WO2019240223A1 - 数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを含む、ポリイオンコンプレックスミセル - Google Patents

数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを含む、ポリイオンコンプレックスミセル Download PDF

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kda
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泰孝 安楽
片岡　一則
重人 福島
完二郎 宮田
ヒョンス ミン
瑞 内藤
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公益財団法人川崎市産業振興財団
国立大学法人 東京大学
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    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis

Definitions

  • the present invention relates to a polyion complex micelle comprising a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer, and an antisense oligonucleotide.
  • Development of a drug delivery system is to efficiently and selectively deliver a drug contained in a target tissue or organ.
  • the drug delivery system can play a role in increasing the blood retention of the encapsulated drug.
  • Patent Document 1 discloses a micelle whose surface is modified with glucose. Patent Document 1 reveals that when micelles whose surfaces are modified with glucose are administered while performing blood glucose manipulation, the accumulation of micelles in the brain is remarkably increased.
  • the present invention provides a polyion complex micelle comprising a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer, and an antisense oligonucleotide (or oligonucleotide).
  • the present inventors have found that when a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 2 kDa and a cationic polymer and an antisense oligonucleotide are mixed, the formation efficiency of polyion complex micelles is low.
  • the present inventors also mixed a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 12 kDa and a cationic polymer and an antisense oligonucleotide, the polyion complex micelle is used for drug delivery to modify the PEG block side. It was found that the targeting molecules of the PEG penetrate into the interior of the PEG and the efficiency presented on the micelle surface is reduced.
  • the present inventors further provide a polyion complex micelle comprising a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer and a nucleic acid, and a formation efficiency when the nucleic acid is DNA or mRNA.
  • the target molecule for drug delivery that modifies the PEG block side when the micelles are formed, and can be efficiently formed when the nucleic acid is an antisense oligonucleotide. I found it easier to be exposed.
  • a polyion complex micelle comprising a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer, and an antisense oligonucleotide.
  • the PEG-side end of a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer is modified with a molecule that binds to a cell surface or an extracellular matrix.
  • Polyion complex micelle comprising a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer, and an antisense oligonucleotide.
  • a pharmaceutical composition comprising the polyion complex micelle according to any one of (1) to (6) above.
  • the dosing regimen comprises administering the pharmaceutical composition to a subject that has been fasted or induced hypoglycemia and inducing an increase in blood glucose level in the subject,
  • the pharmaceutical composition wherein the outer surface of the polyion complex micelle is modified with a GLUT1 ligand.
  • FIG. 1A shows the relationship between the mixing ratio (N / P ratio) of cationic polymer and antisense oligo, scattered light intensity (SLI), and polydispersity (PDI).
  • FIG. 1B shows the relationship between the ratio of the cationic polymer that has undergone glucose modification (glucose contains in micelle (%)) to the total number of cationic polymers constituting the micelle, and the particle size and PDI.
  • FIG. 1C shows the relationship between the diffusion time of ASO micelles in the presence of fetal bovine serum (FBS) and the ASO concentration used for micelle formation.
  • FIG. 2 is a fluorescent electron microscopic image of ASO micelles administered to mice observed in an ear blood vessel.
  • FIG. 3 shows the blood retention (Relative Invensity) of ASO micelles administered to mice.
  • FIG. 4A shows the relationship between the amount of ASO micelles accumulated in the brain tissue of mice administered with fluorescently labeled ASO micelles and the rate of glucose modification on the ASO surface. The vertical axis represents the value obtained by converting the ratio of micelles accumulated in the brain tissue to the dose per 1 g of brain tissue.
  • FIG. 4B shows the relationship between the amount of ASO micelles accumulated in the brain tissue of Alzheimer's disease mice administered with fluorescently labeled ASO micelles and the rate of glucose modification on the ASO surface. The vertical axis represents the value obtained by converting the ratio of micelles accumulated in the brain tissue to the dose per 1 g of brain tissue.
  • FIG. 4A shows the relationship between the amount of ASO micelles accumulated in the brain tissue of mice administered with fluorescently labeled ASO micelles and the rate of glucose modification on the ASO surface. The vertical axis represents the value obtained by converting the
  • FIG. 5 shows the ratio of the accumulation amount of Glc-PIC (ASO) in which 25% of the cationic polymer is modified with glucose in each organ to the accumulation amount of naked ASO in each organ in the brain.
  • FIG. 6A shows the scattered light intensity (SLI) of ASO micelles with an average molecular weight of PEG in the PEG block of 2 kDa.
  • FIG. 6B shows the scattered light intensity (SLI) of ASO micelles with an average molecular weight of PEG in the PEG block of 12 kDa.
  • SLI scattered light intensity
  • FIG. 6C is a diagram showing the degree of accumulation in the mouse brain of model micelles in which the average molecular weight of PEG in the PEG block is 2 kDa and ASO micelles in which the average molecular weight of PEG in the PEG block is 12 kDa.
  • FIG. 6D shows the formation efficiency of micelles in which the average molecular weight of PEG in the PEG block is 5 kDa and the anionic polymer is plasmid DNA (pDNA) or messenger RNA (mRNA).
  • the vertical axis represents scattered light intensity (SLI).
  • micelle means a vesicle formed by a single layer of molecular film (or molecular layer).
  • examples of micelles include micelles formed from amphiphilic molecules such as surfactants, and micelles formed from polyion complexes (PIC micelles). It is known that the micelle is preferably modified on the outer surface with polyethylene glycol from the viewpoint of residence time in blood.
  • polyion complex means that a copolymer of PEG and an anionic block and a copolymer of PEG and a cationic block are charged in an aqueous solution. It is an ionic layer formed between the cationic block and the anionic block of both block copolymers when mixed so as to neutralize.
  • the significance of linking PEG and the above-mentioned charged chain is that the polyion complex is prevented from aggregating and precipitating, and thereby the polyion complex has a monodisperse core-shell structure with a particle size of several tens of nm. Forming nano-particles.
  • PEG covers the outer shell (shell) of the nanoparticle, it is known that it has high biocompatibility and is advantageous in improving the residence time in blood. It has also been shown that in forming a polyion complex, one charged block copolymer does not require a PEG moiety and may be replaced with a homopolymer, surfactant, nucleic acid and / or enzyme. In the formation of the polyion complex, at least one of the anionic polymer and the cationic polymer forms a copolymer with PEG, and both of them may form a copolymer with PEG. Further, it is well known that PIC micelles are easily formed when the PEG content is increased, and PICsomes are easily formed when the PEG content is reduced.
  • Examples of the anionic polymer or block often used for the preparation of the polyion complex include polyglutamic acid, polyaspartic acid and nucleic acid (for example, DNA, mRNA and siRNA).
  • Examples of the cationic polymer or block include polylysine.
  • poly (5-aminopentylaspartic acid) means messenger RNA used for protein synthesis by translation
  • siRNA means double-stranded RNA (nucleic acid) capable of inducing RNA interference (RNAi).
  • the siRNA is not particularly limited, but is a double-stranded RNA consisting of 20 to 30 bp, preferably 21 to 23 bp, 25 bp, and 27 bp, and having a sequence homologous to the sequence of the target gene.
  • an antisense oligo can be used as an anionic polymer in PIC.
  • inducing hypoglycemia means lowering the blood sugar level in a subject than the blood sugar that would have been shown if the treatment was not performed.
  • examples of a method for inducing hypoglycemia include administration of a diabetic drug.
  • in inducing hypoglycemia as long as the purpose of inducing hypoglycemia is achieved, for example, taking other drugs or drinking a drink such as water is acceptable.
  • Inducing hypoglycemia may involve other treatments that do not substantially affect blood glucose.
  • fasting means fasting a subject, for example, 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, 6 hours or more, 7 hours or more, 8 hours or more, 9 hours or more, 10 hours or more, 11 hours or more, 12 hours or more, 13 hours or more, 14 hours or more, 15 hours or more, 16 hours or more, 17 hours or more, 18 hours or more, 19 hours or more, 20 hours or more, 21 hours or more, 22 hours or more, 23 hours Or more, 24 hours or more, 25 hours or more, 26 hours or more, 27 hours or more, 28 hours or more, 29 hours or more, 30 hours or more, 31 hours or more, 32 hours or more, 33 hours or more, 34 hours or more, 35 hours or more, 36 hours or more, 37 hours or more, 38 hours or more, 39 hours or more, 40 hours or more, 41 hours or more, 42 hours or more, 43 hours or more, 44 hours or more, 45 hours or more, 46 hours or more, 47 hours Means to the upper or fasted at least 48 hours.
  • the fasting period is determined by a doctor or the like in view of the health condition of the subject. For example, it is preferable that the fasting period be a period of time longer than the time for the subject to reach fasting blood glucose.
  • the fasting period may be, for example, a period of time beyond which the expression of GLUT1 on the intravascular surface of cerebral vascular endothelial cells increases or reaches a plateau.
  • the fasting period can be, for example, the above period that is 12 hours or more, 24 hours or more, or 36 hours or more. Fasting may also involve other treatments that do not substantially affect blood glucose levels or the expression of GLUT1 on the intravascular surface.
  • “inducing an increase in blood glucose level” means increasing the blood glucose level in a subject in which hypoglycemia is induced or in a subject in which a hypoglycemic state is maintained.
  • the blood glucose level can be increased by various methods well known to those skilled in the art.
  • administration of an agent that induces an increase in blood glucose level for example, an increase in blood glucose level such as glucose, fructose (fructose), galactose, etc.
  • administration of a simple sugar administration of a polysaccharide that induces an increase in blood sugar level such as maltose, intake of a carbohydrate that induces an increase in blood sugar level such as starch, or diet.
  • blood glucose manipulation refers to inducing hypoglycemia in a subject and then raising the blood glucose level. After inducing hypoglycemia in the subject, the subject's blood glucose level can be maintained at the hypoglycemia.
  • the time for maintaining the subject's blood sugar level at low blood sugar is, for example, 0 hour or more, 1 hour or more, 2 hours or more, 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, 6 hours or more, 7 hours or more, 8 hours or more 9 hours or more, 10 hours or more, 11 hours or more, 12 hours or more, 13 hours or more, 14 hours or more, 15 hours or more, 16 hours or more, 17 hours or more, 18 hours or more, 19 hours or more, 20 hours or more, 21 More than time, more than 22 hours, more than 23 hours, more than 24 hours, more than 25 hours, more than 26 hours, more than 27 hours, more than 28 hours, more than 29 hours, more than 30 hours, more than 31 hours, more than 32 hours, more than 33 hours 34 hours or more, 35 hours or more, 36 hours or more, 37 hours or more, 38 hours or more, 39 hours or more, 40 hours or more, 41 hours or more, 42 hours or more, 43 hours or more, 44 hours or more, 45 hours or less , 46 hours or more
  • the blood sugar level can be raised.
  • “maintaining blood glucose” is permitted to take other drugs or drink beverages such as water, for example, as long as the purpose of maintaining hypoglycemia in the subject is achieved. Inducing hypoglycemia may involve other treatments that do not substantially affect blood glucose.
  • subject refers to mammals including humans.
  • the subject may be a healthy subject or a subject suffering from some disease.
