CN100378140C - 杂质量降低的嵌段共聚物、聚合载体、呈聚合形式的药物制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种纯化方法，它能满意地除去嵌段共聚物的杂质，所述嵌段共聚物基本上由聚乙二醇类和聚(酸性氨基酸)组成，并且所述方法适于制备其纯度在医药上可接受的聚合载体；一种制备这种聚合载体的方法；杂质量降低的嵌段共聚物；如上所述的聚合载体；使用所述载体制备的呈聚合形式的医药制剂；以及使用离子交换树脂或者分配/吸附树脂处理聚乙二醇类和聚(酸性氨基酸)，然后使用凝胶过滤柱测定它们的量的方法，所述聚乙二醇类和聚(酸性氨基酸)是嵌段共聚物中包含的杂质。

Description

杂质量降低的嵌段共聚物、聚合载体、呈聚合形式的药物制剂及其制备方法
发明领域
本发明涉及在递送药物等时用作载体的高纯度嵌段共聚物、通过使所述嵌段共聚物和蒽环类抗生素抗癌药缩合形成的用作药物载体的聚合载体、由该聚合载体形成的聚合药物制剂及其制备方法。而且，本发明涉及嵌段共聚物中所含杂质的定量测定方法。
发明背景
已.知一种通过使用形成胶束的聚合载体将药物和基因等递送到活体中目标位置处的方法，但是对用于此目的的嵌段共聚物来说，还不能充分除去其中的杂质。
通常，使用如透析操作、超滤操作和沉析操作的方法来进行所述合成高分子化合物如嵌段共聚物的提炼工艺。
在透析操作和超滤操作的提炼方法中，根据分子量的不同进行分离和提炼步骤。通常，根据允许渗透的最大分子量将透析膜和超滤膜分类，但是，其在级分分子量精度方面存在巨大的差异。因此，在通过透析操作和超滤操作提炼合成高分子化合物如嵌段共聚物的方法中，当目标合成高分子化合物的分子量和杂质的分子量相差不大时，是不可能进行充分的提炼操作。而且，这些方法不适于工业应用，在大多数情况下只能用作实验室规模的提炼方法。
相比较，使用沉析工艺的精制方法已经广泛使用，它也适于工业应用。在这一方法中，通过对溶剂的溶解度差异来除去杂质，从而进行提炼工艺，这种方法在除去合成高分子化合物如嵌段共聚物中的低分子量组分时更加优越。但是，当为具有更高分子量的杂质如聚乙二醇类和聚(酸性氨基酸)时，所述合成高分子化合物如嵌段共聚物和杂质之间对溶剂的溶解度差异就小，导致不能通过沉析工艺充分地提炼所述高分子化合物如嵌段共聚物。
如上所述，嵌段共聚物中所含的高分子量杂质尚不能充分地除去，并且也没有，可用于制备药物等的适于制备嵌段共聚物的提炼方法。
而且，对于具有两亲性质的形成胶束的嵌段共聚物来说，定量测定所述嵌段共聚物中杂质的常规方法不能提供充分的分析结果。
在所述常规方法中，所述合成高分子化合物如嵌段共聚物溶解在溶剂中，并通过使用高速液相色谱法进行分析，其上连接有凝胶渗透色谱柱(凝胶渗透色谱法：GPC)。
但是，当所述嵌段共聚物和其中所含杂质的分子量相差较小时，则难以以清晰的峰将其分离，不能提供高性能的杂质定量测定方法。
而且，即使当它们分子量之间存在足够的差异时，若杂质量小的话，也不可能获得清晰的峰。这是因为凝胶渗透分离的机理是利用分子扩散，峰会沿色谱图扩展，导致量小组分的峰高不够。因此，常规方法不能提供高性能的定量测定方法。
而且，由于常规方法仅仅根据分子量的差异进行分离和定量测定主要组分和杂质，不能获得定性信息如结构和杂质来源。
发明概述
本发明的发明人已经研究解决了上述问题，并提出了本发明。
换句话说，本发明涉及：
1)聚乙二醇类和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物或其盐，其中，杂质含量不超过10重量％。
2)上述1)中所述的嵌段共聚物或其盐，其中，所述杂质为聚乙二醇类和聚(酸性氨基酸)。
3)上述1)或2)中所述的嵌段共聚物或其盐，其中，所述聚(酸性氨基酸)是聚天冬氨酸。
4)上述1)或2)中所述的嵌段共聚物或其盐，其中，所述嵌段共聚物是通式(1)所示的共聚物：
Figure C0281228400051
(式中，R1表示氢原子或低级烷基，R2表示结合基团，R3表示亚甲基或亚乙基，且R4表示氢原子或氨基保护基，n是5-1000之间的整数，m是2-300之间的整数，x是0-300之间的整数，x不大于m。)
5)上述4)中所述的嵌段共聚物或其盐，其中，R1表示具有1-5个碳原子的烷基，R2表示具有1-5个碳原子的亚烷基，R3表示亚甲基或亚乙基，R4表示氢原子或具有1-5个碳原子的酰基，n是5-1000之间的整数，m是2-300之间的整数，x是0-300之间的整数，但是x不大于通式(1)中的m。
6)上述4)中所述的嵌段共聚物或其盐，其中，R1表示甲基，R2表示三亚甲基，R3表示亚甲基，R4表示乙酰基，n是20-500之间的整数，m是10-100之间的整数，x是0-100之间的整数，但是x不大于通式(1)中的m。
7)一种制备以上1)-6)任一项所述嵌段共聚物或其盐的方法，其中，聚乙二醇类衍生物通过离子交换树脂进行纯化，由此制备嵌段共聚物，并且在除去所述保护基之后，若需要的话，使用分离/吸附树脂中进行纯化工艺。
8)聚合载体，其中，以上1)-6)任一项所述嵌段共聚物的聚(酸性氨基酸)和蒽环类抗生素抗癌药残基缩合。
9)以上8)所述的聚合载体，其中，聚(酸性氨基酸)和蒽环类抗生素抗癌药残基的缩合反应是聚(酸性氨基酸)的侧链羧酸和蒽环类抗生素抗癌药残基之间的缩合反应。
10)以上8)或9)所述的聚合载体，其中，所述蒽环类抗生素抗癌药残基是阿霉素残基。
