CN113116855A - 联合递送化疗药物和免疫检查点抗体药物的纳米颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种联合递送化疗药物和免疫检查点抗体药物的纳米颗粒。本发明的纳米颗粒为核壳结构,所述核壳结构是由包括高分子聚合物、聚醇修饰的高分子聚合物和酸响应基团修饰的高分子聚合物的原料自组装而成;其中,所述纳米颗粒的酸响应基团上修饰有树枝状聚酰胺‑胺类聚合物,且树枝状聚酰胺‑胺类聚合物的末端氨基能与免疫检查点抗体药物的Fc段共价连接;所述纳米颗粒的核内包载化疗药物。本发明的纳米颗粒其能够高效地负载化疗药物以及免疫检查点抗体药物,并能在肿瘤微酸环境下逐渐水解释放靶向肿瘤的抗体药物,提高抗体药物在肿瘤部位的富集与渗透,降低两种药物叠加引起的毒副作用,同时提高化疗药物与免疫检查点抗体的协同抗肿瘤疗效。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,特别是涉及联合递送化疗药物和免疫检查点抗体药物的纳米颗粒。
背景技术
最近十年来,针对宿主免疫系统的抗肿瘤治疗策略逐渐成为肿瘤治疗领域的研究热点。随着Ipilimumab(CTLA-4单抗)、Pembrolizumab和Nivolumab(PD-1单抗)、Atezolizumab和Avelumab(PD-L1单抗)等相继被批准用于晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌等多种类型肿瘤的治疗,免疫检查点阻断疗法展现了巨大的临床应用潜力和商业价值,但目前仍面领着诸多困境和挑战。首先,应用此类药物所产生的免疫相关副作用;其次,并且不同类型肿瘤以及同类肿瘤不同患者对免疫检查点阻断疗法的反应差异很大且临床应答率偏低,例如PD-1/PD-L1抗体治疗晚期实体瘤的响应率仅为30%左右,严重限制了受益患者的范围。因此,优化抗体药物,开发更高效的免疫治疗策略是目前亟待解决的问题。
随着肿瘤微环境逐渐被了解,人们发现细胞毒性化疗药对肿瘤免疫微环境的调节也是其重要抗肿瘤作用之一。除了直接抑制肿瘤细胞增殖,部分细胞毒性化疗药还能够诱导肿瘤细胞免疫原性死亡,促使其释放损伤相关分子模式,促进抗原提呈细胞的成熟活化,激活效应T细胞的抗肿瘤免疫反应,化疗药在造成杀伤的同时也会引起肿瘤细胞过表达细胞程序性死亡-配体1,这也是肿瘤逃避免疫监视的手段之一。
近年来,化疗与免疫治疗的联合应用成为改善两类药抗肿瘤疗效的重要策略,越来越多的肿瘤临床治疗试验开始对化疗药物与免疫检查点抗体药物进行联合应用。部分临床结果显示,对两药的简单系统注射给药已具有较好的协同抗肿瘤疗效,但简单的系统给药无法改善传统化疗药物因脱靶导致的毒副作用以及较低的生物利用度,也无法改善抗体药物在肿瘤内的富集量低与渗透能力较差等问题。为解决这些药物本身的缺陷问题,研究人员开发了如阿霉素脂质体、白蛋白结合型紫杉醇等纳米制剂,有效增加了药物在肿瘤部位的富集与渗透,减少了药物的脱靶副作用。但由于单克隆抗体药物的分子量(>1×105道尔顿)及尺寸较大(5~10nm),在剧烈化学反应条件下易失活等特点,传统纳米制剂(50~200nm)将药物包载于内部的方式很难负载足够量且具有较高活性的抗体类药物,同时,简单的系统给药也无法改善抗体药物所产生的免疫相关副作用。因此开发能够联合递送化疗药物与抗体药物的递送系统仍具有较多困难。
发明内容
基于此,本发明的目的是提供一种联合递送化疗药物和免疫检查点抗体药物的纳米颗粒,其能够高效地负载化疗药物以及免疫检查点抗体药物,并能在肿瘤微酸环境下逐渐水解释放靶向肿瘤的抗体药物,提高抗体药物在肿瘤部位的富集与渗透,降低两种药物叠加引起的毒副作用,同时显著提高化疗药物与免疫检查点抗体的协同抗肿瘤疗效。
具体技术方案如下:
所述纳米颗粒为核壳结构,所述核壳结构是由包括高分子聚合物、聚醇修饰的高分子聚合物和酸响应基团修饰的高分子聚合物的原料自组装而成;
其中,所述纳米颗粒的酸响应基团上修饰有树枝状聚酰胺-胺类聚合物,且树枝状聚酰胺-胺类聚合物的末端氨基能与免疫检查点抗体药物的Fc段共价连接;
所述纳米颗粒的核内包载化疗药物。
在其中一些实施例中,所述聚醇修饰的高分子聚合物为聚醇修饰的疏水性高分子聚合物。
在其中一些实施例中,所述聚醇修饰的高分子聚合物为聚乙二醇修饰的高分子聚合物,优选为聚乙二醇修饰的聚已内酯,优选为聚乙二醇修饰的聚已内酯,进一步优选聚乙二醇的分子量为3000~8000。
在其中一些实施例中,所述高分子聚合物为疏水性高分子聚合物,所述酸响应基团修饰的高分子聚合物为酸响应基团修饰的疏水性高分子聚合物。
在其中一些实施例中,所述高分子聚合物为聚酯,优选为聚已内酯,进一步优选聚已内酯的分子量为3500~8000。
在其中一些实施例中,所述酸响应基团修饰的高分子聚合物为酸响应基团修饰的聚酯,优选为酸响应基团修饰的聚已内酯。
在其中一些实施例中,所述纳米颗粒中的酸响应基团为2-丙酸-3-甲基马来酸酐基团。
在其中一些实施例中,所述纳米颗粒的核壳结构是由包括聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺的原料自组装而成。
在其中一些实施例中,以占纳米颗粒中聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺总重量的质量百分比计算,聚乙二醇修饰的聚己内酯所占质量百分比为5%~40%,进一步为8%~35%。
在其中一些实施例中,聚乙二醇修饰的聚己内酯的质量百分比为20~28%。
在其中一些实施例中,以占纳米颗粒中聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺总重量的质量百分比计算,所述聚己内酯的质量百分比为30~40%。
在其中一些实施例中,所述聚乙二醇修饰的聚己内酯的制备包括:将聚乙二醇与聚己内酯混合,加入异辛酸亚锡,反应,将所得聚合物溶解于二氯甲烷,再置于乙醚中沉淀,干燥。
