PL222061B1

PL222061B1 - Sposób produkcji kopolimeru blokowego, nośnik polimerowy oraz polimerowy preparat farmaceutyczny

Info

Publication number: PL222061B1
Application number: PL366773A
Authority: PL
Inventors: Takeshi Nakanishi; Kazuhisa Shimizu; Ryuji Uehara; Masanobu Suzuki; Megumi Machida; Tomoko Akutsu; Shigeto Fukushima
Original assignee: Nippon Kayaku Kk; Sakurai Yasuhisa
Priority date: 2001-06-20
Filing date: 2002-06-19
Publication date: 2016-06-30
Also published as: CA2450448A1; EP1408066B1; AU2002346296B2; ES2343679T3; US7138490B2; WO2003000771A1; EP1408066A4; RU2004101281A; PL366773A1; JP4462928B2; JPWO2003000771A1; ATE462746T1; US20040151690A1; EP1408066A1; RU2282641C2; KR100924990B1; CN1518573A; CN100378140C; DE60235812D1; KR20040030693A

Description

Przedmiotowy wynalazek dotyczy sposobu produkcji kopolimeru blokowego, nośnika polimerowego oraz polimerowego preparatu farmaceutycznego.

Znany jest sposób, według którego za pomocą nośnika polimerowego, który tworzy micelę, lek, geny itp. są przenoszone w odległe miejsce w żywym organizmie, jednakże w odniesieniu do kopolimeru blokowego użytego do tego celu zanieczyszczenia nie zostały z niego wystarczająco usunięte.

Konwencjonalnie procesy oczyszczania syntetycznego związku wielkocząsteczkowego, takiego jak kopolimer blokowy, przeprowadzane są przez zastosowanie dializowania, ultrafiltracji i wytrącania. Takim sposobem oczyszcza się kopolimer będący przedmiotem zgłoszenia patentowego EP0397307 (A2). Jest to rozpuszczalny w wodzie blokowy kopolimer zawierający segment hydrofobowy, który zawiera farmakologicznie aktywną część łańcucha bocznego. Może on być stosowany do produkcji leku. Sposób wytwarzania polimerowych preparatów farmaceutycznych jest na przykład opisany w japońskim zgłoszeniu patentowym nr 7-69900, według którego mieszany rozpuszczalnik z dimetyloformamidu i wody, w którym rozpuszcza się kopolimer blokowy i antracyklinowy czynnik przeciwrakowy, poddaje się dializie za pomocą membrany dializowej i ultrafiltrowaniu za pomocą błony ultrafiltracyjnej, a następnie wymraża się i suszy, jeśli jest to potrzebne.

W przypadku sposobów oczyszczania opartych na dializowaniu i ultrafiltracji procesy oddzielania i oczyszczania przeprowadza się w oparciu o różnicę mas cząsteczkowych. Zwykle membrany do dializowania i błony do ultrafiltracji klasyfikuje się w dwóch grupach w zależności od maksymalnej masy cząsteczkowej, która jest przepuszczana. Jednakże istnieją znaczne różnice masy cząsteczkowej w obrębie frakcji. W konsekwencji przy stosowaniu sposobów oczyszczania syntetycznego związku wielkocząsteczkowego, takiego jak kopolimer blokowy, przez dializowanie i ultrafiltrację nie ma możliwości przeprowadzania wystarczających procesów oczyszczających w przypadku, gdy nie ma dużej różnicy pomiędzy masą cząsteczkową docelowego syntetycznego związku wielkocząsteczkowego a masą cząsteczkową zanieczyszczeń. Ponadto sposoby te nie nadają się do zastosowań przemysłowych i są przeważnie używane jako sposoby oczyszczania w laboratoriach.

Natomiast sposób oczyszczania wykorzystujący proces wytrącania jest szeroko stosowany jako sposób nadający się również do użycia w przemyśle. Według tego sposobu procesy oczyszczania z zanieczyszczeń wykorzystują różnice rozpuszczalności, przy czym sposób ten bardziej się nadaje do usuwania składników o małej masie cząsteczkowej z syntetycznego związku wielkocząsteczkowego, takiego jak kopolimer blokowy. Jednakże w przypadku zanieczyszczeń o większych masach cząsteczkowych, takich jak glikole polietylenowe i poli(kwasowe aminokwasy) istnieje tylko niewielka różnica rozpuszczalności w rozpuszczalniku pomiędzy syntetycznym związkiem wielkocząsteczkowym, takim jak kopolimer blokowy, a zanieczyszczeniami, na skutek czego związek wielkocząsteczkowy, taki jak kopolimer blokowy, nie jest wystarczająco oczyszczany przez proces wytrącania.

Jak opisano powyżej, zanieczyszczenia o większej masie cząsteczkowej zawarte w kopolimerze blokowym nie były zadowalająco usuwane, a sposób oczyszczania, który byłby stosowany do uzyskania kopolimeru blokowego, nadającego się do preparatów farmaceutycznych itp., nie jest znany.

Ponadto w odniesieniu do tworzącego micelę kopolimeru blokowego mającego właściwość amfipatyczności konwencjonalny sposób ilościowego oznaczania zanieczyszczeń w kopolimerze blokowym nie zapewnia wystarczających wyników analizy. Według konwencjonalnego sposobu syntetyczny związek o dużej masie cząsteczkowej, taki jak kopolimer blokowy, rozpuszcza się w rozpuszczalniku i analizuje się stosując szybką chromatografię cieczową, do której dołączona jest kolumna żelowo-permeacyjna (chromatografia żelowo-permeacyjna: GPC).

Jednakże, kiedy jest tylko niewielka różnica masy cząsteczkowej pomiędzy kopolimerem blokowym a zanieczyszczeniami zawartymi w nim, trudno jest oddzielić je z wyraźnymi pikami, w związku z czym brak jest sposobu oznaczania ilościowego zanieczyszczeń z wystarczającą dokładnością.

Ponadto, nawet gdy istnieje wystarczająca różnica masy cząsteczkowej pomiędzy nimi, jeśli ilość zanieczyszczeń jest niewielka, nie można otrzymać wyraźnych pików. Jest to spowodowane tym, że ponieważ żelowo-permeacyjny mechanizm rozdzielania wykorzystuje dyfuzję molekularną, pik ma tendencję do rozszerzania się na chromatogramie, powodując niewystarczające wysokości pików w stosunku do składnika występującego w małej ilości. W konsekwencji i w tym przypadku ten konwencjonalny sposób nie daje oznaczania ilościowego z wystarczającą dokładnością.

PL 222 061 B1

Ponadto, ponieważ konwencjonalny sposób oddziela i ilościowo oznacza główny składnik i zanieczyszczenia w zależności od różnicy masy cząsteczkowej, nie uzyskuje się żadnych informacji jakościowych, takich jak struktury i pochodzenie zanieczyszczeń.

Wynalazcy przedmiotowego wynalazku usilnie pracowali nad rozwiązaniem wymienionych wyżej problemów, czego wynikiem jest niniejszy wynalazek.

Przedmiotem wynalazku jest sposób produkcji kopolimeru blokowego glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu) określonego wzorem (1):

gdzie R¹ oznacza grupę alkilową zawierającą 1-5 atomów węgla, R² oznacza grupę alkilenową zawierającą 1-5 atomów węgla, R³ oznacza grupę metylenową albo etylenową, a R⁴ oznacza atom wodoru albo grupę acylową zawierającą 1-5 atomów węgla, przy czym n jest liczbą całkowitą od 5 do 1000, m jest liczbą całkowitą od 2 do 300, a x jest liczbą całkowitą od 0 do 300, z tym, że x jest nie większe niż m, lub jego sól. Sposób według wynalazku charakteryzującego się tym, że zawartość zanieczyszczeń składających się z glikoli polietylenowych oraz poli(kwasowych aminokwasów) wynosi co najwyżej 10% wagowo, wtedy gdy pochodną glikolu polietylenowego według wzoru; 1 2 1 2

R¹-(OCH2CH2)n-O-R²-NH2, gdzie R¹, R² oraz n są zdefiniowane powyżej, oczyszcza się za pomocą żywicy jonowymiennej w celu przygotowania kopolimeru blokowego, a po usunięciu grupy osłonowej grupy karboksylowej w łańcuchu bocznym kwaśnego aminokwasu, wybranej z grupy zawierającej grupę metylową, etylową, propylową butylową, benzylową, fenetylową, p-metoksybenzylową i p-nitrobenzylową przeprowadza się proces oczyszczania przy użyciu żywicy rozdzielającej/adsorpcyjnej.

