JP4259599B2 - 生体適合性ブロック共重合体、その用途および製造法 - Google Patents
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Description
これらの原因が引き起こす結果として、例えば、(1)注射液の調製が困難、(2)タンパク性医薬の経口投与が困難、(3)癌組織や脳、神経組織への薬物送達が不十分、(4)親水性薬物の粘膜吸収が不十分、(5)疎水性薬物の生体利用率が不十分、(6)サイトカインなどの早すぎる血中消失、(7)標的部位への移行性の欠如などが問題点として挙げられる。
これらの問題点を解決するためのアプローチは多数提案されている。例えば、(1)親水性高分子化合物とタンパク性薬物との結合体の形成、(2)能動輸送物質と薬物との結合体の形成、(3)リポソームヘの親水性薬物の封入、(4)ナノまたはマイクロメーターサイズの生分解性重合体微粒子への薬物の封入、(5)両親媒性の高分子物質と薬物による高分子ミセル形成などが挙げられる。しかし、薬物送達に関わる全ての問題に対する普遍的解決策はいまだ見出されていない。
生分解性重合体として、主鎖がアミド結合で連結したポリアミノ酸が挙げられる。しかしながら、アミド結合は分子間あるいは分子内で強固に水素結合して安定な高次構造を形成するため、ポリアミドを生分解によって分解するためには、この強固な水素結合で支持された高次構造を切断する必要があり、不安定構造を有するラセミ体や、イオン化する極性側鎖を有する特殊なポリアミノ酸を除き、完全には生分解されないことが明らかにされている(非特許文献1参照)。
生分解が可能な薬物送達用の高分子として、水酸基とカルボキシル基を分子内に有するヒドロキシカルボン酸がエステル縮合したポリオキシ酸が挙げられる。ポリオキシ酸においては、エステル結合が水素原子を有しないことから、エステル結合において水素結合が生じることがなく、ポリアミノ酸より容易に生分解されることが明らかにされている。更に、ヒドロキシカルボン酸と水から無触媒でヒドロキシカルボン酸を重合する方法が開発され、触媒の残渣の混入がないオリゴマーを重縮合したポリマーは、薬物送達システムに使用した場合、金属触媒を使用して生成したものと比較して異物反応を誘発するおそれがなく、また、分子間相互作用が弱いため成型も容易に行なえることから、薬物送達システムの好ましい材料とされている。ポリオキシ酸は低分子量の試料ほど生分解速度が速く、特に、低分子量ポリ−DL−乳酸が好ましい薬物送達システムとして採用されている(非特許文献2〜4参照)。
しかし、上記のいずれの文献にもアミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体並びにそれに基づくミセル形成、微粒子形成、複合体形成に関する記載はない。
更に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる生分解性プラスチックスとして、光学活性3−置換−2,5−モルホリンジオンと環状ラクトンを重合せしめたデプシペプチド共重合体や、ポリデプシペプチドから製造される生物吸収外科用装置等(特許文献24参照)や、特定のポリアミドユニット、特定のポリエステルユニットおよび特定のポリラクトンユニットとを有する生分解性ポリラクトンエステルアミド(特許文献25参照)が報告されている。また、特定のデプシペプチドと、ポリ乳酸とからなる重合体が、良好な生分解性を有し、強度を保持したまま、柔軟性を向上させること(特許文献26参照)が可能であることや、ラクチドと水酸基、アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選択される少なくとも1種の反応性置換基を有するε−カプロラクトンとを開環重合して得られる生分解性共重合体が、成形性が良好で各種の利用形態に応じた機能性を有すること(特許文献27参照)等が知られている。また、本発明者の一人がデプシペプチドの合成法並びに合成物を開示している(特許文献28参照)。
しかし、上記特許文献24、特許文献25、特許文献26、特許文献27、特許文献28のいずれの文献にも、同様に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体並びにそれに基づくミセル形成、微粒子形成、複合体形成に関する記載はない。
更に、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなるブロックとポリアルキレングリコールからなるブロックとからなる生分解性プラスチックスとして、三元ブロック共重合体が報告されている(特許文献29参照)。
しかし、この特許文献29にも、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリアルキレンオキシドからなる親水性セグメントを有する生体適合性ブロック共重合体並びにそれに基づくミセル形成、微粒子形成、複合体形成に関する記載はない。
R 1 −〔[−NHCH(R 2 )CO−] n −{−O[CH(R 3 )] k CO−} m −〕 p −[−NHCH(R 2 )CO−] q −O−[−CH(R 4 )CH 2 O−] r −R 5 ・・・(1)
(式中、R 1 は水素原子, アルキル基、置換されたアルキル基またはアミノ基の保護基であり; R 2 は天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基であり; R 3 は水素原子またはC 1 〜C 3 のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたC 1 〜C 3 アルキル基であり; R 4 は水素原子であり; R 5 は水素原子, C 1 〜C 3 のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたC 1 〜C 3 アルキル基、リガンド残基、連結基を有するリガンド残基またはR 1 −〔[−NHCH(R 2 )CO−] n −{−O[CH(R 3 )] k CO−} m −〕 p −[−NHCH(R 2 )CO−] q −で表わされる基であり;nは1〜10の整数であり;kは1〜6の整数であり;mは1〜5の整数であり;pは1〜20の整数であり;qは0〜6の整数でありそしてrは3〜570の整数である)。
本発明の生体適合性ブロック共重合体は、疎水性セグメントとしてのアミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる生体内分解性ブロックと、親水性セグメントとしてのポリエチレンオキシドからなる生体適合性ブロックからなる。具体的には、例えば生体内分解性の疎水性セグメントの末端に親水性セグメントを共有結合してなるブロック共重合体である。これらのセグメントは直接または連結基を有するスぺーサーを介して結合していても良い。このようなブロック共重合体は、下記式(1)
R1−〔[−NHCH(R2)CO−]n−{−O[CH(R3)]kCO−}m−〕p−[−NHCH(R2)CO−]q−O−[−CH(R4)CH2O−]r−R5 ・・・(1)
(式中、R 1 は水素原子, アルキル基、置換されたアルキル基またはアミノ基の保護基であり; R 2 は天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基であり; R 3 は水素原子またはC 1 〜C 3 のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたC 1 〜C 3 アルキル基であり; R 4 は水素原子であり; R 5 は水素原子, C 1 〜C 3 のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたC 1 〜C 3 アルキル基、リガンド残基、連結基を有するリガンド残基またはR 1 −〔[−NHCH(R 2 )CO−] n −{−O[CH(R 3 )] k CO−} m −〕 p −[−NHCH(R 2 )CO−] q −で表わされる基であり;nは1〜10の整数であり;kは1〜6の整数であり;mは1〜5の整数であり;pは1〜20の整数であり;qは0〜6の整数でありそしてrは3〜570の整数である)で表される。
本発明に用いられるブロック共重合体の疎水性セグメントは、上記式(1)中に示されるように、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる化合物である。用いられるアミノ酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はない。天然のL−α−アミノ酸だけでなく、DL−α−アミノ酸、D−α−アミノ酸、合成アミノ酸およびこれらアミノ酸の側鎖における誘導体も使用することができる。アミノ酸の具体例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、システイン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、4−ヒドロキシプロリン、ホモプロリン、ノルバリン、ノルロイシン、α−t−ブチルグリシン、シクロヘキシルグリシン、アスパラギン、グルタミンおよびβ−シクロヘキシルアラニンなどが挙げられる。これらのうち、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンが好ましく用いられる。さらに、これらのうちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンが特に好ましく用いられる。用いられるヒドロキシカルボン酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はないが、α−ヒドロキシカルボン酸だけでなく、その他のヒドロキシカルボン酸を用いることもできる。具体例としては、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシカプロン酸およびヒドロキシカプリン酸などが挙げられる。これらのうち、グリコール酸および乳酸が特に好ましく用いられる。
本発明に用いられるブロック共重合体の疎水性セグメントは、α−アミノ酸およびα−ヒドロキシカルボン酸からなるデプシペプチド化合物であってもよい。用いられるα−アミノ酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はないが、天然のL−α−アミノ酸だけでなく、DL−α−アミノ酸、D−α−アミノ酸、合成α−アミノ酸を使用することができる。α−アミノ酸の具体例としては、上記したアミノ酸のうちのα−アミノ酸およびその側鎖における誘導体が挙げられる。用いられるα−ヒドロキシカルボン酸としては、生体内分解性または生体適合性である限り特に限定はないが、上記したヒドロキシカルボン酸のうちのα−ヒドロキシカルボン酸であるグリコール酸および乳酸が特に好ましく用いられる。
デプシペプチドはその分子内にアミド結合とエステル結合を有し、そのアミド結合部分は水素原子を有するので分子間水素結合を形成して強固な分子間結合を形成するが、エステル結合部分は水素原子を有さないので分子間水素結合を形成しえず比較的加水分解されやすい。したがってアミド結合連鎖の中にエステル結合があるデプシペプチドは生体内で分解されやすく、その分解速度をアミノ酸の種類と数、ヒドロキシカルボン酸の種類と数およびその配列順序により制御することが可能である。またポリアミノ酸はしばしばその抗原性が問題となるが、アミノ酸数が約5以下のペプチドにおいてはほとんど抗原性を示さないとされている。デプシペプチドにおいては抗原性を示さないように分子設計することが可能である。ポリデプシペプチドはそれを構成するアミノ酸の種類とシーケンスの長さ、及びヒドロキシカルボン酸の種類によって全く異なる物理化学的特性を示す。アミノ酸が3個連結しヒドロキシカルボン酸が1個存在するテトラデプシペプチドシーケンスは、アミノ酸2個とヒドロキシカルボン酸1個のトリデプシペプチドシーケンスとは全く異なる溶媒への溶解性、二次構造の安定性、ミセル形成能などを示す。更に、アミノ酸の種類、ヒドロキシカルボン酸の種類を変化させれば様々な特性を有するポリデプシペプチドを合成することができる。
とりわけ、アミノ酸の配列を3〜5個とし次いでこれにヒドロキシカルボン酸を1〜3個結合させたポリデプシペプチドが好ましい。