11)以上8)或9)所述的聚合载体，其中，在所述聚(酸性氨基酸)中，蒽环类抗生素抗癌药残基的结合率为30-55％。
12)一种制备以上8)-11)任一项所述聚合载体的方法，其中，在以上1)-6)任一项所述嵌段共聚物和反应助剂之间的缩合化合物分离之后，使所述缩合化合物和蒽环类抗生素抗癌药反应。
13)以上12)所述的制备方法，其中，所述蒽环类抗生素抗癌药是阿霉素或其盐。
14)包含嵌段共聚物-药物复合物的聚合药剂，其中，在以上8)-11)任一项所述聚合载体形成的胶束内核中包含蒽环类抗生素抗癌药。
15)以上14)所述的聚合药剂，其中，所述蒽环类抗生素抗癌药是阿霉素或其盐。
16)以上14)或15)所述的聚合药剂，其中，所述嵌段共聚物-药物复合物呈冻干物质的形态。
17)定量测定以上1)所述聚乙二醇类和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物中所含杂质的方法，所述方法包括以下步骤：
将所述嵌段共聚物溶解在溶剂中，
将所述溶液进行树脂处理，并
使用凝胶渗透柱使所述处理后的溶液进行高速液相色谱处理。
18)以上17)所述定量测定方法，其中，所述溶剂是水，它允许包含和水混溶的有机溶剂，所述树脂是离子交换树脂，杂质为聚乙二醇类。
19)以上17)所述的定量测定方法，其中，所述溶剂是水，它允许包含和水混溶的有机溶剂；所述树脂是分配/吸附树脂，它能附收具有醚键的化合物；所述杂质是聚(酸性氨基酸)。
本发明最佳实施方式
以下将详细说明本发明。
本发明一方面涉及聚乙二醇类和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物或其盐，其中杂质含量不超过10重量％。分析所述嵌段共聚物中所含的杂质，发现所述杂质由聚乙二醇类和聚(酸性氨基酸)，即其侧链上具有羧酸的聚氨基酸组成。所述聚乙二醇类的例子包括聚乙二醇和单封端烷氧基聚乙二醇。聚(酸性氨基酸)的例子包括聚谷氨酸和聚天冬氨酸。
在本发明中，聚乙二醇类和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物中的聚(酸性氨基酸)例子包括在其侧链上具有羧基的α-和/或β-氨基酸的聚合物，较好是聚谷氨酸或聚天冬氨酸，而所述嵌段共聚物例子包括以上通式(1)或(2)所示的嵌段共聚物或其盐。
Figure C0281228400071
(式中，R1表示氢原子或低级烷基，R2表示结合基团，R3表示亚甲基或亚乙基，且R4表示氢原子或氨基保护基，n是5-1000之间的整数，m是2-300之间的整数，x是0-300之间的整数，x不大于m。)
此处，R1的例子包含氢原子或低级烷基，且较好使用低级烷基，其具体的例子包括甲基、乙基、正丙基和异丙基；尤其更好是使用甲基。至于R2结合基团，其例子包括可以具有支链的烃基，较好使用亚烷基，并且其具体实施例包括亚乙基、三亚甲基和四亚甲基；尤其更加的是使用亚乙基和三亚甲基。至于R3，使用亚甲基或亚乙基，更好是使用亚甲基。
至于R4，使用氢原子或氨基保护基，并且所述氨基保护基并没有特殊限制，可以使用任何基团，只要它是通常使用的氨基保护基，尤其宜使用低级酰基，其具体的例子包括甲酰基、乙酰基、丙酰基和丁酰基，更好是使用乙酰基。此处，n是5-1000，更好是20-500，最好是80-300之间的整数，m是2-300，更好是10-100，最好是20-50之间的整数，x是0-300，更好是0-100，最好是0-50之间的整数；但是x不大于m。
至于本发明嵌段共聚物的盐，其例子包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和有机铵盐，较好的例子是钠盐、钾盐、钙盐、铵盐和三乙基铵盐。
应认为嵌段共聚物中所含的杂质不能形成胶束，且不能作为药物和基因等的聚合载体，因此，为了医药应用的目的，杂质含量宜降至不超过10％，更好是不超过5％。
而且，本发明第二方面涉及制备聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物或其盐的方法，其中，使用离子交换树脂来纯化聚乙二醇，之后和聚(酸性氨基酸)一起形成嵌段共聚物，并且在除去保护基之后，若需要的话，使用分配/吸附树脂纯化所述嵌段共聚物。至于所述聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物，较好使用和上述聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物相同的嵌段共聚物。在使用保护基保护所述嵌段共聚物时，所述保护基没有特殊限制，只要它能保护酸性氨基酸侧链上的羧基即可，其例子包括具有低级醇的酯以及具有芳基取代的低级醇的酯，所述芳基可以具有取代基。具体的例子包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、苄酯、苯乙酯(phenetyl)、对甲氧基苄酯和对硝基苄酯。至于除去所述保护基的方法，根据所述的保护基，可以从常用的方法中选择合适的方法，例如，可以进行酸水解或碱水解方法，以及使用催化剂的氢解方法等。
至于本发明杂质含量降低的聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物，以下将详细讨论例如通式(1)所述化合物的纯化方法。