  • diseases include cranial nerve diseases such as psychotic disorders, depression, mood disorders, anxiety, sleep disorders, dementia and substance-related disorders.
  • dementia include, but are not limited to, Alzheimer's disease and Creutzfeldt-Jakob disease.
  • blood-brain barrier refers to a functional barrier that exists between the blood circulation and the brain and has selectivity for the permeation of substances.
  • the actual state of the blood-brain barrier is considered to be cerebrovascular endothelial cells.
  • substance permeability of the blood brain barrier there are many unclear points, but glucose, alcohol and oxygen are known to easily pass through the blood brain barrier, and fat-soluble substances and small molecules (for example, molecular weight less than 500) It is considered that there is a tendency to pass through more easily than water-soluble molecules and polymers (for example, molecular weight of 500 or more).
  • Many therapeutic agents and diagnostic agents for brain diseases do not pass through the blood-brain barrier, which is a major obstacle for treatment of brain diseases and brain analysis.
  • blood nerve barrier refers to a functional barrier that exists between the blood circulation and peripheral nerves and has selectivity for the permeation of substances.
  • blood cerebrospinal fluid barrier refers to a functional barrier that exists between blood circulation and cerebrospinal fluid and has selectivity for the permeation of substances.
  • blood retinal barrier refers to a functional barrier that exists between blood circulation and retinal tissue and has selectivity for the permeation of substances.
  • the entities of the blood nerve barrier, blood cerebrospinal fluid barrier, and blood retinal barrier are considered to be vascular endothelial cells existing at the respective barriers, and the functions thereof are considered to be the same as the blood brain barrier.
  • GLUT1 ligand means a substance that specifically binds to GLUT1.
  • Various ligands are known as GLUT1 ligands, including, but not limited to, molecules such as glucose and hexose, both of which are used in the present invention for the preparation of carriers or conjugates instead of glucose. be able to.
  • the GLUT1 ligand preferably has an affinity for GLUT1 that is equal to or greater than that of glucose.
  • antisense oligonucleotide As used herein, “antisense oligonucleotide”, “antisense oligo”, “ASO” or “antisense compound” are used interchangeably and are produced from a cell under physiological conditions (eg, intracellular). It is a molecule that can hybridize with a target nucleic acid.
  • An “antisense oligo” or “antisense compound” is a polymer of monomer units, each monomer unit having a base and a backbone, the backbone having a linkage between the monomers, thereby A molecule that enables Watson-Crick base pairing between an antisense oligo and a target nucleic acid (eg, RNA).
  • Antisense oligos include, for example, various nucleic acids such as nucleic acids, particularly RNA and DNA, and analogs with enhanced stability thereof (eg, locked nucleic acid (LNA), cross-linked nucleic acid (BNA), morpholino oligo, peptide nucleic acid).
  • LNA locked nucleic acid
  • BNA cross-linked nucleic acid
  • morpholino oligo peptide nucleic acid
  • the antisense oligo (or oligonucleotide) has a length of 15 bases or longer, 16 bases or longer, 17 bases or longer, 18 bases or longer, 19 bases or longer, 20 bases or longer, 21 bases or longer, 22 It may be at least base length, at least 23 base length, at least 24 base length, at least 25 base length, or at least 26 base length, and / or 100 base length or less, 90 base length or less, 80 base length or less, 70 base length Hereinafter, it may be 60 base length or less, 50 base length or less, 40 base length or less, or 30 base length or less.
  • the antisense oligo (or oligonucleotide) is 15 to 50 bases long, 15 to 40 bases long, 15 to 30 bases long, 20 to 50 bases long, 20 to 40 bases long, 20 to 30 bases long, It can be 18-40 bases long, 18-30 bases long, 18-25 bases long, or 21-26 bases long.
  • antisense oligos can be nucleic acids such as RNA and DNA with nucleic acid analogs with increased stability at both ends.
  • “monodisperse” means that the particle group is a particle group in which the standard deviation of the particle size of each particle is within 10%.
  • the particle diameter can be determined based on, for example, a dynamic scattered light method.
  • An autocorrelation function can be obtained by the photon correlation method from the observed temporal fluctuation of scattered light, and the diffusion coefficient, particle size, and particle size distribution can be obtained by cumulant method and histogram method analysis.
  • the present inventors have shown that in a PIC micelle of a block copolymer of a PEG block and a cationic polymer block and an antisense oligo, the micelle formation efficiency is lowered when the number average molecular weight of the PEG constituting the PEG block is small. It was. In the PIC micelle of a block copolymer of a PEG block and a cationic polymer block and an antisense oligo, the present inventors also have a drug delivery on the PEG block side when the number average molecular weight of the PEG constituting the PEG block is large. For this reason, it was shown that the targeted molecule is difficult to be exposed on the micelle surface.
  • the present inventors when the number average molecular weight of PEG constituting the PEG block is medium, the present inventors have excellent micelle formation efficiency, and the targeted molecule is exposed on the micelle surface.
  • the present invention has been completed by finding that it is easy. That is, according to the present invention, there is provided a PIC micelle of a block copolymer of a PEG block and a cationic polymer block and an antisense oligo, wherein the number average molecular weight of the PEG block is, for example, 3 kDa to 10 kDa. Is done.
  • the number average molecular weight of the PEG block in the block copolymer of the PEG block and the cationic polymer block is not particularly limited.
  • the lower limit is 3 kDa or more, 3.5 kDa or more, 4 kDa or more, or 4.5 kDa or more. It can be.
  • the number average molecular weight of the PEG block in the block copolymer of the PEG block and the cationic polymer block has an upper limit of 11 kDa or less, 10 kDa or less, 9 kDa or less, 8 kDa or less, 7 kDa or less, 6 kDa or less, or 5.5 kDa. It can be as follows.
  • the number average molecular weight of the PEG block in the block copolymer of the PEG block and the cationic polymer block is, for example, one lower limit selected from the above lower limit and one selected from the above upper limit. It can be a numerical value in a range with the upper limit value.
  • the number average molecular weight of the PEG block in the block copolymer of the PEG block and the cationic polymer block is, for example, 3 kDa to 10 kDa, 3.5 kDa to 9 kDa, 4 kDa to 7 kDa, 4 kDa to 6 kDa, for example, about 5 kDa (for example, 5 kDa ⁇ 30%, ⁇ 25%, ⁇ 20%, ⁇ 15%, or ⁇ 10%).
  • an antisense oligo that is anionic can form a polyion complex micelle by ionic interaction between a block copolymer of a PEG block and a cationic polymer block.
  • the antisense oligo may or may not be modified with PEG.
  • the antisense oligo is 5% or less, 10% or less, 15% or less, 20% or less, 30% or less, 40% or less, 50% or less of the number average molecular weight of the PEG chain of the block copolymer. It may have a PEG block having a number average molecular weight of 60% or less, 70% or less, 80% or less, 90% or less, or 95% or less.
  • the antisense oligo does not have a modification with PEG.
  • the mixing ratio of the block copolymer of the PEG block and the cationic polymer block and the antisense oligo is, for example, 1.0 / N ratio (ratio of the number of nitrogen atoms in the polymer side chain to the number of phosphate groups in the DNA). To 2.0, 1.1 to 1.9, 1.2 to 1.8, 1.3 to 1.7, 1.4 to 1.6, or about 1.5.
  • PEG can be linear PEG.
  • other hydrophilic polymer blocks may be used instead of PEG.
  • a polymer of a cationic monomer unit can be used as the cationic polymer.
  • a non-natural cationic amino acid for example, modified natural cationic amino acid
  • a natural cationic amino acid can be used.
  • Natural cationic amino acids include one or more natural cationic amino acids selected from lysine and ornithine.
  • Non-natural cationic amino acids include one or more modified natural amino acids selected from glutamic acid and aspartic acid modified with a cationic side chain.
  • Examples of the cationic side chain include groups having a 5-aminopentyl group, a 4-aminobutyl group, a 3-aminopropyl group, and a 2-aminoethyl group, and in these groups, C is replaced by N. It may be done.
  • Examples of the cationic side chain include —NH—CH 2 CH 2 —NH 2 , —NH—CH 2 CH 2 —NH—CH 2 CH 2 —NH 2 (sometimes referred to as diethyltriamine (DET)), —NH —CH 2 CH 2 —NH—CH 2 CH 2 —NH—CH 2 CH 2 —NH 2 (sometimes referred to as triethyltetraamine (TET)), and —NH—CH 2 CH 2 —NH—CH 2 CH 2 —NH—CH 2 CH 2 —NH—CH 2 CH 2 —NH 2 (sometimes referred to as tetraethylpentamine (TEP)).
  • DET diethyltriamine
  • TET triethyltetraamine
  • TEP tetraethylpentamine
  • the cationic amino acid may be modified with, for example, 2-iminothiolane or dimethyl 3,3′-dithiobis (propionimidate) (DTBP) in order to enhance the convenience of crosslinking ⁇ however, at least Some or all amino acids remain cationic ⁇ .
  • 2-iminothiolane or dimethyl 3,3′-dithiobis (propionimidate) (DTBP) in order to enhance the convenience of crosslinking ⁇ however, at least Some or all amino acids remain cationic ⁇ .
  • the block copolymer of the PEG block and the cationic polymer block may be modified at the PEG side end with a targeting molecule for drug delivery.
  • the targeting molecule for drug delivery is a molecule that is exposed on the surface of the micelle when the micelle is formed using the block copolymer, and is selectively expressed on the surface of the body site to be targeted (eg, molecules that selectively bind to membrane proteins, glycoproteins, receptors, and others) (eg, antibodies or antigen-binding fragments of antibodies, receptor ligands, lectins, or affinity peptides such as RGD peptides) Or cRGD peptide).
  • micelles are targeted to a site in the body to be targeted by exposing the micelle surface with a targeting molecule that selectively binds to a molecule that is selectively expressed on the surface of the site in the body to be targeted. Can be accumulated.
  • a targeting molecule for drug delivery a molecule that binds to a cell surface or a molecule that binds to an extracellular matrix can be mentioned.
  • Molecules that bind to the cell surface can be, for example, receptors that are exposed on the cell surface, membrane proteins such as channels, and molecules that bind to glycoproteins.
  • GLUT1 is expressed on the blood vessel side surface of vascular endothelial cells at a specific location in the body.
  • examples of targeting molecules for drug delivery include molecules that bind to GLUT1 (hereinafter referred to as “GLUT1 ligand”).
  • GLUT1 ligand various ligands are known and are not particularly limited, and examples thereof include molecules such as glucose and hexose.
  • the GLUT1 ligand is also known to bind to GLUT1, 2-N-4- (1-azi-2,2,2-trifluoroethyl) benzoyl-1,3-bis (D-mannose-4- Yloxy) -2-propylamine (ATB-BMPA), 6- (N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino) -2-deoxyglucose (6-NBDG), Examples include 4,6-O-ethylidene- ⁇ -D-glucose, 2-deoxy-D-glucose and 3-O-methylglucose.
  • Antisense oligos that can be used in the present invention are not particularly limited.