式(1)で表されるブロック共重合体の疎水性セグメントのポリアミノ酸を構成するアミノ酸の数nは1〜10の整数であり、好ましくは1〜6の整数である。疎水性セグメントの親水性セグメント結合側のポリアミノ酸を構成するアミノ酸の数qは0〜6の整数である。疎水性セグメントのポリヒドロキシカルボン酸を構成するオキシ酸の数mは1〜5の整数である。アミノ酸ヒドロキシカルボン酸結合体の繰り返し数pは1〜20の整数であり、好ましくは1〜10の整数、より好ましくは1〜5の整数である。ヒドロキシカルボン酸のメチレン基および置換メチレン基の数kは1〜6の整数である。
なお、n、pまたはqが2〜20の整数の場合の複数のR2は同一でも異なっていてもよく、mまたはpが2〜20の整数の場合の複数のR3は同一でも異なっていてもよく、さらにrが2以上の場合の複数のR4も同一でも異なっていてもよい。
式(1)で表されるブロック共重合体の疎水性セグメントの末端R1は水素原子、アルキル基、置換されたアルキル基またはアミノ基の保護基である。アミノ基の保護基としては、例えばt−ブトキシカルボニル基(Boc−)、ベンジルオキシカルボニル基(Z−)、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc−)などが挙げられる。生体適合性である限り特に限定されないが、とりわけ、t−ブトキシカルボニル基(Boc−)が好ましく用いられる。
R2は天然アミノ酸の側鎖または誘導体化された側鎖(以下、誘導基と称する)を表し、アミノ酸単位ごとに、それぞれ独立に、天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基の一つを示す。誘導基を有するアミノ酸誘導体としては、例えばグルタミン酸5−誘導体、アスパラギン酸4−誘導体、リジンε−誘導体などが挙げられる。グルタミン酸5−誘導体、アスパラギン酸4−誘導体としては側鎖の末端カルボキシル基が保護基で保護された誘導体、メチルエステル、エチルエステルなどのアルキルエステル体、薬物の水酸基とのエステル体、薬物のアミノ基とのアミド体、スペーサー介在による薬物との結合体が挙げられる。また、リジン誘導体としては、例えばリジンの側鎖の末端アミノ基が保護基で保護された誘導体、薬物のカルボキシル基とのアミド体、スペーサー介在による薬物との結合体などが挙げられる。薬物との誘導体の他に、グルタミン酸5−エチルエステル単位、アスパラギン酸4−エチルエステル単位、末端アミノ基がベンジルオキシカルボニル基で保護されたリジン単位が好ましく用いられる。
R3はヒドロキシカルボン酸の側鎖を表し、ヒドロキシカルボン酸ごとに、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数1〜3のアルキル基またはそれが置換基で置換されたものである。かかるアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、を挙げることができる。また、置換基は、メチル基、エチル基もしくはプロピル基である。
本発明に用いられるブロック共重合体の親水性セグメントは、ポリエチレンオキシドからなり、より具体的には、ポリエチレングリコールである。式(1)において、エチレンオキシドの繰り返し数rは3〜570であり、好ましくは3〜250である。R4は水素原子である。
上記式(1)におけるR5は、水素原子、炭素数1〜3のアルキル基、またはそれがメチル基、エチル基もしくはプロピル基で置換基で置換されたもの、リガンド残基、連結基を有するリガンド残基または式 R1−〔[−NHCH(R2)CO−]n−{−O[CH(R3)]kCO−}m−〕p−[−NHCH(R2)CO−]q− で表される基である(ここでR1、R2、R3、n、k、m、pおよびqの定義は上記と同じである)を表す。
リガンドとしては、例えばレクチン、抗体、抗体フラグメント(例えば、Fab’フラグメントなど)、リンホカイン、サイトカイン、レセプタータンパク質(例えば、CD4、CD8、CD44,CD71など)、核酸、抗原、ホルモン、接着因子(例えば、VCAM−1、ICAM−1、 PECAM−1、RGD、NGR など)、トランスフェリン、葉酸、増殖因子(例えば、EGF、bFGF、VEGFなど)および所望の標的細胞と特異的に結合するものなどを挙げることができる。
本発明のブロック共重合体は、例えば、以下のようにして製造することができる。
(i)親水性セグメントであるポリエチレンオキシドの両末端ヒドロキシル基に、保護されたアミノ基を有するアミノ酸N−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを、ジメチルアミノピリジンを触媒として反応させることにより、両末端に保護されたアミノ基を有するアミノ酸がエステル結合したポリエチレンオキシドが得られる。この両末端にあるアミノ酸残基のアミノ保護基をジオキサン中塩酸で処理して除去する。この処理で、保護基が除去され両末端がジアミノアシル化されたポリエチレンオキシドまたは両末端の内の一方のアミノ酸が脱離し、一つのヒドロキシル基が再生したモノアミノアシル化ポリエチレンオキシドが得られる。
末端アミノ酸のアミノ基に、保護されたアミノ基を有するアミノ酸N−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを反応させて、保護ジペプチド結合ポリエチレンオキシドを得る。保護基をはずして生じたアミノ基に,末端アミノ基が保護され他末端がヒドロキシカルボン酸からなるオリゴデプシペプチドN−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを反応させる。このアミノ基保護オリゴデプシペプチドエステルの反応を繰り返すと,任意のアミノ酸,ヒドロキシカルボン酸配列をもつポリデプシペプチド疎水性セグメントとポリエチレンオキシド親水性セグメントからなるブロック共重合体が得られる。
(ii)ヒドロキシカルボン酸にハロゲンおよびハロゲン化チオニルを作用させてヒドロキシカルボン酸のハロゲン化物を得、これにアミノ酸またはポリアミノ酸をアルカリの存在下で反応させてデプシペプチドを得る。なお、アミノ酸がアミノ基とカルボキシル基の2つの官能基以外に、他の官能基を有する場合は、ポリデプシペプチドの製造中、他の官能基を保護基と結合させておくことが好ましい。次に、このアミノ酸誘導体を、アルカリの存在下、加熱することにより閉環させて、環状デプシペプチドを得ることができる。次いで、オクチル酸第一錫のような触媒の存在下、環状デプシペプチドとポリエチレンオキシド、モノ置換ポリエチレンオキシド、あるいは一方のヒドロキシル基が保護されたポリエチレンオキシドとを反応させることにより、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントとポリエチレンオキシドからなる親水性セグメントを有するブロック共重合体を得ることができる。
また、アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントは本発明者の一人が出願した特開2004−269462号公報に記載された方法によって合成することができる。すなわち、保護されたアミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基と、無保護のカルボキシル基を有するヒドロキシカルボン酸のヒドロキシル基とを、アミノピリジン化合物を触媒として反応させ、ジデプシペプチドを合成する。得られたジデプシペプチドのカルボキシル基をイミド誘導体とし、かつ、ジデプシペプチドの保護されたアミノ基の脱保護を行い、これらにより得られたジデプシペプチドの脱保護されたアミノ基と、保護されたアミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基とを反応させることにより、オリゴデプシペプチドが合成される。
ポリエチレンオキシドに保護アミノ酸あるいは保護オリゴデプシペプチドを結合させる反応はこれらを溶解する適当な溶媒例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル中で行うことができる。反応後は生成物をジクロロメタンあるいはクロロホルムに溶解し、次いでこれを炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸水溶液などで洗浄することにより副生成物を除去し、溶媒を留去した後、エーテルを加えて純粋な生成物を沈殿、単離する。必要であれば、本ブロック共重合体のテトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチルなどの溶液にエーテルを加えて再沈殿させ、精製する。この再沈殿法による精製は、ポリデプシペプチドを疎水性セグメントとする本ブロック共重合体に対して有効な方法である。ポリペプチド−ポリエチレンオキシドポリマーではポリペプチドのアミド結合に基づく水素結合が分子内、分子間および分子−溶媒間で強く形成され、再沈殿に適した溶媒−非溶媒の組み合わせを見いだすことが困難である。
本発明のブロック共重合体は、薬物とのミセル形成、薬物を含有する微粒子、薬物との複合体を製するだけでなく、リポソームなどの小胞体を製することにも使用することができる。また、目的に応じ、当該ミセル、微粒子または複合体をリポソームに含有せしめることもできる。
本発明のブロック共重合体は薬物と一緒に用いることができる。該薬物としては天然物、合成物、半合成物、発酵産物、生体由来物質、遺伝子工学の産物のいずれの生理活性化合物でも用いられる。また、合成生理活性化合物、ペプチド、タンパク質、ホルモン、ビタミン、酵素、補酵素、脂肪酸、脂質、遺伝子、これらの誘導体などのいずれでも用いられる。
薬物は、溶解性については、水不溶性、水難溶性、脂溶性、水溶性のいずれであってもよい。このような薬物としては、例えば、抗炎症薬(例えば、メフェナム酸、ブフェキサマク、フェルビナクなどの非ステロイド系薬物、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベクロメタゾンなどのステロイド系薬物など)、解熱薬(例えば、アセトアミノフェン、アルクロフェナク、ブフェキサマクなど)、鎮痛薬(例えば、アミノピリン、アセタミノフェン、モルヒネ、ブプレノルフィンなど)、抗関節炎薬/・抗リウマチ薬(例えば、オーラノフィン、アザチオプリン、メトトレキサートなど)、抗痛風薬(例えば、アロプリノール、プロベネシド、スルフィンピラゾンなど)、強心薬(例えば、オキシフェドリン、テオブロミンなど)、抗狭心症薬(例えば、アルプレノロール、ジルチアゼム、イソソルビドジニトレート、ニフェジピンなど)、ベータ遮断薬(例えば、塩酸プロプラノロール、アテノロール、カルベジロールなど)、カルシウム拮抗薬(例えば、ニフェジピン、ニカルジピン、ジルチアゼムなど)、抗不整脈薬(例えば、キニジン、ベラパミル、チモロールなど)、利尿薬(例えば、フロセミド、アルブチンなど)、抗高血圧薬(例えば、チモロール、カプトプリル、ニカルジピン、プラゾシンなど)、末梢循環障害改善薬(例えば、プロスタグランジン類など)、抗血栓薬(例えば、アルガトロバン、オザグレル、チクロピジンなど)、抗高脂血症薬(例えば、スタチン系薬物、フィブラート系薬物、プロビコールなど)、抗血小板薬(例えば、プロスタサイクリンなど)、昇圧薬(例えば、ドパミン、ノルエピネフリンなど)、脳循環代謝改善薬(例えば、塩酸チアプリド、スルピリソなど)、抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン、アクチノマイシン、メトトレキサート、シタラビン、シスプラチン、パクリタキセル、タモキシフェンなど)、免疫抑制薬(例えば、アザチオプリン、タクロリムス、シクロフォスファミドなど)、抗アレルギー薬(例えば、アゼラスチン、クロモリン、ペンチゲチドなど)、抗ヒスタミン薬(例えば、クロルフェニラミン、クレマスチン、ジフェンヒドラミンなど)、気管支拡張薬(例えば、アルブテロール、イソプロテレノール、臭化イプラトロピウムなど)、抗喘息薬(例えば、ツロブテロール、クレンブテロールなど)、鎮咳薬(例えば、リン酸コデイン、デキストロメトルファンなど)、去痰薬(例えば、アンブロキソール、カルボシステインなど)、抗潰瘍薬(例えば、セトラキサート、ラニチジン、シメチジンなど)、止瀉薬(例えば、アセチルタンニン酸、ジフェノキシンなど)、制吐薬(例えば、ジフェニドール、スコポラミンなど)、抗糖尿病薬(例えば、ビグアニド系物質、インスリン、トルブタミド、クロルプロパミドなど)、催眠薬・鎮静薬(例えば、ニトラゼパム、フルラゼパム、アモバルビタールなど)、抗不安薬(例えば、ジアゼパム、オキサゾラムなど)、抗精神病薬(例えば、ハロペリドール、ベルフェナジン、クロルプロマジンなど)、抗うつ薬(例えば、ジメタザン、イミプラミン、スルピリドなど)、抗眩暈薬(例えば、ジメンヒドリナート、塩酸ジフェニドール、メシル酸ベタヒスチンなど)、抗てんかん薬(例えば、カルバマゼピン、フェノバルビタール、5−ヒドロキシトリプトファンなど)、筋弛緩薬(例えば、塩化ツボクラリン、バクロフェン、メトカルバモールなど)、抗パーキンソン病薬(例えば、アマンタジン、カルビドパなど)、自律神経系作用薬(例えば、ベタネコール、ネオスチグミンなど)、抗生物質(例えば、アミノグリコシド系物質、セファロスポリン系物質、マクロライド系物質など)、抗菌薬(例えば、キノロン系物質、スルフォナミド系物質、スルホン系物質など)、抗真菌薬(例えば、アリルアミン系物質、エコナゾールなどのイミダゾール系物質、フルコナゾールなどのトリアゾール系物質など)、抗ウィルス薬(例えば、アシクロビル、シタラビン、アマンタジンなど)、駆虫薬(例えば、アミノピリン、ニクロサミド、キナクリンなど)、ホルモン薬(例えば、ソマトスタチン、ゴナドトロピン、LHRHなど)、抗骨粗鬆症・骨代謝改善薬(例えば、ビタミンD、カルシトニン、ビスフォスフォネートなど)、ビタミン薬(例えば、トコフェロール、ビタミンB12など)、止血薬(例えば、トラネキサム酸など)、酵素薬(例えば、プロナーゼ、リゾチーム、セラペプターゼなど)、ワクチン(例えば、インフルエンザワクチン、コレラワクチンなど)、麻酔薬、診断薬、造影薬、検査薬などが用いられる。