2 3

Korzystnie R¹ oznacza grupę metylową, R² oznacza grupę trimetylenową, R³ oznacza grupę metylenową, a R⁴ oznacza grupę acetylową, przy czym n jest liczbą całkowitą od 20 do 500, m jest liczbą całkowitą od 10 do 100, a x jest liczbą całkowitą od 0 do 100, jednakże x jest nie większe niż m we wzorze (1). Korzystniejsza jest grupa acetylowa, n oznacza tu liczbę całkowitą od 5 do 1000, korzystnie 20-500, najkorzystniej 80-300, m jest liczbą całkowitą od 2 do 300, korzystniej 10-100, najkorzystniej 20-50, a x oznacza liczbę całkowitą od 0 do 300, korzystniej 0-100, najkorzystniej 0-50, jednakże x nie jest większe niż m.

Według wynalazku nośnik polimerowy, zawierający poli(kwasowy aminokwas) kopolimeru blokowego wyprodukowanego powyższym sposobem charakteryzuje się tym, że poli(kwasowy aminokwas) kopolimeru blokowego jest skondensowany z resztą doksorubicynową, przy czym kondensacja pomiędzy poli(kwasowym aminokwasem) a resztą doksorubicynową jest kondensacją pomiędzy grupą karboksylową w bocznym łańcuchu poli(kwasowego aminokwasu) a resztą doksorubicynową, zaś reszta doksorubicynowa w poli(kwasowym aminokwasie) ma stopień wiązania 30-55%.

Polimerowy preparat farmaceutyczny według wynalazku zawiera kompleks leku z kopolimerem blokowym, w którym doksorubicyna lub jej sól są zawarte w wewnętrznym rdzeniu miceli utworzonej przez nośnik polimerowy określony powyżej, przy czym związek kompleks leku z kopolimerem blokowym jest zawarty w postaci substancji wysuszonej przez wymrażanie.

Kopolimer blokowy wytworzony według wynalazku i odznaczający się wysoką czystością, nadaje się do stosowania jako nośnik leku itp., nośnika polimerowego utworzonego przez reakcję kondensacji kopolimeru blokowego z antracyklinowym czynnikiem przeciwrakowym i użytego jako nośnik leku, polimerowych preparatów farmaceutycznych tworzonych przez ten nośnik polimerowy.

Wynalazek jest poniżej wyjaśniony bardziej szczegółowo.

Sposobem według przedmiotowego wynalazku otrzymuje się kopolimer blokowy glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu) lub jego soli, w którym zawartość zanieczyszczeń jest nie większa niż 10% wag. W wyniku analizy zanieczyszczeń zawartych w tym kopolimerze blokowym stwierdzono, że zanieczyszczenia złożone są z glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu), to znaczy poliaminokwasu posiadającego w swym łańcuchu bocznym kwas karboksylowy. Przykłady glikoli polietylenowych obejmują glikol polietylenowy oraz pojedynczo zakończony grupą alkoksy glikol

PL 222 061 B1 polietylenowy. Przykłady poli(kwasowego aminokwasu) obejmują kwas poliglutaminowy i kwas poliasparaginowy.

Według przedmiotowego wynalazku, jeśli chodzi o poli(kwasowy aminokwas) w kopolimerze blokowym z glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu), przykłady obejmują polimer a- i/lub β-aminokwasu posiadającego grupę karboksylową na swym łańcuchu bocznym, korzystnie kwas poliglutaminowy lub kwas poliasparaginowy.

Przykłady soli kopolimeru blokowego otrzymywanego sposobem według przed miotowego wynalazku obejmują sól metalu alkalicznego, sól metalu ziem alkalicznych, sól amonową i organiczną sól amonową, a korzystnymi przykładami są sól sodowa, sól potasowa, sól wapniowa, sól amonowa i sól trietyloamonowa.

Uważa się, że zanieczyszczenia zawarte w kopolimerze blokowym nie tworzą miceli i nie są wykorzystywane jako nośnik polimerowy w medycynie, genetyce itp. Dlatego w zastosowaniu w medycynie zawartość zanieczyszczeń jest korzystnie zmniejszona do nie więcej niż 10%, korzystniej nie więcej niż 5%.

Jak podano powyżej, w pierwszym rzędzie wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kopolimeru blokowego glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu) lub jego soli, według którego glikole polietylenowe oczyszcza się za pomocą żywicy jonowymiennej, a następnie tworzy się kopolimer blokowy z poli(kwasowym aminokwasem), po czym usuwa się z niego grupę osłonową, jeśli trzeba, kopolimer blokowy oczyszcza się przez użycie żywicy oddzielającej/adsorpcyjnej. Jeśli chodzi o kopolimer blokowy glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu), korzystnie stosuje się taki sam kopolimer blokowy, jak wspomniany powyżej kopolimer blokowy glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu). Jeżeli kopolimer blokowy jest chroniony przez grupę osłonową, chociaż w odniesieniu do grupy osłonowej nie ma szczególnych ograniczeń, dopóki normalnie osłania ona grupę karboksylową w łańcuchu bocznym kwaśnego aminokwasu, jej przykłady obejmują ester z niższym alkoholem oraz ester z grupą arylową zastępującą niższy alkohol taki, który może mieć podstawnik. Specyficznymi przykładami są ester metylowy, ester etylowy, ester propylowy, ester butylowy, ester benzylowy, ester fenetylowy, ester p-metoksybenzylowy i ester p-nitrobenzylowy. Jeśli chodzi o sposób usuwania grupy osłonowej, odpowiedni sposób wybiera się z normalnie stosowanych sposobów w zależności od grupy osłonowej i na przykład można stosować hydrolizę kwasu lub zasady oraz sposób hydrogenolizy z użyciem katalizatora itp.

W odniesieniu do kopolimeru blokowego glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu) według przedmiotowego wynalazku, który ma zmniejszoną zawartość zanieczyszczeń, następujący opis przedstawi sposób oczyszczania przykładowo związku według wzoru (1).

Proces modyfikowania zakończenia grupą wodorotlenową glikolu metoksypolietylenowego z pojedynczym zakończeniem można przeprowadzać sposobami wykorzystującymi znane w odpowiednich gałęziach przemysłu reakcje. Przykładowo proponowano następujące sposoby: sposób, w którym umożliwia się reakcję iminy etylenowej itp., sposób, w którym po akrylonitrylu metakrylonitryl itp. poddaje się procesowi addycji Michela, grupę nitrylową redukuje się w celu przetworzenia w grupę aminową, sposób, w którym po podstawieniu grupy wodorotlenowej do grupy chlorowcowej umożliwia się jej reakcję z aminą alkoholową, taką jak amina etanolowa oraz sposób, w którym grupę wodorotlenową przetwarza się bezpośrednio w grupę nitrylową, a następnie redukuje się w celu przetworzenia w grupę aminową.

Glikol polietylenowy, którego zakończenie jest modyfikowane do grupy aminowej, obejmuje pojedynczo zakończone glikole polietylenowe z niepełną modyfikacją, to znaczy przykładowo pojedynczo zakończony glikol polietylenowy zakończony grupą wodorotlenową i pojedynczo zakończony glikol polietylenowy, do zakończenia którego dodany jest akrylonitryl.

