JP6108369B2 - 核酸内包高分子ミセル複合体及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本願は、2013年8月6日に日本に出願された、特願2013−163106号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
また、遺伝子キャリアの大きさが大きすぎると、細胞に取り込まれ難いという問題がある。特に膵臓がんのように血管密度の低いがんに対しては、血管の透過性が障壁となり、全身投与によって100nmサイズの遺伝子キャリアをがん組織深部にまで送達させることは非常に困難である。
[1] 非電荷性親水性高分子鎖ブロック及びカチオン性高分子鎖ブロックを含むブロック共重合体と、1000塩基長以上の互いに相補的な塩基配列からなる2本の一本鎖DNA、少なくとも二重らせん構造の一部が解離して一本鎖構造となっている1000塩基対長以上の二本鎖DNA、又は1000塩基長以上の1本の一本鎖DNAとから形成されてなることを特徴とする、球体状である核酸内包高分子ミセル複合体。
[2] 非電荷性親水性高分子鎖ブロック及びカチオン性高分子鎖ブロックを含むブロック共重合体と、1000塩基長以上の互いに相補的な塩基配列からなる2本の一本鎖DNA、又は少なくとも二重らせん構造の一部が解離して一本鎖構造となっている1000塩基対長以上の二本鎖DNAとから形成されてなる、前記[1]の核酸内包高分子ミセル複合体。
[3] 前記一本鎖DNAが2000塩基長以上であり、前記二本鎖DNAが2000塩基対長以上である、前記[1]又は[2]の核酸内包高分子ミセル複合体。
[4] 水性媒体中の動的光散乱法による平均粒子径が100nm以下である、前記[1]〜[3]のいずれかの核酸内包高分子ミセル複合体。
[5] DNAと、静電的相互作用によりDNAと結合したカチオン性高分子鎖ブロックとがコア部分を形成し、非電荷性親水性高分子鎖ブロックがシェル部分を形成している、前記[1]〜[4]のいずれかの核酸内包高分子ミセル複合体。
[6] 前記コア部分の平均粒子径が、50nm以下である、前記[5]の核酸内包高分子ミセル複合体。
[7] 前記一本鎖DNA又は前記二本鎖DNAが、線状である、前記[1]〜[6]のいずれかの核酸内包高分子ミセル複合体。
[8] 前記ブロック共重合体の少なくとも一部が、互いに架橋されている、前記[1]〜[7]のいずれかの核酸内包高分子ミセル複合体。
[9] 前記カチオン性高分子鎖ブロックの主鎖又は側鎖に、疎水性基が共有結合している、前記[1]〜[8]のいずれかの核酸内包高分子ミセル複合体。
[10] 前記カチオン性高分子鎖ブロックの側鎖に、エチルアミン構造又はプロピルアミン構造を有する、前記[1]〜[9]のいずれかの核酸内包高分子ミセル複合体。
[11] DNAを収容した核酸内包高分子ミセル複合体を製造する方法であって、
非電荷性親水性高分子鎖ブロック及びカチオン性高分子鎖ブロックを含むブロック共重合体と、二重らせん構造の少なくとも一部を解離させた状態の1000塩基対長以上の二本鎖DNAとを、水性媒体中で混合する工程を有することを特徴とする、球体状である核酸内包高分子ミセル複合体の製造方法。
[12] 前記二本鎖DNAが、2000塩基対長以上である、[11]の核酸内包高分子ミセル複合体の製造方法。
[13] 前記二本鎖DNAが、線状である、前記[11]又は[12]の核酸内包高分子ミセル複合体の製造方法。
[14] 前記二本鎖DNAが、60℃以上で変性されたものである、[11]〜[13]のいずれかの核酸内包高分子ミセル複合体の製造方法。
本発明において用いられるブロック共重合体は、非電荷性親水性高分子鎖ブロックとカチオン性高分子鎖ブロックとを含むものである。非電荷性親水性高分子鎖ブロックとしては、例えば、PEG、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール;ポリ(2−メチル−2−オキサゾリン)、ポリ(2−エチル−2−オキサゾリン)、ポリ(2−イソプロピル−2−オキサゾリン)等のポリオキサゾリン;ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、及びそれらの誘導体由来の各種のブロック等が例示される。中でも、生体適合性が高い中性の水溶性高分子であることから、PEG、ポリオキサゾリン、デキストラン、ポリビニルアルコールが好ましい。
