WO2018038155A1 - ミセル及びその使用 - Google Patents

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WO2018038155A1
WO2018038155A1 PCT/JP2017/030109 JP2017030109W WO2018038155A1 WO 2018038155 A1 WO2018038155 A1 WO 2018038155A1 JP 2017030109 W JP2017030109 W JP 2017030109W WO 2018038155 A1 WO2018038155 A1 WO 2018038155A1
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WO
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micelle
segment
porphyrin
peg
micelles
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/030109
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English (en)
French (fr)
Inventor
オラシオ カブラル
由佳 小沼
片岡　一則
泰孝 安楽
健介 長田
Original Assignee
国立大学法人東京大学
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Filing date
Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers

Definitions

  • the present invention relates to micelles and uses thereof. Specifically, the present invention relates to micelles, and pharmaceutical compositions and contrast agents containing the micelles.
  • This application claims priority based on US Patent No. 62 / 378,236, provisionally filed in the United States on August 23, 2016, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Drug delivery system is a system that enhances the therapeutic effect of a drug by encapsulating the drug in a carrier (drug carrier) and controlling the pharmacokinetics of the drug.
  • a carrier drug carrier
  • worm micelles have attracted attention in recent years. It is known that worm micelles have a higher blood retention than spherical micelles (see, for example, Non-Patent Document 1). Therefore, by using the worm micelle as a carrier, the efficiency of reaching the tissue targeted by the drug can be improved, and the therapeutic effect can be enhanced and the number of administrations can be reduced.
  • Conventional spherical micelles and worm micelles are formed of a block copolymer having a hydrophilic segment and a hydrophobic segment (see, for example, Patent Document 1).
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a micelle that can be easily produced and can contain hydrophilic, hydrophobic, and ionic compounds. Moreover, the pharmaceutical composition and contrast agent containing the said micelle are provided.
  • the micelle according to the first aspect of the present invention includes a core formed by ⁇ - ⁇ stacking of a compound having an aromatic ring, a first charged segment connected to the core, a hydrophilic segment, and the hydrophilic segment.
  • the micelle according to the first aspect may be fibrous.
  • the core may be a porphyrin laminate.
  • the hydrophilic segment may be polyethylene glycol.
  • the ratio of the positively charged segment to the total mass of the micelle may be 6% by mass or more.
  • the pharmaceutical composition according to the second aspect of the present invention contains the micelle according to the first aspect.
  • the first charged segment may have a functional nucleic acid.
  • the contrast agent according to the third aspect of the present invention contains the micelle according to the first aspect.
  • the micelle of the above aspect can be easily produced and can contain hydrophilic, hydrophobic and ionic compounds.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of 1 H-NMR analysis of porphyrin-PBLA in Production Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of analysis of porphyrin-polyaspartic acid (Porphyrin-PAsp) in Production Example 1 by gel permeation chromatography (GPC).
  • GPC gel permeation chromatography
  • 2 is a graph showing the results of 1 H-NMR analysis of polyethylene glycol (molecular weight 5000) -polylysine (PEG 5k -PLys 20 ) in Production Example 1.
  • 6 is a graph showing the results of GPC analysis of PEG 5k -PLys 20 in Production Example 1.
  • FIG. 4 is a transmission electron microscope (TEM) image of micelles formed by mixing Porphyrin-PAsp and PEG 5k -PLys 20 at different charge ratios in Production Example 1.
  • FIG. 4 is a TEM image of micelles formed by mixing Porphyrin-PAsp and PEG 12k -PLys 28 at different charge ratios in Production Example 1.
  • FIG. 4 is a TEM image of micelles formed by mixing Porphyrin-PAsp and PEG 30k -PLys 21 at different charge ratios in Production Example 1.
  • FIG. 4 is a TEM image of micelles formed by mixing Porphyrin-PAsp and PEG 73k -PLys 19 at different charge ratios in Production Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing temporal changes in the fluorescence intensity of Alexa647 and Cy3 in mice administered with PIC worm micelle in Test Example 1.
  • 2 is a fluorescence image of blood vessels (arteries and veins) of mice administered with PIC worm micelle in Test Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the temporal change in the fluorescence intensity of Alexa 647 in mice administered with the PIC microcell in Test Example 1.
  • 6 is a graph showing temporal changes in fluorescence intensity of Alexa647 and Cy3 in mice administered with Cross-linked PIC worm micelle in Test Example 2.
  • 4 is a fluorescence image of blood vessels (arteries and veins) of mice administered with Cross-linked PIC worm micelle in Test Example 2.
  • FIG. 6 is a graph showing the temporal change in the fluorescence intensity of Alexa 647 in mice administered with Cross-linked Special PIC microcell in Test Example 2.
  • FIG. 10 is a graph showing the analysis results of porphyrin-maleimide in Production Example 4 by MALDI TOF MS.
  • 6 is a graph showing the results of 1 H-NMR analysis of porphyrin-maleimide in Production Example 4.
  • FIG. 1 is a schematic process diagram showing an example of a micelle manufacturing method according to an embodiment of the present invention. The structure of the micelle of this embodiment will be described in detail below with reference to FIG.
  • the micelle A of the present embodiment includes a core 20 formed by ⁇ - ⁇ stacking of the compound 1 having an aromatic ring, and a hydrophilic segment 30.
  • the first chargeable segment 3 is connected to the core 20.
  • the hydrophilic segment 30 is connected to the second charged segment 4 having a charge opposite to that of the first charged segment 3. As shown in FIG. 1, the core 20 and the hydrophilic segment 30 are bonded through electrostatic interaction between the first charged segment 3 and the second charged segment 4.
  • the micelle of this embodiment can be easily produced as shown in the examples described later, and can contain hydrophilic, hydrophobic and ionic compounds.
  • the micelle A of the present embodiment may be a fibrous micelle 1A or a spherical micelle 2A.
  • the shape can be controlled by the molecular weight and blending amount of the molecules (hydrophilic polymer) 2 forming the hydrophilic segment 30.
  • the micelle of this embodiment is a fibrous micelle.
  • the size of the micelle A of the present embodiment is not particularly limited as long as it is a size that can be administered into a subject and delivered to a target tissue.
  • the average diameter can be, for example, 1 nm or more and 1000 nm or less.
  • the length can be 1 nm or more and 1000 nm or less, for example.
  • the core 20 is formed by stacking the compound 1 having an aromatic ring by self-assembly by ⁇ - ⁇ stacking.
  • the compound 1 having an aromatic ring include, but are not limited to, tetrapyrroles such as porphyrin, chlorin, and corol, choline, and phthalocyanine.
  • tetrapyrroles such as porphyrin, chlorin, and corol, choline, and phthalocyanine.
  • it is a molecule
  • a metal atom may be coordinated to the center by chelating action.
  • the metal atom include, but are not limited to, platinum, copper, gold, iron, zinc, silver, gadolinium, europium, manganese, and the like. Since these metal atoms are coordinated to the molecule 1 forming the core, the micelle A of this embodiment can be used as a contrast agent or an artificial enzyme.
  • the first charged segment 3 is connected to the core 20 (or the molecule 1 forming the core).
  • the first charged segment 3 has a positive or negative charge.
  • the first chargeable segment 3 and the second chargeable segment 4 described later have different charges. That is, when the first charged segment 3 has a positive charge, the second charged segment 4 connected to the hydrophilic segment 30 has a negative charge. On the other hand, when the first charged segment 3 has a negative charge, the second charged segment 4 connected to the hydrophilic segment 30 has a positive charge.
  • the micelle A of the present embodiment When the micelle A of the present embodiment is formed, an attractive force based on electrostatic interaction is generated between the first charged segment 3 and the second charged segment 4 due to the difference in charge. Therefore, the molecule 1 forming the core and the molecule 2 forming the hydrophilic segment are combined to form the complex 10.
  • the composite 10 is preferably electrically neutral because the charges of the first charged segment 3 and the second charged segment 4 are offset. Furthermore, as described above, micelles A are formed by stacking the composite 10 by self-assembling the compounds having an aromatic ring, which is the molecule 1 forming the core, by ⁇ - ⁇ stacking.
  • the “complex” mentioned here is a structure formed by binding one molecule of the first molecule (5) and one molecule of the second molecule (6) as shown in FIG.
  • the state that “the complex is electrically neutral” means the sum of charges derived from the first charged segment and the sum of charges derived from the second charged segment in the complex. Includes a state where the difference is in a range of about ⁇ 10%, for example, in a range of about ⁇ 5%.
  • the total charge of the first chargeable segment is 40
  • the total charge derived from the second chargeable segment in the composite is, for example, in the range of 30 to 50, for example, in the range of 35 to 45,
  • the positively charged segment may be a compound having a cationic group.
  • Examples of the positively charged segment include cationic polyamino acids and cationic proteins.
  • amino acid constituting the cationic polyamino acid examples include any cationic amino acid having a cationic group (for example, an amino group) in the side chain.
  • cationic amino acid examples include basic amino acids such as lysine, arginine, histidine and ornithine; amino acid derivatives obtained by introducing a cationic group into acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid.
  • the negatively charged segment may be a compound having an anionic group.
  • Examples of the negatively charged segment include an anionic polyamino acid and an anionic protein.