PL 222 061 B1

Te glikole polietylenowe, które mają niekompletną modyfikację, mogą być usuwane w oddzielny sposób przez wykorzystanie materiału jonowymiennego posiadającego kwasową grupę funkcjonalną. Chociaż nie są szczególnie ograniczone, jeżeli tytko zawierają kwasową grupę funkcjonalną, przykłady materiału jonowymiennego mogą obejmować: Diaion SKIB (produkcji Mitsubishi Chemical Corporation), Diaion PK-216 (produkcji Mitsubishi Chemical Corporation), Diaion WK-10 (produkcji Mitsubishi Chemical Corporation), Diaion WK20 (produkcji Mitsubishi Chemical Corporation), Amberlite 120B (produkcji Rohm and Haas Japan Co.), Amberlite 200C (produkcji Rohm and Haas Japan Co.), Amberlite IRC-50 (produkcji Rohm and Haas Japan Co.), Amberlite IRC-76 (produkcji Rohm and Haas Japan Co.) oraz Dowex50W (produkcji Dow Chemical Corp.), które służą jako żywice jonowymienne, a ponadto obejmują też SP-Sephadex C-25 (produkcji Pharmacia Biotech), SP-Sephadex C-50 (produkcji Pharmacia Biotech), CM-Sephadex C-25 (produkcji Pharmacia Biotech), CM-Sephadex C-50 (produkcji Pharmacia Biotech), SP-Toyopearl 550 (produkcji Toso K.K.), SP-Toyopearl 650 (produkcji Toso K.K.), CM-Sephadex 550 (produkcji Pharmacia) oraz CM-Sephadex 650 (produkcji Pharmacia), który służy jako żel jonowymienny, a szczególnie korzystnie stosuje się SP-Toyopearl 650 i CM-Sephadex 650. Sposób oczyszczania uzyskanego glikolu polietylenowego może być albo sposobem wsadowym, albo sposobem kolumnowym, przy czym korzystniejszy jest sposób kolumnowy. Inaczej mówiąc, pojedynczo zakończony glikol metoksypolietylenowy ze zmodyfikowanym zakończeniem jest rozpuszczany w rozpuszczalniku. Odnośnie do stosowanego rozpuszczalnika nie ma szczególnych ograniczeń, jeżeli nadaje się on do procesu wymiany jonów, a szczególnie korzystna jest woda lub mieszany rozpuszczalnik woda/rozpuszczalnik organiczny, np. woda/metanol i woda/acetonitryl. Następnie umożliwia się przejście otrzymanego roztworu przez kolumnę, w której umieszczony jest wymieniony wyżej materiał jonowymienny w postaci H⁺, a kolumnę tę przepłukuje się potem wodą lub mieszanym rozpuszczalnikiem woda/rozpuszczalnik organiczny, tak że usuwane są z niej te glikole polietylenowe, które nie zostały całkowicie zmodyfikowane. Następnie pojedynczo zakończony glikol metoksypolietylenowy z zakończeniem modyfikowanym do grupy aminowej, który został adsorbowany, wymywa się rozpuszczalnikiem z dodaną do niego substancją zasadową, taką jak wodny roztwór amoniaku lub mieszany rozpuszczalnik z wodnego roztworu amoniaku i rozpuszczalnika organicznego. Tak eluowany roztwór poddaje się odpowiednim procesom, takim jak proces kondensacji lub wymrażania i suszenia, tak że otrzymuje się pojedynczo zakończony glikol metoksypolietylenowy z zakończeniem modyfikowanym do grupy aminowej, charakteryzujący się wysoką czystością.

Następnie ten pojedynczo zakończony glikol metoksypolietylenowy z zakończeniem modyfikowanym do grupy aminowej dopuszcza się do reagowania na przykład z bezwodnikiem N-karboksylowym kwasu aminowego, w którym grupa karboksylowa w łańcuchu bocznym została osłonięta tak, że syntezowany jest kopolimer blokowy, a w razie potrzeby grupa aminowa na zakończeniu jest potem acetylowana przez bezwodnik octowy itp. Następnie, w razie potrzeby, osłonięta grupa w łańcuchu bocznym jest odsłaniana, tak że otrzymuje się kopolimer blokowy glikol polietylenowy - poli(kwasowy aminokwas).

Tak otrzymany kopolimer blokowy glikol polietylenowy-poli(kwasowy aminokwas) zawiera poli(kwasowy aminokwas) jako zanieczyszczenie. Jednakże można go oczyścić za pomocą żywicy przegradzającej/adsorpcyjnej. Jeśli chodzi o tę żywicę przegradzającą/adsorpcyjną, jej przykłady obejmują żel krzemionkowy, sproszkowany krzemian, żel krzemionkowy modyfikowany węglowodorem oraz żywicę styren-diwinylobenzen, a korzystnie stosuje się żywicę styren-diwinylobenzen. Ponadto korzystniej stosuje się HP-20 SS (produkcji Mitsubishi Chemical Corporation).

Sposób oczyszczania wynikowego kopolimeru glikol polietylenowy-poli(kwasowy aminokwas) może być albo wsadowy, albo kolumnowy. Korzystniejszy jest sposób kolumnowy. Inaczej mówiąc kopolimer blokowy glikol polietylenowy-poli)kwaśny aminokwas) rozpuszcza się w rozpuszczalniku. Stosowany rozpuszczalnik nie jest szczególnie ograniczony dopóki ma podstawowe właściwości wystarczające do dysocjacji poli)kwaśnego aminokwasu) i nadaje się do żywicy przegradzająco-adsorpcyjnej. Korzystne przykłady obejmują wodny roztwór wodorotlenku metalu alkalicznego lub mieszany roztwór wodnego roztworu wodorotlenku metalu alkalicznego i organicznego rozpuszczalnika, taki jak roztwór wodny wodorotlenku sodu z metanolem i wodny roztwór wodorotlenku sodu z acetonitrylem. Roztwór kopolimeru blokowego glikol polietylenowy-poli(kwasowy aminokwas)rozpuszczonego w rozpuszczalniku przepuszcza się przez kolumnę z umieszczoną w niej żywicą przegradzająco-adsorpcyjną, a następnie wodny roztwór wodorotlenku sodu lub mieszany roztwór wodny wodorotlenku sodu i rozpuszczalnika organicznego przepuszcza się przez kolumnę w celu usunięcia poli(kwasowego aminokwasu). Następnie adsorbowany kopolimer blokowy glikol polietylenowy- poli(kwasowy amino6

PL 222 061 B1 kwas) wymywa się stosując rozpuszczalnik mniej polarny, taki jak mieszany rozpuszczalnik z wody i rozpuszczalnika organicznego o zwiększonej zawartości rozpuszczalnika organicznego. Tak eluowany roztwór poddaje się odpowiednim procesom dodatkowym, takim jak proces kondensacji, proces wymrażania i suszenia lub wytrącanie, tak że otrzymuje się kopolimer blokowy glikol polietylenowypoli(kwasowy aminokwas) o wysokiej czystości.

Drugi aspekt dotyczy nośnika polimerowego, który otrzymuje się przez kondensację oczyszczonego kopolimeru blokowego glikol polietylenowy- poli(kwasowy aminokwas) wraz z antracyklinowym czynnikiem przeciwrakowym. Jeśli chodzi o nośnik polimerowy, proponowany jest związek wielkocząsteczkowy o następującym wzorze (3). Wynalazek dotyczy również jego soli.

gdzie R oznacza grupę wodorotlenową lub reszta antracyklinowego czynnika przeciwrakowego, 23 oznacza atom wodoru albo niższą grupę alkilową, R² oznacza grupę łączącą, R³ oznacza grupę metylenową lub grupę etylenową, a R⁴ oznacza atom wodoru lub grupę osłonową grupy aminowej, przy czym n jest liczbą całkowitą od 5 do 1000, m jest liczbą całkowitą od 2 do 300, a x+y jest liczbą całkowitą od 0 do 300, jednakże x+y nie jest większe niż m.

