KR20160021291A - 핵산 내포 고분자 미셀 복합체 및 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 비전하성 친수성 고분자쇄 블록 및 양이온성 고분자쇄 블록을 포함하는 블록 공중합체와, 1000염기 길이 이상의 서로 상보적인 염기 서열로 이루어지는 2개의 1개쇄 DNA, 적어도 2중 나선 구조의 일부가 해리되어서 1개쇄 구조로 되어 있는 1000염기쌍 길이 이상의 2개쇄 DNA 또는 1000염기 길이 이상의 1개의 1개쇄 DNA로 형성되어서 이루어지는 것을 특징으로 한다.

Description

핵산 내포 고분자 미셀 복합체 및 그 제조 방법{NUCLEIC ACID-ENCAPSULATING POLYMER MICELLE COMPLEX AND METHOD FOR PRODUCING SAME}
본 발명은 핵산(DNA)을 내포하는 고분자 미셀 복합체에 관한 것이다. 보다 상세하게는 비교적 장쇄의 DNA를 내포하고 있음에도 불구하고, 충분히 작은 고분자 미셀 복합체에 관한 것이다.
본원은 2013년 8월 6일에 일본에 출원된 일본 특허출원 2013-163106호에 의거하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
차세대의 치료법으로서 유전자 발현을 제어함으로써 질환을 치료하는 유전자 치료에 큰 기대가 몰려있다. 유전자 치료에 있어서의 최대의 과제는 유전자를 표적의 세포나 조직으로 도입할 때의 도입 효율이 불충분하다는 점이다. 특히, 전신 투여에 의한 유전자 치료를 실현하기 위해서는 유전자가 혈중을 안정적으로 순환해서 표적 조직에 집적하는 것, 또한 표적 세포에 침입한 후 효과적으로 유전자 발현이 행해지는 것이 필요하다. 그래서, 이들을 해결하기 위해서 표적 세포 등으로의 도입 효율이나 표적 세포 내에 있어서의 유전자 발현 효율이 보다 우수한 유전자 운반체(유전자 캐리어)의 개발이 왕성하다.
예를 들면, 1차 구조가 정밀하게 제어된 고분자는 자발적으로 조직화를 발생시켜 미셀, 베시클 등의 고차 구조체를 형성할 수 있는 것이 알려져 있고, 이와 같은 고분자의 자기 조직화된 구조체의 이용이 약품 송달 시스템이나 재료 과학을 비롯한 여러 가지 분야에 있어서 종전 검토되어 있다. 예를 들면, 특허문헌 1에는 비하전성 세그먼트(비하전성 고분자쇄 블록)와 하전성 세그먼트(하전성 고분자쇄 블록)를 갖는 블록 공중합체로 이루어지고, 코어 부분에 상기 하전성 세그먼트와는 반대의 하전을 갖는 약제를 내포할 수 있는 정전 결합형 고분자 미셀 약제 담체가 개시되어 있다. 상기 하전성 세그먼트로서 양이온성 세그먼트를 사용함으로써 DNA를 코어 부분에 내포할 수 있다.
또한, 보다 고분자 미셀의 안정화를 도모하는 고안도 각종 보고되고 있다. 예를 들면, 특허문헌 2에는 정전 결합형 고분자 미셀 약제 담체에 있어서 블록 공중합체끼리를 가교제를 통해 가교시킴으로써 안정화시킨 정전 결합형 고분자 미셀 약제 담체가 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 3에는 비하전성 친수성 고분자쇄 블록과, 측쇄의 일부에 소수성기가 도입된 양이온성 폴리아미노산쇄 블록을 포함해서 이루어지는 블록 공중합체도 개시되어 있다. 상기 블록 공중합체는 측쇄에 소수성기가 도입되어 있음으로써 계면 에너지가 증대되기 때문에 미셀 내의 응집력이 증강해서 코어가 작아지는 결과, 고분자 미셀의 안정화가 도모되고 있다.
일본 특허공개 평 8-188541호 공보 국제공개 제2004/105799호 국제공개 제2009/113645호
유전자 캐리어를 전신 투여할 경우, 표적 세포에 유전자를 도입하기 위해서는 유전자 캐리어의 혈중 체류성이 높을 필요가 있다.
또한, 유전자 캐리어의 크기가 지나치게 크면 세포에 도입되기 어렵다는 문제가 있다. 특히 췌장암와 같이 혈관 밀도가 낮은 암에 대해서는 혈관의 투과성이 장벽이 되어 전신 투여에 의해 100㎚ 사이즈의 유전자 캐리어를 암 조직 심부에까지 송달시키는 것은 매우 곤란하다.
정전 결합형 고분자 미셀 약제 담체의 코어에 유전자를 수용한 고분자 미셀 복합체는 유전자 캐리어로서 매우 유망하지만, 크기나 혈중 체류성의 점에서 아직 개선의 여지가 있다.
본 발명은 비교적 장쇄의 DNA를 내포하고, 크기가 충분히 작아 유전자 캐리어로서도 기능할 수 있는 고분자 미셀 복합체 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.
본 발명자들은 생체 적합성 중성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 양이온성 고분자(이하, 「양이온성 고분자쇄 블록」으로 약기하는 경우가 있다)로 이루어지는 블록 공중합체에 환상 2개쇄 DNA인 플라스미드 DNA(이하, 「pDNA」로 약기하는 경우가 있다)를 내포시킨 고분자 미셀 복합체에 대해서 양이온성 고분자쇄 블록의 길이(중합도)와 고분자 미셀 복합체의 입자 지름의 관계를 조사한 결과, 양이온성 고분자쇄 블록의 길이가 비교적 짧은 경우에는 고분자 미셀 복합체는 장축이 100㎚ 이상의 로드형상이지만, 양이온성 고분자쇄 블록의 길이가 길어질수록 장축의 길이가 짧아지고, 양이온성 고분자쇄 블록의 길이가 충분히 길어지면 구체형상에 가까운 형상으로까지 작아지는 경향이 있는 것을 발견했다. 또한, PEG 밀도와 혈중 체류 시간의 관계를 조사한 결과, PEG 밀도가 높은 고분자 미셀 복합체일수록 혈중 체류 시간이 길어지는 경향이 있는 것도 발견했다. 여기에서 양이온성 고분자쇄 블록의 길이가 길어지면 1분자의 pDNA와 회합하는 블록 공중합체 수가 적어지는 결과, PEG 밀도는 저하되어버린다. 즉, pDNA를 내포시킨 고분자 미셀 복합체의 경우 입자 지름을 작게 하기 위해서 PEG 밀도를 저하시키면 혈중 체류성이 저하되어버리는 것을 알 수 있었다.
본 발명자들은 연구를 더 진행시킨 결과, pDNA의 2중 나선 구조를 해리시킨 상태에서 블록 공중합체와 혼합해서 복합체를 형성함으로써 쉘 부분을 구성하는 비전하성 친수성 고분자쇄 블록의 밀도를 저하시키는 일 없이 로드형상보다 훨씬 작은 구체형상의 고분자 미셀 복합체를 형성할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하는 것에 이르렀다.
즉, 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체 및 그 제조 방법은 하기 [1]~[15]이다.
[1] 비전하성 친수성 고분자쇄 블록 및 양이온성 고분자쇄 블록을 포함하는 블록 공중합체와, 1000염기 길이 이상의 서로 상보적인 염기 서열로 이루어지는 2개의 1개쇄 DNA, 적어도 2중 나선 구조의 일부가 해리되어서 1개쇄 구조로 되어 있는 1000염기쌍 길이 이상의 2개쇄 DNA 또는 1000염기 길이 이상의 1개의 1개쇄 DNA로 형성되어서 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
[2] 상기 [1]에 있어서, 비전하성 친수성 고분자쇄 블록 및 양이온성 고분자쇄 블록을 포함하는 블록 공중합체와, 1000염기 길이 이상의 서로 상보적인 염기 서열로 이루어지는 2개의 1개쇄 DNA 또는 적어도 2중 나선 구조의 일부가 해리되어서 1개쇄 구조로 되어 있는 1000염기쌍 길이 이상의 2개쇄 DNA로 형성되어서 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
[3] 상기 [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 1개쇄 DNA가 2000염기 길이 이상이며, 상기 2개쇄 DNA가 2000염기쌍 길이 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 수성 매체 중의 동적 광산란법에 의한 평균 입자 지름이 100㎚ 이하인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, DNA와, 정전적 상호 작용에 의해 DNA와 결합한 양이온성 고분자쇄 블록이 코어 부분을 형성하고, 비전하성 친수성 고분자쇄 블록이 쉘 부분을 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
[6] 상기 [5]에 있어서, 상기 코어 부분의 평균 입자 지름이 50㎚ 이하인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 구체형상인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
[8] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 1개쇄 DNA 또는 상기 2개쇄 DNA가 선상인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
[9] 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 상기 블록 공중합체 중 적어도 일부가 서로 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
[10] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 고분자쇄 블록의 주쇄 또는 측쇄에 소수성기가 공유 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
[11] 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 고분자쇄 블록의 측쇄에 에틸아민 구조 또는 프로필아민 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
[12] DNA를 수용한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 제조하는 방법으로서,
비전하성 친수성 고분자쇄 블록 및 양이온성 고분자쇄 블록을 포함하는 블록 공중합체와, 2중 나선 구조 중 적어도 일부를 해리시킨 상태의 1000염기쌍 길이 이상의 2개쇄 DNA를 수성 매체 중에서 혼합하는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 제조 방법.
[13] 상기 [12]에 있어서, 상기 2개쇄 DNA가 2000염기쌍 길이 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 제조 방법.
[14] 상기 [12] 또는 [13]에 있어서, 상기 2개쇄 DNA가 선상인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 제조 방법.
[15] 상기 [12] 내지 [14] 중 어느 하나에 있어서, 상기 2개쇄 DNA가 60℃ 이상에서 변성된 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 제조 방법.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면 1000염기쌍 길이 이상, 바람직하게는 2000염기쌍 길이 이상이라는 장쇄의 DNA를 내부에 수용할 경우에 종래는 로드형상 또는 토로이드형상의 핵산 내포 고분자 미셀 복합체가 주로 형성되는 블록 공중합체를 사용한 경우에도 구체형상의 고분자 미셀 복합체를 제공할 수 있다. 구체형상의 고분자 미셀 복합체는 로드형상의 핵산 내포 고분자 미셀 복합체보다 입자 지름이 작고, 또한 상기 블록 공중합체를 구성하는 비전하성 친수성 고분자쇄 블록의 밀도도 크기 때문에 세포로의 도입 효율과 혈중 체류성 양쪽이 우수하다.
도 1은 참고예 1에 있어서, 각 고분자 미셀 복합체의 TEM 화상과, 상기 화상으로부터 산출된 고분자 미셀 복합체(로드형상 입자)의 장축 길이의 분포를 나타낸 도면이다.
도 2는 참고예 1에 있어서, 각 고분자 미셀 복합체를 전신 투여한 마우스의 귀 정맥에 있어서의 형광 강도의 경시적 변화의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 1에 있어서, 형광 표지 PEG-PAsp(DET)-Chole을 사용해서 형성된 고분자 미셀 복합체(좌: PM-1, 우: MCPM-1)의 TEM 화상이다.
도 4는 실시예 1에 있어서, TEM 화상으로부터 산출된 고분자 미셀 복합체의 장축 길이의 분포를 나타낸 도면(좌: PM-1, 우: MCPM-1)이다.
도 5는 실시예 2에 있어서, 고분자 미셀 복합체 MCPM-2-GFP를 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직의 형광 화상이다.
도 6은 실시예 2에 있어서, 고분자 미셀 복합체 PM-2-GFP를 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직의 형광 화상이다.
도 7은 실시예 2에 있어서, 고분자 미셀 복합체 MCPM-1를 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직의 형광 화상이다.
도 8은 실시예 2에 있어서, GFP 유전자를 수용하고 있는 고분자 미셀 복합체 중 PM-2-GFP를 투여한 췌장암 모델 마우스와, MCPM-2-GFP를 투여한 췌장암 모델 마우스에 대해서 췌장암 조직 심부에 있어서의 GFP 발현의 상대 형광 강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 실시예 3에 있어서, 마우스에 전신 투여한 고분자 미셀 복합체의 전량에 대한 전신 투여 후 30분 경과 후에 혈중에 체류하고 있는 고분자 미셀 복합체량의 비율(%)의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 실시예 4에 있어서, 고분자 미셀 복합체(MCPM-4-Venus-CL)를 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직의 형광 화상이다.
도 11은 실시예 5에 있어서, 각 고분자 미셀 복합체의 TEM 화상을 나타낸 도면이다.
도 12는 실시예 6에 있어서, 각 고분자 미셀 복합체의 TEM 화상을 나타낸 도면이다.
도 13은 실시예 6에 있어서, 각 고분자 미셀 복합체의 TEM 화상으로부터 산출된 고분자 미셀 복합체의 장축 길이의 분포를 나타낸 도면이다.
도 14는 실시예 7에 있어서, 각 온도에서 변성 처리를 행한 고분자 미셀 복합체의 장축 길이 및 애스펙트비의 분포를 나타낸 도면이다.
도 15는 실시예 8에 있어서, 루시페라아제 유전자를 수용하고 있는 PEG-PLys 또는 PEG-PLys-PDP를 트랜스펙트한 세포주에 있어서 루시페라아제 발현의 상대 형광 강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 실시예 9에 있어서, 각 고분자 미셀 복합체를 전신 투여한 마우스에 있어서의 췌장암의 크기를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 비전하성 친수성 고분자쇄 블록 및 양이온성 고분자쇄 블록을 포함하는 블록 공중합체와 핵산(DNA)으로 형성되어서 이루어지고, 상기 양이온성 고분자쇄 블록이 회합한 핵산이 코어 부분을 형성하고, 상기 비전하성 친수성 고분자쇄 블록이 쉘 부분을 형성하고 있다. 이하, 상세하게 설명한다.
<비전하성 친수성 고분자쇄 블록>
본 발명에 있어서 사용되는 블록 공중합체는 비전하성 친수성 고분자쇄 블록과 양이온성 고분자쇄 블록을 포함하는 것이다. 비전하성 친수성 고분자쇄 블록으로서는, 예를 들면 PEG, 폴리프로필렌글리콜 등의 폴리알킬렌글리콜; 폴리(2-메틸-2-옥사졸린), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리(2-이소프로필-2-옥사졸린) 등의 폴리옥사졸린; 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리아크릴산 에스테르, 폴리메타크릴산 에스테르 및 그들의 유도체 유래의 각종 블록 등이 예시된다. 그 중에서도 생체 적합성이 높은 중성의 수용성 고분자인 점에서 PEG, 폴리옥사졸린, 덱스트란, 폴리비닐알코올이 바람직하다.