至于所述嵌段共聚物的合成方法，已经提出了各种方法，例如，待公开的日本专利申请No.6-206832已经揭示了一种方法，所述方法使通过单封端甲氧基聚乙二醇的羟基末端改性制得的原料和天冬氨酸衍生物进行聚合反应，之后保护所述氨基，然后水解酯键，由此制备嵌段共聚物；但是，并没有提到获得高纯度嵌段共聚物的纯化方法。
所述单封端甲氧基聚乙二醇的羟基末端的改性方法通过使用在相应工艺技术领域中已知反应的方法来进行，例如，提出了以下方法：反应吖丙啶的方法；使丙烯腈、甲基丙烯腈等进行Michel加成步骤之后，还原所述腈基，将其转化成氨基的方法；使用卤原子取代所述羟基之后，使之和醇胺如乙醇胺反应的方法；直接将羟基转化成腈基，然后还原成氨基的方法。
所述将端基改性成氨基的聚乙二醇包括进行不完全改性的单封端聚乙二醇，即例如，具有羟基末端的单封端聚乙二醇和具有加合乙腈的端基的单封端聚乙二醇。
这些进行不完全改性的聚乙二醇可以使用具有酸性官能团的离子交换材料以另外的方法除去。对所述离子交换材料并没有特殊限制，只要它具有酸性官能团即可，所述离子交换材料的例子包括：Diaion SKIB(MitsubishiChemical Corporation制造)、Diaion PK-216(Mitsubishi ChemicalCorporation制造)、Diaion WK-10(Mitsubi shi Chemical Corporation制造)、Diaion WK20(Mitsubishi Chemical Corporation制造)、Amber lite 120B(Rohmand hass Japan Co.制造)、Amber lite 200C(Rohm and hass Japan Co.制造)、Amber lite IRC-50(Rohm and hass Japan Co.制造)、Amber liteIRC-76(Rohmand hass Japan Co.制造)和Dowex50W(Dow Chemical Corp.制造)，它们作为离子交换树脂；并且还包括SP-Sephadex C-25(Pharmacia Biotech制造)、SP-Sephadex C-50(Pharmacia Biotech制造)、CM-Sephadex C-25(PharmaciaBiotech制造)、CM-Sephadex C-50(Pharmacia Biotech制造)、SP-Toyopearl550(Toso K.K.制造)、SP-Toyopearl650(Toso K.K.制造)、CM-Toyopearl550(Toso K.K.制造)、CM-Toyopearl650(Toso K.K.制造)，它们作为离子交换凝胶；尤其宜使用SP-Toyopearl650和CM-Toyopearl650。
所述纯化所得聚乙二醇的方法可以是间歇方法和柱方法，较好是使用柱方法。换句话说，将具有改性端基的单封端甲氧基聚乙二醇溶解在溶剂中。所用溶剂没有特殊限制，只要它能用于离子交换工艺，宜使用水或水/有机溶剂的混合溶剂，如水/甲醇，水/乙腈的混合溶剂。接着，使所得的溶液经过所述柱，在其中，已经加入上述重新形成H+形式的离子交换材料，然后用水或水/有机溶剂的混合溶剂洗涤所述柱，由此除去不完全改性的聚乙二醇类。之后，通过使用其中已经加入碱性物质如氨水的溶剂或者氨水/有机溶剂的混合溶剂洗提已经被吸收的具有改性为氨基的端基的单封端甲氧基聚乙二醇。使由此洗提所得的溶液进行合适的工艺，如浓缩工艺或冻干工艺，制得高纯度的具有改性成氨基的端基的单封端甲氧基聚乙二醇。
接着，使具有改性成氨基的端基的单封端甲氧基聚乙二醇和例如氨基酸的N-羧酸酐反应，由此合成嵌段共聚物，在所述氨基酸中，侧链的羧基已经被保护；若需要的话，通过乙酸酐等将乙酰基使末端处的氨基己酰化。之后，若需要的话，除去侧链上的保护基，制得聚乙二醇-聚(酸性氨基酸)嵌段共聚物。
由此获得的聚乙二醇-聚(酸性氨基酸)嵌段共聚物包含作为杂质的聚(酸性氨基酸)，但是它可以通过使用分配/吸附树脂进行纯化。至于所述分配/吸附树脂，其例子包括硅胶、二氧化硅粉末、用烃和苯乙烯/二乙烯基苯树脂改性的硅胶、且较好使用苯乙烯/二乙烯基苯树脂，更好是使用HP-20SS(MitsubishiChemical Corporation制造)。
纯化所得聚乙二醇-聚(酸性氨基酸)共聚物的方法可以是间歇方法和柱方法，更好是使用柱方法。换句话说，所述聚乙二醇-聚(酸性氨基酸)嵌段共聚物溶解在溶剂中。所用溶剂没有特殊限制，只要它具有用于解离所述聚(酸性氨基酸)所需的足够碱性，并可应用于分配/吸附树脂；较好的例子包括碱金属氢氧化物水溶液或者碱金属氢氧化物水溶液和有机溶剂的混合溶液，如氢氧化钠水溶液/甲醇，氢氧化钠水溶液/乙腈。使所述溶解在溶剂中的聚乙二醇-聚(酸性氨基酸)嵌段共聚物的溶液通过其中加入分配/吸附树脂的柱，然后使氢氧化钠水溶液或者氢氧化钠水溶液/有机溶剂的混合溶液流过所述柱，除去所述聚(酸性氨基酸)。之后，使用极性较低的溶剂如有机溶剂比例增大的水/有机溶剂混合溶剂洗提所述吸收的聚乙二醇-聚(酸性氨基酸)嵌段共聚物。将由此洗提的溶液进行合适的后处理工艺，如浓缩工艺、冻干工艺或沉析，由此制得高纯度聚乙二醇-聚(酸性氨基酸)嵌段共聚物。
本发明第三方面涉及通过缩合所述纯化的聚乙二醇-聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物和蒽环类抗生素抗癌药所制得的聚合载体。至于所述聚合载体，提出了以下通式(3)或(4)所示的高分子化合物。本发明也包括其盐。
Figure C0281228400111
