图23～26所示：由图23可知，每隔40s测试一次，随时间增加，MC链段吸光度逐渐降低，MC组分逐渐减少，闭环SP组分逐渐增加，但衰减速度明显慢于聚合物；由图24可知，每隔40min测试一次，随时间增加，由于热弛豫效应，MC链段吸光度逐渐降低，MC组分逐渐减少，闭环SP组分逐渐增加，但速度明显慢于聚合物热弛豫衰减速度；由图25可知，每隔10s测试一次，随时间增加，MC链段吸光度逐渐增强，MC组分逐渐增加，约120s达到开环最大程度；光活性纳米复合物最大吸收波长处的紫外吸光度变化测试如图27所示；光活性纳米复合物的粒径变化结果如图28所示。
初始状态下，光活性复合物溶液在450～700nm区域内有较强的吸收，最大吸收波长552nm，这属于开环态MC的吸收峰。然后在可见光(λ2,520nm:20mW/cm2)或黑暗状态下处理不同时间，开环态MC的吸收峰强度逐渐降低，表明MC逐渐转变为闭环态SP；其中，可见光处理半衰期3min，黑暗状态处理半衰期2.8h。上述SP-MC转变过程可以在不同波长条件下可逆循环多次，最大吸收波长处的紫外吸光度测试与粒径测试(DLS)表明上述过程可以重复循环多次，且不会引起吸光度与粒径的急剧变化。通过不同光照条件下光活性纳米复合物的多次循环性能表明光活性纳米复合物具有优异的光响应性和抗疲劳性。
(3)光活性纳米复合物的荧光量子产率(Φf)测试
光活性纳米复合物的荧光量子产率(Φf)测试以0.1M硫酸奎宁(Φf＝0.545)为标准，测试条件为除氧HEPES缓冲液(10mM,pH＝7.0)，温度25℃。通过以最大吸收波长为激发波长测试光活性纳米复合物的荧光发射曲线(EX Slit:5.0nm,EM Slit:5.0nm,PMTVoltage:600V,Scan speed:12000nm/min1)，并计算其发射峰面积，根据如下公式计算得到Φf：
其中，Φ表示荧光量子产率，A表示最大吸收波长的吸光度，I表示荧光发射峰积分面积，η表示溶液的折光系数。
光活性纳米复合物的荧光发射曲线如图19所示；光活性纳米复合物的荧光量子产率测试结果如图29所示。测试结果表明，相比较阳离子聚合物PHPS溶液的荧光量子产率，光活性纳米复合物的荧光量子产率有了约4倍的提高。这是由于阳离子聚合物与核酸分子形成复合物后，MC分子之间相互聚集，导致荧光强度提高。
(4)光活性纳米复合物的细胞成像
将Hela细胞以7×104个细胞/孔的密度接种在用于激光共聚焦成像的4孔培养板中，并在含有10％胎牛血清、5％CO2的37℃培养箱中孵育24h。将细胞与光活性纳米复合物共孵育4h。弃去培养基并用PBS缓冲液洗涤两次之后，用具有63×油浸物镜的Zeiss激光扫描显微镜710进行细胞成像。使用Zen 2008软件进行数据分析，光活性纳米复合物在543nm处被激发，并且在600～750nm范围内收集发射信号。同时测试在不同波长光照条件下，光活性纳米复合物用于细胞成像的效果。
光活性纳米复合物用于细胞可逆成像测试结果如图31所示，图中(1)UV 1min,(2)Vis 10min,(3)UV 1min,(4)Vis 10min,(5)UV 1min,(6)Vis 10min。测试结果表明：在紫外光照后，光活性纳米复合物中具有大量MC，此时发出强烈的红色荧光，Hela细胞被点亮；在可见光照射一段时间后，光活性纳米复合物中的MC几乎全部转变为SP，此时几乎没有荧光，Hela细胞红色荧光信号消失。上述过程可以重复多次，实现细胞成像可逆开关。其中，UV,365nm:90mW cm-2；Vis,500/550/635nm:250mW cm-2。
步骤6：光活性纳米复合物活性氧可逆性调控