비전하성 친수성 고분자쇄 블록의 분자량은 블록 공중합체가 내부에 핵산을 수용한 고분자 미셀 복합체를 형성할 수 있는 크기이면 좋고, 특별히 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 비전하성 친수성 고분자쇄 블록으로서 PEG 유래의 블록(폴리옥시에틸렌쇄 블록, 이하, 단순히 「PEG 블록」이라고 하는 경우가 있다)을 사용할 경우에는 PEG 블록의 분자량은 약 1.0~100kDa가 바람직하고, 2~80kDa가 보다 바람직하고, 8~25kDa가 더 바람직하다. 또한, PEG 블록 중의 옥시에틸렌의 반복 단위의 수로서는 22~2,300개가 바람직하고, 45~1,850개가 보다 바람직하고, 180~600개가 더 바람직하다.
<양이온성 고분자쇄 블록>
본 발명에 있어서 사용되는 양이온성 고분자쇄 블록으로서는 DNA와 정전적으로 결합할 수 있는 양이온성의 고분자쇄로 이루어지는 블록이면 좋고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 예를 들면 양이온성기를 측쇄에 갖는 폴리아미노산 유도체; 폴리에틸렌이민(PEI); 폴리메타크릴산 유도체, 폴리아크릴산 유도체 등의 아크릴계 수지 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 양이온성 고분자쇄 블록으로서는 양이온성 아미노산의 폴리아미노산이나 그 유도체로부터 유래되는 블록이나 음이온성 아미노산의 음이온성기(일반적으로는 카르복실기)에 양이온성 화합물을 에스테르 결합이나 아미드 결합 등에 의해 결합시킨 아미노산 유도체로부터 유래되는 블록이 바람직하게 사용된다. 양이온성 아미노산의 폴리아미노산으로서는 폴리리신, 폴리오르니틴, 폴리아르기닌, 폴리호모아르기닌 및 폴리히스티딘 등을 들 수 있다. 또한, 음이온성 아미노산에 양이온성 화합물을 결합시킨 아미노산 유도체로서는 아스파르트산이나 글루탐산의 1개의 카르복실기에 카르복실기와 결합하는 부위 이외에 아미노기, 이미노기, 제 4 급 아미노기 등의 양이온성기를 갖는 화합물을 결합시킨 유도체를 들 수 있다. 상기 양이온성기를 갖는 화합물로서는, 예를 들면 여러 가지 디아민 등을 들 수 있다. 아스파르트산이나 글루탐산의 1개의 카르복실기에 디에틸렌트리아민을 반응시킨 아미노산 유도체 유래의 반복 단위를 갖는 블록은 측쇄에 에틸아민 구조를 갖는다. 그 밖에 측쇄에 프로필아민 구조를 도입한 폴리아미노산 유도체 유래의 반복 단위를 갖는 블록도 바람직하다.
본 발명에 있어서는 리신 및/또는 그 유도체를 반복 단위로 하는 폴리아미노산 유래의 블록(이하, 「PLys 블록」이라고 하는 경우가 있다) 또는 아스파르트산의 1개의 카르복실기에 디에틸렌트리아민을 결합시킨 아미노산 유도체 및/또는 그 유도체를 반복 단위로 하는 폴리아미노산 유래의 블록(이하, 「PAsp(DET) 블록」이라고 하는 경우가 있다)을 양이온성 고분자쇄 블록으로 하는 블록 공중합을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
양이온성 고분자쇄 블록 중의 반복 단위의 수로서는 블록 공중합체가 내부에 핵산을 수용한 고분자 미셀 복합체를 형성했을 때에 쉘을 형성하는 비전하성 친수성 고분자쇄 블록의 밀도를 충분히 높게 하기 쉽기 때문에 10~200개가 바람직하고, 20~100개가 보다 바람직하다.
양이온성 고분자쇄 블록의 측쇄 또는 그 말단(비전하성 친수성 고분자쇄 블록과 직접 또는 간접적으로 공유 결합시키는 말단과는 반대측의 말단)에 소수성기가 공유 결합되어 있음으로써 얻어진 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 보다 안정화시킬 수 있다. 양이온성 고분자쇄 블록의 측쇄에 소수성기를 구비할 경우, 소수성기는 양이온성 고분자쇄 블록 중에 어떻게 배치되어 있어도 좋고, 예를 들면 랜덤하게 배치되어 있는 경우나, 블록으로서 배치되어 있는 경우(즉, 비전하성 친수성 고분자쇄 블록과, 측쇄에 소수기가 공유 결합되어 있는 반복 단위로 이루어지는 양이온성 고분자쇄 블록과, 소수기를 담지하지 않는 반복 단위로 이루어지는 양이온성 고분자쇄 블록이 트리 블록을 형성하는 경우)를 들 수 있다.
소수성기로서는 스테롤 유도체의 잔기 또는 C4-24 히드로카빌기를 들 수 있다. 스테롤이란 시클로펜탄온히드로페난트렌환(C17H28)을 베이스로 하는 천연, 반합성 또는 합성의 화합물을 의미하고, 예를 들면 천연의 스테롤로서는 한정되는 것은 아니지만, 콜레스테롤, 콜레스탄올, 디히드로콜레스테롤, 콜산 등을 들 수 있고, 그 반합성 또는 합성의 화합물로서는 이들 천연물의 예를 들면, 합성 전구체(필요에 따라 존재할 경우에는 일정 관능기, 히드록시기의 일부 또는 전부가 상기 기술분야에서 기지의 히드록시 보호기에 의해 보호되어 있거나 또는 카르복실기가 카르복실 보호기에 의해 보호되어 있는 화합물을 포함한다)일 수 있다. 또한, 스테롤 유도체란 본 발명의 목적에 악영향을 끼치지 않는 범위 내에서 시클로펜탄온히드로페난트렌환에 C1- 12알킬기, 할로겐 원자, 예를 들면 염소, 브롬, 불소가 도입되어 있어도 좋고, 상기 환계는 포화 또는 부분 불포화일 수 있는 것 등을 의미한다. 스테롤 유도체의 잔기는 콜레스테롤, 콜레스탄올, 디히드록시콜레스테롤의 3위치 히드록시기의 수소 원자가 제거된 기가 바람직하고, 콜레스테롤 3위치 히드록시기의 수소 원자가 제거된 기가 보다 바람직하다. C4- 24히드로카빌기는 탄소수 4~24개의 탄소 원자와 수소 원자로 이루어지는 탄화수소로부터 1개의 수소 원자를 제거함으로써 생성되는 1가기이다. 구체적으로는 직쇄 또는 분기쇄의 C4- 24알킬기, 바람직하게는 직쇄 또는 분기쇄의 C12- 24알킬기; 직쇄 또는 분기쇄의 C4- 24알케닐기, 바람직하게는 직쇄 또는 분기쇄의 C12- 24알케닐기; 직쇄 또는 분기쇄의 C4- 24알키닐기, 바람직하게는 직쇄 또는 분기쇄의 C12- 24알키닐기; 아다만틸 등의 C4-24의 바구니형상 화합물, 바람직하게는 C12-24의 바구니형상 화합물; 벤질기 등의 아릴이 페닐 또는 나프틸이며, 알킬기가 C1-5인 아릴알킬기를 들 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 블록 공중합체 중의 양이온성 고분자쇄 블록이 측쇄에 구비하는 소수성기로서는 직쇄 또는 분기쇄의 C4- 20알킬기, 직쇄 또는 분기쇄의 C4- 20알케닐기 또는 벤질기가 바람직하고, 직쇄 또는 분기쇄의 C12- 20알킬기, 직쇄 또는 분기쇄의 C12- 20알케닐기 또는 벤질기가 바람직하고, 직쇄 또는 분기쇄의 C12- 20알킬기, 직쇄 또는 분기쇄의 C12- 20알케닐기 또는 벤질기가 보다 바람직하다. 또한, 상술한 알케닐기 및 알키닐기에는 복수의 불포화 결합이 포함되어 있어도 좋다.
또한, 본원명세서에 있어서, 「Cx -y」는 탄소수 x~y개를 의미한다.
핵산 내포 고분자 미셀 복합체에 있어서는 이것을 구성하는 블록 공중합체끼리가 가교되어 있는 것이 고분자 미셀 복합체의 안정성의 점으로부터 바람직하다. 예를 들면, 양이온성 고분자쇄 블록의 측쇄 또는 그 말단(비전하성 친수성 고분자쇄 블록과 직접 또는 간접적으로 공유 결합시키는 말단과는 반대측의 말단)에 티올기(-SH기)나 가교제와의 결합 부위를 가짐으로써 얻어진 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 보다 안정화할 수 있다. 양이온성 고분자쇄 블록 중의 티올기끼리를 디술피드 결합(SS 결합)시킴으로써 가교할 수도 있다.
가교제와의 결합 부위로서는 아미노기(-NH2기), 티올기, 수산기, 카르복실기 등을 들 수 있다. 이들 결합 부위로 할 수 있는 가교제로서는 분자 내에 복수개의 알데히드기를 갖는 글루타르알데히드, 숙신알데히드, 파라포름알데히드, 프탈릭디카르복시알데히드(프탈알데히드) 등; 분자 내에 말레이미드기와 활성 에스테르기를 갖는 N-[α-말레이미드아세톡시]숙신이미드에스테르, N-[β-말레이미드프로필옥시]숙신이미드에스테르, N-[ε-말레이미드카프로일옥시]숙신이미드에스테르, N-[γ-말레이미드부티릴옥시]숙신이미드에스테르, 숙신이미딜-4-[N-말레이미드메틸]시클로헥산-1-카르복시-[6-아미드카프로에이트], m-말레이미드벤조일-N-히드록시숙신이미드에스테르, 숙신이미딜-4-[N-말레이미드메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트, 숙신이미딜-4-[p-말레이미드페닐]부티레이트, 숙신이미딜-6-[(β-말레이미드프로피온아미드)헥사노에이트] 등; 분자 내에 활성 에스테르와 니트로페닐아미드기를 갖는 N-5-아지드-2-니트로벤조일옥시숙신이미드, N-숙신이미딜-6-[4'-아지드-2'-니트로페닐아미노]헥사노에이트 등; 분자 내에 페닐아지드기와 페닐글리옥살기를 갖는 p-아지드페닐글리옥살 등; 분자 내에 복수개의 말레이미드기를 갖는 1,4-비스-말레이미드부탄, 비스-말레이미드에탄, 비스-말레이미드헥산, 1,4-비스-말레이미딜-2,3-디하이드로부탄, 1,8-비스-말레이미드트리에틸렌글리콜, 1,11-비스-말레이미드테트라에틸렌글리콜, 비스[2-(숙신이미딜옥시카르보닐옥시)에틸]술폰, 트리스-[2-말레이미드에틸]아민 등; 분자 내에 복수개의 술포 활성 에스테르기를 갖는 비스[술포숙신이미딜]수베레이트, 비스[2-(술포숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸]술폰, 디술포숙신이미딜타트레이트, 에틸렌글리콜비스[술포숙신이미딜숙시네이트], 트리스-술포숙신이미딜아미노트리아세테이트 등; 분자 내에 복수개의 알릴할라이드기를 갖는 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 등; 분자 내에 복수개의 이미드에스테르기를 갖는 디메틸아디프이미데이트, 디메틸피멜이미데이트, 디메틸수베르이미데이트 등; 분자 내에 복수개의 피리딜디티오기를 갖는 1,4-디-[3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드]부탄 등; 분자 내에 복수개의 활성 에스테르기를 갖는 디숙신이미딜글루탈레이트, 디숙신이미딜수베레이트, 디숙신이미딜타트레이트, 에틸렌글리콜비스[숙신이미딜숙시네이트] 등; 분자 내에 복수개의 비닐술폰산기를 갖는 1,6-헥산-비스-비닐술폰 등; 분자 내에 피리딜디티오기와 활성 에스테르기를 갖는 숙신이미딜-6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미드]헥사노에이트, 4-숙신이미딜옥시카르보닐-메틸-α-[2-피리딜디티오]톨루엔, N-숙신이미딜-3-[2-피리딜디티오]프로피오네이트 등; 분자 내에 히드록시페닐아미드기와 활성 에스테르기를 갖는 N-히드록시숙신이미딜-4-아지드살리실산 등; 분자 내에 말레이미드기와 이소시아네이트기를 갖는 N-[p-말레이미드페닐]이소시아네이트 등; 분자 내에 말레이미드기와 술포 활성 에스테르기를 갖는 N-[ε-말레이미드카프로일옥시]술포숙신이미드에스테르, N-[γ-말레이미드부틸옥시]술포숙신이미드에스테르, N-히드록시술포숙신이미딜-4-아지드벤조에이트, N-[κ-말레이미드운데카노일옥시]술포숙신이미드에스테르, m-말레이미드벤조일-N-히드록시술포숙신이미드에스테르, 술포숙신이미딜-4-[N-말레이미드메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트, 술포숙신이미딜-4-[p-말레이미드페닐]부티레이트 등; 분자 내에 피리딜디티오기와 술포 활성 에스테르기를 갖는 술포숙신이미딜-6-[3'-(2-피리딜디티오)프로피온아미드]헥사노에이트, 술포숙신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미드]헥사노에이트 등; 분자 내에 히드록시페닐아미드기와 술포 활성 에스테르기를 갖는 술포숙신이미딜[4-아지드살리실아미드]헥사노에이트 등; 분자 내에 니트로페닐아지드기와 술포 활성 에스테르기를 갖는 술포숙신이미딜-6-[4'-아지드-2'-니트로페닐아민]헥사노에이트 등; 분자 내에 비닐술폰기와 활성 에스테르기를 갖는 N-숙신이미딜-[4-비닐술포닐]벤조에이트 등을 사용할 수 있고, 글루타르알데히드를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
<블록 공중합체>
본 발명에 있어서 사용되는 블록 공중합체는 상기 비전하성 친수성 고분자쇄 블록의 말단과 상기 양이온성 고분자쇄 블록의 말단이 직접 또는 간접적(즉, 적당한 링커를 통해)으로 공유 결합된 것이다.