(式中，R表示氢原子或蒽环类抗生素抗癌药残基，R1表示氢原子或低级烷基，R2表示结合基团，R3表示亚甲基或亚乙基，且R4表示氢原子或氨基保护基，n是5-1000之间的整数，m是2-300之间的整数，x+y是0-300之间的整数，x+y不大于m。)
至于通式(3)或(4)所示的化合物中的R，其例子包括羟基或蒽环类抗生素抗癌药残基。在所述嵌段共聚物的聚(酸性氨基酸)部分中，组成部分结合的顺序没有特殊限制，可以随意设定或者有规律的设定。所述嵌段共聚物的聚(酸性氨基酸)的侧链羧酸残基和蒽环类抗生素抗癌药残基之间的结合方式没有什么限制，较好是使用结合到蒽环类抗生素抗癌药残基的氨基上的酰胺键。尤其更好使用由蒽环类抗生素抗癌药氨基糖部分的伯氨基形成的酰胺键。结合到聚(酸性氨基酸)部分的侧链羧酸残基上的蒽环类抗生素抗癌药比例为1-100％，且当考虑形成胶束的能力时，所述比例较好设定为10-60％，更好是30-55％。所述蒽环类抗生素抗癌药残基的例子包括如柔红霉素、阿霉素、阿柔比星、表柔比星和皮鲁比星(pyrarubicin)，更好是使用阿霉素残基。
R1、R2、R3、R4、n和m较好处于上述相同的范围内。
此处，x+y是0-300，较好为0-100，更好是0-50之间的整数，且x+y可以是包括0的任一值，只要它们各自为满足上述条件的整数。
而且，本发明第四方面涉及一种制备聚合载体的方法，所述聚合载体通过以下步骤制得：使聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的精制嵌段共聚物和反应助剂进行缩合反应，在将所述缩合化合物分离之后，和蒽环类抗生素抗癌药反应。所述聚合载体通过国际公开No.WO97/12895的小册子中所述的方法制备，即通过使用碳二亚胺型脱水缩合剂将嵌段共聚物和蒽环类抗生素抗癌药缩合，但是这一次通过分子内重排来转移作为活性中间体的酰基异脲，从而产生酰基脲副产物，形成加入了酰基脲的聚合载体。此处，通过分离所述嵌段共聚物和反应助剂之间的缩合化合物，它可以降低所述副产物酰基脲，由此提供其中加入较少酰基脲的聚合载体。气相色谱注入部分的温度应设定得足够高，然后测量所述酰基脲热解形成的异氰酸酯衍生物来定量确定其中加入的副产物酰基脲的量。
以下将更加详细的说明上述制备方法：将所述精制的嵌段共聚物溶解在有机溶剂中，并往其中加入脱水缩合剂和反应助剂，进行反应，并过滤所述反应产生的烷基脲衍生物，将活性酯物质从滤液中分离出来。接着，将蒽环类抗生素抗癌药或其盐加入有机溶剂中的活性酯物质中之后，若需要的话，往其中加入碱，使它们反应，并将聚合载体从所述反应溶液中分离出来。至于所述有机溶剂，虽然没有什么限制，只要所述反应物质能溶解在其中即可，但是较好使用非水性极性溶剂，其例子包括二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和1，3-二甲基-2-咪唑烷酮，更好是使用二甲基甲酰胺。至于用于缩合所述嵌段共聚物和反应助剂的脱水缩合剂，通常使用用于合成肽的缩合剂，宜使用二环己基碳二亚胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。至于所述反应助剂，可以使用常用于合成肽的反应助剂。其例子包括N-羟基化合物，宜使用N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑等。至于所用的碱，虽然没有特殊限制，但是宜使用有机碱如三乙基胺。至于蒽环类抗生素抗癌药，可以使用提供上述蒽环类抗生素抗癌药残基的蒽环类抗生素基化合物。
而且，本发明第五方面涉及包含嵌段共聚物-药物复合物的聚合药剂，其中蒽环类抗生素抗癌药包裹在聚合载体形成的胶束内核中，所述聚合载体由聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物制备。所述蒽环类抗生素抗癌药的例子包括如柔红霉素、阿柔比星、表柔比星和吡柔比星(pyrarubicin)的化合物或其盐，更好是使用阿霉素或其盐。而且，本发明另一方面还涉及其中包含呈冻干物质形式的嵌段共聚物-药物复合物的聚合药剂。上述聚合药剂的制备方法没有特殊限制，可以使用待公开的日本专利申请No.7-69900中揭示的方法，即使用透析薄膜使其中溶解了嵌段共聚物和蒽环类抗生素抗癌药的二甲基甲酰胺和水的混合溶剂进行透析操作，并使用超滤薄膜进行超滤操作，若需要的话，之后进行冻干。而且，可以使用另一方法，将所述嵌段共聚物和蒽环类抗生素抗癌药溶解在和水混溶的低沸点有机溶剂如乙醇/水的混合溶剂中，浓缩所得的溶液，将所述低沸点有机溶剂蒸馏除去，若需要的话再进行冻干。
本发明第六方面涉及定量测定方法，在定量测定上述聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物中所含杂质时，将嵌段共聚物溶解在溶剂中，并使所述溶液进行树脂处理，使用凝胶渗透柱使所述处理的溶液进行高速液相色谱处理。至于所述聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物和所述嵌段共聚物中所含的杂质，其例子如上所述。