例えば、非電荷性親水性高分子鎖ブロックとしてPEG由来のブロック(ポリオキシエチレン鎖ブロック、以下、単に「PEGブロック」ということがある。)を用いる場合には、PEGブロックの分子量は約1.0〜100kDaが好ましく、2〜80kDaがより好ましく、8〜25kDaがさらに好ましい。また、PEGブロック中のオキシエチレンの反復単位の数としては、22〜2,300個が好ましく、45〜1,850個がより好ましく、180〜600個がさらに好ましい。
本発明において用いられるカチオン性高分子鎖ブロックとしては、DNAと静電的に結合し得るカチオン性の高分子鎖からなるブロックであればよく、特に限定されるものではない。具体的には例えば、カチオン性基を側鎖に有するポリアミノ酸誘導体;ポリエチレンイミン(PEI);ポリメタクリル酸誘導体、ポリアクリル酸誘導体等のアクリル系樹脂等が挙げられる。
なお、本願明細書において、「Cx−y」は、炭素数x〜yを意味する。
本発明において用いられるブロック共重合体は、前記非電荷性親水性高分子鎖ブロックの末端と前記カチオン性高分子鎖ブロックの末端が、直接又は間接的(すなわち、適当なリンカーを介して)に共有結合されたものである。
高分子ミセル複合体を遺伝子キャリアとして使用するには、遺伝子(DNA)を標的組織や標的細胞に効率よく運搬するために、特定の細胞や組織との親和性の高い分子(標的指向性分子)を表面に備えることが好ましい。例えば、非電荷性親水性高分子鎖ブロックの2つの末端のうち、カチオン性高分子鎖ブロックと直接又は間接的に共有結合させる末端とは反対側の末端に、直接又は適当なリンカーを介して標的指向性分子を付加することにより、標的指向性分子が表面に露出した核酸内包高分子ミセル複合体を形成させることができる。標的指向性分子としては、例えば、特定の受容体タンパク質等に対するリガンド又は抗体(その断片:F(ab’)2、F(ab)等)、糖、核移行シグナル分子等が挙げられる。本発明に係る核酸内包高分子ミセル複合体は、2000塩基対長以上という長さのDNAを内部に収容するにもかかわらず、従来になく小さな粒子である。このため、その表層に核移行シグナル分子を備えることにより、非分裂細胞に対しても核膜孔通過による遺伝子導入を成功させ得る。
本発明に係る核酸内包高分子ミセル複合体が内包する核酸は、2000塩基長以上の互いに相補的な塩基配列からなる2本の一本鎖DNA、又は2000塩基長以上の1本の一本鎖DNAである。互いに相補的な塩基配列からなる2本の一本鎖DNAは、通常、互いに会合してなる二本鎖DNAが二重らせん構造をとっている。二重らせん構造は非常に剛性が強いため、二本鎖DNAとブロック共重合体を単に混合して自己組織化により、DNAを内包する高分子ミセル複合体を形成させる従来法により核酸内包高分子ミセル複合体を形成させた場合には、シェル部分の非電荷性親水性高分子鎖ブロックの密度を充分に低下させない限り、球体状に近い小さな粒子とすることはできなかった。
PEGブロックとPLysブロックからなるブロック共重合体により二重らせん構造の二本鎖DNA(pDNA)を内包させた高分子ミセル複合体における、PLysブロックの重合度と、高分子ミセル複合体の形状との関係を調べた。
本発明者の一人により既に開示された方法(Kataoka et al.,Macromolecules,1996,vol.29,p.8556−8557)に準じて得られたα−メトキシ−ω−アミノPEG(PEG、Mw=12kDa、Mw/Mn=1.05)を開始剤として用い、Nε−トリフルオロアセチル−L−リシンのN−カルボン酸無水物(NCA)を開環重合することによってPEGブロック−ポリ(ε−トリフルオロアセチル−L−リシン)ブロック(PEG−PLys(TFA))を製造した。この際、開始剤とモノマーであるNCAとの比を調節することにより、重合度の異なる3種のPEG−PLys(TFA)を製造した。こうして得られた3種のPEG−PLys(TFA)のトリフルオロアセチル基(TFA基)を水酸化ナトリウムで脱保護して、重合度(下記化学式中の「n1」)の異なる3種のPEG−PLysを得た。
PEG−PLysがDNAと結合したことを確認するために、PEG−PLysを予め蛍光標識した。具体的には、前記(1)で得たPEG−PLysに対して、Alexa Fluor(登録商標)680 carboxylic acid succinimidyl ester(Molecular Probes社製)を、製造者による使用説明書に従って反応させて結合させた。未反応の蛍光物質をPD−10脱塩カラム(GE Healthcare Life Sciences社製)を用いて除去した。PEG−PLysが実際に蛍光標識されたことは、UV検出器、IR検出器、及び蛍光検出器を備えるGPCにより確認した。蛍光標識効率を算出したところ、おおよそ全てのPEG−PLysにおいて、40リシン反復単位当たり1分子の蛍光物質が結合していた。