疎水性薬物としては、例えば、非ステロイド性抗炎症薬(例えば、インドメサシン、ナプロキセンなど)、ステロイド性抗炎症薬(例えば、デキサメタゾン、吉草酸デキサメタゾン、パルミチン酸デキサメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、酢酸パラメタゾン、酢酸ハロプレゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、ブチル酢酸プレドニゾロン、吉草酸酢酸プレドニゾロン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾンなど)、抗腫瘍薬(例えば、パクリタキセル、カンプトテシン、エポトシド、ビンブラスチン、フルオロウラシル、メトトレキサート、テガフール、テガフール・ウラシル、マイトマイシンC、シスプラチン、カルボコン、ダカルバジン、メルカプトプリン、アクチノマイシンD、塩酸ドキソルビシン、クエン酸タモキシフェンなど)、解熱鎮痛薬(例えば、イブプロフェン、ブプレノルフィンなど)、抗喘息薬(例えば、アゼラスチン、ケトチフェン、プロピオン酸フルチカゾンなど)、抗うつ薬(例えば、オキシペルチン、ネフォパムなど)、抗痛風薬(例えば、アロプリノール、コルヒチン、スルフィンピラゾン、プロベネシドなど)、中枢神経系薬(例えば、アニラセタムなど)、抗高血圧薬(例えば、カプトプリル、エナラプリル、塩酸マニジピンなど)、抗血小板薬(例えば、プロスタグランジン類など)、抗高脂血症薬(例えば、クロフィブラート、ガンマーオリザノールなど)、気管支拡張薬(例えば、テオフィリン、塩酸メトキシフェナミン、塩酸ツロブテロールなど)、抗アレルギー薬(例えば、エメダスチン、トラニラスト、テルフェナジンなど)、抗尿失禁薬(例えばカプロン酸ゲストノロンなど)、抗ウィルス薬(例えば、アシクロビル、リバビリンなど)、蛍光色素(例えば、ピレン系蛍光色素、ローダミン系蛍光色素など)などが用いられる。
その他、薬物としては、黄体形成ホルモン放出ホルモンおよび誘導体または類縁体、インスリンおよび誘導体または類縁体、ソマトスタチンおよび誘導体または類縁体、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、プロラクチン、エリスロポイエチン、副腎皮質ホルモンおよび誘導体または類縁体、メラノサイト刺激ホルモン、甲状腺ホルモン放出ホルモンおよび誘導体または類縁体、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、バソプレシンおよび誘導体、オキシトシン、カルシトニンおよび誘導体または類縁体、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤ラクトーゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、エンケファリンおよび誘導体または類縁体、エンドルフィン、キョウトルフィン、タフトシン、サイモポイエチン、サイモシン、サイモチムリン、胸腺液性因子、血中胸腺因子およびその誘導体、コロニー誘導因子(例えば、CSF、GCSF、GMCSF、MCSFなど)、モチリン、デイノルフィン、ボンベシン、ニューロテンシン、セルレイン、ブラジキニン、心房性ナトリウム排泄増加因子、神経成長因子、細胞増殖因子(例えば、EGF、TGF−β、PDGF、酸性FGF、塩基性FGFなど)、神経栄養因子(例えば、NT−3、NT−4、CNTF、GDNF、BDNFなど)、エンドセリン拮抗作用を有するペプチド類およびその類縁体などが挙げられる。
本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物含有ミセルを調製するには、例えば、薄膜水中攪拌法、溶液水中希釈法、透析法などが用いられ、これらは単独あるいは組み合わせて用いられる。
本発明のブロック共重合体のうちミセル形成能を有するブロック共重合体の少なくとも1種類と薬物を溶媒に溶解後、容器に入れ、溶媒を除去して薄膜を形成させる。これに水を加え、攪拌しミセルを形成させる。ここで用いる溶媒としては、該ブロック共重合体と薬物を溶解できるものであれば特に限定するものではないが、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドなどが用いられる。いずれも単独だけでなく、組み合わせて使用することもできる。また、その他の溶媒であっても該ブロック共重合体が析出しない程度に溶媒中に添加することもできる。水相には添加剤を添加してもよい。添加剤としては、例えば、pH調整剤(例えば、リン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、希塩酸、水酸化ナトリウムなど)、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸等の乳化剤やマンニトールなどの糖類が用いられる。調製温度は約0℃〜約80℃が好ましく、さらに好ましくは約5℃〜約50℃である。さらに、水中攪拌時に外的剪断力や超音波照射を付与することや減圧条件下で常法に従ってエバポレーターなどで残存溶媒を除去することもできる。外的剪断力を付与する装置としては、例えば、タービン型攪拌機や、ホモジナイザーなどが挙げられる。
本発明のブロック共重合体のうちミセル形成能を有するブロック共重合体の少なくとも1種類と薬物を溶媒に溶解後、攪拌下少量ずつ水に添加し、溶媒を水中に除去して高分子ミセルを調製する。ここで用いる溶媒としては、水に混和できるものであれば特に限定するものではないが、例えば、メタノール、エタノール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、あるいはこれらと水の混液などが用いられる。溶媒は単独であるいは2種以上組み合わせて使用することができる。なかでもテトラヒドロフランとアセトンと水の組み合わせが好ましく用いられる。該ブロック共重合体にとっての良溶媒とはポリマーの組成により当然変化するものであるため、使用するポリマーに応じて溶媒の選択を行うのが好ましい。水相には上記薄膜水中攪拌法の項で記載した水相における添加剤を同様に添加してもよい。調製温度は約0℃〜約80℃が好ましく、さらに好ましくは約5℃〜約50℃である。さらに、溶液水中希釈時に外的剪断力や超音波照射を付与することや減圧条件下で常法に従ってエバポレーターなどで溶媒を除去することや通気法によって溶媒を除去することもできる。外的剪断力を付与する装置としては、例えば、タービン型攪拌機や、ホモジナイザーなどが挙げられる。
本発明のブロック共重合体のうちミセル形成能を有するブロック共重合体の少なくとも1種類と薬物を溶媒に溶解後、透析チューブに入れ水中で透析し、溶媒を除去してミセルを形成させる。ここで用いる溶媒としては、該ブロック共重合体を溶解でき、水に混和できるものであれば特に限定するものではない。例えば、メタノール、エタノール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリルなどが用いられる。いずれも単独だけでなく、2種以上組み合わせて使用することもできる。また、その他の溶媒も該ブロック共重合体および薬物を析出しない程度に溶媒中に添加することもできる。ブロック共重合体と溶媒の比率は特に限定されるものではない。また、透析膜としては、用いるブロック共重合体の分子量により適切な分子量分画サイズを選択すればよく、セルロース膜などを用いることが多いが、これに限定されるものではない。また、透析溶液には添加剤を添加してもよい。添加剤としては、例えば、pH調整剤(例えば、リン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、希塩酸、水酸化ナトリウムなど)、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸等の乳化剤やマンニトールなどの糖類が用いられる。透析時間は、通常1回約5分〜約24時間であるが、外水相の液交換操作を1回以上繰り返すことでミセルを調製する。調製温度は約0℃〜約80℃が好ましく、さらに好ましくは約5℃〜約50℃である。これによって調製できたミセルは透析膜中で透明からやや白濁した状態で得ることができる。
本発明において、疎水性/親水性セグメントを有するブロック共重合体が形成しうるミセルの形態は、調製方法により変えることが可能である。ブロック共重合体を有機溶媒に溶解または分散後、多量の水溶液中でミセルを調製した場合は、O/W型となり疎水性セグメントを内核にしてそして親水性セグメントを外殻に配した形態となる。また、逆にブロック共重合体を水溶液中で溶解または分散した後、多量の有機溶媒内でミセルを調製した場合、W/O型となり親水性セグメントを内核にして疎水性セグメントを外殻に配した形態となる。通常は、例えば、疎水性セグメントを内核として親水性セグメントを外殻とするコア/シェル型ミセルである。その場合ブロック共重合体の疎水性セグメントが集合して高密度に凝集してコアを形成し、親水性セグメントは粒子表面から外に向いて延びていると推察される。また、親水性セグメントの末端を保護または修飾した場合には、親水性セグメントの部分的凝集の存在も考えられる。これらの調製方法も目的に応じて変えることができる。例えば、薬物を封入する場合、その薬物の水あるいは有機溶媒への溶解度や安定性などの物性によって決められる。
上記いずれの調製方法においても薬物含有ミセル形成後に水に分散した状態で凍結乾燥または真空乾燥を行い、乾燥粉末として保存できる。乾燥操作中の凝集抑制を目的として添加剤を添加することもできる。添加剤としては、例えば、マンニトール、ラクトース、ブドウ糖、トレハロース、デンプン類、ヒアルロン酸あるいはこれのアルカリ金属塩、水溶性多糖、ポリエチレングリコール、グリシン、フィブリン、コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類などが用いられる。添加剤の添加量は、ミセルを再分散した時に凝集抑制が達成される範囲であれば、特に制限されない。
親水性セグメントにリガンドを結合させた本発明のブロック共重合体は、生体内でのターゲティング能を有する。本発明に基づく高分子ミセルは比較的穏やかな条件で調製することができるためリガンドの活性維持、不安定性な薬物の封入に適している。また疎水性セグメントと親水性セグメントの分子量を適切に変えることにより粒子径の調整が可能となるので、粒子径を調製して薬物を封入した製剤では血中滞留性を調節することも可能である。また、本発明のブロック共重合体は、上記性能からも理解されるように、疎水性化合物の水への可溶化にも利用できる。
高分子ミセルは、通常疎水性セグメントを核とする製剤であるため、封入する薬物は疎水性であるのが好ましいが、水溶性であっても疎水性部分を持つ化合物にあってはその疎水性部分で本ブロック共重合体とミセルを形成することも可能である。また、特定臓器(例えば、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脳など)または疾患部位・臓器(例えば、癌、炎症部位など)に指向することにより、薬効を増強できるものや、血中滞留性を延長することで薬効を増強できるものが好ましい。