Przykłady grupy R w związku według wzoru (3) obejmują grupę wodorotlenową lub reszta antracyklinowego czynnika przeciwrakowego. W części kopolimeru blokowego, stanowiącej poli(kwasowy aminokwas), rząd wiązania odpowiednich części składowych nie jest szczególnie ograniczony i może być ustalany przypadkowo lub regularnie. Tryb wiązania pomiędzy resztą kwasu karboksylowego łańcucha bocznego poli(kwasowego aminokwasu) kopolimeru blokowego oraz resztą antracyklinowego czynnika przeciwrakowego nie jest szczególnie ograniczony, a korzystnie stosuje się wiązanie amidowe do grupy aminowej reszty antracyklinowego czynnika przeciwrakowego. W szczególności stosuje się korzystnie wiązanie amidowe utworzone przez pierwotną grupę aminową będącej cukrem aminowym części antracyklinowej reszty czynnika przeciwrakowego. Rząd antracyklinowego czynnika przeciwrakowego spojonego z resztą kwasu karboksylowego części łańcucha bocznego, będącej poli(kwasowym aminokwasem) wynosi od 1 do 100%, a jeśli uwzględni się zdolność tworzenia miceli, rząd ten jest korzystnie ustawiony w zakresie od 10 do 60%, korzystniej 30-55%. Przykłady reszty antracyklinowego czynnika przeciwrakowego obejmują reszty takie jak daunorubicyna, doksorubicyna, akrarubicyna, epirubicyna i pirarubicyna, przy czym korzystne są reszty doksorubicyny.

R¹, R², R³, R⁴, n i m są korzystnie ustawione w takim samym zakresie, jak opisano wcześniej. x+y jest tu liczbą całkowitą od 0 do 300, korzystnie od 0 do 100, jeszcze korzystniej od 0 do 50, a x i y mogą mieć dowolne wartości obejmujące 0, jeśli tylko każda z nich jest liczbą całkowitą spełniającą wymienione wyżej warunki.

Polimerowy nośnik otrzymuje się za pomocą procesów, w których: oczyszczony kopolimer blokowy z glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu) poddaje się kondensacji z pomocnikiem reakcji, a po kondensacji związek oddziela się i umożliwia się mu reagowanie z antracyklinowym czynnikiem przeciwrakowym. Polimerowy nośnik otrzymuje się sposobem opisanym w Międzynarodowej Publikacji nr WO97/12895, to znaczy sposobem, w którym kopolimer blokowy i antracyklinowy czynnik przeciwrakowy poddaje się kondensacji stosując dehydratacyjny czynnik kondensacyjny typu karbodiimidu. Jednakże w tym czasie acyloizokarbamid, który jest aktywnym czynnikiem pośredniczącym, jest przenoszony przez przegrupowanie wewnątrzcząsteczkowe, by wytworzyć acylokarbamid jako produkt uboczny, otrzymując w rezultacie nośnik polimerowy, do którego dodany jest acylokarbamid. Temperatura otworu wejściowego w chromatografii gazowej jest ustawiana na wystarczająco wysokim poziomie, a następnie oznacza się ilościowo dodany acylokarbamid, będący produktem ubocznym, mierząc pochodne izocyjanianowe, które zostały rozłożone termicznie z acylokarbamidu.

PL 222 061 B1

Poniżej wymieniony sposób wytwarzania opisany jest bardziej szczegółowo. Oczyszczony kopolimer blokowy rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym i dodaje się dehydracyjnego czynnika kondensacyjnego oraz pomocnika reakcji, tak że zachodzi reakcja, a pochodne alkilokarbamidu, wytworzone podczas tej reakcji, są filtrowane tak, że aktywny materiał estrowy jest oddzielany od filtratu. Następnie, po dodaniu antracyklinowego czynnika przeciwrakowego lub jego soli do otrzymanego aktywnego materiału estrowego w rozpuszczalniku organicznym dodaje się do tego zasady, jeśli trzeba, by spowodować reakcję i z roztworu reakcyjnego oddziela się polimerowy nośnik. Chociaż rozpuszczalnik organiczny nie jest szczególnie ograniczony, jeśli tylko materiał reakcyjny rozpuszcza się w nim, korzystnie stosuje się tu niewodny rozpuszczalnik polarny, którego przykłady obejmują formamid dimetylowy, acetamid dimetylowy i 1,3-dimetylo-2-imidazolidinon, przy czym korzystniejsze jest stosowanie formamidu dimetylowego. Jako dehydracyjny czynnik kondensacyjny używany do kondensacji pomiędzy kopolimerem blokowym a pomocnikiem reakcji, zwykle stosuje się czynnik kondensacyjny używany do syntezy peptydów, korzystnie taki jak karbodiimid dicykloheksylowy (DCC) i karbodiimid 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylowy) (EDC). W charakterze pomocnika reakcji zwykle stosuje się pomocnik reakcji używany do syntezy peptydów. Jego przykłady obejmują związki N-hydroksy, korzystnie N-hydroksysukcynoimid, N-hydroksybenzotriazol itp. Jako zasadę, chociaż nie jest ona szczegóinie ograniczona, korzystnie stosuje się zasady organiczne, takie jak trietyloamina. Jako antracyklinowy czynnik przeciwrakowy stosuje się związek na bazie antracykliny, który dostarcza wymienionej wyżej reszty antracyklinowego czynnika przeciwrakowego.

Ponadto trzeci aspekt przedmiotowego wynalazku dotyczy polimerowego preparatu farmaceutycznego, który zawiera związek kompleksu leku z kopolimerem blokowym, w którym antracyklinowy czynnik przeciwrakowy jest zamknięty w wewnętrznym rdzeniu miceli utworzonej przez nośnik polimerowy utworzony przez oczyszczony kopolimer blokowy z glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu). Przykłady antracyklinowego czynnika przeciwrakowego obejmują związki, takie jak daunorubicyna, akrarubicyna, epirubicyna i pirarubicyna lub ich sole, przy czym korzystna jest doksorubicyna lub jej sole.

Wynalazek dotyczy również polimerowego preparatu farmaceutycznego, w którym związek kompleksu leku z kopolimerem blokowym ma postać substancji suszonej przez wymrażanie. Sposób wytwarzania wymienionego wyżej polimerowego preparatu farmaceutycznego nie jest szczególnie ograniczony i można stosować sposób opisany we wspomnianym wcześniej japońskim zgłoszeniu patentowym nr 7-69900, to znaczy sposób, według którego mieszany rozpuszczalnik z dimetyloformamidu i wody, w którym rozpuszcza się kopolimer blokowy i antracyklinowy czynnik przeciwrakowy, poddaje się dializie za pomocą membrany dializowej i ultrafiltrowaniu za pomocą błony ultrafiltracyjnej, a następnie wymraża się i suszy, jeśli jest to potrzebne. Ponadto można stosować inny sposób, według którego kopolimer blokowy i antracyklinowy czynnik przeciwrakowy rozpuszcza się w mieszanym rozpuszczalniku z niskowrzącego rozpuszczalnika organicznego zmieszanego z wodą, np. z etanolu i wody, a otrzymany roztwór poddaje się kondensacji, aby oddestylować niskowrzący rozpuszczalnik organiczny oraz wymraża się i suszy, jeśli trzeba.

