WO2009113645A1

WO2009113645A1 - 非荷電性親水性ブロック及び側鎖の一部に疎水性基が導入されカチオン性のポリアミノ酸ブロックを含んでなる共重合体、その使用

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Publication number: WO2009113645A1
Application number: PCT/JP2009/054824
Authority: WO
Inventors: 片岡　一則; 西山　伸宏; 篤史石井; 加藤　泰己; 完ニ郎宮田; ヒョンジンキム; 宏康武元
Original assignee: 国立大学法人東京大学
Priority date: 2008-03-10
Filing date: 2009-03-06
Publication date: 2009-09-17
Also published as: EP2272897A1; AU2009224286B2; WO2009113645A8; AU2009224286A1; US8431545B2; JPWO2009113645A1; CA2718003A1; TWI459968B; JP5467366B2; CN101970541B; CN101970541A; EP2272897A4; KR20100138910A; CA2718003C; TW200948384A; KR101564796B1; US20110052917A1; EP2272897B1

Abstract

本発明は、非荷電性親水性ポリマー鎖ブロック及びカチオン性ポリアミノ酸鎖ブロックを含んでなるブロック共重合体を開示する。該共重合体は、親水性ポリマー鎖ブロックが該ポリアミノ酸鎖ブロックの主鎖のいずれか一方の末端に共有結合を介して結合しており、かつ、該ポリアミノ酸鎖ブロックにおけるアミノ酸反復単位１０パーセント以上から７０パーセント以下の側鎖に疎水性基が共有結合を介して結合している。該共重合体は小分子核酸であるｓｉＲＮＡとも生理的条件下で安定な会合体を提供する。

Description

明細書非荷電性親水性ブロック及び側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性のポリアミノ酸ブロックを含んでなる共重合体、その使用技術分野

本発明は、親水性ポリマー鎖ブロックと、側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリアミノ酸鎖ブロックを含んでなるブロック共重合体ならぴに該共重合体と核酸分子から形成される複合体、特にミセル型粒子に関する。背景技術

sma l l interferring RNA ( si RNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチドを始めとする生理活性を有する核酸医薬は、癌やウィルス性疾患等に対する次世代の治療薬として期待されている。しかし、これらの核酸は本質的に生体内で不安定であり、生体利用効率の低さから現在のところ実用的な用途は限定されている。核酸医薬をより幅広い疾患の治療に応用するためには、全身投与を可能とする効率的で安全な核酸デリバリーシステムが必要である（下記の非特許文献 1及び 2参照）。ウィルスベクターは高効率で核酸を標的部位にデリバリ一できることが知られているが、免疫原性、発癌性等により臨床上の利用は制限されている（下記の非特許文献 3及び 4参照）。そのため、カチオン性のポリマーゃカチオン性脂質から構成される非ウィルスベクターに注目が集まっている（下記の非特許文献 5及び 6参照）。

カチオン性ポリマーは静電的相互作用により核酸と複合体を形成するが、それだけでは標的に効率よくデリバリーできる粒子径の制御及び血中での安定性に問題があるため、カチオン性ポリマーにポリエチレングリコール（PEG)などの生体親和性の高い水溶性高分子を結合させる方法が提案されている（下記の特許文献 1、特許文献 2、特許文献 3、非特許文献 7及び 8参照）。これらの複合体は PEGからなる親水性のシェルと核酸の結合したコアを有するコア一シエル型の粒子となるため粒子径の制御は可能となるが、静脈投与した場合には速やかに血中から除去されてしまうことが報告されており（下記の非特許文献 9及び 1 0参照）、さらなる安定化が望まれる。

概説すれば、特許文献 1は、例えば荷電性分子である DNAの標的デリバリ一用担体として親水性セグメントおよび荷電性セグメントを含むブロック共重合体を記載しているが、該共重合体から形成された核酸複合体は上述したような血中での安定性に問題がある場合がある。特許文献 2では、かような問題点を改善すること、具体的には、水性媒体中での該ブロック共重合体の複数分子から形成される高分子ミセルを安定化すること等を目的として該重合体分子間にジスルフイド架橋が形成されるようにメルカプト基が該ブロック共重合体の荷電性セグメント中に導入されている。また、特許文献 3では、例えば、ポリ一 L— リシンの側鎖の ε—アミノ基を介して親水性基としての PEG鎖および疎水性基としてのパルミトイル基を導入したグラフト重合体が提供されている。

他方、一方の末端に P EG鎖を導入したカチオン性ポリマー（例えば、 PEGィ匕ポリ（N—メチルジェタンアミンセバゲート））に対し、側鎖として疎水性基であるコレステロールをグラフトして、ポリマーミセルを安定化する方法が提案されている（下記の非特許文献 1 1参照）。この文献では血中滞留性の評価は報告されていないが、疎水基の導入により粒子はある程度安定化されたと考えられる。し力、し、このポリマーの調製には過酷な条件（1 20°C、 24時間）を用いる必要があり、ポリマーの分解が生じることから、ポリマーの分子量及び PEG、コレステロールの導入率を安定に制御することは困難と考えられる。また、この方法では pH 4. 6という酸性条件において核酸との複合体を調製する必要があるが、そのような酸性条件では DNAは不安定である（下記の非特許文献 1 2参照）。これらの点で、このポリマーを使う場合には製剤化に問題が生じる可能性がある。さらに、該文献で用いられている PEGは分子量が最大で 2000であり、またポリマー中の PEG含量は 1 . 8〜8. 2 %である。この条件では親水性シェルの形成は不十分と考えられ、 DNAとの複合体の粒子径は 2 OOnm以上と大きまた粒子のゼ一タ電位はコアの性質を反映して負または正の値を示している。このような性質は高い血中滞留性を実現するための障害となる（当該技術分野に関するその他の情報も含めて下記の非特許文献 6及び 13〜17参照）。引用文献の一覧：

特許文献 1 : 特開平 8— 188541号公報

特許文献 2: 特開 2001- 146556号公報

特許文献 3: WO 99/61512

非特許文献 1： C. D. Novina, et al.， Nature, 2004, 430, 161-164.

非特許文献 2: W. Pun, et al.， Journal of Cellular Biochemistry, 2006, 98， 14-35.

特許文献 3: . G. Crystal, et al.， Science, 1995, 270, 404-410.

非特許文献 4: S. K. Tripathy, et al.， Nature Medicine, 1996 2, 545-550. 特許文献 5: A. de Fougerolles, et al" Nature Review Drug Discovery, 2007, 6, 443-453.

非特許文献 6: S. Akhtar, et aに Journal of Clinical Investigation, 2007, 117, 3623 - 3632,

非特許文献 7: R. M. Schiffelers, et aに ucleic Acids Research, 2004, 32, e149.

特許文献 8: S. Hu-Lieskovan, et al., Cancer Research, 2005, 65, 8984-8992.