  • an amino acid which comprises an anionic polyamino acid arbitrary anionic amino acids which have an anionic group (for example, a carboxy group, a hydroxyl group, etc.) in a side chain are mentioned.
  • anionic amino acid include acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid; amino acid derivatives obtained by introducing an anionic group into basic amino acids such as lysine, arginine, histidine and ornithine.
  • the ratio of the positively charged segment to the total mass of the micelle is preferably 6% by mass or more, more preferably 6% by mass or more and 50% by mass or less, and more preferably 6% by mass or more and 30% by mass. More preferably, it is at most mass%.
  • the proportion of the positively charged segment is within the above range, the shape is fibrous and longer micelles can be obtained.
  • the physiologically active substance may be physically or chemically bound to the first charged segment directly or indirectly through a linker.
  • the physiologically active substance when the physiologically active substance has a positive or negative charge, the physiologically active substance itself may be used as the first charged segment.
  • physiologically active substance examples include, but are not limited to, proteins such as antibodies and enzymes; nucleic acids; sugars such as peptide aptamers and lactose; folic acid; drugs and the like.
  • Nucleic acid means an oligonucleotide or polynucleotide whose basic unit is a nucleotide consisting of a purine base or pyrimidine base, pentose, and phosphate.
  • the nucleotide contained in the nucleic acid may be a natural type or a chemically modified non-natural type, and may be a molecule to which an amino group, a thiol group, a fluorescent compound or the like is added. Also good.
  • the nucleic acid may be single-stranded or double-stranded.
  • the chain length of the nucleic acid may be, for example, from 4 bases to 20,000 bases, from 10 bases to 10,000 bases, and from 18 bases to 30 bases.
  • nucleic acid for example, functions such as plasmid DNA, siRNA, microRNA, shRNA, antisense nucleic acid, decoy nucleic acid, nucleic acid aptamer, ribozyme, gene, or artificial nucleic acid that compensates for these functions
  • functions such as plasmid DNA, siRNA, microRNA, shRNA, antisense nucleic acid, decoy nucleic acid, nucleic acid aptamer, ribozyme, gene, or artificial nucleic acid that compensates for these functions
  • a nucleic acid is mentioned.
  • the siRNA for example, all those designed by any appropriate method for the target gene can be used.
  • the chain length of siRNA the length of the portion constituting the double strand is preferably 15 bases or more and 50 bases or less, and more preferably 18 bases or more and 30 bases or less.
  • numerator (compound which has an aromatic ring) 1 which forms the 1st charged segment 3 and a core a coordinate bond, a covalent bond, a hydrogen bond, a hydrophobic interaction, physical adsorption etc., for example Is mentioned.
  • the first charged segment is a nucleic acid useful as an anticancer agent
  • the hydrophilic segment 30 contributes to the solubilization of the micelle A.
  • the hydrophilic segment 30 can be formed by any suitable hydrophilic polymer 2.
  • hydrophilic polymer 2 examples include polyethylene glycol, polysaccharide, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, polyacrylic acid, polymethacrylamide, polymethacrylic acid, polymethacrylic ester, polyacrylic ester, polyamino acid, polyapple. Examples thereof include acids, polyoxazolines, and derivatives thereof.
  • polysaccharide examples include starch, dextran, fructan, and galactan.
  • polyethyleneglycol is preferable as the molecule
  • Polyethylene glycol is commercially available as terminal-reactive polyethylene glycol having various functional groups at its terminals, and various molecular weight and branched types are commercially available. Polyethylene glycol is also preferable because it has biocompatibility and further has an effect of suppressing nonspecific adsorption of proteins and the like.
  • the molecular weight of the molecules 2 forming the hydrophilic segment 30 is appropriately set according to the size of the micelle.
  • the molecular weight of the molecule 2 forming the hydrophilic segment 30 is preferably 5000 or more and 25000 or less, more preferably 7000 or more and 20000 or less, and 10,000 or more and 15000 or less. More preferably.
  • the molecular weight of the molecule 2 forming the hydrophilic segment 30 is preferably 25000 or more and 100000 or less, more preferably 30000 or more and 80000 or less, and 50000 or more and 75000 or less. Is more preferable.
  • the number of repeating oxyethylene groups is preferably 100 or more and 300 or less.
  • the number of repeating oxyethylene groups is preferably 550 or more and 2000 or less.
  • the second charged segment 4 is connected to the hydrophilic segment 30 (or the molecule 2 forming the hydrophilic segment).
  • the second charged segment 4 has a positive or negative charge.
  • the second charged segment 4 has a charge opposite to that of the first charged segment 3. Examples of the positively charged segment and the negatively charged segment include the same as those exemplified in the first charged segment 3.
  • the physiologically active substance may be physically or chemically bound to the second charged segment 4 directly or indirectly through a linker.
  • the physiologically active substance may be used as the second charged segment.
  • a physiologically active substance having a positive charge and a physiologically active substance having a negative charge may be used as the first charged segment and the second charged segment, respectively.
  • the micelle of the present embodiment when the micelle of the present embodiment has a physiologically active substance, it can be stably included in the micelle, and therefore the first charged segment is a physiologically active substance, or directly or directly on the first charged segment. It is preferable that the physiologically active substance is physically or chemically bound indirectly via a linker.
  • physiologically active substance examples include those similar to those exemplified for the first charged segment.
  • the second charged segment 4 may be physically or chemically bonded to the hydrophilic segment 30 directly or indirectly through a linker.
  • Examples of the bonding mode include the same ones as exemplified in the first charged segment 3.
  • FIG. 1 is a schematic process diagram showing an example of a micelle manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
  • the manufacturing method of the micelle of this embodiment will be described in detail below with reference to FIG. 1 illustrates the case where the first charged segment 3 has a negative charge and the second charged segment 4 has a positive charge, but the charge may be reversed. .
  • the case where a core is porphyrin is illustrated, the compound which has another aromatic ring may be sufficient.
  • a first molecule 5 composed of a molecule (compound having an aromatic ring) 1 and a first charged segment 3 forming a core
  • a second molecule 6 composed of a hydrophilic segment 2 and a second charged segment.
  • the reaction temperature may be any temperature at which the first molecule 5 and the second molecule 6 can stably react and do not hinder the reaction. As reaction temperature, 20 degreeC or more and 30 degrees C or less may be sufficient, for example.
  • the molecules (compounds having an aromatic ring) 1 forming the core of the composite 10 are self-assembled by ⁇ - ⁇ stacking and stacked. Thereby, the micelle A which has the hydrophilic segment 30 on the outer side and the core 20 on the inner side is formed.
  • the shape of the micelle A can be adjusted by adjusting the molecular weight of the molecule 2 forming the hydrophilic segment in the reaction and the ratio of the positively charged segment to the total mass of the micelle A, and the fibrous micelle 1A or Spherical micelle 2A can be manufactured.
  • the molecular weight of the molecule 2 forming the hydrophilic segment is preferably 5000 or more and 25000 or less, more preferably 7000 or more and 20000 or less, and more preferably 10,000 or more and 15000 or less. More preferably.
  • the number of repeating oxyethylene groups is preferably 100 or more and 300 or less.
  • the ratio of the positively charged segment to the total mass of the micelle is preferably 6% by mass or more, and more preferably 6% by mass or more and 50% by mass or less. More preferably, the content is 6% by mass or more and 30% by mass or less.
  • the molecular weight of the molecule 2 forming the hydrophilic segment is preferably 25000 or more and 100000 or less, more preferably 30000 or more and 80000 or less, and 50000 or more and 75000 or less. More preferably it is.
  • the number of repeating oxyethylene groups is preferably 550 or more and 2000 or less.
  • the micelle of this embodiment can be easily manufactured.
  • the micelles of the present embodiment can be widely used in the medical field such as pharmaceutical compositions, contrast agents, artificial enzymes and the like.
  • the artificial enzyme here means an artificially produced enzyme that can replace an enzyme in a living body.
  • the molecule that forms the core is porphyrin and a divalent iron ion is coordinated to the center of the porphyrin, it can be used as heme, It can be a prosthetic molecule for proteins.
  • ⁇ Pharmaceutical composition The pharmaceutical composition which concerns on one Embodiment of this invention contains the micelle of the said embodiment.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment is further improved in blood retention, particularly by containing fibrous micelles. Furthermore, the efficiency of reaching the target tissue of the drug is further improved, the therapeutic effect is higher, and the number of administrations of the pharmaceutical composition can be reduced.
  • a drug is included in the micelle.
  • medical agent The thing similar to what was illustrated as a bioactive substance in the said micelle is mentioned.
  • the 1st charged segment of a micelle has a functional nucleic acid. That is, in the pharmaceutical composition of the present embodiment, the first charged segment of the micelle is a functional nucleic acid, or is functional nucleic acid directly or indirectly through a linker to the first charged segment. Are preferably physically or chemically bound. Examples of the functional nucleic acid include those exemplified in the above micelle.
  • the content ratio of the micelle is not limited and can be appropriately set in consideration of the therapeutic effect.
  • the number of administration is preferably 1 to several times per week.