本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物含有微粒子を調製するには、例えば、水中乾燥法、超音波処理法、凍結乾燥法などが用いられ、これらは単独あるいは組み合わせて用いられる。
本発明のブロック共重合体のうち微粒子形成能を有するブロック共重合体の少なくとも1種類と薬物を溶媒に溶解後、攪拌下少量ずつ水に添加し、溶媒を水中に除去または拡散せしめて微粒子を調製する。ここで用いる溶媒としては、該ブロック重合体と薬物を溶解するものである限り特に限定するものではない。例えば、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、あるいはこれらと水の混液などが用いられる。これらを単独であるいは2種以上溶媒と組み合わせて使用することができる。水相には上記薄膜水中攪拌法の項で記載した水相における添加剤を同様に添加してもよい。有機溶媒に対しては水の量は任意に選択できる。調製温度は約0℃〜約80℃が好ましく、さらに好ましくは約5℃〜約50℃である。さらに、水中乾燥時に外的剪断力を付与することや通気により溶媒を除去することや減圧条件下でエバポレーターなどで溶媒を除去することもできる。外的剪断力を付与する装置としては、例えば、タービン型攪拌機やホモジナイザーなどが挙げられる。
本発明のブロック共重合体のうち微粒子形成能を有するブロック共重合体の少なくとも1種類と薬物を適切な溶媒で溶解して多量の水中に分散させる。装置の形状、処理量によって一概に決定できないが、例えば、1W〜約200W、好ましくは1W〜約10Wの範囲で1秒〜約24時間、より好ましくは1分〜約5時間超音波照射を行う。調製温度は約0℃〜約80℃の範囲で行われるが、好ましくは約5℃〜50℃である。上記の水中乾燥法と組み合わせて行われることが多い。
本発明の微粒子におけるブロック共重合体の含有割合は、微粒子全体に対して、通常10〜100重量%、好ましくは30〜100重量%である。本発明の微粒子に薬物が含まれる場合、本発明の微粒子における薬物の含有割合は、治療上の必要量により定まるものであり、特に限定されない。本発明の微粒子は、例えば、分散剤(ポリソルベート80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60などの界面活性剤;カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウムなどの多糖類;硫酸プロタミン;ポリエチレングリコール400など)、保存剤(例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルなど)、等張化剤(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など)、油脂類(例えば、ゴマ油、コーン油など)、リン脂質(例えば、レシチンなど)、賦形剤(例えば、乳糖、コーンスターチ、マンニトール、セルロースなど)、結合剤(例えば、ショ糖、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストリンなど)、崩壊剤(例えば、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど)などと混合されていてもよい。
本発明のブロック共重合体を構成成分とする薬物複合体粒子を調製するには、例えば、水中混練法などが用いられる。該ブロック共重合体の水溶液に薬物を添加して混練することにより薬物複合体を製することができる。混練を効率よく行うことにより、ナノオーダーの薬物結晶と本ブロック共重合体との複合体を形成せしめることができ、薬物の懸濁状態が安定に保たれる。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子を注射剤または埋め込み剤とするには、これらを界面活性剤(例えば、ポリソルベート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など)、分散剤(例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸ナトリウムなど)、保存剤(例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルなど)、等張化剤(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖、プロリンなど)、緩衝剤(例えば、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウムなど)と共に水性液剤、水性懸濁剤とするか、ゴマ油、コーン油などの植物油と共に分散して油性懸濁剤とすることができる。水性液剤、水性懸濁剤は凍結乾燥により凍結乾燥製剤とすることもできる。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子を無菌製剤にするには、無菌濾過、無菌充填工程を経る方法、ガンマ線滅菌する方法、防腐剤を添加する方法、全製造工程を無菌化する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子は、哺乳動物に対して安全な医薬として用いることができる。本発明の薬物を含有したミセルまたは微粒子の投与量は、主薬である薬物の種類と含量、剤形、投与経路、対象疾患、対象動物などによって種々異なるが、薬物の有効量であればよい。投与回数は1日1〜数回、1週間に1回、2週間に1回、1か月に1回、または数か月に1回など主薬である薬物の種類と含量、剤形、投与経路、対象疾患、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
アミノアシルポリエチレングリコールの合成
平均分子量4,000のポリエチレングリコール(HO−PEG4000−OH)200g(0.05モル)を400mLのアセトニトリルに溶かした。この溶液にt−ブトキシカルボニル−L−フェニルアラニン−N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル(Boc−Phe−ONSu)55g(0.15モル)と4−ジメチルアミノピリジン2.65g(0.015モル)を加えて2日間室温で撹拌した。反応後、溶媒を減圧留去後、残査を600mLのジクロロメタンに溶かし、10%クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗った。溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を濃縮し、残査にエーテルを加えて結晶化させた。得られた粗生成物をアセトリトリルに溶かし、450nmのメンブランフィルターでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残査にエーテルを加えて再結晶させた。このもののNMRスペクトルはHO−PEG4000−OHの両末端にBoc−Pheがエステル結合により結合したBoc−Phe−O−PEG4000−O−Phe−Bocであることを示した。収量215g(94%)。次いで、Boc−Phe−O−PEG4000−O−Phe−Boc 90g(0.02モル)をジオキサン中の4M−HClで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。NMRスペクトルはこの結晶がHCl・H−Phe−O−PEG−OHであることを示した。77.8g(93%)。
アミノアシルポリエチレングリコールへのt−ブトキシカルボニル−L−ロイシンの導入
上記ポリエチレングリコール−L−フェニルアラニネート塩酸塩 38.9g(0.01モル)をアセトニトリル(ACN)−テトラヒドロフラン(THF) 1:1混合溶媒300mLに溶かし、N−メチルモルホリン(NMM)1.15mL(0.0105モル)を加え、これにt−ブトキシカルボニル−L−ロイシン−N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル(Boc−Leu−ONSu)4.92g(0.015モル)を加えて室温で1夜撹拌した。反応終了後、溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を10%炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。
得られたBoc−Leu−Phe−O−PEG4000−OHをTHFに溶かし,エーテルを加えて再結晶させた。41g(94%)。
t−ブトキシカルボニル−L−ロイシル−L−ロイシル−L−アラニル−L−乳酸−N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル(Boc−Leu−Leu−Ala−Lac−ONSu)の合成
L−乳酸 45g(0.5モル)を500mLのTHFに溶かし,ピリジン40.5mL(0.5モル)を加えた。室温で撹拌しながらBoc−L−アラニン−ONSu 143g(0.5モル)を加え、更に4−ジメチルアミノピリジン6.1g(0.05モル)を加えた。室温で1.5日撹拌し、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル500mLに溶かし、クエン酸飽和水溶液、水で洗った。溶液を10%炭酸水素ナトリウム水溶液で3回抽出し、得られた抽出液を合わせてクエン酸で酸性にした。酸性水溶液を300mL酢酸エチルで3回抽出した。合わせた抽出液を水洗し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られたオイルにヘキサンを加えると結晶化した。酢酸エチルから再結晶し,純粋なBoc−L−アラニル−L−乳酸(Boc−Ala−Lac−OH)を得た。91g(7%)。このジデプシペプチドをジオキサン中の4M塩酸で処理し、Boc保護基を除去した。得られたジデプシペプチド塩酸塩を400mLのTHFに溶かし、撹拌しながら28mLのピリジンを加えた。この溶液に Boc−Leu−ONSu 121g(0.37モル)を加え,撹拌しながらNMM 38.5mL(0.35モル)を加えた。室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣を500mLの酢酸エチルに溶かした。この溶液を上記のように処理してBoc−Leu−Ala−Lac−OHを115g(88%)得た。このトリデプシペプチドのBoc基を除去し、Boc−Leu−ONSuと反応させてBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−OHを127g(85%)得た。このBoc−テトラデプシペプチドを400mLのTHFに溶かし、N−ヒドロキシコハク酸イミド(HOSu)34.5g(0.3モル)を加えた。溶液を−10℃に冷却し、55.4g(0.27モル)のジシクロヘキシルカルボジイミドを加えて,−10℃で3時間、室温で一夜撹拌した。溶液を500mLの酢酸エチルで希釈し、生じたジシクロヘキシル尿素の結晶を濾去し、濾液を減圧濃縮した。残渣にヘキサンを加えて結晶化させた。酢酸エチルから再結晶し、純粋なBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−ONSuを138g(90%)得た。
Boc−Leu−Leu−Ala−Lac−Leu−Phe−O−PEG4000−OHの製造
Boc−Leu−Phe−O−PEG4000−OH 40g(9.2ミリモル)を4M塩酸/ジオキサンで処理してBoc保護基を除去した。得られた塩酸塩をACN−THF(1:1)に溶かし、NMM 1mLを加えた。これにN−保護テトラデプシペプチド活性エステル、t−ブトキシカルボニル−L−ロイシル−L−ロイシル−L−アラニル−L−乳酸−N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル(Boc−Leu−Leu−Ala−Lac−ONSu)8.1g(13.9ミリモル)を加えて室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かして、10%炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られた結晶をTHF−エーテルで再結晶し、純粋なBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−Leu−Phe−O−PEG4000−OH 41.8g(96%)を得た。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)2−Leu−Phe−O−PEG4000−OHの製造