特許文献 9 : H. K. de Wolf, et al., International Journal of Pharmaceutics, 2007, 331， 167-175.

ί寺言午文献 10: J. D. Heidel, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007， 104, 5715— 5721.

非特許文献 11 : Υ· Wang， et al" Biomaterials, 2007, 28， 5358- 5368.

非特許文献 12: E. Walter, et al., Journal of Controlled Release, 1999, 61, 361-374.

特許文献" 13: C. Nicolazzi, et al., Journal of Controlled Release, 2003, 88， 429-443. Pui/J ^uua/uo4o24

非特許文献 14: B. Thompson, et al" Bioconjugate Chemistry, 2005， 16, 608-614.

非特許文献 15: D. Oupicky, et al., Gene Therapy, 2001, 8， 713 - 724.

非特許文献 16: Y. Takakura, et al" International Journal of

Pharmaceutics, 1994, 105, 19一 29.

T寺言午文献 17: Y. Yamasaki, et al., Journal of Pharmacology and

Experimental Therapeutics, 2002, 301, 467-477. 発明の開示

上述したとおり、核酸のベクターとして、ウィルスベクター以外について、今日でも、多種多様な開発研究または取り組みがなされている。し力、し、医療用の材料として有利に使用でき、しかも効率よく標的に核酸をデリバリーできるべクターまたは担体に対するニーズは未だ存在する。例えば、非特許文献 11に記載された PEG化ポリ（N—メチルジェタンアミンセバケ一卜）一 co— ((コレステ

リルォキソカルボニルアミドエチル）メチルビス（エチレン）アンモニゥムブロミドセ

バケー卜））はそれらから形成されるミセル型粒子が一定の安定性を有することが記載されているものの、医薬用材料に要求される材料の均質性、また、医薬それ自体の均質性を確立することが容易にできる系を提供するとの観点からは、さらなる改良が望まれるであろう。

本発明者等の一部は、上記の特許文献 2に記載されているとおり、ブロック共重合体から形成される高分子ミセル（またはミセル型粒子）の安定化が該共重合体分子間にジスルフイド架橋を形成（共有結合を形成）することにより飛躍的に向上できることを明らかにした。しかし、材料の多様性を図るベさらなる異なる核酸デリバリー用の材料を探索してきた。

その結果、特許文献 2に記載された非荷電性親水性ポリマー鎖ブロック及びカチオン性ポリアミノ酸鎖ブロックを含んでなるブロック共重合体は、非特許文献 11に記載された共重合体とは本質的に構造を異にするが、ポリアミノ酸反復単位（ユニット）の側鎖の一部に疎水性基を導入して修飾したブロック共重合体は、前記のブロック共重合体分子のポリマー主鎖間をジスルフイド結合した場合以上の利点を高分子ミセルに付与し得ることを見出した。

こうして、本願発明では、非荷電性親水性ポリマ一鎖ブロック及びカチオン性ポリアミノ酸鎖ブロックを含んでなるブロック共重合体であって、親水性ポリマー鎖ブロックが該ポリアミノ酸鎖ブロックの主鎖のいずれか一方の末端に共有結合を介して結合しており、かつ、該ポリアミノ酸鎖ブロックにおけるアミノ酸単位の 10パーセント以上 70パーセント以下の側鎖に疎水性基が共有結合を介して結合している、上記ブロック共重合体が提供される。

また、本願発明は、かような共重合体と核酸の複合体も提供する。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 2で合成された PPLC1の 'Η NMRスペクトラムである。なお、図中 aはポリエチレングリコールのメチレン基由来のピークであり、 bはコレステロール基中のメチル基由来のピークである。

図 2は、実施例 2で合成された PPLS1の ¹ H NMRスペクトラムである。なお、図中 aはポリエチレングリコールのメチレン基由来のピークであり、 bはステア口ィル基中のメチル基由来のピークである。

図 3は、 PPLC1〜PPLC4及び PEG— P(Lys)の各ポリマーと siRNAを用い、各 NZ P比において形成させた粒子溶液の電気泳動の結果得られた写真である（但し、 NZP比 0とは、 siRNAのみを泳動したレーンを指す。）。

図 4は、動的光散乱法により測定した PPLC1〜PPLC4及び PEG— P(Lys) の各ポリマーと siRNAからなる会合体の多分散度（PDI)を示すグラフである。図 5は、動的光散乱法により測定した PPLC1〜PPLC4及び PEG-P (し ys) の各ポリマーと siRNAからなる会合体のキュ厶ラント粒径（diameter)を示すグラフである。

図 6は、動的光散乱法により測定した、 PPLC2を用い siRNAと NZP比 6で形成させた粒子の粒子径分布のヒストグラムである。

図 7は、 PPLC2と siRNAからなる会合体のゼータ電位（zeta potential)の測定結果を示すグラフである。 _{r n n n} .

図 8は、 PPLC2を用し \NZPJ;匕 1. 5〜10で調製した粒子、 PPLS1を用 Ι Ν

比 6で調製した粒子及び粒子化していない siRNA (naked)の投与後 1時間における血中滞留性を評価した結果を示すグラフである。

図 9は、 PPLC1〜4及び PEG— PLysを用い、 N/P比 6で調製した粒子及ぴ粒子化していない siRNA(naked)の、投与後 2時間における血中滞留性を評価した結果を示すグラフである。

図 10は、 PPLZを用い NZP比 8で調製した粒子、 PPし Zbを用し、 NZP比 8で調製した粒子及び粒子化していない siRNA(naked)の投与後 2時間における血中滞留性を評価した結果を示すグラフである。

図 11は、 PPLC2を用い NZP比 6で調製した粒子及び粒子化していない siR NA (naked)の、投与後 15分〜 4時間までの血中滞留性を評価した結果を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

本発明について使用する用語または技術用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で使用されている通常の意味を有するものと理解される。

非荷電性親水性ポリマー鎖ブロックは、ポリエチレングリコール（またはポリ (ォキシエチレン)からなる水溶性ポリマ一由来である。ポリアミノ酸鎖ブロックがポリリシン、ポリオル二チン、ポリアルギニン、ポリホモアルギニン又はポリヒスチジンからなる群より選ばれるポリマー由来であることができる。かかる非荷電性親水性ポリマー鎖ブロックの分子量は、ブロック共重合体が薬物内包高分子ミセルを形成できる限り、限定できるものでないが、約 2500〜200， OOODa、好ましくは 5, 000〜20, OOODa、より $子ましくは 8, 000〜15, OOODaであり、才キシエチレンの反復単位の数では、 55〜4， 500の整数であり、好ましくは 110 〜450、より好ましくは 180〜340の整数である。