  • Administration forms are known to those skilled in the art, for example, intravascular injection (intraarterial injection intravenous injection), subcutaneous injection, intranasal, intraperitoneal, transbronchial, intramuscular, percutaneous, or orally The method is mentioned.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment includes a micelle containing a therapeutically effective amount of the above-mentioned physiologically active substance, and a pharmaceutically acceptable diluent.
  • Pharmaceutically acceptable carriers or diluents include excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners, flavoring agents. Agents, solubilizers, additives and the like. By using one or more of these carriers or diluents, pharmaceutical compositions in the form of injections, solutions, capsules, suspensions, emulsions, syrups and the like can be prepared.
  • Examples of formulation in the pharmaceutical composition of this embodiment include those used orally as tablets, capsules, elixirs, and microcapsules with sugar coating as necessary. Alternatively, those which are used parenterally in the form of sterile solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, or injectable suspensions. Further, a pharmacologically acceptable carrier or diluent, specifically, sterilized water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, Examples thereof include those formulated by mixing with a preservative, a binder and the like, and mixing in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice.
  • Additives that can be mixed into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, swelling such as corn starch, gelatin, and alginic acid Agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, red mono oil or cherry.
  • the above material can further contain a liquid carrier such as fats and oils.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride.
  • Suitable solubilizers such as Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-50 may be used in combination.
  • oily liquids for injection examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • a buffering agent eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • a soothing agent eg, procaine hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • an antioxidant etc.
  • an injection it can also be prepared as an aqueous or non-aqueous diluent, suspension, or emulsion as described above.
  • sterilization of injections can be performed by blending filter sterilization with a filter, bactericides, and the like.
  • injectables can be manufactured in the form of business preparation. That is, it can be used as a sterile solid composition by lyophilization or the like, dissolved in distilled water for injection or other solvent before use.
  • use of the said micelle for manufacturing the said pharmaceutical composition can be provided.
  • the treatment method including administering the effective amount of the said micelle containing the said bioactive substance to the patient who needs a treatment can be provided.
  • the contrast agent which concerns on one Embodiment of this invention contains the micelle of the said embodiment.
  • the contrast agent of this embodiment is particularly a fibrous micelle, and the retention in blood is further improved by containing a micelle in which a metal atom is coordinated to the center of a molecule forming the core in the micelle. It becomes possible to reduce the dose of contrast medium.
  • the content ratio of the micelle is not limited and can be appropriately set in consideration of the MRI contrast effect.
  • the contrast agent of the present embodiment can be applied to various animals such as humans, mice, rats, rabbits, pigs, dogs, cats and the like, and is not limited.
  • parenteral methods such as infusion and intravenous injection are usually employed, and each condition such as dose, number of administrations and administration period is appropriately set according to the type and condition of the test animal. can do.
  • the dose for intravenous administration to humans is determined by a specialist by conducting small experiments with laboratory animals or volunteers as necessary, considering the results, and further considering the patient's condition. Is preferred.
  • the dose for intravenous administration to humans can be 1.0 mg / m 2 or more and 10,000 mg / m 2 or less once a day.
  • the contrast agent of the present embodiment may be used as a contrast composition by mixing an additive generally used in drug production in consideration of the use for MRI contrast.
  • additives include excipients, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives, and taste masking agents.
  • examples include flavoring agents, soothing agents, stabilizers, and isotonic agents.
  • the MRI imaging method provided with the process of administering the said contrast agent or the said composition for a contrast to the inside of a test animal can be provided.
  • FIG. 2 shows the result of 1 H-NMR analysis of the obtained porphyrin-PBLA. From FIG. 2, it was confirmed that the product was porphyrin-PBLA.
  • porphyrin-polyaspartic acid 52.5 mg of porphyrin-PBLA was dissolved in 5 mL of acetonitrile and 5 mL of dimethyl sulfoxide in a 10 mL vial. Subsequently, 1 mL of 1N NaOH aqueous solution was added and mixed. Then 6 mL of water was added and mixed. Next, 600 ⁇ L of 1N NaOH aqueous solution was added and reacted at room temperature for 3 hours with stirring to produce porphyrin-polyaspartic acid (Porphyrin-PAsp). Subsequently, dialysis (fraction molecular weight: 3500) was performed 6 times with water. Next, the residue was freeze-dried to obtain purified porphyrin-polyaspartic acid (Porphyrin-PAsp) (19.11 mg).
  • FIG. 3 shows the analysis result of the obtained porphyrin-polyaspartic acid (Porphyrin-PAsp) by gel permeation chromatography (GPC). From FIG. 3, since there was one peak, it was confirmed that no by-product was contained and only porphyrin-polyaspartic acid (Porphyrin-PAsp) was obtained.
  • PEG-PLys polyethylene glycol-polylysine
  • Polyethylene glycol-polylysine was produced by the following route. Polyethylene glycols having different molecular weights of 5000 (5k), 12000 (12k), 30000 (30k) and 73000 (73k) are used, and PEG 5k -PLys, PEG 12k -PLys, PEG 30k -PLys and It was produced four of PEG 73k -PLys.
  • FIGS. 4 and 5 The analysis results by 1 H-NMR and the analysis results by GPC of the obtained polyethylene glycol-polylysine (typically PEG 5k -PLys) are shown in FIGS. 4 and 5, respectively. From FIG. 4, it was confirmed that the product was PEG 5k -PLys. From FIG. 5, it was confirmed that since there was one peak, no by-product was contained and only PEG 5k -PLys was obtained.
  • both spherical and fibrous (worm) micelles were formed due to excess of porphyrin in micelles with anions / cations of 3/1 or more. . Further, at any charge ratio, fibrous (worm) micelles were formed.
  • FIG. 10 reveals that the proportion of the spherical shape in the micelle shape increases as the molecular weight of polyethylene glycol increases. This suggests that ⁇ - ⁇ stacking by porphyrin is inhibited by steric hindrance of polyethylene glycol.
  • the average value of the neck of the obtained micelle was about 4 nm
  • the average value of the diameter a was about 9 nm
  • the average value of the diameter b was 10 nm.
  • the average value of the length of the micelle was 72 nm.
  • PIC worm micelle fluorescent-labeled fibrous micelles
  • mice Micellar blood retention test 1 1. Administration of micelles to mice Subsequently, 130 ⁇ L of the fluorescently labeled fibrous micelles (PIC worm micelle) produced in Production Example 2 were administered to 6-week-old male BALB / c-nu mice via the tail vein. Further, as a control, PEG 12k -PAsp 40 / PEG 12k -PLys 40 -Alexa 647 (average diameter 30 nm) (hereinafter sometimes referred to as “Spherical PIC micelle”), which is a conventional spherical micelle, is similarly applied to the mouse. It was administered intravenously.
  • PEG 12k -PAsp 40 / PEG 12k -PLys 40 -Alexa 647 average diameter 30 nm
  • Alexa647 fluorescence was not detected immediately after the start of administration in the mice administered with Special PIC micelle.
  • Alexa647 and Cy3 fluorescence was detected for 2 hours or more from the start of administration in mice administered with PIC worm micelle.
  • FIG. 13B is a fluorescence image (magnification: 10 times) of blood vessels (arteries and veins) of mice administered with PIC worm micelle. From FIG. 13B, fluorescence of both Alexa647 and Cy3 was observed in the veins of mice.
  • fibrous micelles can greatly improve the blood retention.
  • miceelle blood retention test 2 1. Administration of micelles to mice Next, 130 ⁇ L of cross-linked PIC worm micelle prepared in Production Example 3 was administered to 6-week-old male BALB / c-nu mice via the tail vein. As a control, cross-linked spherical micelles (hereinafter sometimes referred to as “Cross-linked Spiral PIC micelle”) were also administered to mice via the tail vein. This crosslinked spherical micelle was produced by adding a crosslinking agent to PEG 12k -PAsp 40 / PEG 12k -PLys 40 -Alexa 647 (average diameter 30 nm), which is a conventional spherical micelle.
  • FIG. 14B is a fluorescence image (magnification: 10 times) of blood vessels (arteries and veins) of mice administered with Cross-linked PIC worm micelles. From FIG. 14B, fluorescence of both Alexa647 and Cy3 was observed in the blood vessels (arteries and veins) of mice.
  • the crosslinked fibrous micelle can significantly improve the blood retention.
  • Porphyrin-siRNA was produced by the route shown below. Specifically, it is as shown below.
  • FIG. 16 shows the analysis result of the obtained porphyrin-maleimide by 1 H-NMR.
  • FIG. 16 confirmed that the product was porphyrin-maleimide.
  • porphyrin-siRNA was produced by mixing the porphyrin-maleimide obtained in (1) and siRNA.
  • porphyrin-siRNA and a hydrophilic segment are mixed to form micelles, whereby micelles containing siRNA can be obtained.
  • the micelle of this embodiment can be easily manufactured and can contain hydrophilic, hydrophobic and ionic compounds.
  • the micelles of this embodiment are useful as, for example, carriers for drug delivery such as nucleic acids, artificial enzymes, and contrast agents.