본 발명에 있어서 사용되는 블록 공중합체로서는 상기 비전하성 친수성 고분자쇄 블록이 폴리에틸렌글리콜 유래이며, 상기 양이온성 고분자쇄 블록이 폴리아미노산 또는 그 유도체 유래인 것이 바람직하고, 상기 비전하성 친수성 고분자쇄 블록이 폴리에틸렌글리콜 유래이며, 상기 양이온성 고분자쇄 블록이 폴리리신, 폴리오르니틴, 폴리아르기닌, 폴리호모아르기닌, 폴리히스티딘, 폴리아스파르트산 및 폴리글루탐산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리아미노산 유래(폴리아미노산 유도체 유래를 포함한다)인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용되는 블록 공중합체로서는 구체적으로는 하기 일반식(I) 또는 일반식(Ⅱ)으로 나타내어지는 것을 예시할 수 있다. 또한, 하기 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ)에 있어서의 각 반복 단위는 기재의 편의상 특정한 순서로 나타내고 있지만, 각 반복 단위는 랜덤한 순서로 존재할 수 있다.
Figure pct00001
[일반식(I) 및 일반식(Ⅱ) 중 R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 미치환 또는 치환된 직쇄 또는 분기의 C1- 12알킬기를 나타내고, L1 및 L2는 연결기를 나타내고, R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고, R3은 수소 원자, 보호기, 티올기, 소수성기 또는 중합성기를 나타내고, R4는 수산기, 옥시벤질기, -NH-(CH2)a-X기(여기에서 a는 1~5의 정수이며, X는 각각 독립적으로 1급, 2급, 3급 아민 또는 4급 암모늄염 중의 1종류 또는 2종류 이상을 포함하는 아민 화합물 잔기이거나 또는 아민이 아닌 화합물 잔기이다), 티올기, 소수성기 또는 개시제 잔기를 나타내고, R5a, R5b, R5c 및 R5d는 각각 독립적으로 수산기, 옥시벤질기 또는 NH-(CH2)a-X기를 나타내고, R5a와 R5b의 총수 및 R5c와 R5d의 총수 중 -NH-(CH2)a-X기(여기에서 X는 (NH(CH2)2)e-NH2이며, e는 1~5의 정수이다)가 적어도 2개 이상 존재하고, R6a 및 R6b는 각각 독립적으로 수소 원자, 보호기(여기에서 보호기는 통상 아미노기의 보호기로서 사용되고 있는 Z기, Boc기, 아세틸기 또는 트리플루오로아세틸기이다) 또는 L3-SH(L3은 C1- 20알킬렌기, C1- 6알킬-페닐기, C1- 6알킬-페닐렌-C1- 6알킬기, 페닐렌기 및 카르보닐-C1- 20알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 연결기이다)이며, m은 5~20,000의 정수이며, n은 2~5,000의 정수이며, y는 0~5,000의 정수이며, z는 1~5,000의 정수이며, y+z는 n보다 크지 않은 것으로 하고, 또한 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ)에 있어서의 각 반복 단위는 기재의 편의상 특정한 순서로 나타내고 있지만, 각 반복 단위는 랜덤한 순서로 존재할 수 있다]
여기에서 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ)의 구조식 중 반복 단위 수(중합도)가 「m」인 블록이 PEG 블록(비전하성 친수성 고분자쇄 블록)이며, 반복 단위 수가 「n-y-z」인 부분과 「y」인 부분과 「z」인 부분을 합한 블록이 양이온성 고분자쇄 블록이다.
상기 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ) 중 R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 미치환 또는 치환된 직쇄 또는 분기의 C1- 12알킬기를 나타낸다. 직쇄 또는 분기의 C1- 12알킬기로서는, 예를 들면 메틸기, 에틸기, n-프로필기, iso-프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기, n-헥실기, 데실기, 운데실기 등을 들 수 있다. 또한, 치환되었을 경우의 치환기로서는 아세탈화 포르밀기, 시아노기, 포르밀기, 카르복실기, 아미노기, C1- 6알콕시카르보닐기, C2- 7아실아미드기, 동일 또는 다른 트리-C1- 6알킬실록시기, 실록시기 또는 실릴아미노기를 들 수 있다. 여기에서 아세탈화란 포르밀의 카르보닐과, 예를 들면 탄소수 1~6개의 알칸올의 2분자 또는 탄소 원자수 2~6개의 분기되어 있어도 좋은 알킬렌디올의 반응에 의한 아세탈부의 형성을 의미하고, 상기 카르보닐기의 보호 방법이기도 하다. 예를 들면, 치환기가 아세탈화 포르밀기일 때에는 산성의 온화한 조건 하에서 가수 분해되어서 다른 치환기인 포르밀기(-CHO: 또는 알데히드기)로 전화될 수 있다.
또한, 필요에 따라 R1a 및 R1b로서 아미노기 등의 반응성이 높은 치환기를 갖는 것을 사용했을 경우에는 상기 치환을 통해 또는 필요에 따라서 활성 에스테르기, 말레이미드기를 더 갖는 결합기를 도입한 후에 표적 지향성 분자를 결합시켜도 좋다. 표적 지향성 분자로서는, 예를 들면 상술한 것을 들 수 있다.
상기 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ) 중 L1 및 L2는 연결기를 나타낸다. 구체적으로는 L1은 -(CH2)b-NH-(여기에서 b는 0~5의 정수이다)인 것이 바람직하고, L2는 -(CH2)c-CO-(여기에서 c는 1~5의 정수이다)인 것이 바람직하다. 또한, b가 0인 경우 「-(CH2)b-」는 단결합을 나타낸다.
상기 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ) 중 R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타낸다. R2a 및 R2b 모두가 메틸렌기인 경우에는 폴리(아스파르트산 유도체)에 상당하고, 에틸렌기인 경우에는 폴리(글루탐산 유도체)에 상당하고, 또한 R2c 및 R2d 모두가 메틸렌기인 경우에는 폴리(아스파르트산 유도체)에 상당하고, 에틸렌기인 경우에는 폴리(글루탐산 유도체)에 상당한다. 이들 일반식 중 R2a 및 R2b(R2b 및 R2a)가 메틸렌기 및 에틸렌기의 양자를 나타내는 경우 및 R2c 및 R2d(R2d 및 R2c)가 메틸렌기 및 에틸렌기의 양자를 나타내는 경우, 아스파르트산 유도체 및 글루탐산 유도체의 반복 단위는 각각 블록을 형성해서 존재하거나 또는 랜덤하게 존재할 수 있다.
상기 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ) 중 R3은 수소 원자, 보호기, 티올기, 소수성기 또는 중합성기를 나타낸다. 구체적으로는 R3은 아세틸기, 아크릴로일기, 메타크릴로일기, 티올기 또는 소수성기인 것이 바람직하다. 소수성기는 구체적으로는 연결기 B1[B1은 단결합, -COO-, -CO-, -CO-(CH2)h-CO-(단, h는 1~5의 정수이다) 또는 하기 식(Ⅲ)]을 통해 결합하는 상술한 스테롤 유도체의 잔기 또는 C4- 24히드로카빌기이다. R3에 있어서의 소수성기로서는 연결기 B1을 통해 결합하는 스테롤 유도체의 잔기가 바람직하고, 콜레스테롤, 콜레스탄올 또는 디히드록시콜레스테롤의 3위치 히드록시기의 수소 원자가 제거된 기가 연결기 B1을 통해 결합하는 기가 보다 바람직하고, 콜레스테롤 3위치 히드록시기의 수소 원자가 제거된 기가 연결기 B1을 통해 결합하는 기가 더 바람직하다.
Figure pct00002
상기 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ) 중 R4는 수산기, 옥시벤질기, -NH-(CH2)a-X기, 티올기, 소수성기 또는 개시제 잔기를 나타낸다. 여기에서 a는 1~5의 정수이며, X는 1급, 2급, 3급 아민 또는 4급 암모늄염 중의 1종류 또는 2종류 이상을 포함하는 아민 화합물 잔기 또는 아민이 아닌 화합물 잔기인 것이 바람직하다. 또는 경우에 따라 R4가 -NH-R9(여기에서 R9는 미치환 또는 치환된 직쇄 또는 분기의 C1- 20알킬기를 나타낸다)인 것이 바람직하다. 소수성기는 구체적으로는 상술한 스테롤 유도체의 잔기 또는 C4- 24히드로카빌기이다. R4에 있어서의 소수성기로서는 스테롤 유도체의 잔기가 바람직하고, 콜레스테롤, 콜레스탄올, 디히드록시콜레스테롤의 3위치 히드록시기의 수소 원자가 제거된 기가 보다 바람직하고, 콜레스테롤 3위치 히드록시기의 수소 원자가 제거된 기가 더 바람직하다.
상기 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ) 중 R5a, R5b, R5c 및 R5d는 각각 독립적으로 수산기, 옥시벤질기, -NH-(CH2)a-X기를 나타낸다. 여기에서 a는 1~5의 정수이며, X는 1급, 2급, 3급 아민 또는 4급 암모늄염 중의 1종류 또는 2종류 이상을 포함하는 아민 화합물 잔기 또는 아민이 아닌 화합물 잔기인 것이 바람직하다.
R5a와 R5b의 총수 및 R5c와 R5d의 총수 중 -NH-(CH2)a-X기[여기에서 X는 NH-(CH2)e-NH2(단, e는 1~5의 정수)이다]인 것이 적어도 2개 이상 존재하는 것이 바람직하고, 상기 총수의 50% 이상 존재하는 것이 보다 바람직하고, 상기 총수의 85%이상 존재하는 것이 더 바람직하다. 또한, R5a, R5b, R5c 및 R5d의 전부 또는 일부가 -NH-(CH2)a-NH-(CH2)e-NH2인 것이 바람직하다.
또한, R4 및 R5a, R5b, R5c 및 R5d의 예시로서 상기한 -NH-(CH2)a-X기에 있어서 X가 하기 15의 각 식으로 나타내어지는 기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 경우가 특히 바람직하다.
Figure pct00003
여기에서 상기 각 식 중 X2는 수소 원자 또는 C1- 6알킬기 또는 아미노C1 - 6알킬기를 나타내고, R7a, R7b 및 R7c는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, d1, d2 및 d3은 각각 독립적으로 1~5의 정수를 나타내고, e1, e2 및 e3은 각각 독립적으로 1~5의 정수를 나타내고, f는 0~15의 정수를 나타내고, g는 0~15의 정수를 나타내고, R8a 및 R8b는 각각 독립적으로 수소 원자, 보호기 또는 L3-SH(L3은 C1- 20알킬렌기, C1- 6알킬-페닐기, C1- 6알킬-페닐렌-C1- 6알킬기, 페닐렌기 및 카르보닐-C1- 20알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 연결기이다)를 나타낸다. 여기에서 상기 보호기는 통상 아미노기의 보호기로서 사용되고 있는 Z기, Boc기, 아세틸기 및 트리플루오로아세틸기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기인 것이 바람직하다. 또한, f 및 g가 0인 경우 각각 단결합을 의미한다.
상기 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ) 중 R6a 및 R6b는 각각 독립적으로 수소 원자, 보호기 또는 L3-SH(L3은 C1- 20알킬렌기, C1- 6알킬-페닐기, C1- 6알킬-페닐렌-C1- 6알킬기, 페닐렌기 및 카르보닐-C1- 20알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 연결기이다)이다. 여기에서, 보호기는 통상 아미노기의 보호기로서 사용되고 있는 Z기, Boc기, 아세틸기 및 트리플루오로아세틸기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기인 것이 바람직하다.
상기 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ) 중 m은 5~20,000의 정수이다. 또한, n은 2~5,000의 정수이며, y는 0~5,000의 정수이며, z는 1~5,000의 정수이다. 단, y와 z의 합계(y+z)는 n보다 크지 않은 것으로 한다.
상기 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ)으로 나타내어지는 블록 공중합체의 제조 방법은 한정되지 않지만, 예를 들면 R1aO- 또는 R1bO-와 PEG쇄를 포함하는 PEG 블록을 미리 합성해두고, 이 PEG 블록의 편말단(R1aO- 또는 R1bO-와 반대의 말단)에 소정의 모노머를 순차적으로 중합하고, 그 후 필요에 따라서 측쇄를 양이온성기를 포함하도록 치환 또는 변환하는 방법 또는 상기 PEG 블록과, 양이온성 고분자쇄 블록(반복 단위 수가 「n-y-z」인 부분과 「y」인 부분과 「z」인 부분을 합한 블록)을 미리 각각 합성해두고, 이들을 서로 연결하는 방법 등을 들 수 있다. 상기 제법에 있어서의 각종 반응의 방법 및 조건은 상법을 고려하여 적당하게 선택 또는 설정할 수 있다. 상기 PEG 블록은, 예를 들면 국제공개 제96/32434호 공보, 국제공개 제96/33233호 공보 및 국제공개 제97/06202호 공보 등에 기재된 블록 공중합체의 PEG 블록 부분의 제법을 사용해서 조제할 수 있다.
일반식(I) 및 (Ⅱ)에서 나타내어지는 블록 공중합체의 보다 구체적인 제조 방법으로서는, 예를 들면 말단에 아미노기를 갖는 PEG 블록 유도체를 사용해서 그 아미노 말단에 β-벤질-L-아스파르테이트(BLA) 및 Nε-Z-L-리신 등의 보호 아미노산의 N-카르복실산 무수물(NCA)을 중합시켜서 블록 공중합체를 합성하고, 그 후 각 블록의 측쇄가 상술한 양이온성기를 갖는 측쇄가 되도록 디에틸렌트리아민(DET) 등으로 치환 또는 변환하는 방법을 바람직하게 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 일반식(I) 및 일반식(Ⅱ)으로 나타내어지는 블록 공중합체의 구체예로서는, 예를 들면 후술하는 실시예에 기재된 PEG-poly[N-[N'-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl)]aspartamide](PEG-PAsp(DET))나, PEG-폴리리신(PEG-PLys) 및 이들 양이온성 블록의 주쇄 말단에 직접 또는 필요에 따라서 연결기를 통해 스테롤 유도체의 잔기를 부가한 것이나, 이들 양이온성 블록의 측쇄에 티올기를 부가한 것 등을 바람직하게 들 수 있다.