ブロック共重合体のもう一方のブロックであるポリアミノ酸鎖ブロックは、ポリリシン、ポリオル二チン、ポリアルギニン、ポリホモアルギニン又はポリヒスチジンからなる群より選ばれるポリマ一由来の反復単位を含んでなるか、または該反復単位からなることができる。これらのブロックは該反復単位が 10〜 100の整数にあり、好ましくは 20〜80の整数にあり、より好ましくは 20〜60の整数にある。このポリアミノ酸鎖ブロックのアミノ酸残基のうち、全反復単位数（nで表される整数）の 1 00/ &〜 70 %に相当する数のアミノ酸残基は、疎水性基をその側鎖に担持する。疎水性基を担持するアミノ酸残基は、ポリアミノ酸ブロック中にどのように配置されていても良例えば無秩序またはランダムに配置されている場合、およびブロックとして配置されている場合（すなわち、ポリエチレングリコールブロックと、疎水基を担持するポリアミノ酸からなるブロックと、疎水基を担持しないポリアミノ酸からなるブロックがトリブロックを形成する場合）が挙げられる。疎水性基としては、ステロール誘導体の残基または C₄_₂₄ヒドロカルビル基が挙げられる。ステロールとは、シクロペンタノンヒドロフエナントレン環（C _{1 7} H ₂ ₈)をベースとする天然、半合成または合成の化合物を意味し、例えば、天然のステロールとしては、限定されるものではないが、コレステロール、コレスタノ一ル、ジヒドロコレステロール、コール酸等が挙げられ、その半合成または合成の化合物としては、これら天然物の例えば、合成前駆体（必要により、存在する場合には、一定の官能基、ヒドロキシ基の一部もしくは全部が当該技術分野で既知のヒドロキシ保護基により保護されている力、、またはカルボキシル基がカルボキシル保護により保護されている化合物を包含する）であることができる。また、ステロール誘導体とは、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲内で、シクロペンタノンヒドロフエナントレン環に 2アルキル基、ハロゲン原子、例えば、塩素、臭素、フッ素、が導入されていてもよぐ該環系は飽和、部分不飽和、であることができること等を意味する。ステロール誘導体の残基は、好ましくは、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロキシコレステロールの 3位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。さらに好ましくは、コレステロール 3位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。 C₄_₂₄ヒドロカルビル基に言う、ヒドロカルビルとは、炭素原子と水素原子からなり、直鎖もしくは分岐の C₄_₂₄、好ましくは C_{1 2}-₂₄アルキル、直鎖もしま分岐の C_{4 24}、好ましくは C_{1 2}_₂₄アルケニル、直鎖もしくは分岐の C₄_₂₄、好ましくは C_{1 2}_₂₄アルキニル、 C₄_₂₄、好ましくは ₂_₂₄の籠状化合物、例えば、ァダマンチル等、およびァリールアルキルで、ァリールがフエニルまたはナフチルであり、アルキルが Gj-Gsであるもの、例えば、ベンジル基等を挙げることができるが、好ましくは、直鎖もしくは分岐 c₄— ₂₀、より好ましくは c₁₂一 ₂。アルキル、直鎖もしくは分岐の c₄_₂₀、好ましくは c₁₂_₂₀アルケニル、およびべンジル基である。なお、上述のアルケニル及びアルキニル基には複数の不飽和結合が含まれていても良い。

このような、ブロック共重合体のより具体的なものとしては、一般式 I又は Π

A-(OCH₂CH₂)_m— L- (C

(I)

A-(OCH₂CH₂)_m—L'— -Z

(ID で表される共重合体を挙げることができる。

上式中、式中、 Aは水素原子、または式 ( R₂) CH ( CH₂) _q—で表される基を表し、及び R₂は独立して水素原子、アルコキシ基、ァリールォキシ基、ァリールォキシ基、シァノ基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ力ルポ二ル基、 C₂— ₇ァシルアミド基、トリ— アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示す力、、またはおよび R₂は一緖になって一 ₃アルキル基で置換されていているかもしくは未置換のエチレンジォキシまたはプロピレンジォキシ基を表し、またはおよび R₂はそれらが結合している = CH—基と一緒になってホルミル基を表し、

qは 0〜1 0の整数を表し、 Lは一（CH₂)rNH―、一 NHCH₂CH₂NH―、一NHCH₂GH₂CH₂NH—または一 COCH₂CH₂— NH—を表し、但し、 rは 0〜5の整数を表し、

L'は、一 CO―、 -OCO- (CH₂)r'― CO—および一 NHCO— (CH₂)r，一 C O—を表し、但し、 r'は 1〜5の整数を表し、

Bは一 NH—、一 NHCOO—、一 NHCO—または式 IHで表される置換基を介して結合するステロール誘導体残基または C₄—₂₄tドロカルビル基を表し、

(III)

Qは NH₂、― NHC( = NH)NH₂または式 IVで表される置換基を表し、

(IV)

Zは水素原子、 c₂_₁₂アルキルカルボニル基、 c₃— ₁₂アルケニルカルボニル基、 c₃— ₁₂アルケニルカルボニル基、ァリールカルボニル基、ァリールォキシカルボニル基、ァリールカルボニル基または Bについて規定する基であり、

Z'は一 NH— R₃を表し、但し、 R₃は未置換または置換された直鎖もしくは分枝の C^- アルキル基であり、

mは 55〜5， 000の整数を表し、

nは 10~100の整数を表し、

pは 1、 3または 4の整数を表し、 xはポリアミノ酸鎖ブロックに含有される置換基 Qを有するユニットの数、 yはポリアミノ酸鎖ブロックに含有される置換基 Bを有するユニットの数であるが、 x+y=nであり、 yは nの 1 0パ一セント以上 70パーセント以下までを占める整数であ。上式中の — _{1 2}アルキル、 ₃アルキル、または本明細書に言うアルキルとしては、それぞれに該当する炭素数を有する、例えば、メチル、ェチル、プロピル、 iso—プロピル、 n—ブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチル、 n—ペンチル、 n —へキサン、 n—ヘプタンデカン、ゥンデシル等の直鎖もしくは分岐のアルキルを挙げることができる。

上式中の Bが水素原子であるブロック共重合体をはじめとする疎水性基を導入する前のブロック共重合体は、一部はそれ自体公知であるか、それ自体公知の方法で製造できる。一般的に、本発明で使用できるブロック共重合体は、それ自体公知のまたは市販されている非荷電性親水性ポリマー鎖を有するポリマー及びカチオン性ポリアミノ酸鎖を有するポリマーをそのまま、または必要により、分子量分布を狭くするように精製した後、それ自体公知の方法によリカップリングして製造することができる。ポリアミノ酸側鎖への疎水性基の導入は、非荷電性親水性ポリマー鎖とのカップリングによるブロック共重合体の製造の前に行っても良ぐまたは後に行っても良い。これらの場合共重合体の構造は —般式 Iまたは IIとなる。別法としては、例えば、非荷電性親水性ポリマー鎖がポリエチレングリコール鎖であり、ポリアミノ酸鎖がリシンまたはオル二チンである場合、前者を例えば、一般式 Iの Aをもたらすことのできる開始剤を用いてァニオンリビング重合を行うことにより製造し、次いで、成長末端側にアミノ基を導入し、そのアミノ末端から、 Nど一 TFA— L—リシン、 Nど一 Z—し一リシン、 N S— Z— L—オル二チン、 1—ベンジル一 L—ヒスチジン、 N 5， N OJ—ジ一Z— L 一アルギニン等の保護されたアミノ酸の Ν—力ルボン酸無水物（NCA)を重合させてブロック共重合体を合成し、次いで、ポリアミノ酸側鎖に疎水性基を導入することにより、本発明のブロック共重合体を提供できる。この場合共重合体の . _n ι