  • SYMBOLS 1 ... Molecule which forms a core (compound which has an aromatic ring), 2 ... Molecule which forms a hydrophilic segment (hydrophilic polymer), 3 ... 1st charged segment, 4 ... 2nd charged segment, 5 ... 1st molecule, 6 ... second molecule, 10 ... complex, 20 ... core, 30 ... hydrophilic segment, 100 ... laminated composite, A ... micelle, 1A ... fibrous (worm) micelle, 2A ... Spherical micelle

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Abstract

ミセルは、芳香環を有する化合物のπ－πスタッキングにより形成されたコアと、前記コアに接続する第１の荷電性セグメントと、親水性セグメントと、前記親水セグメントに接続する第２の荷電性セグメントを含有し、前記第２の荷電性セグメントは、前記第１の荷電性セグメントの電荷と反対の電荷を有し、前記コアと前記親水性セグメントとが、前記第１の荷電性セグメント及び前記第２の荷電性セグメントによる静電相互作用を介して結合している。医薬組成物は、前記ミセルを含有する。造影剤は、前記ミセルを含有する。

Description

ミセル及びその使用
　本発明は、ミセル及びその使用に関する。具体的には、本発明は、ミセル、並びに前記ミセルを含有する医薬組成物及び造影剤に関する。
　本願は、２０１６年８月２３日に、米国に仮出願された米国特許第６２／３７８，２３６号明細書に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）は、キャリア（薬物運搬体）に薬剤を内包し、その薬剤の薬物動態をコントロールすることで、薬剤の治療効果を高めるシステムである。これまで、様々なキャリアが開発されており、近年ワームミセルが注目を集めている。ワームミセルは、球状のミセルと比較して、高い血中滞留性を有することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。そのため、ワームミセルをキャリアとして用いることで、薬剤の標的とする組織への到達効率を向上させるができ、治療効果を高めることや、投与回数を減らすことが可能になる。
　従来の球状ミセル及びワームミセルは、親水性セグメント及び疎水性セグメントを有するブロックコポリマーにより形成されている（例えば、特許文献１参照）。
再公表ＷＯ２０１３／１６２０４１号公報
Dennis E et al., "Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery.", Nat Nanotechnol, Vol. 2, No. 4, p249-255, 2007.
　従来のワームミセルは、疎水性相互作用を駆動力にワームミセルを形成しているため、内包できる薬剤が疎水性のものに限定されている。
また、従来のワームミセルの製造方法は、有機及び水系混合溶媒を用いるため、多くの工程を経る必要があり、煩雑である。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便に製造可能であり、親水性、疎水性及びイオン性の化合物を内包できるミセルを提供する。また、前記ミセルを含有する医薬組成物及び造影剤を提供する。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
　本発明の第１態様に係るミセルは、芳香環を有する化合物のπ－πスタッキングにより形成されたコアと、前記コアに接続する第１の荷電性セグメントと、親水性セグメントと、前記親水セグメントに接続する第２の荷電性セグメントを含有し、前記第２の荷電性セグメントは、前記第１の荷電性セグメントの電荷と反対の電荷を有し、前記コアと前記親水性セグメントとが、前記第１の荷電性セグメント及び前記第２の荷電性セグメントによる静電相互作用を介して結合している。
　上記第１態様に係るミセルは、繊維状であってもよい。
　前記コアは、ポルフィリンの積層体であってもよい。
　前記親水性セグメントは、ポリエチレングリコールであってもよい。
　ミセルの全質量に対する正の荷電性セグメントの割合が６質量％以上であってもよい。
　本発明の第２態様に係る医薬組成物は、上記第１態様に係るミセルを含有する。
　前記第１の荷電性セグメントは、機能性核酸を有してもよい。
　本発明の第３態様に係る造影剤は、上記第１態様に係るミセルを含有する。
　上記態様のミセルは、簡便に製造可能であり、親水性、疎水性及びイオン性の化合物を内包できる。
本発明の一実施形態に係るミセルの製造方法の一例を示す概略工程図である。 製造例１におけるポルフィリン－ＰＢＬＡの１Ｈ－ＮＭＲによる分析結果を示すグラフである。 製造例１におけるポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ）のゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分析結果を示すグラフである。 製造例１におけるポリエチレングリコール（分子量５０００）－ポリリジン（ＰＥＧ５ｋ－ＰＬｙｓ２０）の１Ｈ－ＮＭＲによる分析結果を示すグラフである。 製造例１におけるＰＥＧ５ｋ－ＰＬｙｓ２０のＧＰＣによる分析結果を示すグラフである。 製造例１における異なる電荷比率でＰｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐとＰＥＧ５ｋ－ＰＬｙｓ２０とを混合して形成されたミセルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。 製造例１における異なる電荷比率でＰｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐとＰＥＧ１２ｋ－ＰＬｙｓ２８とを混合して形成されたミセルのＴＥＭ像である。 製造例１における異なる電荷比率でＰｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐとＰＥＧ３０ｋ－ＰＬｙｓ２１とを混合して形成されたミセルのＴＥＭ像である。 製造例１における異なる電荷比率でＰｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐとＰＥＧ７３ｋ－ＰＬｙｓ１９とを混合して形成されたミセルのＴＥＭ像である。 製造例１におけるアニオン／カチオン＝１／１でＰｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐと異なる分子量のＰＥＧを含むＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＰＥＧ５ｋ－ＰＬｙｓ２０、ＰＥＧ１２ｋ－ＰＬｙｓ２８、ＰＥＧ３０ｋ－ＰＬｙｓ２１及びＰＥＧ７３ｋ－ＰＬｙｓ１９）とを混合して形成されたミセルを比較したＴＥＭ像である。 製造例１におけるアニオン／カチオン＝１／１でＰｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐとＰＥＧ１２ｋ－ＰＬｙｓ２８とを混合して形成された繊維状ミセルのサイズを示す模式図である。 製造例２における蛍光標識ミセルの製造方法を示す概略工程図である。 試験例１におけるＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスでのＡｌｅｘａ６４７及びＣｙ３の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。 試験例１におけるＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスの血管（動脈及び静脈）の蛍光像である。 試験例１におけるＳｐｈｅｒｉｃａｌ　ＰＩＣ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスでのＡｌｅｘａ６４７の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。 試験例２におけるＣｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスでのＡｌｅｘａ６４７及びＣｙ３の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。 試験例２におけるＣｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスの血管（動脈及び静脈）の蛍光像である。 試験例２におけるＣｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ　ＰＩＣ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスでのＡｌｅｘａ６４７の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。 製造例４におけるポルフィリン－マレイミドのＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　ＭＳによる分析結果を示すグラフである。 製造例４におけるポルフィリン－マレイミドの１Ｈ－ＮＭＲによる分析結果を示すグラフである。
≪ミセル≫
　図１は、本発明の一実施形態に係るミセルの製造方法の一例を示す概略工程図である。図１を参照しながら、本実施形態のミセルの構造について、以下に詳細を説明する。
　本実施形態のミセルＡは、芳香環を有する化合物１のπ－πスタッキングにより形成されたコア２０と、親水性セグメント３０とを含有する。コア２０には、第１の荷電性セグメント３が接続している。親水性セグメント３０には、第１の荷電性セグメント３の電荷と反対の電荷を有する第２の荷電性セグメント４が接続している。図１に示すように、コア２０と親水性セグメント３０とが、第１の荷電性セグメント３及び第２の荷電性セグメント４による静電相互作用を介して結合している。
　本実施形態のミセルは、後述の実施例に示すとおり、簡便に製造可能であり、親水性、疎水性及びイオン性の化合物を内包できる。
　本実施形態のミセルＡは、繊維状ミセル１Ａであってもよく、球状ミセル２Ａであってもよい。後述の製造方法に示すように、親水性セグメント３０を形成する分子（親水性ポリマー）２の分子量及び配合量によって、形状を制御することができる。
　中でも、後述の実施例に示すように、血中滞留性が優れていることから、本実施形態のミセルは、繊維状ミセルであることが好ましい。