実施例1のBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−Leu−Phe−O−PEG4000−OHのBoc保護基を4M−塩酸/ジオキサンで処理して除去し、これに実施例1と同様な操作および条件でBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−ONSuを反応させると、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)2−Leu−Phe−O−PEG4000−OHが92%の收率で得られた。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)3−Leu−Phe−O−PEG4000−OHの製造
実施例2のBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)2−Leu−Phe−O−PEG4000−OHのBoc保護基を4M−塩酸/ジオキサンで処理して除去し、これに実施例1と同様な操作および条件でBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−ONSuを反応させると、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)3−Leu−Phe−O−PEG4000−OHが92%の收率で得られた。このものの比旋光度は[α]D 25=−13.1(c=1.0,CH3CN)であり、NMRスペクトル〔0.84ppm(42H)Leuの二つのCH3に基づく多重ピーク;1.2〜1.7ppm(48H)AlaおよびLacのβ−CH3,LeuのβCH2,γCH,Bocの三つのCH3に基づく多重ピーク;3.5ppm(360H)PEGのCH2に基づくシングルピーク;4.2〜4.9ppm14H)アミノ酸および乳酸のα−CHに基づく多重ピーク;7.2ppm(5H)Pheの芳香環水素に基づく多重ピーク;7.6〜8.5ppm(11H) アミド結合のNHに基づく多重ピーク〕はこのものがBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)3−Leu−Phe−O−PEG4000−OHであることを示した。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)4−Leu−Phe−O−PEG4000−OHの製造
実施例3のBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)3−Leu−Phe−O−PEG4000−OHのBoc保護基を4M−塩酸/ジオキサンで処理して除去し、これに実施例1と同様な操作および条件でBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−ONSuを反応させると、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)4−Leu−Phe−O−PEG4000−OHが95%の收率で得られた。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHの製造
実施例4のBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)4−Leu−Phe−O−PEG4000−OHのBoc保護基を4M−塩酸/ジオキサンで処理して除去し、これに実施例1と同様な操作および条件でBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−ONSuを反応させると、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHが95%の收率で得られた。このものの比旋光度は[α]D 25=−13.7(c=1.0,CH3CN)であり、NMRスペクトル〔0.84ppm(66H)Leuの二つのCH3に基づく多重ピーク;1.2〜1.7ppm(72H)AlaおよびLacのβ−CH3,LeuのβCH2,γCH,Bocの三つのCH3に基づく多重ピーク;3.5ppm(360H)PEGのCH2に基づくシングルピーク;4.2〜4.9ppm(22H)アミノ酸および乳酸のα−CHに基づく多重ピーク;7.2ppm(5H)Pheの芳香環水素に基づく多重ピーク;7.6〜8.5ppm(17H)アミド結合のNHに基づく多重ピーク〕はこのものがBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHであることを示した。
Boc−Leu−Leu−Ala−Lac−Leu−Phe−O−PEG600−O−Phe−Leu−Lac−Ala−Leu−Leu−Bocの製造
参考例1の平均分子量4,000のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量600のポリエチレングリコールを用い、以下参考例2、実施例1と同様に処理して、Boc−Leu−Leu−Ala−Lac−Leu−Phe−O−PEG600−O−Phe−Leu−Lac−Ala−Leu−Leu−Bocが96%の収率で得られた。
Boc−Leu−Leu−Ala−Lac−Leu−Phe−O−PEG1540−O−Phe−Leu−Lac−Ala−Leu−Leu−Bocの製造
参考例1の平均分子量4,000のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量1,540のポリエチレングリコールを用い、以下参考例2、実施例1と同様に処理して、Boc−Leu−Leu−Ala−Lac−Leu−Phe−O−PEG1540−O−Phe−Leu−Lac−Ala−Leu−Leu−Bocが95%の収率で得られた。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG6000−OHの製造
参考例1の平均分子量4,000のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量6,000のポリエチレングリコールを用い、以下参考例2、実施例1〜5と同様に処理して、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG6000−OHが95%の収率で得られた。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG20000−OHの製造
参考例1の平均分子量4,000のポリエチレングリコールに代えて、平均分子量20,000のポリエチレングリコールを用い、以下参考例2、実施例1〜5と同様に処理して、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG20000−OHが97%の収率で得られた。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OCH3の製造
平均分子量4,000のモノメトキシポリエチレングリコール(HO−PEG4000−OCH3) 200g(0.05モル)を400mLのアセトニトリルに溶かし、この溶液にt−ブトキシカルボニル−L−フェニルアラニン−N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル(Boc−Phe−ONSu)55g(0.15モル)と4−ジメチルアミノピリジン2.65g(0.015モル)を加えて2日間室温で反応させた。反応後、溶媒を減圧留去し、残査を600mLのジクロロメタンに溶かし、10%クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を濃縮し、残査にエーテルを加えて結晶化させた。得られた粗生成物をアセトニトリルに溶かし、450nmのメンブランフィルターでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残査にエーテルを加えて再結晶した。このもののNMRスペクトルはHO−PEG4000−OCH3の末端にBoc−Pheがエステル結合により結合したBoc−Phe−O−PEG4000−OCH3であることを示した。収量200g(94%)。次いで、Boc−Phe−O−PEG4000−OCH390g(0.02モル)をジオキサン中の4M−HClで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。NMRスペクトルはこの結晶がHCl・H−Phe−O−PEG−OCH3であることを示した。収量77.8g(93%)。以下、参照例2、実施例1〜5と同様に処理して、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OCH3を得た。
Boc−Leu−Leu−Ala−Hea−Ala−Phe−O−PEG4000−OHの製造
参考例1で合成したポリエチレングリコール L−フェニルアラニネート塩酸塩 38.9g(0.01モル)をアセトニトリル(ACN)−テトラヒドロフラン(THF)1:1混合溶媒300mLに溶かし、NMM 1.15mL(0.0105モル)を加え、これにt−ブトキシカルボニル−L−アラニン−N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル(Boc−Ala−ONSu)4.3g(0.015モル)を加えて室温で1夜撹拌した。反応終了後、溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を10%炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られたBoc−Ala−Phe−O−PEG4000−OHをTHFに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量39g(90%)。Boc−Ala−Phe−O−PEG4000−OH 43.2g(10ミリモル)を4M塩酸/ジオキサンで処理してBoc保護基を除去した。得られた塩酸塩をACN−THF(1:1)に溶かし、NMM 1mLを加えた。これにN−保護テトラデプシペプチド活性エステル、t−ブトキシカルボニル−L−ロイシル−L−ロイシル−L−アラニル−L−グリコール酸−N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル(Boc−Leu−Leu−Ala−Hea−ONSu)8.55g(15ミリモル)を加えて室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かして、10%炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られた結晶をTHF−エーテルで再結晶し、純粋なBoc−Leu−Leu−Ala−Hea−Ala−Phe−O−PEG4000−OH 42.1g(90%)を得た。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHの製造
実施例11のBoc−Leu−Leu−Ala−Hea−Ala−Phe−O−PEG4000−OHのBoc保護基を4M−塩酸/ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でBoc−Leu−Leu−Ala−Hea−ONSuを反応させると、Boc−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHが89%の收率で得られた。
Boc−Leu−Leu−Ala−Lac−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHの製造