在本发明中，在于定量测定所含聚乙二醇杂质时用于溶解所述聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物的溶剂，可以使用任何能溶解所述嵌段共聚物的溶剂，较好使用用合适的盐调节pH的水溶液，或者这种水溶液和有机溶剂如甲醇、乙醇、乙腈和四氢呋喃的混合溶剂。至于用来调节pH的盐，可以使用具有缓冲作用的常用盐，较好使用磷酸盐、硼酸盐、碳酸氢钠、邻苯二甲酸盐和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐等。
此外，至于用来定量测定所含聚氨基酸杂质的溶剂，可以使用在定量测定聚乙二醇时能溶解所述聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物并使侧链上羧酸游离的溶剂，较好使用通过合适盐来调节pH的水溶液，或者这种水溶液和有机溶剂如甲醇、乙醇、乙腈和四氢呋喃的混合溶剂。为了适当游离侧链上的羧酸，所述溶剂的pH较好处于5-13之间，至于所用的盐，可以使用上述磷酸盐、硼酸盐、碳酸氢钠、邻苯二甲酸盐和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)等。
本发明中，至于在定量测定所述嵌段共聚物中所含聚乙二醇杂质时用来处理所述嵌段共聚物溶液的树脂，较好使用离子交换树脂，它可以形成所述嵌段共聚物解离基团的抗衡离子，即阴离子交换树脂。它并没有特殊限制，可以使用任何离子交换树脂，如二烷基胺，三烷基胺和二烷基乙醇胺，只要它们具有碱性官能团即可。
至于所述分析方法，可以使用间歇方法和柱方法，较好是使用柱方法。
在所述柱方法中，提出了一种方法：往敞开柱中加入离子交换树脂，如Diaion SA10A(Mitsubishi Chemical Corporation制造)、DiaionPA318(Mitsubishi Chemical Corporation制造)、Diaion SA20A(MitsubishiChemical Corporation制造)、Diaion WA30(Mitsubishi Chemical Corporation制造)、Diaion WA10(Mitsubishi Chemical Corporation制造)、Amber liteIRA402(Rohm and hass Japan Co.制造)、Amber lite MR904(Rohm and hass JapanCo.制造)、Amber lite IRA410(Rohm and hass Japan Co.制造)、Amber liteIRA93(Rohm and hass Japan Co.制造)、Amber lite IRA68(Rohm and hass JapanCo.制造)和Dowex66(Dow Chemical Corp.制造)；纤维素离子交换材料如CellexQAE(Bio-Rad Co.，Ltd.制造)、Cellex PEI(Bio-Rad Co.，Ltd.制造)、CellexD(Bio-Rad Co.，Ltd.制造)和Cellex DE52(Bio-Rad Co.，Ltd.制造)；或者凝胶离子交换材料，如QAE-Sephadex A25(Pharmacia Biotech制造)、QAE-SephadexA50(Pharmacia Biotech制造)、DEAE-Sephadex A25(Pharmacia Biotech制造)、DEAE-Sephadex A50(Pharmacia Biotech制造)、DEAE-Sephadex CL-6B(Pharmacia Biotech制造)和DEAE-Bio Gel A(Pharmacia Biotech制造)；或者提出了另一种方法：往其中预先加入离子交换树脂并用于高速液相色谱预处理的市售填充柱(cartridge)，如Sep-Pak QMA(Waters Co.，Ltd.制造)、Sep-Pak NH2(Waters Co.，Ltd.制造)、Bond Elut PSA(Barian Co.，Ltd.制造)、BondElut DMA(Barian Co.，Ltd.制造)和Bond Elut SAX(Barian Co.，Ltd.制造)。此处，从分析的容易度来看，宜使用利用填充柱的方法。尤其更好是使用Sep-Pak QMA。
在定量分析嵌段共聚物中所含聚乙二醇杂质时，使用凝胶渗透柱通过高速液相色谱来分析一些已经进行上述树脂处理和洗提但是未被树脂吸收的聚乙二醇，获得分析结果。在这一方法中，由于所述洗提溶液可以浓缩成高浓度，它可以以高灵敏度定量分析聚乙二醇。
在本发明中，对用于定量测量杂质中所用凝胶渗透柱的载体没有特殊限制，可以使用任何载体，只要它可以用于高速液相色谱即可。但是，根据嵌段共聚物中杂质的大致分子量，可以使用具有合适分子量排除限的那些载体。对于定量测定聚乙二醇来说，例如可以使用以下载体：Shodex Ohpak SB-803HQ(Showa Denko K.K.制造)、Shodex Ohpak SB-802.5HQ(Showa Denko K.K.制造)、Shodex Ohpak SB-804HQ(Showa Denko K.K.制造)，对于定量测量聚(酸性氨基酸)来说，可以使用以下载体，例如Asahipak GF-310HQ(Asahi KaseiCorporation制造)和Asahipak GF-510HQ(Asahi Kasei Corporation制造)。除了这些以外，也可以使用Asahipak GS-320HQ(Asahi Kasei Corporation制造)和Asahipak Q-802(Showa Denko K.K.制造)。至于本发明中的高速液相色谱，可以使用市售高速液相色谱装置。