　本実施形態のミセルＡの大きさとしては、被検体内に投与し、目的の組織に送達可能な大きさであればよく、特別な限定はない。ミセルＡの大きさとしては、球状の場合、その平均直径が例えば１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下とすることができる。また、繊維状である場合、その長さが例えば１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下とすることができる。
　次いで、本実施形態のミセルＡの構成成分について、以下に詳細を説明する。
＜コア＞
　本実施形態のミセルＡにおいて、コア２０は、芳香環を有する化合物１がπ－πスタッキングにより自己集積して積層することで形成されている。芳香環を有する化合物１として具体的には、例えば、ポルフィリン、クロリン、コロール等のテトラピロール類、コリン、フタロシアニン等が挙げられ、これらに限定されない。
　中でも、生体内に存在する分子であることから、本実施形態のミセルＡのコア２０を形成する分子１としては、ポルフィリンであることが好ましい。すなわち、本実施形態のミセルＡのコア２０は、ポルフィリンの積層体であることが好ましい。
　また、コアを形成する分子１がテトラピロール類等の芳香環を有する大員環化合物である場合、その中心にキレート作用により金属原子が配位していてもよい。金属原子としては、白金、銅、金、鉄、亜鉛、銀、ガドリニウム、ユーロピウム、マンガン等が挙げれられ、これらに限定されない。コアを形成する分子１にこれらの金属原子が配位されていることで、本実施形態のミセルＡを造影剤又は人工酵素として用いることができる。
［第１の荷電性セグメント］
本実施形態のミセルＡにおいて、コア２０（又は、コアを形成する分子１）には、第１の荷電性セグメント３が接続している。第１の荷電性セグメント３は正又は負の電荷をもつ。第１の荷電性セグメント３と、後述する第２の荷電性セグメント４とは、電荷が異なる。すなわち、第１の荷電性セグメント３が正の電荷をもつ場合、親水性セグメント３０に接続している第２の荷電性セグメント４は負の電荷をもつ。一方、第１の荷電性セグメント３が負の電荷をもつ場合、親水性セグメント３０に接続している第２の荷電性セグメント４は正の電荷をもつ。
　本実施形態のミセルＡが形成される際に、上記電荷の違いにより、第１の荷電性セグメント３と第２の荷電性セグメント４との間に静電相互作用に基づく引力が生じる。そのため、コアを形成する分子１と親水性セグメントを形成する分子２とが結合して複合体１０を形成する。また、この複合体１０は、第１の荷電性セグメント３及び第２の荷電性セグメント４の電荷が相殺されるため、電気的に中性であることが好ましい。さらに、上述したとおり、コアを形成する分子１である芳香環を有する化合物同士がπ－πスタッキングにより自己集積して、複合体１０が積層することで、ミセルＡが形成される。なお、ここでいう「複合体」とは、図１に示すように、第１の分子（５）１分子と、第２の分子（６）１分子とが結合してなる構造体である。
本明細書において、「複合体が電気的に中性である」という状態は、複合体における第１の荷電性セグメントに由来する電荷の合計と第２の荷電性セグメントに由来する電荷の合計との相違が、例えば±１０％程度の範囲、例えば±５％程度の範囲にある状態を含む。例えば、第１の荷電性セグメントの電荷の合計が４０である場合、複合体における第２の荷電性セグメントに由来する電荷の合計が例えば３０以上５０以下の範囲、例えば３５以上４５以下の範囲、例えば３８以上４３以下の範囲、例えば３９以上４１以下の範囲にある状態を含む。
　正の荷電性セグメントとしては、カチオン性基を有する化合物であればよい。正の荷電性セグメントとしては、例えば、カチオン性ポリアミノ酸、カチオン性タンパク質等が挙げられる。
　カチオン性ポリアミノ酸を構成するアミノ酸としては、側鎖にカチオン性基（例えば、アミノ基等）を有する任意のカチオン性アミノ酸が挙げられる。カチオン性アミノ酸としては、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸にカチオン性基を導入したアミノ酸誘導体等が挙げられる。
　負の荷電性セグメントとしては、アニオン性基を有する化合物であればよい。負の荷電性セグメントとしては、例えば、アニオン性ポリアミノ酸、アニオン性タンパク質等が挙げられる。
アニオン性ポリアミノ酸を構成するアミノ酸としては、側鎖にアニオン性基（例えば、カルボキシ基、水酸基等）を有する任意のアニオン性アミノ酸が挙げられる。アニオン性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸；リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸にアニオン性基を導入したアミノ酸誘導体等が挙げられる。
　本実施形態のミセルにおいて、ミセルの全質量に対する正の荷電性セグメントの割合が６質量％以上であることが好ましく、６質量％以上５０質量％以下であることがより好ましく、６質量％以上３０質量％以下であることがさらに好ましい。
　正の荷電性セグメントの割合が上記範囲であることで、繊維状であって、より長いミセルとすることができる。
　また、本実施形態のミセルにおいて、第１の荷電性セグメントに直接的又はリンカーを介すことで間接的に、生理活性物質が物理的又は化学的に結合されていてよい。又は、生理活性物質が正又は負の電荷をもつ場合、生理活性物質自体を第１の荷電性セグメントとして用いてもよい。
生理活性物質としては、例えば、抗体、酵素等のタンパク質；核酸；ペプチドアプタマー、ラクトース等の糖、葉酸；薬物等が挙げられ、これらに限定されない。
　核酸は、プリン塩基又はピリミジン塩基、ペントース、及びリン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味する。当該核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであってもよく、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物等の分子が付加されたものであってもよい。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
　上記核酸の鎖長は、例えば、４塩基以上２０，０００塩基以下であってよく、１０塩基以上１０，０００塩基以下であってよく、１８塩基以上３０塩基以下であってよい。
上記核酸としては、その機能又は作用を考慮すると、例えば、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、核酸アプタマー、リボザイム、遺伝子、又はそれらの機能を代償する人工核酸等の機能核酸が挙げられる。
　上記ｓｉＲＮＡとしては、例えば、標的とする遺伝子に対し、任意の適切な方法で設計されたすべてのものを用いることができる。ｓｉＲＮＡの鎖長としては、二重鎖を構成する部分の長さが１５塩基以上５０塩基以下であることが好ましく、１８塩基以上３０塩基以下であることがより好ましい。
　また、第１の荷電性セグメント３と、コアを形成する分子（芳香環を有する化合物）１との結合としては、例えば、配位結合、共有結合、水素結合、疎水性相互作用、物理吸着等が挙げられる。例えば、第１の荷電性セグメントが抗がん剤として有用な核酸である場合、コアを形成する分子（芳香環を有する化合物）と当該核酸とをチオエーテル結合（－Ｓ－）により結合させたミセルとすることができる。このチオエーテル結合はがん細胞において開裂することが知られているため、当該ミセルをがん患者に投与することで、がん細胞に選択的に核酸を送達させることができる。
＜親水性セグメント＞
　本実施形態のミセルＡにおいて、親水性セグメント３０は、ミセルＡの可溶化に寄与している。親水性セグメント３０は、任意の適切な親水性ポリマー２によって形成することができる。
親水性ポリマー２としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリサッカライド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミノ酸、ポリリンゴ酸、ポリオキサゾリン、これらの誘導体等が挙げられる。
ポリサッカライドの具体例としては、例えば、デンプン、デキストラン、フルクタン、ガラクタン等が挙げられる。
中でも、本実施形態のミセルＡの親水性セグメント３０を形成する分子２としては、ポリエチレングリコールが好ましい。ポリエチレングリコールは、末端に種々の官能基を有する末端反応性ポリエチレングリコールが市販されており、また、種々の分子量のものや分岐型のものが市販されており、容易に入手できる。また、ポリエチレングリコールは、生体適合性を有し、さらにタンパク質等の非特異的吸着を抑制する効果を有することからも好ましい。
　親水性セグメント３０を形成する分子２の分子量は、ミセルの大きさに応じて、適宜設定される。例えば、繊維状ミセル１Ａである場合、親水性セグメント３０を形成する分子２の分子量は、５０００以上２５０００以下であることが好ましく、７０００以上２００００以下であることがより好ましく、１００００以上１５０００以下であることがさらに好ましい。
　一方、球状ミセル２Ａである場合、親水性セグメント３０を形成する分子２の分子量は、２５０００以上１０００００以下であることが好ましく、３００００以上８００００以下であることがより好ましく、５００００以上７５０００以下であることがさらに好ましい。
　また、例えば、親水性セグメント３０を形成する分子２がポリエチレングリコールであり、繊維状ミセル１Ａである場合、オキシエチレン基の繰り返し数は１００以上３００以下であることが好ましい。一方、親水性セグメント３０を形成する分子２がポリエチレングリコールであり、球状ミセル２Ａである場合、オキシエチレン基の繰り返し数は５５０以上２０００以下であることが好ましい。
［第２の荷電性セグメント］
　本実施形態のミセルＡにおいて、親水性セグメント３０（又は、親水性セグメントを形成する分子２）には、第２の荷電性セグメント４が接続している。第２の荷電性セグメント４は正又は負の電荷をもつ。上述のとおり、第２の荷電性セグメント４は、上記第１の荷電性セグメント３と反対の電荷を有する。正の荷電性セグメント及び負の荷電性セグメントとしては、上記第１の荷電性セグメント３で例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、第２の荷電性セグメント４に直接的又はリンカーを介すことで間接的に、生理活性物質が、物理的又は化学的に結合されていてよい。又は、生理活性物質が、正又は負の電荷をもつ場合、生理活性物質を第２の荷電性セグメントとして用いてもよい。
なお、正の電荷をもつ生理活性物質及び負の電荷をもつ生理活性物質をそれぞれ、第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントとして用いてもよい。
中でも、本実施形態のミセルが生理活性物質を有する場合、ミセル内に安定的に包含できることから、第１の荷電性セグメントが生理活性物質である、又は、第１の荷電性セグメントに直接的又はリンカーを介すことで間接的に、生理活性物質が物理的又は化学的に結合されていることが好ましい。
生理活性物質としては、上記第１の荷電性セグメントで例示されたものと同様のものが挙げられる。