構造は一般式 Iとなる。また、必要により、かような側鎖基の導入と同時に一

般式 Iの Z基として、水素原子以外に該側鎖基と同一の基を導入してもよい。

また、 Zが水素原子、該側鎖基以外の基である場合には、対応する酸無水物等を反応体として用いて、それ自体公知の縮合反応により目的とする基を z基として導入することができる。上記式中の Qは NH₂、一 NHC ( = NH) NH₂または式 IIIで表される置換基を

示すが、これらは同一の分子中で混在して存在していても良い。

(III) 上記式中の Qに一 C ( == NH) NH₂で表される置換基を導入する方法としては、例えば、ブロック共重合体中のリシン及びオルチニン残基の側鎖に存在するァ

ミノ ίこメ寸し 3， 5— Di methyl— 1— pyrazolyけ ormaminiai um

応させる方法や、水酸化アンモニゥム等の塩基存在下で O—メチルイソ尿素を反応させる方法を用いることができる。これらの反応は、 Bに疎水基を導入する前、導入した後のいずれにおいても行うことができる。こうして提供できる本発明のブロック共重合体は、カチオン荷電性基を有するため、例えば、ァニオン荷電性化合物、核酸またはァニオン荷電性薬物とィォンコンプレックスを形成することができる。このようなイオンコンプレックは水性媒体中で、自律的に会合してミセル、所謂、高分子ミセルを形成することができる。

力、ようなミセルは、コア部に核酸または薬物を内包し、シェル部として非荷電性親水性ポリマー鎖を有するコア一シェル型構造であることができる。ブロック共

重合体には、必要により、一般式 Iで示されるブロック共重合体の F^ F^CH— で示される特定の官能基、例えば、ホルミル基、アミノ基もしくはカルボキシル基を介し、必要に応じて活性エステル基、マレイミド基等を有する結合基を導入した後に、特定の受容体タンパク質等に対するリガンドまたは抗体（その断片： F ( ab ' ) 2、 F ( ab)等）を結合して、当該ミセルに標的指向性を付与してもよし、。

上記イオンコンプレックスを生成することのできる核酸または薬物は安定性が向上するものであれば何ら制限されることなく使用できる。し力、し、好ましくは核酸を使用できるので、説明を簡潔にする目的で、以下では、核酸について説明する。本発明にいう核酸は、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味し、ォリゴもしくはポリ二本鎖 RNA、オリゴもしくはポリ二本鎖 DNA、オリゴもしくはポリー本鎖 D N Aおよびオリゴもしくはポリ一本鎖 R N Aを挙げることができ、また同一の鎖に RNAと DNAが混在したオリゴもしくはポリ 2本鎖核酸、オリゴもしくはポリ 1本鎖核酸も含まれる。また核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であつても、化学修飾された非天然型のものであっても良く、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであっても良い。限定されるものでなし、力《、該核酸は、 4 - 20, 000塩基、好ましくは 1 0〜"！ 0， 000塩基、さらに好ましくは 1 8〜30塩基からなるものであることができる。また、機能もしくは作用を考慮すると、プラスミド D NA、 si RNA、 m i cro RNA、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アブタマ一およぴリボザィムを挙げることができる。 si RNAは標的とする遺伝子またはポリヌクレオチドに対し、公知の方法で設計されたすベてのものを用いることができる。 siRNAは長さがヌクレオチド約 1 8〜30個にある一本鎖もしくは二本鎖のいずれかであることができ、当該技術分野で公知の化合物、また、それらと同様な作用または機能を有するすべてのヌクレオチドを包含する。限定されるものでないが、 si RNAの具体例は、遺伝子療法の対象となりうる遺伝子を参照して設計することができる。このような遺伝子としては、限定されるものでないが、非小細胞肺癌等に関係のある PKCひ、悪性黒色腫等に関係のある BCL— 2、クローン病に関係のある ICAM— 1、 C型肝炎に関係のある H CV、関節リュウマチもしくは乾癬に関係のある TN F 、喘息に関係のあるアデノシン AI受容体、卵巣癌等に関係のある c— raf ki n a se、塍臓癌等に関係のある H— ras、冠動脈疾患に関係のある c一 myc、大腸癌に関係のある P KA Ria、エイズに関係のある HIV、固形癌に関係のある DNAメチルトランスフエラーゼ、癌に関係のある VEGF受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、 CMV性網膜炎に関係のある CMV IE2、前立腺癌に関係のある MM P— 9、悪性グリオ一マに関係のある TGF jS 2、多発性硬化症に関係のある CD49d、糖尿病に関係のある PTP— 1 B、癌に関係のある c一 myb、乳癌等に関係のある EGFR、癌に関係のある mdrl、 autotaxin及び GLUT— 1の遺伝子を挙がることができる。

アンチセンス核酸も当該術分野で公知ものまたはそれらと同様の機能または作用を有するすべてのものを用いることができる。かような機能は、 mRNAに対してハイブリッドを形成し、二本鎖分子を形成して遺伝子の翻訳を阻害する。他方、リボザィ厶は、 DNA制限エンドヌクレアーゼ卜同様内その他の一本鎖 RN Aを特異的に分解できる能力を有する RNA分子を意味する。本発明のブロック共重合体と核酸との複合体を形成させる方法としては、ブロック共重合体および核酸が溶解した極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の含有率を低下させる方法を用いることができる。該極性有機溶媒としては、限定されるものではないが、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルァセトアミド、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ァセトニトリル、アセトン、メチルェチルケトン、 1—プロパノール、 2—プロパノール、 1—ブタノ一ル、 2—メチル一1—プロパノール、 2—ブタノ一ル、 2—メチルー 2—プロパノ一ル、亍トラヒドロフラン、ジォキサンからなる群より、 1又は複数を用いることができる。極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の含有率を低下させる方法としては、限定されるものではないが、透析又は留去による方法や、水溶液で希釈した後、必要に応じて限外ろ過等の方法により濃縮する方法などが挙【ザられる。本発明の複合体を形成させる際のブロック共重合体と核酸は、 [ブロック共重合体中のカチオン残基のモル濃度] Z [核酸中のリン酸基のモル濃度]で定義される NZ P比力 1〜50となるように混合されることが好ましより好ましくは 2〜20の場合であり、さらに好ましくは 4〜1 0の場合である。ここで、ブロック共重合体中のカチオン残基のモル濃度とは、ブロック共重合体中のポリアミノ酸鎖ブロックに含有される、リシン残基のモル数、オル二チン残基のモル数、ァルギニン残基のモル数、ホモアルギニン残基のモル数及びヒスチジン残基のモル数、リシン又はオル二チン残基に疎水性基が結合し、結合によリニ級ァミノ基が生成する場合には該疎水性基が結合したリシン又はオル二チン残基のモル数、ヒスチジン残基に疎水性基が結合している場合には該疎水性基が結合したヒスチジン残基のモル数、の総和として算出することができる。例えば、プロック共重合体が一般式 I又は Πで表される場合のカチオン残基のモル濃度は、 Qにおける NH₂で表される置換基のモル数、一 N HC ( = NH) N H₂で表される置換基のモル数、式 IVで表される置換基のモル数、 Bにおける一 N H—を介してポリアミノ酸ブロックに結合している疎水性置換基のモル数、 Bにおける式 ΙΠで表される置換基を介してポリアミノ酸ブロックに結合している疎水性置換基のモル数、の総和から算出することができる。