在其中一些实施例中,所述聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺的制备包括:将2-丙酸-3-甲基马来酸酐溶于溶剂中,加入草酰氯、N,N-二甲基甲酰胺,反应得到酰氯化的2-丙酸-3-甲基马来酸酐,再溶于有机溶剂中,加入羟基末端的聚己内酯均聚物,反应,反应产物置于乙醚中沉淀,干燥,得到聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐共聚物;再将所得聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐共聚物与树枝状聚酰胺-胺混合,溶剂存在下,发生开环反应,得到聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺。
在其中一些实施例中,所述纳米颗粒中的树枝状聚酰胺-胺为3代、4代和5代树枝状聚酰胺-胺的至少一种,优选为4代树枝状聚酰胺-胺。
在其中一些实施例中,所述纳米颗粒的粒径范围为50~250nm。
在其中一些实施例中,所述化疗药物疏水性化疗药物,优选所述疏水性化疗药物为阿霉素。
在其中一些实施例中,所述纳米颗粒的树枝状聚酰胺-胺的末端氨基能与免疫检查点抗体药物的Fc段的糖链共价连接。
本发明的再一目的是提供一种抗肿瘤的药物纳米颗粒药物,包括上述的纳米颗粒和免疫检查点抗体药物,所述免疫检查点抗体药物的Fc段与所述树枝状聚酰胺-胺类聚合物的末端氨基共价连接。
在其中一些实施例中,所述免疫检查点抗体药物为免疫检查点阻断抗体PD-L1单抗、CTLA-4单抗和PD-1单抗中的至少一种。
本发明的再一目的是提供上述的药物纳米颗粒药物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺和化疗药物溶解在有机溶剂中,混合,离心,纯化,得到内核包载化疗药物的纳米颗粒;
(2)将免疫检查点抗体药物经氧化剂氧化,得到Fc段糖链含醛基的免疫检查点抗体药物;
(3)步骤(1)所得纳米颗粒与步骤(2)所得Fc段糖链含醛基的免疫检查点抗体药物进行反应,再经还原剂还原,离心纯化,得到药物纳米颗粒药物。
在其中一些实施例中,步骤(2)所得Fc段糖链含醛基的免疫检查点抗体与步骤(1)所得纳米颗粒的质量比为1:(1~20),更优选为1:(2~12),进一步优选为1:(9.5~12)或1:(9.5~10.5)。
在其中一些实施例中,所述药物纳米颗粒药物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺和化疗药物溶解在有机溶剂中,在40~70℃搅拌10~20分钟,再加入3~10倍反应液体积的超纯水,继续在40~70℃搅拌10~20分钟,离心,透析纯化,得到内核包载化疗药物的纳米颗粒;
(2)将免疫检查点抗体药物经氧化剂氧化,得到Fc段糖链含醛基的免疫检查点抗体药物;
(3)步骤(1)所得纳米颗粒与步骤(2)所得Fc段糖链含醛基的免疫检查点抗体药物进行反应,再经还原剂还原,离心纯化,得到药物纳米颗粒药物。
在其中一些实施例中,步骤(1)中的透析纯化方法包括:收集离心上清液,进行高转速离心,所得沉淀重悬于超纯水中,在超纯水中透析除去有机溶剂。
在其中一些实施例中,所述氧化剂为高碘酸钠,进一步地,氧化剂在氧化反应体系中的浓度为5~25mM,免疫检查点抗体药物在氧化反应体系中的浓度为0.5~2mg/mL。
在其中一些实施例中,所述有机溶剂为氯仿。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明首次构建得到一种可以联合递送化疗药物和免疫检查点抗体药物的纳米颗粒(iCluster),发明人创造性地将纳米颗粒与免疫检查点抗体药物的Fc段两者联合使用,使其能够实现高效地负载化疗药物以及免疫检查点抗体药物,并能在肿瘤微酸环境下逐渐水解释放靶向肿瘤的抗体药物,提高抗体药物在肿瘤部位的富集与渗透,促进化疗药物的摄取,降低两种药物叠加引起的毒副作用;并通过肿瘤酸度微环境释放免疫检查点抗体药物分子,恢复效应T细胞抗肿瘤活性,同时化疗药物抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞免疫原性死亡,促进抗肿瘤免疫反应。本发明的纳米颗粒能同时显著地提高化疗药物与免疫检查点抗体的协同抗肿瘤疗效,提供了一种高效实现化疗药物和免疫检查点抗体药物联合递送的新策略。
为了真正实现上述用途,本发明的发明人在研究中发现,要解决纳米颗粒对抗体药物的键合率,与聚乙二醇修饰的聚己内酯的含量有很大关系。
由于纳米颗粒中聚乙二醇修饰的聚己内酯的质量百分比对纳米颗粒的抗体药物键合率具有较大的影响,当聚乙二醇修饰的聚己内酯的质量百分比为20~28%,纳米颗粒具有很好的抗体药物键合率高达75%以上。
附图说明
图1为肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(空颗粒)的粒径表征图;
图2为肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(包载阿霉素)的粒径表征图;
图3为肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(包载阿霉素同时键合PD-L1抗体)的粒径表征图;
图4为肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(空颗粒及载药颗粒)的表面电势表征图及颗粒示意图;
图5为化疗药物的载药率;
图6为化疗药物的酸响应释放效果图;
图7的上图为抗体药物的载药率,下图为抗体药物的酸响应释放效果图;
图8为载药纳米颗粒与IFN-γ处理的B16F10黑色素瘤细胞共培养4小时后的流式结果图;
图9为载药纳米颗粒与IFN-γ处理的B16F10黑色素瘤细胞共培养4小时后的激光共聚焦显微镜照片;
图10为载药纳米颗粒对CT26结直肠癌小鼠肿瘤模型治疗后肿瘤大小统计图;
图11为给药后小鼠体重变化趋势图;
图12为治疗结束后小鼠肿瘤组织照片;