　また、第２の荷電性セグメント４は、親水性セグメント３０と直接的又はリンカーを介すことで間接的に、物理的又は化学的に結合されていてよい。結合の様式としては、上記第１の荷電性セグメント３で例示されたものと同様のものが挙げられる。
≪ミセルの製造方法≫
　図１は、本発明の一実施形態に係るミセルの製造方法の一例を示す概略工程図である。図１を参照しながら、本実施形態のミセルの製造方法について、以下に詳細を説明する。なお、図１において、第１の荷電性セグメント３が負の電荷を有し、第２の荷電性セグメント４が正の電荷を有する場合を例示しているが、電荷が逆であってもよい。また、コアがポルフィリンである場合を例示しているが、その他の芳香環を有する化合物であってもよい。
まず、コアを形成する分子（芳香環を有する化合物）１及び第１の荷電性セグメント３からなる第１の分子５と、親水性セグメント２及び第２の荷電性セグメントからなる第２の分子６とを、必要により緩衝化された水溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液）中で混合する。反応温度としては、第１の分子５及び第２の分子６が安定して反応でき、当該反応を妨げない温度であればよい。反応温度としては、例えば、２０℃以上３０℃以下であってもよい。
第１の分子５と第２の分子６とを混合することで、コアを形成する分子（芳香環を有する化合物）１に接続している第１の荷電性セグメント３と、親水性セグメント２に接続している第２の荷電性セグメント４との間に静電相互作用に基づく引力が生じる。この引力により第１の分子５及び第２の分子６が結合することで、複合体１０が形成される。
　さらに、複合体１０のコアを形成する分子（芳香環を有する化合物）１同士がπ－πスタッキングにより自己集積し、積層される。これにより、親水性セグメント３０を外側に、コア２０を内側に有するミセルＡが形成される。
　また、反応における親水性セグメントを形成する分子２の分子量及びミセルＡの全質量に対する正の荷電性セグメントの割合を調整することで、ミセルＡの形状を調整することができ、繊維状ミセル１Ａ又は球状ミセル２Ａを製造することができる。
例えば、繊維状ミセル１Ａを形成させる場合、親水性セグメントを形成する分子２の分子量は、５０００以上２５０００以下であることが好ましく、７０００以上２００００以下であることがより好ましく、１００００以上１５０００以下であることがさらに好ましい。
また、例えば、親水性セグメントを形成する分子２がポリエチレングリコールであり、繊繊維状ミセル１Ａを形成させる場合、オキシエチレン基の繰り返し数は１００以上３００以下であることが好ましい。
また、例えば、繊維状ミセル１Ａを形成させる場合、ミセルの全質量に対する正の荷電性セグメントの割合が６質量％以上であることが好ましく、６質量％以上５０質量％以下であることがより好ましく、６質量％以上３０質量％以下であることがさらに好ましい。
一方、例えば、球状ミセル２Ａを形成させる場合、親水性セグメントを形成する分子２の分子量は、２５０００以上１０００００以下であることが好ましく、３００００以上８００００以下であることがより好ましく、５００００以上７５０００以下であることがさらに好ましい。
また、例えば、親水性セグメントを形成する分子２がポリエチレングリコールであり、球状ミセル２Ａを形成させる場合オキシエチレン基の繰り返し数は５５０以上２０００以下であることが好ましい。
以上のとおり、本実施形態のミセルは、簡便に製造することができる。
≪用途≫
　本実施形態のミセルは、例えば、医薬組成物、造影剤、人工酵素等の医学分野において幅広く利用することができる。
　なお、ここでいう人工酵素とは、人工的に製造された酵素であって、生体内の酵素を代替可能なものを意味する。例えば、本実施形態のミセルにおいて、コアを形成する分子がポルフィリンであり、ポルフィリンの中心に２価の鉄イオンが配位している場合、ヘムとして利用でき、生体内に投与することで、ヘムタンパク質の補欠分子となり得る。
＜医薬組成物＞
　本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、上記実施形態のミセルを含有する。
　本実施形態の医薬組成物は、特に繊維状ミセルを含有することで、血中滞留性がより向上される。さらに、薬剤の標的とする組織への到達効率がより向上されており、治療効果をより高く、医薬組成物の投与回数を減らすことが可能になる。
　本実施形態の医薬組成物は、上記ミセル内に薬剤が包含されている。薬剤としては、特別な限定はなく、上記ミセルにおいて生理活性物質として例示されたものと同様のものが挙げられる。
中でも、本実施形態の医薬組成物において、ミセルの第１の荷電性セグメントが機能性核酸を有することが好ましい。すなわち、本実施形態の医薬組成物においてミセルの第１の荷電性セグメントが機能性核酸である、又は、第１の荷電性セグメントに直接的又はリンカーを介すことで間接的に、機能性核酸が物理的又は化学的に結合されていることが好ましい。機能性核酸としては、上記ミセルにおいて例示されたものと同様のものが挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物において、上記ミセルの含有割合は、限定はされず、治療効果を勘案して適宜設定することができる。
　投与回数としては、１週間平均当たり、１回～数回投与することが好ましい。
　投与形態としては、例えば、血管内注射（動脈内注射静脈内注射）、皮下注射、鼻腔内的、腹腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、又は経口的に当業者に公知の方法が挙げられる。
＜組成成分＞
　本実施形態の医薬組成物は、治療的に有効量の上述の生理活性物質を含むミセル、及び、薬学的に許容されうる希釈剤を含む。薬学的に許容されうる担体又は希釈剤は、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体又は希釈剤の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、又はシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。
　本実施形態の医薬組成物における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
　又は、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。さらには、薬理学上許容される担体又は希釈剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
　錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
　注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－５０と併用してもよい。
　注射用の油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等を配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
　注射剤である場合、上記のような水性又は非水性の希釈剤、懸濁剤、又は乳濁剤として調製することもできる。このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法等によって、無菌の固体組成物とし、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。
　また、本発明の一実施形態において、上記医薬組成物を製造するための上記ミセルの使用を提供することができる。
　また、本発明の一実施形態において、上記生理活性物質を含む上記ミセルの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、治療方法を提供することができる。
＜造影剤＞
　本発明の一実施形態に係る造影剤は、上記実施形態のミセルを含有する。
本実施形態の造影剤は、特に繊維状ミセルであり、当該ミセル内のコアを形成する分子の中心に金属原子が配位しているミセルを含有することで、血中滞留性がより向上され、造影剤の投与量を減らすことが可能になる。
本実施形態の造影剤において、上記ミセルの含有割合は、限定はされず、ＭＲＩ造影効果を勘案して適宜設定することができる。
本実施形態の造影剤は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等の各種動物に適用することができ、限定はされない。被験動物への投与方法は、通常、点滴、静脈注射等の非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間等の各条件は、被験動物の種類及び状態等に応じて、適宜設定することができる。例えば、ヒトに静脈内投与をする場合の用量は、必要に応じて実験動物又はボランティアによる小実験を行い、それらの結果を考慮して、さらには患者の状態を考慮して専門医が決定するのが好ましい。ヒトに静脈内投与をする場合の用量は、一般的には、１日１回、１．０ｍｇ／ｍ２以上１０，０００ｍｇ／ｍ２以下とすることができる。
本実施形態の造影剤は、、ＭＲＩ造影用という用途を勘案し、薬剤製造上一般に用いられる添加剤を混合して、造影用組成物としてもよい。
添加剤としては、例えば、賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等が挙げられる。
また、本発明の一実施形態において、被験動物の体内に上記造影剤又は上記造影用組成物を投与する工程を備えるＭＲＩ造影方法を提供することができる。
　以下、実施例及び比較例等を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
［製造例１］ミセルの製造１
１．ポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ）の製造
　以下に示す経路で、ポルフィリン－ポリアスパラギン酸を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
［上記反応式中は、ｎ１は１９である。］
（１）ポルフィリン－ＰＢＬＡの製造
　具体的には、まず、５０ｍＬの１口フラスコ内において、真空乾燥下及びアルゴンガス雰囲気下で、β－ベンジル－Ｌ－アスパルテート－Ｎ－カルボン酸無水物（Ｎ－ｃａｒｂｏｘｙ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ　ｏｆ　Ｐ－ｂｅｎｚｙｌ－Ｌ－ａｓｐａｒｔａｔｅ：ＮＣＡ－ＢＬＡ）０．３５ｇ（１．３７ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド及び１Ｍチオ尿素の混合液１ｍＬに溶解した。次いで、５０ｍＬの２口フラスコ内で、５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ　１０．５ｍｇ（０．０１５６ｍｍｏｌ）（ＣＡＳ　Ｎｏ．２２１１２－８４－１）にベンゼンを加えて凍結乾燥させた。次いで、凍結乾燥物をジメチルホルムアミド及び１Ｍチオ尿素の混合液１ｍＬに溶解した。次いで、５０ｍＬの１口フラスコ内からＮＣＡ－ＢＬＡを含む溶液を５０ｍＬの２口フラスコに移し、撹拌しながら３０℃で３日間反応させて、ポルフィリン－ＰＢＬＡを生成させた。次いで、メタノールで２回、水で３回、透析（分画分子量：３５００）を行った。次いで、凍結乾燥し、褐色の粉末として精製後のポルフィリン－ＰＢＬＡ（１９４．１ｍｇ）を得た。