  • antisense oligos are genes related to development (e.g., adhesion molecules, cyclin kinase inhibitors, members of the Wnt family, members of the Pax family, members of the Winged Helix family, members of the Hox family, cytokines / lymphokines and their receptors, Growth / differentiation factors and their receptors, neurotransmitters and their receptors, etc .; proteins encoding oncogenes (eg ABLI, BCLI, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ERBB2, ERBB3, ETSI, ETSI, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLI, MYCN, NRAS, PIM 1, PML, RET, SRC, TALI Tumor suppressor proteins (eg, APC
  • antisense oligos can target genes encoding proteins involved in tumor growth (including angiogenesis) or metastatic activity. Also for example, antisense oligos target genes encoding one or more secreted proteins, cell cycle control proteins, gene regulatory proteins, apoptosis regulatory proteins or proteins involved in immune response, inflammation, complement cascade or blood coagulation system It can also be.
  • antisense oligos include c-myc, c-myb, mdm2, PKA-I (type I protein kinase A), Ras, c-Raf kinase, CDC25 phosphatase, cyclin, cyclin-dependent kinase (cdks), telomerase Genes encoding PDGF / sis and mos can be targeted.
  • antisense oligos can be used to target mRNA encoded by fusion genes generated by chromosomal translocation, such as the Bcr / Abl fusion oncogene.
  • antisense oligos include cyclin-dependent kinases, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), transforming growth factor ⁇ (TGF- ⁇ ), nuclear factor ⁇ B (NF- ⁇ B), E2F, HER-2 / neu, PKA , TGF- ⁇ , EGFR, TGF- ⁇ , IGFIR, P12, MDM2, VEGF, MDR, transferrin, ferritin, ferritin receptor, transferrin receptor, IRE, C-fos, HSP27, metallothionein, etc. It can also be targeted.
  • a PIC micelle can be prepared by mixing a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa, a cationic polymer block, and an antisense oligo.
  • the block copolymer of the PEG block and the cationic polymer block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and the antisense oligo may be mixed in an electrically neutralizing amount ratio.
  • PIC micelles may be formed, and then the polymers forming the micelles may be cross-linked. Crosslinking can be performed using, for example, a crosslinking agent.
  • Crosslinks are also formed, for example, by SS bonds between 2-iminothiolane or dimethyl 3,3′-dithiobis (propionimidate) (DTBP) introduced into the side chain of the cationic polymer as disclosed in this example. You may let them.
  • DTBP dimethyl 3,3′-dithiobis
  • a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer block, and an antisense oligo form an ionic layer between the block copolymer and the antisense oligo.
  • the PEG end of a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer block may be modified with, for example, a GLUT1 ligand, such as glucose.
  • glucose may have modified the PEG block through an oxygen atom linked to its 6th carbon.
  • the GLUT1 ligand is linked to the PEG terminus of the cationic polymer.
  • a PIC micelle comprising a block copolymer of a PEG block modified with a GLUT1 ligand and having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa, a cationic polymer block, and an antisense oligo can be administered according to a dosing schedule.
  • the dosing regimen includes administering the micelles to a subject that has been fasted or has induced hypoglycemia and inducing an increase in blood glucose levels in the subject.
  • vesicles whose surface is modified with GLUT1 ligand have a higher delivery efficiency to the brain than vesicles that are not modified with GLUT1 ligand when administered.
  • the delivery efficiency to the brain is simply administered without such manipulation. It is even higher than vesicles whose surface has been modified by a ligand.
  • the PIC micelle comprising a block copolymer of a PEG block modified with the GLUT1 ligand and having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer block, and an antisense oligo has a blood nerve barrier, a blood retinal barrier, or Can pass through the cerebrospinal fluid barrier.
  • a PIC micelle comprising a block copolymer of a PEG block modified with a GLUT1 ligand and having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa, a cationic polymer block, and an antisense oligo has a number average molecular weight having no GLUT1 ligand. It may further comprise a block copolymer of a PEG block and a cationic polymer block having a 3 kDa to 10 kDa.
  • a block copolymer of a PEG block modified with a GLUT1 ligand having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer block and a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa without the GLUT1 ligand.
  • a block copolymer of a cationic polymer block may be included in the PIC micelle in a molar ratio of 10:90 to 40:60 (eg, 20:80 to 30:70, eg, 25:75).
  • 10 to 40 mol% (for example, 20 to 20 mol%, for example, 25 mol%) of a PEG side end of a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer is modified with glucose.
  • a PEG side end of a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer is modified with glucose.
  • a cationic polymer is modified with glucose.
  • a block copolymer of a PEG block modified with a GLUT1 ligand having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer block and a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa without the GLUT1 ligand.
  • the block copolymer of the cationic polymer block are contained in the PIC micelle in a molar ratio of 50:50 to 100: 0 (for example, 60:40 to 90:10, 70:30 to 80:20). Also good.
  • 50 to 100 mol% of the PEG side terminal of a block copolymer of a PEG block having a number average molecular weight of 3 kDa to 10 kDa and a cationic polymer can be modified with glucose.
  • the ratio of the block copolymer modified with the GLUT1 ligand to 50:50 to 100: 0 (or 50 mol% to 100 mol%), the PIC micelle is taken into the vascular endothelial cell, but from the vascular endothelial cell. It is thought that it becomes difficult to be released into the tissue parenchyma, and as a result, it tends to accumulate in vascular endothelial cells.
  • the ratio of the block copolymer modified with the GLUT1 ligand in the PIC can be adjusted depending on whether it is desired to pass through vascular endothelial cells expressing GLUT1 or to accumulate in vascular endothelial cells expressing GLUT1.
  • the micelle of the present invention can be administered by oral administration and parenteral administration (for example, intravenous administration or intraperitoneal administration).
  • a pharmaceutical composition comprising the micelle of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise the micelle of the present invention and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • PIC polyion complex
  • ASO antisense oligo
  • PEG polyethylene glycol
  • ASO cationic polymer having a polyethylene glycol
  • ASO cationic polymer having a polyethylene glycol
  • Glc (6) was linked to the PEG chain in the same manner as described above.
  • 2-iminothiolane (2-IT) or dimethyl 3,3′-dithiobis (propionimidate) (DTBP) was introduced into the lysine side chain.
  • the length of PEG was set to a number average molecular weight of 5 kDa.
  • the mixture was concentrated to about 50 mL under reduced pressure, 50 mL of toluene was added again, and the mixture was concentrated again to about 20 mL.
  • the obtained concentrated liquid was extracted three times with 100 mL of dichloromethane and 100 mL of pure water, and the dichloromethane layer was collected in a beaker.
  • An appropriate amount of anhydrous sodium sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and mixed with stirring for 30 minutes. Solid matter was removed by suction filtration (Kiriyama filter paper 5C), and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • the concentrated oily solution was separated and purified on silica gel (Merck).
  • hexane manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Ethyl acetate manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the white solid was dissolved in a small amount of ethanol warmed to 75 ° C., cooled, and the crystals on the precipitated particles were collected by suction filtration (Kiriyama filter paper 5C) and dried under reduced pressure to obtain DIG (6). It was.
  • reaction solution was dropped into 1.5 L of diethyl ether (manufactured by Showa Ether), and the precipitate was collected by suction filtration (JCWP 10 ⁇ m) to obtain DIG (6) -PEG-OH.
  • DIG (6) -PEG-OH was weighed into a 6 g flask, dissolved in benzene, and then lyophilized. Thereafter, 40 mL of tetrahydrofuran purified by distillation under an argon atmosphere was added, and 0.32 mL of triethylamine purified by distillation was added. In another flask, 20 mL of tetrahydrofuran purified by boiling was taken, and 0.19 mL of methanesulfonic acid chloride purified by distillation was added. While cooling the methanesulfonic acid chloride solution in a water bath, the PEG solution was slowly added dropwise and mixed with stirring for 2 hours.
  • the precipitate deposited during the reaction was removed by suction filtration (JCWP 10 ⁇ m), the filtrate was added dropwise to 1 L of diethyl ether, and the precipitate was collected by suction filtration (Kiriyama filter paper 5C). Thereafter, the precipitate was placed in an eggplant flask, dissolved in 500 mL of ammonia water (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and stirred at room temperature for 4 days. Thereafter, the reaction solution was concentrated under reduced pressure and purified by a cation exchange column to obtain DIG (6) -PEG-NH 2 (molecular weight 5,300).
  • NCA-Lys (TFA) was weighed under an argon atmosphere, and 26 mL of N, N-dimethylformamide purified by distillation in which thiourea was dissolved at a concentration of 1 mol / L was added and dissolved.
  • NCA-Lys (TFA) was added to the PEG solution and mixed with stirring at 25 ° C. for 3 days.
  • the reaction solution was put into a dialysis membrane (MWCO: 3,500), the external solution was dialyzed with water, and DIG (6) -PEG-PLys (TFA) was recovered by freeze-drying.
  • the obtained DIG (6) -PEG-PLys was dissolved in 80% trifluoroacetic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • the reaction solution was neutralized with sodium hydroxide, Dialyzed into a dialysis membrane (MWCO: 3,500).
  • the external solution was dialyzed 3 times with 0.01 N hydrochloric acid and 3 times with pure water, and Glc (6) -PEG-PLys was recovered by lyophilization.
  • the number average degree of polymerization of lysine was 42.
  • the amount of DTBP and IM bound to PEG-PLys is, CH 2 peak of the DTBP was measured by 1 H-NMR, was calculated from the ratio of the CH 2 backbone peaks of CH 2 and PEG of IM .
  • the introduction rates of DTBP and IM of the obtained Glc (6) -PEG-PLys (DTBP / IM) were 18% and 82%, respectively (that is, in the above chemical formula, a was 0.2 and b was 6). .2, c was 35.5, and a + b + c was 41.9).
  • Glc-PIC (ASO) micelle Glc (6) -PEG-PLys (DTBP / IM) was dissolved in a 10 mM HEPES solution containing 100 mM dithiothreitol so as to be 5 mg / mL.
  • ASO was dissolved in a 10 mM HEPES solution at a concentration of 30 ⁇ M. Both solutions were mixed so that the charges were balanced, and stirred and mixed for 15 seconds.
  • ASO micelles Glc-PIC micelles
  • N / P ratio with which the charge is balanced was determined as follows. Specifically, PIC (ASO) is obtained by mixing PEG-PLys and ASO at various values ranging from 0.2 to 1.9 in the N / P ratio (amidine number / phosphoric acid number). A micelle was produced in the same manner. Thereafter, the particle size, scattered light intensity (SLI) and polydispersity (PDI) were measured using a Zetasizer. The result was as shown in FIG. 1A. As shown in FIG. 1A, when the N / P ratio was 0.5 or less, the value of PDI was high, suggesting that micelles were not formed well. On the other hand, when the N / P ratio was 1.5 or more, SLI reached a plateau. This suggests that the cationic polymer and ASO were electrically neutralized when the N / P ratio was 1.5. Therefore, in subsequent experiments, the cationic polymer and ASO were mixed so that the N / P ratio was 1.5 to form micelles.
  • Example 2 Glucose modification rate Next, the relationship between the glucose modification rate and particle formation, the relationship with blood retention, and the relationship with accumulation in the brain were examined.