图13为各组小鼠个体肿瘤生长趋势图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形,意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块,而是可选地还包括没有列出的步骤,或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”,描述关联对象的关联关系,表示可以存在三种关系,例如,A和/或B,可以表示:单独存在A,同时存在A和B,单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本实施方式提供一种联合递送化疗药物和免疫检查点抗体药物联合递送的纳米颗粒,所述纳米颗粒为核壳结构,所述核壳结构是由包括高分子聚合物、聚醇修饰的高分子聚合物和酸响应基团修饰的高分子聚合物的原料自组装而成;其中,所述纳米颗粒的酸响应基团上修饰有树枝状聚酰胺-胺类聚合物,且树枝状聚酰胺-胺类聚合物的末端氨基能与免疫检查点抗体药物的Fc段共价连接;所述纳米颗粒的核内包载化疗药物。
本发明首次构建得到一种可以联合递送化疗药物和免疫检查点抗体药物的纳米颗粒(iCluster),发明人创造性地将纳米颗粒与免疫检查点抗体药物的Fc段两者联合使用,使其能够实现高效地负载化疗药物以及免疫检查点抗体药物,并能在肿瘤微酸环境下逐渐水解释放靶向肿瘤的抗体药物,提高抗体药物在肿瘤部位的富集与渗透,促进化疗药物的摄取,降低两种药物叠加引起的毒副作用;并通过肿瘤酸度微环境释放免疫检查点抗体药物分子,恢复效应T细胞抗肿瘤活性,同时化疗药物抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞免疫原性死亡,促进抗肿瘤免疫反应。本发明的纳米颗粒能同时显著地提高化疗药物与免疫检查点抗体的协同抗肿瘤疗效,提供了一种高效实现化疗药物和免疫检查点抗体药物联合递送的新策略。
本发明的纳米颗粒与抗体药物的键合是通过抗体Fc段与纳米颗粒外壳的树枝状聚酰胺-胺的末端氨基反应而得,对抗体Fab段的抗原抗体结合域影响较小,因此对抗体亲和力影响也较小。
本案的化疗药物包载在纳米颗粒的内核,不会因外壳树枝状聚酰胺-胺-抗体复合物的酸响应释放而崩解,包载化疗药物的纳米颗粒内核可经由肿瘤细胞吞噬进入胞内,发挥药效,抑制肿瘤细胞增殖。
进一步地,本发明的纳米颗粒还包括聚醇修饰的高分子聚合物,其聚醇结构可以延长纳米颗粒在血液中循环时间的作用。
可选地,所述高分子聚合物为疏水性高分子聚合物,所述酸响应基团修饰的高分子聚合物为酸响应基团修饰的疏水性高分子聚合物。
可选地,本发明所述酸响应基团修饰的高分子聚合物是一种两亲性高分子聚合物材料,即在酸响应基团的两端分别修饰有亲水性的树枝状聚酰胺-胺类聚合物和疏水性的高分子聚合物,其与疏水性的高分子聚合物在水介质中能自组装成胶束或纳米颗粒,疏水性高分子聚合物部分形成疏水性的核,树枝状聚酰胺-胺类聚合物部分形成亲水性的壳,呈“集束化”纳米颗粒。
本发明所述酸响应基团是指可以在酸性条件下可以键裂解的基团,该酸响应基团的一端与核内的高分子聚合物连接,另一端与外壳的树枝状聚酰胺-胺类聚合物连接,酸响应基团在酸性条件下裂解后,外壳的树枝状聚酰胺-胺类聚合物以及其所连接的抗体药物可以与核内的高分子聚合物解离,而从纳米颗粒上脱落释放。进一步地,所述酸响应基团优选为2-丙酸-3-甲基马来酸酐基团,其在肿瘤微酸(pH 6.5~6.8)环境下可逐渐水解,从而可以在肿瘤微酸环境中释放大量树枝状聚酰胺-胺及与其末端氨基键合的免疫检查点抗体药物。
可选地,聚醇修饰的高分子聚合物也是一种两亲性高分子聚合物,与高分子聚合物和酸响应基团修饰的高分子聚合物一起可以自组装形成具有核壳结构的胶束或纳米颗粒。
本发明的纳米颗粒外壳“集束化”酸响应基团修饰的树枝状聚酰胺-胺的末端氨基可与免疫检查点抗体药物Fc段共价连接,在酸性肿瘤环境下酸响应基团可以水解,从而释放大量树枝状聚酰胺-胺修饰的抗体药物,可减少由细胞Fcγ受体介导的抗体依赖的细胞毒效应,更好地发挥抗体药物对免疫检查点的阻断功能。
在其中一种实施方式中,所述聚醇修饰的高分子聚合物为聚乙二醇修饰的高分子聚合物,优选为聚乙二醇修饰的聚已内酯。进一步优选聚乙二醇的分子量为3000~8000,进一步优选为4000~6000。
在其中一种实施方式中,所述高分子聚合物为聚酯,优选为聚已内酯,进一步优选聚已内酯的分子量为3500~8000。
在其中一种实施方式中,所述纳米颗粒中的酸响应基团为2-丙酸-3-甲基马来酸酐基团。
在其中一种实施方式中,所述纳米颗粒的核壳结构是由包括聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺的原料自组装而成,优选自组装而成的纳米颗粒的粒径范围为50~250nm。其中,聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺与聚乙二醇共同形成纳米颗粒的“集束化”外壳(如图4右图所示),所述外壳中的树枝状聚酰胺-胺再通过其末端氨基与抗体药物的Fc段共价连接;三种聚合物的聚己内酯结构部分则形成纳米颗粒的疏水性内核。
在其中一种实施方式中,以占纳米颗粒中聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺总重量的质量百分比计算,聚乙二醇修饰的聚己内酯所占质量百分比为5%~40%,进一步为8%~35%。
在其中一种优选的实施方式中,聚乙二醇修饰的聚己内酯所占质量百分比为20~28%,具体还可以为20%、21%、22%、23%、25%、26%、27%、28%。
优选地,以占纳米颗粒中聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺总重量的质量百分比计算,所述聚己内酯的质量百分比为30~40%。
