WO2007043486A1 - 生体適合性ブロック共重合体、その用途および製造法 - Google Patents

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Ryoichi Katakai
Kazuhiro Kohama
Yoshiki Suzuki
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Tokyo Cro, Inc.
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    • A61L2300/604—Biodegradation

Definitions

  • the present invention relates to a biocompatible block copolymer having a hydrophobic segment consisting of an amino acid and a hydroxycarboxylic acid and a hydrophilic segment consisting of a polyalkylene oxide, a micelle comprising the biocompatible block copolymer and a drug, and fine particles
  • the present invention also relates to composites and their uses, pharmaceutical compositions containing them, and methods for producing the same. These micelles, microparticles, or complexes enable drug solubilization, dispersion, stabilization, sustained release, and delivery to lesion sites. 'Background technology
  • the drug exhibits its effect by reaching the drug action site in the living body.
  • a drug cannot reach its site of action.
  • the drug (1) is difficult to dissolve in body fluids, (2) is unstable under enzyme, pH, or other physiological conditions, (3) cannot pass through membrane barriers such as endothelium and mucous membrane (4) causing an undesirable immune response, (5) rapidly disappearing and excreting from the blood, (6) lack of targeting ability to the target site, etc. .
  • biodegradable polymer for drug delivery examples include polyoxyacid obtained by ester condensation of hydroxycarboxylic acid having a hydroxyl group and a carboxyl group in the molecule.
  • ester bond since the ester bond does not have a hydrogen atom, it has been clarified that no hydrogen bond is generated in the ester bond and it is more easily biodegradable than a polyamino acid.
  • a non-catalyzed method for polymerizing hydroxycarboxylic acid from hydroxycarboxylic acid and water has been developed.
  • Polymers obtained by polycondensation of oligomers that do not contain catalyst residues use metal catalysts when used in drug delivery systems.
  • Polyoxyacids have a faster biodegradation rate for lower molecular weight samples, and in particular, low molecular weight poly-DL-lactic acid is the preferred drug delivery system (M Asano, H Fukuzaki, M. Yoshida, M. Kumakura, T Mashimo, H Yuasa, K Imai, H Yamanaka, K Suzuki, J Control led Release, (1989) 9 111, M Asano, H Fukuzaki, M Yoshida, M. Kumakura, T Mashimo, H.
  • polymeric micelles are basically nanoparticles formed with a hydrophilic segment as the outer shell and a hydrophobic segment as the inner core. Solubilization, stabilization, and sustained release of drugs. Many reports have been made on delivery carriers.
  • a drug-supporting carrier for a block copolymer comprising a hydrophilic segment such as polyalkyleneoxide and a hydrophobic segment such as polyalkyl spartate (Japanese Patent Laid-Open No. 06-107565, Japanese Patent Laid-Open No.
  • JP-A 06-206830 JP-A 06-206832, JP-A 11-100331, JP-A 2001-226294, JP-A 2003-342167, JP-A 2004-010479, JP-A 2004-35 2972 JP 2005-029480, JP 2005-501831 and WO 03Z000771 pamphlet), a block copolymer comprising a hydrophilic segment such as a hydrophilic polyamino acid and a hydrophobic segment such as polylactide. Fine particles (see JP-A-11-269097), hydrophilic segments such as polyethylene glycol, and blocks containing charged segments such as polyamine polypolyuronic acid.
  • biodegradable plastics consisting of amino acids and hydroxycarboxylic acids
  • depsipeptide copolymers obtained by polymerizing optically active 3-substituted 1,2,5-morpholinediones and cyclic lactones, and bioabsorption produced from polydepsipeptides.
  • Surgical devices, etc. see JP-A-7-188411
  • biodegradable polylactone ester amides having specific polyamide units, specific polyester units, and specific polylactone units (See 11-35679)
  • a polymer composed of a specific depsipeptide and polylactic acid has good biodegradability, and can improve flexibility while maintaining strength (see JP 2001-31762).
  • the moldability is good and it has the functionality corresponding to various utilization forms (see JP 2002-234934 A).
  • one of the inventors of the present invention discloses a method for synthesizing a depsipeptide and a synthetic product (see JP-A-2004-269462).
  • any of the above-mentioned Japanese Patent Laid-Open Nos. 7-188411, 11-35679, 2001-31762, 2002-234934, and 2 004-269462 Similarly, a biocompatible block copolymer having a hydrophobic segment consisting of an amino acid and hydroxycarboxylic acid and a hydrophilic segment consisting of a polyalkylene oxide, and a micelle, microparticle, There is no description regarding complex formation.
  • a ternary block copolymer has been reported as a biodegradable plastic comprising a block comprising an amino acid and a hydroxycarboxylic acid and a block comprising a polyalkylene glycol (see International Publication No. 2005/003214 Panflate). .
  • An object of the present invention is to provide a biocompatible block copolymer having affinity for a drug, which makes it possible to eliminate the above six causes that the drug cannot reach its site of action.
  • Another object of the present invention is to have an ester bond that is easily cleaved in vivo and an amide bond that is difficult to cleave, exhibit no antigenicity, and control the type, number, and sequence of amino acids and hydroxycarboxylic acids. It is an object of the present invention to provide a biocompatible block copolymer that can control the affinity with a drug.
  • Still another object of the present invention is to comprise the above-mentioned biocompatible block copolymer and a drug, and solubilize, disperse, stabilize, and release the drug and deliver the drug to a necessary site in the living body. It is to provide micelles, microparticles, or composites that make it possible.
  • Still another object of the present invention is to provide an advantageous process for producing the micelles, fine particles and composites.
  • the above objects and advantages of the present invention include, firstly, a hydrophobic segment consisting of an amino acid and hydroxycarboxylic acid and a hydrophilic segment consisting of polyalkyleneoxide and the hydrophilicity of the hydrophobic segment. This is achieved by a biocompatible block copolymer characterized in that the end not bound to the segment consists of amino acid units.
  • a micelle comprising the biocompatible block copolymer of the present invention and a drug.
  • microparticles or composites comprising the biocompatible block copolymer of the present invention and a drug.
  • the above objects and advantages of the present invention are fourthly achieved by a pharmaceutical composition containing the micelle, microparticle or complex of the present invention.
  • a biocompatible block copolymer having a hydrophobic segment composed of an amino acid and a hydroxycarboxylic acid, and a hydrophilic segment composed of a polyalkylene oxide is achieved by a method for producing a micelle or a complex containing a drug characterized by mixing the compound and the drug in water.
  • the above objects and advantages of the present invention include, finally, a biocompatible block copolymer having a hydrophobic segment consisting of an amino acid and hydroxycarboxylic acid and a hydrophilic segment consisting of a polyalkylene oxide, It is achieved by a method for producing micelles, microparticles or composites characterized in that a mixed solution comprising a drug and a solvent is prepared and the solvent is removed from the mixed solution.
  • a biocompatible block copolymer having a hydrophobic segment consisting of an amino acid and hydroxycarboxylic acid and a hydrophilic segment consisting of a polyalkylene oxide
  • biocompatible block copolymer of the present invention has a hydrophobic segment and a hydrophilic segment.
  • biocompatibility ⁇ means a property that is compatible with a living tissue and shows no damage to the living body after administration in vivo, for example, it is decomposed and metabolized in vivo or not decomposed.
  • biodegradable refers to a property that, after being administered into a living body, is decomposed and metabolized in a living tissue and does not show any damage to the living body. Okay, for example, the property of being decomposed and metabolized in the body and finally excreted outside the body.
  • the “hydrophobic segment” is a biodegradable polymer or a derivative thereof which is hardly soluble or insoluble in water, and is more hydrophilic than the hydrophilic segment which is the other component forming the block copolymer. Also refers to a high molecular polymer that is hydrophobic.
  • the term “hydrophilic segment” refers to a high molecular weight polymer that is soluble in water or is hydrophilic to the hydrophobic segment of the block copolymer even though it is sparingly soluble in water. It refers to its derivative.
  • “micelle” means a particle having an inner core portion and an outer shell portion having different compositions.
  • the term “fine particles” means an average particle size of 300 ⁇ m or less, no clear inner core and outer shell portion, and almost uniform dispersion of the drug in the block copolymer.
  • the term “complex” refers to a complex that does not have a clear inner core and outer shell and is formed by the interaction between a drug molecule or drug crystal and the present block copolymer.
  • ligand generally refers to any molecule that can specifically bind to a specific target molecule and form a binding complex, and is the leading moiety toward the target.
  • the biocompatible block copolymer of the present invention comprises an amino acid as a hydrophobic segment.
  • a biocompatible block composed of a biodegradable block composed of a hydroxycarboxylic acid and a polyalkylene oxide serving as a hydrophilic segment is a block copolymer in which a hydrophilic segment is covalently bonded to the end of a biodegradable hydrophobic segment. These segments may be bonded directly or via a spacer having a linking group.
  • a block copolymer for example, the following formula (1)
  • R 2 is a side chain of a natural amino acid or a derivative thereof;
  • R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group or
  • R 4 is a hydrogen atom or a methyl group;
  • m is an integer from 1 to 20;
  • p is an integer from 1 to 20 and Q is from 0 to 20
  • r is an integer of 2 to 870).
  • the hydrophobic segment of the block copolymer used in the present invention is a compound comprising an amino acid and a hydroxycarboxylic acid, as shown in the above formula (1).
  • the amino acid used is not particularly limited as long as it is biodegradable or biocompatible.
  • DL-amino acids, D_a-amino acids, synthetic amino acids, and derivatives in the side chains of these amino acids can also be used.
  • amino acids include glycine, alanine, norine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, serine, threonine, proline, hydroxyproline, cysteine, methionine, dalbutamate, aspartate, lysine, Arginine, histidine, hydroxylysine,
  • Examples include 4-hydroxyproline, homoproline, norvaline> norleucine, ⁇ -t-butydaricin, cyclohexylglycine, asparagine, glutamine, and j8-cyclohexylalanine.
  • glycine, alanine, norin, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, glutamic acid, aspartic acid, lysine and arginine are preferably used.
  • alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, glutamic acid, aspartic acid, lysine and arginine are particularly preferably used.
  • the hydroxycarboxylic acid used is not particularly limited as long as it is biodegradable or biocompatible, but not only hyhydroxycarboxylic acid but also other hydroxycarboxylic acids can be used. Specific examples include glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, hydroxyvaleric acid, hydroxycabronic acid and hydroxycapric acid. Of these, glycolic acid and lactic acid are particularly preferably used.
  • the hydrophobic segment of the block copolymer used in the depsipeptide and the present invention may be a depsipeptide compound composed of an ⁇ -amino acid and an ⁇ -hydroxycarboxylic acid.
  • the ⁇ -amino acid used is not particularly limited as long as it is biodegradable or biocompatible, but not only natural L-amino acid, but also DL- ⁇ -amino acid, D— ⁇ -amino acid, synthesis One amino acid can be used.
  • Specific examples of ⁇ -amino acids include amino acids among the amino acids described above and derivatives in the side chains thereof.
  • the ⁇ -hydroxycarboxylic acid used is not particularly limited as long as it is biodegradable or biocompatible, but glycolic acid and lactic acid, which are ⁇ -hydroxycarbonic acids among the hydroxycarboxylic acids described above, are used. It is particularly preferably used.
  • Depsipeptides have an amide bond and an ester bond in the molecule, and the amide bond part has a hydrogen atom, so an intermolecular hydrogen bond is formed to form a strong intermolecular bond, but the ester bond part has a hydrogen atom. Since it does not have, intermolecular hydrogen bond is formed It is relatively easy to be hydrolyzed. Therefore, depsipeptides with an ester bond in the amide bond chain are prone to degradation in vivo, and the degradation rate can be controlled by the type and number of amino acids, the type and number of hydroxycarboxylic acids, and their sequence. .
  • Polyamino acids often have a problem with their antigenicity, but they are said to exhibit little antigenicity in peptides with about 5 amino acids or less. It is possible to design the molecule so as not to show antigenicity in debupeptide.
  • Polydepeptidic peptides exhibit completely different physicochemical properties depending on the type of amino acid constituting the polydepeptidic acid, the length of the sequence, and the type of hydroxycarboxylic acid.
  • the teradepsipeptide sequence with three amino acids linked and one hydroxycarboxylic acid is completely different from the tridepsipeptide sequence with two amino acids and one hydroxycarboxylic acid. Stability and micelle formation ability.
  • polydebupeptides having various properties can be synthesized by changing the type of amino acid and the type of hydroxycarboxylic acid.
  • polydepeptidides having 3 to 5 amino acid sequences and 1 to 3 hydroxycarboxylic acids bonded thereto are preferred.
  • the number n of amino acids constituting the polyamino acid of the hydrophobic segment of the block copolymer represented by formula (1) is an integer of 1 to 20, preferably an integer of 1 to 10, more preferably It is an integer from 1 to 6.
  • the number q of amino acids constituting the polyamino acid on the hydrophilic segment binding side of the hydrophobic segment is an integer of 0 to 20, preferably an integer of 0 to 10, and more preferably an integer of 0 to 6.
  • the number m of oxy acids constituting the polyhydroxycarboxylic acid of the hydrophobic segment is an integer of 1 to 20, preferably an integer of 1 to 10, more preferably an integer of 1 to 5.
  • the repeating number p of the amino acid hydroxycarboxylic acid conjugate is an integer of 1 to 20, preferably an integer of 1 to 10, more preferably an integer of 1 to 5.
  • the number k of methylene group and substituted methylene group of hydroxycarboxylic acid is an integer of 1-6.
  • n, p or q is an integer of 2 to 20 a plurality of R 2 may be the same or different, and when m or p is an integer of 2 to 20 a plurality of R 3 are the same But different Furthermore, a plurality of R 4 s when r is 2 or more may be the same or different.
  • the end of the hydrophobic segment of the block copolymer represented by the formula (1) is a hydrogen atom, an alkyl group, a substituted alkyzole group or an amino group protecting group.
  • the amino-protecting group include t-butoxycarbonyl group (B o c—), benzyloxycarbonyl group (Z—), 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fm o c 1) and the like.
  • t_butoxycarbonyl group (B o c-) is preferably used.
  • R 2 represents a side chain of a natural amino acid or a derivatized side chain (hereinafter referred to as a derivative group), and each amino acid unit independently represents a side chain of a natural amino acid or one of its derivative groups.
  • the amino acid derivative having a derivative group include power of glutamic acid 5-derivative, aspartic acid 4 derivative, lysine ⁇ _derivative and the like.
  • Glutamic acid 5-derivative, aspartic acid 4 Derivatives include derivatives in which the carboxyl group at the end of the side chain is protected with a protecting group, alkyl ester compounds such as methyl ester and ethyl ester, ester compounds with drug hydroxyl groups, and drug amino groups.
  • lysine derivatives include derivatives in which the terminal amino group of the side chain of lysine is protected with a protecting group, amides with the carboxyl group of the drug, and conjugates with the drug via spacers. I can get lost.
  • glutamic acid 5-ethyl ester units, aspartic acid 4-ethyl ester units, and lysine units whose terminal amino groups are protected with benzyloxycarbonyl groups are preferably used.
  • R 3 represents a side chain of hydroxycarboxylic acid, and each hydroxycarboxylic acid independently represents a hydrogen atom, an alkyl group or a substituted alkyl group.
  • alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms or those substituted with substituents are preferred. Examples of such an alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, and an isopropyl group. Examples of the substituent include a methyl group, an ethyl group, and a propyl group. Can be mentioned.
  • the hydrophilic segment of the block copolymer used in the present invention is made of polyalkylene oxide, and more specifically, mention may be made of polyethylene glycol, polyethylene diol Z polypropylene glycol block copolymer, and polypropylene glycol. Can do. More preferred is polyethylene glycol.
  • the repeating number r of alkylene oxide is 2 to 870, preferably 3 to 570, more preferably 3 to 250.
  • R 4 is a hydrogen atom or a methyl group.
  • R 5 in the above formula (1) represents a hydrogen atom, an alkyl group, a substituted alkyl group, a ligand residue, a ligand residue having a linking group, or a formula Ri — [[one NHCH (R 2 ) CO-] n _ ⁇ — O [CH (R 3 )] k CO- ⁇ m- ) p- [One NHCH (R 2 ) CO—]. (Wherein R 2 , R 3 , n, k, m, p and Q have the same definitions as _h).
  • ligands include lectins, antibodies, antibody fragments (eg, Fab' fragments), lymphokines, site force-in, receptor proteins (eg, CD 4, CD 8, CD 44, CD 71, etc.), Nucleic acids, antigens, hormones, adhesion factors (eg VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, RGD, NGR, etc.), transferrin, folic acid, growth factors (eg EGF, bFGF, VEGF, etc.) and desired And the like that specifically bind to the target cells.
  • the block copolymer of the present invention can be produced, for example, as follows.
  • the amino acid N-hydroxysuccinimide ester having a protected amino group is reacted with the amino group of the terminal amino acid to obtain a protected dipeptide-linked polyalkylene oxide.
  • the amino group produced by removing the protecting group is reacted with an oligodepsipeptide N-hydroxysuccinimide ester whose terminal amino group is protected and the other terminal is composed of hydroxycarboxylic acid.
  • Halogen and halogenated thionyl are allowed to act on the hydroxycarboxylic acid to obtain a hydroxycarboxylic acid halide, which is reacted in the presence of an amino acid or an alkali polyamino acid to obtain a depsipeptide.
  • an amino acid has other functional groups in addition to the two functional groups, an amino group and a force lupoxyl group, it is preferable that the other functional group is bonded to a protecting group during the production of the polydepsipeptide.
  • this amino acid derivative can be closed by heating in the presence of an alkali to obtain a cyclic depsipeptide.
  • a catalyst such as stannous octylate, a cyclic depsipeptide and a polyalkylene oxide, a mono-substituted polyalkylene oxide, or a polyalkylene oxide in which one hydroxyl group is protected are reacted to form an amino acid.
  • a catalyst such as stannous octylate, a cyclic depsipeptide and a polyalkylene oxide, a mono-substituted polyalkylene oxide, or a polyalkylene oxide in which one hydroxyl group is protected are reacted to form an amino acid.
  • a block copolymer having a hydrophobic segment composed of hydroxycarboxylic acid and a hydrophilic segment composed of polyalkylene oxide can be obtained.
  • a hydrophobic segment comprising an amino acid and a hydroxycarboxylic acid can be synthesized by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-046 9 4 62 filed by one of the present inventors. . That is, the carboxyl group of an amino acid having a protected amino group and the hydroxy group of a hydroxycarboxylic acid having an unprotected carboxyl group. Didepsipeptides are synthesized by reacting droxyl groups with aminopyridine compounds as catalysts.
  • the carboxyl group of the obtained dedepeptide is used as an imide derivative, and the protected amino group of the didepsipeptide is deprotected, and the deprotected amino group of the resulting didepsipeptide and the protected amino group
  • An oligodepsipeptide is synthesized by reacting with a carboxyl group of an amino acid having an amino acid.
  • the reaction in which the protected amino acid or the protected oligodepeptide is bound to the polyalkylene oxide can be carried out in an appropriate solvent for dissolving them, such as chloroform, dichloromethane, tetrahydrofuran, acetonitrile, or ethyl acetate.
  • an appropriate solvent for dissolving them such as chloroform, dichloromethane, tetrahydrofuran, acetonitrile, or ethyl acetate.
  • the product is dissolved in dichloromethane or chloroform, and this is washed with an aqueous solution of sodium hydrogen carbonate, an aqueous solution of citrate, etc. to remove by-products, and after distilling off the solvent, ether is removed.
  • pure product is precipitated and isolated.
  • the block copolymer of the present invention can be used not only to form micelles with drugs, fine particles containing drugs, and complexes with drugs, but also to produce vesicles such as ribosomes. it can. Depending on the purpose, the micelles, microparticles or complexes can be incorporated into liposomes.
  • the block copolymer of the present invention can be used together with a drug.
  • a drug any of biologically active compounds such as natural products, synthetic products, semi-synthetic products, fermentation products, biological materials, and genetic engineering products can be used. Synthetic bioactive compounds, peptides, proteins, hormones, vitamins, enzymes, coenzymes, fatty acids, lipids, genes, this Any of these derivatives may be used.
  • the drug may be water-insoluble, poorly water-soluble, fat-soluble, or water-soluble.
  • examples of such drugs include anti-inflammatory drugs (for example, non-steroidal drugs such as mefenamic acid, bufuexamac, and ferbinac, steroidal drugs such as dexamethasone, prednisolone, and beclomethasone), and antipyretic drugs (for example, , Acetaminophen, alclofenac, bufuexamac, etc.), analgesics (eg, aminovirin, acetominophen, morphine, buprenorphy), anti-arthritis drugs * anti-rheumatic drugs (eg, auranofin, azathioprine, methotrexa) ), Anti-gout drugs (eg, aloprino, probenecid, sulfinpyrazone), cardiotonics (eg, oxipheedrin, theopromine), anti-anginal agents (eg, alpren
  • the drug may be either hydrophilic or hydrophobic.