実施例12のBoc−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHのBoc保護基を4M−塩酸/ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−ONSuを反応させると、Boc− Leu−Leu−Ala−Lac−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHが90%の收率で得られた。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)2−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHの製造
実施例13のBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHのBoc保護基を4M−塩酸/ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−ONSuを反応させると、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)2−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHが92%の收率で得られた。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)3−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHの製造
実施例14のBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)2−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHのBoc保護基を4M−塩酸/ジオキサンで処理して除去し、これに上記と同様な操作でBoc−Leu−Leu−Ala−Lac−ONSuを反応させると、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)3−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHが91%の收率で得られた。このものの比旋光度は[α]D 25=−11.2(c=1.0,CH3CN)であり、NMRスペクトル〔0.84ppm(60H)Leuの二つのCH3に基づく多重ピーク;1.1〜1.7ppm(66H)AlaおよびLacのβ−CH3,LeuのβCH2,γCH,Bocの三つのCH3に基づく多重ピーク;3.5ppm(360H)PEGのCH2に基づくシングルピーク;4.2〜4.9ppm(24H)アミノ酸、乳酸およびグリコール酸のα−CHに基づく多重ピーク;7.2ppm(5H)Pheの芳香環水素に基づく多重ピーク;7.6〜8.5ppm(17H)アミド結合のNHに基づく多重ピーク〕はこのものがBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)3−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−O−PEG4000−OHであることを示した。
Boc−{Glu(OEt)−Ala−Ala−Lac}4−Ala−Phe−OPEG4000−OHの製造
HCl・H−Ala−Phe−OPEG4000−OH 43g(10ミリモル)をTHFに溶かし、NMM 1.1mL及びBoc−Glu(OEt)−Ala−Ala−Lac−ONSu 8.6g(15ミリモル)を加えて、一夜室温で撹拌した。常法通り処理してBoc−Glu(OEt)−Ala−Ala−Lac−Ala−Phe−O−PEG4000−OH を41.7g(89%)得た。このBoc−テトラデプシペプチド活性エステルの反応を更に3回繰り返してデプシペプチド鎖長を延長して、最終的にBoc−{Glu(OEt)−Ala−Ala−Lac}4−Ala−Phe−O−PEG4000−OH を得た。
Boc−Phe−Lac−(Phe−Leu−Phe−Lac)2−Phe−O−PEG4000−OHの製造
ポリエチレングリコール L−フェニルアラニネート塩酸塩 38.9g(0.01モル)をアセトニトリル(ACN)−テトラヒドロフラン(THF)1:1混合溶媒300mLに溶かし、N−メチルモルホリン1.15mL(0.0105モル)を加え、これにt−ブトキシカルボニル−L−フェニルアラニル−L−ロイシL−フェニルアラニル−L−乳酸N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル(Boc−Phe−Leu−Phe−Lac−ONSu)10.4g(0.015モル)を加えて室温で1夜撹拌した。反応終了後、溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を10%炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。
得られたBoc−Phe−Leu−Phe−Lac−Phe−O−PEG4000−OHをTHFに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量45.4g(96%)。Boc−Phe−Leu−Phe−Lac−Phe−O−PEG4000−OH 47.3g(10ミリモル)を4M塩酸/ジオキサンで処理してBoc保護基を除去した。得られた塩酸塩をACN−THF(1:1)に溶かし、NMM 1.15mLを加えた。これにN−保護テトラデプシペプチド活性エステル、Boc−Phe−Leu−Phe−Lac−ONSu 10.4gを加えて室温で一夜撹拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かして、10%炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸飽和水溶液、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて結晶化させた。得られた結晶をTHF−エーテルで再結晶し、純粋なBoc−(Phe−Leu−Phe−Lac)2− Phe−O−PEG4000−OH 42.1g(90%)を得た。このDP−PEGを4M−HCl/ジオキサンで処理してBoc基を除去し、得られた塩酸塩にBpc−Phe−Lac−ONSuを常法通り反応させてBoc−Phe−Lac−(Phe−Leu−Phe−Lac)2− Phe−O−PEG4000−OH38.7g(95%)を得た。このものの比旋光度は[α]D 25=−12.2(c=1.0,CH3CN)であり、NMRスペクトル〔0.84ppm(12H)Leu の二つのCH3に基づく多重ピーク;1.2〜1.7ppm(24H)Lacのβ−CH3,LeuのβCH2,γCH,Bocの三つのCH3に基づく多重ピーク;3.5ppm(360H)PEGのCH2に基づくシングルピーク;4.2〜4.9ppm(11H)アミノ酸および乳酸のα−CHに基づく多重ピーク;7.2ppm(30H)Pheの芳香環水素に基づく多重ピーク;7.6〜8.5ppm(8H)アミド結合のNHに基づく多重ピーク〕はこのものがBoc−Phe−Lac−(Phe−Leu−Phe−Lac)2−Phe−O−PEG4000−OHであることを示した。
ミセルの製造
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH 300mgとパルミチン酸デキサメタゾン(DMP) 15mgを100mLナス形フラスコに取り、20mLのアセトニトリルに溶解した。この溶液から50℃で溶媒を減圧留去した。得られたフィルム状残渣に水100mLを加えて、フラスコを手で振って、残渣を水に溶解させた。DMPは水に不溶であるが、フィルム状残渣は完全に水に溶け、不溶分は全く析出せず、ミセルに取り込まれたことが示唆された。これにより、本ブロック共重合体は難溶性疎水性化合物を可溶化することができることが示された。
ミセルの製造とミセルの粒径
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−OPEG4000−OH 200mgとDMP 60mgをアセトニトリルに溶かし、常法通り処理し、生理的食塩水100mlを加えた。溶液はわずかに白濁したので、メンブランフィルターでろ過した。フィルター上には不溶分14mgが残った。従って、生理的食塩水溶液100mL中に46mgのDMPを含むミセルを調製することができた。このミセルの直径は102.5nmであった。
ミセルの製造
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)3−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−OPEG4000−OH 300mgとアシクロビル(AV) 10.5mgをアセトニトリルに溶かした。溶液を50℃で減圧濃縮し、残渣に水3mLを加えた。残渣はミセルを形成し容易に溶解した。
ミセルの製造
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−OPEG4000−OH 300mgとアシクロビル10.5mgをアセトニトリルに溶かした。溶液を50℃で減圧濃縮し、残渣に水3mLを加えた。残渣はミセルを形成し容易に溶解した。
ミセル形成の証拠
実施例18と同様と同様の重量、操作でBoc−Phe−Lac−(Phe−Leu−Phe−Lac)2−Phe−O−PEG4000−OHとDMPからなるミセルを調製し、これを凍結乾燥した。500MhzプロトンNMRにより、凍結乾燥試料をD2O及びジメチルスルホキシド−d6(DMSO−d6)中で測定した。D2O溶媒中で測定したスペクトルは3.8ppmにポリエチレンオキシドのメチレンプロトンに由来するピークと5.0ppmに系中に存在する水からのプロトンピークの2種類のピークしか観測されなかった。同じ試料のDMSO−d6中でのスペクトルにはBoc−Phe−Lac−(Phe−Leu−Phe−Lac)2−Phe−O−PEG4000−OHとDMPからのプロトンピークが全て観測された。この事実は、凍結乾燥試料をD2Oに再溶解するとミセルを保って溶解し、エネルギーの弱いラジオ波を用いたNMRスペクトルはミセルの外側に存在するポリエチレンオキシドのメチレンプロトンしか観測されず、ミセル内部に存在するデプシペプチドセグメント及びDMPは観測されなかったが、同じ凍結乾燥試料をDMSO−d6に溶解するとミセルが破壊され、試料中のBoc−Phe−Lac−(Phe−Leu−Phe−Lac)2−Phe−O−PEG4000−OHとDMPは分子状でDMSO溶液となり、NMRでは全てのプロトンが観測されたと考えられる。従って、このNMRスペクトルはBoc−Phe−Lac−(Phe−Leu−Phe−Lac)2−Phe−O−PEG4000−OHとDMPからなるミセルが形成されているといえる。
凍結乾燥によるミセルの凝集、破壊のないことの証明
Boc(Leu−Leu−Ara−Lac)3(Leu−Leu−Ara−Hea)2−Ara−Phe−OPEG4000−OH 500mgとDMP 100mgをアセトニトリルに溶解し、減圧で溶媒を留去した。残査に水50mLを加えてよく振った。一夜放置後、生じた不溶物を450nmのメンブランフィルターで濾過した。不溶物の重量は24mgであった。ろ液を2分割し、一方には250mg(サンプル1)、及び他方には125mg(サンプル2)のPEG4000を加えて凍結乾燥した。収量はそれぞれ477mgと413mgであった。サンプル1を26.6mg取り、生理的食塩水1mLを加えて手で軽く振ったところ15秒で透明な均一溶液となった。一方、サンプル2を20.0mg取り、同様な処理をしたところ、軽く振った後、45秒後には均一溶液になった。いずれも、凍結乾燥品は生理的食塩水に極めてすばやく溶解し、透明な均一溶液を与えた。粒径はそれぞれ105.5nm、 101.6nmであった。
ミセル内封薬物の放出性
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)3−(Leu−Leu−Ala−Hea)2−Ala−Phe−OPEG4000−OH 100 mgとDMP 5 mgからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約14,000、孔径約5nmの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたDMPを紫外分光光度計により測定した。24時間後に14%、48時間後に33%が放出された。
ミセル内封薬物の放出性