<블록 공중합체의 수식>
고분자 미셀 복합체를 유전자 캐리어로서 사용하는 데에는 유전자(DNA)를 표적 조직이나 표적 세포에 효율 좋게 운반하기 위해서 특정 세포나 조직과의 친화성이 높은 분자(표적 지향성 분자)를 표면에 구비하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 비전하성 친수성 고분자쇄 블록의 2개의 말단 중 양이온성 고분자쇄 블록과 직접 또는 간접적으로 공유 결합시키는 말단과는 반대측의 말단에 직접 또는 적당한 링커를 통해 표적 지향성 분자를 부가함으로써 표적 지향성 분자가 표면에 노출된 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 형성시킬 수 있다. 표적 지향성 분자로서는, 예를 들면 특정 수용체 단백질 등에 대한 리간드 또는 항체(그 단편: F(ab')2, F(ab) 등), 당, 핵 이행 시그널 분자 등을 들 수 있다. 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 2000염기쌍 길이 이상이라는 길이의 DNA를 내부에 수용하는 데에도 불구하고, 종래에 없는 작은 입자이다. 이 때문에 그 표층에 핵 이행 시그널 분자를 구비함으로써 비분열 세포에 대해서도 핵막공 통과에 의한 유전자 도입을 성공시킬 수 있다.
<핵산 내포 고분자 미셀 복합체>
본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체가 내포하는 핵산은 2000염기 길이 이상의 서로 상보적인 염기 서열로 이루어지는 2개의 1개쇄 DNA 또는 2000염기 길이 이상의 1개의 1개쇄 DNA이다. 서로 상보적인 염기 서열로 이루어지는 2개의 1개쇄 DNA는 통상 서로 회합해서 이루어지는 2개쇄 DNA가 2중 나선 구조를 취하고 있다. 2중 나선 구조는 매우 강성이 강하기 때문에 2개쇄 DNA와 블록 공중합체를 단순히 혼합해서 자기 조직화에 의해 DNA를 내포하는 고분자 미셀 복합체를 형성시키는 종래법에 의해 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 형성시켰을 경우에는 쉘 부분의 비전하성 친수성 고분자쇄 블록의 밀도를 충분히 저하시키지 않는 한 구체 형상에 가까운 작은 입자로 할 수는 없었다.
이것에 대해서 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 1000염기 길이 이상(바람직하게는 1500염기 길이 이상, 보다 바람직하게는 2000염기 길이 이상)의 서로 상보적인 염기 서열로 이루어지는 2개의 1개쇄 DNA, 적어도 2중 나선 구조의 일부가 해리되어서 1개쇄 구조로 되어 있는 1000염기쌍 길이 이상(바람직하게는 1500염기쌍 길이 이상, 보다 바람직하게는 2000염기쌍 길이 이상)의 2개쇄 DNA 또는 1000염기 길이 이상(바람직하게는 1500염기 길이 이상, 보다 바람직하게는 2000염기 길이 이상)의 1개의 1개쇄 DNA를 코어 부분으로서 내포하고 있다. 즉, 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체가 pDNA 등의 2개쇄 DNA를 내포하는 경우에는 1000염기쌍 길이 이상(바람직하게는 1500염기쌍 길이 이상, 보다 바람직하게는 2000염기쌍 길이 이상)의 2개쇄 DNA가 2중 나선 구조를 적어도 일부, 바람직하게는 전부 해리시킨 상태로 상기 블록 공중합체 중의 양이온성 고분자쇄 블록과 정전적으로 결합해서 수용되어 있다. 1개쇄 DNA는 유연쇄로서 행동하기 때문에 상기 블록 공중합체와 정전적으로 결합시킬 때에 구체형상으로의 응축 전이가 가능해진다. 즉, 코어 부분(DNA)의 표면적을 매우 작게 할 수 있고, 이것에 의해 쉘 부분의 비전하성 친수성 고분자쇄 블록의 밀도도 비약적으로 증대시킬 수 있다.
본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 2개쇄 DNA의 2중 나선 구조의 전부 또는 적어도 일부를 해리시킨 상태로 블록 공중합체와 혼합하고, 자기 조직화시킴으로써 DNA를 코어로 한 고분자 미셀 복합체를 형성시킴으로써 얻어진다. DNA를 가장 작게 응축시키고, 구체형상의 코어가 얻어지기 때문에 내포시키는 2개쇄 DNA는 완전히 해리시킨 2개의 1개쇄 DNA로 한 상태에서 블록 공중합체와 혼합하여 자기 조직화시키는 것이 바람직하다. 이것에 의해 2개의 1개쇄 DNA를 코어에 포함하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체 또는 1개의 1개쇄 DNA를 코어에 포함하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체가 형성된다. 또한, 2개쇄 DNA의 2중 나선 구조의 1개쇄 구조로의 해리는 가열 처리에 의한 변성(열변성)에 의한 변성 등의 종래 공지의 변성 방법에 의해 적당히 행할 수 있다. 가열 처리의 온도는 실온 이상이면 좋지만, 60℃ 이상이 바람직하고, 70℃ 이상이 보다 바람직하고, 80℃ 이상이 더 바람직하고, 95℃ 이상이 특히 바람직하다. 상기 온도 이상에서 가열 처리를 행함으로써 1000염기쌍 길이 이상의 2개쇄 DNA의 2중 나선 구조를 적합하게 해리시킬 수 있다. 2개쇄 DNA의 2중 나선 구조의 해리의 정도는 융해 곡선을 조사함으로써 판별할 수 있다.
본 발명에 있어서 블록 공중합체에 내포시키는 DNA는 블록 공중합체와의 혼합시에 2중 나선 구조를 적어도 일부, 바람직하게는 전부 해리시킨 상태이면 좋고, 환상 DNA이어도 좋다. 본 발명에 있어서는 2중 나선 구조를 보다 해리시키기 쉽기 때문에 선상 DNA인 편이 바람직하다. 환상 DNA는 미리 제한 효소 처리 등에 의해 선상화해둠으로써 보다 용이하게 2중 나선 구조를 해리시킬 수 있다.
본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 내포시키는 2개쇄 DNA를 변성(1개쇄화)시킨 상태로 블록 공중합체와 혼합하는 이외에는 특허문헌 1~3 등에 개시되어 있는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 형성하는 방법 등과 마찬가지로 형성할 수 있다. 예를 들면, 변성시킨 DNA와 블록 공중합체를 혼합시키는 반응 용매가 되는 수성 매체로서는 물(특히, 탈이온수) 또는 물에 각종 무기 또는 유기 완충제를 포함하는 것이며, 본 발명에 의한 복합체의 형성 반응에 악영향을 미치지 않는 범위에서 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 에탄올 등의 물 혼화 유기 용매를 포함하고 있어도 좋다. 조제한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 단리 및 정제는 상법에 의해 수성 매체 중으로부터 회수할 수 있다. 전형적인 방법으로서는 한외 여과법, 디아필트레이션, 투석 방법을 들 수 있다.
또한, 양이온성 고분자쇄 블록에 티올기를 갖는 블록 공중합체를 사용했을 경우에는 DNA를 내포한 고분자 미셀 복합체를 형성시킨 후 상기 고분자 미셀 복합체를 함유하는 수성 매체를 산화 조건 하에 둠으로써 양이온성 고분자쇄 블록끼리를 티올기를 통한 SS 결합에 의해 가교할 수 있다. 통상, 산화 조건은 주위 환경 하로의 방치 또는 공기 산화되는 조건 하에 두는 것이 좋다. 가교의 정도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 고분자 미셀 복합체를 형성하는 양이온성 고분자쇄 블록에 SH기를 5~20%, 바람직하게는 8~15% 도입하고, 모든 티올기를 산화시킨 정도가 바람직하다.
본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 동적 광산란법에 의해 측정한 수성 매체 중에 있어서의 평균 입자 지름이 100㎚ 이하인 것이 바람직하고, 80㎚ 이하인 것이 보다 바람직하고, 70㎚ 이하인 것이 더 바람직하다. 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 이와 같이 매우 작기 때문에 표적의 세포나 조직에 효율 좋게 도입될 수 있다. 또한, 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 수성 매체 중에 있어서의 입자 지름은, 예를 들면 비접촉 후방 산란 광학계(NIBS)를 사용한 동적 광산란식 입자 지름·입도 분포 측정 장치를 사용해서 측정할 수 있다. 상기 장치로서는, 예를 들면 Zetasizer Nano ZS(제품명)(Malvern Instruments Ltd.제)를 들 수 있다. 또한, 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 수성 매체 중에 있어서의 평균 입자 지름이란 동적 광산란법에 의해 측정한 수성 매체 중에 있어서의 ZETA 평균 유체 역학 입자 지름을 의미한다.
본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 투과형 전자 현미경(TEM)에 의해 코어 부분(DNA)을 관찰할 수 있다. 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 코어 부분은 로드형상이 아니라 구체형상이다. 실제로 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 TEM으로 관찰하면 로드형상이 아니라 원형상의 코어 부분이 관찰된다. 본 발명 및 본원명세서에 있어서 「구체형상」이란 진정의 구(球)뿐만 아니라 구에 가까운 타원체형상(예를 들면, 3지름 중 최장 지름과 나머지 한쪽의 지름의 비가 2:1~1:1인 타원체형상)도 포함한다. 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 코어 부분이 구체형상임으로써 코어 부분이 로드형상인 핵산 내포 고분자 미셀 복합체에 비해서 코어 부분의 표면적당 블록 공중합체의 평균 밀도를 높게 할 수 있다. 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체에 있어서는 코어 부분의 표면적당 블록 공중합체의 평균 밀도를 높게 할수록 생체 내의 세포 내외에 많이 존재하는 폴리 음이온에 의한 영향을 받기 어려워 생체 내 안정성을 높일 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 크기로서는 코어 부분의 평균 입자 지름이 50㎚ 이하인 것이 바람직하고, 40㎚ 이하인 것이 보다 바람직하고, 30㎚ 이하인 것이 더 바람직하고, 25㎚ 이하인 것이 보다 더 바람직하다. 또한, 본 발명 및 본원명세서에 있어서, 「핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 코어 부분」이란 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 TEM으로 촬상했을 경우에 촬상되는 부분을 의미하고, 「코어 부분의 입자 지름」은 구체형상의 반경(즉, TEM 화상에 촬상된 코어 부분의 원형상의 반경)을 의미한다. 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 입자 지름은 후기 참고예(6)에 나타내는 바와 같이 TEM 화상으로부터 구할 수 있다.
본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 코어 부분의 표면적당 블록 공중합체의 평균 밀도가 0.01쇄/㎚2 이상인 것이 바람직하고, 0.03쇄/㎚2 이상인 것이 보다 바람직하고, 0.05쇄/㎚2 이상인 것이 더 바람직하다. 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 충분히 블록 공중합체 밀도를 크게 할 수 있기 때문에 전신에 투여했을 경우에 혈중 체류성이 양호한 것이 얻어진다.
또한, 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 표면적당 블록 공중합체의 평균 밀도는 이하의 방법에 의해 산출할 수 있다. 우선, 형광 표지된 블록 공중합체를 사용해서 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 얻는다. 이어서, 반응 용매로부터 복합체를 원심 제거하고, 상청에 포함되어 있는 복합체 형성에 관여하지 않은 블록 공중합체를 형광 강도를 지표로서 정량한다. 복합체 조제시에 사용한 블록 공중합체 총량과의 차분으로부터 복합체에 결합하고 있는 블록 공중합체의 분자수를 산출하고, 또한 이 분자수를 반응에 사용한 2개쇄 DNA의 분자수로 나눔으로써 핵산 내포 고분자 미셀 복합체 1분자를 형성하고 있는 블록 공중합체의 평균 분자수(단위: 쇄)를 산출한다. 또한, 얻어진 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 TEM 화상을 촬상하고, 얻어진 TEM 화상 중의 복수의 핵산 내포 고분자 미셀 복합체에 대해서 각각 코어 부분의 원형의 반경의 크기를 구하고, 각 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 표면적을 TEM 화상 상의 반경을 회전축으로 한 회전 구로서 산출하고, 핵산 내포 고분자 미셀 복합체 1분자당 코어 부분의 평균 표면적(㎚2)을 산출한다. 최후에 핵산 내포 고분자 미셀 복합체 1분자를 형성하고 있는 블록 공중합체의 평균 분자수를 핵산 내포 고분자 미셀 복합체 1분자당 코어 부분의 평균 표면적으로 나눔으로써 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 표면적당 블록 공중합체의 평균 밀도(쇄/㎚2)가 구해진다.
(실시예)
이어서, 실시예 등에 의해 본 발명을 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 예에 의해 한정되는 것은 아니다. 또한, 이하의 모든 동물 실험은 국립 대학 법인 동경 대학에 있어서의 실험 동물의 관리와 사용에 관한 가이드라인에 따라 이루어졌다.
[참고예 1]
PEG 블록과 PLys 블록으로 이루어지는 블록 공중합체에 의해 2중 나선 구조의 2개쇄 DNA(pDNA)를 내포시킨 고분자 미셀 복합체에 있어서의 PLys 블록의 중합도와, 고분자 미셀 복합체의 형상의 관계를 조사했다.
(1) PEG-PLys
본 발명자 중 한 사람에 의해 이미 개시된 방법(Kataoka et al., Macromolecules, 1996, vol.29, p.8556-8557)에 준해서 얻어진 α-메톡시-ω-아미노 PEG(PEG, Mw=12kDa, Mw/Mn=1.05)를 개시제로서 사용하고, Nε-트리플루오로아세틸-L-리신의 N-카르복실산 무수물(NCA)을 개환 중합함으로써 PEG 블록-폴리(ε-트리플루오로아세틸-L-리신)블록(PEG-PLys(TFA))을 제조했다. 이때, 개시제와 모노머인 NCA의 비를 조절함으로써 중합도가 다른 3종의 PEG-PLys(TFA)를 제조했다. 이렇게 해서 얻어진 3종의 PEG-PLys(TFA)의 트리플루오로아세틸기(TFA기)를 수산화나트륨으로 탈보호해서 중합도(하기 화학식 중의 「n1」)가 다른 3종의 PEG-PLys를 얻었다.