  • the block copolymer of the present invention can form micelles. Micelles have a hydrophobic segment in the inner core of the micelle and a hydrophilic segment in the outer shell of the micelle. May be present in the inner core of micelles, hydrophobic segments may be present in the outer shell of micelles, and both segments may be present randomly in the vehicle and may not have a domain structure. When the inner micelle core consists of hydrophobic segments, it is preferable to select a hydrophobic drug, and when the inner micelle core consists of hydrophilic segments, it is preferable to select a hydrophilic drug. For the drug, either a hydrophilic or hydrophobic drug can be selected.
  • hydrophobic drugs examples include non-steroidal anti-inflammatory drugs (eg, indomethacin, naproxen), steroidal anti-inflammatory drugs (eg, dexamethasone, dexamethasone valerate, dexamethasone palmitate, triamcinolone, triamcinolone acetonide , Parazozone acetate, haloprezone acetate, hydrocortisone, flucortisone acetate, prednisolone butyl acetate, prednisolone acetate valerate, prednisolone acetate, betamethasone methazone valerate, antitumor drugs (for example, paclitaxel, Camptothecin, epotosid, vinblastine, fluouracil, methotrexate, tegafur, tegafur uracil, toggleomycin / C, sizplatin, force lupocon, dacarbazine, mercaptop Phosphorus
  • a water-soluble polypeptide As a hydrophilic drug, for example, a water-soluble polypeptide is used.
  • water-soluble polypeptides include cyto force-in, hematopoietic factors, various growth factors, and enzymes.
  • site power-in is preferable, for example, lymphokine (for example, Yinyu Ferron and Interferon) 8, Interferon, Interleukin (IL 1-2 to IL-12), mono force-in (Inter 1). Leukin 1 and tumor necrosis factor (TNF)).
  • drugs include luteinizing hormone-releasing hormone and derivatives or analogs, insulin and derivatives or analogs, somatosutin and derivatives or analogs, growth hormone, growth hormone-releasing hormone, prolactin, Ellis mouth boyetin, adrenal gland Cortical hormones and derivatives or analogs, melanocyte stimulating hormone, thyroid hormone releasing hormone and derivatives or analogs, thyroid stimulating hormone, luteinizing hormone, follicle stimulating hormone, vasopressin and derivatives, oxytocin, calcitonin and derivatives or analogs, Glucagon, gastrin, secretin, pancreosymine, cholecystokinin, angiotensin, human placental ketogen, human chorionic gonadotropin, enkephalin and derivatives Or analogs, endorphins, chitotorphins, tuftsin, thymopoietin, thymosin, thymothymline, thymic factor, blood th
  • the drug used in the present invention may be in a pharmacologically acceptable form as well as itself.
  • a basic group such as an amino group, an inorganic acid (for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, boric acid, etc.) or an organic acid (for example, carbonic acid, bicarbonate, succinic acid, Salts with acetic acid, propionic acid, fumaric acid, trifluoroacetic acid, etc.).
  • the drug is a carboxyl group or the like
  • an inorganic base for example, an alkali metal such as sodium or potassium or an alkaline earth metal such as calcium or magnesum
  • an organic base for example, an organic amine such as trytylamine, arginine
  • the drug may form a metal complex compound such as a copper complex or a zinc complex.
  • a drug-containing micelle containing the block copolymer of the present invention as a constituent, for example, a thin-film water stirring method, a solution-water dilution method, a dialysis method, or the like is used, and these are used alone or in combination.
  • block copolymers of the present invention at least one type of block copolymer having micelle-forming ability and a drug are dissolved in a solvent, and then placed in a container, and the solvent is removed to form a thin film. Water is added to this and stirred to form micelles.
  • the solvent used here is not particularly limited as long as it can dissolve the block copolymer and the drug.
  • tetrahydrofuran, dioxane, acetone, methyl ethyl ketone, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, Methanol, ethanol, benzene, toluene, dimethylacetamide, dimethylformamide, etc. are used. Either can be used alone or in combination.
  • additives can be added to the aqueous phase.
  • additives include pH adjusting agents (for example, phosphate buffer, carbonate buffer, acetate buffer, dilute hydrochloric acid, sodium hydroxide, etc.), anionic surfactants, nonionic surfactants, polyoxy Emulsifiers such as ethylene castor oil derivatives, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, lecithin, gelatin, hyaluronic acid, and sugars such as mannitol are used.
  • the preparation temperature is preferably about 0 to about 8, more preferably about 5 to about 50 ° C.
  • the residual solvent can be removed by applying an external shearing force or ultrasonic irradiation during stirring in water, or by evaporating the evaporator in accordance with a conventional method under reduced pressure conditions.
  • the device for applying the external shearing force include a turbine type agitator and a homogenizer.
  • At least one type of block copolymer having the ability to form micelles and a drug in the block copolymer of the present invention and a drug are dissolved in a solvent, and then added to water little by little with stirring, and the solvent is removed in water to form a polymer.
  • the solvent used here is not particularly limited as long as it is miscible with water. For example, 'methanol, ethanol, dimethylacetamide, dimethylformamide, dimethylsulfoxide, tetrahydrofuran, dioxane, acetone, and acetonitrile. Or a mixture of these and water is used. Solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • a combination of tetrahydrofuran, acetone and water is preferably used. Since the good solvent for the block copolymer naturally varies depending on the composition of the polymer, it is preferable to select a solvent according to the polymer used.
  • the additives in the aqueous phase described in the section of the thin film underwater stirring method may be similarly added.
  • the preparation temperature is preferably about 0 ° C to about 80 ° C, more preferably about 5 ° C to about 50 ° C.
  • the solvent can be removed by applying an external shearing force or ultrasonic irradiation at the time of diluting the solution in water, removing the solvent with an evaporator or the like according to a conventional method under reduced pressure conditions, or by aeration.
  • the device for applying an external shearing force include a turbine type agitator and a homogenizer.
  • At least one of the block copolymers having the ability to form micelles and a drug in the solvent of the present invention and a drug are dissolved in a solvent, then placed in a dialysis tube and dialyzed in water, and the solvent is removed to form micelles.
  • the solvent used here is not particularly limited as long as it can dissolve the block copolymer and is miscible with water.
  • methanol, ethanol, dimethylacetamide, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, tetrahydrofuran, dioxane, acetone, and acetonitrile are used. Any of these can be used alone or in combination of two or more.
  • the ratio of the block copolymer to the solvent is not particularly limited.
  • the dialysis membrane the block copolymer used An appropriate molecular weight fraction size may be selected depending on the molecular weight, and a cellulose membrane is often used, but is not limited thereto.
  • an additive may be added to the dialysis solution.
  • additives include pH adjusting agents (eg, phosphate buffer, carbonate buffer, acetate buffer, dilute hydrochloric acid, sodium hydroxide, etc.), anionic surfactants, nonionic surfactants, polyoxy Ethylene castor oil derivatives, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, lecithin, gelatin, hyaluronic acid and other emulsifiers, and saccharides such as mannitol.
  • the dialysis time is about 5 minutes to about 24 hours at a time, but the micelles are prepared by repeating the liquid exchange operation of the outer water phase one or more times.
  • the preparation temperature is about 0 to about 80 ° C, more preferably about 5 ° C to about 5 Ot.
  • the micelle prepared in this way can be obtained in a dialysis membrane from a transparent state to a slightly cloudy state.
  • the form of the micelle that can be formed by the block copolymer having a hydrophobic Z hydrophilic segment can be changed by the preparation method.
  • micelles are prepared in a large amount of aqueous solution after dissolving or dispersing the block copolymer in an organic solvent, it becomes an OZW type, with a hydrophobic segment as the inner core and a hydrophilic segment in the outer shell.
  • the block copolymer is dissolved or dispersed in an aqueous solution and then micelles are prepared in a large amount of organic solvent, it becomes WZO type, with the hydrophilic segment as the inner core and the hydrophobic segment as the outer shell. It becomes a distributed form.
  • core Z-shell micelles having a hydrophobic segment as an inner core and a hydrophilic segment as an outer shell.
  • the hydrophobic segments of the block copolymer aggregate and aggregate at a high density to form a core, and the hydrophilic segments extend outward from the particle surface.
  • the ends of the hydrophilic segment are protected or modified, the presence of partial aggregation of the hydrophilic segment is also considered.
  • These preparation methods can also be changed according to the purpose. For example, when a drug is encapsulated, it is determined by physical properties such as solubility and stability of the drug in water or an organic solvent.
  • the average particle size of the drug-containing micelles or aggregates obtained by the above method is preferably in the state dispersed in water, for example, I nm to: I, 100 nm, more preferably 5 nm to 50 0 nm, particularly preferably 5 nm to 3 0 0 n m.
  • the determinants of these particle sizes are the composition of the block copolymer and its preparation method.
  • the particle diameter can be changed according to the purpose of use, it is not limited to these particle diameters.
  • the particle diameter can be measured by a known method. For example, a light scattering measurement method or a microscopic observation is used.
  • freeze-drying or vacuum-drying can be performed in the state of being dispersed in water after the formation of drug-containing micelles and stored as a dry powder.
  • Additives can also be added for the purpose of inhibiting aggregation during the drying operation.
  • additives include mannitol, lactose, glucose, trehalose, starches, hyaluronic acid or alkali metal salts thereof, water-soluble polysaccharides, polyethylene glycol, glycine, fibrin, collagen and other proteins, sodium chloride sodium, Inorganic salts such as sodium hydrogen phosphate are used.
  • the amount of the additive added is not particularly limited as long as aggregation suppression is achieved when the micelles are redispersed.
  • the block copolymer of the present invention in which a ligand is bound to a hydrophilic segment has an ability to get in vivo.
  • the polymer micelle according to the present invention can be prepared under relatively mild conditions, and is suitable for maintaining the activity of a ligand and encapsulating an unstable drug.
  • the block copolymer of the present invention can be used for solubilization of a hydrophobic compound in water, as can be understood from the above performance.
  • polymeric micelles are usually a preparation with a hydrophobic segment as the core, it is preferable that the drug to be encapsulated is hydrophobic, but in the case of a compound having a hydrophobic part even if it is water-soluble, its hydrophobicity It is also possible to form micelles with the present block copolymer in part.
  • specific organs eg, kidney, liver, lung, knee, brain, etc.
  • diseased part / organ eg, cancer, inflammatory part, etc.
  • the block copolymer of the present invention can stably encapsulate these drugs in the inner core portion of a micelle composed of a hydrophobic segment.
  • the method for encapsulating a drug of the present invention comprises a polymer -Add to the solution to allow preparation of polymeric micelles with the drug and hydrophobic segments as the core and hydrophilic segments on the surface.
  • an appropriate solvent can be added to trap the drug efficiently.
  • a solvent such as chloroform to stabilize the hydrophobic environment in the block copolymer and to encapsulate the drug.
  • polymer micelles are prepared in advance using a block copolymer, and a drug dissolved in a solvent is added to the polymer micelle solution to allow the drug to penetrate into the core part of the polymer micelle.
  • a polymer micelle is prepared in advance using a block copolymer, and the drug is added to the polymer micelle solution and kneaded to allow the drug to penetrate into the core part of the polymer micelle.
  • the hydrophobic drug to be encapsulated include those described above.
  • the core hydrophilic segments preferably also 1 polymeric micelle hydrophobic segment shea El, which hydrophilic drug encapsulated within the core of the polymeric micelles, sustained release And drug stability.
  • the hydrophilic drug the same ones as described above are used.
  • an underwater drying method for example, an underwater drying method, an ultrasonic treatment method, a freeze drying method, or the like is used, and these are used alone or in combination.
  • At least one of the block copolymers having the ability to form fine particles and a drug in the solvent of the present invention and a drug are dissolved in a solvent, and then added to water little by little with stirring, and the solvent is removed or diffused in water. Prepare microparticles.
  • the solvent used here is not particularly limited as long as it can dissolve the block polymer and the drug.
  • methanol, ethanol, benzene, toluene, dimethylacetamide, dimethylformamide, dimethylsulfoxide, tetrahydrofuran, dioxane, acetone, acetonitrile, or a mixture of these with water is used. These can be used alone or in combination with two or more solvents.
  • the amount of water can be arbitrarily selected.
  • the preparation temperature is preferably about 0 to about 80 V, more preferably about 5 X: to about 50.
  • Examples of the device for applying the external shearing force include a turbine type agitator and a homogenizer.
  • block copolymers of the present invention at least one type of block copolymer capable of forming fine particles and a drug are dissolved in an appropriate solvent and dispersed in a large amount of water.
  • an appropriate solvent for example, in the range of 1 W to about 200 W, preferably 1 W to about 10 W, 1 second to about 24 hours, more preferably 1 minute Perform ultrasonic irradiation for about 5 hours.
  • the preparation temperature is in the range of about 0 ° C. to about 80 ° C., preferably about 5 to 50 °. Often done in combination with the above-mentioned underwater drying method.
  • the content of the block copolymer in the fine particles of the present invention is usually from 10 to 100% by weight, preferably from 30 to 100% by weight, based on the whole fine particles.
  • the content ratio of the drug in the microparticles of the present invention is determined by the therapeutically necessary amount> no particular limitation.
  • the fine particles of the present invention include, for example, a dispersant (surfactant such as polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60; polysaccharides such as carboxymethylcellulose, sodium alginate, sodium hyaluronate; Polyethylene glycol 400, etc.), preservatives (eg, methyl paraoxybenzoate, propyl parabenzoate), tonicity agents (eg, sodium chloride, mannitol, sorbitol, glucose), fats and oils (eg, sesame oil) , Corn oil, etc.), phospholipids (eg, lecithin, etc.), excipients (eg, lactose, corn starch, mannitol, cellulose, etc.), binders (eg, sucrose, gum arabic, methylcellulose, carboxymethylcellulose, dextrin) Etc.) It may be mixed with a disintegrating agent (for example, carboxymethylcellulose calcium, etc.).
  • a dispersant surfactant
  • a drug complex can be produced by adding a drug to an aqueous solution of the block copolymer and kneading. By kneading efficiently, a complex of nano-order drug crystals and the block copolymer can be formed, and the suspended state of the drug can be kept stable.
  • the micelles, microparticles or complexes containing the drug of the present invention are formulated into various dosage forms by adding various pharmaceutical additives, and injected or implanted (for example, intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, skin Intramucosal, indirect cavity administration, tissue administration, etc.), transmucosal agents (eg, oral mucosa, nasal, suppositories, vaginal, pulmonary, etc.), transdermal agents (eg, ointments) , Creams, gels, etc.), oral preparations (eg, tablets, capsules, granules, etc.).
  • various pharmaceutical additives for example, intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, skin Intramucosal, indirect cavity administration, tissue administration, etc.
  • transmucosal agents eg, oral mucosa, nasal, suppositories, vaginal, pulmonary, etc.
  • transdermal agents eg, ointments
  • micelles or microparticles containing the drug of the present invention are used as surfactants (for example, polysorbate, polyoxyethylene hydrogenated castor oil), dispersants (for example, carboxymethylcellulose, sodium alginate).
  • surfactants for example, polysorbate, polyoxyethylene hydrogenated castor oil
  • dispersants for example, carboxymethylcellulose, sodium alginate
  • Aqueous solutions and suspensions can also be made into lyophilized preparations by lyophilization.
  • the micelles or microparticles containing the drug of the present invention can be used as a safe medicine for mammals.
  • the dosage of micelles or microparticles containing the drug of the present invention varies depending on the type and content of the main drug, dosage form, administration route, target disease, target animal, etc., but it may be an effective drug amount.
  • the administration frequency is 1 to several times a day. Once a week, once every two weeks, once a month, or once every few months, depending on the type and content of the main drug, dosage form, route of administration, target disease, target animal, etc. You can select as appropriate. '
  • the block copolymer of the present invention can form a hydrophobic compound, micelles, fine particles, and composites.
  • hydrophobic compounds can be solubilized and can be administered intravenously. Accumulation at the diseased site is also possible with a ligand.
  • this block copolymer is biocompatible and can be expected to have sustained drug efficacy due to its sustained release. Improvement of oral absorbability can also be expected by micellization.
  • microparticles can be expected to release drugs over a long period of time as subcutaneous injections, and composites can be made into nanoparticulates of poorly absorbable drugs and can be expected to improve oral absorption.
  • the block copolymer of the present invention imparts various properties such as selectivity by changing the type and number of constituent amino acids, the type and number of hydroxycarboxylic acids, the sequence order, or the modifying group. Examples that can be-,
  • Polyethylene glycol having an average molecular weight of 4,00 0 (HO—PEG 4 0 0 0 —OH) 2 0 0 g (0 0 5 mol) was dissolved in 40 0 mL of acetonitrile.
  • the obtained didepsipeptide hydrochloride was dissolved in 40 OmL of THF, and 28 mL of pyridine was added with stirring. To this solution was added 121 g (0 37 mol) of Bo c—Leu-ON ! Su, and 5 mL of NMM (0 35 mol) was added with stirring. Stir overnight at room temperature. The solution was concentrated under reduced pressure, and the residue was dissolved in 50 OmL of ethyl acetate. This solution was treated as described above to give 1 15 g (88%) of Boc 1 Leu—A 1 a—Lac—OH.
  • the tridepeptidic peptide Boc group was removed and reacted with Boc-Leu-ONSu to obtain 127 g (85%) of Boc-LeuLeuA1a-Lac-OH.
  • This Boc-tetradepsipeptide was dissolved in 40 OmL of THF, and 34.5 g (0.3 mol) of N-hydroxysuccinimide (HOSu) was added. The solution was cooled to ⁇ 10, 55.4 g (0.27 mol) of dicyclohexyl carpositimide was added, and stirred at ⁇ 10 ° C. for 3 hours and at room temperature overnight.
  • Bo c— Leu— Phe— ⁇ — PEG 4000 — OH 40 g (9.2 mmol) was treated with 4 M dioxane hydrochloride to remove the Boc protecting group.
  • the obtained hydrochloride was dissolved in ACN-THF (1: 1), and 1 mL of NMM was added.
  • t-butoxycarbolulu L-sucrose isil- L-sicyl-isyl-L-alanyl-l-L-lactic acid-N-hydroxysuccinimide ester (B oc-L eu-L eu- A 1 a — L ac— ONS u) 8 1 g (13.9 mmol) was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • Boc— (Leu-LeuA la-La c) 4 of Example 4 Le u— Phe — O— PEG ⁇ oo— OH
  • B oc protecting group was removed by treatment with 4M-dioxane hydrochloride.
  • Boc- (Leu-Leu-A la-Lac) 5 Leu— Phe is reacted with B o c-Leu-Le uA 1 a—L ac— ⁇ NS u in the same operation and conditions as in Example 1.
  • — ⁇ — PEG 4000 — ⁇ H was obtained with a yield of 95%.
  • Polyethylene glycol L monophenylalaninate hydrochloride synthesized in Reference Example 1 (38.9 g, 0.01 mol) is dissolved in 30 mL of acetonitrile (ACN) -tetrahydrofuran (THF) 1 ⁇ 1 mixed solvent, and NMM 1.
  • ACN acetonitrile
  • THF tetrahydrofuran
  • NMM 1 acetonitrile
  • Add 15 mL (0 0105 mol) and add 4.3 g (0 015 mol) of 1-butoxycarbonyl-L-lanalanin-N-hydroxysuccinimide ester (B oc-A 1 a- ONS u) In addition, the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • the obtained hydrochloride was dissolved in ACN-THF (1: 1) and 1 mL of NMM was added.
  • NMM N-protected tetradepsipeptide active ester
  • t-Butoxycarbolulu L—Mouth isyl-L—Mouth isyl-L-alanyl-L-glycolic acid mono-N-hydroxysuccinimide ester Bo c- Leu— Leu— A 1 a-He a-ONS ⁇
  • Example 1 1 of Bo c- Leu- Le u-A l a-He aA 1 -P he -O _PEG 4. . .
  • the OH Boc protecting group was removed by treatment with 4 M-dioxane hydrochloride, and B oc- Leu- Leu- Ala- He a- ON Su was reacted with this by the same procedure as above.
  • — (L e uL e uA 1 a-He a) 2 -A 1 a — Ph e— ⁇ — PEG 4000 _ ⁇ H was obtained with a yield of 89%.
  • Boc-Le Example 13 u- Leu- A l a-Lac- (Leu-Le u- A l a-He a) 2 -A 1 a-Ph e- ⁇ - PEG 4. . .
  • Boc-Leu-Leu-A1a-Lac_ONSu is reacted in the same manner as above, , Boc— (Le u — Leu— A la— L ac) 2 — (L eu— L eu— A 1 a— Hea) 2 — A la — P he— O— PEG 4000 — OH is 92% Obtained at a rate.
  • Example 15 Example 15
  • the B oc protecting group of ⁇ H is removed by treatment with 4 M-Z dioxane, and B oc -L eL e uA 1 a—L ac— ON S u is reacted in the same manner as above.
  • ACN acetonitrile
  • THF tetrahydrofuran
  • the solution was concentrated under reduced pressure, the residue was dissolved in dichloromethane, and the solution was washed with 10% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, saturated aqueous citrate solution, and water, and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • the solution was concentrated under reduced pressure, and ether was added to the residue;
  • Boc-Phe-Leu-Phe-Lac-Phe-O-PEG 400 was dissolved in THF and recrystallized with ether. Yield 45 4 g (9 6%).