(IV)

(III)

本発明のブロック共重合体と核酸との複合体は、平均粒子径が 1 0〜300n mの粒子であることが好ましいが、より好ましくは平均粒子径が 20nm〜200n mの場合である。本発明のブロック共重合体と核酸との複合体は、ゼータ電位が一 1 0〜1 0m Vであることが好ましい。さらに好ましくは _ 5〜5 mVである。本発明によれば、ブロック共重合体と核酸の複合体は、以下のような特性及び利点を有する。

特性

核酸と緩やかな条件で調製が可能であることから核酸を不安定化することなく安定に生産できる。更に核酸との結合状態は可逆的であることから核酸の化学的構造変化を伴わないため核酸の持つ特性、作用を損なわない。

利点

製造が簡単であるため工業的な生産性に優れているため医療経済上の利点ともなる。生体内などでの安定性が高例えば注射剤として投与された後の有効利用される率が格段に改善されるため投与量の大幅な軽減による医療経済上の改善や効果的な薬理作用の発現が期待される。投与量の低減は、核酸に対する免疫応答の惹起や化学修飾オリゴ核酸による血液凝固系への影響などの副作用の抑制などの観点でも有用である。以下、具体例を挙げて本発明をさらに説明するが、これらは本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明をこれらに限定することを意図するものではない。

実施例 1 : ポリエチレングリコール一ポリ（L一リシン）ブロック共重合体の合成及び該重合体へのコレステロール基の導入

( 1 ) Mw (重量平均分子量） 1 2000の α—メトキシ一 ω—アミノポリ（エチレングリコール）（日油株式会社） 1 . 5gをジメチルスルホキシド 22. 5m lに溶解し、 ε—トリフルォロアセチルー L—リシンの N—力ルボン酸無水物（NCA) 1 . 5g n 4 . _{n n} .

(ポリエチレングリコールに対し 45等量）のジメチルスルホキシド溶液 22. 5ml を加え、 35°Cで 48時間反応を行った。こうして得られたポリ（エチレングリコール）一ブロック一ポリ（ ε—トリフルォロアセチルー L—リシン）（PEG— P(Lys

(TFA) ) )をメタノール 300ml、 1 N NaOH30mlに溶解し、 35 で 6時間携拌することによって脱保護を行った。この溶液は、分画分子量 6000~ 8000の再生セルロース製透析チューブ（SpetraZ Por 1、 Spectrum Laboratorie s)を用い、 0. 01 N HCIに対して 3回透析を行うことにより精製した。透析膜

内の溶液を凍結乾燥し、 2. 2gのポリ（エチレングリコール）一ブロック一ポリ（L

一リシン）（PEG— P(Lys) )の塩酸塩を得た。 ¹ H— NM Rによる解析から、 P

(Lys)部分の重合度は 40であった。

(2)コレステロール基の導入（その 1 )

PEG— P (Lys)の塩酸塩 50mgをメタノール 2. 5ml【二溶解し、コレステリルク

ロロホルメート 4, 8mg (リシンユニットに対するモル分率 1 0%)の塩化メチレン溶液 2. 5mlを加え、さらに卜リエチルァミン 30 lを添加した後に室温で 24時間攪拌した。反応溶液をジェチルエーテル溶液 1 50 m Iへ滴下することで、ポリマーを析出させた。このポリマ一を減圧濾過により回収した後、 0· 01 N塩酸水溶液 5ml及びメタノール 5mlを加えて溶解させ、分画分子量 6000— 8000の透析膜を用いて、 500mlの 0. 01 N塩酸水溶液に対し 2時間の透析を 2回行つた。透析外液を 500m lの水に交換し、さらに 2時間透析を行った後に、透析膜内の溶液を凍結乾燥することにより白色固体の目的物である PEG— PLys

(cholesterol)の塩酸塩 38mgを得た（以下、 PPLC 1と称す）。

得られたポリマーの構造は、 ¹ H— NM Rにより分析した（スぺクトラムは図 1参昭）。

NM R用の溶媒としては、メタノール一 d4とクロ口ホルム一dを体積比 1： 1で混合したものを用いた。コレステロール基の導入率は、コレステロール基に由来するメチル基のプロトン（CH₃ : 0. 6ppm)と PEGのメチレン基のプロトン（OCH₂C

H₂ : 3.5ppm)のピークの強度比から算出した。本実施例で得られた P PLC 1では、全リシンユニット中の 1 1 %に対し、コレステロール基が導入されていた。 .„„ ,

PCT;'JP 200S/U54824

実施例 2: ポリエチレングリコール一ポリ（L—リシン）ブロック共重合体へのコ

レステロール基の導入（その 2)

コレステリルクロ口ホルメートの添加量を変えた以外は実施例 2と同様にして

PPLC(2)〜（5)を得た。コレステリルクロ口ホルメートの添加量、リシンユニットに対するコレステリルクロ口ホルメートのモル分率および¹ H— NMRにより分析

したリシンユニットに対するコレステロール基の導入率を表 1に示した。なお、コレステリルクロ口ホルメートをリシンユニットに対し 70%添加した PPLC5は NM

R溶媒に溶解せず、導入量の算出はできなかった。表 1

実施例 3: ポリエチレングリコール一ポリ（L—リシン）ブロック共重合体へのス

テアロイル基の導入

ス亍アリン酸 1. 87gをジクロロメタン 50mlに溶解させ、 N—ヒドロキシスクシ

ンイミド 0. 76g及び 1—ェチルー 3—（3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド塩酸塩 1. 25gを添加し室温で 24時間撹拌した。反応後の溶液に水 100ml