Figure pct00004
각 PEG-PLys의 PLys 블록의 중합도는 1H-NMR 측정으로부터 얻어진 PEG쇄(-CH2CH2O-)의 메틸렌의 프로톤의 총량과 리신 반복 단위[-(CH2)3CH2NH3)의 메틸렌의 프로톤의 총량의 비로부터 각각 19, 39 및 70으로 구해졌다. 또한, 겔 침투 크로마토그래피(GPC)(TOSOH CORPORATION제의 고속 GPC 장치 HLC-8220GPC를 사용)의 결과 3종의 PEG-PLys의 전부가 분산도(Mw/Mn)는 1.1 미만이었다.
(2) 형광 표지 PEG-PLys
PEG-PLys가 DNA와 결합한 것을 확인하기 위해서 PEG-PLys를 미리 형광 표지했다. 구체적으로는 상기 (1)에서 얻은 PEG-PLys에 대해서 Alexa Fluor(등록상표)680 carboxylic acid succinimidyl ester(Molecular Probes, Inc.제)를 제조자에 의한 사용 설명서에 따라서 반응시켜서 결합시켰다. 미반응의 형광 물질을 PD-10탈염 컬럼(GE Healthcare Life Sciences제)을 사용해서 제거했다. PEG-PLys가 실제로 형광 표지된 것은 UV 검출기, IR 검출기 및 형광 검출기를 구비하는 GPC에 의해 확인했다. 형광 표지 효율을 산출한 결과, 대략 모든 PEG-PLys에 있어서 40리신 반복 단위당 1분자의 형광 물질이 결합되어 있었다.
(3) 사용한 핵산
코어 부분의 표면적당 PEG의 평균 밀도(σ)를 측정하기 위한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 형성하기 위해서는 시판된 플라스미드 pBR322(4361bp, TAKARA BIO INC.제)를 사용했다.
혈중 체류성을 조사하기 위한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 형성하기 위해서는 형광 물질 Cy(등록상표) 5로 표지된 플라스미드 pCAG-Luc2(6.4kbp)를 사용했다. pCAG-Luc2의 형광 표지은 Label IT(등록상표) Tracker Nucleic Acid Localization Kit(Mirus Bio LLC.제)를 사용해서 행했다. 또한, pCAG-Luc2는 플라스미드 pCAGGS(riken gene bank로부터 공급)에 플라스미드 pGL4(Promega Corporation제)로부터 Luc2를 코딩하는 유전자를 잘라내서 장착한 것이다.
(4) 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형성
PEG-PLys 용액에 DNA 용액을 N/P비가 2가 되도록 빠르게 혼합함으로써 pDNA를 내포한 PEG-PLys의 고분자 미셀 복합체를 형성했다. 또한, N/P비란 [PLys 블록 중의 아민기의 몰 농도]/[pDNA 중의 인산기의 몰 농도]이다. 반응 용매는 10mM HEPES 버퍼(pH7.3)로 하고, 반응 용액 중의 pDNA 농도는 PEG의 평균 밀도(σ) 측정을 위한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체 형성의 경우에는 33.3ng/㎕, 혈중 체류성 측정을 위한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체 형성의 경우에는 100ng/㎕로 했다.
(5) 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 형성하고 있는 PEG-PLys의 결정
형광 표지 PEG-PLys를 사용해서 형성된 고분자 미셀 복합체에 대해서는 pDNA와 결합한 형광 표지 PEG-PLys를 pDNA와 결합하고 있지 않은 유리의 형광 표지 PEG-PLys로부터 분리하기 위해서 고분자 미셀 복합체 형성 후의 반응 용액을 벽이 두꺼운 폴리카보네이트제 튜브(제품 번호: 343776, Beckman Coulter, Inc.제)에 넣어서 초원심 분리 처리를 행했다. 초원심 분리 처리는 TLA-120. 1로터(Beckman Coulter, Inc.제)를 구비한 초원심 분리기 Optima TLX(Beckman Coulter, Inc.제)를 사용하여 50,000×g으로 3시간 초원심 분리 처리를 행했다. 상기 조건에서는 유리된 PEG-PLys는 상청에 남는 한편, 고분자 미셀 복합체는 완전히 침전되는 것이 베크먼 분석용 초원심 분리기 XL-I(Beckman Coulter, Inc.제)에 의해 확인되어 있다. 상청의 702㎚에 있어서의 형광 강도를 측정하고, 유리된 형광 표지 PEG-PLys의 표준품의 결과에 의거하여 작성된 검량선을 사용해서 상기 상청의 형광 표지 PEG-PLys의 농도를 산출했다. 또한, 702㎚는 형광 물질 Alexa Fluor(등록상표)680의 극대 형광 파장이다.
고분자 미셀 복합체 형성을 위한 반응 용액에 원래 첨가한 형광 표지 PEG-PLys의 양으로부터 상기 상청 중의 형광 표지 PEG-PLys의 양을 뺀 양을 형성된 전체 고분자 미셀 복합체에 포함되어 있는 형광 표지 PEG-PLys의 총량(몰)으로 하고, 이것을 반응 용액에 원래 첨가한 DNA량(몰)으로 나눔으로써 1분자의 pDNA에 결합하고 있는 형광 표지 PEG-PLys의 평균 분자수(즉, 고분자 미셀 복합체 1분자당 포함되어 있는 형광 표지 PEG-PLys의 평균 분자수, 단위: 쇄)를 산출했다.
이 결과, 고분자 미셀 복합체 1분자당 포함되어 있는 형광 표지 PEG-PLys의 평균 분자수는 PLys 블록의 중합도가 19인 형광 표지 PEG-PLys를 포함하는 고분자 미셀 복합체는 436±31.2쇄, PLys 블록의 중합도가 39인 형광 표지 PEG-PLys를 포함하는 고분자 미셀 복합체는 258±10.4쇄, PLys 블록의 중합도가 70인 형광 표지 PEG-PLys를 포함하는 고분자 미셀 복합체는 168±2.5쇄이었다. 즉, 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 구성하는 블록 공중합체의 양이온성 고분자쇄 블록의 중합도가 클수록 고분자 미셀 복합체 1분자당 포함되어 있는 형광 표지 PEG-PLys의 평균 분자수가 작아지는 경향이 있는 것을 알 수 있었다.
(6) TEM 관찰
PEG-PLys를 사용해서 형성된 고분자 미셀 복합체에 대해서 TEM 화상을 촬상했다. TEM 화상에는 고분자 미셀 복합체를 구성하는 DNA와 PLys 블록이 나타내어져 PEG는 관찰할 수 없다. 고분자 미셀 복합체 중 DNA는 코어 부분을 형성하고 있다. 즉, TEM 화상으로부터 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 형상을 확인할 수 있다.
TEM 관찰 및 화상의 취득은 전자 현미경 H-7000(Hitachi High-Tech Solutions Corporation제)을 사용해서 가속 전압을 75㎸로 하는 조건으로 행했다. 측정 샘플은 고분자 미셀 복합체 용액에 등량의 2질량/용량%의 아세트산 우라닐 용액을 첨가해서 조제했다. 이온 코터(장치명: Eiko IB-3, EIKO Engineering Co., Ltd.제)를 사용해서 미리 글로 방전시킨 400메시의 카본막 피복 구리 그리드(Nisshin EM Corporation제)를 각각 측정 샘플에 30초간 침지시킨 후 필터 페이퍼 상에서 건조시킨 것을 TEM 관찰했다. TEM 화상 중의 고분자 미셀 복합체의 코어 부분은 로드형상이며, 장축의 길이(Ln)와 단축의 길이(2rn)를 화상 처리 소프트웨어ImageJ를 사용해서 측정했다.
도 1에 PEG-PLys를 사용해서 형성된 고분자 미셀 복합체의 TEM 화상(도면 중, 좌측)과, 상기 화상으로부터 산출된 고분자 미셀 복합체의 장축(Ln)(로드형상 입자의 길이)의 분포(도면 중, 우측)를 나타냈다. 도 1 중 「PLys19」는 PLys 블록의 중합도가 19인 형광 표지 PEG-PLys를 포함하는 고분자 미셀 복합체의 결과를, 「PLys39」는 PLys 블록의 중합도가 39인 형광 표지 PEG-PLys를 포함하는 고분자 미셀 복합체의 결과를, 「PLys70」은 PLys 블록의 중합도가 70인 형광 표지 PEG-PLys를 포함하는 고분자 미셀 복합체의 결과를 각각 나타낸다. 이 결과, PLys 블록의 중합도가 커질수록 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 크기는 작아져 로드형상으로부터 구체형상에 가까워져 가는 것을 알수 있었다.
(7) 코어 부분의 표면적의 산출 및 PEG의 평균 밀도(σ)의 산출
각 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 표면적[An]을 TEM 화상 중에 있어서의 장축[Ln]을 회전축으로 하고, 단축의 반분의 길이[rn]를 반경으로 하는 원기둥으로 해서 하기식과 같이 구했다. TEM 화상 중의 복수의 코어 부분에 대해서 측정하여 평균을 산출했다.
코어 부분의 표면적: [An]=(Ln×2πrn)+2×(π×rn 2)
이어서, 상기 (5)에서 구한 고분자 미셀 복합체 1분자당 포함되어 있는 형광 표지 PEG-PLys의 평균 분자수(쇄)를 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 평균 표면적으로 나눔으로써 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 표면적당 블록 공중합체의 평균 밀도(σ)(쇄/㎚2)를 구했다.
이 결과, 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 표면적당 블록 공중합체의 평균 밀도(σ)는 PLys 블록의 중합도가 19인 형광 표지 PEG-PLys를 포함하는 고분자 미셀 복합체는 0.075쇄/㎚2, PLys 블록의 중합도가 39인 형광 표지 PEG-PLys를 포함하는 고분자 미셀 복합체는 0.051쇄/㎚2, PLys 블록의 중합도가 70인 형광 표지 PEG-PLys를 포함하는 고분자 미셀 복합체는 0.038쇄/㎚2이었다. 즉, 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 구성하는 블록 공중합체의 양이온성 고분자쇄 블록의 중합도가 클수록 코어 부분의 표면적당 블록 공중합체의 평균 밀도(σ)가 작아지는 경향이 있는 것을 알 수 있었다.
(8) 혈중 체류성의 평가
형광 표지된 DNA를 사용해서 형성된 고분자 미셀 복합체에 대해서 마우스에 투여하고, 혈중 체류 시간을 생체 리얼 타임 공초점 주사 현미경에 의해 경시적으로 관찰했다. 모든 화상 및 동화는 정립 현미경 ECLIPSE FN1(Nikon Corporation제)(대물렌즈: 20배, 다이오드 레이저: 640㎚, 에미션 밴드 패스 필터: 700/75㎚)가 부속되어 있는 공초점 레이저 주사 현미경 시스템 A1R(Nikon Corporation제)에 의해 취득했다.
구체적으로는 우선 8주령의 암컷의 BALB/c 마우스(Charles River Laboratories International, Inc.제)에 대해서 소동물용 이소플루레인 마취기(형식: 400, Univentor Limited제)를 사용해서 2.0~3.0% 이소플루레인(ABBOTT JAPAN CO., LTD.제)에 의해 마취시켰다. 이들 마우스의 측면 꼬리 정맥에 30게이지의 주사 바늘(Becton, Dickinson and Company제)과 함께 무독성의 의료용 폴리에틸렌 튜브(NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.제)에 연결한 카테터를 삽입했다. 마취시킨 마우스를 현미경 스테이지에 장착된 온도 제어 패드(제품명: THERMOPLATE(등록상표), Tokai Hit Corporation제)에 얹고, 측정 중에는 진정 상태를 유지했다. 이어서, 비디오의 녹화 개시로부터 10초 후에 형광 표지된 pDNA를 내포하는 고분자 미셀 복합체(주입량: 200㎕, DNA 농도: 100ng/㎕)를 꼬리 정맥으로부터 마우스에 주입했다. 귓불의 피부를 1방울의 액침유와 함께 커버 클립 밑에 고정하고, 외과적 처치 없이 관찰했다. 데이터는 비디오 모드로 5분간 마다의 슬랩 샷으로 해서 취득했다. 상기 실험은 각 고분자 미셀 복합체에 대해서 각각의 마우스에 대해서 각각 4회 행했다.
비디오 데이터는 혈관 내 또는 혈관 이외의 피부 조직에 대해서 흥미가 있는 영역을 선택해서 해석했다. 우선, 백 그라운드의 형광 강도를 비디오 녹화 개시로부터 10초간의 사이(고분자 미셀 복합체 주입 전)에 취득된 비디오에 의거하여 결정하고, 각 시점에 있어서의 픽셀당 평균 형광 강도를 화상 통합 소프트웨어 NIS-Elements C(Nikon Corporation제)를 사용해서 결정했다. 각 시점에 있어서의 백 그라운드 보정된 강도를 얻기 위해서 백 그라운드 값은 고분자 미셀 복합체 주입 후에 측정된 픽셀당 평균 강도로부터 뺐다. 고분자 미셀 복합체의 체내 순환은 조직 백 그라운드로부터의 형광이 빠진 혈관으로부터의 형광 강도에 의해 모니터했다.
마우스의 귀 정맥에 있어서의 형광 강도의 경시적 변화의 측정 결과를 도 2에 나타낸다. 실험 개시로부터 40분 경과 후까지는 혈관의 형광 강도는 PLys 블록의 중합도가 19인 PEG-PLys를 포함하는 고분자 미셀 복합체를 투여했을 경우(도면 중 「PLys19」)가 가장 높고, PLys 블록의 중합도가 70인 PEG-PLys를 포함하는 고분자 미셀 복합체를 투여했을 경우(도면 중 「PLys70」)가 가장 낮았다. 즉, 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 구성하는 블록 공중합체의 양이온성 고분자쇄 블록의 중합도가 작을수록, 즉 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 구성하는 블록 공중합체의 밀도가 클수록 혈중 체류성이 양호한 것을 알 수 있었다.
[실시예 1]
pDNA를 그대로 내포시키는 종래법에 의해 제조된 핵산 내포 고분자 미셀 복합체와, pDNA의 2중 나선 구조를 해리시킨 상태에서 블록 공중합체와 결합시키는 방법에 의해 제조된 핵산 내포 고분자 미셀 복합체에 대해서 형상, 크기, 블록 공중합체의 밀도를 비교했다.
(1) PEG-PAsp(DET)-Chole
α-메톡시-ω-아미노PEG(PEG, Mw=12kDa, Mw/Mn=1.05)를 개시제로서 사용하고, β-벤질-L-아스파르테이트(BLA)의 NCA를 개환 중합함으로써 PEG 블록-폴리(β-벤질-L-아스파르테이트) 블록(PEG-PBLA)을 제조했다. 이때, 개시제와 모노머인 NCA의 비를 조절함으로써 중합도가 다른 3종의 PEG-PBLA를 제조했다.