  • Boc-Phe-Leu-Phe-Lac-Phe—O_PEG 4000 —OH 47.3 g (10 mmol) was treated with 4 M hydrochloric acid / dioxane to remove the B oc protecting group.
  • the obtained hydrochloride was dissolved in ACN—THF (1: 1), and 1.15 mL of NMM was added.
  • the solution was concentrated under reduced pressure at 50, and 3 mL of water was added to the residue. The residue formed micelles and dissolved easily.
  • this NMR spectrum forms micelles consisting of Bo c—P he—L ac— (Ph e-Le u-Ph eL ac) 2 —P he—O—PEG 40 oo—OH and DMP. .
  • the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • To the residue add 50 mL of water and shake. After standing overnight, the resulting insoluble material was filtered through a 450 nm membrane fill. The weight of insoluble matter was 24 mg.
  • the filtrate is divided into two, the one 25 Omg (Sample 1), and PEG 4 of 125 mg (sample 2) on the other. . 0 was added and freeze-dried.
  • Boc— (Leu-Leu ⁇ Ala-La c) 5 Leu— P he— O— PEG 4000 -OH 100 mg and DMP 5 mg were prepared. Dialysis was performed using a dialysis cellulose tube having a pore diameter of about 5 nm and the released DMP was measured with an ultraviolet spectrophotometer. 2% was released after 24 hours and 4% was released after 48 hours.
  • Boc— (Le u-Leu-A la— La c) 5 — Le u-Phe-O— PE G 4000 -OH l O Omg and DMP 10 mg were prepared, and this was used as a permeated molecular weight of about 14, 000, dialyzed and with pore size of about 5 nm cellulose tube for dialysis, and the released DMP was measured by ultraviolet spectrophotometer. 24% was released after 24 hours.
  • Bo c- (Leu-Leu-A la-La c) 5 -L eu -P he -OP EG 4000 -OH A micelle solution consisting of 100 mg and dexamethasone 5 mg was prepared, and this was used as a permeated molecular weight of about 14,000. Dialysis was performed using a cellulose tube for dialysis having a pore diameter of about 5 nm, and the released DMP was measured with an ultraviolet spectrophotometer. 57% was released after 10 hours, and only 3% was released over the next 10 hours.
  • the affinity between the drug and the block copolymer of the present invention varies greatly from drug to drug, and the polymer structure of the hydrophobic segment in the micelle is adjusted to match the chemical properties of the drug. It was found that micelle formation can be controlled by constructing for each drug. It was also found that the release of the drug encapsulated in the micelle can be controlled by the structure of the drug and the block copolymer of the present invention and the amount of drug encapsulated.
  • dexamethasone palmitate 1 Omg Take dexamethasone palmitate 1 Omg in a mortar and mix it with Boc— (L eu— Leu— A la-L ac) 5 -A 1 a— Phe— ⁇ — PEG 4000 — OH 10 Omg in 15 mL of water.
  • Boc— (L eu— Leu— A la-L ac) 5 -A 1 a— Phe— ⁇ — PEG 4000 — OH 10 Omg in 15 mL of water.
  • dexamethasone palmitate crystals were uniformly dispersed in an extremely fine crystalline state, and this suspension was sufficiently stable at room temperature.
  • add dexamethasone palmitate 1 Omg to an agate mortar, add ImL of water to it, and add agate milk.
  • lipid microsphere injection solution of dexamethasone palmitate (Remethasone (registered trademark), manufactured by Mitsubishi Wellpharma Co., Ltd.), dexamethasone sodium phosphate injection solution (Decadron (registered trademark)) (Manufactured by Manyu Pharmaceutical Co., Ltd.)
  • dexamethasone palmitate Remethasone (registered trademark)
  • dexamethasone sodium phosphate injection solution Decadron (registered trademark)
  • Manufactured by Manyu Pharmaceutical Co., Ltd. the same volume of drug-free physiological saline was administered, and the foot volume was measured with the same time schedule.
  • drug-free saline the foot volume increased by 19.9 ⁇ 7.7%, and in Lime Yuzon, it increased by 15 4 3 5%.
  • Bo c— (Leu— Leu— A la— La c) — Leu— Phe— O— PE G 4000 -OH 6 mg and prostaglandin I 2 (PG I 2 ) 0. 12 mg in 10 OmL eggplant-shaped flask 3 OmL of acetonitrile and THF-ethanol Dissolved in (5: 5: 1). The solvent was distilled off from this solution under reduced pressure. Distilled water (3 OmL) was added to the obtained film to dissolve the film in water. The film was completely dissolved in water. The UV spectrum was then measured. Even after 3 days, the UV spectrum with an absorption maximum at 19 ⁇ nm did not change. In addition, 3 mg of PEG400 was added to this aqueous solution and lyophilized. The UV spectrum did not change even after the lyophilized product was stored at room temperature for 24 days.
  • Nocritaxel 2 mg and Boc— (Le u-Le u-Le ⁇ aL ac) 5 -L eu-Phe-O-PEG 4000 -OH 5 mg are dissolved in 10 mL of acetonitrile and the solvent is distilled off under reduced pressure. Left.
  • the transparent film remaining on the glass wall was dissolved in 3 OmL of water at 40. Although paclitaxel is insoluble in water, the film was completely soluble in water, and no insoluble matter was deposited, suggesting that it was incorporated into micelles.
  • the clear homogeneous solution was filtered through a membrane fill, and 25 mg of PEG4000 was added to the filtrate and lyophilized. Lyophilized samples were measured in D 2 0 and dimethyl sulfoxide 1 d 6 (DMS 0-d 6 ) by 50 OMhz proton NMR.
  • the spectrum measured in the D 2 0 solvent is 3.8 p pm with a peak derived from the methylene proton of polyethylene oxide and 5.0 Only two types of proton peaks from water present in the system were observed at P pm.
  • the spectrum in DMSO-d 6 of the same sample Bo c- (Le u- Le u- A la- La c) 5 L eu- P he- ⁇ one PEG 400. 1 All proton peaks from OH and paclitaxel were observed.
  • this NMR spectrum shows that micelles consisting of B oc— (L e uL e uA 1 aL ac) 5 —L e li-P he—O—PEG 4000 — ⁇ H and paclitaxel are formed. It can be said that it shows.
  • FCA Greenethyl omp leteadjuvant
  • FIA FIA
  • Sensitization was performed by administering FCA emulsion at the first dose and FIA emulsion at a dose of 2 SmlZkg subcutaneously in the back and foo tp ad in the second and third weeks.
  • the induction reaction was Bo c- (Leu- Leu-Ala- Lac) 5 — Leu— Phe— O— PEG 4000 -OH (dose 4 OmgZk g) as the test substance, and ovalbumin 0. 4 mg / kg), saline was used as a negative control. These substances were adjusted with physiological saline so as to have predetermined concentrations.
  • the dose was 1. OmlZkg, induced in the veins of the forelimbs or hind limbs and observed for 4 hours. Thereafter, the body weight was measured once a week for one month and the general condition was observed.
  • the number of animals is Bo c— (L eu— L eu— A la— L ac) 5 — L eu— Ph e— O— PEG 4000 — OH group: 4 animals, ovalbumin group: 3 animals, physiological saline group: Three animals were used.
  • Boc- (Leu-Leu-Ala-Lac) 5 —Leu—Phe—O—PEG 40 00 —OH showed no anaphylactic reaction. There was no particular abnormality in the general condition and body weight thereafter.
  • anaphylactic symptoms were observed in all individuals immediately after challenge.
  • Bo c— (Le u-Le uA la-Lac) 5 Le u— Ph e— ⁇ —PEG 40 .
  • Active systemic anaphylaxis (ASA) reaction test using OH guinea pigs was negative and found to be non-antigenic

Abstract

アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントならびにポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有しそして疎水性セグメントの親水性セグメントと結合していない末端がアミノ酸単位からなる生体適合性ブロック共重合体。

Description

明 細 書 生体適合性ブロック共重合体、 その用途および製造法 技術分野
本発明は、 アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメン卜と ポリアルキレンォキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック 共重合体、 この生体適合性ブロック共重合伴と薬物からなるミセル、 微粒子また は複合体ならびにそれらの用途、 これらを含む医薬組成物およびその製造法に関 する。 このミセル、 微粒子または複合体は、 薬物の可溶化、 分散化、 安定化、 徐 放化、，病巣部位への送達などを可能とする。 ' 背景技術 ，
薬物は生体内の薬物作用部位へ到達することによりその効果を発揮す ¾もので ある。薬物がその作用部位に到達できない原因は種々ある。例えば、薬 が、 （1 ) 体液に溶けにくいこと、 （2 )酵素、 p H、 その他の生理的条件下で不安定である こと、 （3 )内皮、 粘膜などの膜性バリア一を通過できないこと、 （4 )望ましくな い免疫反応を引き起こすこと、 （ 5 )血中から速やかに消失し排泄されること、 ( 6 )標的部位へのタ一ゲティング能力が欠如していることなどが挙げられる。 これらの原因が引き起こす結果として、例えば、（1 )注射液の調製が困難、 ( 2 ) タンパク性医薬の経口投与が困難、 （3 )癌組織や脳、 神経組織への薬物送達が不 十分、 （ 4 )親水性薬物の粘膜吸収が不十分、 （ 5 )疎水性薬物の生体利用率が不十 分、 （6 )サイト力インなどの早すぎる血中消失、 （7 )標的部位への移行性の欠如 などが問題点として挙げられる。
これらの問題点を解決するためのアブローチは多数提案されている。 例えば、 ( 1 ) 親水性高分子化合物とタンパク性薬物との結合体の形成、 （2 )能動輸送物 質と薬物との結合体の形成、 （3 )リボソームへの親水性薬物の封入、 （4 )ナノま たはマイクロメーターサイズの生分解性重合体微粒子への薬物の封入、 （ 5 )両親 媒性の高分子物質と薬物による高分子ミセル形成などが挙げられる。 しかし、 薬 物送達に関わる全ての問題に対する普遍的解決策はいまだ見出されていない。 生分解性重合体として、 主鎖がアミド結合で連結したポリアミノ酸が挙げられ る。 しかしながら、 アミド結合は分子間あるいは分子内で強固に水素結合して安 定な高次構造を形成するため、 ポリアミドを生分解によって分解するためには、 この強固な水素結合で支持された高次構造を切断する必要があり、 不安定構造を 有するラセミ体や、 イオン化する極性側鎖を有する特殊なポリアミノ酸を除き、 完全には生分解されないことが明らかにされている （M Asano, M. Yoshida, I. Kaetsu, K Nakai, H. Yamanaka, H Yuasa, K Shida, K Suzuki, M Oya, Makromol Chem ， (1983) 84: 1761参照）。
生分解が可能な薬物送達用の高分子として、 水酸基とカルボキシル基を分子内 に有するヒドロキシカルボン酸がエステル縮合したポリォキシ酸が挙げられる。 ポリオキシ酸においては、 エステル結合が水素原子を有しないことから、 エステ ル結合において水素結合が生じることがなく、 ポリアミノ酸より容易に生分解さ れることが明らかにされている。 更に、 ヒドロキシカルボン酸と水から無触媒で ヒドロキシカルボン酸を重合する方法が開発され、 触媒の残渣の混入がないオリ ゴマーを重縮合したポリマーは、 薬物送達システムに使用した場合、 金属触媒を 使用して生成したものと比較して異物反応を誘発するおそれがなく、 また、 分子 間相互作用が弱いため成型も容易に行なえることから、 薬物送達システムの好ま しい材料とされている。 ポリオキシ酸は低分子量の試料ほど生分解速度が速く、 特に、 低分子量ポリ— D L—乳酸が好ましい薬物送達システムとして採用されて レ る (M Asano, H Fukuzaki, M. Yoshida, M. Kumakura, T Mashimo, H Yuasa, K Imai, H Yamanaka, K Suzuki, J Control led Release, (1989) 9 111、 M Asano, H Fukuzaki, M Yoshida, M. Kumakura, T Mashimo, H. Yuasa, K Imai, H Yamanaka, Biomaterial s, (1989) 10. 569 および真下透、 湯浅久子、 今井強 一、 山中英寿、 浅野雅春、 吉田勝、 熊倉稔著 「北関東医学 4 1」 1 9 9 1年 p 3 1 1参照)。
一方、 高分子ミセルは、 基本的に、 親水性セグメントを外殻とし、 疎水性セグ メントを内核として形成されるナノ粒子であり、 薬物の可溶化、 安定化、 持続放 出、 送達用担体として多数報告されている。 例えば、 ポリアルキレンォキシド等 の親水性セグメントおよびポリアルキルァスパルテート等の疎水性セグメントか らなるブロック共重合体の薬物担持用担体 （特開平 06— 107565号公報、 特開平 06— 206830号公報、 特開平 06— 206832号公報、 特開平 1 1 - 100331号公報、 特開 2001— 226294号公報、 特開 2003— 342167号公報、 特開 2004— 010479号公報、 特開 2004— 35 2972号公報、 特開 2005— 029480号公報、 特表 2005— 5018 31号公報および国際公開第 03Z000771号パンフレツト参照）、親水性ポ リアミノ酸等の親水性セグメントおよびボリラクチド等の疎水性セグメントから なるブロック共重合体の微粒子（特開平 11— 269097号公報参照)、ポリエ チレングリコ一ル等の親水性セグメン卜およびポリアミンゃポリ力ルポン酸等の 荷電性セグメントを含むブロック共重合体 （特開平 08— 188541号公報、 特開 2001— 146556号公報、 特開 2005— 008614号公報および 特表 2001 -525357号公報参照)、水難溶性薬物を含有する高分于ミセル の調製方法 （特開平 11一 335267号公報、 特開 2003— 012505号 公報、特開 2003-026566号公報、特開 2003— 026812号公報、 特開 2003— 3421, 68号公報、 特表 2003— 532688号公報および 国際公開第 02/026241号パンフレツト参照） が報告されている。
しかし、 上記のいずれの文献にもアミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からな る疎水性セグメントとポリアルキレンォキシドからなる親水性セグメントを有す る生体適合性ブロック共重合体並びにそれに基づくミセル形成、 微粒子形成、 複 合体形成に関する記載はない。
更に、 アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる生分解性プラスチックス として、 光学活性 3—置換一 2, 5—モルホリンジオンと環状ラクトンを重合せ しめたデプシペプチド共重合体や、 ポリデプシペプチドから製造される生物吸収 外科用装置等 （特開平 7— 188411号公報参照） や、 特定のポリアミドュニ ット、 特定のポリエステルュニットおよび特定のポリラクトンュニッ卜とを有す る生分解性ボリラクトンエステルアミド （特開平 11一 35679号公報参照） が報告されている。 また、 特定のデプシペプチドと、 ポリ乳酸とからなる重合体 力 良好な生分解性を有し、 強度を保持したまま、 柔軟性を向上させること （特 開 2001— 31762号公報参照） が可能であることや、 ラクチドと水酸基、 アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選択される少なくとも 1種の反応性 置換基を有する ε—力プロラクトンとを開環重合して得られる生分解性共重合 体が、 成形性が良好で各種の利用形態に応じた機能性を有すること （特開 200 2-234934号公報参照） 等が知られている。 また、 本発明者の一人がデブ シペプチドの合成法並びに合成物を開示している （特開 2004-269462 号公報参照)。
しかし、上記特開平 7— 18841 1号公報、特開平 1 1—35679号公報、 特開 2001— 31762号公報、 特開 2002— 234934号公報、 特開 2 004— 269462号公報のいずれの文献にも、 同様に、 アミノ酸およびヒド 口キシカルポン酸からなる疎水性セグメン卜とポリアルキレンォキシドからなる 親水性セグメン卜を有する生体適合性プロック共重合体並びにそれに基 'くミセ ル形 、 微粒子形成、， 複合体形成に関する記載はない。
更に、 アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなるブロックとポリアルキレ ングリコールからなるブロックとからなる生分解性プラスチックスとして、 三元 ブロック共重合体が報告されている （国際公開第 2005/003214号パン フレツト参照)。
しかし、 この国際公開第 2005Ζ0032 14号パンフレットにも、 ァミノ 酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンォキ シドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体並びにそれ に基づくミセル形成、 微粒子形成、 複合体形成に関する記載はない。 発明の開示
本発明の目的は、 薬物がその作用部位に到達できない上記 6つの原因を除去す ることを可能とする、 薬物に親和性を有する生体適合性プロック共重合体を提供 することにある。 本発明の他の目的は、 生体内で切断され易いエステル結合と切断され難いアミ ド結合とを有し、 抗原性を示さず、 そしてアミノ酸とヒドロキシカルボン酸の種 類と数と配列を制御することにより薬物との親和性を制御することのできる、 生 体適合性プロック共重合体を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、 上記生体適合性ブロック共重合体と薬物からなり そして薬物の可溶化、 分散化、 安定化、 徐放化ならびに生体内の必要な部位に薬 物を送達することを可能とする、 ミセル、 微粒子または複合体を提供することに ある。
本発明のさらに他の目的は、 上記ミセル、 微粒子および複合体の有利な製造法 を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
本発明によれば、 本発明の上記目的および利点は、 第 1に、 アミノ酸およびヒ ドロキシカルポン酸からなる疎水性セグメン卜ならびにポリアルキレンォキシド からなる親水性セグメントを有しそして疎水性セグメントの親水性セグメントと 結合していない末端がアミノ酸単位からなることを特徴とする生体適合性ブロッ ク共重合体によって達成される。
本発明によれば、 本 明の上記目的および利点は、 第 2に、 本発明の生体適合 性ブロック共重合体と薬物からなるミセルによって達成される。
本発明によれば、 本発明の上記目的および利点は、 第 3に， 本発明の生体適合 性プロック共重合体と薬物からなる微粒子または複合体（ミセルを除く）によつ て達成される。
本発明によれば、 本発明の上記目的および利点は、 第 4に、 本発明のミセル、 微粒子または複合体を含有する医薬組成物によつて達成される。
本発明によれば、 本発明の上記目的および利点は、 第 5に、 アミノ酸およびヒ ドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメント、 ポリアルキレンォキシドからな る親水性セグメントを有する生体適合性プロック共重合体と薬物を水中で混合す ることを特徴とする薬物を含有するミセルまたは複合体の製造法によつて達成さ れる。 本発明によれば、 本発明の上記目的および利点は、 最後に、 アミノ酸およびヒ ドロキシカルポン酸からなる疎水性セグメン卜およびポリアルキレンォキシドか らなる親水性セグメントを有する生体適合性プロック共重合体、 薬物および溶媒 からなる混合液を準備しそして該混合液から溶媒を除去することを特徴とするミ セル、 微粒子または複合体の製造法によって達成される。 発明を実施するための最良の形態
本発明の生体適合性プロック共重合伴は、 疎水性セグメントと親水性セグメン トを有する。 本明細書において 「生体適合性 ]· とは、 生体内に投与後、 生体組織 に適合して生体への障害などを示さない性質をいい、 例えば、 生体内で分解代謝 されまたは分解されなくても、 最終的には体外に排泄される性質をいう。 本明細 書において 「生体内分解性」 とは、 生体内に投与後、 生体組織において分解代謝 され生体への障害などを示さない性質をいい、 例えば、 生体内で分解代謝され、 最終的には体外に排泄される性質をいう。本明細書において「疎水性セグメント」 とは、 水に難溶または不溶である生体内分解性ポリマーまたはその誘導体であつ て、 本ブロック共重合体を形成するもう一方の成分である親水性セグメントより も疎水性である高分子重合体をいう。 本明細書において 「親水性セグメント」 と は、 水に可溶であるか、 あるいは水に難溶であっても本ブロック共重合体の疎水 性セグメントに対して親水的である高分子重合体またはその誘導体をいう。 本明 細書において 「ミセル」 とは、 組成が異なる内核部分と外殻部分を有する粒子を いう。 本明細書において 「微粒子」 とは、 平均粒子径が 3 0 0マイクロメートル 以下であって、 明確な内核および外殻部分を有さず、 本ブロック共重合体中に薬 物がほぼ均一に分散してなる粒子を言う。 本明細書において 「複合体」 とは、 明 確な内核および外殻部分を有さず、 薬物分子または薬物結晶と本ブロック共重合 体の相互作用により形成された複合体を言う。 本明細書において 「リガンド」 と は、 一般に特定の標的分子と特異的に結合し、 結合複合体を形成することができ る全ての分子を指し、 標的に向かうリーディング部分である。
本発明の生体適合性プロック共重合体は、 疎水性セグメントとしてのァミノ酸 およびヒドロキシカルボン酸からなる生体内分解性ブロックと、 親水性セグメン 卜としてのポリアルキレンォキシドからなる生体適合性ブロックからなる。 具体 的には、 例えば生体内分解性の疎水性セグメントの末端に親水性セグメントを共 有結合してなるブロック共重合体である。 これらのセグメントは直接または連結 基を有するスぺーサーを介して結合していても良い。 このようなブロック共重合 体としては、 例えば、 下記式 （1)
〔[一 NHCH(R2)CO_] n— {ー〇 [CH(R3)] kCO-} m—〕 p 一 [-NHCH (R2) CO-] q— O -， [一 CH (R4) CH2〇— ] r-R
5 · · · (!)