Z wynalazkiem łączy się sposób oznaczania ilościowego, przy czym po ilościowym oznaczeniu zanieczyszczeń zawartych w wymienionym wyżej kopolimerze blokowym z glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu) kopolimer blokowy rozpuszcza się w rozpuszczalniku i roztwór traktuje się żywicą tak, że roztwór podlega chromatograficznemu oczyszczaniu za pomocą kolumny żelowopermeacyjnej. Przykłady kopolimeru blokowego z glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu) i zanieczyszczeń zawartych w takim kopolimerze blokowym są takie same jak opisano wcześniej.

Według przedmiotowego wynalazku, jeśli chodzi o rozpuszczalnik stosowany do rozpuszczania kopolimeru blokowego z glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu) po ilościowym oznaczeniu glikoli polietylenowych zawartych jako zanieczyszczenia można użyć dowolnego potrzebnego rozpuszczalnika nadającego się do rozpuszczania kopolimeru blokowego. Korzystnie stosuje się roztwór wodny, którego współczynnik pH jest ustawiany za pomocą odpowiedniej soli, albo rozpuszczalnik mieszany z tego wodnego roztworu i rozpuszczalnika organicznego, takiego jak metanol, etanol, acetonitryl i tetrahydrofuran. Jeśli chodzi o sól stosowaną do ustawiania wartości współczynnika pH, można stosować normalnie używane sole o działaniu buforującym, korzystnie fosforany, borany, wodorowęglan sodu, ftalany, triswodorochlorki itp.

Ponadto, jeśli chodzi o rozpuszczalnik używany do ilościowego oznaczania poliaminokwasu zawartego jako zanieczyszczenia, można stosować każdy żądany rozpuszczalnik, który nadaje się do rozpuszczania kopolimeru blokowego glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu) oraz do

PL 222 061 B1 dysocjowania kwasu karboksylowego w łańcuchu bocznym po ilościowym oznaczeniu glikoli polietylenowych. Korzystnie stosuje się wodny roztwór, którego wartość współczynnika pH jest ustawiana przy użyciu odpowiedniej soli lub mieszany rozpuszczalnik z tego roztworu wodnego i rozpuszczalnika organicznego, takiego jak metanol, etanol, acetonitryl i tetrahydrofuran. W celu odpowiedniego dysocjowania kwasu karboksylowego w bocznym łańcuchu wartość współczynnika pH rozpuszczalnika korzystnie ustawia się w zakresie 5-13, a jeśli chodzi o sól stosowaną do tego celu, używa się wymienionych wyżej fosforanów, boranów, wodorowęglanu sodu, ftalanów, triswodorochlorków itp.

Według przedmiotowego wynalazku, jeśli chodzi o żywicę stosowaną do przetwarzania roztworu kopolimeru blokowego po ilościowym oznaczeniu glikoli polietylenowych zawartych w kopolimerze blokowym jako zanieczyszczenia korzystnie stosuje się żywicę jonowymienną, która może two rzyć przeciwjon wobec jonowo zdysocjowanej grupy kopolimeru blokowego, to znaczy żywicę anionowowymienną. Bez szczególnego ograniczenia może być stosowana dowolna żywica jonowymienna, taka jak dialkiloamina, trialkiloamina i dialkiloetanoloamina, jeżeli tylko ma zasadową grupę funkcjonalną.

Jeśli chodzi o sposób analizowania, można stosować albo sposób wsadowy, albo sposób kolumnowy. Korzystniejszy jest sposób kolumnowy.

Proponowany jest sposób kolumnowy, według którego kolumnę ładuje się żywicą jonowymienną, taką jak Diaion SA10A(produkcji Mitsubishi Chemical Corporation), Diaion PA318 (produkcji Mitsubishi Chemical Corporation), Diaion SA20A (produkcji Mitsubishi Chemical Corporation), Diaion WA30 (produkcji Mitsubishi Chemical Corporation), Diaion WA10 (produkcji Mitsubishi Chemical Corporation), Amberlite IRA402 (produkcji Rohm and Haas Japan Co.), Amberlite MR904 (produkcji Rohm and Haas Japan Co.), Amberlite IRA410 (produkcji Rohm and Haas Japan Co.), Amberlite IRA93 (produkcji Rohm and Haas Japan Co.), Amberlite IRA68 (produkcji Rohm and Haas Japan Co.) oraz Dowex66 (produkcji Dow Chemical Japan Corp.); celulozowy materiał jonowymienny, taki jak Cellex QAE (produkcji Bio-Rad Co., Ltd.), Cellex PEI (produkcji Bio-Rad Co., Ltd.), Cellex D (produkcji Bio-Rad Co., Ltd.) oraz Cellex DE52 (produkcji Bio-Rad Co., Ltd.); lub żelowy materiał jonowymienny, taki jak QAE-Sephadex A25 (produkcji Pharmacia Biotech), QAE-SephadexA50 (produkcji Pharmacia Biotech), DEAE-Sephadex A25 (produkcji Pharmacia Biotech), DEAE-SephadexA50 (produkcji Pharmacia Biotech), DEAE-Separose CL-6B (produkcji Pharmacia Biotech) i DEAE-Bio Gel A (produkcji Pharmacia Biotech); albo też proponowany jest inny sposób, w którym stosowany jest handlowy wkład, który jest uprzednio naładowany żywicą jonowymienną i służy do wstępnego przeprowadzania szybkiej chromatografii cieczowej, taki jak Sep-Pak OMA (produkcji Waters Co., Ltd.), Sep-Pak NH2 (Waters Co., Ltd.), Bond Elut PSA (produkcji Barian Co., Ltd.), Bond Elut DMA (produkcji Barian Co., Ltd.) oraz Bond Elut SAX (produkcji Barian Co., Ltd.). Z punktu widzenia łatwości analizowania korzystnie stosuje się sposób z wykorzystywaniem wkładów. Szczególnie korzystnie stosuje się Sep-Pak QMA.

W analizie ilościowej na glikole polietylenowe zawarte w kopolimerze blokowym jako zanieczyszczenia niektóre glikole polietylenowe, które zostały poddane wymienionym obróbkom za pomocą żywicy i były eluowane bez adsorbowania przez żywicę, są analizowane przez szybką chromatografię cieczową przy użyciu kolumny żelowo-permeacyjnej, by otrzymać wyniki analizy. Według tego sposobu, ponieważ eluowany roztwór może być kondensowany do wysokiego stężenia, możliwa staje się analiza ilościowa glikoli polietylenowych z dużą czułością.

Według przedmiotowego wynalazku, jeśli chodzi o nośnik do kolumny żelowo-permeacyjnej do stosowania w ilościowych pomiarach zanieczyszczeń, bez szczególnych ograniczeń można stosować dowolny nośnik, jeżeli tylko jest on stosowany w szybkiej chromatografii cieczowej, jednakże, zależnie od odpowiedniej masy cząsteczkowej zanieczyszczeń w kopolimerze blokowym, stosuje się nośniki posiadające odpowiednie masy cząsteczkowe wyłączające ekskluzję. Jeśli chodzi o pomiary ilościowe glikoli polietylenowych, stosuje się przykładowo następujące nośniki: Shodex OHpak SB-803 HQ (produkcji Showa Denko K.K.), Shodex OHpak SB-802.5 HQ (produkcji Showa Denko K.K.), Shodex OHpak SB-804 HQ (produkcji Showa Denko K.K.), a jeśli chodzi o ilościowe pomiary poli(kwasowych aminokwasów), stosuje się przykładowo następujące nośniki; Asahipak GF-310 HQ (produkcji Asahi Kasei Corporation) i Asahipak GF-510 HQ (produkcji Asahi Kasei Corporation). Oprócz tego można również stosować GS-320 HQ (produkcji Asahi Kasei Corporation) i Shodex OHpak Q-802 (produkcji Showa Denko K.K.). Jeśli chodzi o szybką chromatografię cieczową, według przedmiotowego wynalazku można stosować przemysłowe urządzenie do szybkiej chromatografii cieczowej.