可选地,所述聚乙二醇修饰的聚己内酯的制备包括:将聚乙二醇与聚己内酯混合,加入异辛酸亚锡,反应,将所得聚合物溶解于二氯甲烷,再置于乙醚中沉淀,干燥。优选其混合的温度为100~140℃,进一步优选混合的温度为110~130℃,更优选为120℃;优选其混合的时间为20~40分钟,进一步优选为25~35分钟,更优选为30分钟。优选其反应的温度为100~140℃,进一步优选反应的温度为110~130℃,更优选为120℃。优选其反应的时间为10~14小时,进一步优选反应的时间为11~13小时,更优选为12小时。
可选地,所述聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺的制备包括:
将2-丙酸-3-甲基马来酸酐溶于溶剂中,加入草酰氯、N,N-二甲基甲酰胺,反应,得到酰氯化的2-丙酸-3-甲基马来酸酐,再溶于有机溶剂中,加入羟基末端的聚己内酯均聚物,反应,反应产物置于乙醚中沉淀,干燥,得到聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐共聚物;再将所得聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐共聚物与树枝状聚酰胺-胺混合,溶剂存在下,发生开环反应,得到聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺。
更具体地,所述聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺的制备包括:
将2-丙酸-3-甲基马来酸酐溶于二氯甲烷中,加入草酰氯、N,N-二甲基甲酰胺,于冰浴中反应,再于室温中反应,纯化,得到酰氯化的2-丙酸-3-甲基马来酸酐,再溶于二氯甲烷中,加入羟基末端的聚己内酯均聚物,于室温中反应,反应产物置于乙醚中沉淀,干燥,得到聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐共聚物;再将所得聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐共聚物与树枝状聚酰胺-胺混合,DMSO存在下,避光下发生开环反应,得到聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺。
其中,优选所述于冰浴中反应的时间为8~12分钟。优选所述于室温中反应的时间为1~3小时。优选所述纯化的方法包括:在真空条件下除去二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺和过量的草酰氯。优选所述开环反应的时间为1~3小时。
本发明所述的化疗药物包括阿霉素。
在其中一种实施方式中,所述纳米颗粒的树枝状聚酰胺-胺的末端氨基能与免疫检查点抗体药物Fc段的糖链共价连接。更具体地,所述纳米颗粒的树枝状聚酰胺-胺的末端氨基是能与免疫检查点抗体药物Fc段的糖链氧化后的醛基共价连接。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例中所用原料来源及处理方法:
聚己内酯(poly(ε-caprolactone),PCL;CAS:24980-41-4;分子量为3500~5000道尔顿;型号:DG-C),购自济南岱罡生物工程有限公司;
6-己内酯(6-hexanolactone,ε-CL;CAS:502-44-3),购自Sigma-Aldrich公司;
异辛酸亚锡(Tin(II)2-ethylhexanoate;CAS:301-10-0),购自Sigma-Aldrich公司;
2-丙酸-3-甲基马来酸酐(CDM,CAS:487-66-1),购自上海毕得医药科技股份有限公司;
端基为氨基的第四代树枝状聚酰胺-胺(Polyamindoamine,PAMAM)购自美国Dendritech公司以及威海晨原分子新材料公司;分子量为14215道尔顿。
盐酸阿霉素(Doxorubicin HCl,CAS:25316-40-9),购自大连美仑生物技术有限公司;
大鼠抗小鼠IgG(αPD-L1)抗体(Clone号:10F.9G2),购自美国BioXcell公司;
罗丹明B(Rhodamine B,RhoB;CAS:81-88-9),购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
DMSO(Dimethyl sulfoxide,DMSO;CAS:67-68-5),购自国药集团化学试剂有限公司;
高碘酸钠(Sodium periodate,CAS:7790-28-5),购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
单甲醚的聚乙二醇5000(Methoxypolyethylene glycols,mPEG5K;CAS:9004-74-4)购买自百灵威,使用前经甲苯135℃常压共沸除水(1g/10mL),随后降温至70℃抽真空搅拌干燥过夜;
羟基末端聚己内酯(PCL-OH)均聚物的合成:三异丙醇铝溶解于无水甲苯中,加入到己内酯中并在室温下反应1小时,然后加入冰醋酸并继续搅拌过夜。将得到的产物用二氯甲烷溶解并沉淀至冰乙醚中,真空下干燥过夜后得到白色固体产物;
羧基末端聚己内酯(PCL-COOH)均聚物的合成:将0.3g正癸酸溶解于8g无水6-己内酯中,230℃油浴搅拌混合反应7小时,转移至冰水浴中终止反应。将所得聚合物溶解与二氯甲烷后置于冰乙醚中沉淀,真空下干燥过夜后得到白色固体产物。
聚乙二醇-聚己内酯共聚物(mPEG5K-PCL5K)的合成:将5g mPEG5K溶解于6g无水6-己内酯中,120℃搅拌30分钟。加入0.011g异辛酸亚锡混合,在手套箱内120℃搅拌12小时。冷却至室温后,将所得聚合物溶解于二氯甲烷后置于冰乙醚中沉淀,真空下干燥过夜后得到白色固体产物。
聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐共聚物(PCL-CDM)的合成:将0.06gCDM(2-丙酸-3-甲基马来酸酐)溶解于4ml无水二氯甲烷中,再依次加入0.052g草酰氯、0.08ml N,N-二甲基甲酰胺。上述反应先置于冰水浴中反应10分钟,然后转移至室温反应2小时。在真空条件下除去二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺和过量的草酰氯,得到酰氯化CDM中间产物。将酰氯化CDM溶解于无水二氯甲烷中,将预先通过甲苯共沸除水干燥后的0.2g PCL-OH溶解于无水二氯甲烷,置于干燥的恒压滴液漏斗于冰水浴中缓慢加入酰氯化CDM的二氯甲烷溶液中,滴加完毕后转移至室温继续反应2小时。加入饱和氯化铵水溶液消耗过量的酰氯化CDM后,用氯仿萃取三次,干燥浓缩有机相后,置于冰乙醚中沉淀,真空下干燥过夜后得到浅棕色固体产物;
聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺(PCL-CDM-PAMAM)的合成:通过PCL-CDM中的酸酐与PAMAM表面氨基的开环反应合成。将0.12g PAMAM(树枝状聚酰胺-胺)与0.04g PCL-CDM溶解于10mL DMSO中,并在避光条件下于室温下搅拌2小时。于搅拌条件下加入超纯水使产物组装成纳米颗粒,随后通过超滤进行纯化,收集上层溶液并冻干,得到白色固体;
聚己内酯修饰的树枝状聚酰胺-胺(PCL-PAMAM)的合成:将0.04g PAMAM与0.013gPCL-COOH溶解于5mL DMSO中,加入2mg EDC·HCl和1.3mg NHS催化反应,并在避光条件下于室温下搅拌12h。于搅拌条件下加入超纯水使产物组装成纳米颗粒,随后通过超滤进行纯化,收集上层溶液并冻干,得到白色固体;
盐酸阿霉素脱盐酸化处理,将盐酸阿霉素分散在DMSO中,加入3摩尔比例的三乙胺混合,避光搅拌过夜,得到脱盐酸化阿霉素,避光保存。
细胞骨架染料鬼笔环肽(Alexa 488-phalloidin),购自美国Invitrogen公司;
细胞因子IFN-γ,购自美国Peprotech公司;
B16F10黑色素瘤细胞以及CT26结直肠癌细胞,来源于ATCC;
C57BL6/J小鼠,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司;
细胞核蓝色荧光染料(2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidinedihydrochloride,DAPI),购自上海碧云天生物技术有限公司;
实施例中所用仪器型号及公司:
磁力搅拌器:型号为RCT basic,德国IKA公司;
台式微量冷冻离心机:型号为Centrifuge 5424R,德国Eppendorf公司;
纳米粒度仪:型号为Zetasizer Nano ZSE,英国马尔文帕纳科公司;
冻干机:型号为BenchTop,美国SP Scientific公司;
多功能酶标仪:型号为Infinite 200PRO,瑞士Tecan公司;
BIO-RAD凝胶成像系统:型号为ChemiDoc MP,美国伯乐公司;
超高效纳升级液相色谱仪:型号为ACQUITY UPLC H-Class,美国Waters公司;
实施例1、肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(空颗粒)的制备及其粒径表征
空肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(iCluster)的制备方法:配制PCL的DMSO溶液,浓度为10mg/mL。配制mPEG5K-PCL5K的DMSO溶液,浓度为10mg/mL。配制PCL-CDM-PAMAM的DMSO溶液,浓度为10mg/mL。PCL的DMSO溶液、mPEG5K-PCL5K的DMSO溶液、PCL-CDM-PAMAM的DMSO溶液各取100μL于10mL圆底烧瓶中,在磁力搅拌器上以750rpm,恒温60℃水浴搅拌15分钟,加入3mL超纯水,磁力搅拌器转速升至1100rpm,继续恒温60℃水浴搅拌15分钟,将所得纳米颗粒溶液转移至14000道尔顿的透析袋中,在4.5L超纯水中透析6小时,每小时更换透析液一次。收集透析后的纳米颗粒,转移至1.5mL EP管中,利用台式微量冷冻离心机高速(12000rpm)离心1.5小时,收集沉淀并重悬于适量超纯水中,最终得到的纳米颗粒为空纳米颗粒。
粒径表征:取100μL未载药的纳米颗粒(iCluster)溶液于粒径池中,通过纳米粒度仪检测该纳米颗粒的粒径及表面电势(见图1、图4),可看到iCluster纳米颗粒其水化粒径在80~200nm范围内。
实施例2、肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(包载阿霉素的纳米颗粒)的制备及其粒径表征
包载阿霉素(Doxorubicin,DOX)的肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(iClusterDOX)的制备方法:PCL的DMSO溶液、mPEG5K-PCL5K的DMSO溶液、PCL-CDM-PAMAM的DMSO溶液的配制同实施例1步骤。配置脱盐酸处理后的阿霉素的DMSO溶液,其浓度为5mg/mL。同实施例1步骤各取PCL的DMSO溶液、mPEG5K-PCL5K的DMSO溶液、PCL-CDM-PAMAM的DMSO溶液100μL于10mL圆底烧瓶中,再加入60μL脱盐酸处理后的阿霉素的DMSO溶液至圆底烧瓶中,在磁力搅拌器上以750rpm,恒温60℃水浴避光搅拌15分钟,加入3.6mL超纯水,磁力搅拌器转速升至1100rpm,继续恒温60℃水浴避光搅拌15分钟,得到未纯化的纳米颗粒溶液,将该溶液转移至1.5mL EP管中,利用台式微量冷冻离心机低速(6000rpm)离心10分钟除去未组装的游离药物沉淀,将上清液转移至14000道尔顿的透析袋中,在4.5L超纯水中透析6小时,每小时更换透析液一次。收集透析后的纳米颗粒,转移至1.5mL EP管中,利用台式微量冷冻离心机高速(15000rpm)离心1.5小时,收集沉淀并重悬于适量超纯水中,最终得到的纳米颗粒为包载阿霉素的肿瘤酸响应型“集束化”纳米颗粒(iClusterDOX)。