光活性纳米复合物内含有大量MC分子时，在可见光的照射下可以产生单线态氧，并逐渐恢复到闭环SP状态；然后给予紫外光照射，SP又重新转变为开环态MC，重新具有单线态氧的产生能力，因此可以通过不同波长的光照调控光活性纳米复合物单线态氧的产生状态，过程如图35所示。
光活性纳米复合物活性氧可逆性调控测试通过单线态氧量子产率、细胞内活性氧水平、细胞毒性测试表征。
性能测试1光活性纳米复合物单线态氧量子产率(ΦΔ)及可逆性测试
水溶性四钠盐α，α'-(蒽-9,10-二基)双(甲基丙二酸酯)(ABMM)作为1O2捕集剂，玫瑰红(RB)用作标准光敏剂(ΦRB＝0.75)。使用可见光(520nm，20mW/cm2)作为照射源，记录不同照射时间ABMM吸收光谱，根据如下公式计算：
其中，ΦΔ是单线态氧量子产率,K表示ABMM紫外吸收衰减速率,I表示520nm处吸收光强度。同时测试3次循环光活性纳米复合物的单线态氧量子产率。光活性纳米复合物的单线态氧量子产率的测试结果如图30所示。
测试结果表明，相比较阳离子聚合物PHPS的单线态氧量子产率，光活性纳米复合物的单线态氧量子产率稍低，最高能达到0.2。但是光活性纳米复合物的循环性能更加优异，也就说明光活性纳米复合物相比较阳离子聚合物具有更加优异的抗疲劳性。
性能测试2光活性纳米复合物细胞内活性氧水平测试
2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)是常用的标记细胞内活性氧水平的荧光探针，其本身没有荧光，但自由穿越细胞膜进入细胞后可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能通透细胞膜，因此探针容易富集在细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，通过荧光倒置显微镜可以观察细胞内DCF的荧光以判定细胞内活性氧的水平。将Hela细胞接种到黑色96孔板(每孔1×104)，并在含有10％胎牛血清、5％CO2的37℃培养箱中孵育24h。然后，将Hela细胞与光活性纳米复合物共孵育4h，加入DCFH-DA探针，使其最终浓度为20μM。在暗处孵育20min后，用PBS洗涤细胞两次，并用不同波长光照射处理细胞，通过倒置荧光显微镜观察细胞荧光。
光活性纳米复合物细胞内活性氧可逆循环水平测试结果如图32所示。光活性纳米复合物细胞内活性氧水平测试结果表明复合物在MC含量较高的状态下经过光照能够产生活性氧并氧化探针，致使细胞内显示出绿色荧光，表明细胞内具有一定水平的活性氧。当光活性纳米复合物中几乎全部为不能产生活性氧的SP时，经过光照射后细胞内仍然不能观察到绿色荧光，表明细胞内活性氧水平较低。同时，控制光活性纳米复合物单线态氧产生状态的“开”或“关”，可以观察到细胞内绿色荧光可以交替的产生或静默。结果表明光活性纳米复合物具有优异的活性氧可逆调控能力。
性能测试3光活性纳米复合物细胞毒性测试
光活性纳米复合物能够产生大量的活性氧会对细胞造成伤害，因此通过噻唑蓝(MTT)与流式细胞检测技术等方法检测光活性纳米复合物的细胞毒性水平，以期在光动力治疗领域获得应用。
MTT法是实验室常用的检测细胞存活度的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。将细胞接种到黑色96孔板(每孔1×104)中，并在含有10％胎牛血清、5％CO2的37℃培养箱中孵育24h。然后，将Hela细胞与光活性纳米复合物共孵育4h，弃去培养基并用PBS缓冲液洗涤2次后，用光照射处理细胞。进一步培养24h后，用PBS洗涤细胞两次。然后，向每个孔中加入含有MTT(100μL，0.5mg/mL)的新鲜培养基，并在培养条件下孵育4h。弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤，然后加入DMSO(150μL)以溶解甲瓒，用酶标仪检测在490nm、720nm紫外吸光度，通过比值计算可间接反映活细胞力水平。