Jeśli chodzi ponadto o żywicę stosowaną do obróbki roztworu kopolimeru blokowego, aby przeprowadzić pomiary ilościowe na poli(kwasowe aminokwasy), zawarte w kopolimerze blokowym pomięPL 222 061 B1 dzy glikolami polietylenowymi i poli(kwasowym aminokwasem) według przedmiotowego wynalazku, jako zanieczyszczenia, korzystnie stosuje się żywicę, która adsorbuje kopolimer blokowy posiadający wiązanie eterowe, to znaczy żywicę przegradzająco-adsorpcyjną. Jej przykłady obejmują żel krzemionkowy, sproszkowany krzemian, żel krzemionkowy modyfikowany węglowodorem i żywicę styren-diwinylobenzen. Jeśli chodzi o żel krzemionkowy modyfikowany węglowodorem, korzystnie stosuje się żel krzemionkowy modyfikowany węglowodorem zawierającym 1-30 atomów węgla, a zwłaszcza żel krzemionkowy modyfikowany węglowodorem zawierającym 4-18 atomów węgla.

Jeśli chodzi o sposób analizowania, można stosować albo sposób wsadowy, albo sposób kolumnowy. Korzystniejszy jest sposób kolumnowy. Ponadto można stosować kolumnę naładowaną handlową żywicą przegradzająco-adsorpcyjną z ustawieniem rozmiaru według potrzeb. Ponadto można również stosować dostępne w handlu analizujące kolumny do ekstrakcji w stanie stałym, takie jak

Sep-Pak CIS (produkcji Waters Co., Ltd.), Sep-Pak tC18 (produkcji Waters Co., Ltd.), Sep-Pak C8 (produkcji Waters Co., Ltd.), Bond Elut CIS (produkcji BarianCo., Ltd.) oraz Bond Elut C8 (produkcji Barian Co., Ltd.), a korzystnie stosuje się Sep-Pak C18.

Jeśli chodzi o poli(kwasowe aminokwasy) zawarte w kopolimerze blokowym jako zanieczyszcze-nia, ich pomiary ilościowe przeprowadza się w następujący sposób: roztwór, w którym poli(kwasowy aminokwas) został rozpuszczony takim rozpuszczalnikiem, aby zdysocjować kwas karboksylowy, poddaje się działaniu wyżej wymienionej żywicy, a poli(kwasowe aminokwasy), które zostały wymyte bez adsorbowania przez żywicę, oznacza się ilościowo za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej przy użyciu kolumny żelowo-permeacyjnej. Ponieważ wymyty roztwór może być kondensowany do dużego stężenia, sposób ten umożliwia analizę ilościową poli(kwasowych aminokwasów) z dużą czułością.

Przy użyciu takich sposobów analizowania zmierzono ilości glikoli polietylenowych i kwasów poliasparaginowych, które zawarte były w kopolimerze blokowym z glikoli polietylenowych i kwasu poliasparaginowego, otrzymanym w opisanych powyżej procesach oczyszczania, jak również w konwencjonalnym kopolimerze blokowym z glikoli polietylenowych i kwasu poliasparaginowego. Wyniki tych pomiarów przedstawiono poniżej:

Ilości zanieczyszczeń zawartych w kopolimerze blokowym

Zanieczyszczenia Bez oczyszczenia Po oczyszczeniu

Glikole polietylenowe 6,0% wag. 1,3% wag.

Kwas poliasparaginowy 7,5% wag. 2,4% wag.

Wynalazek zostanie poniżej wyjaśniony szczegółowo w przykładach realizacji wynalazku;

P r z y k ł a d 1-go etapu realizacji wynalazku.

Do kolumny szklanej załadowano materiał Toyopearl 650 M (900 ml), przetworzony do postaci H⁺. Pojedynczo zakończony glikol metoksypolietylenowy/3-aminopropoksypolietylenowy (29,97 g) (wagowo średnia masa cząsteczkowa 5287) rozpuszczono w 1,98 I 10% wodnego roztworu acetonitrylu i pozwolono, by roztwór ten przeniknął przez kolumnę. Po przepłukaniu kolumny 1,6 I 10% roztworu wodnego acetonitrylu kolumnę rozwinięto przy użyciu 0,4-molowego wodnego roztworu amoniaku, zawierającego 10% acetonitrylu. Frakcje zawierające docelowy związek zebrano i po zatężen iu pod zmniejszonym ciśnieniem zamrożono je i wysuszono, by otrzymać 25,71 g oczyszczonego pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego/3-aminopropoksypolietylenowego.

P r z y k ł a d 2-go etapu realizacji wynalazku.

Oczyszczony pojedynczo zakończony glikol metoksypolietylenowy/3-aminopropoksypolietylenowy (23,32 g), otrzymany w przykładzie 1-go etapu realizacji wynalazku, rozpuszczono w 466 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i ogrzano do temperatury 35°C. Dodano do tego 42,87 g bezwodnika kwasu β-benzylo-L-asparagino-N-karboksylowego (BLA-NCA) i umożliwiono przebieg reakcji przez 22 h. Mieszaninę reakcyjną wkraplano w mieszany rozpuszczalnik zawierający 3,73 i eteru diizopropylowego (tPE) oraz 0,93 l etanolu (EtOH). Wytrącony osad przefiltrowano i przemyto mieszanym roztworem (4:1) złożonym z IPE i EtOH, a następnie IPE, po czym suszono w próżni tak, że otrzymano 54,29 g kopolimeru z pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego i poli^-benzylo-L-aspara-ginianu) (liczba jednostek kwasu asparaginowego: 29,0).

P r z y k ł a d 3-go etapu realizacji wynalazku.

Kopolimer złożony z pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego i poli^-benzylo-L-asparaginianu) (52,85 g), otrzymany w przykładzie 2-go etapu realizacji wynalazku, rozpuszczono w 529 ml dimetyloformamidu i ogrzano do temperatury 35°C. Dodano do tego 2,5 ml bez10

PL 222 061 B1 wodnika kwasu octowego i umożliwiono przebieg reakcji przez 3 h. Mieszaninę reakcyjną wkraplano do mieszanego rozpuszczalnika zawierającego 4,76 i eteru diizopropylowego (IPE) oraz 0,53 l etanolu (EtOH). Wytrącony osad przefiltrowano przemyto mieszanym roztworem (9:1) z IPE i EtOH, a następnie IPE, po czym wysuszono w próżni tak, że otrzymano 51,67 g N-acetylowanego związku kopolimeru z pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego oraz poli(3-benzylo-Lasparaginianu).

P r z y k ł a d 4-go etapu realizacji wynalazku.

N-acetytowany związek (50,19 g) kopolimeru pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego i poli(3-benzylo-L-asparaginianu), otrzymany w przykładzie 3-go etapu realizacji wynalazku, reagował z 753 ml acetonitrylu i 2,16 i 2-N roztworu wodorotlenku sodu przez 5 h. Po zobojętnieniu mieszaniny reakcyjnej za pomocą 2-N kwasu solnego zatężono ją pod zmniejszonym ciśnieniem w celu usunięcia z niej acetonitrylu, a następnie poddano procesom ekstrakcji stosując trzykrotnie 1,2 l octanu etylu. Po zatężeniu warstwy wodnej ilość roztworu ustawiono na 1,3 I i dodano do niego jeszcze 11 ml 6-N wodorotlenku sodu, by wytworzyć zasadowy roztwór wodny, któremu umożliwiono przenikanie przez kolumnę HP-20 SS (2 I), która została wystarczająco przepłukana. Po płukaniu za pomocą 0,01-N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (8 I) i wody (3 I) przeprowadzono eluowanie za pomocą 50% wodnego roztworu acetonitrylu (6 I). Frakcje zawierające docelowy związek zebrano i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, a wynikowemu roztworowi umożliwiono przenikanie przez materiał Dowex 50W8 (520 ml), który został przetworzony do postaci H⁺ i przemyty 50% roztworem wodnym acetonitrylu (1 I). Eluowany roztwór zatężono jeszcze pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie zamrożono i wysuszono. Tak otrzymany produkt wysuszony przez wymrożenie rozpuszczono w 320 ml dimetyloformamidu (DMF), a otrzymany roztwór wkroplono w mieszany rozpuszczalnik złożony z 2,56 I heksanu i 0,64 I octanu etylu. Wytrącony osad przefiItrowano i przemyto mieszanym roztworem (4:1) heksanu i octanu etylu, a następnie heksanem, po czym wysuszono próżniowo, by otrzymać 33,20 g N-acetylowanego związku kopolimeru pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego i kwasu poliasparaginowego.