粒径表征:取100μL包载阿霉素的肿瘤酸响应型“集束化”纳米颗粒(iClusterDOX)溶液于粒径池中,通过纳米粒度仪检测该纳米颗粒的粒径及表面电势(见图2),可看到iClusterDOX纳米颗粒其水化粒径在80~200nm范围内。
实施例3、肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(包载阿霉素同时键合抗体的纳米颗粒)的制备及其粒径表征
包载阿霉素同时键合PD-L1抗体的肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(iClusterDOX@αPD-L1)的制备方法:配制硼氢化钠水溶液,浓度为10mg/mL。配制高碘酸钠水溶液,浓度为20mM。取200μg PD-L1抗体,加入等体积的20mM高碘酸钠水溶液,使抗体终浓度为1mg/mL,高碘酸钠终浓度为10mM,于4℃避光反应2小时。收集反应液至50kDa超滤管中,利用台式微量冷冻离心机9000rpm离心5分钟,重复离心三次,除去多余的高碘酸钠,得到氧化后含醛基的PD-L1抗体。取实施例2中所得纳米颗粒1mg,加入100μg氧化后含醛基的PD-L1抗体,于4℃反应12小时。收集反应液加入硼氢化钠溶液至其终浓度为1mg/mL,于4℃反应30分钟,得到未纯化的纳米颗粒溶液,收集该溶液至1.5mL EP管中,利用台式微量冷冻离心机高速(15000rpm)离心1.5小时,收集沉淀并重悬于适量超纯水中,最终得到的纳米颗粒为包载阿霉素同时键合抗体的肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(iClusterDOX@αPD-L1)。
表面键合αPD-L1纳米颗粒(iCluster@αPD-L1)的制备方法:按上述方法制备得到氧化后含醛基的PD-L1抗体100μg,取实施例1所得的纳米颗粒iCluster 1mg,将含醛基的PD-L1抗体与iCluster纳米颗粒混合,并于4℃反应12小时。收集反应液加入硼氢化钠溶液至其终浓度为1mg/mL,于4℃反应30分钟,得到未纯化的纳米颗粒溶液,收集该溶液至1.5mLEP管中,利用台式微量冷冻离心机高速(15000rpm)离心1.5小时,收集沉淀并重悬于适量超纯水中,最终得到未包载阿霉素的键合抗体的肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(iCluster@αPD-L1)。
粒径表征:取100μL包载阿霉素同时键合抗体的肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(iClusterDOX@αPD-L1)溶液于粒径池中,通过纳米粒度仪检测该纳米颗粒的粒径及表面电势(见图3、图4),可看到iClusterDOX@αPD-L1纳米颗粒其水化粒径在80~200nm范围内。
实施例4、非酸响应型颗粒“集束化”纳米颗粒(包载阿霉素同时键合抗体的纳米颗粒)的制备
包载阿霉素同时键合抗体的肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(ClusterDOX@αPD-L1)的制备方法:配制PCL的DMSO溶液,浓度为10mg/mL。配制mPEG5K-PCL5K的DMSO溶液,浓度为10mg/mL。配制PCL-PAMAM的DMSO溶液,浓度为10mg/mL。取实施例2中脱盐酸处理后的阿霉素的DMSO溶液,按实施例2所述制备方式,制备得到的纳米颗粒为包载阿霉素的非酸响应型“集束化”纳米颗粒(ClusterDOX)。按实施例3所述制备方式得到氧化后含醛基的PD-L1抗体。取1mg所得ClusterDOX与100μg含醛基的PD-L1抗体混合,并于4℃反应12小时。收集反应液加入硼氢化钠溶液至其终浓度为1mg/mL,于4℃反应30分钟,得到未纯化的纳米颗粒溶液,收集该溶液至1.5mL EP管中,利用台式微量冷冻离心机高速(15000rpm)离心1.5小时,收集沉淀并重悬于适量超纯水中,最终得到包载阿霉素且键合抗体的非酸响应型“集束化”纳米颗粒(ClusterDOX@αPD-L1)。
实施例5、不同密度PEG的包载阿霉素同时键合抗体的肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒的制备及其抗体键合率表征
按表1的投料量加入各组分,其他制备步骤同实施例3,将得到的未纯化的纳米颗粒通过台式微量冷冻离心机高速(15000rpm)离心1.5小时,收集上清液及纳米颗粒沉淀,加入适量超纯水重悬该沉淀,即得到表面PEG密度为16.6%、25.0%和33.3%的纳米颗粒(表面PEG密度的计算公式=mmPEG-PCL/(mmPEG-PCL+mPCL+m PAMAM-CDM-PCL))。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法表征上述纳米颗粒上PD-L1抗体的键合效果:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对上述纳米颗粒进行电泳,随后将凝胶在凝胶成像仪下检测。
超高效纳升级液相色谱仪检测上述上清液中的游离PD-L1抗体的含量:利用超高效纳升级液相色谱仪检测280nm波长下不同颗粒上清液的紫外吸收值,并用游离PD-L1抗体梯度稀释作为标准品,可测出不同颗粒上清液中剩余的游离PD-L1抗体量m1,将投入的氧化后的抗体量记为m0,则可间接计算出不同PEG密度纳米颗粒的表面抗体键合率,其键合率计算公式为(m0-m1)/m0×100%。
通过电泳和液相色谱法检测结果(见表2)可知,当PEG密度为25%时,纳米颗粒的抗体键合率最高,达到了77%以上,而当PEG密度为33.3%和16.7%时,纳米颗粒的抗体键合率都明显下降。。
表1.不同PEG密度的纳米颗粒制备中各组分的投料量
表2.不同PEG密度纳米颗粒的αPD-L1键合率
不同PEG密度颗粒(%) | αPD-L1键合率(%) |