(式中、 は水素原子、 アルキル基、 置換されたアルキル基又はアミノ基の保 護基であり； R2は天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基であり； R3は水素原子、 アルキル基または置換されたアルキル基であり ； R4は水素原子またはメチル基 であり ； R5は水素原子、 アルキル基、 置換されたアルキル基、 リガンド残基、 連結 ¾を有するリガンド残基、 または Ri— C[-NHCH(R2)CO-ln- {_ 〇 [CH(Rj)'] kC,〇— } m―〕 p— [— NHCH(R2) CO— ] q— で表され る基であり ； nは 1〜 20の整数であり ； kは 1〜 6の整数であり ； mは 1〜 2 0の整数であり ； pは 1〜 20の整数であり ， Qは 0〜 20の整数であり ； rは 2〜870の整数である）で表される生体適合性ブロック共重合体が挙げられる。
疎水性セグメント
本発明に用いられるブロック共重合体の疎水性セグメントは、 上記式 （1) 中 に示されるように、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる化合物である。 用いられるアミノ酸としては、 生体内分解性または生体適合性である限り特に限 定はない。 天然の L— α—アミノ酸だけでなく、 DL—ひ—アミノ酸、 D_a— アミノ酸、 合成アミノ酸およびこれらアミノ酸の側鎖における誘導体も使用する ことができる。 アミノ酸の具体例としては、 グリシン、 ァラニン、 ノ リン、 ロイ シン、 イソロイシン、 フエ二ルァラニン、 チロシン、 トリプトファン、 セリン、 トレォニン、 プロリン、 ヒドロキシプロリン、 システィン、 メチォニン、 ダル夕 ミン酸、 ァスパラギン酸、 リジン、 アルギニン、 ヒスチジン、 ヒドロキシリジン、 4—ヒドロキシプロリン、 ホモプロリン、 ノルバリン>ノルロイシン、 α— t—ブ チルダリシン、 シクロへキシルグリシン、 ァスパラギン，グルタミンおよび j8—シ クロへキシルァラニンなどが挙げられる。 これらのうち、 グリシン、 ァラニン、 ノ リン、 ロイシン、 イソロイシン、 フエ二ルァラニン、 チロシン、 トリプトファ ン、 グルタミン酸、 ァスパラギン酸、 リジンおよびアルギニンが好ましく用いら れる。 さらに、 これらのうちァラニン、 バリン、 ロイシン、 イソロイシン、 フエ 二ルァラニン、 グルタミン酸、 ァスパラギン酸、 リジンおよびアルギニンが特に 好ましく用いられる。 用いられるヒドロキシカルボン酸としては、 生体内分解性 または生体適合性である限り特に限定はないが、 ひーヒドロキシカルボン酸だけ でなく、その他のヒドロキシカルボン酸を用いることもできる。具体例としては、 グリコール酸、 乳酸、 ヒドロキシ酪酸、 ヒドロキシ吉草酸、 ヒドロキシカブロン 酸およびヒドロキシカプリン酸などが挙げられる。 これらの ち、 グリコール酸 および乳酸が特に好ましく用いられる。
デプシぺプチド , 本 明に用 られるブロック共重合体の疎水性セグメントは、 α—アミノ酸お よび α—ヒドロキシカルボン酸からなるデブシぺプチド化合物であつてもよい。 用いられる α—アミノ酸としては、 生体内分解性または生体適合性である限り特 に限定はないが、 天然の L一ひ—アミノ酸だけでなく、 D L— α—アミノ酸、 D — α—アミノ酸、 合成ひ一アミノ酸を使用することができる。 α—アミノ酸の具 体例としては、 上記したアミノ酸のうちのひ—アミノ酸およびその側鎖における 誘導体が挙げられる。 用いられる α—ヒドロキシカルボン酸としては、 生体内分 解性または生体適合性である限り特に限定はないが、 上記したヒドロキシカルボ ン酸のうちの α—ヒドロキシカルポン酸であるグリコール酸および乳酸が特に好 ましく用いられる。
デプシペプチドの加水分解性および抗原性回避の可能性
デプシペプチドはその分子内にアミド結合とエステル結合を有し、 そのアミド 結合部分は水素原子を有するので分子間水素結合を形成して強固な分子間結合を 形成するが、 エステル結合部分は水素原子を有さないので分子間水素結合を形成 しえず比較的加水分解されやすい。 したがってアミド結合連鎖の中にエステル結 合があるデプシペプチドは生体内で分解されやすく、 その分解速度をアミノ酸の 種類と数、ヒドロキシカルボン酸の種類と数およびその配列順序により制御する ことが可能である。またポリアミノ酸はしばしばその抗原性が問題となるが、ァミ ノ酸数が約 5以下のペプチドにおいてはほとんど抗原性を示さないとされている。 デブシぺプチドにおいては抗原性を示さないように分子設計することが可能であ、 る。 ポリデブシぺプチドはそれを構成するァミノ酸の種類とシーケンスの長さ、 及びヒドロキシカルボン酸の種類によって全く異なる物理化学的特性を示す。 ァ ミノ酸が 3個連結しヒドロキシカルボン酸が 1個存在するテ卜ラデプシぺプチド シーケンスは、 アミノ酸 2個とヒドロキシカルボン酸 1個のトリデプシペプチド シーケンスとは全く異なる溶媒への溶解性、 二次構造の安定性、 ミセル形成能な どを示す。 更に、 アミノ酸の種類、 ヒドロキシカルボン酸の種類を変化させれば 様々な特性を有するポリデブシぺプチドを合成することができる。
とりわけ、 アミノ酸の配列を 3〜 5個とし次いでこれにヒドロキシカルボン酸 を 1〜 3個結合させたポリデブシぺプチドが好ましい。
アミノ酸の数、 ヒドロキシカルボン酸の数およびデプシの繰り返し数
式 （1 ) で表されるブロック共重合体の疎水性セグメントのポリアミノ酸を構 成するアミノ酸の数 nは 1〜2 0の整数であり、 好ましくは 1〜1 0の整数、 よ り好ましくは 1〜 6の整数である。 疎水性セグメントの親水性セグメント結合側 のポリアミノ酸を構成するアミノ酸の数 qは 0〜2 0の整数であり、 好ましくは 0〜1 0の整数、 より好ましくは 0〜6の整数である。 疎水性セグメントのポリ ヒドロキシカルボン酸を構成するォキシ酸の数 mは 1〜2 0の整数であり、 好ま しくは 1〜 1 0の整数、 より好ましくは 1〜5の整数である。 アミノ酸ヒドロキ シカルボン酸結合体の繰り返し数 pは 1〜 2 0の整数であり、 好ましくは 1〜 1 0の整数、 より好ましくは 1〜5の整数である。 ヒドロキシカルボン酸のメチレ ン基および置換メチレン基の数 kは 1〜 6の整数である。
なお、 n、 pまたは qが 2〜2 0の整数の場合の複数の R 2は同一でも異なつ ていてもよく、 mまたは pが 2〜2 0の整数の場合の複数の R 3は同一でも異な つていてもよく、 さらに rが 2以上の場合の複数の R 4も同一でも異なっていて もよい。
Rい R 9および ·
式 （1 ) で表されるブロック共重合体の疎水性セグメントの末端 は水素原 子，アルキル基、置換されたアルキゾレ基またはァミノ基の保護基である。アミノ基 の保護基としては、例えば t一ブトキシカルポニル基（B o c—）、 ベンジルォキ シカルボニル基（Z—）、 9一フルォレニルメチルォキシカルボニル基（Fm o c 一） などが挙げられる。 生体適合性である限り特に限定されないが、 とりわけ、 t _ブトキシカルボニル基 （B o c—） が好ましく用いられる。
R 2は天然アミノ酸の側鎖または誘導体化された側鎖 （以下、 誘導基と称する） を表し、 アミノ酸単位ごとに、 それぞれ独立に、 天然アミノ酸の側鎖またはその 誘導基の一つを示す。誘導基を有するァミノ酸誘導体としては、例えばグル夕ミン 酸 5—誘導体、ァスパラギン酸 4一誘導体、リジン ε _誘導体など力挙げられる。 グルタミン酸 5—誘導体、 ァスパラギン酸 4一誘導体としては側鎖の末 カルボ キシル基が保護基で保護された誘導体、 メチルエステル、 ェチルエステルなどの アルキルエステル体、 薬物の水酸基とのエステル体、 薬物のァミノ基とのアミド 体、 スぺーサ一介在による薬物との結合体が挙げられる。 また、 リジン誘導体と しては、 例えばリジンの側鎖の末端アミノ基が保護基で保護された誘導体、 薬物 のカルボキシル基とのアミド体、 スぺーサ一介在による薬物との結合体などが挙 げられる。 薬物との誘導体の他に、 グルタミン酸 5—ェチルエステル単位、 ァス パラギン酸 4一ェチルエステル単位、 末端アミノ基がベンジルォキシカルボニル 基で保護されたリジン単位が好ましく用いられる。
R 3はヒドロキシカルボン酸の側鎖を表し、 ヒドロキシカルボン酸ごとに、 そ れぞれ独立に、 水素原子、アルキル基または置換されたアルキル基を示す。また、 1^および R3のアルキル基および置換アルキル基としては炭素数 1〜 3のアルキ ル基またはそれが置換基で置換されたもの力好ましい。 かかるアルキル基として は、 例えば、 メチル基、 ェチル基、 プロピル基、 イソプロピル基、 を挙げること ができる。 また、 置換基としては、 例えば、 メチル基、 ェチル基、 プロピル基を 挙げることができる。
親水性セグメン卜および R±
本発明に用いられるプロック共重合体の親水性セグメントは、 ポリアルキレン ォキシドからなり、より具体的には、ポリエチレングリコール、ポリエチレンダリ コ一ル Zポリプロピレングリコールブロック共重合体、ポリプロピレングリコ一 ルを挙げることができる。より好ましくはポリエチレングリコールである。式（1) において、 アルキレンォキシドの繰り返し数 rは 2〜870であり、 好ましくは 3〜570であり、 より好ましくは 3〜250である。 R4は水素原子またはメ チル基である。 上記式（ 1)における R5は、 水素原子、アルキル基、 置換されたアルキル基、 リ ガンド残基、 連結基を有するリガンド残基または式 Ri— 〔[一 NHCH(R2) CO-] n_ {— O [CH(R3)] kCO-} m -) p - [一 NHCH(R2)CO— ] 。一 で表される基である （ここで R2、 R3、 n、 k、 m、 pおよび Qの定 義は _h記と同じである） を表す。 ' リガンドとしては、例えばレクチン，抗体、抗体フラグメント（例えば、 Fab' フラグメントなど）、 リ ホカイン、 サイト力イン、 レセプ夕一タンパク質 （例え ば、 CD 4、 CD 8、 CD 44, CD 71など）、 核酸、 抗原、 ホルモン、 接着因 子（例えば、 VCAM— 1、 I CAM— 1、 PECAM— 1、 RGD、 NGR な ど）、 トランスフェリン、 葉酸、 増殖因子 （例えば、 EGF、 bFGF、 VEGF など)および所望の標的細胞と特異的に結合するものなどを挙げることができる。 本発明のブロック共重合体は、 例えば、 以下のようにして製造することができ る。
( 1 ) 親水性セグメントであるポリアルキレンォキシドの両末端ヒドロキシル 基に、 保護されたアミノ基を有するアミノ酸 N—ヒドロキシコハク酸イミドエス テルを、 ジメチルァミノピリジンを触媒として反応させることにより、 両末端に 保護されたアミノ基を有するアミノ酸がエステル結合したポリアルキレンォキシ ドが得られる。 この両末端にあるアミノ酸残基のァミノ保護基をジォキサン中塩 酸で処理して除去する。 この処理で、 保護基が除去され両末端がジアミソァシル 化されたポリアルキレンォキシドまたは両末端の内の一方のアミノ酸が脱離し、 一つのヒドロキシル基が再生したモノアミノアシル化ポリアルキレンォキシドが 得られる。
末端アミノ酸のァミノ基に、 保護されたアミノ基を有するアミノ酸 N—ヒドロ キシコハク酸イミドエステルを反応させて、 保護ジペプチド結合ポリアルキレン ォキシドを得る。 保護基をはずして生じたァミノ基に， 末端アミノ基が保護され 他末端がヒドロキシカルボン酸からなるオリゴデプシペプチド N—ヒドロキシコ ハク酸イミドエステルを反応させる。 このアミノ基保護オリゴデプシペプチドェ ステルの反応を繰り返すと， 任意のアミノ酸， ヒドロキシカルボン酸配列をもつ 卜からなるブロック共重合体が得られる。
( i Ί ) ヒドロキシカルボン酸にハロゲンおよびノヽロゲン化チォニルを作用さ せてヒドロキシカルボン酸のハロゲン化物を得、 これにアミノ酸またはポリアミ ノ酸 アルカリの存在下で反応させてデプシペプチドを得る。 なお、 アミノ酸が ァミノ基と力ルポキシル基の 2つの官能基以外に、 他の官能基を有する場合は、 ポリデプシペプチドの製造中、 他の官能基を保護基と結合させておくことが好ま しい。 次に、 このアミノ酸誘導体を、 アルカリの存在下、 加熱することにより閉 環させて、 環状デプシペプチドを得ることができる。 次いで、 ォクチル酸第一錫 のような触媒の存在下、 環状デプシペプチドとポリアルキレンォキシド、 モノ置 換ポリアルキレンォキシド、 あるいは一方のヒドロキシル基が保護されたポリア ルキレンォキシドとを反応させることにより、 アミノ酸およびヒドロキシカルボ ン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンォキシドからなる親水性セグメ ントを有するプロック共重合体を得ることができる。
また、 アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントは本発 明者の一人が出願した特開 2 0 0 4 - 2 6 9 4 6 2号公報に記載された方法によ つて合成することができる。 すなわち、 保護されたアミノ基を有するアミノ酸の カルボキシル基と、無保護のカルボキシル基を有するヒドロキシカルボン酸のヒ ドロキシル基とを、ァミノピリジン化合物を触媒として反応させ、ジデプシぺプチ ドを合成する。得られたジデプ ペプチドのカルボキシル基をイミド誘導体とし、 かつ、 ジデプシペプチドの保護されたァミノ基の脱保護を行い、 これらにより得 られたジデプシペプチドの脱保護されたァミノ基と、 保護されたアミノ基を有す るアミノ酸のカルボキシル基とを反応させることにより、 オリゴデプシペプチド が合成される。
ポリアルキレンォキシドに保護ァミノ酸あるいは保護ォリゴデプシぺプチドを 結合させる反応はこれらを溶解する適当な溶媒例えば、 クロ口ホルム、 ジクロロ メタン、 テトラヒドロフラン、 ァセトニトリル、 酢酸ェチル中で行うことができ る。 反応後は生成物をジクロロメタンあるいはクロ口ホルムに溶解し、 次いでこ れを炭酸水素ナトリゥム水溶液、 クェン酸水溶液などで洗浄することにより副生 成物を除去し、 溶媒を留去した後、 エーテルを加えて純粋な生成物を沈殿、 単離 する。 必要であれば、 本ブロック共重合体のテトラヒドロフラン、 ァセトニトリ ル、 酢酸ェチルなどの溶液にエーテルを加えて再沈殿させ、 精製する。 この再沈 殿法 よる精製は、 ポリデプシペプチドを疎水性セグメントとする本ブロック共 重合体に対して有効な方法である。 ポリぺプチドーポリアルキレンォキシドポリ マ一ではポリペプチドのアミド結合に基づく水素結合が分子内、 分子間および分 子一溶媒間で強く形成され、 再沈殿に適した溶媒一非溶媒の組み合わせを見いだ すことが困難である。
ミセルおよび微粒子
本発明のブロック共重合体は、薬物とのミセル形成、薬物を含有する微粒子、薬 物との複合体を製するだけでなく、 リボソームなどの小胞体を製することにも使 用することができる。 また、目的に応じ、 当該ミセル、 微粒子または複合体をリポ ソームに含有せしめることもできる。
本発明のブロック共重合体は薬物と一緒に用いることができる。 該薬物として は天然物、 合成物、 半合成物、 発酵産物、 生体由来物質、 遺伝子工学の産物のい ずれの生理活性化合物でも用いられる。 また、 合成生理活性化合物、 ペプチド、 タンパク質、 ホルモン、 ビタミン、 酵素、 補酵素、 脂肪酸、 脂質、 遺伝子、 これ らの誘導体などのいずれでも用いられる。
薬物は、 溶解性については、 水不溶性、 水難溶性、 脂溶性、 水溶性のいずれで あってもよい。 このような薬物としては、 例えば、 抗炎症薬 （例えば、 メフエナ ム酸、 ブフエキサマク、 フェルビナクなどの非ステロイド系薬物、 デキサメ夕ゾ ン、 プレドニゾロン、 ベクロメタゾンなどのステロイド系薬物など）、 解熱薬 （例 えば、ァセトァミノフェン、アルクロフエナク、ブフエキサマクなど）、鎮痛薬（例 えば、 アミノビリン、 ァセ夕ミノフェン、 モルヒネ、 ブプレノルフィ など）、 抗 関節炎薬 *抗リウマチ薬 （例えば、 オーラノフィン、 ァザチォプリン、 メトト レキサ一卜など）、 抗痛風薬 （例えば、 ァロプリノー 、 プロベネシド、 スルフィ ンピラゾンなど）、 強心薬 （例えば、 ォキシフエドリン、 テオプロミンなど）、 抗 狭心症薬 （例えば、 アルプレノロール、 ジルチアゼム、 イソソルビドジ二トレー ト、 二フエジピンなど）、 ベー夕遮断薬 （例えば、 塩酸プロブラノロ一ル、 ァテノ ロール カルベジロールなど）、 カルシウム拮抗薬 （例えば、 二フエジピン、 二力 ルジピン、 ジルチアゼムなど）、 抗不整脈薬 （例えば、 キこジン、 ベラパミル、 チ モロ一ルなど）、—利尿薬 （例えば、 フロセミド、 アルブチンなど）、 抗高血圧薬（例 えば、 チモロール、 カプトプリル、 二カルジピン、 プラゾシンなど）、 末梢循環障 害改善薬 （例えば、 プロスタグランジン類など）、 抗血栓薬 （例えば、 アルガトロ バン、ォザダレル、チクロビジンなど）、抗高脂血症薬（例えば、ス夕チン系薬物、 フイブラート系薬物 >プロビコールなど）、 抗血小板薬 （例えば、 プロス夕サイク リンなど）、 昇圧薬 （例えば、 ドパミン、 ノルェピネフリンなど）、 脳循環代謝改 善薬 （例えば、 塩酸チアプリド、 スルピリソなど）、 抗腫瘍薬 （例えば、 ドキソル ビシン、 ァクチノマイシン、 メトトレキサ一ト、 シ夕ラビン、 シスプラチン、 パ クリタキセル、 夕モキシフェンなど）、 免疫抑制薬 （例えば、 ァザチォプリン、 夕 クロリムス、 シクロフォスフアミドなど）、 抗アレルギー薬 （例えば、 ァゼラスチ ン、 クロモリン、 ペンチゲチドなど）、 抗ヒスタミン薬 （例えば、 クロルフエニラ ミン、 クレマスチン、 ジフェンヒドラミンなど）、 気管支拡張薬 （例えば、 アルブ テ口一ル、イソプロテレノール、臭化ィプラト口ピウムなど）、抗喘息薬（例えば、 ッロブテロール、 クレンブテロールなど）、 鎮咳薬 （例えば、 リン酸コディン、 デ キストロメトルファンなど）、 去痰薬 （例えば、' アンプロキソール、 カルボシステ インなど）、抗潰瘍薬（例えば、セトラキサート、 ラニチジン、 シメチジンなど）、 止瀉薬 （例えば、 ァセチルタンニン酸、 ジフエノキシンなど）、 制吐薬 （例えば、 ジフエ二ドール、 スコポラミンなど）、 抗糖尿病薬 （例えば、 ビグアニド系物質、 インスリン、 トルプ夕ミド、 クロルプロパミドなど）、 催眠薬 ·鎮静薬 （例えば、 ニトラゼパム、 フルラゼパム、 ァモバルビタールなど）、 抗不安薬 （例えば、 ジァ ゼパム、 ォキサゾラムなど）、 抗精神病薬 （例えば、 ハロペリドール、 ベルフエナ ジン、 クロルプロマジンなど）、 抗うつ薬 （例えば、 ジメ夕ザン、 イミブラミン、 スルピリドなど）、抗眩暈薬（例えば、ジメンヒドリナ1 "ト、塩酸ジフエ二ドール、 メシル酸べ夕ヒスチンなど）、 抗てんかん薬 （例えば、 カルバマゼピン、 フエノバ ルビタール、 5—ヒドロキシトリブトファンなど）、 筋弛緩薬 （例えば、 塩化ッポ クラリン、バクロフェン、メトカルバモールなど）、抗パーキンソン病薬（例えば、 アマン夕ジン、 カルビドパなど）、 自律神経系作用薬 （例えば、 ベタネコール、 ネ ォス グミンなど）、 抗生物質 （例えば、 アミノグリコシド系物質、 セファロスポ リン系物質、 マクロライド系物質など）、 抗菌薬 （例えば、 キノロン系物質、 スル フォナミド系物質、 スルホン系物質など）、 抗真菌薬 （例えば、 ァリルアミン系物 質、 ェコナゾールなどのィミダゾール系物質、 フルコナゾールなどの卜リァゾー ル系物質など）、 抗ウィルス薬 （例えば、 ァシクロビル、 シ夕ラビン、 アマン夕ジ ンなど）、 駆虫薬 （例えば、 ァミノピリン、 二クロザミド、 キナクリンなど）、 ホ ルモン薬 （例えば、 ソマトス夕チン、 ゴナドトロピン， L HR Hなど）、 抗骨粗鬆 症 ·骨代謝改善薬 （例えば、 ビタミン D、 カルシトニン、ビスフォスフォネートな ど）、 ビタミン薬 （例えば、 トコフエロール、ビタミン B 1 2など）、 止血薬 （例え ば、 トラネキサム酸など）、 酵素薬 （例えば、 プロナーゼ、 リゾチーム、 セラぺプ 夕ーゼなど）、ワクチン（例えば、インフルエンザワクチン、コレラワクチンなど）、 麻酔薬、 診断薬、 造影薬、 検査薬などが用いられる。