コア部分の表面積当たりのPEGの平均密度σを測定するための核酸内包高分子ミセル複合体を形成するためには、市販のプラスミドpBR322(4361bp、タカラバイオ社製)を用いた。
血中滞留性を調べるための核酸内包高分子ミセル複合体を形成するためには、蛍光物質Cy(登録商標)5で標識したプラスミドpCAG−Luc2(6.4kbp)を用いた。pCAG−Luc2の蛍光標識は、Label IT(登録商標)Tracker Nucleic Acid Localization Kit(Mirus Bio社製)を用いて行った。なお、pCAG−Luc2は、プラスミドpCAGGS(理研ジーンバンクから供与)に、プラスミドpGL4(プロメガ社製)からLuc2をコードする遺伝子切り出して組み込んだものである。
PEG−PLys溶液にDNA溶液を、N/P比が2となるように素早く混合することにより、pDNAを内包したPEG−PLysの高分子ミセル複合体を形成した。なお、N/P比とは、[PLysブロック中のアミン基のモル濃度]/[pDNA中のリン酸基のモル濃度]である。反応溶媒は、10mM HEPESバッファー(pH7.3)とし、反応溶液中のpDNA濃度は、PEGの平均密度(σ)測定のための核酸内包高分子ミセル複合体形成の場合には33.3ng/μL、血中滞留性測定のための核酸内包高分子ミセル複合体形成の場合には100ng/μLとした。
蛍光標識PEG−PLysを用いて形成された高分子ミセル複合体については、pDNAと結合した蛍光標識PEG−PLysを、pDNAと結合していない遊離の蛍光標識PEG−PLysから分離するために、高分子ミセル複合体形成後の反応溶液を、壁の厚いポリカーボネート製チューブ(製品番号:343776、ベックマン・コールター社製)に入れて超遠心分離処理を行った。超遠心分離処理は、TLA−120.1ローター(ベックマン・コールター社製)を備えた超遠心分離機Optima TLX(ベックマン・コールター社製)を用い、50,000×gで3時間、超遠心分離処理を行った。当該条件では、遊離のPEG−PLysは上清に残る一方、高分子ミセル複合体は完全に沈殿することが、ベックマン分析用超遠心分離機XL−I(ベックマン・コールター社製)によって確認されている。上清の702nmにおける蛍光強度を測定し、遊離の蛍光標識PEG−PLysの標準品の結果に基づいて作成された検量線を用いて、当該上清の蛍光標識PEG−PLysの濃度を算出した。なお、702nmは、蛍光物質Alexa Fluor(登録商標)680の極大蛍光波長である。
PEG−PLysを用いて形成された高分子ミセル複合体について、TEM画像を撮像した。TEM画像には、高分子ミセル複合体を構成するDNAとPLysブロックが現れ、PEGは観察できない。高分子ミセル複合体中、DNAはコア部分を形成している。つまり、TEM画像から、高分子ミセル複合体のコア部分の形状が確認できる。
各高分子ミセル複合体のコア部分の表面積[An]を、TEM画像中における長軸[Ln]を回転軸とし、短軸の半分の長さ[rn]を半径とする円柱として、下記式の通り求めた。TEM画像中の複数のコア部分について測定し、平均を算出した。
コア部分の表面積: [An]=(Ln×2πrn)+2×(π×rn 2)
蛍光標識したDNAを用いて形成された高分子ミセル複合体について、マウスに投与し、血中滞留時間を、生体リアルタイム共焦点走査顕微鏡により経時的に観察した。全ての画像及び動画は、正立顕微鏡ECLIPSE FN1(ニコン社製)(対物レンズ:20倍、ダイオードレーザー:640nm、エミッションバンドパスフィルタ:700/75nm)が付属している共焦点レーザー走査顕微鏡システムA1R(ニコン社製)により取得した。
pDNAをそのまま内包させる従来法により製造された核酸内包高分子ミセル複合体と、pDNAの二重らせん構造を解離させた状態でブロック共重合体と結合させる方法によりにより製造された核酸内包高分子ミセル複合体とについて、形状、大きさ、ブロック共重合体の密度を比較した。
α−メトキシ−ω−アミノPEG(PEG、Mw=12kDa、Mw/Mn=1.05)を開始剤として用い、β−ベンジル−L−アスパルテート(BLA)のNCAを開環重合することによってPEGブロック−ポリ(β−ベンジル−L−アスパルテート)ブロック(PEG−PBLA)を製造した。この際、開始剤とモノマーであるNCAとの比を調節することにより、重合度の異なる3種のPEG−PBLAを製造した。