얻어진 PEG-PBLA의 말단의 아미노기에 콜레스테롤의 3-히드록실기를 1급 아미노기로 치환한 후에 무수 숙신산과 반응시킴으로써 활성화된 카르복실기를 갖는 콜레스테롤 유도체를 10배당량의 디시클로헥실카르보디이미드와 2배당량의 4-디메틸아미노피리딘의 존재 하 N,N-디메틸포름아미드 중에서 하룻밤 반응시켰다. 얻어진 블록 공중합체를 냉 디에틸에테르와 이소프로판올의 혼합 용매(2:1(용량비))에 적하해서 재침하는 것을 3회 반복한 후 벤젠으로부터 동결 건조함으로써 PEG-PBLA-Chole의 정제 분말을 얻었다.
얻어진 PEG-PBLA-Chole로부터 에스테르-아미드 교환 반응에 의해 PBLA의 측쇄 중에 디에틸렌트리아민을 도입함으로써 PEG-PAsp(DET)-Chole을 얻었다.
Figure pct00005
(2) 형광 표지 PEG-PAsp(DET)-Chole
PEG-PAsp(DET)-Chole이 DNA와 결합한 것을 확인하기 위해서 참고예 1의 (1)과 마찬가지로 해서 Alexa Fluor(등록상표)680 carboxylic acid succinimidyl ester(Molecular Probes, Inc.제)를 사용해서 PEG-PAsp(DET)-Chole을 미리 형광 표지했다. PEG-PAsp(DET)-Chole이 실제로 형광 표지된 것은 UV 검출기, IR 검출기 및 형광 검출기를 구비하는 GPC에 의해 확인했다. 형광 표지 효율을 산출한 결과, 대략 모든 PEG-PAsp(DET)-Chole에 있어서 PAsp(DET) 블록당 0.3~0.5분자의 형광 물질이 결합되어 있었다.
(3) pDNA를 그대로 내포한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형성
PEG-PAsp(DET)-Chole 용액에 참고예 1에서 사용한 플라스미드 pBR322 용액을 N/P비가 4가 되도록 빠르게 혼합함으로써 pDNA를 내포한 PEG-PAsp(DET)-Chole의 고분자 미셀 복합체(이하, 「PM-1」(PM: Polyplex Micelle))를 형성했다. 반응 용매는 10mM HEPES 버퍼(pH7.3)로 하고, 반응 용액 중의 pDNA 농도는 33.3ng/㎕로 했다.
(4) pDNA를 변성시켜서 내포한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형성
플라스미드 pCAG-Luc(6.4kbp) 용액에 제한 효소를 첨가해서 제한 효소 처리하고, pCAG-Luc을 1개소 소화해서 선상으로 했다. 이 선상 DNA를 포함하는 DNA 용액을 95℃에서 10분간 가열 처리하고, 선상화한 pCAG-Luc를 1개쇄로 변성시켰다. 이어서, 변성시킨 상태의 DNA 용액에 PEG-PAsp(DET)-Chole 용액을 N/P비가 4가 되도록 빠르게 혼합함으로써 1분자의 pCAG-Luc 유래의 2개의 선상의 1개쇄 DNA를 내포한 PEG-PAsp(DET)-Chole의 고분자 미셀 복합체(이하, 「MCPM-1」(MCPM: Melt Crumpled Polyplex Micelle))를 형성했다. 용매는 10mM HEPES 버퍼(pH7.3)로 하고, 반응 용액 중의 pDNA 농도는 33.3ng/㎕로 했다. 또한, pCAG-Luc는 플라스미드 pCAGGS(riken gene bank로부터 공급)에 플라스미드 pGL3(Promega Corporation제)로부터 Luc를 코딩하는 유전자를 잘라내서 장착한 것이다.
(5) 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 형성하고 있는 PEG-PAsp(DET)-Chole의 결정
상기 (3) 및 (4)에서 얻어진 고분자 미셀 복합체 중 형광 표지 PEG-PAsp(DET)-Chole을 사용해서 형성된 고분자 미셀 복합체에 대해서 DNA와 결합한 형광 표지 PEG-PAsp(DET)-Chole량을 측정하기 위해서 참고예 1의 (5)와 마찬가지로 해서 고분자 미셀 복합체 형성 후의 반응 용액을 초원심 분리 처리하고, 상청의 702㎚에 있어서의 형광 강도에 의거하여 1분자의 pDNA에 결합하고 있는 형광 표지 PEG-PAsp(DET)-Chole의 평균 분자수(즉, 고분자 미셀 복합체 1분자당 포함되어 있는 형광 표지 PEG-PAsp(DET)-Chole의 평균 분자수, 단위: 쇄)를 산출했다. 산출 결과를 표 1의 「결합 PEG수(쇄)」에 나타낸다.
(6) TEM 관찰
상기 (3) 및 (4)에서 얻어진 고분자 미셀 복합체 중 형광 표지되지 않는 PEG-PAsp(DET)-Chole을 사용해서 형성된 고분자 미셀 복합체에 대해서 참고예 1의 (6)과 마찬가지로 해서 TEM 화상을 촬상하고, TEM 화상 중의 고분자 미셀 복합체의 코어 부분에 대해서 장축의 길이[Ln]와 단축의 길이[2rn]를 측정했다. 이때, 코어 부분의 형상이 원인 경우에는 장축의 길이[Ln]가 직경이 되고, 단축의 길이[2rn]와 같아진다. 도 3에 양쪽 고분자 미셀 복합체의 TEM 화상을 도 4에 TEM 화상으로부터 산출된 고분자 미셀 복합체의 장축의 분포를 각각 나타낸다. TEM 화상 중의 고분자 미셀 복합체의 코어 부분은 PM-1에서는 참고예 1과 마찬가지로 로드형상이었지만, MCPM-1에서는 구체형상(평균 반경: 23.1±3.8㎚)이었다.
(7) 코어 부분의 표면적의 산출 및 PEG의 평균 밀도(σ)의 산출
TEM 화상 중의 복수의 PM-1의 코어 부분의 표면적[An]을 참고예 1의 (7)과 마찬가지로 해서 산출하고, 그 평균을 산출했다.
MCPM-1의 코어 부분의 표면적[An]은 TEM 화상 중에 있어서의 장축[Ln]의 반분의 길이[rn]를 반경으로 하는 구로서 하기 식과 같이 구했다. TEM 화상 중의 복수의 코어 부분에 대해서 측정하여 평균을 산출했다.
코어 부분의 표면적: [An]=4πrn 2
이어서, 상기 (5)에서 구한 고분자 미셀 복합체 1분자당 포함되어 있는 형광 표지 PEG-PAsp(DET)-Chole의 평균 분자수(쇄)를 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 평균 표면적으로 나눔으로써 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 표면적당 블록 공중합체의 평균 밀도(σ)(쇄/㎚2)를 구했다. 코어 부분의 표면적의 평균값과 코어 부분의 표면적당 블록 공중합체의 평균 밀도(σ)의 산출 결과를 각각 표 1의 「코어 부분의 표면적(㎚2)」 및 「PEG 밀도(σ)(쇄/㎚2)」에 나타낸다.
Figure pct00006
이 결과, 같은 크기의 DNA를 내포하고 있음에도 불구하고, 종래법에 의해 제조된 PM-1은 장축이 100~150㎚의 로드형상이며, PEG 밀도도 0.1쇄/㎚2 미만이었던 것에 대해서 DNA의 2중 나선 구조를 해리시켜서 고분자 미셀 복합체를 형성시킨 MCPM-1에서는 코어 부분이 반경 23㎚ 정도인 구체형상으로 매우 작고, 또한 PEG 밀도가 0.3쇄/㎚2 이상으로 매우 높게 되었다. 즉, DNA의 2중 나선 구조를 해리시켜서 고분자 미셀 복합체를 형성시킴으로써 코어 부분의 표면적당 블록 공중합체의 평균 밀도가 크고, 구체형상의 보다 작은 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 형성할 수 있는 것을 알 수 있었다.
[실시예 2]
CAG 프로모터의 하류에 형광 녹색 단백질 GFP를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pCAG-AcGFP(6.5kbp, Riken gene bank로부터 공급)를 사용해서 pDNA를 그대로 내포시키는 종래법과, pDNA의 2중 나선 구조를 해리시킨 상태에서 블록 공중합체와 결합시키는 방법에 의해 각각 GFP 유전자 내포 고분자 미셀 복합체를 제조하고, 췌장암이 발증되어 있는 모델 마우스에 전신 투여하고, 췌장암 조직에 있어서의 GFP 발현을 조사했다. 또한, pCAG-AcGFP는 플라스미드 pCAGGS(Riken gene bank로부터 공급)에 GFP를 코딩하는 유전자를 장착한 것이다.
(1) pGFP를 그대로 내포한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형성
실시예 1에서 제조한 PEG-PAsp(DET)-Chole 용액에 플라스미드 pGFP 용액을 N/P비가 4가 되도록 빠르게 혼합함으로써 pDNA를 내포한 PEG-PAsp(DET)-Chole의 고분자 미셀 복합체(이하, 「PM-2-GFP」)를 형성했다. 반응 용매는 10mM HEPES 버퍼(pH7.3)로 하고, 반응 용액 중의 플라스미드 농도는 100ng/㎕로 했다.
(2) pGFP를 변성시켜서 내포한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형성
플라스미드 pGFP 용액에 제한 효소를 첨가해서 제한 효소 처리하고, pGFP를 1개소 소화해서 선상으로 했다. 이 선상 DNA를 포함하는 DNA 용액을 95℃에서 10분간 가열 처리하고, 선상화한 pGFP를 1개쇄로 변성시켰다. 이어서, 변성시킨 상태의 DNA 용액에 PEG-PAsp(DET)-Chole 용액을 N/P비가 4가 되도록 빠르게 혼합함으로써 1분자의 pGFP 유래의 2개의 선상의 1개쇄 DNA를 내포한 PEG-PAsp(DET)-Chole의 고분자 미셀 복합체(이하, 「MCPM-2-GFP」)를 형성했다. 반응 용매는 10mM HEPES 버퍼(pH7.3)로 하고, 반응 용액 중의 pDNA 농도는 100ng/㎕로 했다.
(3) 췌장암 모델 마우스
췌장암 모델 마우스로서 인간 췌장선암 세포주 BxPC3를 췌장에 이식한 모델 마우스를 사용했다.
상기 췌장암 모델 마우스는 이하와 같이 해서 얻었다. 우선, BALB/c 누드 마우스(Charles River Laboratories International, Inc.제)의 피하에 100㎕의 PBS(인산 완충 생리 식염수)에 현탁시킨 BxPC3(1×107 세포)를 접종했다. 종양은 10일간으로 증식기(종양의 크기가 75㎣ 정도)까지 진행했다.
(4) 췌장암 모델 마우스로의 전신 투여
췌장암 모델 마우스에 대해서 상기 (1), (2) 및 실시예 1의 (4)에서 제조한 고분자 미셀 복합체(주입량: 200㎕, DNA 농도: 100ng/㎕)를 각각 꼬리 정맥으로부터 주입했다. 주입으로부터 72시간 경과한 후의 마우스로부터 BxPC3가 이식된 췌장암 조직을 외과적으로 절제하고, 건조 냉각한 아세톤 중에서 동결시킨 것으로부터 쿠라이오스탯에 의해 두께 10㎛의 박층 절편을 제작했다. 얻어진 절편에 대해서 세포핵을 Hoecst33342를 사용해서 염색했다. 또한, 혈관 내피 세포를 항마우스 PECAM-1 항체(Becton, Dickinson and Company제) 및 항인간 및 마우스 VEGFR1 항체(제품번호: ab32152, Abcam plc.제)를 사용해서 염색했다.
염색 후 공초점 형광 현미경(제품 번호: CLSM780, Carl Zeiss AG제)에 의해 관찰한 결과, PM-2-GFP를 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직에서는 GFP의 발현이 관찰된 세포는 조직 전체의 극히 일부이었다. 이것에 대해서 MCPM-2-GFP를 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직에서는 종양 조직 심부에도 매우 많은 세포에 있어서 GFP의 발현이 관찰되었다. 형광 현미경으로부터 촬상된 형광 화상을 도 5~도 7에 나타낸다. 도 5가 MCPM-2-GFP를 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직의 형광 화상을, 도 6이 PM-2-GFP를 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직의 형광 화상을, 도 7이 MCPM-1을 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직의 형광 화상을 각각 나타낸다.
이 형광 화상으로부터 BxPC3이 이식된 췌장암 조직에 있어서 발현되어 있는 GFP의 형광 강도(화상의 명도)를 측정하고, 백 그라운드를 뺀 것의 8이미지의 평균값을 형광 강도로서 산출했다. PM-2-GFP를 투여한 마우스와, MCPM-2-GFP를 투여한 마우스의 측정 결과를 도 8에 나타낸다. MCPM-2-GFP를 투여한 마우스에서는 췌장암의 종양 조직 심부에 있어서의 GFP 발현이 PM-2-GFP를 투여한 마우스의 10배 이상이었다.
[실시예 3]
양이온성 고분자쇄 블록끼리의 가교의 유무에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 전신 투여했을 경우의 혈중 체류성에 대한 영향을 조사했다.
(1) PEG-PLys-PDP
참고예 1의 (1)과 마찬가지로 해서 α-메톡시-ω-아미노 PEG(PEG, Mw=20kDa)를 개시제로서 사용하고, NCA를 개환 중합함으로써 PEG-PLys(TFA)를 제조했다. 이때, 개시제와 모노머인 NCA의 비를 조절함으로써 중합도가 다른 3종의 PEG-PLys(TFA)를 제조했다. 이렇게 해서 얻어진 3종의 PEG-PLys(TFA)의 TFA기를 탈보호해서 중합도(하기 식 중 「n2」)가 20, 40 및 70인 3종의 PEG-PLys를 얻었다.