また、 薬物は親水性、 疎水性のいずれであってもよい。 本発明のブロック共重 合体はミセルを形成することができる。 ミセルは、 疎水性セグメントがミセル内 核に、 親水性セグメントがミセル外殻に存在する場合や、 逆にブロック共重合体 の親水性セグメントがミセル内核に、 疎水性セグメントがミセル外殻に存在する 場合があり、 さらにビヒクル内で両セグメントがランダムに存在して、 ドメイン 構造を持たない場合がある。 ミセル内核が疎水性セグメントからなる場合は疎水 的な薬物を選択し、 ミセル内核が親水性セグメントからなる場合は親水的な薬物 を選択することが好ましく、 微粒子内でランダムに各セグメントが存在する場合 には親水性あるいは疎水性のどちらの物性の薬物も選択することができる。 疎水性薬物としては、 例えば、 非ステロイド性抗炎症薬 （例えば、 インドメサ シン、 ナプロキセンなど）、 ステロイド性抗炎症薬 （例えば、 デキサメタゾン、 吉 草酸デキサメタゾン、 パルミチン酸デキサメタゾン、 トリアムシノロン、 トリァ ムシノロンァセトニド、 酢酸パラメタゾン、 酢酸ハロプレゾン、 ヒドロコルチゾ ン、 酢酸フルド口コルチゾン、 ブチル酢酸プレドニゾロン、 吉草酸酢酸プレドニ ゾロン、プレドニゾロン、ベタメ夕ゾン、吉草酸べ夕メタゾンなど）、抗腫瘍薬（例 えば、 パクリ夕キセル、 カンプトテシン、 ェポトシド、 ビンブラスチン、 フルォ ロウラシル、 メトトレキサ一ト、 テガフール、 テガフール ·ゥラシル、 ヌィトマ イシ / C、 シズプラチン、 力ルポコン、 ダカルバジン、 メルカプトプリン、 ァク チノマイシン D、塩酸ドキソルビシン、 クェン酸夕モキシフェンなど）、解熱鎮痛 薬 （例えば、 イブプロフェン、 ブプレノルフィンなど）、 抗喘息薬 （例えば、 ァゼ ラスチン、 ケトチフェン、 プロピオン酸フルチカゾンなど）、 抗うつ薬 （例えば、 ォキシペルチン、 ネフォパムなど）、 抗痛風薬 （例えば、 ァロプリノール、 コルヒ チン、 スルフィンビラゾン、 プロべネシドなど）、 中枢神経系薬 （例えば、 ァニラ セ夕ムなど）、 抗高血圧薬 （例えば、 カプトプリル、 ェナラプリル、 塩酸マニジピ ンなど）、 抗血小板薬 （例えば、 プロスタグランジン類など）、 抗高脂血症薬 （例 えば、 クロフイブラート、 ガンマ一オリザノールなど）、 気管支拡張薬 （例えば、 テオフィリン、 塩酸メトキシフェナミン、塩酸ッロブテロールなど）、 抗アレルギ —薬 （例えば、 ェメダスチン、 トラニラスト、 テルフエナジンなど）、 抗尿失禁薬 (例えばカブロン酸ゲストノロンなど）、 抗ウィルス薬（例えば、 ァシクロビル、 リバビリンなど）、 蛍光色素 （例えば、 ピレン系蛍光色素、 ローダミン系蛍光色 素など） などが用いられる。 親水性薬物としては、 例えば、 水溶性ポリペプチドなどが用いられる。 このよ うな水溶性ポリペプチドとしては、 例えば、 サイト力イン、 造血因子、 各種増殖 因子、 酵素などが挙げられる。 なかでも、 サイト力インが好ましく、 例えば、 リ ンホカイン （例えば、 イン夕一フエロンひ、 インターフェロン) 8、 インターフエ ロンァ、 インターロイキン （I L一 2〜I L一 12) など）、 モノ力イン （インタ 一ロイキン一 1、 腫瘍壊死因子 （TNF) など） が挙げられる。
その他、 薬物としては、 黄体形成ホルモン放出ホルモンおよび誘導体または類 縁体、 インスリンおよび誘導体または類縁体、 ソマトス夕チンおよび誘導体また は類縁体、 成長ホルモン、 成長ホルモン放出ホルモン、 プロラクチン、 エリス口 ボイエチン、 副腎皮質ホルモンおよび誘導体または類縁体、 メラノサイト刺激ホ ルモン、 甲状腺ホルモン放出ホルモンおよび誘導体または類縁体、 甲状腺刺激ホ ルモン、 黄体形成ホルモン、 卵胞刺激ホルモン、 バソプレシンおよび誘導体、 ォ キシトシン、カルシトニンおよび誘導体または類縁体、グルカゴン、ガストリン、 セクレチン、 パンクレオザィミン、 コレシストキニン、 アンジォテンシン、 ヒト 胎盤 クトーゲン、 ヒト絨毛性ゴナドトロピン、 エンケフアリンおよび誘導体ま たは類縁体、 エンドルフィン、 キヨウトルフィン、 タフトシン、 サイモポイエチ ン、 サイモシン、 サイモチムリン、 胸腺液性因子、 血中胸腺因子およびその誘導 体、 コロニー誘導因子（例えば、 C S F、 GC S F、 GMC S F、 MC S Fなど）、 モチリン、 ディノルフィン、 ボンべシン、 ニューロテンシン、 セルレイン、 ブラ ジキニン、 心房性ナトリウム排泄増加因子、 神経成長因子、 細胞増殖因子 （例え ば、 EGF、 TGF— ; S、 PDGF、 酸性 FGF、 塩基性 FGFなど）、 神経栄養 因子 （例えば、 NT_3、 NT— 4、 CNTF、 GDNF、 BDNFなど）、 ェン ドセリン拮抗作用を有するぺプチド類およびその類縁体などが挙げられる。 本発明で用いられる薬物は、 それ自身であることはもちろんのこと、 薬理学的 に許容される形態にあってもよい。 このような塩としては、 該薬物がアミノ基等 の塩基性基を有する場合、 無機酸 （例えば、 塩酸、 硫酸、 硝酸、 ホウ酸など） や 有機酸 （例えば、 炭酸、 重炭酸、 コハク酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマール酸、 トリフルォロ酢酸など） などとの塩が挙げられる。 該薬物がカルボキシル基等の 酸性基を有する場合、 無機塩基 （例えば、 ナトリウム、 カリウム等のアルカリ金 属あるいはカルシウム、マグネ.シゥム等のアル力リ土類金属など）や有機塩基（例 えば、 トリェチルァミン等の有機アミン類、 アルギニン等の塩基性アミノ酸類な ど） などとの塩が挙げられる。 また、 薬物は金属錯体化合物例えば、 銅錯体、 亜 鉛錯体を形成していてもよい。
本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物含有ミセルを調製するには、 例えば、 薄膜水中攪拌法、 溶液水中希釈法、 透析法などが用いられ、 これらは単 独あるいは組み合わせて用いられる。
( 1 ) 薄膜水中攪拌法 .
本発明のプロック共重合体のうちミセル形成能を有するプロック共重合体の少 なくとも 1種類と薬物を溶媒に溶解後、 容器に入れ、 溶媒を除去して薄膜を形成 させる。これに水を加え、攪拌しミセルを形成させる。ここで用いる溶媒としては、 該ブ口'ック共重合体と薬物を溶解できるものであれば特に限定するものではない 、例えば、 テトラヒドロフラン、 ジォキサン、 アセトン、 メチルェチルケトン、 ァセトニトリル、 ジメチルスルホキシド、 メタノール、 エタノール、 ベンゼン、 トルエン、 ジメチルァセトアミド、 ジメチルホルムアミドなどが用いられる。 い ずれも単独だけでなく、，組み合わせて使用することもできる。 また、 その他の溶 煤であっても該ブロック共重合体が析出しない程度に溶媒中に添加することもで きる。 水相には添加剤を添加してもよい。 添加剤としては、 例えば、 p H調整剤 (例えば、 リン酸緩衝剤、 炭酸緩衝剤、 酢酸緩衝剤、 希塩酸、 水酸化ナトリウム など)、 ァニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、 ポリオキシエチレンヒマ シ油誘導体、 ポリエチレングリコール、 ポリビニルピロリドン、 ポリビニルアル コール、 カルポキシメチルセルロース、 レシチン、 ゼラチン、 ヒアルロン酸等の 乳化剤やマンニトールなどの糖類力 ^用いられる。 調製温度は約 0 〜約 8 が 好ましく、 さらに好ましくは約 5 〜約 5 0 °Cである。 さらに、 水中攪拌時に外 的剪断力や超音波照射を付与することや減圧条件下で常法に従ってエバポレー夕 一などで残存溶媒を除去することもできる。外的剪断力を付与する装置としては、 例えば、 タービン型攪拌機や、 ホモジナイザーなどが挙げられる。 ( 2 ) 溶液水中希釈法
本発明のプロック共重合体のうちミセル形成能を有するプロック共重合体の少 なくとも 1種類と薬物を溶媒に溶解後、 攪拌下少量ずつ水に添加し、 溶媒を水中 に除去して高分子ミセルを調製する。 ここで用いる溶媒としては、 水に混和でき るものであれば特に限定するものではないが、例えば、'メタノール、エタノール、 ジメチルァセトアミド、 ジメチルホルムアミド、 ジメチルスルホキシド、 テトラ ヒドロフラン、 ジォキサン、 アセトン、 ァセトニトリル、 あるいはこれらと水の 混液などが用いられる。 溶媒は単独であるいは 2種以上組み合わせて使用するこ とができる。 なかでもテトラヒドロフランとアセトンと水の組み合わせが好まし く用いられる。 該ブロック共重合体にとっての良溶媒とはポリマーの組成により 当然変化するものであるため、 使用するポリマーに応じて溶媒の選択を行うのが 好ましい。 水相には上記薄膜水中攪拌法の項で記載した水相における添加剤を同 様に添加してもよい。 調製温度は約 0 °C〜約 8 0 °Cが好ましく、 さらに好ましく は約 5 °C〜約 5 0 °Cである。 さらに、 溶液水中希釈時に外的剪断力や超音波照射 を付 することや減圧条件下で常法に従ってエバポレーターなどで溶媒を除去す ることや通気法によって溶媒を除去することもできる。 外的剪断力を付与する装 置としては、 例えば、 タービン型攪拌機や、 ホモジナイザーなどが挙げられる。
( 3 ) 透析法
本発明のプロック共重合体のうちミセル形成能を有するプロック共重合体の少 なくとも 1種類と薬物を溶媒に溶解後、 透析チューブに入れ水中で透析し、 溶媒 を除去してミセルを形成させる。 ここで用いる溶媒としては、 該ブロック共重合 体を溶解でき、水に混和できるものであれば特に限定するものではない。例えば、 メタノール、 エタノール、 ジメチルァセ卜アミド、 ジメチルホルムアミド、 ジメ チルスルホキシド、 テトラヒドロフラン、 ジォキサン、 アセトン、 ァセトニトリ ルなどが用いられる。 いずれも単独だけでなく、 2種以上組み合わせて使用する こともできる。 また、 その他の溶媒も該ブロック共重合体および薬物を析出しな レ ^程度に溶媒中に添加することもできる。 プロック共重合体と溶媒の比率は特に 限定されるものではない。 また、 透析膜としては、 用いるブロック共重合体の分 子量により適切な分子量分画サイズを選択すればよく、 セルロース膜などを用い ることが多いが、 これに限定されるものではない。 また、 透析溶液には添加剤を 添加してもよい。添加剤としては、例えば、 p H調整剤（例えば、 リン酸緩衝剤、 炭酸緩衝剤、 酢酸緩衝剤、 希塩酸、 水酸化ナトリウムなど)、 ァニオン性界面活性 剤、 非イオン性界面活性剤、 ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、 ポリエチレン グリコール、 ポリビニルピロリドン、 ポリビニルアルコール、 カルポキシメチル セルロース、 レシチン、 ゼラチン、 ヒアルロン酸等の乳化剤やマンニ 1 ^一ルなど の糖類が用いられる。 透析時間は、 通 1回約 5分〜約 2 4時間であるが、 外水 相の液交換操作を 1回以上繰り返すことでミセルを調製する。 調製温度は約 0で 〜約 8 0 °Cが好ましく、 さらに好ましくは約 5 °C〜約 5 O tである。 これによつ て調製できたミセルは透析膜中で透明からやや白濁した状態で得ることができる。 本発明において、 疎水性 Z親水性セグメントを有するプロック共重合体が形成 しうる'ミセルの形態は、 調製方法により変えることが可能である。 ブロック共重 合体を有機溶媒に溶解または分散後、多量の水溶液中でミセルを調製した場合は、 O ZW型となり疎水性セグメントを内核にしてそして親水性セグメントを外殻に 配した形態となる。 また、 逆にブロック共重合体を水溶液中で溶解または分散し た後、 多量の有機溶媒内でミセルを調製した場合、 WZO型となり親水性セグメ ン卜を内核にして疎水性セグメントを外殻に配した形態となる。通常は、例えば、 疎水性セグメントを内核として親水性セグメントを外殻とするコァ Zシェル型ミ セルである。 その場合ブロック共重合体の疎水性セグメントが集合して高密度に 凝集してコアを形成し、 親水性セグメントは粒子表面から外に向いて延びている と推察される。 また、 親水性セグメントの末端を保護または修飾した場合には、 親水性セグメントの部分的凝集の存在も考えられる。 これらの調製方法も目的に 応じて変えることができる。 例えば、 薬物を封入する場合、 その薬物の水あるい は有機溶媒への溶解度や安定性などの物性によって決められる。
上記方法によって得られる薬物含有ミセルまたはその集合体の平均粒子径は、 水中で分散した状態で、 例えば I n m〜： I , 0 0 0 n mであること力好ましく、 さらに好ましくは 5 nm〜5 0 0 n mであり、 特に好ましくは 5 nm〜3 0 0 n mである。 これら粒子径の決定要因は、 ブロック共重合体の組成とその調製方法 にある。 また、 粒子径は使用目的に応じて変えられるため、 これらの粒子径に限 定されない。 粒子径は公知の方法で測定することができるが、 例えば、 光散乱測 定法や顕微鏡観察などが用いられる。
上記いずれの調製方法においても薬物含有ミセル形成後に水に分散した状態で 凍結乾燥または真空乾燥を行い、 乾燥粉末として保存できる。 乾燥操作中の凝集 抑制を目的として添加剤を添加することもできる。 添加剤としては、 例えば、 マ ンニトール、 ラクトース、 ブドウ糖、 トレハロース、 デンプン類、 ヒアルロン酸 あるいはこれのアルカリ金属塩、 水溶性多糖、 ポリエチレングリコール、 グリシ ン、 フイブリン、 コラーゲン等の蛋白質、 塩ィ匕ナトリウム、 リン酸水素ナトリウ ム等の無機塩類などが用いられる。 添加剤の添加量は、 ミセルを再分散した時に 凝集抑制が達成される範囲であれば、 特に制限されない。
親水性セグメントにリガンドを結合させた本発明のプロック共重合体は、 生体 内での夕ーゲティング能を有する。 本発明に基づく高分子ミセルは比較的穏やか な条件で調製することができるためリガンドの活性維持、 不安定性な薬物の封入 に適している。 また疎水性セグメン卜と親水性セグメン卜の分子量を適切に変え ることにより粒子径の調整が可能となるので、 粒子径を調製して薬物を封入した 製剤では血中滞留性を調節することも可能である。 また、 本発明のプロック共重 合体は、 上記性能からも理解されるように、 疎水性化合物の水への可溶化にも利 用できる。
高分子ミセルは、 通常疎水性セグメントを核とする製剤であるため、 封入する 薬物は疎水性であるのが好ましいが、 水溶性であっても疎水性部分を持つ化合物 にあってはその疎水性部分で本プロック共重合体とミセルを形成することも可能 である。 また、 特定臓器 （例えば、 腎臓、 肝臓、 肺、 膝臓、 脳など） または疾患 部位 ·臓器 （例えば、癌、 炎症部位など） に指向することにより、 薬効を増強でき るものや、 血中滞留性を延長することで薬効を増強できるものが好ましい。 本発明のプロック共重合体は疎水性セグメントからなるミセルの内核部分に安 定にこれらの薬物を封入することができる。 本発明の薬物の封入方法は、 ポリマ —溶解液中に添加し、 薬物と疎水性セグメントとを核にし、 親水性セグメントを 表面に配した高分子ミセルの調製を可能にする。 この際、 薬物を効率良くトラッ プするために、 適切な溶媒を添加することができる。 例えば、 クロ口ホルムゃジ クロロメタンなどの溶媒を添加してブロック共重合体中の疎水的環境を安定にし、 薬物を封入する方法力 ί考えられる。 また、 ブロック共重合体を用いて予め高分子 ミセルを調製しておき、 後に溶媒に溶解した薬物を高分子ミセル溶液に添加して 薬物を高分子ミセルのコア部分に浸透させる方法もある。 この場合溶液の Ρ Ηや 塩濃度などを適切に変えることにより浸透効率を上げることも可能である。また、 ブロック共重合体を用いて予め高分子ミセルを調製しておき、 薬物を高分子ミセ ル溶液に添加して混練することにより薬物を高分子ミセルのコア部分に浸透させ る方法もある。 封入する疎水性薬物としては、 前記と同様のものが挙げられる。 上記高分子ミセルとは逆に、 親水性セグメントをコアに、 疎水性セグメントをシ エルに1した高分子ミセルも好ましく、 これは親水性薬物を高分子ミセルのコア内 に封入し、 徐放性や薬物安定性を示すものである。 親水性薬物としては、 前記と 同様のものが用いられる。 この高分子ミセルも後述の投与形態によって投与する ことができる。
本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物含有微粒子を調製するには、 例えば、 水中乾燥法、 超音波処理法、 凍結乾燥法などが用いられ、 これらは単独 あるいは組み合わせて用いられる。
( 1 ) 水中乾燥法
本発明のプロック共重合体のうち微粒子形成能を有するプロック共重合体の少 なくとも 1種類と薬物を溶媒に溶解後、 攪拌下少量ずつ水に添加し、 溶媒を水中 に除去または拡散せしめて微粒子を調製する。 ここで用いる溶媒としては、 該ブ 口ック重合体と薬物を溶解するものである限り特に限定するものではない。 例え ば、 メタノール、 エタノール、 ベンゼン、 トルエン、 ジメチルァセトアミド、 ジ メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジォキサン、 アセトン、 ァセトニトリル、 あるいはこれらと水の混液などが用いられる。 これ らを単独であるいは 2種以上溶媒と組み合わせて使用することができる。 水相に は上記薄膜水中攪拌法の項で記載した水相における添加剤を同様に添加してもよ レ^有機溶媒に対しては水の量は任意に選択できる。調製温度は約 0 〜約 8 0 V が好ましく、 さらに好ましくは約 5 X：〜約 5 0 である。 さらに、 水中乾燥時に 外的剪断力を付与することや通気により溶媒を除去することや減圧条件下でエバ ポレー夕一などで溶媒を除去することもできる。 外的剪断力を付与する装置とし ては、 例えば、 タービン型攪拌機やホモジナイザーなどが挙げられる。
( 2 ) 超音波処理法 ，
本発明のプロック共重合体のうち微粒子形成能を有するプロック共重合体の少 なくとも 1種類と薬物を適切な溶媒で溶解して多量の水中に分散させる。 装置の 形状、 処理量によって一概に決定できないが、 例えば、 1 W〜約 2 0 0 W、 好ま しくは 1 W〜約 1 0 Wの範囲で 1秒〜約 2 4時間、 より好ましくは 1分〜約 5時 間超音波照射を行う。 調製温度は約 0 °C〜約 8 0 の範囲で行われるが、 好まし くは約 5で〜 5 0でである。 上記の水中乾燥法と組み合わせて行われることが多 い。 ， , 本 明の微粒子におけるブロック共重合体の含有割合は、微粒子全体に対して、 通常 1 0〜1 0 0重量％、 好ましくは 3 0〜1 0 0重量％である。 本発明の微粒 子に薬物が含まれる場合、 本発明の微粒子における薬物の含有割合は、 治療上の 必要量により定まるものであり >特に限定されない。 本発明の微粒子は、 例えば、 分散剤 （ポリソルベート 8 0、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 6 0などの界面 活性剤；カルポキシメチルセルロース、 アルギン酸ナトリウム、 ヒアルロン酸ナ トリウムなどの多糖類；硫酸プロ夕ミン；ポリエチレングリコール 4 0 0など）、 保存剤 (例えば、パラォキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸プロピルなど）、 等張化剤 （例えば、 塩化ナトリウム、 マンニトール、 ソルビトール、 ブドウ糖な ど)、 油脂類 （例えば、 ゴマ油、 コーン油など）、 リン脂質 （例えば、 レシチンな ど）、 賦形剤（例えば、 乳糖、 コーンスターチ、 マンニトール、 セルロースなど）、 結合剤 （例えば、 ショ糖、 アラビアゴム、 メチルセルロース、 カルボキシメチル セルロース、 デキストリンなど）、 崩壊剤 （例えば、 カルボキシメチルセルロース カルシウムなど） などと混合されていてもよい。 本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物複合体粒子を調製するには、 例えば、 水中混練法などが用いられる。 該ブロック共重合体の水溶液に薬物を添 加して混練することにより薬物複合体を製することができる。 混練を効率よく行 うことにより、 ナノオーダーの薬物結晶と本ブロック共重合体との複合体を形成 せしめることができ、 薬物の懸濁状態が安定に保たれる。
本発明の薬物を含有したミセル、 微粒子または複合体は、 種々の医薬品添加物 を加え種々の剤形に製剤化し、 注射剤または埋め込み剤 （例えば、 静脈内投与、 皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、間接腔内投与、組織内投与など)、経粘膜剤（例 えば、 経口腔粘膜剤、 経鼻剤、 坐剤、 膣剤、 経肺剤など）、 経皮剤 （例えば、 軟膏 剤、 クリーム剤、 ゲル剤など)、 経口剤 （例えば、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤など） などとして投与することができる。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子を注射剤または埋め込み剤とする には、 これらを界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート、 ポリオキシエチレン硬化 ヒマシ油など）、 分散剤（例えば、 カルボキシメチルセルロース、 アルギン酸ナト リウム、 カルボキシビ二ルポリマー、 ポリエチレングリコール、 ヒアルロン酸ナ トリウムなど）、 保存剤 （例えば、 パラォキシ安息香酸メチル、 パラォキシ安息香 酸プロピルなど）、 等張化剤 （例えば、 塩化ナトリウム、 マンニトール、 ソルビト ール、 ブドウ糖、 プロリンなど）、 緩衝剤 （例えば、 リン酸ナトリウム、 リン酸水 素ナトリウムなど） と共に水性液剤、 水性懸濁剤とするか、 ゴマ油、 コーン油な どの植物油と共に分散して油性懸濁剤とすることができる。 水性液剤、 水性懸濁 剤は凍結乾燥により凍結乾燥製剤とすることもできる。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子を無菌製剤にするには、無菌濾過、 無菌充填工程を経る方法、 ガンマ線滅菌する方法、 防腐剤を添加する方法、 全製 造工程を無菌化する方法などが挙げられるが、 特に限定されない。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子は、 哺乳動物に対して安全な医薬 として用いることができる。 本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子の投与 量は、 主薬である薬物の種類と含量、 剤形、 投与経路、 対象疾患、 対象動物など によって種々異なるが、 薬物の有効量であればよい。 投与回数は 1日 1〜数回、 1週間に 1回、 2週間に 1回、 1か月に 1回、 または数か月に 1回など主薬であ る薬物の種類と含量、 剤形、 投与経路、 対象疾患、 対象動物などによって適宜選 ぶことができる。 '