得られたPEG−PBLAの末端のアミノ基に、コレステロールの3−ヒドロキシル基を一級アミノ基に置換した後に無水コハク酸と反応させることによって活性化されたカルボキシル基を有するコレステロール誘導体を、10倍当量のジシクロヘキシルカルボジイミドと2倍当量の4−ジメチルアミノピリジンの存在下、N,N−ジメチルホルムアミド中で一晩反応させた。得られたブロック共重合体を、冷ジエチルエーテルとイソプロパノールの混合溶媒(2:1(容量比))に滴下して再沈することを3回繰り返した後、ベンゼンから凍結乾燥することによって、PEG−PBLA−Choleの精製粉末を得た。
得られたPEG−PBLA−Choleから、エステル−アミド交換反応によりPBLAの側鎖中にジエチレントリアミンを導入することにより、PEG−PAsp(DET)−Choleを得た。
PEG−PAsp(DET)−CholeがDNAと結合したことを確認するために、参考例1の(1)と同様にして、Alexa Fluor(登録商標)680 carboxylic acid succinimidyl ester(Molecular Probes社製)を用いて、PEG−PAsp(DET)−Choleを予め蛍光標識した。PEG−PAsp(DET)−Choleが実際に蛍光標識されたことは、UV検出器、IR検出器、及び蛍光検出器を備えるGPCにより確認した。蛍光標識効率を算出したところ、おおよそ全てのPEG−PAsp(DET)−Choleにおいて、PAsp(DET)ブロック当たり0.3〜0.5分子の蛍光物質が結合していた。
PEG−PAsp(DET)−Chole溶液に、参考例1で用いたプラスミドpBR322溶液を、N/P比が4となるように素早く混合することにより、pDNAを内包したPEG−PAsp(DET)−Choleの高分子ミセル複合体(以下、「PM−1」(PM:Polyplex Micelle))を形成した。反応溶媒は、10mM HEPESバッファー(pH7.3)とし、反応溶液中のpDNA濃度は33.3ng/μLとした。
プラスミドpCAG−Luc(6.4kbp)溶液に制限酵素を添加して制限酵素処理し、pCAG−Lucを1箇所消化して線状とした。この線状DNAを含むDNA溶液を、95℃で10分間加熱処理し、線状化したpCAG−Lucを1本鎖に変性させた。次いで、変性させた状態のDNA溶液に、PEG−PAsp(DET)−Chole溶液を、N/P比が4となるように素早く混合することにより、1分子のpCAG−Luc由来の2本の線状の1本鎖DNAを内包したPEG−PAsp(DET)−Choleの高分子ミセル複合体(以下、「MCPM−1」(MCPM:Melt Crumpled Polyplex Micelle))を形成した。溶媒は、10mM HEPESバッファー(pH7.3)とし、反応溶液中のpDNA濃度は33.3ng/μLとした。なお、pCAG−Lucは、プラスミドpCAGGS(理研ジーンバンクから供与)に、プラスミドpGL3(プロメガ社製)からLucをコードする遺伝子切り出して組み込んだものである。
前記(3)及び(4)で得られた高分子ミセル複合体のうち、蛍光標識PEG−PAsp(DET)−Choleを用いて形成された高分子ミセル複合体について、DNAと結合した蛍光標識PEG−PAsp(DET)−Chole量を測定するために、参考例1の(5)と同様にして、高分子ミセル複合体形成後の反応溶液を超遠心分離処理し、上清の702nmにおける蛍光強度に基づいて、1分子のpDNAに結合している蛍光標識PEG−PAsp(DET)−Choleの平均分子数(すなわち、高分子ミセル複合体1分子当たりに含まれている蛍光標識PEG−PAsp(DET)−Choleの平均分子数、単位:鎖)を算出した。算出結果を表1の「結合PEG数(鎖)」に示す。
前記(3)及び(4)で得られた高分子ミセル複合体のうち、蛍光標識していないPEG−PAsp(DET)−Choleを用いて形成された高分子ミセル複合体について、参考例1の(6)と同様にして、TEM画像を撮像し、TEM画像中の高分子ミセル複合体のコア部分について、長軸の長さ[Ln]と短軸の長さ[2rn]を測定した。この時、コア部分の形状が円の場合には、長軸の長さ[Ln]が直径となり、短軸の長さ[2rn]と等しくなる。図3に、両高分子ミセル複合体のTEM画像を、図4にTEM画像から算出された高分子ミセル複合体の長軸の分布を、それぞれ示す。TEM画像中の高分子ミセル複合体のコア部分は、PM−1では参考例1と同様にロッド状であったが、MCPM−1では球体状(平均半径:23.1±3.8nm)であった。
TEM画像中の複数のPM−1のコア部分の表面積[An]を、参考例1の(7)と同様にして算出し、その平均を算出した。
MCPM−1のコア部分の表面積[An]は、TEM画像中における長軸[Ln]の半分の長さ[rn]を半径とする球として、下記式の通り求めた。TEM画像中の複数のコア部分について測定し、平均を算出した。