33.3 | 70.6 |
25.0 | 77.0 |
16.7 | 60.6 |
实施例6、肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(包载阿霉素)的载药率及酸响应性释放效果表征
阿霉素载药率表征:参照实施例2的制备方法并按表3的投料量加入各组分,制备得包载阿霉素的肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒,收集透析后所得纳米颗粒溶液,在-80℃冷冻后利用冻干机冻干,随后加入适量的DMSO将颗粒内的阿霉素全部溶出,将梯度稀释的阿霉素于各组分材料混合物作为标准品,利用多功能酶标仪检测490nm处各溶液的紫外吸收值,计算得到阿霉素的载药率,见图5,阿霉素/聚合物的质量比为1/5、1/10和1/20时,其载药率分别为2.3%、4.2%和11%,参考阿霉素常用给药剂量(0.5~5mg/kg)以及αPD-L1(0.1~5mg/kg),为将阿霉素以较低给药剂量给药,优选1/10投入比作为制备方式。
阿霉素酸响应释放表征:按上述制备方法制备两批纳米颗粒,采用实施例2的高速离心法对颗粒进行纯化,收集沉淀,向两批颗粒沉淀中分别加入500μL0.2M pH值为7.4和pH值为6.8的磷酸缓冲液重悬,于37℃放置,分别在放置0、0.5、1、2、4、6、8、12、24小时后按上述高速离心法离心收集上清液,参照上述检测方法测定上清液在490nm处的紫外吸收值,计算得到阿霉素的酸响应释放速率曲线。
如图6所示,包载于颗粒内核的阿霉素在体外因酸响应释放的量低于20%。
表3.不同阿霉素载药量颗粒制备中各组分的投料量
实施例7、肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(包载阿霉素同时键合PD-L1抗体)的载药率及酸响应性释放效果表征
PD-L1抗体的载药率表征:参照实施例3氧化抗体,得到氧化后含醛基的PD-L1抗体。按表4的量取实施例2所制备的包载阿霉素(Doxorubicin,DOX)的肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒(iClusterDOX)并加入相应量的氧化后含醛基的PD-L1抗体,制备得包载阿霉素同时键合PD-L1抗体的肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒,参照实施例3取纯化前的纳米颗粒于1.5mL EP管中,利用台式微量冷冻离心机高速(15000rpm)离心1.5小时,收集上清液,参照实施例5的方法检测上清液中剩余的游离PD-L1抗体含量,从而计算得到不同颗粒的抗体键合率,见图7,抗体的键合率在投入比为1/10时接近最大值(75%),因此优选氧化抗体/纳米颗粒质量比为1/10的制备方式,此时阿霉素和抗体的给药比例约为3/5。
PD-L1抗体的酸响应释放表征:按上述制备方法制备两批纳米颗粒,采用实施例3的高速离心法对颗粒进行纯化,收集沉淀,向两批颗粒沉淀中分别加入500μL 0.2M pH值为7.4和pH值为6.8的磷酸缓冲液重悬,于37℃放置,分别在放置0、0.5、1、2、4、6、8、12、24小时后按上述高速离心法离心收集上清液,用超纯水对上清液进行适当稀释收,通过酶联免疫吸附实验检测纳米颗粒所释放至上清液中的PD-L1抗体的含量。
如图7所示,表面键合的抗体分子在体外通过酸响应逐渐释放,12h时接近50%,而在非酸条件下抗体分子的释放量低于20%。
表4.不同PD-L1抗体载药量颗粒制备中各组分的投料量
实施例8、肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒的促摄取功能表征
用罗丹明B(RhoB)标记PCL得到PCL-RhoB,按照实施例7的优选条件,将PCL替换为PCL-RhoB后参照实施例3的制备方法,制备得荧光标记的纳米颗粒(iClusterRhoB@αPD-L1),利用适量的pH值为6.8的RPMI-1640培养基重悬颗粒。将密度为5×104细胞/孔的B16F10细胞铺至12孔细胞培养板中培养,加入10ng/mL细胞因子IFN-γ,继续培养12小时诱导细胞高表达PD-L1,待细胞长满,加入上述荧光标记的纳米颗粒共培养4小时后用1×磷酸缓冲盐溶液清洗三次,再将细胞消化收集,加入0.4%的台盼蓝淬灭细胞外荧光,通过流式细胞仪检测观察细胞对颗粒的摄取效果。
如图8所示,将荧光分子罗丹明B(RhoB)代替阿霉素后制备得内部含有RhoB荧光的iCluster颗粒,其中表面键合PD-L1抗体的颗粒组(iCluster@αPD-L1)摄取效果比空颗粒组(iCluster)和空颗粒+游离抗体组(iCluster+αPD-L1)效果更好。
将B16F10细胞铺至8孔共聚焦小皿中,加入10ng/mL细胞因子IFN-γ,继续培养12小时诱导细胞高表达PD-L1,加入上述荧光标记的纳米颗粒共培养4小时后用1×磷酸缓冲盐溶液清洗三次,加入染料Alexa 488-phalloidin标记细胞骨架,加入DAPI标记细胞核,在激光共聚焦显微镜下观察该纳米颗粒与肿瘤细胞的共定位结果。
如图9所示,键合PD-L1抗体的颗粒与肿瘤细胞的相结合的量更多,与流式结果类似,表明这种肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒能够有效地促进PDL1high肿瘤细胞的摄取。
实施例9、肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒对小鼠肿瘤的抑制
我们通过CT26小鼠结肠癌细胞构建了小鼠皮下肿瘤模型,将荷瘤小鼠以8只/组随机分为6组,分别通过尾静脉注射125μL的对照组1×磷酸缓冲盐溶液、游离DOX+αPD-L1、iClusterDOX、iCluster@αPD-L1、非酸响应型颗粒ClusterDOX@αPD-L1以及我们的治疗组iClusterDOX@αPD-L1。其中阿霉素的给药量为1.5mg/kg,αPD-L1的给药量为2.5mg/kg,每三天给药一次,共给药3次。治疗期间通过游标卡尺测量肿瘤长(mm,记为a)和宽(mm,记为b),通过电子天平测量小鼠体重,同时观察小鼠的存活情况。肿瘤体积计算公式为:体积(mm3)=a×b2×0.5。