を加え、分液漏斗により分液を行った。得られた有機層は硫酸マグネシウムを加え脱水し、エバポレータ一により濃縮を行った。この溶液を 20倍体積のェタノール中に滴下することで、白色の沈殿が生成した。ろ過により沈殿を回収し、

減圧乾燥を行い N—スクシンイミジルステアレートを得た。 PEG— P(Lys)の塩酸塩 50mgをメタノール 2. 5mlに溶解し、 N—スクシンィミジルステアレー卜 16. 4mg (リシンユニットに対するモル分率 40%)の塩化メチレン溶液 2. 5mlを加え、さらにジイソプロピルェチルァミン 37. 5 lを添加した後に室温で 24時間攪拌した。反応溶液をジェチルエーテル溶液 600 m Iへ滴下することで、ポリマーを析出させた。このポリマーを減圧濾過により回収した後、 0. 01 N塩酸水溶液 5ml及びメタノール 5mlを加えて溶解させ、分画分子量 6000— 8000の透析膜を用いて 0. 01 N塩酸水溶液 500mlに対し 2時間の透析を 2回行った。透析外液を 500mlの水に交換し、さらに 2時間透析を行った後に、透析膜内の溶液を凍結乾燥することにより白色固体の目的物である PEG— PLys(stearoyl)の塩酸塩を得た（以下、 PPLS1と称す）。

実施例 1と同様に、¹ H— NMRにより PPLS1の分析を行った（スペクトラムは図 2参照）。ステアロイル基の導入率はメチル基のプロトン（CH₃:0. 8ppm)と PEGのメチレン基のプロトン（OCH₂CH₂:3.5ppm)のピークの強度比から算出した。本実施例で得られた P P LS 1では、全リシンュニッ卜中の 40 %に対し、ステアロイル基が導入されていた。

実施例 4: ポリエチレングリコール一ポリ（L一リシン一 ε一べンジルォキシカルボニル）一ポリ（L-リシン）ブロック共重合体の合成

(1 )Mw (重量平均分子量） 12000の aーメトキシ一 ω—ァミノポリ（エチレングリコール）（日油株式会社） 1. 5gをジメチルスルホキシド 22, 5mlに溶解し、 ε—ベンジルォキシカルボニル _L—リシンの Ν—カルボン酸無水物（NCA) 1. 03g (ポリエチレングリコールに対し 27等量）およびど一トリフルォロアセチル一 L一リシンの N—力ルボン酸無水物（NCA)603mg (ポリエチレングリコールに対し 18等量）のジメチルスルホキシド溶液 24. 5m Iを加え 35°Cで 48時間反応を行った。こうして得られたポリ（エチレングリコール）一ブロック一ポリ（一ベンジルォキシカルボ二ルー L—リシン Zど一トリフルォロアセチルー L一リシン）（P EG— P(Lys(Z)ZLys(TFA))をメタノール 300ml、 1N NaOH30mlに溶解し、 35°Cで 6時間撹袢することによって脱保護を行った。この溶液は、分画分子量 6000〜8000の再生セルロース製透析チューブ（SpetraZPor 1、 Sp ectrum Laboratories)を用し、 0. 01 N HCIに対して 3回诱析を行うことに PGT;JP 200 S/054824

より精製した。透析膜内の溶液を凍結乾燥することにより、ポリアミノ酸ブロックとして、ランダムに ε—ベンジルォキシカルボ二ルー L—リシン基と L—リシン基

が重合されたポリ（エチレングリコール）一ブロック一ポリ（ど一ベンジルォキシカルポニル一 L一リシン ZL—リシン）（PEG— P ( Lys (Z) ZLys)の塩酸塩 2. Og

を得た（以下 PPLZと称す）。¹ H— NMRによる解析から、ポリマー当たりの ε— ベンジルォキシカルポニル一 L—リシンユニットの含有数は 24であり、 L一リシンユニットの含有数は 1 6であった。

実施例 5 : ポリエチレングリコール一ポリ（L一リシン一 ε一べンジルォキシカルボニル）一ポリ（L-リシン）ブロック共重合体の合成

( 1 ) Mw (重量平均分子量） 1 2000のひ一メ卜キシ一 OJ—ァミノポリ（エチレングリコール）（日油株式会社） 1 . 5gをジメチルスルホキシド 22. 5mlに溶解し、 ε—ベンジルォキシカルボニル一 L—リシンの Ν—カルボン酸無水物（NCA) 1 .

03g (ポリエチレングリコールに対し 27等量）のジメチルスルホキシド溶液 1 5.

5mlを加え 35°Cで 24時間反応を行った後、ど一トリフルォロアセチル一L—リシンの N—カルボン酸無水物（NCA) 603mg (ポリエチレングリコールに対し 1

8等量）のジメチルスルホキシド溶液 9 m Iを加え、 35 °Cでさらに 24時間反応を

行った。こうして得られたポリ（エチレングリコール）一ブロック一ポリ（ど一ベンジルォキシカルボ二ルー L—リシン）一ブロック一ポリ（ ε—トリフルォロアセチルー

L一リシン） ( PEG - PLys (Z)一 block— PLys (TFA) )をメタノール 300mし

1 N NaOH 30mlに溶解し、 35°Cで 6時間撹拌することによって脱保護を行つ

た。この溶液は、分画分子量 6000〜8000の再生セルロース製透析チューブ

( SpetraZPor 1 Spectrum Laboratories)を用しゝ、 0. 01 N HCIに対して 3回透析を行うことにより精製した。透析膜内の溶液を凍結乾燥し、ポリ（ェ

チレングリコール）、ポリ（ ε一べンジルォキシカルボニル一 L—リシン）、及びポ

リ（L-リシン）がトリブロックを形成したポリ（エチレングリコール）一ブロックーポ

リ（ど一べンジルォキシカルボ二ルーし-リシン）一ブロック一ポリ（L一リシン）（Ρ

EG— PLys (Z)— PLys)の塩酸塩 2. 0gを得た（以下 PPLZbと称す）。¹ H— N

MRによる解析から、ポリ（ ε一べンジルォキシカルボニル一 L-リシン）部分の重合度は 24であリ、ポリ（ L一リシン）部分の重合度は 1 6であった。 Γυ I , ur c υ υ / υ «) ½ 0 ώ ¾

実施例 4: 粒子の調製

本実施例で用いる siRNAは、ゥミホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的として設計されたものであり、センス鎖として 5' - CUUACGCUGAGUACUUCGAdTd T— 3'、アンチセンス鎖として 5'—UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT— 3'を用い、常法により 2重鎖を形成させたものであり、株式会社日本イージーティーに合成を依頼し、購入したものである。

siRNAを pH7. 4の 1 OmM Tris HCI buffer( 1. Oml)に溶解させ、 20

Mに調製した。この siRNA溶液 250 lに対し、目的の NZP比を満たすように濃度を調製した PPLC1の DMF溶液を 250 i I加え、混合した。なお NZP比とは、 [ブロック共重合体中のカチオン残基の濃度]/ [核酸中のリン酸基濃度] である。この溶液を分画分子量 10000の透析キット（Slide-A- Lyzer Dialys is Casset、 Pierce)を用し \、 pH7. 4の 1 OmM Tris HCI buffer50mllこ