  • ASO micelles were prepared using Alexa647-labeled ASO. Each micelle was diluted with phosphate buffered saline containing 10% FBS to prepare a solution having an ASO concentration of 5 nM to 5 ⁇ M and incubated at 37 ° C. for 1 hour. 100 ⁇ L of each sample was transferred to an 8-well Lab-Tek TM Chamber (Nalge Nunc Int. Corp., Rochester, NY) and observed using a Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss, Germany) combined with a Confocor3 system.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • Alexa 647 was excited using a He—Ne laser (633 nm) equipped with a bandpass excitation light filter.
  • the corresponding diffusion time was analyzed using Zeiss® Confocor3 software. The result was as shown in FIG. 1C.
  • FIG. 1C no significant change in diffusion time was observed in either micelle at a concentration of 50 nM or more. This result shows that micelles can exist stably without being dissociated even in a severe environment in blood.
  • FIG. 2 shows, as a representative example, a fluorescence electron microscopic image of an ear vessel of a micelle having a glucose content of 25% containing 15 ⁇ M ASO. As shown in FIG. 2, it is shown that the fluorescence derived from Alexa 647 labeled with ASO contained in the micelle decreases in 2 hours.
  • Example 3 Delivery of micelles to brain
  • the delivery efficiency of ASO micelles prepared as described above to the brain parenchyma was evaluated.
  • Glc-PIC (ASO) with a glucose content of 0%, 25% or 50% was prepared using Alexa647 labeled ASO as described above.
  • mice were administered tail vein with Glc-PIC (ASO) having a glucose content of 0%, 25% or 50% containing 20 ⁇ g of ASO or naked ASO not contained in micelles. The mouse was sacrificed and the brain was removed.
  • the removed brain was washed with PBS to remove the remaining blood. After measuring the brain weight, each brain tissue was shredded. As a control, a sample prepared by mixing PBS or the same amount of micelle solution with the brain tissue was used. Tissue was homogenized using a multi-bead shocker in lysis buffer and centrifuged at 2,500 rpm for 10 minutes. 100 ⁇ L of the supernatant was transferred to a 96-well black plate, and the fluorescence intensity of each was measured using a TECAN microplate reader. The fluorescence intensity of the brain tissue was indicated by the relative fluorescence intensity with respect to the control. The result was as shown in FIG. 4A.
  • bare ASO or Glc-PIC (ASO) with 0% glucose content showed little fluorescence from Alexa 647 in brain tissue compared to 25% glucose Fluorescence of 6.2% or 3.6% was observed in micelles with a content of 50% or glucose with a glucose content of 50%, respectively.
  • FIG. 5 shows the ratio of the accumulation of Glc-PIC (ASO) having a glucose content of 25% in each organ and the ratio of the accumulation of naked ASO in each organ in the brain. Then, it was revealed that Glc-PIC (ASO) having a glucose content of 25% is less accumulated in the liver and all other tissues than naked ASO, and shows a specifically high accumulation in the brain.
  • “0%” indicates that the glucose modification rate is 0%
  • “25%” indicates that the glucose modification rate is 25%
  • “50%” indicates that the glucose modification rate is 50%. %.
  • Glc-PIC (ASO) micelles were formed by the same method as that described in the above example except that the number average molecular weight of PEG was changed. More specifically, the efficiency of micelle formation and the delivery efficiency to the brain of Glc-PIC (ASO) micelles with a PEG block number average molecular weight of 2 kDa and Glc-PIC (ASO) micelles with a PEG block number average molecular weight of 12 kDa Show. The results were as shown in FIGS. 6A-6C.
  • the amount of micelles accumulated in the brain was 6.2% in the ASO micelles (Gluc / m (2k)) having a PEG block with an average molecular weight of 2 kDa.
  • the accumulation in the brain was 0.2%. From this result, it became clear that micelles having a PEG block with an average molecular weight of 2 kDa are advantageous in terms of the efficiency of micelle delivery to the brain.
  • model micelles with a number average molecular weight of 2 kD use Gluc-PEG-PAsp (2k-80), PEG-PAsp (2k-75), and PEG-DAP (2k-76) without using ASO.
  • DAP represents PEG-Pasp whose side chain is modified with diaminopentane
  • 2k represents the number average molecular weight of PEG
  • the subsequent numbers represent the number average degree of polymerization of amino acids ⁇ .
  • the micelle formation efficiency is high, but the accumulation efficiency in the brain is low.
  • the number average molecular weight is 2 kDa, the accumulation efficiency in the brain is high.
  • the micelle formation efficiency is low.
  • the above cationic polymer having an average molecular weight of PEG in the PEG block of 5 kDa and plasmid DNA (pDNA) or mRNA were used in the same manner as the ASO micelle preparation method described in the above example.
  • a micelle was formed.
  • plasmid DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 (4931 base length) was used as pDNA
  • mRNA having the base sequence of SEQ ID NO: 3 (720 base length) encoding EGFP was used as mRNA.
  • FIG. 6D the case where pDNA was used as an anionic polymer, mRNA was used, and the obtained micelles were monodispersed unlike the case of using ASO. It was revealed that the micelle formation efficiency was lower than that of ASO micelles.
  • the above results that the formation efficiency of Glc-PIC (ASO) containing a PEG block having a number average molecular weight of 5 kDa is high and the accumulation efficiency of Glc-PIC (ASO) in the brain is high. It is understood that the result depends on the number average molecular weight of PEG and the type of anionic polymer. That is, when the number average molecular weight of PEG is 2 kDa, the formation efficiency of Glc-PIC (ASO) is low, which is disadvantageous in production cost and production efficiency.

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Abstract

本発明は、数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとを含む、ポリイオンコンプレックスミセルを提供する。

Description

数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを含む、ポリイオンコンプレックスミセル
　本発明は、数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを含む、ポリイオンコンプレックスミセルに関する。
　薬剤送達システムの開発は、内包される薬物を効率的にかつ選択的に標的組織または臓器へと送達するものである。薬剤送達システムは、内包される薬物の血中滞留性を高める役割を果たし得る。
　脳に対する薬剤送達システムとしては、特許文献１では、表面をグルコースで修飾したミセルが開示されている。特許文献１では、血糖操作を行いつつ、表面をグルコースで修飾したミセルを投与すると、ミセルの脳への集積が顕著に高まることを明らかにしている。
WO2015/075942
　本発明は、数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド）とを含む、ポリイオンコンプレックスミセルを提供する。
　本発明者らは、数平均分子量が２ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを混合すると、ポリイオンコンプレックスミセルの形成効率が低いことを見出した。本発明者らはまた、数平均分子量が１２ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを混合すると、ポリイオンコンプレックスミセルは、ＰＥＧブロック側を修飾する薬剤送達のための標的化分子がＰＥＧの内部に潜り込み、ミセルの表面に提示される効率が低くなることを見出した。本発明者らはさらに、数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、核酸とを含む、ポリイオンコンプレックスミセルは、核酸がDNAまたはmRNAである場合には形成効率が低いのに対して、核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合には効率良く形成され得ること、および、ミセルが形成された場合にＰＥＧブロック側を修飾する薬剤送達のための標的化分子がミセル表面に露出しやすくなることを見出した。