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH 100 mgとDMP 5 mgからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約14,000、孔径約5nmの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたDMPを紫外分光光度計により測定した。24時間後に2%、48時間後に4%が放出された。
ミセル内封薬物の放出性
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH 100mgとDMP 10mgからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約14,000、孔径約5nmの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたDMPを紫外分光光度計により測定した。24時間後に24%が放出された。
ミセル内封薬物の放出性
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH 100 mgとデキサメタゾン 5mgからなるミセル溶液を調製し、これを透過分子量約14,000、孔径約5nmの透析用セルロースチューブを用いて透析し、放出されたDMPを紫外分光光度計により測定した。10時間後に57%が放出され、その後の10時間では3%の放出しかなかった。これらのことから、薬物と本発明のブロック共重合体との親和性は、薬物ごとに大きな差異があり、薬物の化学的特性に適合するようにミセル中の疎水性セグメントのポリマー構造を薬物毎に構築することにより、ミセルの形成を制御できることが分かった。また、ミセル内に内封された薬物の放出性は薬物、本発明のブロック共重合体の構造と内封させる薬物量によりその放出性を制御できることが分かった。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5Leu−Phe−O−PEG4000−OHとfolic acidとの縮合物の合成
葉酸 4.4g(0.01モル)を100mLの酢酸に溶かし、0℃で塩化チオニル 1.2g(0.01モル)を滴下し、得られた溶液をBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5Leu−Phe−O−PEG4000−OH(0.005モル)とピリジン4mLを含むTHF溶液300mLに滴下し、室温で3時間反応させた。得られた溶液を減圧濃縮し、 酢酸エチルに溶かして、水、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を減圧濃縮しエーテルを加えて生成物を沈殿させた。THFから再沈殿させて精製されたBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5Leu−Phe−O−PEG4000−OHとfolic acidとの縮合物を得た。
微粒子の製造
Boc−Leu−Leu−Ala−Lac−Leu−Leu−Lys(Z)−Lac−Leu−Lac−Phe−O−PEG600−O−Phe−Lac−Leu−Lac−Lys(Z)−Leu−Leu−Lac−Ala−Leu−Leu−Boc 200mgとパルミチン酸デキサメタゾン10mgをアセトニトリル−THF(1:1)2mLに溶かし、スターラーで高速撹拌下、水を徐々に加えて100mLにした。その後、30分間撹拌した。溶液は白濁し、薬物を含有する微粒子が調製された。
複合体の製造
パルミチン酸デキサメタゾン10mgを乳鉢に取り、これに、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Ala−Phe−O−PEG4000−OH 100mgを15mLの水に溶かし超音波処理した水溶液1mLを加えて、乳棒で1分間混練した結果、パルミチン酸デキサメタゾン結晶は極微小の結晶状態で均一に分散し、この懸濁液は室温で十分に安定であった。一方、パルミチン酸デキサメタゾン10mgをメノウの乳鉢に取り、これに水1mLを加えて、メノウの乳棒で混練した場合には、パルミチン酸デキサメタゾンが水に全く親和性がなく、大きな塊のままで分散しなかった。このことから本発明ブロック共重合体は微小薬物結晶と安定な複合体を形成することが分かった。
薬理効果の持続性
実施例18と同様にして得たBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHとパルミチン酸デキサメタゾンからなるミセルを含有する注射液(生理食塩水)を調製し、デキサメタゾンとして0.5mg/kgの投与量になる様に雄性SDラット(5週令、n=3〜5)に静注した。薬剤投与7日後、ラットの右足に3%カラギーナン溶液0.1mlを皮下注し、浮腫による足体積増加を4時間後に測定した。比較として、上記したミセルに代えて、パルミチン酸デキサメタゾンのリピッドマイクロスフェア注射液(リメタゾン(登録商標)、三菱ウェルファーマ(株)製)、リン酸デキサメタゾンナトリウム注射液(デカドロン(登録商標)、万有製薬(株)製)、薬物不含有の生理食塩水を同量投与し、同様のタイムスケジュールで足体積を測定した。薬物不含有の生理食塩水では足体積が19.9±7.7%増加し、リメタゾンでは15.4±3.5%の増加をみた。しかし、上記のミセルは1.46±1.46%の増加しかなく、生理食塩水及びリメタゾンに対し、有意(P<0.01)な抗炎症効果が認められた。リン酸デキサメタゾンナトリウム注射液(デカドロン(登録商標)、万有製薬(株)製)を用いた実験においては、生理食塩水と比較し24時間後が最も強く抗炎症作用があり足体積増加は顕著に抑制されたが、3日目以降その効果は消失していた。このことより、本発明のミセルの薬理効果の持続性が明らかとなった。
ミセルの製造
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH 6mgとプロスタグランジンI2(PGI2)0.12mgを100mLナス形フラスコに取り、30mLのアセトニトリル−THF−エタノール(5:5:1)に溶解した。この溶液から溶媒を減圧留去した。得られたフィルムに蒸留水30mLを加えて、フィルムを水に溶解させた。フィルムは完全に水に溶けた。次いでUVスペクトルを測定した。3日後でも195nmに吸収極大をもつUVスペクトルは変化しなかった。またこの水溶液に3mgのPEG4000を加え、凍結乾燥した。凍結乾燥物を室温に24日保存した後でもUVスペクトルは変化しなかった。
ミセルの製造
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH 50mgとプロスタサイクリンであるベラプロストナトリウム5.0mgを100mLナス形フラスコに取り、30mLのアセトニトリル−THF−エタノール(5:5:1)に溶解した。この溶液から溶媒を減圧留去した。得られた固形物にpH4.5の酢酸緩衝液(0.1M)を1mL加え、超音波をかけ固形物を溶解させた。ベラプロストナトリウム単独では、このpHでは沈殿が生じるが、固形物はこのpHで完全に緩衝液に溶け、ミセルに取り込まれたことが示唆された。
ミセルの製造
パクリタキセル2.2mgとBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH 55mgを10mLのアセトニトリルに溶かし、溶媒を減圧留去した。
ガラス壁に残った透明なフィルムを水30mLに40℃で溶解した。パクリタキセルは水に不溶であるが、フィルムは完全に水に溶け、不溶分は全く析出せず、ミセルに取り込まれたことが示唆された。透明な均一溶液をメンブランフィルターでろ過して、ろ液に25mgのPEG4000を加えて、凍結乾燥した。500MhzプロトンNMRにより、凍結乾燥試料をD2O及びジメチルスルホキシド−d6(DMSO−d6)中で測定した。D2O溶媒中で測定したスペクトルは3.8ppmにポリエチレンオキシドのメチレンプロトンに由来するピークと5.0ppmに系中に存在する水からのプロトンピークの2種類のピークしか観測されなかった。同じ試料のDMSO−d6中でのスペクトルにはBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHとパクリタキセルからのプロトンピークが全て観測された。この事実は、凍結乾燥試料をD2Oに再溶解するとミセルを保って溶解し、エネルギーの弱いラジオ波を用いたNMRスペクトルはミセルの外側に存在するポリエチレンオキシドのメチレンプロトンしか観測されず、ミセル内部に存在するデプシペプチドセグメント及びパクリタキセルは観測されなかったが、同じ凍結乾燥試料をDMSO−d6に溶解するとミセルが破壊され、試料中のBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHとパクリタキセルは分子状でDMSO溶液となり、NMRでは全てのプロトンが観測されたと考えられる。従って、このNMRスペクトルはBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHとパクリタキセルからなるミセルが形成されていることを示しているといえる。
ミセルの製造
メトトレキサート20mgとBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH 200mgを30mLのTHF−メタノール(1:1)に溶かし、溶媒を減圧留去した。残った透明なフィルムに水50mLを加えて溶解した。メトトレキサートは水にほとんど不溶であるが、フィルムは完全に水に溶け、不溶分は全く析出せず、ミセルに取り込まれたことが示唆された。透明な均一溶液をメンブランフィルターでろ過して、ろ液に100mgのPEG4000を加えて、凍結乾燥した。500MhzプロトンNMRにより、凍結乾燥試料をD2O及びジメチルスルホキシド−d6(DMSO−d6)中で測定した。D2O溶媒中で測定したスペクトルは3.8ppmにポリエチレンオキシドのメチレンプロトンに由来するピークと5.0ppmに系中に存在する水からのプロトンピークの2種類のピークしか観測されなかった。同じ試料のDMSO−d6中でのスペクトルにはBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHとメトトレキサートからのプロトンピークが全て観測された。従って、このNMRスペクトルはBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHとメトトレキサートからなるミセルが形成されていることを示しているといえる。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−D−Ala−O−PEG4000−OHの合成
HO−PEG4000−OH 20g(5mmol)を300mLテトラヒドロフラン(THF)に溶かし、t−ブトキシカルボニル−D−アラニンN−ヒドロキシコハク酸エステルBoc−D−Ala−ONSu 4.3g(15mmol)と4−ジメチルアミノピリジン 0.19g(1.5mmol)を加えて、室温で3日撹拌した。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルをジクロロメタン400mLに溶かし、この溶液を10%クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。結晶を温THFに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量20g(収率92%)次いで、Boc−D−Ala−O−PEG4000−O−D−Ala−Boc 20g(4.6mmol)をジオキサン中の4M−HClで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。NMRスペクトルはこの結晶がHCl・H−D−Ala−O−PEG−OHであることを示した。17.6g(93%)。以下、参考例2、実施例1〜4と同様に処理して、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−D−Ala−O−PEG4000−OHを合成した。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Lys(Z)−O−PEG4000−OHの合成