이어서, PEG-PLys로의 피리딜디티오프로피오닐기(PDP기)의 도입을 행했다. 이 도입은 N-숙신이미딜3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)를 사용해서 행했다. PEG-PLys는 브롬산염의 것을 0.1N, pH6.5의 아세트산 완충액에 용해시키고, 동 완충액에 대해서 투석하고, 카운터 이온을 아세트산 이온으로 교환해서 사용했다. PEG-PLys아세트산염(200㎎)과 SPDP(56㎎, 리신 잔기에 대해서 0.5mol당량)을 5㎖의 N-메틸피롤리돈(NMP, 5질량%의 염화리튬을 첨가하여 탈기한 것)에 용해시켰다. 이 용액에 0.5㎖의 N,N-디이소프로필에틸아민을 아민을 탈프로톤화하기 위해서 첨가하여 반응을 개시했다. 반응액은 실온에서 1시간 교반하고, 반응의 추적은 역상 크로마토그래피에 의해 행했다.
반응의 종료 후 반응액을 PEG의 빈용매인 에테르에 적하하여 재침했다. 조 생성물을 메탄올에 용해시킨 후 에테르에 재침하는 조작을 반복하고, 물에 불필요한 불순물을 제거했다. 과잉의 염은 생성물을 0.1N의 아세트산 수용액에 용해시키고, 증류수에 대해서 1시간 투석함으로써 제거했다. 최종 정제물은 동결 건조하여 회수했다.
얻어진 고분자의 구조는 1H-NMR 측정에 의해 확인했다. PDP기의 치환도는 1H-NMR 측정과 UV 측정에 의해 결정했다. 1H-NMR 측정에서는 D2O를 용매로서 사용하고, PDP기의 피리딜기의 프로톤(C3H4N: 7.6ppm)과 PEG의 메틸렌의 프로톤(OCH2CH2: 3.5ppm)의 피크의 강도비로부터 치환도를 구했다. UV 측정에서는 PDP기를 디티오트레이톨(DTT)에 의해 환원했을 때에 유리되는 2-티오피리돈의 흡광도(λmax=343㎚．ε=7.06×103)으로부터 치환도를 구했다. 다른 2개의 방법에 의해 구해진 치환도는 잘 일치하고 있고, 리신 유래 반복 단위의 아미노기의 약 12%에 PDP기가 도입된 것이 나타내어졌다.
얻어진 PEG-PLys-PDP는 DNA와 결합시켜서 고분자 미셀 복합체를 형성하기 전에 미리 PDP기에 대해서 3배의 농도가 되도록 DTT를 첨가해서 15분간 교반하고, PDP기를 티올 잔기에 환원해 두었다.
Figure pct00007
(2) 형광 표지된 pDNA를 변성시켜서 내포한 미가교의 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형성
참고예 1에서 사용한 형광 물질 Cy(등록상표)5로 표지된 플라스미드 pCAG-Luc2를 제한 효소 처리하고, 1개소 소화해서 선상으로 했다. 이 선상 DNA를 포함하는 DNA 용액을 95℃에서 10분간 가열 처리하고, 선상화한 형광 표지 pCAG-Luc2를 1개쇄로 변성시켰다. 이어서, 변성시킨 상태의 DNA 용액에 상기 (1)에서 조제한 환원 처리 후의 PEG-PLys-PDP 용액을 N/P비가 2가 되도록 빠르게 혼합함으로써 1분자의 형광 표지 pCAG-Luc2 유래의 2개의 선상의 1개쇄 DNA를 내포한 PEG-PLys-PDP의 고분자 미셀 복합체(이하, 리신 유래 반복 단위의 중합도 20, 40 또는 70의 고분자를 사용한 것을 각각 「MCPM-3-PLys20」, 「MCPM-3-PLys40」, 「MCPM-3-PLys70」)를 형성했다. 반응 용매는 10mM HEPES 버퍼(pH7.3)로 하고, 반응 용액 중의 pDNA 농도는 100ng/㎕로 했다.
(3) 형광 표지한 pDNA를 변성시켜서 내포하고, 블록 공중합체끼리가 가교화된 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형성
상기 (2)에서 형성된 고분자 미셀 복합체를 포함하는 반응 용액을 분획 분자량 6000-8000의 투석막을 사용해서 1L의 10mM 인산 완충액(pH7.4)에 대해서 투석하여 DTT 등을 제거했다. 투석은 3일간 계속하고, 이 동안 공기 중의 산소에 의해 티올을 SS 결합에 산화하여 가교시켰다. 3일간의 투석 후 미산화의 티올이 존재하지 않는 것은 Ellman법에 의해 확인했다. MCPM-3-PLys20를 가교화한 것을 MCPM-3-PLys20-CL, MCPM-3-PLys40를 가교화한 것을 MCPM-3-PLys40-CL, MCPM-3-PLys70을 가교화한 것을 MCPM-3-PLys70-CL로 했다.
(4) 혈중 체류성의 평가
상기 (2) 및 (3)에서 형성된 고분자 미셀 복합체(주입량: 200㎕, DNA 농도: 100ng/㎕)를 마우스의 측면 꼬리 정맥으로부터 주입했다. 각 고분자 미셀 복합체에 대해서 4마리의 마우스에 각각 투여했다. 투여로부터 30분간 경과 후의 마우스의 대정맥으로부터 혈액을 채취하고, 원심 분리 처리에 의해 혈청을 조제했다. 얻어진 혈청에 트립신과 황산 덱스트란을 첨가해서 37℃에서 밤새 인큐베이트했다. 인큐베이트 후의 혈청의 Cy(등록상표)5의 형광 강도(670㎚)를 형광 분광 광도계(제품명: Nano Drop(ND-3300), Wilmington, Delaware USA제)를 사용해서 측정했다.
전신 투여 후 30분 경과 후에 있어서의 마우스의 혈중에 체류하고 있는 고분자 미셀 복합체량의 비율(%)은 하기 식으로 산출했다. 식 중 [F670(샘플)]은 고분자 미셀 복합체가 투여된 마우스로부터 조제된 혈청(트립신과 황산 덱스트란의 인큐베이트 후의 것)의 670㎚의 형광 강도의 측정값을 의미한다. 또한, [F670(컨트롤)]은 고분자 미셀 복합체 미투여의 마우스로부터 조제된 혈청에 마우스에 투여한 고분자 미셀 복합체와 등량의 고분자 미셀 복합체를 첨가한 것(컨트롤 혈청)을 샘플과 마찬가지로 트립신과 황산 덱스트란을 첨가해서 37℃에서 하룻밤 인큐베이트한 후의 혈청의 670㎚의 형광 강도의 측정값이다. [혈중에 체류하고 있는 고분자 미셀 복합체량의 비율(%)]=[F670(샘플)]/[F670(컨트롤)]×100
측정 결과를 도 9에 나타낸다. 도 9 중 「MCPM」은 「MCPM-3-PLys20」, 「MCPM-3-PLys40」 및 「MCPM-3-PLys70」를 투여한 마우스의 결과를, 「MCPM-CL」은 「MCPM-3-PLys20-CL」, 「MCPM-3-PLys40-CL」 및 「MCPM-3-PLys70-CL」을 투여한 마우스의 결과를 각각 나타낸다. 블록 공중합체를 가교화함으로써 혈중 체류성이 현저히 개선되었다.
[실시예 4]
형광 녹색 단백질 Venus를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드(pVenus, 5.5kbp)를 사용해서 pDNA를 그대로 내포시키는 종래법과, pDNA의 2중 나선 구조를 해리시킨 상태에서 블록 공중합체와 결합시키는 방법에 의해 각각 Venus 유전자 내포 고분자 미셀 복합체를 제조하고, 췌장암이 발증되어 있는 모델 마우스에 전신 투여하여 췌장암 조직에 있어서의 Venus 발현을 조사했다. 또한, pVenus는 플라스미드 pCAGGS(Riken gene bank로부터 공급)에 Venus를 코딩하는 유전자를 장착한 것이다.
(1) PEG-PLys-PDP
참고예 1의 (1)과 마찬가지로 해서 α-메톡시-ω-아미노PEG(PEG, Mw=20kDa)를 개시제로서 사용하고, NCA를 개환 중합함으로써 PEG-PLys(TFA)를 제조했다. 이때, 개시제와 모노머인 NCA의 비를 조절함으로써 중합도가 다른 3종의 PEG-PLys(TFA)를 제조했다. 이렇게 해서 얻어진 3종의 PEG-PLys(TFA)의 TFA기를 탈보호하고, 중합도가 72인 PEG-PLys를 얻었다.
이어서, 실시예 3의 (1)과 마찬가지로 해서 얻어진 PEG-PLys에 PDP기를 도입했다. 얻어진 고분자의 구조는 1H-NMR 측정에 의해 확인한 결과, 리신 유래 반복 단위의 아미노기의 약 12%에 PDP기가 도입된 것이 나타내어졌다.
얻어진 PEG-PLys-PDP는 DNA와 결합시켜서 고분자 미셀 복합체를 형성하기 전에 미리 PDP기에 대해서 3배의 농도가 되도록 DTT를 첨가해서 15분간 교반하고, PDP기를 티올 잔기로 환원해 두었다.
(2) cRGD-PEG-PLys-PDP
환상 RGD 펩티드(cRGD)는 종양 세포 및 종양 혈관 내피 세포에 과잉 발현되어 있는 αvβ3 및αvβ5 인테그린을 선택적으로 인식하는 리간드이다. PEG 블록의 말단에 cRGD를 도입한 cRGD-PEG-PLys-PDP를 합성했다.
구체적으로는 α-메톡시-ω-아미노PEG 대신에 α-아세틸-ω-아미노PEG(PEG, Mw=20kDa)를 개시제로서 사용한 이외에는 실시예 1(1)과 마찬가지로 해서 아세틸-PEG-PBLA-Chole을 얻었다. 얻어진 아세틸-PEG-PBLA-Chole을 물에 용해시켜서 염산으로 pH2로 조정하고, 아세틸기를 완전히 활성형의 알데히드기로 변환시켰다(산성화된 아세틸-PEG-PBLA-Chole 용액).
이것과는 별도로 cyclo{RGDfK(CX-)}펩티드를 이들 펩티드 사이에 형성되어 있을지도 모르는 SS 결합을 절단하기 위해서 펩티드의 10배당량의 DTT를 함유하는 탄산수소나트륨 버퍼(0.1N, pH7.4)에 용해시켜 1시간 인큐베이트한(cRGD 펩티드 용액).
이어서, 산성화된 아세틸-PEG-PBLA-Chole 용액에 cRGD 펩티드가 아세틸-PEG-PBLA-Chole의 10배 등량이 되도록 상기 cRGD 펩티드 용액을 첨가하고, pH5로 조정하여 하룻밤 반응시켰다. 최종 반응 생성물인 cRGD-PEG-PAsp(DET)-Chole는 1M의 염화나트륨 수용액 중에서 3회 투석한 후 탈이온수로 3회 투석했다.
(3) pVenus를 그대로 내포한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형성
상기 (1)에서 제조한 PEG-PLys-PDP 용액에 플라스미드 pVenus 용액을 N/P비가 2가 되도록 빠르게 혼합함으로써 pVenus를 내포한 PEG-PLys-PDP의 고분자 미셀 복합체(이하, 「PM-4-Venus」)를 형성했다. 반응 용매는 10mM HEPES 버퍼(pH7.3)로 하고, 반응 용액 중의 플라스미드 농도는 100ng/㎕로 했다.
이어서, 실시예 3의 (3)과 마찬가지로 해서 형성된 고분자 미셀 복합체를 포함하는 반응 용액을 3일간 투석하고, 상기 고분자 미셀 복합체 중의 티올을 SS 결합에 산화하여 가교시켰다. 가교화해서 얻어진 것을 PM-4-Venus-CL로 했다.
(4) pVenus를 변성시켜서 내포한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형성
pVenus를 제한 효소 처리하고, 1개소 소화해서 선상으로 했다. 이 선상 DNA를 포함하는 DNA 용액을 95℃에서 10분간 가열 처리하고, 선상화된 형광 표지 pVenus를 1개쇄로 변성시켰다. 이어서, 변성시킨 상태의 DNA 용액에 상기 (1)에서 조제한 환원 처리 후의 PEG-PLys-PDP 용액을 N/P비가 2가 되도록 빠르게 혼합함으로써 1분자의 pVenus 유래의 2개의 선상의 1개쇄 DNA를 내포한 PEG-PLys-PDP의 고분자 미셀 복합체(이하, 「MCPM-4-Venus」)를 형성했다. 반응 용매는 10mM HEPES 버퍼(pH7.3)로 하고, 반응 용액 중의 pDNA 농도는 100ng/㎕로 했다.
이어서, 실시예 3의 (3)과 마찬가지로 해서 형성된 고분자 미셀 복합체를 포함하는 반응 용액을 3일간 투석하고, 상기 고분자 미셀 복합체 중의 티올을 SS 결합에 산화하여 가교시켰다. 가교화해서 얻어진 것을 MCPM-4-Venus-CL로 했다.
(5) pVenus를 변성시켜서 내포한 cRGD 도입 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형성
상기 (1)에서 조제한 환원 처리 후의 PEG-PLys-PDP 용액 대신에 상기 (2)에서 조제한 환원 처리 후의 cRGD-PEG-PLys-PDP 용액을 사용한 이외에는 상기 (4)와 마찬가지로 해서 1분자의 pVenus 유래의 2개의 선상의 1개쇄 DNA를 내포하고, 가교화된 MCPM-4-Venus-CL-cRGD를 얻었다.
(6) 췌장암 모델 마우스로의 전신 투여
실시예 2의 (3)과 동종의 췌장암 모델 마우스에 대해서 상기 (3), (4) 및 (5)에서 제조한 고분자 미셀 복합체(주입량: 200㎕, DNA 농도: 100ng/㎕)를 각각 꼬리 정맥으로부터 주입했다. 실시예 2의 (4)와 마찬가지로 해서 주입으로부터 72시간 경과한 후의 마우스로부터 BxPC3가 이식된 췌장암 조직을 외과적으로 절제하고, 현미경 관찰용의 절편을 제작하고, 얻어진 절편에 대해서 세포핵과 혈관을 형광 염색했다.
염색 후 공초점 형광 현미경에 의해 관찰한 결과, pVenus를 그대로 수용한 PM-4-Venus-CL을 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직에서는 Venus의 발현이 관찰된 세포는 조직 전체의 극히 일부이었다. 이것에 대해서 pVenus를 변성해서 수용한 MCPM-4-Venus-CL을 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직에서는 종양 조직 심부에도 불구하고, 매우 많은 세포에 있어서 Venus의 발현이 관찰되었다. 또한, cRGB 리간드를 부가한 MCPM-4-Venus-CL-cRGD를 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직에서도 MCPM-4-Venus-CL과 마찬가지로 많은 세포에 있어서 Venus의 발현이 관찰되었다. MCPM-4-Venus-CL을 전신 투여한 마우스의 췌장암 조직의 형광 화상을 도 10에 나타낸다.