コア部分の表面積:[An]= 4πrn 2
CAGプロモーターの下流に蛍光緑色タンパク質GFPをコードする遺伝子を含むプラスミドpCAG−AcGFP(6.5kbp、理研ジーンバンクから供与)を用いて、pDNAをそのまま内包させる従来法と、pDNAの二重らせん構造を解離させた状態でブロック共重合体と結合させる方法とによりそれぞれGFP遺伝子内包高分子ミセル複合体を製造し、膵臓がんを発症しているモデルマウスに全身投与し、膵臓がん組織におけるGFP発現を調べた。なお、pCAG−AcGFPは、プラスミドpCAGGS(理研ジーンバンクから供与)に、GFPをコードする遺伝子を組み込んだものである。
実施例1で製造したPEG−PAsp(DET)−Chole溶液に、プラスミドpGFP溶液を、N/P比が4となるように素早く混合することにより、pDNAを内包したPEG−PAsp(DET)−Choleの高分子ミセル複合体(以下、「PM−2−GFP」)を形成した。反応溶媒は、10mM HEPESバッファー(pH7.3)とし、反応溶液中のプラスミド濃度は100ng/μLとした。
プラスミドpGFP溶液に制限酵素を添加して制限酵素処理し、pGFPを1箇所消化して線状とした。この線状DNAを含むDNA溶液を、95℃で10分間加熱処理し、線状化したpGFPを1本鎖に変性させた。次いで、変性させた状態のDNA溶液に、PEG−PAsp(DET)−Chole溶液を、N/P比が4となるように素早く混合することにより、1分子のpGFP由来の2本の線状の1本鎖DNAを内包したPEG−PAsp(DET)−Choleの高分子ミセル複合体(以下、「MCPM−2−GFP」)を形成した。反応溶媒は、10mM HEPESバッファー(pH7.3)とし、反応溶液中のpDNA濃度は100ng/μLとした。
膵臓がんモデルマウスとして、ヒト膵臓腺がん細胞株BxPC3を膵臓に移植したモデルマウスを用いた。
当該膵臓がんモデルマウスは、以下のようにして得た。まず、BALB/cヌードマウス(チャールス・リバー・ラボラトリーズ社製)の皮下に、100μLのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に懸濁させたBxPC3(1×107細胞)を接種した。腫瘍は10日間で増殖期(腫瘍の大きさが75mm3程度)にまで進行した。
膵臓がんモデルマウスに対して、前記(1)、(2)及び実施例1の(4)で製造した高分子ミセル複合体(注入量:200μL、DNA濃度:100ng/μL)を、それぞれ尾静脈から注入した。注入から72時間経過した後のマウスから、BxPC3が移植された膵臓がん組織を外科的に切除し、乾燥冷却したアセトン中で凍結させたものから、クライオスタットにより薄さ10μmの薄層切片を作製した。得られた切片について、細胞核を、Hoecst33342を用いて染色した。また、血管内皮細胞を、抗マウスPECAM−1抗体(BD Pharmingen社製)、並びに抗ヒト及びマウスVEGFR1抗体(製品番号:ab32152、Abcam Japan社製)を用いて染色した。
カチオン性高分子鎖ブロック同士の架橋の有無による、核酸内包高分子ミセル複合体を全身投与した場合の血中滞留性に対する影響を調べた。
参考例1の(1)と同様にして、α−メトキシ−ω−アミノPEG(PEG、Mw=20kDa)を開始剤として用い、NCAを開環重合することによってPEG−PLys(TFA)を製造した。この際、開始剤とモノマーであるNCAとの比を調節することにより、重合度の異なる3種のPEG−PLys(TFA)を製造した。こうして得られた3種のPEG−PLys(TFA)のTFA基を脱保護して、重合度(下記式中、「n2」)が20、40、及び70の3種のPEG−PLysを得た。
反応の終了後、反応液をPEGの貧溶媒であるエーテルに滴下し再沈した。粗生成物をメタノールに溶解させた後、エーテルに再沈する操作を繰り返し、水に不要な不純物を取り除いた。過剰の塩は、生成物を0.1Nの酢酸水溶液に溶解させ、蒸留水に対して1時間透析することによって取り除いた。最終精製物は、凍結乾燥し回収した。
参考例1で用いた蛍光物質Cy(登録商標)5で標識したプラスミドpCAG−Luc2を制限酵素処理し、1箇所消化して線状とした。この線状DNAを含むDNA溶液を、95℃で10分間加熱処理し、線状化した蛍光標識pCAG−Luc2を1本鎖に変性させた。次いで、変性させた状態のDNA溶液に、前記(1)で調製した還元処理後のPEG−PLys−PDP溶液を、N/P比が2となるように素早く混合することにより、1分子の蛍光標識pCAG−Luc2由来の2本の線状の1本鎖DNAを内包したPEG−PLys−PDPの高分子ミセル複合体(以下、リシン由来反復単位の重合度20、40、又は70の高分子を用いたものを、それぞれ「MCPM−3−PLys20」、「MCPM−3−PLys40」、「MCPM−3−PLys70」)を形成した。反応溶媒は、10mM HEPESバッファー(pH7.3)とし、反応溶液中のpDNA濃度は100ng/μLとした。