此外，对用于处理嵌段共聚物溶液从而定量测定本发明聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)之间嵌段共聚物中所含聚(酸性氨基酸)杂质的树脂来说，较好使用能吸附具有醚键的嵌段共聚物的树脂，即分配/吸附树脂，其例子包括硅胶、硅酸盐粉末、用烃改性的硅胶和苯乙烯/二乙烯基苯树脂。至于用烃改性的硅胶，较好使用由具有1-30个碳原子的烃改性的硅胶，特别是更好使用由具有4-18个碳原子的烃改性的硅胶。
至于所述分析方法，可以使用间歇方法和柱方法，更好是使用柱方法。此外，可以使用已经加入市售分配/吸附树脂的柱，宜适当选择其尺寸。而且，也可以使用市售分析固态萃取柱，如Sep-Pak C18(Waters Co.，Ltd.制造)、Sep-Pak tC18(Waters Co.，Ltd.制造)、Sep-Pak C8(Waters Co.，Ltd.制造)、Bond elut C18(Barian Co.，Ltd.制造)和Bond elut C8(Barian Co.，Ltd.制造)，更好是使用Sep-Pak C18。
至于嵌段共聚物中所含的聚(酸性氨基酸)杂质，按以下方式进行定量测量：将所述聚(酸性氨基酸)溶解在溶剂中，由此解离羧酸，将此溶液进行上述树脂处理；使用凝胶渗透柱由高速液相色谱法定量测定已经被洗提但未被树脂吸收的聚(酸性氨基酸)。在这种方法中，由于将所述洗提后的溶液浓缩至高浓度，它可以以高灵敏度定量分析聚(酸性氨基酸)。
使用这些分析方法，测量上述纯化工艺制得的聚乙二醇和聚天冬氨酸的嵌段共聚物以及聚乙二醇和聚天冬氨酸的常规嵌段共聚物中分别包含的聚乙二醇和聚天冬氨酸的量，并将结果列于下表中：
嵌段共聚物中所含的杂质量
杂质        未纯化       纯化
聚乙二醇    6.0重量％    1.3重量％
聚天冬氨酸  7.5重量％    2.4重量％
实施例
以下将参考实施例详细讨论本发明。但是，决不是通过这些实施例限制本发明。
制备实施例1
将重新形成H+形式的Toyopearl650M(900ml)加入玻璃柱中。将单封端-甲氧基/单封端-3-氨基丙氧基聚乙二醇(29.97g)(重均分子量5287)溶解在1.98L10％乙腈水溶液中，并使这种溶液渗透经过所述柱。用1.6L10％乙腈水溶液洗涤所述柱之后，使用包含10％乙腈的0.4M氨水将所述柱展开。收集包含所述目标化合物的级分，并在减压条件下进行浓缩，将它们冻干制得25.71g纯单封端甲氧基/单封端-3-氨基丙氧基聚乙二醇。
制备实施例2
将制备实施例1中制得的纯单封端甲氧基/单封端-3-氨基丙氧基聚乙二醇(23.32g)溶解在466ml二甲基亚砜(DMSO)中，并加热至35℃。往其中加入42.87gβ-苄基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐(BLA-NCA)，并反应22小时。将所述反应混合物滴加到包含3.73L二异丙基醚(IPE)和0.93L乙醇(EtOH)的混合溶剂中，并过滤所沉积的沉积物，并用IPE和EtOH的混合溶液(4∶1)洗涤，之后用IPE洗涤，然后，真空干燥制得54.29g(天冬氨酸单元数：29.0)单封端甲氧基聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)共聚物。
制备实施例3
将制备实施例2中制得的单封端甲氧基聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)共聚物(52.85g)溶解在529ml二甲基甲酰胺中，并加热至35℃。往其中加入2.50ml乙酸酐，并反应3小时。将所述反应混合物滴加到包含4.76L二异丙基醚(IPE)和0.53L乙醇(EtOH)的混合溶剂中，过滤所沉积的沉积物，并用IPE和EtOH的混合溶液(9∶1)洗涤，之后用IPE洗涤，然后，真空干燥制得51.67g单封端甲氧基聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)共聚物的N-乙酰化化合物。
制备实施例4
使制备实施例3中制得的单封端甲氧基聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)共聚物的N-乙酰化化合物(50.19g)和753ml乙腈以及2.16L0.2N氢氧化钠水溶液反应5小时。用2N盐酸将所述反应混合物中和之后，在减压条件下进行浓缩，除去其中的乙腈，然后使用1.2L乙酸乙酯萃取三次。在将所述水层浓缩之后，溶液的量为1.3L，往所述溶液中进一步加入11ml6N氢氧化钠，形成碱性水溶液，使该溶液渗透已经充分洗涤的HP-20SS柱(2L)。在用0.01N氢氧化钠水溶液(8L)和水(3L)洗涤之后，用50％乙腈-水(6L)进行洗提。收集包含所述目标化合物的级分，并在减压条件下进行浓缩，使所得的溶液渗透过已经重新形成H+形式的Dowex50W8(520ml)中，并用50％乙腈-水(1L)洗涤。在减压条件下将所述洗提的溶液进一步浓缩，然后冻干。将所述冻干的产物溶解在320ml二甲基甲酰胺(DMF)中，并将所得溶液滴加到2.56L己烷和0.64L乙酸乙酯的混合溶剂中。过滤所沉积的沉积物，并用己烷和乙酸乙酯的混合溶液(4∶1)洗涤，之后用己烷洗涤，然后真空干燥制得33.20g单封端甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物的N-乙酰化化合物。