対し、 4時間の透析を 3回行うことで、 siRNAを内包した ^子の溶液を得た。粒子の溶液は、 pH7. 4の 1 OmM Tris HCI bufferにより希釈する力、、または遠心ろ過ユニット（Amicon Ultra、 Millipore)により濃縮を行い、適宜濃度を調製した。

また、 PPLC2〜PPLC4、 PPLS1、 PPLZ、 PPLZb及び PEG— P(Lys)についても同様に粒子を調製した。

実施例 5: 電気泳動によるキャラクタリゼーシヨン

ポリアクリレアミドゲレ（Novex 20% TBE Geし Invitrogen)に、 1 OOngの s ί RN Aを含有する各粒子の溶液をロードし、 TB E溶液を泳動バッファ一として用い、引加電圧 100 V、泳動時間 1時間の条件で泳動を行った。終了後、 SY

BR (登録商標） Green Il(Invitrogen)により染色を行し、、 Molecular Ima ger FX(Bio— Rad)により画像ィ匕した。

図 3に結果を示す。 si RN Aが粒子に取り込まれた場合には電気泳動での泳動度が小さくなるため、フリーの siRNA由来のバンドは消失する。全てのポリマ一において、 NZP比が 1. 5以上の場合にフリーの siRNA由来のバンドは確認できなくなリ、ほぼ全ての si RN Aが粒子に取リ込まれていた。

実施例 6: 動的光散乱法（DLS)によるキャラクタリゼーシヨンド 1,'vjr ώ υ υ t» / j d ¾ υ it

Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments)を用し、、動的光散舌い: 6に

より各粒子の多分散度（PDI)、キュ厶ラント平均粒径及び粒子径分布のヒストグラムの測定を行った。各粒子溶液は、それぞれ si RN A濃度が 5 Mとなるように調製したものを用いた。

結果を図 4〜6に示す。図 4の結果から、疎水基を持たない PEG— PLysを用いて形成させた粒子は PDIが大きぐ不均一な会合体が形成されていた。これ

に対し PPLC1〜PPLC4を用いて形成させた粒子においては PDIの値は小さ《より分布の狭い粒子が形成されていた。特にリシンュニッ卜に対しコレステ口一

ルが 240/0以上導入された PPLC2〜4を用いて形成させた粒子の場合には、 p

DIttO. 25以下となり、単分散な粒子を得ることができた。

また、図 5の結果力、ら PPLC1〜PPLC4を用いて形成させた粒子では、いず

れの NZP比においてもキュムラント平均粒子径は 40~1 OOnmであった。

代表的な例として、 PPLC2を用い siRNAと N/P比 6で形成させた粒子の粒

子径分布のヒストグラムを図 6に示した。

実施例 7: ゼータ電位測定によるキャラクタリゼーシヨン

Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments)を用い、 PPLC2を用いて

形成させた粒子のゼータ電位を測定した結果を図 7に示す。 NZP比 1におい

ては負の値を示したものの、 NZP比 1. 5〜10においてはゼータ電位の絶対

値は非常に小さく、ほぼ OmVに近いものであった。このようにカチオンの電荷が過剰な条件においてもゼータ電位が小さく保たれていることから、粒子の表面

には PEG層が存在し、粒子内部の電荷をほぼ完全に遮蔽できていることがわ

かる。

実施例 8: 血中滞留性の評価

本実施例で用いる siRNAは、ゥミホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的として設計された siRNAにおいて、アンチセンス鎖の 5'末端に Cy3標識したものであり、センス鎖として 5' -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'、アンチセンス鎖として 5'—Cy3— UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT— 3'を用し、、常法により 2重鎖を形成させたものであり、株式会社日本バイオサービスに合成を依頼し、購入したものである。卜 Lii.'dド <iuuy

各ポリマーを用い、実施例 5と同様にして Cy3標識 siRNAを内包する粒子の溶液を得た。これらの溶液に対し、 1 /20体積の 3M塩化ナトリウム水溶液を加えることで、 150mM塩化ナトリウムを含有する等張液としたものを評価に用いた。

Balb/cマウス（日本チャールズリバ一）に対し、尾静脈より Cy3修飾 siRNA 20 jugを含有する粒子溶液を投与し、一定時間後に下大静脈より血液 200 Iを採取した。次に血液を 4°C、 2000Gで 10分遠心し、上清から 70〃 Iの血漿を得た。この血漿に 5 Iの 1/400Nポリビニル硫酸カリウム溶液（和光純薬 1業ノを Id た後、 Fluoroskan Ascent Fu system (し ab systems)!こより、蛍光強度を測定した（励起波長 544nm、蛍光波長 590nm)。この蛍光強度から、血中に残存する Cy3の定量を行い、血中滞留性を評価した。なお、投与量に対する血漿中の残存率は、マウスの血液量を体重の 80<½として算出した。

PPLC2を用しゝ N/Pi 1. 5〜10で調製した粒子、 PPLS 1を用しゝ NZPjt 6 で調製した粒子及び粒子化していない siRNA(naked)の投与後 1時間における血中滞留性を評価した結果を表 2及び図 8に示す。 PPLC2では NZP比 1. 5〜 4に比べ、 6〜 10で形成させた粒子は高い滞留性を示した。また、 PP LS 1 を用いて NZP比 6で形成させた粒子についても、 PPLC2にはやや劣るものの良好な滞留性を示した。表 2:

ポリマー NZP比（+ Z—）投与量に対する

血漿中の残存率

(%)

なし (naked) - 0.13

PPLC2 1.5 0.44

PPLC2 2 0.82

PPLC2 4 3.8

PPLC2 6 51 PPLC2 8 57

PPLC2 10 43

PPし SI 6 17

PPLC1〜4及び PEG— PLysを用い、 NZP比 6で調製した粒子及び粒子化していない siRNA (naked)の、投与後 2時間における血中滞留性を評価した結果を表 3及ぴ図 9に示す。 naked, PEG— PLysと J;匕較し、各 PPLCは高し、滞留性を示した。また、 PPLC1に比べ PPLC2〜4はより高い滞留性を示した。表 3:

PPLZ及び PPLZbを用しゝ、 NZP比 8で調製した粒子及び粒子化していない s iRNA(naked)の、投与後 2時間における血中滞留性を評価した結果を表 4 及び図 10に示す。ポリリシンユニット中にランダムにベンジルォキシカルボニル基が導入された PPLZは、 nakedに対し約 20倍の高い滞留性を示した。一方、トリブロックポリマーである PPし Zbは 100倍以上の非常に高い滞留性を示した。