　本発明によれば、以下の発明が提供され得る。
（１）数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを含む、ポリイオンコンプレックスミセル。
（２）数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側の末端が細胞表面または細胞外基質に結合する分子により修飾されている、上記（１）に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
（３）細胞表面への結合分子が、ＧＬＵＴ１リガンドである、上記（２）に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
（４）ＧＬＵＴ１リガンドが、グルコースである、上記（３）に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
（５）数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側末端の１０～４０モル％がグルコースにより修飾されている、上記（４）に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
（６）ＰＥＧブロックの数平均分子量が４ｋＤａ～７ｋＤａである、上記（１）～（５）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスミセル。
（７）上記（１）～（６）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスミセルを含む医薬組成物。
（８）上記（１）～（６）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスミセルを含んでなる、投与計画に従って対象に投与するための医薬組成物であって、
　該投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該医薬組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含み、
　該ポリイオンコンプレックスミセルは、その外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、医薬組成物。
図１Ａは、カチオン性ポリマーとアンチセンスオリゴの混合比（Ｎ／Ｐ比）と散乱光強度（ＳＬＩ）および多分散度（ＰＤＩ）との関係を示す。 図１Ｂは、ミセルを構成するカチオン性ポリマーの総数に対するグルコース修飾を受けたカチオン性ポリマーの割合（glucose contains in micelle (%)）と、粒径およびＰＤＩと関係を示す。 図１Ｃは、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）存在下におけるＡＳＯミセルの拡散時間とミセル形成に用いたＡＳＯ濃度との関係を示す。 図２は、マウスに投与されたＡＳＯミセルを耳の血管において観察した蛍光電子顕微鏡像である。 図３は、マウスに投与されたＡＳＯミセルの血中滞留性（Relative Invensity）を示す。 図４Ａは、蛍光標識したＡＳＯミセルを投与したマウスの脳組織に蓄積したＡＳＯミセルの量とＡＳＯ表面のグルコース修飾の割合との関係を示す。縦軸は、投与量に対する脳組織に蓄積したミセルの割合を脳組織１ｇあたりで換算して求めた値を示す。 図４Ｂは、蛍光標識したＡＳＯミセルを投与したアルツハイマー病のマウスの脳組織に蓄積したＡＳＯミセルの量とＡＳＯ表面のグルコース修飾の割合との関係を示す。縦軸は、投与量に対する脳組織に蓄積したミセルの割合を脳組織１ｇあたりで換算して求めた値を示す。 図５は、カチオン性ポリマーの２５％がグルコースで修飾されたＧｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）の各臓器への蓄積量と裸のＡＳＯの脳への各臓器への蓄積の比を示す。 図６Ａは、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が２ｋＤａであるＡＳＯミセルの散乱光強度（ＳＬＩ）を示す。 図６Ｂは、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が１２ｋＤａであるＡＳＯミセルの散乱光強度（ＳＬＩ）を示す。 図６Ｃは、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が２ｋＤａであるモデルミセルと、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が１２ｋＤａであるＡＳＯミセルのマウス脳への集積の程度を示す図である。 図６Ｄは、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が５ｋＤａであり、アニオン性ポリマーがプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるミセルの形成効率を示す。縦軸は、散乱光強度（ＳＬＩ）を示す。
発明の詳細な説明
　本明細書では、「ミセル」とは、１層の分子膜（または分子層）により形成される小胞を意味する。ミセルとしては、界面活性剤などの両親媒性分子により形成されるミセル、および、ポリイオンコンプレックスにより形成されるミセル（ＰＩＣミセル）が挙げられる。ミセルは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいと知られている。
　本明細書では、「ポリイオンコンプレックス」（以下、「ＰＩＣ」ともいう）とは、ＰＥＧとアニオン性ブロックとの共重合体と、ＰＥＧとカチオン性ブロックとの共重合体とを水溶液中で荷電を中和するように混合すると両ブロック共重合体のカチオン性ブロックとアニオン性ブロックとの間で形成されるイオン層である。ＰＥＧと上記の荷電性連鎖とを結合させる意義は、ポリイオンコンプレックスが凝集して沈殿することを抑制すること、および、それにより、ポリイオンコンプレックスが粒径数十ｎｍの単分散なコア－シェル構造を有するナノ微粒子を形成することである。この際、ＰＥＧはナノ微粒子の外殻（シェル）を覆うため、生体適合性が高く、血中滞留時間を向上させる点で都合がよいことでも知られている。また、ポリイオンコンプレックス形成において、一方の荷電性ブロックコポリマーは、ＰＥＧ部分を必要とせず、ホモポリマー、界面活性剤、核酸および／または酵素に置き換えてもよいことが明らかとなっている。そして、ポリイオンコンプレックス形成においては、アニオン性ポリマーおよびカチオン性ポリマーの少なくとも１つがＰＥＧとの共重合体を形成しており、その両方がＰＥＧとの共重合体を形成していてもよい。また、ＰＥＧ含有量を増加させるとＰＩＣミセルが形成されやすく、ＰＥＧ含有量を低減させるとＰＩＣｓｏｍｅが形成されやすいことがよく知られている。ポリイオンコンプレックスの作製によく用いられるアニオン性ポリマーまたはブロックとしては、例えば、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸および核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）が挙げられ、カチオン性ポリマーまたはブロックとしては、例えば、ポリリジンおよびポリ（５－アミノペンチルアスパラギン酸）が挙げられる。ここで、ｍＲＮＡとは、翻訳によりタンパク質合成に用いられるメッセンジャーＲＮＡを意味し、ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる二本鎖ＲＮＡ（核酸）を意味する。ｓｉＲＮＡは、特に限定されないが、２０～３０ｂｐ、好ましくは、２１～２３ｂｐ、２５ｂｐ、２７ｂｐからなる二本鎖ＲＮＡであって、標的遺伝子の配列と相同な配列を有する二本鎖ＲＮＡである。本発明では、ＰＩＣにおいてアニオン性ポリマーとしてアンチセンスオリゴを用いることができる。
　　本明細書では、「低血糖を誘発させる」とは、対象において、その処置がされなければ示したはずの血糖よりも血糖値を低下させることをいう。低血糖を誘発させる方法としては、糖尿病薬の投与などが挙げられる。例えば、低血糖を誘発させる際に、低血糖を誘発させるという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許容される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
　本明細書では、「絶食させる」とは、対象に絶食、例えば、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上または４８時間以上の絶食をさせることを意味する。絶食により対象は低血糖を引き起こす。絶食期間は、対象の健康状態に鑑みて医師等により決定され、例えば、対象が空腹時血糖に達する時間以上の期間とすることが好ましい。絶食期間は、例えば、脳血管内皮細胞の血管内表面でのＧＬＵＴ１の発現が増大する、またはプラトーに達する以上の時間としてもよい。絶食期間は、例えば、１２時間以上、２４時間以上または３６時間以上である上記期間とすることができる。また、絶食は、血糖値やＧＬＵＴ１の血管内表面での発現に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
　本明細書では、「血糖値の上昇を誘発させる」とは、低血糖を誘発させた対象、または、低血糖状態を維持させた対象において血糖値を上昇させることをいう。血糖値は、当業者に周知の様々な方法により上昇させることができるが、例えば、血糖値の上昇を誘発するものの投与、例えば、グルコース、フルクトース（果糖）、ガラクトースなどの血糖値の上昇を誘発する単糖の投与、マルトースなどの血糖値の上昇を誘発する多糖の投与、若しくは、デンプンなどの血糖値の上昇を誘発する炭水化物の摂取、または、食事により上昇させることができる。
　本明細書では、「血糖操作」とは、対象に対して、低血糖を誘発させ、その後、血糖値を上昇させることをいう。対象に対して低血糖を誘発させた後は、対象の血糖値を低血糖に維持することができる。対象の血糖値を低血糖に維持する時間は、例えば、０時間以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上、４８時間以上とすることができる。その後、血糖値を上昇させることができる。本明細書では、「血糖を維持する」とは、対象において低血糖を維持するという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
　本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。ここで疾患としては、脳神経疾患、例えば、精神病性障害、うつ病、気分障害、不安、睡眠障害、認知症および物質関連障害が挙げられる。また、認知症としては、特に限定されないがアルツハイマー病およびクロイツフェルト・ヤコブ病が挙げられる。
　本明細書では、「血液脳関門」とは、血行と脳の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液脳関門の実態は、脳血管内皮細胞などであると考えられている。血液脳関門の物質透過性については、不明な点が多いが、グルコース、アルコールおよび酸素は血液脳関門を通過し易いことが知られ、脂溶性物質や小分子（例えば、分子量５００未満）は、水溶性分子や高分子（例えば、分子量５００以上）に比べて通過し易い傾向があると考えられている。多くの脳疾患治療薬や脳診断薬が血液脳関門を通過せず、このことが脳疾患の治療や脳の分析等の大きな障害となっている。本明細書では、「血液神経関門」とは、血行と末梢神経の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液髄液関門」とは、血行と脳脊髄液との間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液網膜関門」とは、血行と網膜組織の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液神経関門、血液髄液関門および血液網膜関門の実体は、それぞれの関門に存在する血管内皮細胞などであると考えられており、その機能は血液脳関門と同様であると考えられている。
　本明細書では、「ＧＬＵＴ１リガンド」とは、ＧＬＵＴ１と特異的に結合する物質を意味する。ＧＬＵＴ１リガンドとしては、様々なリガンドが知られ、特に限定されないが例えば、グルコースおよびヘキソースなどの分子が挙げられ、ＧＬＵＴ１リガンドは、いずれも本発明でグルコースの代わりにキャリアまたはコンジュゲートの調製に使用することができる。ＧＬＵＴ１リガンドは、好ましくはＧＬＵＴ１に対してグルコースと同等またはそれ以上の親和性を有する。２－Ｎ－４－（１－アジ－２，２，２－トリフルオロエチル）ベンゾイル－１，３－ビス（Ｄ－マンノース－４－イルオキシ）－２－プロピルアミン（ＡＴＢ－ＢＭＰＡ）、６－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（６－ＮＢＤＧ）、４，６－Ｏ－エチリデン－α－Ｄ－グルコース、２－デオキシ－Ｄ－グルコースおよび３－Ｏ－メチルグルコースもＧＬＵＴ１と結合することが知られ、これらの分子もＧＬＵＴ１リガンドとして本発明に用いることができる。
　本明細書では、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「アンチセンスオリゴ」、「ＡＳＯ」または「アンチセンス化合物」は、相互互換的に用いられ、生理的条件（例えば、細胞内）で細胞から産生される標的となる核酸とハイブリダイズすることのできる分子である。「アンチセンスオリゴ」または「アンチセンス化合物」は、単量体単位のポリマーであって、各単量体単位は塩基とバックボーンを有し、バックボーンは単量体間の連結を有し、これにより、アンチセンスオリゴと標的となる核酸（例えば、ＲＮＡ）との間にワトソン－クリック型のベースペアリングを可能とした分子である。アンチセンスオリゴとしては、例えば、核酸、特にＲＮＡおよびＤＮＡ並びにこれらの安定性を高めたアナログ（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、モルフォリノオリゴ、ペプチド核酸）等の様々な核酸が開発されている。いずれのアンチセンスオリゴも、標的となる核酸とワトソン－クリック型のベースペアリングを形成するために塩基を有し、アニオン性のポリマーとなっている。アンチセンスオリゴ（またはオリゴヌクレオチド）は、ある態様では、１５塩基長以上、１６塩基長以上、１７塩基長以上、１８塩基長以上、１９塩基長以上、２０塩基長以上、２１塩基長以上、２２塩基長以上、２３塩基長以上、２４塩基長以上、２５塩基長以上、または２６塩基長以上であり得、および／または、１００塩基長以下、９０塩基長以下、８０塩基長以下、７０塩基長以下、６０塩基長以下、５０塩基長以下、４０塩基長以下、または３０塩基長以下であり得る。アンチセンスオリゴ（またはオリゴヌクレオチド）は、ある態様では、１５～５０塩基長、１５～４０塩基長、１５～３０塩基長、２０～５０塩基長、２０～４０塩基長、２０～３０塩基長、１８～４０塩基長、１８～３０塩基長、１８～２５塩基長、または２１～２６塩基長であり得る。ある態様では、アンチセンスオリゴは、両末端に安定性を高めた核酸アナログを有するＲＮＡおよびＤＮＡなどの核酸であり得る。