制备实施例5
将制备实施例4中制得的单封端甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物的N-乙酰化化合物(28.85g)溶解在577ml二甲基甲酰胺中，并加热至35℃。往其中加入19.75g二环己基碳二亚胺(DCC)和11.01gN-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)，并反应1小时。通过棉塞过滤所得二环己基脲。用2.3L乙酸乙酯稀释所得滤液，然后往其中加入3.5L己烷。过滤所沉积的沉积物，并用己烷∶乙酸乙酯(3∶1)的溶液洗涤，然后真空干燥33.82g单封端甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物的N-乙酰化化合物-HOSu活性酯物质。
制备实施例6
将制备实施例5中制得的单封端甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物的N-乙酰化化合物-HOSu活性酯物质(33.73g)溶解在1.35L二甲基甲酰胺中，并加热至35℃。往其中加入26.13g呈粉末状的盐酸阿霉素，并在悬浮到反应溶液中之后，再往其中加入8.16ml三乙胺，并反应1小时。将所述反应混合物滴加到包含4.0L乙酸乙酯和16.0ml己烷的混合溶剂中，过滤所沉积的沉积物，并用己烷∶乙酸乙酯(3∶1)的溶液洗涤，之后真空干燥。接着，将所得沉积物悬浮在590ml乙腈中，并往其中加入1780ml水，在35℃下加热并搅拌。在确定所述沉积物已经溶解之后，继续搅拌1小时，并在减压条件下将所述反应溶液浓缩，除去其中的乙腈，并进行冻干。将所得冻干的产物重新溶解在1.074L二甲基甲酰胺中，并将所得溶液滴加到包含2.15L乙酸乙酯和8.60L己烷的混合溶剂中。过滤所沉积的沉积物，并用己烷∶乙酸乙酯(3∶1)的溶液洗涤，然后真空干燥。最后，将所得沉积物悬浮在1074ml无水乙醇中，在35℃下搅拌2小时之后，过滤所述悬浮液，并用无水乙醇洗涤，然后真空干燥制得45.39g单封端甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物的N-乙酰化化合物-阿霉素缩合产物。结合到嵌段共聚物中聚天冬氨酸部分的侧链羧酸残基上的阿霉素比例约为47％。
制备实施例7
往制备实施例6中制得的单封端甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物的N-乙酰化化合物-阿霉素缩合产物(20.00g)中加入100ml注射用水，并加热至35℃，形成悬浮液。往其中加入6.0ml 0.5N氢氧化钠水溶液，并进行搅拌，然后再加入100ml无水乙醇。在已经确定嵌段共聚物溶解之后，往其中加入3.906g盐酸阿霉素，并溶解在其中。往其中加入5.9ml0.5N氢氧化钠，将pH调节到6，再加入188ml注射用水。1小时之后，使用膜过滤(Millipore；GV型0.22微米)过滤所述溶液，然后在减压条件下蒸馏去除溶剂，制得嵌段共聚物-药物复合物的溶液，将其冻干制得22.96g冻干的嵌段共聚物-药物复合物。
实施例1
将制备实施例4中制得的嵌段共聚物(10.3mg)溶解在10mM乙酸缓冲液(pH7.0，1ml)中，制得1.0043g嵌段共聚物溶液。使一部分这种溶液(0.7491g)经过Sep-Pak QMA柱(由Waters Co.，Ltd.制造)，所述柱中已经渗透甲醇、水和10mM乙酸缓冲液(各为5ml)，它再用10mM乙酸缓冲液(3mL)洗涤。制备总共4.1171g包含自由通过的级分和洗涤级分的溶液。通过具有以下条件的高速液相色谱定量测定这种溶液，所述色谱装置上连接有凝胶渗透柱。其中所含聚乙二醇的量为0.1005mg(1.3重量％)。
柱：Shodex OHpak SB-803+SB-G(Showa Denko K.K.制造)
柱温度：40℃
流动相：100mM氯化钠水溶液
流动速率：0.5ml/分钟
检测器：差示折射计
注射量：50微升
实施例2
将制备实施例4中制得的嵌段共聚物(10.3mg)溶解在10mM磷酸缓冲液(pH7.0，1ml)中，制得嵌段共聚物溶液。使一部分这种溶液经过Sep-Pak C18柱(由Waters Co.，Ltd.制造)，所述柱中已经渗透甲醇、水和10mM磷酸缓冲液(各为5ml)，它再用10mM磷酸缓冲液(3mL)洗涤。制备总共4.1735g包含自由通过的级分和洗涤级分的溶液。通过具有以下条件的高速液相色谱定量测定这种溶液，所述色谱装置上连接有凝胶渗透柱。其中所含聚乙二醇的量为0.250mg(2.4重量％)。
柱：Asahipack GF310HQ+Asahipack GF-1B(Asahi Kasei Corporation制造)
柱温度：40℃
流动相：100mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)
流动速率：0.5ml/分钟
检测器：差示折射计(或UV检测器)
注射量：50微升
实施例3
精确称重制备实施例6中制得的单封端甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物的N-乙酰化化合物-阿霉素缩合产物(50mg)，并将其溶解在25ml4％SDS∶乙腈(1∶1)溶液中。通过具有以下条件的高速液相色谱定量测定这种溶液，发现已经分离含量为1.29重量％的盐酸阿霉素和来自含量为0.15重量％的阿霉素的杂质(以盐酸阿霉素的吸光度表示)。