MTT法测试光活性纳米复合物细胞毒性结果如图33所示，结果显示：在无光照条件下，光活性纳米复合物几乎没有细胞毒性，但在最高浓度下显示出轻微的细胞毒性；随着光照切换次数的增加，光活性纳米复合物的细胞毒性逐渐增加，这就说明光活性纳米复合物通过可逆控制活性氧的产生导致了明显的细胞毒性。
在正常的细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。膜联蛋白V(Annexin V)是与PS有高度的亲和力的磷脂结合蛋白，故其可以通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
对于细胞凋亡分析，将Hela细胞接种到12孔板中(每孔1×106)，并在含有10％胎牛血清、5％CO2的37℃培养箱中孵育24h。然后，将Hela细胞与光活性纳米复合物共孵育4h，弃去培养基并用PBS缓冲液洗涤2次后，用光照射处理细胞。然后将细胞进一步培养24h，通过胰蛋白酶消化和离心收集，通过Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒染色，并通过流式细胞术分析。
流式测试结果如图34所示，结果表明：在无光照条件下，光活性纳米复合物几乎没有诱导细胞凋亡；随着光照切换次数的增加，细胞凋亡的比例逐渐增加，说明光活性纳米复合物诱导细胞凋亡的能力细胞逐渐增强。
综上所述，光活性纳米复合物通过不同波长的光照可以控制活性氧的可逆产生，并对细胞造成损伤，有望在光动力学方面获得应用。
实施例2
本实施例的步骤1与步骤2均与实施例1相同。
步骤3与实施例1的步骤相同，所不同之处在于：(1)Boc基团保护的聚合物(PBHPS)的合成中，加入原料Boc-HMA(33mg，0.118mmol)，PEGMA(53.2mg，0.145mmol)，SPMA(12.4mg，0.030mmol)，所得到棕色固体(54mg，55.3％)。
性能检测：通过1H NMR(400M Hz,CDCl3)对其结构进行表征，如图13所示，结果显示结构无误，同时根据各基团的特征峰位移积分面积计算各组分所占比例。通过体积排阻色谱(GPC)对聚合物PBHPS的分子量(Mn,Mw)与分子量分布指数(PDI)进行测试。
(2)阳离子聚合物(PHPS)的合成
将40mg Boc基团保护的共聚物PBHPS溶于0.5mL二氯甲烷中，同时在冰浴中冷却。将0.5mL盐酸与1,4-二氧六环的混合液小心的通过注射器滴加到溶液中。滴加完毕后将反应液温度恢复至室温，在室温下反应3h后，向溶液中通氮气鼓泡除去溶剂，并在HEPES缓冲溶液(10mM，pH＝7.0)中透析(MWCO＝7000Da)，得到Boc-去保护的阳离子聚合物PHPS。
性能检测均符合要求。
步骤4：光活性纳米复合物及其制备
在阳离子聚合物PHPS与核酸分子相互作用之前，用紫外光(365nm:2mW/cm2)照射使47.2mol％的螺吡喃保持在开环MC状态。然后，保证阳离子聚合物PHPS与核酸分子的质量比为30，将二者在HEPES缓冲溶液(10mM,pH＝7.0)中等体积混合，值得注意的是要将质量少的一方加入到质量多的体系中，即：将核酸分子溶液加入到阳离子聚合物溶液PHPS中，混合速度适度，过程小心，混合结束后室温静置20min，即可制备得到光活性纳米复合物。
制备过程如图2所示，性能检测、光活性纳米复合物活性氧可逆性调控均符合要求。
实施例3
本实施例的步骤1与步骤2均与实施例1相同。