　得られたポルフィリン－ＰＢＬＡの１Ｈ－ＮＭＲによる分析結果を図２に示す。
　図２から、生成物がポルフィリン－ＰＢＬＡであることが確かめられた。
（２）ポルフィリン－ポリアスパラギン酸の製造
次いで、１０ｍＬのバイアル内でポルフィリン－ＰＢＬＡ　５２．５ｍｇを５ｍＬのアセトニトリル及び５ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解させた。次いで、１Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を１ｍＬ加えて、混合した。次いで、６ｍＬの水を加えて混合した。次いで、１Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を６００μＬ加えて、撹拌しながら室温で３時間反応させて、ポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ）を生成させた。次いで、水で６回、透析（分画分子量：３５００）を行った。次いで、凍結乾燥し、精製後のポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ）（１９．１１ｍｇ）を得た。
　得られたポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ）のゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分析結果を図３に示す。
　図３から、ピークが１つであることから、副生成物は含まれず、ポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ）のみが得られたことが確かめられた。
２．ポリエチレングリコール－ポリリジン（ＰＥＧ－ＰＬｙｓ）の製造
　以下に示す経路で、ポリエチレングリコール－ポリリジンを製造した。なお、ポリエチレングリコールとしては、５０００（５ｋ）、１２０００（１２ｋ）、３００００（３０ｋ）及び７３０００（７３ｋ）の異なる分子量のものを用いて、ＰＥＧ５ｋ－ＰＬｙｓ、ＰＥＧ１２ｋ－ＰＬｙｓ、ＰＥＧ３０ｋ－ＰＬｙｓ及びＰＥＧ７３ｋ－ＰＬｙｓの４種を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
［上記反応式中、ＰＥＧ５ｋのとき、ｍ１は２０であり、ｎ２は１１３である。ＰＥＧ１２ｋのとき、ｍ１は２８であり、ｎ２は２７３である。ＰＥＧ３０ｋのとき、ｍ１は２１であり、ｎ２は６７８である。ＰＥＧ７３ｋのとき、ｍ１は１９であり、ｎ２は１６５１である。］
（１）ポリエチレングリコール－トリフルオロアセチル－Ｌ－リジン（ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）の製造
　具体的には、まず、１００ｍＬの１口フラスコ内において、真空乾燥下及びアルゴンガス雰囲気下で、Ｎ－トリフルオロ酢酸－Ｌ－リジンＮ－カルボン酸無水物（Ｎ－ｃａｒｂｏｘｙ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ　ｏｆ　Ｎ－Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ：ＮＣＡ－Ｌｙｓ（ＴＦＡ））０．３７０ｇ（１．３８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド及び１Ｍチオ尿素の混合液９ｍＬに溶解した。次いで、１００ｍＬの２口フラスコ内で、分子量５０００、１２０００、３００００又は７３０００のＰＥＧ－ＮＨ２（ＰＥＧ５ｋ、１２ｋ、３０ｋ or ７３ｋ－ＮＨ２）３００．０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）にベンゼンを加えて凍結乾燥させた。次いで、凍結乾燥物をジメチルホルムアミド及び１Ｍチオ尿素の混合液３ｍＬに溶解した。次いで、１００ｍＬの１口フラスコ内からＮＣＡ－Ｌｙｓ（ＴＦＡ）を含む溶液を１００ｍＬの２口フラスコに移し、撹拌しながら３０℃で３日間反応させて、ポリエチレングリコール－トリフルオロアセチル－Ｌ－リジン（ＰＥＧ５ｋ、１２ｋ、３０ｋ or ７３ｋ－ＰＬｙｓ（ＴＦＡ））を生成させた。次いで、水で５回、透析（分画分子量：３５００）を行った。次いで、凍結乾燥させた後、エタノールで再沈殿させた。次いで、ベンゼンを加えて、凍結乾燥して、精製後のポリエチレングリコール－トリフルオロアセチル－Ｌ－リジン（ＰＥＧ５ｋ、１２ｋ、３０ｋ or ７３ｋ－ＰＬｙｓ（ＴＦＡ））（４６４．２ｍｇ）を得た。
（２）ポリエチレングリコール－ポリリジンの製造
　次いで、２０４．１０ｍｇのＰＥＧ５ｋ、１２ｋ、３０ｋ or ７３ｋ－ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）に２０ｍＬのメタノール及び２ｍＬの１Ｎ　ＮａＯＨを加えて、撹拌しながら、３５℃で２４時間反応させて、ポリエチレングリコール－ポリリジン（ＰＥＧ５ｋ、１２ｋ、３０ｋ or ７３ｋ－ＰＬｙｓ）を生成させた。次いで、水で５回、透析（分画分子量：３５００）を行った。次いで、凍結乾燥し、精製後のポリエチレングリコール－ポリリジン（ＰＥＧ５ｋ、１２ｋ、３０ｋ or ７３ｋ－ＰＬｙｓ）（１５２．８０ｍｇ）を得た。
　得られたポリエチレングリコール－ポリリジン（代表として、ＰＥＧ５ｋ－ＰＬｙｓ）の１Ｈ－ＮＭＲによる分析結果及びＧＰＣによる分析結果をそれぞれ図４及び図５に示す。
　図４から、生成物がＰＥＧ５ｋ－ＰＬｙｓであることが確かめられた。
　図５から、ピークが１つであることから、副生成物は含まれず、ＰＥＧ５ｋ－ＰＬｙｓのみが得られたことが確かめられた。
３．ミセルの製造
　次いで、「１．」で製造されたポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ）及び「２．」で製造された分子量の異なるＰＥＧを含む４種のポリエチレングリコール－ポリリジン（ＰＥＧ５ｋ、１２ｋ、３０ｋ or ７３ｋ－ＰＬｙｓ）を用いて、以下の表１に示す電荷比（アニオン／カチオン（－／＋））となるように混合し、ミセルを製造した。なお、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ及びＰＥＧ５ｋ、１２ｋ、３０ｋ or ７３ｋ－ＰＬｙｓは、それぞれ１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）に溶解した状態で１０秒間混合した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
４．電子顕微鏡による観察
　次いで、混合後の各ミセルについて、脱塩処理し、酢酸ウラニルで染色した。次いで、透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＴＥＭ）（ＪＥＯＬ社製、型番：ＪＥＭ－１４００）を用いて観察した。各ＴＥＭ像（倍率：１０，０００倍）を図６～９に示す。
　図６から、ＰＥＧ５ｋ－ＰＬｙｓ２０を用いた場合では、アニオン／カチオンが４／１以上のミセルにおいて、ポルフィリンが過剰になることで、ポリエチレングリコールの凝集が引き起こされていた。
　図７から、ＰＥＧ１２ｋ－ＰＬｙｓ２８を用いた場合では、アニオン／カチオンが３／１以上のミセルにおいて、ポルフィリンが過剰になることで、球状及び繊維状（ワーム）ミセルの両方が形成されていた。また、いずれの電荷比率においても、繊維状（ワーム）ミセルが形成されていた。
　図８から、ＰＥＧ３０ｋ－ＰＬｙｓ２１を用いた場合では、アニオン／カチオンが４／１のミセルにおいて、アニオン／カチオンが１／１以下のミセルと比較して、より分厚い構造体が形成されていた。これは、ポルフィリンが過剰になることで、ポリエチレングリコールの凝集したためであると推察された。また、いずれの電荷比率においても、主に球状ミセルが形成されていた。
　図９から、ＰＥＧ７３ｋ－ＰＬｙｓ１９を用いた場合では、いずれの電荷比率においても、球状ミセルのみが形成されていた。
　また、図１０は、アニオン／カチオン＝１／１での異なる分子量のＰＥＧを含むＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＰＥＧ５ｋ－ＰＬｙｓ２０、ＰＥＧ１２ｋ－ＰＬｙｓ２８、ＰＥＧ３０ｋ－ＰＬｙｓ２１及びＰＥＧ７３ｋ－ＰＬｙｓ１９）を用いて形成されたミセルを比較したＴＥＭ像である。
　図１０から、ポリエチレングリコールの分子量の増加に伴って、ミセルの形状のうち球状の割合が増加することが明らかとなった。このことから、ポルフィリンによるπ－πスタッキングは、ポリエチレングリコールの立体障害により阻害されることが示唆された。
　以上の結果から、電荷比率（アニオン／カチオン）を１／１で、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐとＰＥＧ１２ｋ－ＰＬｙｓ２８とを混合することで、特に長い繊維状ミセルが得られることがわかった。このミセルについて、図７中（アニオン／カチオン＝１／１）のＴＥＭ像に基づいて、ミセルのサイズを測定した。その結果を図１１に示す。
　図１１から、得られたミセルのネックの平均値は約４ｎｍであり、直径ａの平均値は約９ｎｍであり、直径ｂの平均値は１０ｎｍであった。また、ミセルの長さの平均値は７２ｎｍであった。
［製造例２］蛍光標識ミセルの製造
　図１２に示す経路で、ミセルを製造した。具体的には、以下に示すとおりである。
１．Ａｌｅｘａ６４７標識ポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ－Ａｌｅｘａ６４７）の製造
（１）ポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ）の製造
　製造例１の「１．」と同様の方法を用いて、ポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ）を製造した。
（２）Ａｌｅｘａ６４７標識ポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ）の製造
　次いで、（１）で得られたＰｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐとＡｌｅｘａ６４７－ＮＨＳエステルとを混合して、Ａｌｅｘａ６４７標識ポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ－Ａｌｅｘａ６４７）を製造した。
２．Ｃｙ３標識ポリエチレングリコール－ポリリジン（ＰＥＧ－ＰＬｙｓ－Ｃｙ３）の製造
（１）ポリエチレングリコール－ポリリジン（ＰＥＧ－ＰＬｙｓ）の製造