　本明細書では、「単分散」とは、粒子群が、各粒子の粒径の標準偏差が１０％以内である、粒子群であることを意味する。ここで粒径は、例えば、動的散乱光法に基づいて決定することができる。観察された散乱光の時間的な揺らぎから光子相関法により自己相関関数を求め、キュムラント法およびヒストグラム法解析等により、拡散係数や粒子径、粒子径分布を求めることができる。
　本発明者らは、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとのＰＩＣミセルにおいて、ＰＥＧブロックを構成するＰＥＧの数平均分子量が小さいとミセル形成効率が低下することを示した。本発明者らはまた、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとのＰＩＣミセルにおいて、ＰＥＧブロックを構成するＰＥＧの数平均分子量が大きいと、ＰＥＧブロック側を薬剤送達のための標的化分子で修飾しても、当該標的化分子がミセル表面に表出しにくいことを示した。本発明者らはさらに、アンチセンスオリゴとのＰＩＣミセルにおいて、ＰＥＧブロックを構成するＰＥＧの数平均分子量が中程度である場合には、ミセル形成効率に優れ、標的化分子がミセル表面に露出しやすくなることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明によれば、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとのＰＩＣミセルであって、ＰＥＧブロックの数平均分子量が例えば３ｋＤａ～１０ｋＤａである、ＰＩＣミセルが提供される。
　本発明では、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーにおけるＰＥＧブロックの数平均分子量は、特に限定されないが例えば、その下限値を３ｋＤａ以上、３．５ｋＤａ以上、４ｋＤａ以上、または４．５ｋＤａ以上とすることができる。本発明では、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーにおけるＰＥＧブロックの数平均分子量は、その上限値を１１ｋＤａ以下、１０ｋＤａ以下、９ｋＤａ以下、８ｋＤａ以下、７ｋＤａ以下、６ｋＤａ以下、または５．５ｋＤａ以下とすることができる。本発明では、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーにおけるＰＥＧブロックの数平均分子量は、例えば、上記の下限値から選択される１つの下限値と、上記の上限値から選択される１つの上限値との範囲の数値であり得る。本発明では、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーにおけるＰＥＧブロックの数平均分子量は、例えば、３ｋＤａ～１０ｋＤａ、３．５ｋＤａ～９ｋＤａ、４ｋＤａ～７ｋＤａ、４ｋＤａ～６ｋＤａ、例えば、約５ｋＤａ（例えば、５ｋＤａ±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、または±１０％）であり得る。
　本発明によれば、アニオン性であるアンチセンスオリゴは、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとの間でイオン相互作用により、ポリイオンコンプレックスミセルを形成できる。アニオン性であるアンチセンスオリゴと前記ブロックコポリマーとのポリイオンコンプレックスミセルでは、アンチセンスオリゴは、ＰＥＧによる修飾を有していても有していなくてもよい。ある態様では、アンチセンスオリゴは、前記ブロックコポリマーが有するＰＥＧ鎖の数平均分子量の、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、９０％以下または９５％以下の数平均分子量のＰＥＧブロックを有していてもよい。ある態様では、アンチセンスオリゴは、ＰＥＧによる修飾を有しない。
　ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとの混合比は、例えば、Ｎ／Ｐ比（ポリマー側鎖の窒素原子数とDNAのリン酸基数の比）で、１．０～２．０、１．１～１．９、１．２～１．８、１．３～１．７、１．４～１．６または約１．５とすることができる。
　本明細書では、ＰＥＧは、直鎖状のＰＥＧでありうる。本発明では、ＰＥＧに置き換えて他の親水性ポリマーブロックを用いてもよい。
　本明細書では、カチオン性ポリマーとしては、カチオン性単量体単位のポリマーを用いることができる。カチオン性単量体単位としては、特に限定されないが例えば、非天然のカチオン性アミノ酸（例えば、修飾された天然のカチオン性アミノ酸）、または天然のカチオン性アミノ酸を用いることができる。天然のカチオン性アミノ酸としては、リジンおよびオルニチンから選択される１以上の天然のカチオン性アミノ酸が挙げられる。非天然のカチオン性アミノ酸としては、カチオン性側鎖で修飾されたグルタミン酸およびアスパラギン酸から選択される修飾された１以上の天然アミノ酸が挙げられる。カチオン性側鎖としては、例えば、５－アミノペンチル基、４－アミノブチル基、３－アミノプロピル基、２－アミノエチル基を有する基が挙げられ、これらの基においては、ＣがＮにより置き換えられていてもよい。カチオン性側鎖としてはまた、－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ２、－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ２（ジエチルトリアミン（ＤＥＴ）ということがある）、－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ２（トリエチルテトラアミン（ＴＥＴ）ということがある）、および－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ２（テトラエチルペンタアミン（ＴＥＰ）ということがある）が挙げられる。カチオン性アミノ酸は、例えば、架橋の利便性を高めるために、その側鎖が２－イミノチオランまたはジメチル３，３’－ジチオビス（プロピオンイミダート）（ＤＴＢＰ）により修飾されていてもよい｛但し、少なくとも一部または全部のアミノ酸はカチオン性を維持する｝。
　本発明では、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーは、ＰＥＧ側の末端が薬剤送達のための標的化分子で修飾されていてもよい。ここで、薬剤送達のための標的化分子とは、上記ブロックコポリマーを用いてミセルを形成させたときにミセルの表面に露出し、標的化したい体内の部位の表面に選択的に発現する分子（例えば、膜タンパク質、糖タンパク質、受容体、およびその他）に選択的に結合する分子（例えば、抗体若しくは抗体の抗原結合断片、受容体のリガンド、レクチン、または親和性を有するペプチド、例えば、ＲＧＤペプチド若しくはｃＲＧＤペプチド）を言う。本明細書では、「選択的」とは、他の分子に対するよりも強い親和性で特定の分子に結合しうることを言う。薬剤送達においては、標的化したい体内の部位の表面に選択的に発現する分子に対して選択的に結合する標的化分子をミセル表面に露出させることにより、ミセルを当該標的化したい体内の部位に集積させ得る。
　本明細書では、薬剤送達のための標的化分子としては、細胞表面に結合する分子、または細胞外基質に結合する分子が上げられる。細胞表面に結合する分子は、例えば、細胞表面に露出する受容体、チャンネルなどの膜タンパク質、糖タンパク質に結合する分子であり得る。例えば、ＧＬＵＴ１は、体内の特定箇所の血管内皮細胞の血管側表面に表出する。従って、薬剤送達のための標的化分子としては例えば、ＧＬＵＴ１に結合する分子（以下、「ＧＬＵＴ１リガンド」という）が挙げられる。ＧＬＵＴ１リガンドとしては、様々なリガンドが知られており、特に限定されないが例えば、グルコースおよびヘキソースなどの分子が挙げられる。ＧＬＵＴ１リガンドとしてはまた、ＧＬＵＴ１と結合することが知られる、２－Ｎ－４－（１－アジ－２，２，２－トリフルオロエチル）ベンゾイル－１，３－ビス（Ｄ－マンノース－４－イルオキシ）－２－プロピルアミン（ＡＴＢ－ＢＭＰＡ）、６－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（６－ＮＢＤＧ）、４，６－Ｏ－エチリデン－α－Ｄ－グルコース、２－デオキシ－Ｄ－グルコースおよび３－Ｏ－メチルグルコースが挙げられる。
　本発明で用いられ得るアンチセンスオリゴとしては、特に限定されないが例えば、ＢＡＣＥ１遺伝子、ＲＡＧＥ遺伝子、Ｍａｒａｔ１遺伝子、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦベータ遺伝子、Ｅｒｂ－Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ－２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ－１遺伝子、ベータカテニン遺伝子、ｃ－ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、ＳＯＲＴ１遺伝子、ＸＢＰ１遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩアルファ遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢ Ｉ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、癌抑制遺伝子、およびｐ５３癌抑制遺伝子からなる群から選択される遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴが挙げられる。また例えば、アンチセンスオリゴは、発生関連タンパク質（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼインヒビター、Wntファミリーのメンバー、Paxファミリーのメンバー、Winged ヘリックスファミリーのメンバー、Hoxファミリーのメンバー、サイトカイン/リンホカインおよびその受容体、増殖/分化因子およびその受容体、神経伝達物質およびその受容体など)；腫瘍遺伝子をコードするタンパク質(例えば、ABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ERBB2、ERBB3、ETSI、ETSI、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIM 1、PML、RET、SRC、TALI、TCL3およびYESなど)；腫瘍抑制タンパク質(たとえば、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF 1、NF2、RB 1、TP53またはWTIなど)；および酵素(たとえば、ACCシンターゼおよびオキシダーゼ、ACPデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ADPグルコースピロホスホリラーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ、ATPアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、DNAおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプン合成酵素、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリン合成酵素、オクトピン合成酵素、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長調節因子合成酵素、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プルラナーゼ、レコンビナーゼ、逆転写酵素、RUBISCO、トポイソメラーゼまたはキシラナーゼなど)をコードする遺伝子を標的とすることができる。また例えば、アンチセンスオリゴは、腫瘍増殖(血管新生を含む)または転移活性に関与するタンパク質をコードする遺伝子を標的とすることもできる。また例えば、アンチセンスオリゴは、１つ以上の分泌タンパク質、細胞周期制御タンパク質、遺伝子調節タンパク質、アポトーシス調節タンパク質または免疫応答、炎症、補体カスケードもしくは血液凝固系に関与するタンパク質をコードする遺伝子を標的とすることもできる。また例えば、アンチセンスオリゴは、c-myc、c-myb、mdm2、PKA-I(I型プロテインキナーゼA)、Ras、c-Rafキナーゼ、CDC25ホスファターゼ、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(cdks)、テロメラーゼ、PDGF/sisおよびmosをコードする遺伝子を標的とすることができる。また例えば、アンチセンスオリゴは、Bcr/Abl融合腫瘍遺伝子などの染色体転座によって生じる融合遺伝子によってコードされるmRNAを標的化するのに用いることもできる。また例えば、アンチセンスオリゴは、サイクリン依存性キナーゼ、増殖性細胞核抗原(PCNA)、形質転換成長因子β(TGF-β)、核因子κB(NF-κB)、E2F、HER-2/neu、PKA、TGF-α、EGFR、TGF-β、IGFIR、P12、MDM2、VEGF、MDR、トランスフェリン、フェリチン、フェリチン受容体、トランスフェリン受容体、IRE、C-fos、HSP27、メタロチオネインなどのタンパク質をコードする遺伝子を標的とすることもできる。
　本発明によれば、ＰＩＣミセルは、数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとを混合して作成することができる。この際、数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとは、電気的に中和する量比で混合してもよい。また、ＰＩＣミセルを形成させ、その後、ミセルを形成するポリマー間を架橋してもよい。架橋は、例えば、架橋剤を用いて行うことができる。架橋はまた、例えば、本実施例で開示するようにカチオン性ポリマーの側鎖に導入した２－イミノチオランやジメチル３，３’－ジチオビス（プロピオンイミダート）（ＤＴＢＰ）間のＳ－Ｓ結合により形成させてもよい。本発明では、架橋をしないＰＩＣミセルであっても、ＰＥＧの数平均分子量を調節することによる、薬剤送達のための標的化分子のミセル表面への表出は理論的に起こると考えられる。
　本発明では、数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとは、前記ブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとの間でイオン層を形成し、これによりポリイオンコンプレックスミセルの形態となり得る。本発明のある態様では、数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーのＰＥＧ側の末端は、例えば、ＧＬＵＴ１リガンド、例えばグルコースにより修飾されていてよい。本発明のある態様では、グルコースはその６位の炭素に連結した酸素原子を介してＰＥＧブロックを修飾していてよい。本発明のある態様では、ＧＬＵＴ１リガンドは、カチオン性ポリマーのＰＥＧ末端に連結される。