步骤3与实施例1的步骤相同，所不同之处在于：(1)Boc基团保护的聚合物(PBHPS)的合成中，加入原料Boc-HMA(35mg，0.126mmol)，PEGMA(50.2mg，0.139mmol)，SPMA(5.9mg，0.0139mmol)，所得到棕色固体(51mg，56％)。
性能检测：通过1H NMR(400M Hz,CDCl3)对其结构进行表征，如图13所示，结果显示结构无误，同时根据各基团的特征峰位移积分面积计算各组分所占比例。通过体积排阻色谱(GPC)对前述三个实施例中聚合物PBHPS的分子量(Mn,Mw)与分子量分布指数(PDI)进行测试。各组分的比例及GPC测试结果如表2所示。
表2Boc基团保护聚合物PBHPS各部分组成以及GPC测试结果
表1中，a表示理论上各组分的投料比，b表示通过1H NMR测试实际上各组分在聚合物PBHPS链段中所占的比例，c表示通过GPC测试得到的数均分子量(Mw)和重均分子量(Mw)。由表2所知，所制备Boc基团保护的聚合物(PBHPS)结构可控规整。
(2)阳离子聚合物(PHPS)的合成
将40mg Boc基团保护的共聚物PBHPS溶于0.5mL二氯甲烷中，同时在冰浴中冷却。将0.5mL盐酸与四氢呋喃的混合液小心的通过注射器滴加到溶液中。滴加完毕后将反应液温度恢复至室温，在室温下反应3h后，向溶液中通氮气鼓泡除去溶剂，并在HEPES缓冲溶液(10mM，pH＝7.0)中透析(MWCO＝7000Da)，得到Boc-去保护的阳离子聚合物PHPS。
性能检测均符合要求。
步骤4：光活性纳米复合物及其制备
在阳离子聚合物PHPS与核酸分子相互作用之前，用紫外光(365nm:2mW/cm2)照射使48.9mol％的螺吡喃保持在开环MC状态。然后，保证阳离子聚合物PHPS与核酸分子的质量比为30，将二者在HEPES缓冲溶液(10mM,pH＝7.0)中等体积混合，值得注意的是要将质量少的一方加入到质量多的体系中，即：将核酸分子溶液加入到阳离子聚合物溶液PHPS中，混合速度适度，过程小心，混合结束后室温静置20min，即可制备得到光活性纳米复合物。
制备过程如图2所示，性能检测、光活性纳米复合物活性氧可逆性调控均符合要求。
实施例4
本实施例的制备方法与实施例1相同，所不同之处在于反应物的加入量不同，详见表3。
表3不同反应物投入质量及对应摩尔分数
| 组号 | 实施例4-1 | 实施例4-2 | 实施例4-3 |
| Boc-HMA投料质量/mg | 4.0 | 40.0 | 8.0 |
| PEGMA投料质量/mg | 51.6 | 5.2 | 41.3 |
| SPMA投料质量/mg | 54.2 | 54.2 | 60.2 |
| Boc-HMA摩尔分数 | 5％ | 50％ | 10％ |
| PEGMA摩尔分数 | 50％ | 5％ | 40％ |
| SPMA摩尔分数 | 45％ | 45％ | 50％ |
本实施例中各组数据的试验结果及性能检测均符合要求。
本发明的活性纳米复合物中阳离子聚合物由摩尔百分比均为5～50％的正电性链段、亲水性链段和光敏性链段组成，三者之和为100％。当摩尔百分比高于5％时，能确保聚合物与核酸的正常结合，低于50％时能确保聚合物在水溶液中的良好分散性以及较高的螺吡喃成分。
实施例5
本实施例的制备方法与实施例1相同，所不同之处在于阳离子聚合物PHPS与核酸分子的质量比为15、20、40、60，所得试验结果与性能检测均符合要求。当阳离子聚合物与核酸分子相互作用时，为保证核酸分子被完全压缩，最低质量比为15；使用高于15:1的质量比既能提高作为光开关及光敏剂的螺吡喃含量，又能确保纳米复合物的稳定性；使用低于60:1的质量比，避免聚合物游离于纳米颗粒之外而可能影响抗疲劳性能；另外，为保证形成的复合物具有较高的稳定性与较低的生物学毒性，同时控制应用成本，最高质量比定为60。