以上のとおり、本発明のブロック共重合体は、疎水性化合物とミセル、微粒子、 複合体を形成することができる。 ミセル化により、 疎水性化合物を可溶化でき、 静脈投与可能となる。 リガンドにより疾患部位への集積も可能である。 更に本ブ 口ック共重合体は生体適合性であり、かつ徐放性により薬効持続性も期待できる。 ミセル化により経口吸収性の向上も期待できる。 また、 微粒子は皮下注射剤とし て長期にわたる薬物放出が期待でき、 複合体は難吸 性薬物のナノ粒子化を可能 とし経口吸収性の向上も期待できる。 また、 本発明のブロック共重合体は、 その 構成アミノ酸の種類と数、 ヒドロキシカルボン酸の種類と数、 配列順序の規定あ るいは修飾基を変えることにより、 選択性などさまざまな特性を付与することが できる 、 実施例 ― ,
以下に参考例、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 これらは 本発明を限定するものではない。
参考例 1
アミノアシルポリエチレングリコールの合成
平均分子量 4， 0 0 0のポリエチレングリコール （HO— P E G4 0 0 0— OH) 2 0 0 g ( 0 0 5モル） を 4 0 O mLのァセトニトリルに溶かした。 この溶液 に t一ブトキシカルボ二ルー L—フエ二ルァラニン一 N—ヒドロキシコハク酸ィ ミドエステル （B o c— P h e— ON S u ) 5 5 g ( 0 . 1 5モル） と 4ージメ チルァミノピリジン 2 6 5 g ( 0 0 1 5モル） を加えて 2日間室温で撹拌し た。 反応後、 溶媒を減圧留去後、 残査を 6 0 O mLのジクロロメタンに溶かし、 1 0 %クェン酸水溶液、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和食塩水で洗った。 溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、 溶液を濃縮し、 残査にエーテルを加えて 結晶化させた。 得られた粗生成物をァセトリトリルに溶かし、 4 5 0 n mのメン ブランフィルターでろ過し、 ろ液を減圧濃縮した。 残査にエーテルを加えて再結 晶させた。このものの NMRスぺクトルは H〇— PEG4000— OHの両末端に B o c— P h eがエステル結合により結合した Bo c—Phe—O— PEG4000 — O—Ph e—Bo cであることを示した。 収量 215 g (94%)。 次いで、 B o c— Phe— O— PEG4000 _〇—Phe— Boc 90 g (0. 02モル） をジォキサン中の 4M— HC 1で処理し、 溶媒を減圧留去すると固体の残査が得 られた。 残查にエーテルを加えて、 得られた結晶をろ過した。 NMRスぺクトル はこの結晶が HC 1 'H—Phe— 0— PEG— OHであることを示した。 77
8 g (93 %)。
参考例 2
アミノアシルポリエチレングリコールへの t一ブトキシカルボニル—L_ロイ シンの導入 ，
上記ポリエチレングリコール一 L_フエ二ルァラ二ネート塩酸塩 38. 9 g (0 01モル） をァセトニトリル （ACN) —テトラヒドロフラン CTHF) 1 ： 1混合溶媒 30 OmLに溶かし、 N—メチルモルホリン （NMM) 1. 15 mL (0. 0105モル） を加え、 これに t一ブトキシカルボ二ルー L一口イシ ン一N—ヒドロキシコハク酸イミドエステル （B o c—L e u— ONS u) 4
92 g (0. 015モル） を加えて室温で 1夜撹拌した。 反応終了後、 溶液を減 圧濃縮し、 残渣をジクロロメタンに溶かし、 溶液を 10%炭酸水素ナトリウム水 溶液、 クェン酸飽和水溶液、 水で洗い、 無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。 溶液 を減圧濃縮し、 残渣にエーテルを加えて結晶化させた。
得られた B o c— Le u— Phe— O— P E G4000 _〇Hを THFに溶かし， エーテルを加えて再結晶させた。 41 g (94%)。
参考例 3
t一ブトキシカルボ二ルー L一口イシルー L一口イシルー Lーァラニル—L一 乳酸一 N—ヒドロキシコハク酸イミドエステル （Boc— Leu— Leu— A 1 a-L a c -ONS u) の合成
L—乳酸 45 g (0. 5モル） を 50 OmLの THFに溶かし， ピリジン 4 0. 5mL (0. 5モル） を加えた。 室温で撹拌しながら Bo c— Lーァラニン -ONS u 143 g (0. 5モル） を加え、 更に 4ージメチルァミノピリジン 6. 1 (0 05モル） を加えた。 室温で 1 5日撹拌し、 溶媒を減圧留去し た。 残渣を酢酸ェチル 50 OmLに溶かし、 クェン酸飽和水溶液、 水で洗った。 溶液を 10%炭酸水素ナトリウム水溶液で 3回抽出し、 得られた抽出液を合わせ てクェン酸で酸性にした。 酸性水溶液を 30 OmL酢酸ェチルで 3回抽出した。 合わせた抽出液を水洗し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、 得られたオイルにへキサンを加えると結晶化した。 酢酸ェチルから再結晶し， 純 粋な B o c— Lーァラニル— L—乳酸（B o c— A 1 a-L a c—OH)を得た。 91 g (7%)。 このジデプシペプチドをジォキサン中の 4M塩酸で処理し、 Bo c保護基を除去した。 得られたジデプシペプチド塩酸塩を 40 OmLの THFに 溶かし、撹拌しながら 28mLのピリジンを加えた。 この溶液に Bo c— Le u -ON!S u 121 g (0 37モル） を加え， 撹拌しながら NMM 38 5 mL (0 35モル) を加えた。 室温で一夜撹拌した。 溶液を減圧濃縮 、 残渣 を 50 OmLの酢酸ェチルに溶かした。 この溶液を上記のように処理して B o c 一 Le u— A 1 a— La c—〇Hを 1 1 5 g (88%) 得た。 このトリデプシぺ プチド Bo c基を除去し、 Bo c— L e u— ONS uと反応させて Bo c -L e u-L e u-A 1 a— La c— OHを 127 g (85%) 得た。 この B o c— テトラデプシペプチドを 40 OmLの THFに溶かし、 N—ヒドロキシコハク酸 イミド （HOSu) 34. 5 g (0. 3モル） を加えた。 溶液を— 10でに冷却 し、 55. 4 g (0. 27モル） のジシクロへキシルカルポジイミドを加えて， — 10°Cで 3時間、 室温で一夜撹拌した。 溶液を 50 OmLの酢酸ェチルで希釈 し、 生じたジシクロへキシル尿素の結晶を濾去し、 濾液を減圧濃縮した。 残渣に へキサンを加えて結晶化させた。 酢酸ェチルから再結晶し、 純粋な Bo c— Le u-L e u-A 1 a— La c— ONS uを 1 38 g (90%) 得た。
実施例 1
Bo c— L e u— Le u— A l a— L a c— L e u— Phe— O— PEG400 o— OHの製造 Bo c— Leu— Phe—〇—PEG4000— OH 40 g (9. 2ミリモル） を 4 M塩酸 ジォキサンで処理して Bo c保護基を除去した。 得られた塩酸塩を ACN-THF (1 ： 1) に溶かし、 NMM lmLを加えた。 これに N—保護 テトラデプシペプチド活性エステル、 t一ブトキシカルボ二ルー L一口イシルー L一口イシルー L—ァラニル一 L—乳酸—N—ヒドロキシコハク酸イミドエステ ル （B o c—L e u—L e u— A 1 a— L a c— ONS u) 8 1 g (13. 9 ミリモル） を加えて室温で一夜撹拌した。 溶液を減圧濃縮し、 残渣をジクロロメ タンに溶かして、 10%炭酸水素ナトリウム水溶液、 クェン酸飽和水溶液、 水で 洗い、 無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。 溶液を減圧濃縮し、 残渣にエーテルを 加えて結晶化させた。 得られた結晶を THF—エーテルで再結晶し、 純粋な Bo c— Le u— Le u— A l a— La c— Le u— Phe— 0— PEG40no— O H 41. 8 g (96%) を得た。
実施例 2
Bo c— (Le u— Leu— A l a— La c) 2— Leu— Phe— P— PE G4。。。— OHの製造，
実施例 1の Bo c— Leu— Leu— A l a— Lac—Le u— Phe—〇— PEG4。Q。— OHの Bo c保護基を 4M—塩酸 Zジォキサンで処理して除去し、 これに実施例 1と同様な操作および条件で Bo c— L e u— L e u— A 1 a-L a c— ONS uを反応させると、 Bo c— (L e u-L e u-A 1 a-L a c) 2 -L e u-P h e一 O— P E G4000— OHが 92 %の收率で得られた。
実施例 3
Bo c— (Le u— Leu— A l a— La c) 3— Le u— Phe— O— PE G4。。。一〇Hの製造
実施例 2の Bo c— (Le u-Leu-A l a-Lac) 2-L e u-P h e — O— PEG4。。。一 OHの B o c保護基を 4 M—塩酸 ジォキサンで処理して 除去し、 これに実施例 1と同様な操作および条件で B oc— Leu— Leu— A 1 a— L a c—ONS uを反応させると、 Bo c— (Leu-Leu-A l a- L a c)。― L e u— P h e—〇— PEG4000— OHが 92%の收率で得られた。 このものの比旋光度は [a] D 25 = _ 13 1 (c = l. 0, CH3CN)であり、 NMRスペクトル 〔0. 84ppm (42 H) L e uの二つの CH3に基づく多 重ピーク ； 1 2〜1 7 p pm (48H) A 1 aおよび L a cの /3— CH3, し611の)6〇^^, r CH, B o cの三つの CH3に基づく多重ピーク， 3 δ ρ pm (36 OH) PEGの CH2に基づくシングルピーク ； 4. 2〜4. 9 p p ml 4H)アミノ酸および乳酸の α— CHに基づく多重ピーク； 7 2 p pm (5 H) Ph eの芳香環水素に基づく多重ピーク ； 7 6〜8. 5 p pm (11 H) アミド結合の NHに基づく多重ピーク〕 はこのものが Bo c— (Leu-Le u -A 1 a— Lac) 3— L e u— P h e— O— P E G4000— OHであることを示 した。
実施例 4
Bo c-(Le u-Le u-A l a-Lac)4-Le u-Phe-0-PEG 40()。ー'〇^1の製造
実施例 3の Bo c— (Le u-Le u-A l a-La c) 3— Leu— Phe — O— PEG4。0C)— ,〇Hの B o c保護基を 4 M—塩酸 Zジォキサンで処理して 除去し、 これに実施例 1と同様な操作および条件で B o c-Leu-Leu-A 1 a— a c— ONS uを反応させると、 Boc— (Le u-Leu-A l a- Lac)4— Le u— Phe—〇— PEG4000—〇Hが 95 %の收率で得られた。 実施例 5 '
Bo c— (Le u-Leu-A l a-La c) 5— L e u— P h e—O— P E G4()。。一 OHの製造
実施例 4の Bo c— (Leu-Le u-A l a-La c) 4— Le u— Phe — O— PEG^oo— OHの B o c保護基を 4M—塩酸 ジォキサンで処理して 除去し、 これに実施例 1と同様な操作および条件で B o c-Leu-Le u-A 1 a— L a c—〇NS uを反応させると、 Boc— (Leu-Leu-A l a - Lac) 5— Leu— Phe—〇— PEG4000—〇Hが 95%の收率で得られた。 このものの比旋光度は [a] D 25 =— 13. 7 (c = 1. 0, CH3CN)であり、 NMRスペクトル 〔0. 84ppm (66 H) L e uの二つの CH3に基づく多 重ピーク ； 1. 2〜： I. 7 p pm (72H) A 1 aおよび L a cの j8— CH3， Leuの j8CH2， r CH, B o cの三つの CH3に基づく多重ピーク； 3. 5 p pm (36 OH) PEGの CH2に基づくシングルピーク ； 4. 2〜4 9 p p m (22H) アミノ酸および乳酸の α— CHに基づく多重ピーク ； 7 2 ppm (5H) P h eの芳香環水素に基づく多重ピーク ； 7 6〜8. δ p pm (17 H) アミド結合の NHに基づく多重ピーク〕 はこのものが Bo c— (L e u-L e u-A 1 a— Lac) 5— L e u— P h e— O— P E G4000—〇Hであること を示した。
実施例 6
Boc— Le u— Le u— A l a—： Lac— Le u— Phe—〇_PEG6。。 -O-Phe-Leu-La c-A l a— Leu— Leu— Bocの製造 参考例 1の平均分子量 4, 000のポリエチレングリコールに代えて、 平均分 子量 600のポリエチレングリコールを用い、 以下参考例 2、 実施例 1と同様に 処理して、 Bo c— Le u— Le u— A l a— La c— Leu— Phe— O— P EG6。Q— O— Phe—Leu—L ac— A l a— Le u— Leu— Boc力 9 6 %の収率で得られた。
実施例 7
Bo c— Leu— Le u— A l a— Lac— Leu— Phe— O— PEG154 。一 O— Phe— Leu— Lac— A l a— Leu— Leu— Bocの製造 参考例 1の平均分子量 4, 000のポリエチレングリコールに代えて、 平均分 子量 1, 540のポリエチレングリコールを用い、 以下参考例 2、 実施例 1と同 様に処理して、 Boc—Leu— Leu— A l a— La c— Leu— Phe—〇 — PEG1540— O— Ph e— Le u— L a c— A l a— Le u— Le u— Bo cが 95 %の収率で得られた。
実施例 8
Bo c— (Leu-Le u-A l a-La c) 5 _ L e u— P h e—〇一 P E G6。QQ— OHの製造
参考例 1の平均分子量 4, 000のポリエチレングリコールに代えて、 平均分 子量 6， 000のポリエチレングリコールを用レ 以下参考例 2、 実施例 1〜5 と同様に処理して、 Bo c—（Le u— Le u—A l a-L a c ) 5-L e u-P h e一〇— PEG 6000— OHが 95%の収率で得られた。
実施例 9
Bo c— (Le u— Leu— A l a— La c) 5— Le u— Phe— O— PE G2。。。。—〇Hの製造
参考例 1の平均分子量 4, 000のポリエチレングリコールに代えて、 平均分 子量 20, 000のポリエチレングリコールを用い、 以下参考例 2、 実施例 1〜 5と同様に処理して、 Bo c— (L e u-L e u-A 1 a-L a c) 5-L e u — 116—〇ー？£020。00_01^が97 の収率で得られた。
実施例 10
Bo c— (Le u— Le u— A l a— La c; 5— Le u— Phe— O— PE G400 0i— OCH3の製造
平均分子量 4, 000のモノメトキシポリエチレングリコール （HO— PEG 4。。。—〇CH3) 200 g (0 05モル） を 40 OmLのァセトニトリルに溶 かし、 この溶液に t一ブトキシカルボ二ルー L一フエ二ルァラニン— N—ヒドロ キシコハク酸イミドエステル （Boc— Phe— ONSu) 55 g (0 15モ ル） と 4—ジメチルァミノピリジン 2 65 g (0. 015モル） を加えて 2日 間室温で反応させた。 反応後、 溶媒を減圧留'去し、 残査を 60 OmLのジクロ口 メタンに溶かし、 10%クェン酸水溶液、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和 食塩水で洗浄した。 溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、 溶液を濃縮し、 残査 にエーテルを加えて結晶化させた。得られた粗生成物をァセトニトリルに溶かし、 450 nmのメンブランフィル夕一でろ過し、 ろ液を減圧濃縮した。 残査にェ一 テルを加えて再結晶した。このものの NMRスぺクトルは HO— PEG4000— O CH3の末端に Bo c— Pheがエステル結合により結合した Bo c— Phe— O— PEG4000— OCH3であることを示した。収量 200 g (94%)。次いで、 Boc-Phe-O-PEG4000-OCH390 g (0 02モル） をジォキサ ン中の 4M— HC 1で処理し、 溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。 残 査にエーテルを加えて、 得られた結晶をろ過した。 NMRスペクトルはこの結晶 が HC 1 · H—P h e—O— PEG—〇CH3であることを示した。 収量 77. 8 g (93%)。 以下、 参照例 2、 実施例 1〜5と同様に処理して、 Bo c—（L e u— Le u— A l a— La c)5— Le u— Phe— 0— PEG4000— OCH 3を得た。
実施例 1 1
Boc— Le u— Leu— A l a-He a-A 1 a— Phe—〇— PEG400 0—〇Hの製造
参考例 1で合成したポリエチレングリコール L一フエ二ルァラ二ネート塩酸 塩 38. 9 g (0. 01モル） をァセトニトリル （ACN) —テトラヒドロフ ラン （THF) 1 · 1混合溶媒 30 OmLに溶かし、 NMM 1. 15mL (0 0105モル） を加え、 これに t一ブトキシカルボ二ルー Lーァラニン一 N—ヒ ドロキシコハク酸イミドエステル （B o c—A 1 a— ONS u) 4. 3 g (0 015モル） を加えて室温で 1夜撹拌した。 反応終了後、 溶液を減圧濃縮し、 残 渣をジクロロメタンに溶かし、 溶液を 10%炭酸水素ナトリウム水溶液、 クェン 酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリゥム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、 残渣に —テルを加えて結晶化させた。 得られた Boc— A 1 a— Phe— O— PEG400。一〇Hを THFに溶かし、 エーテルを加えて再結晶させた。 収量 39 g (90%)o Boc-Al a-Phe-0-PEG400o-OH 43. 2 g (1 0ミリモル） を 4M塩酸 ジォキサンで処理して Bo c保護基を除去した。 得ら れた塩酸塩を ACN— THF (1 : 1) に溶かし、 NMM lmLを加えた。 こ れに N—保護テ卜ラデプシペプチド活性エステル、 t一ブトキシカルボ二ルー L —口イシルー L—口イシルー Lーァラニル—Lーグリコール酸一 N—ヒドロキシ コハク酸イミドエステル（Bo c— Leu— Leu— A 1 a-He a-ONS υ) 8. 55 g (15ミリモル） を加えて室温で一夜撹拌した。 溶液を減圧濃縮し、 残渣をジクロロメタンに溶かして、 10%炭酸水素ナトリウム水溶液、 クェン酸 飽和水溶液、 水で洗い、 無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。 溶液を減圧濃縮し、 残渣にエーテルを加えて結晶化させた。 得られた結晶を THF—エーテルで再結 晶し、 純粋な B oc— Le u— Leu—A l a-He a-A 1 a— Ph,e— O— PEG4000 -OH 42 l g (90%) を得た。
実施例 12 '
Bo c— (Le u-Le u-A l a-He a) 2— A 1 a— P h e— O— P E G4。。。— OHの製造