如图10-13所示,对照组中游离DOX+αPD-L1组在给药第二次后便开始出现死亡现象,最终死亡数为5只,而剩下的3只中有2只具有一定的抑制效果,这可能表明系统注射这两种游离药物是能够引起协同抗肿瘤疗效的,但两药相加的毒副作用也容易引起小鼠死亡。非响应组ClusterDOX@αPD-L1颗粒也显示出了一定的治疗效果,这可能表明即使表面键合的无法响应性脱落,也能够促进纳米颗粒与肿瘤细胞的相互作用,从而发挥一定的肿瘤抑制效果。而我们的治疗组iClusterDOX@αPD-L1颗粒并不会引起小鼠的死亡,表明将阿霉素包载于肿瘤酸度响应型“集束化”纳米颗粒内核且外部键合PD-L1抗体的方式能够减少两药叠加引起的毒副作用,同时显著提高两药的协同抗肿瘤疗效,因此该组的肿瘤抑制作用最明显。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (12)
1.联合递送化疗药物和免疫检查点抗体药物的纳米颗粒,其特征在于,
所述纳米颗粒为核壳结构,所述核壳结构是由包括高分子聚合物、聚醇修饰的高分子聚合物和酸响应基团修饰的高分子聚合物的原料自组装而成;
其中,所述纳米颗粒的酸响应基团上修饰有树枝状聚酰胺-胺类聚合物,且树枝状聚酰胺-胺类聚合物的末端氨基能与免疫检查点抗体药物的Fc段共价连接;
所述纳米颗粒的核内包载化疗药物。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒,其特征在于,所述聚醇修饰的高分子聚合物为聚乙二醇修饰的高分子聚合物,优选为聚乙二醇修饰的聚已内酯,进一步优选聚乙二醇的分子量为3000~8000。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒,其特征在于,所述高分子聚合物为聚酯,优选为聚已内酯,进一步优选聚已内酯的分子量为3500~8000;所述酸响应基团修饰的高分子聚合物为酸响应基团修饰的聚酯;
和/或,所述纳米颗粒中的酸响应基团为2-丙酸-3-甲基马来酸酐基团。
4.根据权利要求3所述的纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒的核壳结构是由包括聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺的原料自组装而成。
5.根据权利要求4所述的纳米颗粒,其特征在于,以占纳米颗粒中聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺总质量的质量百分比计算,聚乙二醇修饰的聚己内酯的质量百分比为5%~40%,进一步为8%~35%。
6.根据权利要求5所述的纳米颗粒,其特征在于,所述聚乙二醇修饰的聚己内酯的质量百分比为20~28%,进一步优选为25%。
7.根据权利要求5所述的纳米颗粒,其特征在于,以占纳米颗粒中聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺总质量的质量百分比计算,所述聚己内酯的质量百分比为30~40%。
8.根据权利要求4所述的纳米颗粒,其特征在于,所述聚乙二醇修饰的聚己内酯的制备包括以下步骤:将聚乙二醇与聚己内酯混合,加入异辛酸亚锡,反应,将所得聚合物溶解于二氯甲烷,再置于乙醚中沉淀,干燥;
和/或,所述聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺的制备包括以下步骤:将2-丙酸-3-甲基马来酸酐溶于溶剂中,加入草酰氯、N,N-二甲基甲酰胺,反应得到酰氯化的2-丙酸-3-甲基马来酸酐,再溶于有机溶剂中,加入羟基末端的聚己内酯均聚物,反应,反应产物置于乙醚中沉淀,干燥,得到聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐共聚物;再将所得聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐共聚物与树枝状聚酰胺-胺混合,溶剂存在下,发生开环反应,得到聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺。
9.根据权利要求1~8任一项所述的纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒中的树枝状聚酰胺-胺为3代、4代和5代树枝状聚酰胺-胺中的至少一种,优选为4代树枝状聚酰胺-胺;
和/或,所述纳米颗粒的粒径范围为50~250nm。
10.根据权利要求1~8任一项所述的纳米颗粒,其特征在于,所述化疗药物为疏水性化疗药物,优选所述疏水性化疗药物为阿霉素。
11.一种抗肿瘤的药物纳米颗粒药物,包括权利要求1~10任一项所述的纳米颗粒和免疫检查点抗体药物,所述免疫检查点抗体药物的Fc段与所述树枝状聚酰胺-胺类聚合物的末端氨基共价连接;优选所述免疫检查点抗体药物为免疫检查点阻断抗体PD-L1单抗、CTLA-4单抗和PD-1单抗中的至少一种。
12.权利要求11所述的药物纳米颗粒药物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将聚己内酯、聚乙二醇修饰的聚己内酯和聚己内酯-2-丙酸-3-甲基马来酸酐修饰的树枝状聚酰胺-胺和化疗药物溶解在有机溶剂中,混合,离心,纯化,得到内核包载化疗药物的纳米颗粒;
(2)将免疫检查点抗体药物经氧化剂氧化,得到Fc段糖链含醛基的免疫检查点抗体药物;
(3)步骤(1)所得纳米颗粒与步骤(2)所得Fc段糖链含醛基的免疫检查点抗体药物进行反应,再经还原剂还原,离心纯化,得到所述药物纳米颗粒。
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