PPLZbを用いて調製した粒子では、ポリエチレングリコールからなるシェル層の内側に疎水性のポリアミノ酸ブ口ックからなる保護層が形成され、さらにその内側に siRNAが担持されるため、安定に siRNAを保持できると考えられる。 , u- v

表 4:

PPLC2を用い NZP比 6で調製した粒子及び粒子化していない siRNA(nak ed)の、投与後 15分〜 4時間までの血中滞留性を評価した結果を表 5及び図 11に示す。 PPLC2で粒子化した siRNAは、少なくとも投与後 2時間まで有意に nakedよりも高い滞留性を示した。表 5:

産業上の利用分野

本発明に従う、親水性ポリマー鎖ブロックと、側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリアミノ酸鎖ブロックを含んでなるブロック共重合体は、上述した利点ともに、例えば、小分子核酸である、 siRNAとの安定な会合体を形成し、しかもこのような会合体は平均粒径が数十 nm〜数百 nmの間で単分散性の粒子を形成し、血流中で長期間滞留性を示すとともに高い細胞導入効率を示す。したがって、限定されるものでないが、治療用遺伝子の標的細胞への送達キヤリャ一として有用であり、製薬または医療産業で利用できる。

Claims

WO 2009/113645 PCT/JP2009/054824 . _n - ,

¹ (.υυο/ ub482i

請求の範囲非荷電性親水性ポリマー鎖ブロック及びカチオン性ポリアミノ酸鎖ブロックを含んでなるブロック共重合体であって、

親水性ポリマー鎖ブロックが該ポリアミノ酸鎖ブロックの主鎖のいずれか一

方の末端に共有結合を介して結合しており、かつ、

該ポリアミノ酸鎖ブロックにおけるアミノ酸単位の 10パーセント以上 70パーセント以下の側鎖に疎水性基が共有結合を介して結合している、上記プロック共重合体。

2. 非荷電性親水性ポリマー鎖ブロックがポリエチレングリコール（またはポリ

(ォキシエチレン)）からなる水溶性ポリマー由来であり、ポリアミノ酸鎖ブロックがポリリシン、ポリオル二チン、ポリアルギニン、ポリホモアルギニン及びポリヒスチジンからなる群より選ばれるポリマー由来であり、そして疎水性基がステロール誘導体の残基又は c₄—₂₄ヒドロカルビル基である、請求項 1記載のブロック共重合体。

3. 一般式 I

A-(OCH₂CH₂)_m— L - (C ) (C ) -Z

(I)

又は一般式 Π

A-(OCH₂CH₂)_m— L'— [ (

(II)

式中、 Aは水素原子、または式 R^R ChKCH^q—で表される基を表し、及び R₂は独立して水素原子、 (^_₆アルコキシ基、ァリールォキシ基、ァリール —3ォキシ基、シァノ基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、 C₂_₇ァシルアミド基、トリ一アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、またはおよび R₂は一緒になつて C^— ₃アルキル基で置換されていているかもしくは未置換のエチレンジォキシまたはプロピレンジォキシ基を表し、またはおよび R₂はそれらが結合している CH 基と一緒になつてホルミル基を表し、

qは 0〜10の整数を表し、

Lは一（CH₂)rNH―、一 NHCH₂CH₂NH―、一 NHCH₂CH₂CH₂N H—または一 COCH₂CH₂— NH—を表し、但し、 rは 0〜5の整数を表し、

ビは、一 CO—、 -OCO-(CH₂)r'― CO—および一NHCO— (CH₂)r，一 CO—を表し、但し、 r'は 1〜5の整数を表し、

Bは一 NH—、一 NHCOO―、一 NHCO—または式 1Πで表される置換基を介して結合するステロール誘導体残基、または C₄— ₂₄ヒドロカルビル墓を表し、

(III)

Qは NH₂、一 NHC( = NH)NH。または式 IVで表される置換基を表し

(IV) WO 2009/113645 PCT/JP2009/054824 _r . _n - .

ドじド ^uuy/u54324

zは水素原子、 c₂__₁₂アルキルカルボニル基、 c₃— ₁₂アルケニルカルボニル

基、

c₃— ₁₂アルケニルカルボニル基、ァリールカルボニル基、ァリールォキシ力ルポニル基、ァリール d—3カルボニル基または Bについて規定する基であ

り、

Z'は一 NH-R₃を表し、但し、 R₃は未置換または置換された直鎖もしくは分枝の — アルキル基であり、

mは 55〜5， 000の整数を表し、

nは 10〜100の整数を表し、

pは 1、 3または 4の整数を表し、

Xはポリアミノ酸鎖ブロックに含有される置換基 Qを有するユニットの数、

yはポリアミノ酸鎖ブロックに含有される置換基 Bを有するユニットの数であ

る力 x+y=nであり、 yは nの 10パ一セント以上 70パーセント以下までを占める整数である、

で表される請求項 1記載のブロック共重合体。

4. ステロール誘導体残基がコレステロール、コレスタノール、ジヒドロキシコレ

ステロール、コール酸よりなる群から選ばれる化合物に由来する、請求項 3

記載のブロック共重合体。

5. ヒドロカルビル基が C₁₂_₂₀アルキル基よりなる群から選ばれる、請求項 3

記載のブロック共重合体。

6. ヒドロカルビル基がフエニルまたはナフチルであるフエニルと C1—5のアル

キルからなるァリールアルキル基よりなる群から選ばれる、請求項 3記載のブロック共重合体。

7. 核酸と請求項 1〜6のいずれかに記載のブロック共重合体との複合体。

8. 核酸がオリゴもしくはポリ二本鎖 RNA、オリゴもしくはポリ二本鎖 DNA、ォ

リゴもしくはポリ一本鎖 DNAおよびオリゴもしくはポリ一本鎖 RNAからなる群より選ばれる、請求項 7記載の複合体。

9. 核酸がプラスミド DNA、 siRNA、 micro RNA、アンチセンス核酸、デコイ

核酸、アブタマ一およびリボザィムからなる群より選ばれる請求項 8記載の WO 2009/113645 PCT/JP2009/054824i 09 Λ

I υし υ「 Λ υ υ »/ / J 04 Ο ώ ¾

複合体。

10. コア一シ: ι:ル型高分子ミセル構造を有し、コア部に核酸を内包した請求

項 7〜 9のいずれかに記載の複合体。

11. ブロック共重合体と核酸が、 [ブロック共重合体中のカチオン残基の濃

度] Ζ [核酸中のリン酸基濃度]ので定義される Ν/Ρ比が¹〜 50となる

ように含有されることを特徴とする請求項 7〜 10のいずれかに記載の複合

体。

12. 平均粒子径が 10〜300nmの粒子である、請求項 7~"1¹のいずれか I

記載の複合体。