实施例6
本实施例的制备方法与实施例1相同，所不同之处在于制备光活性纳米复合物时静置时间为15min、30min、60min、90min、120min，所得试验结果与性能检测均符合要求。
本发明的核酸分子与阳离子聚合物混合后，通常在15～20min内尺寸及表面电势等物化性质达到稳定，即可使用；由于核酸分子与阳离子聚合物相互作用的主要驱动力为静电相互作用，但也包含其它弱相互作用，为保证相互作用的进行程度与实验进程，优选时间20min；另外，二者作用之后所形成的是纳米颗粒，在溶液中相当于一种悬浮液，在纳米颗粒表面净电荷不高的情况下为保证其不聚沉，所以静置时间也不易过长。
实施例7
本实施例的制备方法与实施例1相同，所不同之处在于除去Boc保护基团的阳离子聚合物时反应0.5h、2h、4h、12h、18h、24h，所得试验结果与性能检测均符合要求。
本发明的活性纳米复合物的总体结构示意图如图36所示，其中R1是阳离子链段，R2是亲水性链段，R3是螺吡喃链段；图37为光活性纳米复合物中的聚乙二醇链段为H封端的总体结构示意图；图38为光活性纳米复合物中的聚乙二醇链段为CH3封端的总体结构示意图，以上结构的光活性纳米复合物均可达到本发明的目的。
由此可见，本发明的光活性纳米复合物同时可作为光控开关又可以作为光敏剂；且该纳米复合物生物相容性良好，具有较优异的抗疲劳性质与稳定性，可有效降低光敏剂体系额外的光毒性，因此在指导疾病诊疗与光动力治疗领域具有广泛的应用前景。
Claims (9)
1.一种光活性纳米复合物，其特征在于：包括核酸分子和阳离子聚合物，所述阳离子聚合物由正电性链段、亲水性链段和光敏性链段组成，所述光敏性链段为螺吡喃链段。
2.根据权利要求1所述的光活性纳米复合物，其特征在于：所述阳离子聚合物与核酸分子的质量比为15～60:1。
3.根据权利要求1所述的光活性纳米复合物，其特征在于：所述正电性链段、亲水性链段和光敏性链段的摩尔百分比均为5～50％，三者之和为100％。
4.根据权利要求1所述的光活性纳米复合物，其特征在于：所述正电性链段包括烷基伯胺、烷基仲胺、烷基季铵盐或烷基咪唑，其中所述烷基为C1～C18链；所述亲水性链段包括聚乙二醇链段、乙烯吡咯烷酮、水溶性丙烯酰胺、乙烯醇、甜菜碱类、甲基丙烯酸羟丙酯或丙烯酸羟丙酯。
5.一种制备权利要求1所述光活性纳米复合物的方法，其特征在于包括以下步骤：将所述阳离子聚合物溶液置于紫外光下照射，与核酸分子混合，静置，得到光活性纳米复合物。
6.根据权利要求5所述光活性纳米复合物的制备方法，其特征在于：所述静置时间为15～120min。
7.根据权利要求5所述光活性纳米复合物的制备方法，其特征在于所述阳离子聚合物溶液的制备步骤为：
(1)制备Boc基团保护的阳离子聚合物PBHPS，干燥得到固体，其中，PBHPS的结构式为：
(2)将固体溶解、冷却，滴加三氟乙酸溶液或盐酸与1，4-二氧六环的混合液或盐酸与四氢呋喃的混合液，反应后置于缓冲溶液中透析，得到脱除Boc的阳离子聚合物。
8.根据权利要求7所述光活性纳米复合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述固体反应0.5～24h，所述缓冲溶液的pH为6.8～7.4。
9.根据权利要求7所述光活性纳米复合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述缓冲溶液为HEPES缓冲溶液、PBS缓冲溶液、Bis-Tris缓冲溶液、PIPES缓冲溶液或MOPS缓冲溶液。
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