P r z y k ł a d 5-go etapu realizacji wynalazku.

N-acetylowany związek kopolimeru pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego i kwasu poliasparaginowego (28,85 g), otrzymany w przykładzie 4-go etapu realizacji wynalazku, rozpuszczono w 577 ml dimetyloformamidu i ogrzano do temperatury 35°C. Do tego dodano 19,75 g dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) oraz 11,01 g N-hydroksysuksynimidu (HOSu) i umożliwiono reagowanie z nimi przez 1 h. Otrzymany dicykloheksylokarbamid przefiItrowano przez bawełniany korek. Tak otrzymany filtrat rozcieńczono 2,3 I octanu etylu i dodano do tego 3,5 I heksanu. Wytrącony osad przefiltrowano i przemyto roztworem (3:1) heksan : octan etylu, a następnie suszono w próżni, by otrzymać 33,82 g aktywnego materiału estrowego z HOSu i z N-acetylowanym związkiem kopolimeru pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego z kwasem poliasparaginowym.

P r z y k ł a d 6-go etapu realizacji wynalazku.

Aktywny materiał estrowy (33,73 g) zawierający HOSu oraz N-acetylowany związek pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego i kwasu poliasparaginowego, otrzymany w przykładzie 5go etapu realizacji wynalazku, rozpuszczono w 1,35 I dimetyloformamidu i ogrzano do temperatury 35°C. Do tego dodano 26,13 g sproszkowanego wodorochlorku doksorubicyny i po rozprowadzeniu jej w postaci zawiesiny w roztworze reakcyjnym dodano do tego jeszcze 8,16 ml trietyloaminy i umożliwiono reagowanie przez 1 h. Mieszaninę reakcyjną wkroplono w mieszany rozpuszczalnik zawierający 4,0 I octanu etylu i 16,0 ml heksanu. Wytrącony osad przefiItrowano i przemyto roztworem złożonym z heksanu i octanu etylu (3:1), a następnie suszono próżniowo. Następnie otrzymany osad przeprowadzono w zawiesinę w 590 ml acetonitrylu i dodano do tego potem 1780 ml wody oraz ogrzewano i mieszano w temperaturze 35°C. Po stwierdzeniu, że osad rozpuścił się, mieszanie kontynuowano jeszcze przez 1 h, a następnie roztwór reakcyjny zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, aby usunąć z niego acetonitryl i wysuszono przez wymrożenie. Otrzymany produkt wysuszony przez wymrożenie powtórnie rozpuszczono w 1,074 I dimetyloformamidu, a otrzymany roztwór skroplono w mieszany rozpuszczalnik zawierający 2,15 I octanu etylu i 8,60 I heksanu. Wytrącony osad przefiltrowano i przemyto roztworem złożonym z heksanu i octanu etylu (3:1), po czym wysuszono w próżni. Wreszcie otrzymany osad przeprowadzono w zawiesinę w 1074 ml bezwodnego etanolu i po mieszaniu przy temperaturze 35°C przez 2 h zawiesinę przefiltrowano i przemyto bezwodnym etanolem, po czym suszono ją próżniowo, by otrzymać 45,39 g produktu kondensacji złożonego z doksorubicyny i N-ace-tylowanego związku kopolimeru pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego i kwasu poliasparaginoPL 222 061 B1 wego. Ilość doksorubicyny związanej z resztą kwasu karboksylowego w łańcuchu bocznym kwasu poliasparaginowego, stanowiącego część kopolimeru blokowego, wynosiła w przybliżeniu 47%.

P r z y k ł a d 7-go etapu realizacji wynalazku.

Do produktu kondensacji (20,00 g) doksorubicyny z N-acetylowanym związkiem kopolimeru pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego i kwasu poliasparaginowego, otrzymanego w przykładzie 6-go etapu realizacji wynalazku, dodano 100 ml wody do iniekcji, całość podgrzano do temperatury 35°C i przeprowadzono w zawiesinę. Dodano do tego 6,0 ml 0,5 N roztworu wodorotlenku sodu i wymieszano, a następnie dodano jeszcze 100 ml bezwodnego etanolu. Po stwierdzeniu, że kopolimer blokowy rozpuścił się, dodano do tego 3,906 g wodorochlorku doksorubicyny i rozpuszczono w roztworze. Do roztworu tego dodano 5,9 ml 0,5 N wodorotlenku sodu, aby ustawić wartość współczynnika pH = 6, a dodatkowo dodano 188 ml wody do iniekcji. Po upływie jednej godziny roztwór przefiltrowano za pomocą filtru membranowego (Millipore; typ GV 0,22 pm). Następnie rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, by otrzymać roztwór związku kompleksu leku z kopolimerem blokowym. Roztwór ten zamrożono i suszono, by otrzymać 22,96 g wysuszonej przez wymrożenie substancji zawierającej związku kompleksu leku z kopolimerem blokowym.

P r z y k ł a d 1

Kopolimer blokowy (10,3 mg) otrzymany w przykładzie 4-go etapu realizacji wynalazku rozpuszczono w 10 mM buforowego roztworu kwasu octowego (pH 7,0, 1 ml), by otrzymać 1,0043 g roztworu kopolimeru blokowego. Jednej części (0,7491 g) tego roztworu pozwolono przejść przez kolumnę Sep-Pak QMA (produkcji Waters Co., Ltd.), przez którą przepuszczono metanol, wodę i 10 mM buforowego roztworu kwasu octowego (każdy po 5 ml), a następnie przemyto za pomocą 10 mM buforowego roztworu kwasu octowego (3 ml). Otrzymano razem 4,1171 g roztworu zawierającego swobodnie przechodzące frakcje i frakcje wypłukane. Roztwór ten oznaczano ilościowo przez szybką chromatografię cieczową w następujących warunkach z dołączoną kolumną żelowo-permeacyjną. Ilość otrzymanych glikoli polietylenowych wynosiła 0,1005 mg (1,3% wag.).

Kolumna: Shodex OHpak SB803 + SB-G (produkcji Showa Denko K.K.)

Temperatura kolumny: 40°C

Faza ruchoma: 100 mM wodnego roztworu chlorku sodu

Natężenie przepływu: 0,5 ml/min

Czujnik: różnicowy czujnik refraktometryczny

Wprowadzana ilość: 50 pI

P r z y k ł a d 2

Kopolimer blokowy (10,3 mg) otrzymany w przykładzie 4-go etapu realizacji wynalazku rozpuszczono w 100 mM roztworu buforowego kwasu fosforowego (pH 7,0, 1 ml), aby otrzymać roztwór kopolimeru blokowego. Umożliwiono temu roztworowi przejście przez kolumnę Sep-Pak C18 (produkcji Waters Co., Ltd.), przez którą przepuszczono wstępnie metanol, wodę i 100 mM buforowego roztworu kwasu (każdy po 5 ml) i dalej płukano za pomocą 100 mM roztworu buforowego kwasu fosforowego (3 ml). W sumie otrzymano 4,1735 g roztworu zawierającego swobodnie przechodzące frakcje i frakcje wypłukane. Roztwór ten oznaczano ilościowo za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej w następujących warunkach z dołączoną kolumną żelowo-permeacyjną. Ilość zawartego kwasu poliasparaginowego wynosiła 0,250 mg (2,4% wag.).