　本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとを含む、ＰＩＣミセルは、投与計画に従って投与され得るものであり、投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該ミセルを投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含むものである。ＷＯ２０１５０７５９４２Ａに開示されるように、ＧＬＵＴ１リガンドにより表面が修飾された小胞は、投与されると脳への送達効率がＧＬＵＴ１リガンドで修飾されていない小胞よりも高まる。また、ＷＯ２０１５０７５９４２Ａに開示されるように、ＧＬＵＴ１リガンドにより表面が修飾された小胞は、上記投与計画に従って投与されると、脳への送達効率がこのような操作をせずに単に投与されたＧＬＵＴ１リガンドにより表面が修飾された小胞よりもさらに高まる。また、上記のＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとを含む、ＰＩＣミセルは、血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門を通過させることができる。
　本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとアンチセンスオリゴとを含む、ＰＩＣミセルは、ＧＬＵＴ１リガンドを有しない数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーをさらに含んでいてもよい。本発明のある態様では、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとＧＬＵＴ１リガンドを有しない数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとは、１０：９０～４０：６０（例えば、２０：８０～３０：７０、例えば、２５：７５）のモル比で上記ＰＩＣミセルに含まれていてもよい。あるいは、数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側末端の１０～４０モル％（例えば、２０～２０モル％、例えば、２５モル％）をグルコースにより修飾させることができる。ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されたブロックコポリマーの比率を１０：９０～４０：６０（または１０～４０モル％）とすることにより、ＰＩＣミセルは、血管内皮細胞を通り抜け易くなり、組織の実質により多く集積しやすくなる。本発明のある態様では、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとＧＬＵＴ１リガンドを有しない数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとのブロックコポリマーとは、５０：５０～１００：０（例えば、６０：４０～９０：１０、７０：３０～８０：２０）のモル比で上記ＰＩＣミセルに含まれていてもよい。あるいは、数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側末端の５０～１００モル％がグルコースにより修飾させることができる。ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されたブロックコポリマーの比率を５０：５０～１００：０（または５０モル％～１００モル％）とすることにより、上記ＰＩＣミセルは、血管内皮細胞に取り込まれるが、血管内皮細胞から組織実質に放出されにくくなり、結果として血管内皮細胞に集積しやすくなると考えられる。従って、ＧＬＵＴ１を発現する血管内皮細胞を通過させたいか、ＧＬＵＴ１を発現する血管内皮細胞に蓄積させたいかによって、ＰＩＣにおけるＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されたブロックコポリマーの比率を調節することができる。
　本発明のミセルは、経口投与および非経口投与（例えば、静脈内投与または腹腔内投与）により投与することができる。
　本発明によれば、本発明のミセルを含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、本発明のミセルおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。
実施例１：ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセルの構築
　本実施例では、アンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロックを有するカチオン性ポリマーとを用いてポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセル（以下、「ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセル」ということがある）を構築した。脳への集積効率を確認するため、上記と同様にＧｌｃ（６）をＰＥＧ鎖に連結させた。また、架橋剤を用いずに分子間架橋を導入するため、リジン側鎖に２－イミノチオラン（２－ＩＴ）またはジメチル３，３’－ジチオビス（プロピオンイミダート）（ＤＴＢＰ）を導入した。ＰＥＧの長さは、数平均分子量５ｋＤａに設定した。
（１）ＤＩＧ（６）の合成
　１，２-ｏ-イソプロピリデン-α-Ｄ-グルコフラノース（東京化成工業（株）社製）を１１．７ｇナスフラスコに量り取り、ピリジン（和光純薬工業（株）社製）６０ｍLを加えてドライヤーで加熱して溶解させ、その後ジクロロメタン（和光純薬工業（株）社製）を６０ｍＬ加えた。塩化ピバロイル（和光純薬工業（株）社製）を７．２ｍL滴下し、室温で５時間撹拌混合した。反応後、溶媒を減圧下にて除去し、純水を１００ｍL軽く撹拌しながら加えた。析出してきた白色の固形物を吸引ろ過（桐山ろ紙５Ｃ）にて回収し、純水で洗浄した。得られた白色固形物を減圧下にて乾燥した。乾燥させた白色固形物全量を６５度に温めた少量のメタノールに溶解させ、その後冷却することで再結晶にて精製を行い、針状の結晶を得た。
　ジメトキシプロパン（和光純薬工業（株）社製）２９０ｍLとｐ－トルエンスルホン酸（和光純薬工業（株）社製）３６７ｍｇを加え、７５℃に加熱して溶解させ、針状結晶へと加え、７５℃で３０分撹拌混合し、室温へと戻した。反応後トリエチルアミン（和光純薬工業（株）社製）を１ｍL少しずつ滴下し、トルエン（和光純薬工業（株）社製）を５０ｍL加えた。混合液を減圧下にて５０ｍL程度まで濃縮し、再度トルエンを５０ｍL加えて再度２０ｍL程度まで濃縮した。得られた濃縮液をジクロロメタン１００ｍLと純水１００ｍLで３回抽出し、ジクロロメタン層をビーカーに回収し、無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業（株）社製）を適量加えて３０分撹拌混合した。吸引ろ過（桐山ろ紙５Ｃ）にて固形物を除去し、ろ液を減圧下で濃縮した。濃縮されたオイル状の溶液をシリカゲル（メルク社製）にて分離精製を行った。展開溶媒としてはヘキサン（和光純薬工業（株）社製）：酢酸エチル（和光純薬工業（株）社製）＝７：３を用いた。
　精製物にメタノール（和光純薬工業（株）社製）３０ｍLを加えて７０℃に加熱して溶解した。５規定の水酸化ナトリウム水溶液を６０ｍL加え、７０℃で１時間激しく撹拌した。ジクロロメタン３００ｍLを反応液に加えて抽出し、ジクロロメタン層を回収し、その後同様の条件で抽出を２回繰り返した。抽出液に適量の無水硫酸ナトリウムを加えて３０分間撹拌し、吸引濾過（桐山ろ紙５Ｃ）にて固形物を除去し、ジクロロメタンを減圧下にて濃縮し、白色固形物を得た。白色固形物を７５℃に温めた少量のエタノールで溶かし、冷却して析出してきた粒上の結晶を吸引ろ過（桐山ろ紙５Ｃ）で回収し、減圧下で乾燥させることでＤＩＧ（６）を得た。
（２）ＤＩＧ（６）－ＰＥＧ－ＮＨ 2 の合成
　ＤＩＧ（６）を５２０ｍｇ量り取り、少量のジクロロメタンおよびベンゼンで溶解し、凍結乾燥を行った。乾燥したＤＩＧ（６）にアルゴン雰囲気下で蒸留にて精製したテトラヒドロフランを７５ｍL添加し、０．３ｍｏｌ／Ｌのカリウムナフタレン溶液を６．７ｍL加え、５分撹拌した。これに蒸留にて精製したエチレンオキサイド１３．５ｍL加え、２５度で３日間撹拌した。３日後、反応溶液を１．５Lのジエチルエーテル（昭和エーテル社製）に滴下し、沈殿物を吸引ろ過（ＪＣＷＰ　１０μｍ）にて回収し、ＤＩＧ（６）－ＰＥＧ－ＯＨを得た。
　ＤＩＧ（６）－ＰＥＧ－ＯＨを６ｇフラスコに量り取りベンゼンに溶解した後、凍結乾燥した。その後アルゴン雰囲気下で蒸留にて精製したテトラヒドロフランを４０ｍＬ加え、蒸留にて精製したトリエチルアミンを０．３２ｍＬ加えた。別のフラスコに蒸留煮て精製したテトラヒドロフランを２０ｍＬ取り、蒸留にて精製したメタンスルホン酸クロライドを０．１９ｍL加えた。メタンスルホン酸クロライドの溶液を水浴で冷やしながら、ＰＥＧ溶液をゆっくり滴下し、２時間撹拌混合した。反応中に析出した沈殿物を吸引ろ過（ＪＣＷＰ　１０μｍ）にて除去し、ろ液を１Ｌのジエチルエーテルに滴下して、沈殿物を吸引ろ過（桐山ろ紙５Ｃ）にて回収した。その後、沈殿物をナスフラスコにいれ、アンモニア水５００ｍＬ（和光純薬（株）社製）で溶かし、室温で４日間撹拌した。その後、反応液を減圧下で濃縮し、陽イオン交換カラムで精製してＤＩＧ（６）－ＰＥＧ－ＮＨ2（分子量５，３００）を得た。
（３）Ｇｌｃ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓの合成
　ＤＩＧ（６）－ＰＥＧ－ＮＨ2５３０ｍｇをフラスコに量り取り、ベンゼンを加えて溶解し、凍結乾燥を行った。その後、チオ尿素（和光純薬工業（株）社製）を１ｍｏｌ／Ｌの濃度で溶解した蒸留にて精製したＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを１２ｍL加えて溶解した。別のフラスコにＮＣＡ－Ｌｙｓ（ＴＦＡ）をアルゴン雰囲気下で１，３３０ｍｇ量り取り、チオ尿素を１ｍｏｌ／Ｌの濃度で溶解した蒸留にて精製したＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを２６ｍL加えて溶解した。ＮＣＡ－Ｌｙｓ（ＴＦＡ）をＰＥＧ溶液に添加し、３日間２５℃で撹拌混合した。反応液は透析膜（ＭＷＣＯ：３，５００）に入れて外液を水で透析し、凍結乾燥にてＤＩＧ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）を回収した。
　乾燥後、５００ｍｇをフラスコに取り５０ｍLのメタノールと５ｍLの１規定の水酸化ナトリウムを加えて溶解し、３５℃で２４時間撹拌した。その後、反応液を透析膜（ＭＷＣＯ:３，５００）に入れて外液を水で透析し、凍結乾燥にてＤＩＧ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓを回収した。
　得られたＤＩＧ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓを８０％トリフルオロ酢酸（東京化成工業（株）社製）に溶解し、室温で３０分反応させ、反応液は水酸化ナトリウムにて中和後、透析膜（ＭＷＣＯ:３，５００）に入れて透析した。外液は０．０１規定の塩酸で３回、純水で３回透析を行い、凍結乾燥にてＧｌｃ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓを回収した。リジンの数平均重合度は４２であった。
　その後、以下スキームに従ってリジンの側鎖に２－ＩＴまたはＤＴＢＰを導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記で得られたＧｌｃ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ　５０ｍｇを０．１Ｍのホウ砂緩衝液（ｐＨ　９．０）に５ｍL溶解した。別の容器に、ジ-tert-ブチルペルオキシド（ＤＴＢＰ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）　５．５ｍｇ（Ｇｌｃ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓのＰＬｙｓに対して０．１当量）を冷水に溶解した。ＤＴＢＰ溶液をＧｌｃ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ溶液へと滴下し、２５℃で４５分間撹拌した。その後、２－イミノチオラン（２－ＩＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）　５８ｍｇ（Ｇｌｃ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓのＰＬｙｓに対して２．４当量）を粉末のまま添加し、２５℃で３０分撹拌した。反応液を３５℃に加温し、一晩撹拌した。反応溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：３，５００）に移し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液で透析（３０分で外液を交換し、２回透析）した。次いで、ＤＴＴ（和光純薬工業（株）社製）　５４ｍｇ（Ｇｌｃ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓのＰＬｙｓに対して２．０当量）を透析膜の内液に加え、３０分間静置した。その後、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ溶液で３０分で３回、純水で３０分を３回透析した。透析後、フィルター（日本ミリポア社製、ＳｔｅｒｉｖｅｘＴＭ ＧＰ ０．２２μｍ）で処理した後、凍結乾燥し、Ｇｌｃ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）の白色粉末を得た（収量：６０．４ｍｇ）。ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）に結合したＤＴＢＰおよびＩＭの量は、1Ｈ－ＮＭＲにより測定したＤＴＢＰのＣＨ2ピーク、ＩＭのＣＨ2及びＰＥＧのＣＨ2主鎖ピークとの積分比から算出した。得られたＧｌｃ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）のＤＴＢＰ、ＩＭの導入率はそれぞれ１８％、８２％であった（すなわち、上記化学式においてａが０．２であり、ｂが６．２であり、ｃが３５．５であり、ａ＋ｂ＋ｃが４１．９である、分子が得られた）。
（３）Ｇｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセルの調整