実施例 1 1の Bo c— Leu— Le u—A l a-He a-A 1 -P h e -O _PEG4。。。一 OHの Bo c保護基を 4 M—塩酸 ジォキサンで処理して除去 し、 これに上記と同様な操作で B oc— Leu— Leu— A l a— He a— ON Suを反応させると、 Bo c— (L e u-L e u-A 1 a-He a) 2-A 1 a — Ph e—〇— PEG4000 _〇Hが 89%の收率で得られた。
実施例 13
Boc— Le u— Le u— A l a— L a c— (Le u— Leu— A l a— He a)2」A l a— Ph e— 0」PEG4。。。— OHの製造
実施例 12の Bo c— (Leu-Leu-A l a-He a) 2— A l a— Ph e— O— PEG4000— OHの B o c保護基を 4 M—塩酸ノジォキサンで処理し て除去し、 これに上記と同様な操作で B o c -L e u-L e u-A 1 a— La c —〇NS uを反応させると、 Bo c— Leu-Le u-Al a-Lac - (L e u-L e u-A 1 a-He a) 2— A l a— Phe—〇一 P E G4000— OHが 90%の收率で得られた。
実施例 14
Bo c— (Le u— Le u— A l a— La c; 。一 (L e u _I e u— A 1 a -He a) 2— A 1 a— Ph e—〇— PEG4。。。一〇Hの製造
実施例 13の Boc— Le u— Leu— A l a-Lac- (Leu-Le u- A l a-He a) 2-A 1 a-Ph e—〇— P E G4。。。一 OHの B o c保護基を 4M—塩酸 ジォキサンで処理して除去し、 これに上記と同様な操作で Bo c— L e u— L e u— A 1 a— L a c _〇NS uを反応させると、 Boc— (Le u — Leu—A l a— L a c ) 2— (L e u— L e u— A 1 a— H e a) 2— A l a — P h e— O—PEG4000— OHが 92%の收率で得られた。 実施例 15
B o c— (Le u— Le u— A l a— La c) 3— (Le u— Le u— A l a -He a) 2— A 1 a_Ph e— O— PEG4000— OHの製造
実施例 14の Bo c— (Le u Le u— A l a— La c) 2— （Le u— L e u-A 1 a-He a) 2— A 1 a— P h e—O— P E G4。。。—〇Hの B o c保 護基を 4 M—塩酸 Zジォキサンで処理して除去し、 これに上記と同様な操作で B o c -L e u-L e u-A 1 a— L a c— ON S uを反応させると、 B o c— (L eu-Leu— A l a— L a c ) 3— (Leu— Leu— A l a—He a) 2— A 1 a-P h e一〇一 P E G4000— OHが 91 %の收率で得られた。このものの比 旋光度は [a] D 25 = - 11 2 (c = l . 0, CH3CN) であり、 NMRスぺ クトル 〔0 84 p pm (6 OH) L e uの二つの CH3に基づく多重ピーク ； 1 1 1 7 ppm (66H) A l aおよび L a cの ;8— CH3, Leuの CH2 i ァ CH, B o cの三つの CH3に基づく多重ピーク ； 3. 5 p pm (36 OH) PEGの CH2に基づくシングルピーク ； 4. 2 4. 9 p pm (24H) アミノ酸、 乳酸およひ 'ダリコール酸の α— CHに基づく多重ピーク ： 7. 2 p p m (5H) Ph eの芳香環水素に基づく多重ピーク ； 7 6 8. 5 p pm (1 7H) アミド結合の NHに基づく多重ピーク〕 はこのものが Bo c— （Le u— Leu— A l a— Lac) 3— (Leu— Le u— A l a— He a) 2— A l a— Ph e— O_PEG4000—〇Hであることを示した。
実施例 16
B o c - {G 1 u (OE t) -A 1 a -A 1 a -L a c } 4— A l a— Phe — OPEG4000 - OHの製造
HC 1 - H-A 1 a-Phe-OPEG4000-OH 43 g (10ミリモル） を THFに溶かし、 NMM 1. lmL及び Bo c— G l u (OE t) —A l a -A 1 a-L a c -ONS u 8. 6 g ( 15ミリモル） を加えて、 一夜室温で撹 拌した。 常法通り処理して Bo c— G l u (OE t) — A l a—A l a—Lac -A l a-Phe-O-PEG4000-OH を 41 7 g (89%) 得た。 この B o c—テトラデブシぺプチド活性エステルの反応を更に 3回繰り返してデプシ ペプチド鎖長を延長して、 最終的に Bo c— {G 1 υ (OE t) — A 1 a— A 1 a— La c} 4— A l a— P h e—〇一 P E G4。 0。一 OH を得た。
実施例 17 ■
Bo c-Phe-Lac - (Phe-Le u-Phe-La c) 2— Phe— 〇一 PEG40()0_OHの製造
ポリエチレングリコール L—フエ二ルァラ二ネート塩酸塩 38 9 g(0. 01モル） をァセトニトリル （ACN) —テトラヒドロフラン （THF) 1 ： 1 混合溶媒 30 OmLに溶かし、 N—メチルモルホリン 1 15mL (0. 010 5モル） を加え、 これに t一ブトキシカルボ二ルー L一フエ二ルァラ二ルー L— 口イシ L一フエ二ルァラ二ルー L一乳酸 N—ヒドロキシコハク酸イミドエステル (Boc-Phe-Le u-Phe-Lac-ONSu) 10. 4 g (0. 01 5モル） を加えて室温で 1夜撹拌した。 反応終了後、 溶液を減圧濃縮し、 残渣を ジクロ iロメタンに溶かし、 液を 10%炭酸水素ナトリウム水溶液、 クェン酸飽 和水溶液、 水で洗い、 無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。 溶液を減圧濃縮し、 残 渣にエーテルを加え; Γ結晶化させた。
得られた B o c-Phe-Leu-Phe-L a c-Phe-O-PEG400 。― OHを THFに溶かし、 エーテルを加えて再結晶させた。収量 45 4 g (9 6%)。 Bo c—Phe— Le u— Phe— L ac— Phe—〇_PEG4000— OH 47.3 g (10ミリモル） を 4 M塩酸/ジォキサンで処理して B o c保 護基を除去した。 得られた塩酸塩を ACN— THF (1 ： 1) に溶かし、 NMM 1. 15mLを加えた。 これに N—保護テトラデプシペプチド活性エステル、 B o c— Phe— Leu— Phe— La c— ON Su 10 4 gを加えて室温で一 夜撹拌した。 溶液を減圧濃縮し、 残渣をジクロロメタンに溶かして、 10%炭酸 水素ナトリウム水溶液、 クェン酸飽和水溶液、 水で洗い、 無水硫酸ナトリウム上 で乾燥した。 溶液を減圧濃縮し、 残渣にェ一テルを加えて結晶化させた。 得られ た結晶を THF—エーテルで再結晶し、 純粋な Bo c— （Phe— Le u— Ph e— La c) 2— Phe—〇— PEG4。。0— OH 42 l g (90%)を得た。 この DP— PEGを 4M— HC 1 /ジォキサンで処理して B o c基を除去し、 得 られた塩酸塩に B p c-Phe-Lac -ONS uを常法通り反応させて B o c -Ph e-La c - (Phe-Leu-Phe-La c) 2— Phe— O— P EG4000 -OH38 7 g (.95%) を得た。 このものの比旋光度は [a] D 25 =- 12 2 (c = 1. 0， CH3CN) であり、 NMRスペクトル 〔0. 84 p pm (12H) L e uの二つの CH3に基づく多重ピーク ； 1. 2〜1 7 p pm (24H) Lacの j8— CH3, Leuの; 8CH2, r CH, Bocの三つの CH3に基づく多重ピーク ； 3 δ p pm (36 OH) PEGの CH2に基づくシ ングルピーク ； 4 2〜4 9 p pm (1 1 H) アミノ酸および乳酸の a_CH に基づく多重ピーク ； 7 2 p pm (3 OH) P iTeの芳香環水素に基づく多重 ピーク ； 7. 6〜8. 5 p pm (8H) アミド結合の NHに基づく多重ピーク〕 はこのものが B o c— P h e— L a c— (Phe-Le u-Phe-La c) 2 -Pheー〇ー 504000 _0^^でぁることを示した。
実施例 18 '
ミセルの製造
Bo c— (Le u— Leu— A l a— La c) 5— Le u— Phe— O— PE G4000 -OH 30 Omgとパルミチン酸デキサメタゾン （DMP) 15mgを 10 OmLナス形フラスコに取り、 2 OmLのァセトニトリルに溶解した。 この 溶液から 50 で溶媒を減圧留去した。 得られたフィルム状残渣に水 10 OmL を加えて、 フラスコを手で振って、 残渣を水に溶解させた。 DMPは水に不溶で あるが、 フィルム状残渣は完全に水に溶け、 不溶分は全く析出せず、 ミセルに取 り込まれたことが示唆された。 これにより、 本ブロック共重合体は難溶性疎水性 化合物を可溶化することができることが示された。
実施例 19
ミセルの製造とミセルの粒径
Boc— (Leu-Le u-A l a-Lac) 5-Le u-Phe-OPEG4 。00— OH 20 Omgと DMP 6 Omgをァセトニトリルに溶かし、 常法通り 処理し、 生理的食塩水 100m 1を加えた。 溶液はわずかに白濁したので、 メン ブランフィルターでろ過した。 フィルター上には不溶分 14mgが残った。 従つ て、 生理的食塩水溶液 10 OmL中に 46mgの DMPを含むミセルを調製する ことができた。 このミセルの直径は 102 5 nmであった。
実施例 20
ミセルの製造
Boc— (Leu— Leu— A l a— La c) 3— (Leu— Le u— A l a — He a) 2— A l a— Phe— OPEG4000—〇H 30 Omgとァシクロビル (AV) 10 5mgをァセトニトリルに溶かした。溶液を 50 で減圧濃縮し、 残渣に水 3 mLを加えた。 残渣はミセルを形成し容易に溶解した。
実施例 21 、
ミセルの製造
Bo c- (Le u-Le u-A l a-La c) 5-Leu-Phe-OPEG4 。00— OH 30 Omgとァシクロビル 10. 5mgをァセトニトリルに溶かし た。 溶液を 50 で減圧濃 し、 残渣に水 3mLを加えた。 残渣はミセルを形成 し容易に溶解した。
実施例 22 - ミセル形成の証拠
実施例 i 8と同様と同様の重量、 操作で B oc-Phe-Lac- (Phe— Leu-Phe-Lac) 2-P h e— O— P E G4000— OHと DMPからなる ミセルを調製し、 これを凍結乾燥した。 50 OMh zプロトン NMRにより、 凍 結乾燥試料を D20及びジメチルスルホキシドー d6 (DMS〇一 d6) 中で測定 した。 D20溶媒中で測定したスペクトルは 3. 8 p pmにポリエチレンォキシ ドのメチレンプロトンに由来するピークと 5. 0 p pmに系中に存在する水から のプロトンピークの 2種類のピークしか観測されなかった。 同じ試料の DM SO —d6中でのスぺクトルには B o c-Phe-La c - (Phe— Le u— Ph e— La c) 2— Phe— O_PEG4000—〇Hと DMP からのプロトンピーク が全て観測された。 この事実は、 凍結乾燥試料を D2〇に再溶解するとミセルを 保って溶解し、 エネルギーの弱いラジオ波を用いた NMRスぺクトルはミセルの 外側に存在するポリエチレンォキシドのメチレンプロトンしか観測されず、 ミセ ル内部に存在するデブシぺプチドセグメント及び DM Pは観測されなかったが、 同じ凍結乾燥試料を DMSO— d6に溶解するとミセルが破壊され、 試料中の B O C— Ph e— La c— (Ph e— Le u— Ph e— La c) 2— Ph e—〇— PEG4000— OHと DMPは分子状で DM SO溶液となり、 NMRでは全てのプ 口トンが観測されたと考えられる。 従って、 この NMRスペクトルは Bo c—P he— L a c— (Ph e-Le u-Ph e-L a c) 2— P h e— O— P E G40 oo— OHと DMPからなるミセルが形成されているといえる。
実施例 23
凍結乾燥によるミセルの凝集、 破壊のないことの証明 '
Bo c (Le u— Le u— Ar a— L a c) 3 (L e u— Le u— Ar a— H e a) 2-Ar a-Phe-OPEG4000-OH 500mgと DMP 100m gをァセトニトリルに溶解,し、 減圧で溶媒を留去した。 残査に水 50mLを加え てよぐ振った。 一夜放置後、 '生じた不溶物を 450 nmのメンブランフィル夕一 で濾過した。 不溶物の重量は 24 mgであった。 ろ液を 2分割し、 一方には 25 Omg (サンプル 1)、 及び他方には 125mg (サンプル 2) の PEG4。。0を 加えて凍結乾燥した。 収量はそれぞれ 477mgと 413mgであった。 サンプ ル1を26. 6mg取り、 生理的食塩水 lmLを加えて手で軽く振ったところ 1 5秒で透明な均一溶液となった。 一方、 サンプル 2を 20. Omg取り、 同様な 処理をしたところ、 軽く振った後、 45秒後には均一溶液になった。 いずれも、 凍結乾燥品は生理的食塩水に極めてすばやく溶解し、 透明な均一溶液を与えた。 粒径はそれぞれ 105 5 nm, 101 6 nmであった。
実施例 24
ミセル内封薬物の放出性
Bo c— (L e u— Le u— A l a— L a c) 3― (Le u— L e u— A l a -He a) 2— A 1 a— Ph e—〇PEG4000— OH 100 mgと DMP 5 mgからなるミセル溶液を調製し、 これを透過分子量約 14, 000、 孔径約 5 nmの透析用セルロースチューブを用いて透析し、 放出された DMPを紫外分光 光度計により測定した。 24時間後に 14%、 48時間後に 33%が放出された。 実施例 25 '
ミセル内封薬物の放出性
Boc— (Le u-Leu^A l a-La c) 5— L e u— P h e— O— P E G4000 -OH 100 mgと DMP 5 mgからなるミセル溶液を調製し、 これ を透過分子量約 14， 000、 孔径約 5 nmの透析用セルロースチューブを用い て透析し、放出された DM Pを紫外分光光度計により測定した。 24時間後に 2 %、 48時間後に 4%が放出された。
, 実施例 26
ミセル内封薬物の放出性 、
Boc— (Le u-Leu-A l a— La c) 5— Le u-Phe-O— PE G 4000 -OH l O Omgと DMP 10 mgからなるミセル溶液を調製し、 これ を透過分子量約 14, 000、 孔径約 5 nmの透析用セルロースチューブを用い て透析1し、 放出された DMPを紫外分光光度計により測定した。 24時間後に 2 4%が放出された。
, 実施例 27 - , '
ミセル内封薬物の放出性
Bo c- (Le u-Leu-A l a-La c) 5-L e u - P h e -O-P E G4000 -OH 100 mgとデキサメタゾン 5mgからなるミセル溶液を調製 し、 これを透過分子量約 14, 000、 孔径約 5 nmの透析用セルロースチュー ブを用いて透析し、 放出された DMPを紫外分光光度計により測定した。 10時 間後に 57%が放出され、 その後の 10時間では 3%の放出しかなかった。 これ らのことから、 薬物と本発明のブロック共重合体との親和性は、 薬物ごとに大き な差異があり、 薬物の化学的特性に適合するようにミセル中の疎水性セグメント のポリマー構造を薬物毎に構築することにより、 ミセルの形成を制御できること が分かった。 また、 ミセル内に内封された薬物の放出性は薬物、 本発明のブロッ ク共重合体の構造と内封させる薬物量によりその放出性を制御できることが分か つた。
実施例 28 Bo c— （Leu— Le u—A l a— Lac) 5L e u-Ph e-0-PEG4 000— OHと f o 1 i c a c i dとの縮合物の合成
葉酸 4 4g (0. 01モル） を 10 OmLの酢酸に溶かし、 0でで塩化チ ォニル 1 2 g (0. 01モル） を滴下し、 得られた溶液を Boc— (Leu — L e u— A 1 a _L a c) 5L e u— P h e—O— PEG4。00— OH (0. 0 05モル） とピリジン 4mLを含む THF溶液 30 OmLに滴下し、 室温で 3時 間反応させた。 得られた溶液を減圧濃縮し、 酢酸ェ ルに溶かして、 水、 炭酸水 素ナトリウム水溶液で洗い、 無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。 溶液を減圧濃縮 しエーテルを加えて生成物を沈殿させた。 THFか ¾再沈殿させて精製された B o c— (Le u— Le u— A l a— Lac) 5Leu— Phe— O— PEG4000 一 OHと f o l i c a c i dとの縮合物を得た。 , 実施例 29
微粒子の製造
Boc— Leu— Le u— A l a— Lac— Le u— Leu— Ly s (Z) ― La c_Leu—： L,a c— Phe—O— PEG6QQ— O— Phe— La c— : Le u— La c— Ly s (Z) — Le u— Leu— La c— Al a— Leu— Leu -Boc 20 Omgとパルミチン酸デキサメタゾン 1 Omgをァセトニトリル -THF (1 . 1) 2mLに溶かし、 ス夕一ラーで高速撹拌下、 水を徐々に加え て 10 OmLにした。 その後、 30分間撹拌した。 溶液は白濁し、 薬物を含有す る微粒子が調製された。
実施例 30
複合体の製造
パルミチン酸デキサメタゾン 1 Omgを乳鉢に取り、 これに、 Boc— (L e u— Leu— A l a -L a c) 5-A 1 a— Phe—〇— PEG4000— OH 10 Omgを 15mLの水に溶かし超音波処理した水溶液 ImLを加えて、 乳棒で 1 分間混練した結果、 パルミチン酸デキサメタゾン結晶は極微小の結晶状態で均一 に分散し、 この懸濁液は室温で十分に安定であった。 一方、 パルミチン酸デキサ メタゾン 1 Omgをメノウの乳鉢に取り、 これに水 ImLを加えて、 メノウの乳 棒で混練した場合には、 パルミチン酸デキサメタゾンが水に全く親和性がなく、 大きな塊のままで分散しなかった。 このことから本発明ブロック共重合体は微小 薬物結晶と安定な複合体を形成することが分かつた。
実施例 31
薬理効果の持続性
実施例 18と同様にして得た B o c _ (Le u— Leu— A l a— La c) 5 _L e u— Ph e— O— PEG4000— OHとパルミチン酸デキサメタゾンから なるミセルを含有する注射液（生理食塩水）を調製し、デキサメタゾンとして 0 SmgZk gの投与量になる様に雄性 SDラット （5週令、 n = 3〜5) に静注 した。 薬剤投与 7日後、 ラットの右足に 3%カラギーナン溶液 0. 1mlを皮下 注し、 浮腫による足体積増加を 4時間後に測定した。 比較として、 上記じたミセ ルに代えて、パルミチン酸デキサメタゾンのリピッドマイクロスフェア注射液（リ メタゾン （登録商標)、 三菱ゥエルファーマ （株） 製)、 リン酸デキサメタゾンナ トリウム注射液 （デカドロン （登録商標)、 万有製薬 （株） 製)、 薬物不含有の生 理食塩水を同量投与 ,し、 同様のタイムスケジュールで足体積を測定した。 薬物不 含有の生理食塩水では足体積が 19. 9 ±7. 7%増加し、リメ夕ゾンでは 15 4土 3 5%の増加をみた。 しかし、 上記のミセルは 1 46± 1. 46%の増 加しかなく、 生理食塩水及びリメ夕ゾンに対し、 有意 （Pぐ 0. 01) な抗炎症 効果が認められた。 リン酸デキサメ夕ゾンナトリゥム注射液 （デカドロン （登録 商標)、 万有製薬 （株） 製） を用いた実験においては、 生理食塩水と比較し 24時 間後が最も強く抗炎症作用があり足体積増加は顕著に抑制されたが、 3日目以降 その効果は消失していた。 このことより、 本発明のミセルの薬理効果の持続性が 明らかとなった。
実施例 32
ミセルの製造
Bo c— (Leu— Le u— A l a— La c) =— Le u— Phe— O— PE G4000 -OH 6mgとプロスタグランジン I 2 (PG I 2) 0. 12mgを 10 OmLナス形フラスコに取り、 3 OmLのァセトニトリル一 THF—エタノール (5 : 5 : 1) に溶解した。 この溶液から溶媒を減圧留去した。 得られたフィル ムに蒸留水 3 OmLを加えて、 フィルムを水に溶解させた。 フィルムは完全に水 に溶けた。 次いで UVスペクトルを測定した。 3日後でも 19 δ nmに吸収極大 をもつ UVスぺクトルは変化しなかった。 またこの水溶液に 3mgの PEG40 00を加え、 凍結乾燥した。 凍結乾燥物を室温に 24日保存した後でも UVスぺ クトルは変化しなかった。
実施例 33