Kolumna: Asahipack GF310 HQ + Asahipak GF-1B (produkcji Asahi Kasei Corporation)

Temperatura kolumny: 40°C

Faza ruchoma: 100 mM buforowego roztworu kwasu fosforowego (pH 7,0)

Natężenie przepływu: 0,5 ml/min

Czujnik: różnicowy czujnik refraktometryczny (lub detektor nadfioletu)

Wprowadzana ilość: 50 pl

P r z y k ł a d 3

Produkt kondensacji doksorubicyny z N-acetylowanym związkiem kopolimeru pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego i kwasu poliasparaginowego (50 mg), otrzymany w przykładzie 6-go etapu realizacji wynalazku, dokładnie zważono i rozpuszczono w 25 ml roztworu 4% SDS : acetonitryl (1:1). Roztwór ten analizowano za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej w następujących warunkach i stwierdzono, że zawiera 1,29% wag. wyizolowanego wodorochlorku doksorubicyny oraz zanieczyszczenia pochodzące od doksorubicyny w ilości 0,15% wag. (wyrażone jako równoważnik wodorochlorku doksorubicyny na podstawie absorbancji światła).

PL 222 061 B1

Kolumna: Capsule pack C18UG80 5 pm (produkcji Shiseido Co., Ltd.) średnica wewnętrzna 4,6 mm x 150 mm

Temperatura kolumny: 40°C

Faza ruchoma: (A) 0,2% kwasu fosforowego, 0,15% SDS/H2O: CH3CN = 7:3 (B) 0,2% kwasu fosforowego 0,15% SDS/H2O: CH3CN = 3:7

Gradient: B% (minuty); 25 (0), 25 (13), 100 (30), 100 (40)

Natężenie przepływu: 1,0 ml/min

Detekcja: ultrafiolet (254 nm)

Wprowadzana ilość: 20 pl

P r z y k ł a d 4

Produkt kondensacji doksorubincyny z N-acetylowanym związkiem kopolimeru pojedynczo zakończonego glikolu metoksypolietylenowego i kwasu poliasparaginowego (30 mg), otrzymany w przykładzie 6-go etapu realizacji wynalazku, dokładnie zważono i rozpuszczono w 1 ml d imetyloformam idu. Roztwór ten analizowano za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej w następujących warunkach. Ilość przeniesionych i związanych pochodnych dicykloheksylokarbamidu była nie większa niż 0,08% (nie więcej niż granica wykrywalności).

Kolumna: TC-1 (produkcji GL Science Co., Ltd.), 30 mm x 0,25 mm średnica wewnętrzna, grubość folii 0,25 pm

Faza ruchoma: hel 0,8 ml/min

Temperatura kolumny: 70°C, 3°C/min, 88°C, 15°C/min, 180°C (5 minut)

Otwór wejściowy: 290°C

Czujnik: FID (290°C)

Wprowadzana ilość: Split (20:1), 1 pl

Przedmiotowy wynalazek umożliwia otrzymanie kopolimeru blokowego o wysokiej czystości, z którego usunięte zostały glikole polietylenowe i poli(kwasowe aminokwasy) zawarte w kopolimerze blokowym z glikoli polietylenowych i poli(kwasowych aminokwasów) w charakterze zanieczyszczeń, aby wytworzyć polimerowy nośnik, który jest utworzony przez kondensację kopolimeru i antracyklinowego czynnika przeciwrakowego i może być stosowany do celów medycznych jako nośnik leku i genu oraz do tworzenia polimerowego preparatu farmaceutycznego, który zawiera antracyklinowy czynnik przeciwrakowy w wewnętrznym rdzeniu miceli utworzonej przez polimerowy nośnik.

Jest oczywiste, że zanieczyszczenia, które są zawarte w kopolimerze blokowym i są usuwane przez przedmiotowy wynalazek, nie mają żadnego wpływu na powstawanie miceli itp., a nośnik polimerowy, z którego zostały one usunięte, jest uważany za lepiej działający. Ponadto polimerowy preparat farmaceutyczny, otrzymany przez zastosowanie tego nośnika polimerowego o wysokiej czystości, może tworzyć preparat farmaceutyczny o wysokiej czystości, który jest stosowany do celów klinicznych.

Ponadto przedmiotowy wynalazek umożliwia też oznaczenie ilości glikoli polietylenowych i poli(kwasowych aminokwasów) z kwasem karboksylowym w swym łańcuchu bocznym, które są zanieczyszczeniami w wymienionym wyżej kopolimerze blokowym i w rezultacie dostarczenie informacji użytecznych przy ulepszaniu sposobu wytwarzania kopolimeru blokowego, planowaniu jego wzorców produkcyjnych i sterowaniu procesami produkcyjnymi.

Claims

1. Sposób produkcji kopolimeru blokowego glikoli polietylenowych i poli(kwasowego aminokwasu) według wzoru (1):

(1)

PL 222 061 B1

12 gdzie R¹ oznacza grupę alkilową zawierającą 1-5 atomów węgla, R² oznacza grupę alkilenową zawierającą 1-5 atomów węgla, R³ oznacza grupę metylenową albo etylenową, a R⁴ oznacza atom wodoru albo grupę acylową zawierającą 1-5 atomów węgla, przy czym n jest liczbą całkowitą od 5 do 1000, m jest liczbą całkowitą od 2 do 300, a x jest liczbą całkowitą od 0 do 300, z tym, że x jest nie większe niż m, lub jego sól, znamienny tym, że zawartość zanieczyszczeń składających się z glikoli polietylenowych oraz poli(kwasowych aminokwasów) wynosi co najwyżej 10% wagowo, przy

1 2 1 2 czym pochodną glikolu polietylenowego według wzoru: R¹-(OCH2CH2)n-O-R²-NH2, gdzie R¹, R² oraz n są zdefiniowane powyżej, oczyszcza się za pomocą żywicy jonowymiennej w celu przygotowania kopolimeru blokowego, a po usunięciu grupy osłonowej grupy karboksylowej w łańcuchu bocznym kwaśnego aminokwasu, wybranej z grupy zawierającej grupę metylową, etylową, propylową butylową, benzylową, fenetylową, p-metoksybenzylową i p-nitrobenzylową przeprowadza się proces oczyszczania przy użyciu żywicy rozdzielającej/adsorpcyjnej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że R¹ oznacza grupę metylową, R² oznacza grupę trimetylenową, R³ oznacza grupę metylenową, a R⁴ oznacza grupę acetylową, przy czym n jest liczbą całkowitą od 20 do 500, m jest liczbą całkowitą od 10 do 100, a x jest liczbą całkowitą od 0 do 100, jednakże x jest nie większe niż m we wzorze (1).

3. Nośnik polimerowy, zawierający poli(kwasowy aminokwas) kopolimeru blokowego wyprodukowanego sposobem określonym zastrz. 1-2, znamienny tym, że poli(kwasowy aminokwas) kopolimeru blokowego jest skondensowany z resztą doksorubicynową, przy czym kondensacja pomiędzy poli(kwasowym aminokwasem) a resztą doksorubicynową jest kondensacją pomiędzy grupą karboksylową w bocznym łańcuchu poli(kwasowego aminokwasu) a resztą doksorubicynową, zaś reszta doksorubicynowa w poli(kwasowym aminokwasie) ma stopień wiązania 30-55%.

4. Polimerowy preparat farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera kompleks leku z kopolimerem blokowym, w którym doksorubicyna lub jej sól są zawarte w wewnętrznym rdzeniu miceli utworzonej przez nośnik polimerowy określony zastrz. 3, przy czym związek + dc kompleksu leku z kopolimerem blokowym jest zawarty w postaci substancji wysuszonej przez wymrażanie.