HO−PEG4000−OH 20g(5mmol)を300mLテトラヒドロフラン(THF)に溶かし、t−ブトキシカルボニル−ベンジルオキシカルボニル?−L−リジンN−ヒドロキシハク酸エステルBoc−Lys(Z)−ONSu 7.2g(15mmol)と4−ジメチルアミノピリジン 0.19g(1.5mmol)を加えて、室温で3日撹拌した。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルをジクロロメタン400mLに溶かし、この溶液を10%クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。結晶を温THFに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量21g(収率89%)。次いで、Boc−Lys(Z)−O−PEG4000−O−Lys(Z)−Boc 18.9g(4mmol)をジオキサン中の4M−HClで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。NMRスペクトルはこの結晶がHCl・H−Lys(Z)−O−PEG−OHであることを示した。収量16.5g(収率96%)。以下、参考例2、実施例1〜4と同様に処理して、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Lys(Z)−O−PEG4000−OHを合成した。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Asp(OEt)−O−PEG4000−OHの合成
HO−PEG4000−OH 20g(5mmol)を300mLテトラヒドロフラン(THF)に溶かし、t−ブトキシカルボニル−エチル−L−アスパラギン酸N−ヒドロキシコハク酸エステルBoc−Asp(OEt)−ONSu 5.4g(15mmol)と4−ジメチルアミノピリジン 0.19g(1.5mmol)を加えて、室温で3日撹拌した。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルをジクロロメタン400mLに溶かし、この溶液を10%クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を減圧濃縮し、得られたオイルにエーテルを加えると結晶化した。結晶を温THFに溶かし、エーテルを加えて再結晶させた。収量19g(収率85%)。次いで、Boc−Asp(OEt)−O−PEG4000−O−Asp(OEt)−Boc 18g(4.01mmol)をジオキサン中の4M−HClで処理し、溶媒を減圧留去すると固体の残査が得られた。残査にエーテルを加えて、得られた結晶をろ過した。NMRスペクトルはこの結晶がHCl・H−Asp(OEt)−O−PEG4000−OHであることを示した。収量15.1g(収率90%)。以下、参考例2、実施例1〜4と同様に処理して、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Asp(OEt)−O−PEG4000−OHを合成した。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHのモルモットにおける静脈内単回投与毒性試験
動物種としては、Hartley系雄性モルモット、10週齢、体重338−490gを用いた。被検物質としてBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH (投与量20mg/kg)、対照としてHO−PEG4000−OH (投与量10mg/kg)、陰性対照として生理食塩水を用いた。これらの物質は所定の濃度となるように生理食塩水で溶解し、超音波処理を行った後、0.22μmのメンブラン・フィルターを通して濾過滅菌を行った。また生理食塩水も同様に0.22μmのメンブラン・フィルターを通し濾過滅菌を行った。1群5匹のモルモットに、生理食塩水、HO−PEG4000−OH 、及びBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHを1ml/kgで1分間かけて前肢の静脈内に単回投与し、24時間観察を行った。その後1ヶ月間、週1回体重を測定するとともに一般状態も観察した。その結果、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH及びHO−PEG4000−OH の投与群において、死亡例は見られなかった。一般状態についても特に異常は見られなかった。また体重についても、特記すべき変化はみられなかった。以上のことから、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHのモルモットにおける静脈内単回投与による毒性はみとめられなかった。
Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHのモルモットを用いた能動全身性アナフィラキシー(ASA)反応試験
動物種として、Hartley系モルモット、7週齢、体重380−510gを用いた。動物感作において、被検物質としてBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH (投与量10mg/kg)、陽性対照として卵白アルブミン(投与量10mg/kg)、陰性対照として生理食塩水を用いた。これらの物質は所定の濃度となるように生理食塩水を用いて調整し等量のFCA(Freund’s complete adjuvant)、もしくはFIA(Freund’s incomplete adjuvant)を加え、w/oエマルジョンを作製した。初回にFCAエマルジョンを、第2・3週目にFIAエマルジョンを投与量2.5ml/kgとして背部皮下及びfoot padに投与し感作した。惹起反応としては、被検物質としてBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH (投与量4.0mg/kg)、陽性対照として卵白アルブミン(0.4mg/kg)、陰性対照として生理食塩水を用いた。これらの物質は所定の濃度となるように生理食塩水を用いて調整した。第5週目に投与量1.0ml/kgとして、前肢もしくは後肢の静脈に誘発投与し、4時間観察を行った。その後1ヶ月間、週1回体重を測定するとともに一般状態も観察した。動物数はBoc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OH群:4匹、卵白アルブミン群:3匹、生理食塩水群:3匹とした。その結果、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHはアナフィラキシー反応を示さなかった。その後の一般状態及び体重についても特に異常は見られなかった。陽性対照となる卵白アルブミン投与群においては、誘発投与直後にすべての個体にアナフィラキシー症状が観察された。以上のことから、Boc−(Leu−Leu−Ala−Lac)5−Leu−Phe−O−PEG4000−OHのモルモットを用いた能動全身性アナフィラキシー(ASA)反応試験は陰性であり、抗原性がないことがわかった。
Claims (19)
- アミノ酸およびヒドロキシカルボン酸からなる疎水性セグメントならびにポリエチレンオキシドからなる親水性セグメントを有し、疎水性セグメントの親水性セグメントと結合していない末端がアミノ酸単位からなりそして下記式(1)で表されることを特徴とする、生体適合性ブロック共重合体。
R 1 −〔[−NHCH ( R 2 ) CO−] n −{−O[CH ( R 3 ) ] k CO−} m −〕 p −[−NHCH ( R 2 ) CO−] q −O−[−CH ( R 4 ) CH 2 O−] r −R 5 ・・・(1)
(式中、R 1 は水素原子 , アルキル基、置換されたアルキル基またはアミノ基の保護基であり; R 2 は天然アミノ酸の側鎖またはその誘導基であり; R 3 は水素原子またはC 1 〜C 3 のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたC 1 〜C 3 アルキル基であり; R 4 は水素原子であり; R 5 は水素原子 , C 1 〜C 3 のアルキル基またはメチル、エチルもしくはプロピル基で置換されたC 1 〜C 3 アルキル基、リガンド残基、連結基を有するリガンド残基またはR 1 −〔[−NHCH ( R 2 ) CO−] n −{−O[CH ( R 3 ) ] k CO−} m −〕 p −[−NHCH ( R 2 ) CO−] q −で表わされる基であり;nは1〜10の整数であり;kは1〜6の整数であり;mは1〜5の整数であり;pは1〜20の整数であり;qは0〜6の整数でありそしてrは3〜570の整数である)。 - アミノ酸が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニンおよびそれらの側鎖における誘導体よりなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸である請求項1に記載の生体適合性ブロック共重合体。
- ヒドロキシカルボン酸が、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシカプロン酸およびヒドロキシカプリン酸よりなる群から選ばれる少なくとも一つのヒドロキシカルボン酸である請求項1〜2のいずれか1項に記載の生体適合性ブロック共重合体。
- 親水性セグメントのポリエチレンオキシドの数平均分子量が10,000以下である請求項1〜3のいずれか1項に記載の生体適合性ブロック共重合体。
- 疎水性セグメントが、デプシペプチドである請求項1に記載の生体適合性ブロック共重合体。
- 式(1)のR5のリガンド残基を生じるリガンドが、レクチン、抗体、抗体フラグメント、ホルモン、接着因子、トランスフェリンまたは葉酸である請求項1に記載の生体適合性ブロック共重合体。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の生体適合性ブロック共重合体の疎水性セグメントが内核を形成しそして親水性セグメントが外殻を形成してなるミセル。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなりそして内核が疎水性セグメントと薬物からなり外殻が親水性セグメントからなるミセル。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなる微粒子(ミセルを除く)。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物からなる複合体(ミセルを除く)。
- 平均粒子径が5nm〜300nmである請求項7または8に記載のミセル。
- 薬物が、抗炎症薬、解熱薬、鎮痛薬、抗関節炎薬もしくは抗リウマチ薬、抗痛風薬、強心薬、抗狭心症薬、ベータ遮断薬、カルシウム拮抗薬、抗不整脈薬、利尿薬、抗高血圧薬、末梢循環障害改善薬、抗血栓薬、抗高脂血症薬、抗血小板薬、昇圧薬、脳循環代謝改善薬、抗腫瘍薬、免疫抑制薬、抗アレルギー薬、抗ヒスタミン薬、気管支拡張薬、抗喘息薬、鎮咳薬、去痰薬、抗潰瘍薬、止瀉薬、制吐薬、抗糖尿病薬、催眠薬・鎮静薬、抗不安薬、抗精神病薬、抗うつ薬、抗眩暈薬、抗てんかん薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン病薬、自律神経系作用薬、抗生物質、抗菌薬、抗真菌薬、抗ウィルス薬、駆虫薬、ホルモン薬、抗骨粗鬆症・骨代謝改善薬、ビタミン薬、止血薬、酵素薬、ワクチン、麻酔薬、診断薬、造影薬または検査薬である請求項8〜11のいずれか1項に記載のミセル、微粒子または複合体。
- 薬物が疎水性薬物である請求項8〜11のいずれか1項に記載のミセル、微粒子または複合体。
- 請求項8〜11のいずれか1項に記載のミセル、微粒子または複合体を含有する医薬組成物。
- 投与形態が、注射剤、経口剤、吸入剤,経皮剤または経粘膜剤の形態にある請求項14に記載の医薬組成物。
- 請求項1に記載の生体適合性ブロック共重合体と薬物を水中で混合することを特徴とする薬物を含有するミセルまたは複合体の製造法。
- 請求項1に記載の生体適合性ブロック共重合体、薬物および溶媒からなる混合液を準備しそして該混合液から溶媒を除去することを特徴とするミセル、微粒子または複合体の製造法。
- 請求項1に記載の生体適合性ブロック共重合体の、薬物と組み合わせて生体に適用するための使用。
- 請求項1に記載の生体適合性ブロック共重合体の、薬物とのミセル、微粒子または複合体を製造するための使用。
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