前記(2)で形成された高分子ミセル複合体を含む反応溶液を、分画分子量6000−8000の透析膜を用いて1Lの10mMリン酸緩衝液(pH7.4)に対して透析し、DTT等を除いた。透析は3日間続け、この間、空気中の酸素によって、チオールをSS結合に酸化し架橋させた。3日間の透析後、未酸化のチオールが存在しないことは、Ellman法によって確認した。MCPM−3−PLys20を架橋化したものをMCPM−3−PLys20−CL、MCPM−3−PLys40を架橋化したものをMCPM−3−PLys40−CL、MCPM−3−PLys70を架橋化したものをMCPM−3−PLys70−CLとした。
前記(2)及び(3)で形成された高分子ミセル複合体(注入量:200μL、DNA濃度:100ng/μL)を、マウスの側面尾静脈から注入した。各高分子ミセル複合体について、4匹のマウスにそれぞれ投与した。投与から30分間経過後のマウスの大静脈から血液を採取し、遠心分離処理により血清を調製した。得られた血清に、トリプシンと硫酸デキストランを加えて、37℃で一晩インキュベートした。インキュベート後の血清のCy(登録商標)5の蛍光強度(670nm)を、蛍光分光光度計(製品名:Nano Drop(ND−3300)、Wilmington)社製)を用いて測定した。
[血中に滞留している高分子ミセル複合体量の割合(%)]=[F670(サンプル)]/[F670(コントロール)]×100
蛍光緑色タンパク質Venusをコードする遺伝子を含むプラスミド(pVenus、5.5kbp)を用いて、pDNAをそのまま内包させる従来法と、pDNAの二重らせん構造を解離させた状態でブロック共重合体と結合させる方法とによりそれぞれVenus遺伝子内包高分子ミセル複合体を製造し、膵臓がんを発症しているモデルマウスに全身投与し、膵臓がん組織におけるVenus発現を調べた。なお、pVenusは、プラスミドpCAGGS(理研ジーンバンクから供与)に、Venusをコードする遺伝子を組み込んだものである。
参考例1の(1)と同様にして、α−メトキシ−ω−アミノPEG(PEG、Mw=20kDa)を開始剤として用い、NCAを開環重合することによってPEG−PLys(TFA)を製造した。この際、開始剤とモノマーであるNCAとの比を調節することにより、重合度の異なる3種のPEG−PLys(TFA)を製造した。こうして得られた3種のPEG−PLys(TFA)のTFA基を脱保護して、重合度が72のPEG−PLysを得た。
次いで、実施例3の(1)と同様にして、得られたPEG−PLysにPDP基を導入した。得られた高分子の構造は1H−NMR測定によって確認したところ、リシン由来反復単位のアミノ基の約12%にPDP基が導入されたことが示された。
得られたPEG−PLys−PDPは、DNAと結合させて高分子ミセル複合体を形成する前に、予め、PDP基に対して3倍の濃度となるようにDTTを加えて15分間撹拌し、PDP基をチオール残基に還元しておいた。
環状RGDペプチド(cRGD)は、腫瘍細胞及び腫瘍血管内皮細胞に過剰発現しているαvβ3及びαvβ5インテグリンを選択的に認識するリガンドである。PEGブロックの末端にcRGDを導入したcRGD−PEG−PLys−PDPを合成した。
具体的には、α−メトキシ−ω−アミノPEGに代えてα−アセチル−ω−アミノPEG(PEG、Mw=20kDa)を開始剤として用いた以外は、実施例1(1)と同様にして、アセチル−PEG−PBLA−Choleを得た。得られたアセチル−PEG−PBLA−Choleを水に溶解させて塩酸でpH2に調整し、アセチル基を完全に活性型のアルデヒド基に変換させた(酸性化したアセチル−PEG−PBLA−Chole溶液)。
これとは別に、cyclo{RGDfK(CX−)}ペプチドを、これらのペプチド間に形成されているかもしれないSS結合を切断するために、ペプチドの10倍当量のDTTを含有する炭酸水素ナトリウムバッファー(0.1N、pH7.4)に溶解させ、1時間インキュベートした(cRGDペプチド溶液)。
次いで、酸性化したアセチル−PEG−PBLA−Chole溶液に、cRGDペプチドがアセチル−PEG−PBLA−Choleの10倍等量となるように前記cRGDペプチド溶液を加え、pH5に調整し、一晩反応させた。最終反応生成物であるcRGD−PEG−PAsp(DET)−Choleは、1Mの塩化ナトリウム水溶液中で3回透析した後、脱イオン水で3回透析した。