ミセルの製造 ，
Bo c— (Le u— Leu— A l a— Lac) 5— Le u— Phe— O— PE G4000 -OH 5 Omgとプロス夕サイクリンであるベラプロストナトリウム 5 ◦ mgを 10 OmLナス形フラスコに取り、 30 mLのァセトニトリル一 TH F —エタノール （5 : 5 . 1) に溶解した。 この溶液から溶媒を減圧留去した。 得 られだ固形物に pH 4 5の酢酸緩衝液 （0 1M) を lmL加え、 超音波をか け固形物を溶解させた。 ベラプロストナトリウム単独では、 この pHでは沈殿が 生じるが、 固形物は,この pHで完全に緩衝液に溶け、 ミセルに取り込まれたこと が示唆された。
実施例 34
ミセルの製造
ノ クリタキセル 2. 2mgと Boc— (Le u-Le u-Α ί a-L a c) 5 -L e u-Phe-O-PEG4000-OH 5 5 mgを 10 mLのァセトニト リルに溶かし、 溶媒を減圧留去した。
ガラス壁に残った透明なフィルムを水 3 OmLに 40でで溶解した。 パクリタ キセルは水に不溶であるが、フィルムは完全に水に溶け、不溶分は全く析出せず、 ミセルに取り込まれたことが示唆された。 透明な均一溶液をメンブランフィル夕 —でろ過して、 ろ液に 25mgの PEG4000を加えて、 凍結乾燥した。 50 OMh zプロトン NMRにより、凍結乾燥試料を D2〇及びジメチルスルホキシド 一 d6 (DMS〇—d6)中で測定した。 D2〇溶媒中で測定したスペクトルは 3. 8 p pmにポリエチレンォキシドのメチレンプロトンに由来するピークと 5. 0 P pmに系中に存在する水からのプロトンピークの 2種類のピークしか観測され なかった。 同じ試料の DMSO— d6中でのスペクトルには Bo c— (Le u— Le u— A l a— La c) 5 L e u— P h e—〇一 P E G400。一 OHとパクリ タキセルからのプロトンピークが全て観測された。 この事実は、 凍結乾燥試料を D2〇に再溶解するとミセルを保って溶解し、 エネルギーの弱いラジオ波を用い た NMRスぺクトルはミセルの外側に存在するポリエチレンォキシドのメチレン プロトンしか観測されず、 ミセル内部に存在するデプシペプチドセグメント及び パクリ夕キセルは観測されなかつたが、 同じ凍結乾燥試料を DMSO— d6に溶 解するとミセルが破壊され、 試料中の B o c— (L e u-L e u-A 1 a-L a c) 5— Leu— Phe— O— PEG4000— OHとパクリタキセルは分子状で D MSO溶液となり、 NMRでは全てのプロトンが観測されたと考えられる。 従つ て、 この NMRスペクトルは B o c— (L e u-L e u-A 1 a-L a c) 5— L e li-P h e— O— P E G 4000—〇Hとパクリタキセルからなるミセルが形 成されていることを示しているといえる。
実施例 35— ,
ミセルの製造
メトトレキサート 2 Omgと B o c— (Le u-Le u-A l a-Lac) 5 -Le u-Phe-O-PEG4000-OH 200mgを 30mLの THF_ メタノール （1 ： 1) に溶かし、 溶媒を減圧留去した。 残った透明なフィルムに 水 5 OmLを加えて溶解した。 メト卜レキサートは水にほとんど不溶であるが、 フィルムは完全に水に溶け、 不溶分は全く析出せず、 ミセルに取り込まれたこと が示唆された。 透明な均一溶液をメンブランフィルターでろ過して、 ろ液に 10 Omgの PEG4000を加えて、 凍結乾燥した。 500 M h zプロトン NMR により、 凍結乾燥試料を D2〇及びジメチルスルホキシドー d6 (DMSO-d6) 中で測定した。 D2〇溶媒中で測定したスペクトルは 3 8 ppmにポリエチレ ンォキシドのメチレンプロトンに由来するピークと 5. 0 pmに系中に存在す る水からのプロトンピークの 2種類のピークしか観測されなかった。 同じ試料の DM SO— d6中でのスぺクトルには B o c— (Le u-Leu-A l a-L a c) 5— Le u— Phe—0— PEG4000—〇Hとメトトレキサー卜からのプロ トンピークが全て観測された。 従って、 この NMRスペクトルは Bo c— (L e u-L e u-A 1 a— Lac) 5— Leu— Phe— O— PEG4000— OHとメ 卜トレキサートからなるミセルが形成されていることを示しているといえる。 実施例 36
Bo c— (Le u-Le u-A l a-La c) 5— L e u— D— A 1 a— O— P EG4。。Q— OHの合成 ， ,
HO-PEG4000 -OH 20 g (5mmo 1) を 300 mLテトラヒドロフ ラン （THF) に溶かし、 t-ブトキシカルボニル- D-ァラニン N-ヒドロキシ コハク酸エステル B o c— D_A 1 a— ONS u 4. 3 g ( 1 ommo 1 ) と 4-ジメチルァミノピリジン 0. 19 g (1 5mmo 1 ) を加えて、 室温で 3日撹拌した。 溶液を減圧濃縮し、 得られたオイルをジクロロメタン 40 OmL に溶かし、 この溶液を 10%クェン酸水溶液、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、 飽和食塩水で洗い、 無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。 溶液を減圧濃縮し、 得 られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。 結晶を温 THFに溶かし、 エー テルを加えて再結晶させた。 収量 20 g (収率 92%) 次いで、 Boc—D— A l a—〇一 PEG4。。。一 O— D— Al a— Bo c 20 g (4. 6mmo 1 ) を ジォキサン中の 4M— HC 1で処理し、 溶媒を減圧留去すると固体の残査が得ら れた。 残查にエーテルを加えて、 得られた 晶をろ過した。 NMRスぺクトルは この結晶が HC 1 · H— D— A 1 a—〇一 PEG— OHであることを示した。 1 7. 6 g (93%)。 以下、 参考例 2、 実施例 1〜4と同様に処理して、 Bo c— (Leu— Leu— A l a— L a c ) s— Le u— D— A l a— O— P E G4000 一〇Hを合成した。
実施例 37
Bo c— (Le u— Le u— A l a— Lac) 5— Leu— Ly s (Z) 一〇— PEG4。。。一〇Hの合成
HO-PEG4000 -OH 20 g (5mmo 1) を 300 mLテトラヒドロフ ラン （THF) に溶かし、 t-ブトキシカルボニル-ベンジルォキシカルボニル- L一リジン N—ヒドロキシハク酸エステル B o c -Ly s (Z)-ONS u 7 2 g (15mmo 1 ) と 4—ジメチルァミノピリジン 0 19 g (1. 5 mm o 1) を加えて、 室温で 3日撹拌した。 溶液を減圧濃縮し、 得られたオイルをジ クロロメタン 40 OmLに溶かし、 この溶液を 10 %クェン酸水溶液、 飽和炭酸 水素ナトリゥム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリゥム上で乾燥させた。 溶液を減圧濃縮し、 得られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。 結晶を温 THFに溶かし、 エーテルを加えて再結晶させた。 収量 21 g (収率 89%)。 次 いで、 Bo c—Ly s (Z) -0-P EG4000 -O-L y s (Z) —Boc 1 8 9 g (4mmo 1 ) をジォキサン中の 4M_H、C 1で処理し、 溶媒を減圧留 去すると固体の残查が得られた。 残查にエーテルを加えて、 得られた結晶をろ過 した。 NMRスペクトルはこの結晶が HC 1 - H-Ly s (Z) — O— PEG— OHであることを示した。 収量 16. 5 g (収率 96%)。 以下、 参考例 2、 実施 例 1 4と同様に処理して、 Bo c— (L e u-L e u-A 1 a-L a c) 5— L e u-Ly s (Z) 一 O— P E G4000— OHを合成した。
実施例 38 - ,
Bo c— (Le u— Leu— A l a— La c) 5— Le u— As p (O E t ) ― 〇— PEG4。。。_OHの合成
HO-P EG400 o-OH 20 g (5mmo 1) を 300 mLテトラヒドロフ ラン （THF) に溶かし、 t-ブトキシカルボニル-ェチル -L-ァスパラギン酸 N -ヒドロキシコハク酸エステル B o c—A s p (OE t ) — ONSu 5. 4 g (15mmo 1 ) と 4—ジメチルァミノピリジン 0. 19 g (l. 5 mm o 1 ) を加えて、 室温で 3日撹拌した。 溶液を減圧濃縮し、 得られたオイルをジクロ口 メタン 40 OmLに溶かし、 この溶液を 10%クェン酸水溶液、 飽和炭酸水素ナ トリウム水溶液、 飽和食塩水で洗い、 無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。 溶液 を減圧濃縮し、 得られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。 結晶を温 TH Fに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量 19 g (収率 85%)。次いで、 Boc— As p (OE t)—〇— PEG4000— O— As p (OE t)— Bo c 1 8 g (4. O lmmo l) をジォキサン中の 4M— HC 1で処理し、 溶媒を減圧 留去すると固体の残查が得られた。 残査にエーテルを加えて、 得られた結晶をろ 過した。 NMRスペクトルは；の結晶が HC 1 · Η— As p (OE t) 一 O— P EG4000—〇Hであることを示した。 収量 15. 1 g (収率 90%)。 以下、 参 考例 2、 実施例 1〜4と同様に処理して、 Bo c— (L e u -L e u-A 1 a- Lac) 5-L e u-A s p (OE t ) — O— P E G4000— OHを合成した。 実施例 39
Boc— (Leu-Le u-A l a-Lac) 5-Leu-Phe-0-PEG4 。。。一 OHのモルモッ卜における静脈内単 HI投与毒性試験
動物種としては、 Ha r t 1 e y系雄性モルモッ、卜、 10週齢、 体重 338— 490 gを用いた。被検物質として B o c - (L e u-L e u-A 1 a-Lac) 5— Leu— Phe— O— PEG4000—〇H (投与量 2 Omg/k g),対照と して H〇— PEG4000— OH (投与量 10mgZkg)、 陰性対照として生理 食塩水を用いた。 これらの 質は所定の濃度となるように生理食塩水で溶解し、 超音波処理を行った後、 0. 22 mのメンブラン ·フィルターを通し,て濾過滅 菌を行った。 また生理食塩水も同様に 0. 22 mのメンブラン ·フィルターを 通し濾過滅菌を行った。 1群 5匹のモルモットに、 生理食塩水、 HO— PEG4。 00—〇H 、 及び B o c— (Leu-Leu-A l a-La c) 5— Leu— P h e— O— PEG4。。。— OHを lmlZk gで 1分間かけて前肢の静脈内に単 回投与し、 24時間観察を行った。 その後 1ヶ月間、 週 1回体重を測定するとと もに一般状態も観察した。 その結果、 Bo c— (Leu-Le u-A l a-L a c) 5-L e u-P h e—〇一 P E G40。。—〇H及び HO— P E G4。。。一〇H の投与群において、 死亡例は見られなかった。 一般状態についても特に異常は見 られなかった。 また体重についても、 特記すべき変化はみられなかった。 以上の こと力、ら、 Bo c— (Leu— Le u— A l a— La c) 5— Le u— Phe— 〇—PEG4。。。一 OHのモルモッ卜における静脈内単回投与による毒性はみと められなかった。
実施例 40
Boc— (Leu-Le u-A l a-Lac) 5— L e u— P h e—〇一 P E G4 。00—〇Hのモルモットを用いた能動全身性アナフィラキシー （ASA) 反応試 験
動物種として、 Ha r t l'e y系モルモット、 7週齢、 体重 380— 510 g を用いた。 動物感作において、 被検物質として Bo c— （Leu— Leu— A 1 a-La c) 5-L e u-P h e -O-PEG4000 -OH (投与量 l OmgZ kg), 陽性対照として卵白アルブミン （投与量 1 OmgZkg), 陰性対照とし、 て生理食塩水を用いた。 これらの物質は所定の濃度となるように生理食塩水を用 いて調整し等量の FCA (F r e un d' s c omp l e t e a d j u v a n t)、 もしく fま F IA (F r e und' s i nc omp l e t e a d j u v an t)を加え、 wZoェマルジヨンを作製した。初回に FCAェマルジヨンを、 第 2 · 3週目に F I Aェマルジヨンを投与量 2 SmlZkgとして背部皮下及 び f oo t p adに投与し感作した。 惹起反応としては、 被検物質として Bo c― (Leu— Le u— A l a— Lac) 5— Leu— Phe— O— PEG4000 -OH (投与量 4 OmgZk g)、 陽性対照として卵白アルブミン 0. 4m g/k g)、陰性対照として生理食塩水を用いた。 これらの物質は所定の濃度とな るように生理食塩水を用いて調整した。 第 5週目に投与量 1. OmlZkgとし て、 前肢もしくは後肢の静脈に誘発投与し、 4時間観察を行った。 その後 1ヶ月 間、 週 1回体重を測定するとともに一般状態も観察した。 動物数は Bo c— (L e u— L e u— A l a— L a c ) 5— L e u— Ph e— O— PEG4000— OH 群： 4匹、 卵白アルブミン群： 3匹、 生理食塩水群： 3匹とした。 その結果、 B o c— (Le u— Leu— A l a— La c) 5— Leu— Phe— O— PEG40 00— OHはアナフィラキシ一反応を示さなかった。 その後の一般状態及び体重に ついても特に異常は見られなかった。 陽性対照となる卵白アルブミン投与群にお いては、 誘発投与直後にすべての個体にアナフィラキシー症状が観察された。 以 上のことから、 Bo c— (Le u-Le u-A l a-Lac) 5— Le u— Ph e—〇—PEG40。。一 OHのモルモットを用いた能動全身性アナフィラキシ一 (ASA) 反応試験は陰性であり、 抗原性がないことがわかった

Claims

1. アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントならびに ポリアルキレンォキシドからなる親水性セグメントを有しそして疎水性セグメン トの親水性セグメン卜と結合していない末端がァミノ酸単位からなることを特徴 とする、 生体適合性ブロック共重合体。 請
2. 下記式 （1)
R「 〔[- NHCH(R2) CO -] n - {_〇 [CH(R3)] kCO-} m -〕 p — [— NHCH(R2) CO 8
— ] q—〇一 [つ一 CH(R4) CH2〇_] r一 R5
範
(1) .
囲
(式中、 は水素原子、 アルキル基、 置換されたアルキル基またはァミノ基の 保護基であり ； R2は天然 ミノ酸の側鎖またはその誘導基であり ； R3は水素 原子、 アルキル基または置換されたアルキル基であり ； R4は水素原子またはメ チル基であり ； R5,は水素原子、 アルキル基、 置換されたアルキル基、 リガンド 残基、 連結基を有するリガンド残基、 R「 〔[― NHCH(R2) CO— ] n— {— O [CH(R3)] kC〇— } m—〕 p— [-NHCH(R2) CO-] q—で表わされ る基であり ； nは 1〜 20の整数であり ； kは 1〜 6の整数であり ； mは 1〜 2 0の整数であり ； pは 1〜 20の整数であり ； Qは 0〜 20の整数でありそして rは 2〜870の整数である） で表わされる請求項 1に記載の生体適合性ブロッ ク共重合体。
3 アミノ酸が、 ァラニン、 バリン、 ロイシン、 イソロイシン、 フエ二ルァラ ニン、 グルタミン酸、 ァスパラギン酸、 リジン、 アルギニンおよびそれらの側鎖 における誘導体よりなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸である請求項 1または 2に記載の生体適合性ブロック共重合体。
4 ヒドロキシカルボン酸が、 グリコール酸、 乳酸、 ヒドロキシ酪酸、 ヒドロ キシ吉草酸、 ヒドロキシカブロン酸およびヒドロキシカプリン酸よりなる群から 選ばれる少なくとも一つのヒドロキシカルボン酸である請求項 1〜3のいずれか に記載の生体適合性プロック共重合体。
る請求項 1〜 4のいずれかに記載の生体適合性プロック共重合体。
6 親水性セグメントのポリアルキレンォキシドの数平均分子量が 1 0， 0 0 0以下である請求項 1〜 5のいずれかに記載の生体適合性プロック共重合体。
7 親水性セグメントのポリアルキレンォキシドがポリ（エチレンォキシドノ プロピレンォキシド）ブロック共重合体である請求項 1〜 6のいずれかに記載の 生体適合性プロック共重合体。 8 疎水性セグメン卜が、 デブシぺプチドである請求項 1に記載の生体適合性 ブロック共重合体。
9 式（ 1 )の R 5のリガンド残基を生じるリガンドが、 レクチン、 抗体、 抗体 フラグメント、 ホルモン、 接着因子、 トランスフェリンまたは葉酸である請求項 2に記載の生体適合性プロック共重合体。
1 0 . 請求項 1〜 9のいずれかに記載の生体適合性プロック共重合体の疎水性 セグメントが内核を形成しそして親水性セグメントが外殻を形成してなるミセル。 1 1 . 請求項 1〜9のいずれかに記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物か らなりそして内核が疎水性セグメン卜と薬物からなり外殻が親水性セグメントか らなるミセル。
1 2 . 請求項 1〜 9のいずれかに記載の生体適合性プロック共重合体と薬物か らなる微粒子（ミセルを除く）。
1 3 . 請求項 1〜 9のいずれかに記載の生体適合性プロック共重合体と薬物か 5 らなる複合体（ミセルを除く）。
1 4 平均粒子径が 5 n m〜 3 0 0 n mである請求項 1 0または 1 1に記載の ■ ミセル。 0 1 5 . 薬物が、抗炎症薬、解熱薬、鎮痛薬、抗関節炎薬もしくは抗リウマチ薬、 抗痛風薬、強心薬、抗狭心症薬、ベータ遮断薬、 カルシウム拮抗薬、 抗不整脈薬、 利尿薬、 抗高血圧薬、 末梢循環障害改善薬、 抗血栓薬、 抗高脂血症薬、 抗血小板 薬、 昇圧薬、 脳循環代謝改善薬、 抗腫瘍薬、 免疫抑制薬、 抗アレルギー薬、 抗ヒ ス夕ミン薬、 気管支拡張薬、 抗喘息薬、 鎮咳薬、 去痰薬、 抗潰瘍薬、 It瀉薬、 制5 吐薬、 抗糖尿病薬、 催眠薬 ·鎮静薬、 抗不安薬、 抗精神病薬、 抗うつ薬、 抗眩暈 薬、 抗てんかん薬、 筋弛緩薬、 抗パーキンソン病薬、 自律神経系作用薬、 抗生物 質、 抗菌薬、 抗真菌薬、 抗ウィルス薬、 駆虫薬、 ホルモン薬、 抗骨粗鬆症 ·骨代 謝改善薬、 ビタミン薬、 止血薬、 酵素薬、 ワクチン、 麻酔薬、 診断薬、 造影薬ま たは検査薬である請求項 1 1〜1 4のいずれかに記載のミセル、 微粒子または複0 合体。
1 6 薬物が疎水性薬物である請求項 1 1〜1 4のいずれかに記載のミセル、 微粒子または複合体。 1 7 請求項 1 1〜1 4のいずれかに記載のミセル、 微粒子または複合体を含 有する医薬組成物。
1 8 . 投与形態が、 注射剤、 経口剤、 吸入剤， 経皮剤または経粘膜剤の形態に ある請求項 1 7に記載の医薬組成物。
1 9 . アミノ酸およびヒド'ロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリ アルキレンォキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重 合体と薬物を水中で混合することを特徴とする薬物を含有するミセルまたは複合 体の製造法。
2 0 . アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントおよび ポリアルキレンォキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック 共重合体、 薬物および溶媒からなる混合液を準備しそして該混合液から溶媒を除 去することを特徴とするミセル、 微粒子または複合体の製造法。
2 1 ' 請求項 1に記載の生体適合性ブロック共重合体の、 薬物と組み合わせて 生体に適用するための使用。 ，
2 2 請求項 1に記載の生体適合性ブロック共重合体の、 薬物とのミセル、 微 粒子または複合体を製造するための使用。
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