　Ｇｌｃ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）を１００ｍＭのジチオスレイトールを含む１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ溶液で５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。ＡＳＯを１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ溶液で３０μＭの濃度で溶解した。電荷が釣り合うように双方の溶液を混合し、１５秒間撹拌混合した。その後、透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＭＷＣＯ：３，５００）に入れ、０．５％ジメチルスルホキシド（和光純薬工業（株）社製）及び５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ溶液を外液として２日間透析を行った。その後外液を５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ溶液に変えて再度２日間透析を行い、Ｇｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセル（以下「ＡＳＯミセル」ともいう）を得た（図１参照）。なお、ＡＳＯの配列は、５’－GGGTCagctgccaatGCTAG－３’であった｛ここで、大文字はＬＮＡであり、小文字はＤＮＡである｝。蛍光標識を付与した場合は、ＡＳＯの３’末端が標識された。
　なお、電荷が釣り合うＮ／Ｐ比は、以下の通り決定した。具体的には、ＰＩＣ（ＡＳＯ）は、Ｎ／Ｐ比（アミジン数／リン酸数）を０．２～１．９までの様々な値でＰＥＧ－ＰＬｙｓとＡＳＯとを混合して、上記と同様の方法でミセルを作製した。その後、ゼータサイザーを用いて粒径、散乱光強度（ＳＬＩ）および多分散度（ＰＤＩ）を測定した。結果は、図１Ａに示される通りであった。図１Ａに示されるように、Ｎ／Ｐ比が０．５以下である場合にはＰＤＩの値が高くミセルが良好に形成しなかったことを示唆した。一方で、Ｎ／Ｐ比１．５以上である場合には、ＳＬＩがプラトーに達した。このことは、Ｎ／Ｐ比が１．５であるときにカチオン性ポリマーとＡＳＯが電気的に中和したことを示唆する。従って、以降の実験では、カチオン性ポリマーとＡＳＯとは、Ｎ／Ｐ比が１．５となるように混合してミセルを形成させた。
実施例２：グルコース修飾率
　次に、グルコース修飾率と粒子形成との関係、血中滞留性との関係、および脳への蓄積との関係を調べた。
（１）グルコース修飾率と粒子形成および粒子の安定性との関係
　Ｇｌｃ（６）－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）とメトキシ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）とを１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、または０：１００のモル比で混合し、グルコース修飾率（グルコース含有量ともいう）を１００％、７５％、５０％、２５％、または０％にそれぞれ調整した。ゼータサイザーを用いて、得られた様々なグルコース含量を有するミセルの粒径（Ｚ－ａｖｅｒａｇｅ）、および多分散度（ＰＤＩ）を測定した。すると、図１Ｂに示されるように、全てのグルコース含量のミセルが０．２未満のＰＤＩを示し、良好にミセルを形成した。また、粒径は、５０～７０ｎｍ程度であり、グルコース含量の増加に伴って粒径が増大した。
　さらに、ＡＳＯミセルのインビボでの安定性を評価した。安定性は、蛍光相関スペクトロスコピー（ＦＣＳ）により測定した。グルコース含量１００％および０％のミセルをＡｌｅｘａ６４７標識ＡＳＯを用いて調製した。それぞれのミセルを１０％ＦＢＳを含むリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、５ｎＭ～５μＭのＡＳＯ濃度の溶液を作製し、３７℃で１時間インキュベートした。それぞれのサンプル１００μＬずつを８穴Lab-Tek Chamber（Nalge Nunc Int. Corp., Rochester, NY）に移し、ConfoCor3 systemと組み合わせたZeiss LSM 510（Carl Zeiss, Germany）を用いて観察した。Ａｌｅｘａ６４７は、バンドパス励起光フィルターを備えたＨｅ－Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）を用いて励起した。対応する拡散時間（Diffusion time）はZeiss Confocor3ソフトウェアを用いて解析した。結果は図１Ｃに示される通りであった。図１Ｃに示されるように、どちらのミセルも５０ｎＭ以上の濃度において拡散時間に大きな変化は認められなかった。この結果は、血中の厳しい環境下でもミセルが解離せず安定的に存在しうることを示すものである。
（２）グルコース修飾率とインビボにおける血中滞留性との関係
　全ての動物実験は、東京大学動物倫理委員会の関連規定を遵守して行われた。Ａｌｅｘａ６４７標識ＡＳＯ（２２．５μＭ）を含むミセルを調製し、マウス（BALB/c、雌、６週齢）に静脈投与した。その後、蛍光強度の経時変化をIVRT-CLSM (Nikon Corp., Tokyo, Japan)を用いて観察した。結果は、図２および３に示される通りであった。
　図３に示されるように、グルコース含量が０％または２５％である場合に最も高い血中滞留性を示した。また、グルコース含量が高まるほど血中滞留性が低下することが明らかになった。
　図２には、１５μＭ　ＡＳＯを含むグルコース含量２５％のミセルの耳の血管の蛍光電子顕微鏡像を代表的な例として示す。図２に示されるように、２時間でミセルに含まれるＡＳＯに標識されたＡｌｅｘａ６４７由来の蛍光が低下するようすが示されている。
実施例３：脳へのミセルの送達
　本実施例では、上記のように作製したＡＳＯミセルの脳実質への送達効率を評価した。
　０％、２５％または５０％のグルコース含有量を有するＧｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）は、上述のようにＡｌｅｘａ６４７標識ＡＳＯを用いて調製した。正常なマウス（BALB/c、雌、６週齢、ｎ＝３）またはアルツハイマー病マウス（BALB/c、雌、６週齢、ｎ＝３）を２４時間絶食させ、血糖値を低下させ、その後、２００μＬの２０（ｗ／ｖ）％グルコースを含むＰＢＳを腹腔内投与した。投与３０分後に、マウスに２０μｇのＡＳＯを含む、０％、２５％若しくは５０％のグルコース含有量を有するＧｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）またはミセルに内包していない裸のＡＳＯを尾静脈投与した。
　マウスを犠牲にし、脳を摘出した。摘出した脳をＰＢＳで洗浄して残存する血液を取り除いた。脳重量を計測した後にそれぞれの脳組織を細断した。対照として、ＰＢＳまたは投与量と同量のミセル溶液を脳組織と混合した試料を用いた。溶解緩衝液中でマルチビーズショッカーを用いて組織をホモジェナイズし、２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１００μＬの上清を９６穴黒色プレートに移し、ＴＥＣＡＮマイクロプレートリーダーを用いてそれぞれの蛍光強度を測定した。脳組織の蛍光強度は、対照に対する相対蛍光強度により示した。結果は、図４Ａに示される通りであった。
　図４Ａに示されるように、裸のＡＳＯまたはグルコース含量が０％であるＧｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）では、脳組織におけるＡｌｅｘａ６４７に由来する蛍光はほとんど観察されなかったのに対して、２５％のグルコース含量のミセル、または５０％のグルコース含量のミセルではそれぞれ、６．２％または３．６％の蛍光が観察された。
　また、アルツハイマー病のマウスの脳へのミセルの集積についても確認したところ、図４Ｂに示されるように、２５％のグルコース含量のミセルは、０％のグルコース含量のミセルと比較して１１倍高い脳への蓄積を示した。この結果は、Ｇｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）がアルツハイマー病治療のための薬剤送達システムとして利用できる可能性を示唆するものである。
　図５には、２５％のグルコース含量のＧｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）の各臓器への蓄積量と裸のＡＳＯの脳への各臓器への蓄積の比を示した。すると、２５％のグルコース含量のＧｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）は肝臓その他のあらゆる組織に対して裸のＡＳＯよりも蓄積が少なく、脳に特異的に高い蓄積を示すことが明らかとなった。図中、「0％」は、グルコース修飾率が0％であることを示し、「25％」は、グルコース修飾率が25％であることを示し、「50％」は、グルコース修飾率が50％であることを示す。
参考例
　本参考例では、ＰＥＧの数平均分子量を変えた以外は上記実施例に記載の手法と同様の手法によりＧｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセルを形成させた。より具体的には、ＰＥＧブロックの数平均分子量が２ｋＤａのＧｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセルとＰＥＧブロックの数平均分子量が１２ｋＤａのＧｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）ミセルのミセル形成効率および脳への送達効率を示す。結果は、図６Ａ～６Ｃに示される通りであった。
　図６Ａに示されるように、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が２ｋＤａの場合、ミセルは形成されるものの、二峰性の粒径分布を示しミセルの形成効率は高くなかったのに対して、図６Ｂに示されるように、１２ｋＤａのＰＥＧブロックを有するミセルは、高いミセル形成効率を示した。また、１２ｋＤａのＰＥＧブロックを有するミセルは、単分散性の粒径分布を示した。この結果は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および抗体の種別によらず同様であった。
　図６Ｃに示されるように、脳へのミセルの集積量は、２ｋＤａの平均分子量のＰＥＧブロックを有するASOミセル（Gluc/m(2k)）では、脳への集積が６．２％であったのに対して、１２ｋＤａの平均分子量のＰＥＧブロックを有するASOミセル（Gluc/m(12k)）では、脳への集積が０．２％であった。この結果から、脳へのミセルの送達効率の面では、２ｋＤａの平均分子量のＰＥＧブロックを有するミセルが有利であることが明らかとなった。なお、本実験では、数平均分子量２ｋＤのモデルミセルは、ASOを用いず、Gluc-PEG-PAsp(2k-80), PEG-PAsp(2k-75), PEG-DAP(2k-76)を用いて調製した｛ここでDAPは、側鎖をジアミノペンタンで修飾したPEG-Paspを示し；２ｋはPEGの数平均分子量を表し、その後の数字はアミノ酸の数平均重合度を表す｝。
　上記から、ＰＥＧブロックの数平均分子量が１２ｋＤａである場合、ミセル形成効率は高いが、脳への集積効率が低く、他方で、数平均分子量が２ｋＤａである場合、脳への集積効率が高いが、ミセル形成効率は低い。
　本参考例ではまた、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が５ｋＤａの上記カチオン性ポリマーと、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）またはｍＲＮＡとを用いて、上記実施例に記載のＡＳＯミセルの作製手法と同様の手法によりミセルを形成させた。ここで、ｐＤＮＡとしては、配列番号２の塩基配列（4931塩基長）を有するプラスミドＤＮＡを用い、ｍＲＮＡとしてはＥＧＦＰをコードする配列番号３の塩基配列（720塩基長）を有するｍＲＮＡを用いた。ミセルの形成効率を確認すると、図６Ｄに示されるように、アニオン性ポリマーとしてｐＤＮＡを用いた場合も、ｍＲＮＡを用いた場合も、ＡＳＯを用いた場合とは異なり、得られたミセルが単分散性を有さず、ミセル形成効率はＡＳＯミセルよりも低いことが明らかとなった。
　このことから、本実施例において、５ｋＤａの数平均分子量を有するＰＥＧブロックを含むＧｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）の形成効率が高く、Ｇｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）の脳への集積効率が高いという上記結果は、ＰＥＧの数平均分子量とアニオン性ポリマーの種類に依存する結果であると理解される。すなわち、ＰＥＧの数平均分子量が２ｋＤａの場合には、Ｇｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）の形成効率が低いために、製造コスト、製造効率において不利であり、ＰＥＧの数平均分子量が１２ｋＤａの場合には、脳への送達効率が低いために不利であり、本実施例のこれらの中間的な数平均分子量を有するＰＥＧを有する場合には、アニオン性ポリマーとしてＡＳＯを用いた場合には、ｐＤＮＡやｍＲＮＡよりもミセル形成効率が格段に高く、これにより、Ｇｌｃ－ＰＩＣ（ＡＳＯ）は、ミセル形成効率および脳への送達効率の両方に優れるものとなった。

Claims (8)

  1. 　数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴとを含む、ポリイオンコンプレックスミセル。
  2. 　数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側の末端が細胞表面または細胞外基質に結合する分子により修飾されている、請求項１に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
  3. 　細胞表面への結合分子が、ＧＬＵＴ１リガンドである、請求項２に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
  4. 　ＧＬＵＴ１リガンドが、グルコースである、請求項３に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
  5. 　数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーのＰＥＧ側末端の１０～４０モル％がグルコースにより修飾されている、請求項４に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
  6. 　ＰＥＧブロックの数平均分子量が４ｋＤａ～７ｋＤａである、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスミセル。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスミセルを含む医薬組成物。
  8. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスミセルを含んでなる、投与計画に従って対象に投与するための医薬組成物であって、
    　該投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該医薬組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含み、
    　該ポリイオンコンプレックスミセルは、その外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、医薬組成物。
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