前記(1)で製造したPEG−PLys−PDP溶液に、プラスミドpVenus溶液を、N/P比が2となるように素早く混合することにより、pVenusを内包したPEG−PLys−PDPの高分子ミセル複合体(以下、「PM−4−Venus」)を形成した。反応溶媒は、10mM HEPESバッファー(pH7.3)とし、反応溶液中のプラスミド濃度は100ng/μLとした。
次いで、実施例3の(3)と同様にして、形成された高分子ミセル複合体を含む反応溶液を3日間透析し、当該高分子ミセル複合体中のチオールをSS結合に酸化し、架橋させた。架橋化して得られたものをPM−4−Venus−CLとした。
pVenusを制限酵素処理し、1箇所消化して線状とした。この線状DNAを含むDNA溶液を、95℃で10分間加熱処理し、線状化した蛍光標識pVenusを1本鎖に変性させた。次いで、変性させた状態のDNA溶液に、前記(1)で調製した還元処理後のPEG−PLys−PDP溶液を、N/P比が2となるように素早く混合することにより、1分子のpVenus由来の2本の線状の1本鎖DNAを内包したPEG−PLys−PDPの高分子ミセル複合体(以下、「MCPM−4−Venus」)を形成した。反応溶媒は、10mM HEPESバッファー(pH7.3)とし、反応溶液中のpDNA濃度は100ng/μLとした。
次いで、実施例3の(3)と同様にして、形成された高分子ミセル複合体を含む反応溶液を3日間透析し、当該高分子ミセル複合体中のチオールをSS結合に酸化し、架橋させた。架橋化して得られたものをMCPM−4−Venus−CLとした。
前記(1)で調製した還元処理後のPEG−PLys−PDP溶液に代えて、前記(2)で調製した還元処理後のcRGD−PEG−PLys−PDP溶液を用いた以外は、前記(4)と同様にして、1分子のpVenus由来の2本の線状の1本鎖DNAを内包し、架橋化されたMCPM−4−Venus−CL−cRGDを得た。
実施例2の(3)と同種の膵臓がんモデルマウスに対して、前記(3)、(4)及び(5)で製造した高分子ミセル複合体(注入量:200μL、DNA濃度:100ng/μL)を、それぞれ尾静脈から注入した。実施例2の(4)と同様にして、注入から72時間経過した後のマウスから、BxPC3が移植された膵臓がん組織を外科的に切除し、顕微鏡観察用の切片を作製し、得られた切片について、細胞核と血管を蛍光染色した。
実施例3の(1)と同様にして、重合度が20かつPDP基の置換度10%のPEG−PLys−PDP(PEG−PLys20−SH10%)と、重合度が69かつPDP基の置換度12%のPEG−PLys−PDP(PEG−PLys69−SH12%)を製造した。これらのブロック共重合体は、DNAと結合させて高分子ミセル複合体を形成する前に、予め、PDP基に対して3倍の濃度となるようにDTTを加えて15分間撹拌し、PDP基をチオール残基に還元しておいた。
次いで、実施例1の(3)と同様にして、これらのブロック共重合体溶液にプラスミドpCAG−Luc溶液を混合し、pCAG−Lucを内包したPEG−PLys−PDPの高分子ミセル複合体を形成した。
カチオン性高分子鎖ブロック同士の架橋の有無による、核酸内包高分子ミセル複合体の形態に対する影響を調べた。
次いで、実施例3の(2)、(3)と同様にして、これらのブロック共重合体溶液にプラスミドpCAG−Luc2溶液を混合し、pCAG−Luc2を内包したPEG−PLysの高分子ミセル複合体(以下、「MCPM−6」)と、pCAG−Luc2を内包し、架橋を行ったPEG−PLys−PDPの高分子ミセル複合体(以下、「MCPM−6−CL」)を形成した。
核酸変性温度による、核酸内包高分子ミセル複合体の大きさ及び形態に対する影響を調べた。
次いで、線状DNA溶液の加熱処理を、25℃、70℃、80℃又は95℃で10分間行った以外は実施例6と同様にして、pCAG−Luc2を内包したPEG−PLysの高分子ミセル複合体を形成した。
核酸内包高分子ミセル複合体を用いた培養細胞株への遺伝子導入について調べた。
(1)PEG−PLys−PDP
実施例4の(1)と同様にして、重合度が21かつPDP基の置換度12%のPEG−PLys−PDPを製造した。PEG−PLys−PDPのブロック共重合体は、DNAと結合させて高分子ミセル複合体を形成する前に、予め、PDP基に対して3倍の濃度となるようにDTTを加えて15分間撹拌し、PDP基をチオール残基に還元しておいた。