　分子量１２０００のＰＥＧを用いて、製造例１の「２．」と同様の方法を用いて、ＰＥＧ１２ｋ－ＰＬｙｓ２８を製造した。
（２）Ｃｙ３標識ポリエチレングリコール－ポリリジン（ＰＥＧ－ＰＬｙｓ－Ｃｙ３）の製造
　次いで、（１）で得られたＰＥＧ１２ｋ－ＰＬｙｓ２８とＣｙ３－ＮＨＳエステルとを混合して、Ｃｙ３標識ポリエチレングリコール－ポリリジン（ＰＥＧ－ＰＬｙｓ－Ｃｙ３）を製造した。
３．ミセルの製造
　次いで、「１．」で製造されたＡｌｅｘａ６４７標識ポルフィリン－ポリアスパラギン酸（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－ＰＡｓｐ－Ａｌｅｘａ６４７）と、「２．」で製造されたＣｙ３標識ポリエチレングリコール－ポリリジン（ＰＥＧ－ＰＬｙｓ－Ｃｙ３）と混合して、蛍光標識された繊維状ミセル（以下、「ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅ」と称する場合がある）を製造した。
［試験例１］ミセルの血中滞留性確認試験１
１．マウスへのミセルの投与
　次いで、製造例２で製造された蛍光標識された繊維状ミセル（ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅ）１３０μＬを６週齢の雄性ＢＡＬＢ/ｃ－ｎｕマウスに、尾静脈投与した。また、対照として、従来の球状ミセルであるＰＥＧ１２ｋ－ＰＡｓｐ４０／ＰＥＧ１２ｋ－ＰＬｙｓ４０－Ａｌｅｘａ６４７（平均直径３０ｎｍ）（以下、「Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ　ＰＩＣ　ｍｉｃｅｌｌｅ」と称する場合がある）も同様に、マウスに尾静脈投与した。
２．血中滞留性の評価
　投与開始から３時間後まで、生体内共焦点蛍光顕微鏡（ニコン社製、製品名「Ａ１Ｒ」）によりマウス耳介真皮深層の血流中を流れるＡｌｅｘａ６４７及びＣｙ３の蛍光強度を測定することにより血中滞留性を評価した。結果を図１３Ａ（ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅ）及び図１３Ｃ（対照：Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ　ＰＩＣ　ｍｉｃｅｌｌｅ）に示す。
　図１３Ａ及び図１３Ｃから、Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ　ＰＩＣ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスでは、Ａｌｅｘａ６４７の蛍光が投与開始からすぐに検出されなくなった。一方、ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスでは、Ａｌｅｘａ６４７及びＣｙ３の蛍光が投与開始から２時間以上検出された。
また、図１３Ｂは、ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスの血管（動脈及び静脈）の蛍光像（倍率：１０倍）である。
図１３Ｂから、マウスの静脈において、Ａｌｅｘａ６４７及びＣｙ３の両方の蛍光が観察された。
これらの結果から、繊維状ミセルは、血中滞留性を大幅に向上し得ることが示唆された。
［製造例３］架橋ミセルの製造
１．ミセルの製造
　製造例２の「１．」～「３．」と同様の方法を用いて、蛍光標識された繊維状ミセル（ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅ）を製造した。
２．架橋ミセルの製造
　次いで、「１．」で製造されたＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅに架橋剤として１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（１－（３－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）－３－ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＥＤＣ－ＨＣｌ）を添加して、架橋ミセル（以下、「Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅ」と称する場合がある）を製造した。
［試験例２］ミセルの血中滞留性確認試験２
１．マウスへのミセルの投与
　次いで、製造例３で製造された架橋ミセル（Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅ）１３０μＬを６週齢の雄性ＢＡＬＢ/ｃ－ｎｕマウスに、尾静脈投与した。また、対照として、架橋球状ミセル（以下、「Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ　ＰＩＣ　ｍｉｃｅｌｌｅ」と称する場合がある）も同様に、マウスに尾静脈投与した。この架橋球状ミセルは、従来の球状ミセルであるＰＥＧ１２ｋ－ＰＡｓｐ４０／ＰＥＧ１２ｋ－ＰＬｙｓ４０－Ａｌｅｘａ６４７（平均直径３０ｎｍ）に架橋剤を添加して製造した。
２．血中滞留性の評価
　投与開始から１４時間後まで、生体内共焦点蛍光顕微鏡（ニコン社製、製品名「Ａ１Ｒ」）によりマウス耳介真皮深層の血流中を流れるＡｌｅｘａ６４７及びＣｙ３の蛍光強度を測定することにより血中滞留性を評価した。結果を図１４Ａ（Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅ）及び図１４Ｃ（対照：Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ　ＰＩＣ　ｍｉｃｅｌｌｅ）に示す。
　図１４Ａ及び図１４Ｃから、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ　ＰＩＣ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスでは、Ａｌｅｘａ６４７の蛍光が投与開始からすぐに検出されなくなった。一方、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスでは、Ａｌｅｘａ６４７及びＣｙ３の蛍光が投与開始から１４時間後も検出された。
また、図１４Ｂは、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ＰＩＣ　ｗｏｒｍ　ｍｉｃｅｌｌｅを投与したマウスの血管（動脈及び静脈）の蛍光像（倍率：１０倍）である。
図１４Ｂから、マウスの血管（動脈及び静脈）において、Ａｌｅｘａ６４７及びＣｙ３の両方の蛍光が観察された。
これらの結果から、架橋された繊維状ミセルは、血中滞留性をより大幅に向上し得ることが示唆された。
［製造例４］ポルフィリン－ｓｉＲＮＡの製造
１．ポルフィリン－ｓｉＲＮＡの製造
　以下に示す経路で、ポルフィリン－ｓｉＲＮＡを製造した。具体的には、以下に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（１）ポルフィリン－マレイミドの製造
　５０ｍＬの２口フラスコに、Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｃａｒｂｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ　３．６ｍｇ（０．００４ｍｍｏｌ）（ＣＡＳ　Ｎｏ．１４６０９－５４－２）及びＮ－（２－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ－ＨＣｌ）１７．７ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を加えた。さらに、ブタノール１２．７ｇ（０．０９ｍｍｏｌ）、ジメチルアセトアミド２ｍＬ及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩２０．７ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を加えて、撹拌しながら２５℃で４時間反応させて、ポルフィリン－マレイミドを生成させた。次いで、メタノールで２回、水で４回透析を行った。次いで、凍結乾燥して、精製後のポルフィリン－マレイミド（２．５８ｍｇ）を褐色の粉末として得た。
　得られたポルフィリン－マレイミドのＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　ＭＳによる分析結果を図１５に示す。
　図１５から、ポルフィリン－マレイミドの分子量は１２７９．３（Ｅｘａｃｔ　ｍａｓｓ：１２７８．４０）であった。
　得られたポルフィリン－マレイミドの１Ｈ－ＮＭＲによる分析結果を図１６に示す。
　図１６から、生成物がポルフィリン－マレイミドであることが確かめられた。
（２）ポルフィリン－ｓｉＲＮＡの製造
　次いで、（１）で得られたポルフィリン－マレイミドとｓｉＲＮＡとを混合して、ポルフィリン－ｓｉＲＮＡを製造した。
　なお、この得られたポルフィリン－ｓｉＲＮＡと親水性セグメントとを混合してミセル化することで、ｓｉＲＮＡが内包されたミセルを得ることができる。
　本実施形態のミセルは、簡便に製造可能であり、親水性、疎水性及びイオン性の化合物を内包できる。本実施形態のミセルは、例えば、核酸等の薬剤デリバリーのためのキャリア、人工酵素、造影剤として有用である。
　１…コアを形成する分子（芳香環を有する化合物）、２…親水性セグメントを形成する分子（親水性ポリマー）、３…第１の荷電性セグメント、４…第２の荷電性セグメント、５…第１の分子、６…第２の分子、１０…複合体、２０…コア、３０…親水性セグメント、１００…複合体の積層体、Ａ…ミセル、１Ａ…繊維状（ワーム）ミセル、２Ａ…球状ミセル

Claims (8)

  1. 　芳香環を有する化合物のπ－πスタッキングにより形成されたコアと、前記コアに接続する第１の荷電性セグメントと、親水性セグメントと、前記親水セグメントに接続する第２の荷電性セグメントを含有し、
    　前記第２の荷電性セグメントは、前記第１の荷電性セグメントの電荷と反対の電荷を有し、
    前記コアと前記親水性セグメントとが、前記第１の荷電性セグメント及び前記第２の荷電性セグメントによる静電相互作用を介して結合しているミセル。
  2. 　繊維状である請求項１に記載のミセル。
  3. 　前記コアは、ポルフィリンの積層体である請求項１又は２のミセル。
  4. 　前記親水性セグメントは、ポリエチレングリコールである請求項１～３のいずれか一項に記載のミセル。
  5. 　ミセルの全質量に対する正の荷電性セグメントの割合が６質量％以上である請求項１～４のいずれか一項に記載のミセル。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のミセルを含有する医薬組成物。
  7. 　前記第１の荷電性セグメントは、機能性核酸を有する請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のミセルを含有する造影剤。
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