柱：Capsule pack C18UG8 05微米(Shiseido Co.，Ltd.制造)
i.d.4.6mm×150mm
柱温度：40℃
流动相：(A)0.2％磷酸，0.15％SDS/H2O∶CH3CN＝7∶3
(B)0.2％磷酸，0.15％SDS/H2O∶CH3CN＝3∶7
流动速率：1.0ml/分钟
检测器：UV检测器(254nm)
注射量：20微升
实施例4
精确称重制备实施例6中制得的单封端甲氧基聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物的N-乙酰化化合物-阿霉素缩合产物(30mg)，并将其溶解在1ml二甲基甲酰胺中。通过具有以下条件的高速液相色谱定量测定这种溶液。所述转移和结合的二环己基脲衍生物的量不超过0.08％(不超过检测限)。
柱：TC-1(GL Science Co.，Ltd.制造)，20mm×0.25mm
i.d.薄膜厚度0.25微米
流动相：Helium 0.8ml/min
柱温度：70℃，3ml/min，88℃，15℃/min，180℃(5分钟)
注射端：290℃
检测器：FID(290℃)
注射量：分开(20∶1)，1微升
发明效果
本发明可以从聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)嵌段共聚物中除去所含聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)杂质提供高纯度嵌段共聚物，通过缩合所述共聚物和蒽环类抗生素抗癌药形成的聚合载体，它可以用于医药用途，用作药物和基因用载体，也可以提供一种聚合药剂，所述药剂包含蒽环类抗生素抗癌药，它位于聚合载体形成的胶束内核中。
很明显，嵌段共聚物中所含的杂质通过本发明除去，同时并没有对胶束的形成产生任何影响，并且从中除去杂质的聚合载体起到更优越的作用。而且，使用这种高纯度聚合载体制得的聚合药剂可以形成用于临床应用的高纯度聚合载体。
而且，本发明也可以定量测定聚乙二醇和其侧链上具有羧酸的聚(酸性氨基酸)的量，它们是上述嵌段共聚物中的杂质，由此，提供用于改进嵌段共聚物制备方法、其计划制造标准以及管理工艺的成形块。

Claims (9)

1.一种制备聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物或其盐的方法，其中，杂质含量不超过10重量％，该方法包括以下步骤：使用离子交换树脂纯化聚乙二醇；将所述纯化的聚乙二醇与聚(酸性氨基酸)一起形成嵌段共聚物；在视需要除去保护基之后，使用分配/吸附树脂进行纯化工艺。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂质为聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚(酸性氨基酸)是聚天冬氨酸。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述嵌段共聚物是通式(1)所示的共聚物：
Figure C028122840002C1
式中，R1表示氢原子或具有1-5个碳原子的烷基，R2表示具有1-5个碳原子的亚烷基，R3表示亚甲基或亚乙基，且R4表示氢原子或氨基保护基，n是5-1000之间的整数，m是2-300之间的整数，x是0-300之间的整数，x不大于m。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，R1表示具有1-5个碳原子的烷基，R2表示具有1-5个碳原子的亚烷基，R3表示亚甲基或亚乙基，R4表示氢原子或具有1-5个碳原子的酰基，n是5-1000之间的整数，m是2-300之间的整数，x是0-300之间的整数，但是x不大于通式(1)中的m。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，R1表示甲基，R2表示三亚甲基，R3表示亚甲基，R4表示乙酰基，n是20-500之间的整数，m是10-100之间的整数，x是0-100之间的整数，但是x不大于通式(1)中的m。
7.一种制备聚合载体的方法，该方法是将聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物的聚(酸性氨基酸)或其盐与蒽环类抗生素抗癌药残基缩合，它包括：根据权利要求1-6中任一项的方法制备纯化的聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物或其盐，其中，杂质含量不超过10重量％；用反应助剂缩合所述纯化的聚乙二醇和聚(酸性氨基酸)的嵌段共聚物或其盐；分离所述缩合化合物；使所述缩合化合物与蒽环类抗生素抗癌药反应。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蒽环类抗生素抗癌药是阿霉素或其盐。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在所述聚合载体的聚(酸性氨基酸)中，蒽环类抗生素抗癌药残基的结合率为30-55％。
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