[실시예 5]
실시예 3의 (1)과 마찬가지로 해서 중합도가 20이며, 또한 PDP기의 치환도 10%인 PEG-PLys-PDP(PEG-PLys20-SH 10%)와, 중합도가 69이며, 또한 PDP기의 치환도 12%인 PEG-PLys-PDP(PEG-PLys69-SH 12%)를 제조했다. 이들 블록 공중합체는 DNA와 결합시켜서 고분자 미셀 복합체를 형성하기 전에 미리 PDP기에 대해서 3배의 농도가 되도록 DTT를 첨가해서 15분간 교반하고, PDP기를 티올 잔기로 환원해 두었다.
이어서, 실시예 1의 (3)과 마찬가지로 해서 이들의 블록 공중합체 용액에 플라스미드 pCAG-Luc 용액을 혼합하고, pCAG-Luc를 내포한 PEG-PLys-PDP의 고분자 미셀 복합체를 형성했다.
얻어진 고분자 미셀 복합체에 대해서 참고예 1의 (6)과 마찬가지로 해서 TEM 화상을 촬상했다. 도 11에 PEG-PLys20-SH 10%를 사용한 고분자 미셀 복합체의 TEM 화상(좌, 「20-SH 10%」)과, PEG-PLys69-SH 12%를 사용한 고분자 미셀 복합체의 TEM 화상(우, 「69-SH 12%」)을 각각 나타낸다. PEG-PLys20-SH 10%를 사용한 고분자 미셀 복합체에서는 PEG-PLys69-SH 12%를 사용한 고분자 미셀 복합체의 코어보다 명백히 작은 코어가 2개 페어가 되어 있었다. PEG-PLys20-SH 10%를 사용한 편이 PEG-PLys69-SH 12%를 사용한 것보다 명백히 쉘의 PEG 밀도는 높다. 이들 결과로부터 PEG-PLys20-SH 10%를 사용한 고분자 미셀 복합체에서는 pCAG-Luc 유래의 2개의 1개쇄 DNA가 각각 별개로 응축해서 페어로 되어 있는 것으로 추찰된다. 페어가 되어 있었던 것은 열처리 후에도 DNA쇄끼리가 얽혀있는 점에서 응축 후에도 완전하게는 멀어질 수 없기 때문일 것이다. 즉, PEG-PLys69-SH 12%를 사용한 고분자 미셀 복합체에서는 pCAG-Luc 유래의 2개의 1개쇄 DNA가 1개의 코어에 포함되어 있는 것으로 여겨진다.
[실시예 6]
양이온성 고분자쇄 블록끼리의 가교의 유무에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형태에 대한 영향을 조사했다.
실시예 3의 (1)과 마찬가지로 해서 중합도가 21인 PEG-PLys와, 중합도가 21이며, 또한 PDP기의 치환도 12%인 PEG-PLys-PDP를 제조했다. PEG-PLys-PDP의 블록 공중합체는 DNA와 결합시켜서 고분자 미셀 복합체를 형성하기 전에 미리 PDP기에 대해서 3배의 농도가 되도록 DTT를 첨가해서 15분간 교반하고, PDP기를 티올 잔기로 환원해 두었다.
이어서, 실시예 3의 (2), (3)과 마찬가지로 해서 이들 블록 공중합체 용액에 플라스미드 pCAG-Luc2 용액을 혼합하고, pCAG-Luc2를 내포한 PEG-PLys의 고분자 미셀 복합체(이하, 「MCPM-6」)와, pCAG-Luc2를 내포하고, 가교를 행한 PEG-PLys-PDP의 고분자 미셀 복합체(이하, 「MCPM-6-CL」)를 형성했다.
얻어진 고분자 미셀 복합체에 대해서 참고예 1의 (6)과 마찬가지로 해서 TEM 화상을 촬상했다. 도 12에 PEG-PLys를 사용한 고분자 미셀 복합체(MCPM-6)의 TEM 화상(좌)과, PEG-PLys-PDP를 사용한 고분자 미셀 복합체(MCPM-6-CL)의 TEM 화상(우)을 각각 나타낸다. 또한, 상기 화상으로부터 산출된 고분자 미셀 복합체의 장축 길이의 분포를 도 13에 각각 나타낸다. 이 결과, 가교의 유무에 의한 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 형태의 차이는 확인되지 않고, 가교는 고분자 미셀 복합체의 코어 부분의 형태에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다.
[실시예 7]
핵산 변성 온도에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 크기 및 형태에 대한 영향을 조사했다.
실시예 6과 마찬가지로 해서 중합도가 21인 PEG-PLys를 제조했다.
이어서, 선상 DNA 용액의 가열 처리를 25℃, 70℃, 80℃ 또는 95℃에서 10분간 행한 이외에는 실시예 6과 마찬가지로 해서 pCAG-Luc2를 내포한 PEG-PLys의 고분자 미셀 복합체를 형성했다.
얻어진 고분자 미셀 복합체에 대해서 참고예 1의 (6)과 마찬가지로 해서 TEM 화상을 촬상하고, 얻어진 화상으로부터 산출된 고분자 미셀 복합체의 장축 길이 및 애스펙트비에 의거하는 분포를 조사했다. 결과를 도 14에 나타낸다. 이 결과, 실온 이상의 온도(70℃ 이상)에서 가열 처리를 행함으로써 장축 길이, 애스펙트비가 모두 작아지고, 또한 고분자 미셀 복합체 사이의 분산도 작아지는 것을 알 수 있었다. 특히, 95℃에서 가열 처리를 행함으로써 소입경이며, 또한 소분산의 고분자 미셀 복합체 집단을 얻을 수 있는 것을 알 수 있었다.
[실시예 8]
핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 사용한 배양 세포주로의 유전자 도입에 대해서 조사했다.
우선, 인간 췌장암 선암 유래의 세포주 BxPC-3를 24웰 플레이트를 사용해서 12000cells/웰(400㎕/웰의 배양액 중 3×104cells/㎖)로 액체 배양했다. 배지는 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 5% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI-1640을 사용했다. 37℃에서 24시간 배양한 후, 실시예 3(1)과 마찬가지로 해서 얻은 PEG-PLys72(PLys 블록의 중합도: 72)의 고분자 미셀 복합체(이하, 「MCPM-8」) 용액 또는 PEG-PLys69-SH 12%의 가교화한 고분자 미셀 복합체(이하, 「MCPM-8-CL」) 용액 30㎕(33ng/㎕)를 사용해서 각 샘플 6예씩 트랜스펙션했다. 컨트롤에는 HEPES를 사용했다.
24시간 후에 배지 교환을 행한 후 3일간 배양했다. 그 후에 PBS 용액으로 3회 워싱하고, 150㎕의 passive lysis buffer를 사용해서 회수했다. 용해물 40㎕를 사용해서 GloMax™ 96 Microplate Luminomater에 의해 루시페라아제 유전자의 발현을 백 그라운드를 뺀 형광 강도로 정량했다. 결과를 도 15에 나타낸다.
이 결과로부터 본 발명의 고분자 미셀 복합체는 가교의 유무에 상관없이 인간 배양 세포주에 도입되는 것 및 상기 고분자 미셀 복합체가 함유하는 유전자는 인간 배양 세포주에 있어서 발현되는 것을 알 수 있었다.
[실시예 9]
(1) PEG-PLys-PDP
실시예 4의 (1)과 마찬가지로 해서 중합도가 21이며, 또한 PDP기의 치환도 12%의 PEG-PLys-PDP를 제조했다. PEG-PLys-PDP의 블록 공중합체는 DNA와 결합시켜서 고분자 미셀 복합체를 형성하기 전에 미리 PDP기에 대해서 3배의 농도가 되도록 DTT를 첨가해서 15분간 교반하고, PDP기를 티올 잔기로 환원해 두었다.
(2) pCAG-sFlt-1을 변성해서 내포한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 형성
플라스미드 pCAGGS(Riken gene bank로부터 공급)에 sFlt-1 유전자를 장착하여 플라스미드 pCAG-sFlt-1을 제작했다. sFlt-1 유전자는 혈관 신생에 관한 혈관 내피 세포 증식 인자 수용체(VEGFR)와 길항함으로써 혈관 신생을 저해하고, 항종양 효과를 갖는 것으로 여겨지는 유전자이다. 얻어진 pCAG-sFlt-1을 제한 효소 처리하고, 1개소 소화해서 선상으로 했다. 이 선상 DNA를 포함하는 DNA 용액을 95℃에서 10분간 가열 처리하고, 선상화한 pCAG-sFlt-1을 1개쇄로 변성시켰다.
상기 (1)에서 제조한 PEG-PLys-PDP 용액에 1개쇄로 변성시킨 선상 pCAG-sFlt-1 용액을 N/P비가 2가 되도록 빠르게 혼합함으로써 1분자의 플라스미드 pCAG-sFlt-1 유래의 2개의 선상의 1개쇄 DNA를 내포한 PEG-PLys-PDP의 고분자 미셀 복합체(이하, 「MCPM-9-sFlt1-PDP」)를 형성했다. 반응 용매는 10mM HEPES 버퍼(pH7.3)로 하고, 반응 용액 중의 pDNA 농도는 100ng/㎕로 했다.
이어서, 실시예 3의 (3)과 마찬가지로 해서 형성된 MCPM-9-sFlt1-PDP를 포함하는 반응 용액을 3일간 투석하고, 상기 고분자 미셀 복합체 중의 티올을 SS 결합에 산화하여 가교시켰다. 가교화해서 얻어진 것을 MCPM-9-sFlt1-CL로 했다.
컨트롤로서 pCAG-sFlt-1을 가열 처리에 의해 변성시키지 않은 이외는 상기 (2)와 마찬가지로 해서 얻어진 고분자 미셀 복합체(이하, 「PM-9-sFlt1-CL」) 및 sFlt-1 유전자 대신에 참고예 1과 마찬가지의 방법에 의해 Luc2 유전자를 장착한 이외에는 상기 (2)와 마찬가지로 해서 얻어진 고분자 미셀 복합체(이하, 「MCPM-9-Luc2-CL」)를 형성했다.
(3) 췌장암 모델 마우스로의 전신 투여
실시예 3의 (6)과 동종의 췌장암 모델 마우스에 대해서 상기 (2)에서 제조한 3종의 고분자 미셀 복합체 중 어느 하나, 또는 HEPES를 2일 간격으로 계 3회(0일째, 3일째, 6일째) 200㎕씩(플라스미드 또는 pDNA 농도: 100ng/㎕) 각각 꼬리 정맥으로부터 주입했다.
마우스의 췌장암의 체적을 22일간 측정한 결과를 도 16에 나타낸다. 이 결과로부터 「MCPM-9-Flt1-CL」을 투여함으로써 마우스에 있어서의 종양 증식이 효과적으로 억제되는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 입자 지름이 작고, 또한 상기 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 쉘을 구성하는 비전하성 친수성 고분자쇄 블록의 밀도도 높기 때문에 혈중 체류성, 종양 혈관 투과성 및 종양 조직 침투성이 우수하다. 이 때문에 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 경정맥 투여 등의 전신 투여에 의해 내포하는 DNA를 암 조직 심부에까지 효율적으로 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체는 한정되는 것이 아니지만, 치료용 유전자를 표적 세포로 송달하기 위한 유전자 캐리어로서 매우 유용하다. 제약 또는 의료 산업에서 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 의해 혈관 투과성이 낮은 난치성 암으로의 전신 투여에 의한 유전자 치료도 가능해질 것으로 기대된다.

Claims (15)

  1. 비전하성 친수성 고분자쇄 블록 및 양이온성 고분자쇄 블록을 포함하는 블록 공중합체와, 1000염기 길이 이상의 서로 상보적인 염기 서열로 이루어지는 2개의 1개쇄 DNA, 적어도 2중 나선 구조의 일부가 해리되어서 1개쇄 구조로 되어 있는 1000염기쌍 길이 이상의 2개쇄 DNA 또는 1000염기 길이 이상의 1개의 1개쇄 DNA로 형성되어서 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    비전하성 친수성 고분자쇄 블록 및 양이온성 고분자쇄 블록을 포함하는 블록 공중합체와, 1000염기 길이 이상의 서로 상보적인 염기 서열로 이루어지는 2개의 1개쇄 DNA 또는 적어도 2중 나선 구조의 일부가 해리되어서 1개쇄 구조로 되어 있는 1000염기쌍 길이 이상의 2개쇄 DNA로 형성되어서 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 1개쇄 DNA는 2000염기 길이 이상이며, 상기 2개쇄 DNA는 2000염기쌍 길이 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    수성 매체 중의 동적 광산란법에 의한 평균 입자 지름이 100㎚ 이하인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    DNA와, 정전적 상호 작용에 의해 DNA와 결합한 양이온성 고분자쇄 블록이 코어 부분을 형성하고, 비전하성 친수성 고분자쇄 블록이 쉘 부분을 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 코어 부분의 평균 입자 지름은 50㎚ 이하인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    구체형상인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 1개쇄 DNA 또는 상기 2개쇄 DNA는 선상인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 블록 공중합체의 적어도 일부는 서로 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양이온성 고분자쇄 블록의 주쇄 또는 측쇄에 소수성기가 공유 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양이온성 고분자쇄 블록의 측쇄에 에틸아민 구조 또는 프로필아민 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체.
  12. DNA를 수용한 핵산 내포 고분자 미셀 복합체를 제조하는 방법으로서,
    비전하성 친수성 고분자쇄 블록 및 양이온성 고분자쇄 블록을 포함하는 블록 공중합체와, 2중 나선 구조의 적어도 일부를 해리시킨 상태의 1000염기쌍 이상의 2개쇄 DNA를 수성 매체 중에서 혼합하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 제조 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 2개쇄 DNA는 2000염기쌍 길이 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 제조 방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    상기 2개쇄 DNA는 선상인 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 제조 방법.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 2개쇄 DNA는 60℃ 이상에서 변성된 것을 특징으로 하는 핵산 내포 고분자 미셀 복합체의 제조 방법.
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