プラスミドpCAGGS(理研ジーンバンクから供与)に、sFlt−1遺伝子を組み込み、プラスミドpCAG−sFlt−1を作製した。sFlt−1遺伝子は、血管新生に関わる血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)と拮抗することで、血管新生を阻害し、抗腫瘍効果を有すると考えられる遺伝子である。得られたpCAG−sFlt−1を制限酵素処理し、1箇所消化して線状とした。この線状DNAを含むDNA溶液を、95℃で10分間加熱処理し、線状化したpCAG−sFlt−1を1本鎖に変性させた。
前記(1)で製造したPEG−PLys−PDP溶液に、1本鎖に変性させた線状pCAG−sFlt−1溶液を、N/P比が2となるように素早く混合することにより、1分子のプラスミドpCAG−sFlt−1由来の2本の線状の1本鎖DNAを内包したPEG−PLys−PDPの高分子ミセル複合体(以下、「MCPM−9−sFlt1−PDP」)を形成した。反応溶媒は、10mM HEPESバッファー(pH7.3)とし、反応溶液中のpDNA濃度は100ng/μLとした。
実施例3の(6)と同種の膵臓がんモデルマウスに対して、前記(2)で製造した3種の高分子ミセル複合体のいずれか、又はHEPESを、2日おきに計3回(0日目、3日目、6日目)200μLずつ(プラスミド又はpDNA濃度:100ng/μL)、それぞれ尾静脈から注入した。
Claims (14)
- 非電荷性親水性高分子鎖ブロック及びカチオン性高分子鎖ブロックを含むブロック共重合体と、1000塩基長以上の互いに相補的な塩基配列からなる2本の一本鎖DNA、少なくとも二重らせん構造の一部が解離して一本鎖構造となっている1000塩基対長以上の二本鎖DNA、又は1000塩基長以上の1本の一本鎖DNAとから形成されてなることを特徴とする、球体状である核酸内包高分子ミセル複合体。
- 非電荷性親水性高分子鎖ブロック及びカチオン性高分子鎖ブロックを含むブロック共重合体と、1000塩基長以上の互いに相補的な塩基配列からなる2本の一本鎖DNA、又は少なくとも二重らせん構造の一部が解離して一本鎖構造となっている1000塩基対長以上の二本鎖DNAとから形成されてなる、請求項1に記載の核酸内包高分子ミセル複合体。
- 前記一本鎖DNAが2000塩基長以上であり、前記二本鎖DNAが2000塩基対長以上である、請求項1又は2に記載の核酸内包高分子ミセル複合体。
- 水性媒体中の動的光散乱法による平均粒子径が100nm以下である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸内包高分子ミセル複合体。
- DNAと、静電的相互作用によりDNAと結合したカチオン性高分子鎖ブロックとがコア部分を形成し、非電荷性親水性高分子鎖ブロックがシェル部分を形成している、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸内包高分子ミセル複合体。
- 前記コア部分の平均粒子径が、50nm以下である、請求項5に記載の核酸内包高分子ミセル複合体。
- 前記一本鎖DNA又は前記二本鎖DNAが、線状である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸内包高分子ミセル複合体。
- 前記ブロック共重合体の少なくとも一部が、互いに架橋されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸内包高分子ミセル複合体。
- 前記カチオン性高分子鎖ブロックの主鎖又は側鎖に、疎水性基が共有結合している、請求項1〜8のいずれか一項に記載の核酸内包高分子ミセル複合体。
- 前記カチオン性高分子鎖ブロックの側鎖に、エチルアミン構造又はプロピルアミン構造を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸内包高分子ミセル複合体。
- DNAを収容した核酸内包高分子ミセル複合体を製造する方法であって、
非電荷性親水性高分子鎖ブロック及びカチオン性高分子鎖ブロックを含むブロック共重合体と、二重らせん構造の少なくとも一部を解離させた状態の1000塩基対以上の二本鎖DNAとを、水性媒体中で混合する工程を有することを特徴とする、球体状である核酸内包高分子ミセル複合体の製造方法。 - 前記二本鎖DNAが、2000塩基対長以上である、請求項11に記載の核酸内包高分子ミセル複合体の製造方法。
- 前記二本鎖DNAが、線状である、請求項11又は12に記載の核酸内包高分子ミセル複合体の製造方法。
- 前記二本鎖DNAが、60℃以上で変性されたものである、請求項11〜13のいずれか一項に記載の核酸内包高分子ミセル複合体の製造方法。
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